IT202100007331A1 - PROCEDURE FOR THE EXTRACTION OF POLYAMINE FROM NATURAL COMPLEX MATRICES - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
- C07C209/82—Purification; Separation; Stabilisation; Use of additives
- C07C209/84—Purification
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Landscapes
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: ?Procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali complesse? Description of the industrial invention entitled: ?Extraction process of polyamines from complex natural matrices?
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda un procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali complesse, in particolare matrici alimentari complesse, nonch? una composizione di poliammine ottenibile con il procedimento dell?invenzione. The present invention relates to a process for the extraction of polyamines from complex natural matrices, in particular complex food matrices, as well as a polyamine composition obtainable with the process of the invention.
Le poliammine sono composti organici aventi due o pi? gruppi amminici. Le poliammine lineari a basso peso molecolare si trovano in quasi tutti gli organismi viventi. Le pi? comuni sono putrescina, cadaverina, spermina e spermidina, tutte note per essere potenti fattori di crescita per cellule eucariotiche e procariotiche. Le poliammine vengono sintetizzate solo da cellule eucariotiche attraverso una via biochimica altamente regolata. Bench? le loro funzioni non siano ancora completamente chiare, esse sembrano avere funzioni stimolanti la proliferazione cellulare e certamente giocano un ruolo fondamentale nel superavvolgimento della catene di DNA nel nucleo cellulare. Concentrazioni rilevanti di poliammine si trovano ad esempio nel cervello dei mammiferi. Polyamines are organic compounds having two or more? amino groups. Linear low molecular weight polyamines are found in almost all living organisms. The most? common are putrescine, cadaverine, spermine, and spermidine, all known to be potent growth factors for eukaryotic and prokaryotic cells. Polyamines are synthesized only by eukaryotic cells through a highly regulated biochemical pathway. Bench? their functions are still not fully understood, they seem to have cell proliferation stimulating functions and they certainly play a fundamental role in the supercoiling of DNA chains in the cell nucleus. Relevant concentrations of polyamines are found for example in the brain of mammals.
La spermidina, in particolare, ? considerata un ?agente della longevit?? nei mammiferi, grazie a vari meccanismi d'azione che stanno appena iniziando a essere compresi. La spermidina interviene nel controllo metabolico delle cellule, partecipando a numerose funzioni all?interno dell?organismo dei mammiferi in generale ed anche, nello specifico, di quello umano. Vi sono indicazioni del fatto che la spermidina sia importante per la protezione dallo stress ossidativo; l?azione antinfiammatoria; la proteostasi (contribuisce a mantenere i normali livelli funzionali delle proteine necessarie allo svolgimento delle funzioni cellulari); l?omeostasi cellulare, regolando la crescita, la proliferazione e la morte cellulare; la stabilizzazione del DNA e dell?RNA; la conservazione della funzione mitocondriale; e la prevenzione della senescenza delle cellule staminali. Spermidine in particular considered a ?agent of longevity?? in mammals, thanks to various mechanisms of action that are just beginning to be understood. Spermidine intervenes in the metabolic control of cells, participating in numerous functions within the mammalian organism in general and also, specifically, in the human one. There are indications that spermidine is important for protection from oxidative stress; the anti-inflammatory action; proteostasis (helps to maintain normal functional levels of proteins necessary for carrying out cellular functions); cellular homeostasis, regulating cell growth, proliferation and death; the stabilization of DNA and RNA; the preservation of mitochondrial function; and prevention of stem cell senescence.
L'autofagia ? il meccanismo principale indotto dalla spermidina a livello cellulare ma sono state trovate prove per altri meccanismi, tra cui la riduzione dell'infiammazione, il metabolismo dei lipidi e la regolazione della crescita, la proliferazione e il ricambio cellulare. Inoltre, la spermidina esibisce effetti antitumorali, cardioprotettivi e neuroprotettivi, che si riflettono positivamente sulla salute generale dell?organismo. Tuttavia, i livelli di spermidina diminuiscono con l?avanzare dell?et?, esibendo una correlazione tra spermidina e molti dei marcatori dell?invecchiamento. In ultimo, la spermidina ? stata testata con successo come stimolante per l'allungamento del fusto del capello e delle unghie. Autophagy? the primary mechanism induced spermidine at the cellular level but evidence was found for other mechanisms, including reduction of inflammation, lipid metabolism, and regulation of cell growth, proliferation, and turnover. Furthermore, spermidine exhibits anticancer, cardioprotective and neuroprotective effects, which are reflected positively on the general health of the organism. However, spermidine levels decline with advancing age, exhibiting a correlation between spermidine and many of the markers of aging. Lastly, spermidine? It has been successfully tested as a stimulant for lengthening hair shafts and nails.
Alla luce delle summenzionate propriet?, risulta evidente che le poliammine, ed in particolare la spermidina, risultano di particolare interesse in ambito farmaceutico, nutraceutico e cosmetico. In the light of the aforementioned properties, it is evident that polyamines, and in particular spermidine, are of particular interest in the pharmaceutical, nutraceutical and cosmetic fields.
Sebbene pressoch? ubiquitarie in quasi tutti gli organismi viventi, le poliammine (e in particolare le pi? preziose ai fini della salute umana, ovvero la spermina e la spermidina) sono solitamente presenti in concentrazioni relativamente basse. Although almost Ubiquitous in almost all living organisms, polyamines (and in particular the most valuable for human health, i.e. spermine and spermidine) are usually present in relatively low concentrations.
Ai fini della loro estrazione come principio attivo di grado alimentare, ? quindi necessario identificare delle fonti edibili in cui queste sostanze siano presenti in quantit? sufficientemente elevate. Buone fonti alimentari di spermidina e poliammine in generale sono elencate nella Tabella 1 sottostante: formaggi stagionati, alcune variet? di the, funghi, prodotti a base di soia, legumi, mais e cereali integrali. For the purposes of their extraction as a food grade active ingredient, ? therefore it is necessary to identify edible sources in which these substances are present in quantities? high enough. Good dietary sources of spermidine and polyamines in general are listed in Table 1 below: aged cheeses, some varieties of tea, mushrooms, soy products, legumes, corn and whole grains.
Il germe di grano tenero risulta in assoluto la fonte pi? ricca in rapporto al peso (fino 500 mg/kg) e, di conseguenza, esso costituisce la fonte naturale preferibile per il processo estrattivo che forma oggetto della presente invenzione. The soft wheat germ is by far the most? rich in weight ratio (up to 500 mg/kg) and, consequently, it constitutes the preferable natural source for the extraction process which forms the object of the present invention.
Nello stato della tecnica sono descritti numerosi procedimenti di estrazione di poliammine da fonti naturali, ivi incluse matrici alimentari come quelle sopra indicate. In the state of the art numerous processes for the extraction of polyamines from natural sources are described, including food matrices such as those indicated above.
Il procedimento comunemente utilizzato per estrarre poliammine da matrici naturali prevede l?impiego di soluzioni acquose acide. ? noto infatti che le poliammine presentano reattivit? basica e reagiscono con acidi formando sali estremamente solubili in acqua. The process commonly used to extract polyamines from natural matrices involves the use of acidic aqueous solutions. ? in fact, it is known that polyamines have reactivity? basic and react with acids to form extremely water soluble salts.
Sul mercato, perlopi? giapponese, sono presenti prodotti basati su estratti vegetali ricchi in poliammine (Brochure Polyamine-P, On the market, mostly? Japanese, there are products based on plant extracts rich in polyamines (Brochure Polyamine-P,
PHYTOPOLYAMINE-S e PHYTOPOLYAMINE-SP, GLYCINE SOJA (SOYBEAN) GERM EXTRACT), che tuttavia presentano lo svantaggio di contenere titoli piuttosto bassi di poliammine. PHYTOPOLYAMINE-S and PHYTOPOLYAMINE-SP, GLYCINE SOJA (SOYBEAN) GERM EXTRACT), which however have the disadvantage of containing rather low titers of polyamines.
?Polyamine content and metabolism in Arabidopsis thaliana and effect of spermidine on plant development?, Plant Physiology and Biochemistry, Volume 38, Issue 5, May 2000, pagine 383-393, descrivono un processo di estrazione di poliammine a fini analitici in cui il campione viene estratto in acido perclorico al 4% (p/v) (PCA) a freddo e centrifugato. Il pellet ottenuto viene risospeso in PCA, a cui segue un?idrolisi con 6 N HCl al fine di rilasciare le poliammine dai loro coniugati. ?Polyamine content and metabolism in Arabidopsis thaliana and effect of spermidine on plant development?, Plant Physiology and Biochemistry, Volume 38, Issue 5, May 2000, pages 383-393, describe a process of extraction of polyamines for analytical purposes in which the sample it is cold extracted in 4% (w/v) perchloric acid (PCA) and centrifuged. The pellet obtained is resuspended in PCA, followed by hydrolysis with 6 N HCl in order to release the polyamines from their conjugates.
?Determination of putrescine, cadaverine, spermidine and spermine in different chemical matrices by high performance liquid chromatography?electrospray ionization?ion trap tandem mass spectrometry (HPLC?ESI?ITMS/MS)?, Journal of Chromatography B, 1002 (2015) 176?184, riportano un processo che prevede l?impiego di acido cloridrico per l'estrazione di poliammine da L. sativum. ?Determination of putrescine, cadaverine, spermidine and spermine in different chemical matrices by high performance liquid chromatography?electrospray ionization?ion trap tandem mass spectrometry (HPLC?ESI?ITMS/MS)?, Journal of Chromatography B, 1002 (2015) 176? 184, report a process which provides for the use of hydrochloric acid for the extraction of polyamines from L. sativum.
?Improved method for the determination of biogenic amines and polyamines in vegetable products by ion-pair highperformance liquid chromatography?, Journal of Chromatography A, 1129 (2006) 67?72 descrivono l?estrazione di poliammine a scopi analitici con acido perclorico 0,6 M. ?Improved method for the determination of biogenic amines and polyamines in vegetable products by ion-pair highperformance liquid chromatography?, Journal of Chromatography A, 1129 (2006) 67?72 describe the extraction of polyamines for analytical purposes with 0.6 perchloric acid m.
La domanda di brevetto US2014/0378708 A1 descrive un procedimento di estrazione di poliammine da matrici vegetali con alta efficienza e ottenendo un prodotto finale a basso contenuto di sali. Il procedimento prevede diversi passaggi di estrazione a pH neutro con acqua, ed un passaggio finale di estrazione effettuato con acido debole (pH 4,0-6,0, preferenzialmente condotta con acido citrico). ? altres? prevista la possibilit? di effettuare passaggi preliminari di estrazione con alcol etilico 20%-90% di purezza, meglio se 30%-70%, con lo scopo di rimuovere componenti non desiderate dalla matrice, ottenendo soluzioni meno viscose e quindi migliorando la lavorabilit? del prodotto. Nell?ambito di questo procedimento l?impiego di alcol etilico non ha lo scopo di estrarre le poliammine, che a quel pH non sono solubili in alcool etilico. Il risultato del procedimento descritto in US2014/0378708 A1 ? una soluzione acquosa che pu? essere ridotta ad un solido tramite processi di essiccazione, o che pu? essere ulteriormente purificata tramite l?utilizzo di resine a scambio ionico, frazionamento con membrane selettive, filtrazione su gel, elettrodialisi. Patent application US2014/0378708 A1 describes a process for extracting polyamines from vegetable matrices with high efficiency and obtaining a final product with a low salt content. The process involves several extraction steps at neutral pH with water, and a final extraction step carried out with weak acid (pH 4.0-6.0, preferably carried out with citric acid). ? otherwise? foreseen the possibility? to carry out preliminary extraction steps with 20%-90% purity ethyl alcohol, preferably 30%-70%, with the aim of removing unwanted components from the matrix, obtaining less viscous solutions and therefore improving the workability? of the product. In the context of this process, the use of ethyl alcohol is not intended to extract the polyamines, which at that pH are not soluble in ethyl alcohol. The result of the process described in US2014/0378708 A1 ? an aqueous solution that can? be reduced to a solid through drying processes, or that pu? be further purified through the use of ion exchange resins, fractionation with selective membranes, gel filtration, electrodialysis.
I procedimenti della tecnica nota sopra descritti presentano tutti lo svantaggio di fornire prodotti solidi aventi un titolo in poliammine totali estremamente basso (generalmente ? 0,6 % in peso). Un?alternativa all?estrazione di poliammine da fonti naturali ? rappresentata dalle poliammine di sintesi, ma anche in questo caso, per quanto ? a conoscenza degli inventori, non sono disponibili in commercio prodotti adatti al consumo alimentare. The processes of the prior art described above all have the drawback of providing solid products having an extremely low total polyamine content (generally ? 0.6% by weight). An alternative to the extraction of polyamines from natural sources? represented by synthetic polyamines, but also in this case, for how much? to the knowledge of the inventors, there are no commercially available products suitable for food consumption.
? quindi evidente la necessit? di fornire un procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali, anche complesse, che permetta di ottenere come risultato un estratto naturale sufficientemente concentrato in poliammine (in particolare spermidina) e di grado alimentare, quindi utilizzabile in campo alimentare, nutraceutico e farmaceutico. ? is therefore evident the need? to provide a process for the extraction of polyamines from natural, even complex, matrices which allows to obtain as a result a natural extract sufficiently concentrated in polyamines (in particular spermidine) and of food grade, therefore usable in the food, nutraceutical and pharmaceutical fields.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali, anche complesse, che sia semplice e che faccia uso di reagenti non pericolosi e di grado alimentare. A further object of the present invention ? that of making available a process for the extraction of polyamines from natural, even complex, matrices which is simple and which makes use of non-hazardous and food-grade reagents.
Ancora un altro scopo della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali, anche complesse, che sia facilmente scalabile. Yet another object of the present invention? that of making available a process for the extraction of polyamines from natural, even complex, matrices which is easily scalable.
Ancora un altro scopo della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali, anche complesse, che permetta di ottenere come risultato un estratto naturale che sia sostanzialmente esente da eventuali contaminanti presenti nella matrice di partenza, quali ad esempio pesticidi. Yet another object of the present invention? that of making available a process for the extraction of polyamines from natural, even complex, matrices which allows to obtain as a result a natural extract which is substantially free from any contaminants present in the starting matrix, such as for example pesticides.
Un altro scopo della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un procedimento di estrazione di poliammine da matrici naturali, anche complesse, che permetta il riciclo del liquido di reazione dopo separazione del principio attivo di interesse. Another object of the present invention ? that of making available a process for the extraction of polyamines from natural, even complex, matrices which allows the recycling of the reaction liquid after separation of the active principle of interest.
Questi ed altri scopi sono raggiunti dal procedimento di estrazione di poliammine da una matrice naturale come definito nell?annessa rivendicazione 1. These and other objects are achieved by the process for the extraction of polyamines from a natural matrix as defined in the annexed claim 1.
Nell?ambito dell?invenzione rientra altres? una composizione di poliammine di origine naturale (ossia non di sintesi) ottenibile con il procedimento dell?invenzione. Gli esempi della presente descrizione dimostrano che, grazie all?innovativo procedimento di estrazione utilizzato, la composizione di poliammine di origine naturale cos? ottenuta presenta un titolo in principio attivo, ossia spermidina, molto superiore rispetto a quello ottenibile con i procedimenti della tecnica nota. Ad esempio, utilizzando come matrice naturale di partenza le fave di soia, il procedimento di estrazione dell?invenzione permette di ottenere un titolo in spermidina superiore all?1% in peso; utilizzando germe di grano come matrice naturale di partenza, ? addirittura possibile ottenere un titolo in spermidina superiore al 7% in peso (7-11% negli esempi). The scope of the invention also includes a composition of polyamines of natural origin (ie non-synthetic) obtainable with the process of the invention. The examples of the present description demonstrate that, thanks to the innovative extraction process used, the composition of polyamines of natural origin is so? obtained has a title in active principle, ie spermidine, much higher than that obtainable with the processes of the known art. For example, by using soybeans as the starting natural matrix, the extraction process of the invention allows to obtain a spermidine titer higher than 1% by weight; using wheat germ as a natural starting matrix, ? it is even possible to obtain a spermidine titer higher than 7% by weight (7-11% in the examples).
Ulteriori caratteristiche e vantaggi del procedimento di estrazione e della composizione di poliammine dell?invenzione sono definiti nelle rivendicazioni dipendenti. Further characteristics and advantages of the extraction process and of the polyamine composition of the invention are defined in the dependent claims.
Tutte le rivendicazioni formano parte integrante della presente descrizione. All the claims form an integral part of the present description.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Il procedimento di estrazione di poliammine da una matrice naturale secondo l?invenzione prevede tre passaggi essenziali: trattamento basico della matrice naturale di partenza, estrazione delle poliammine con alcool etilico o propilico e salificazione/cristallizzazione delle poliammine. La limitazione ad alcool etilico o propilico ? giustificata dal fatto che questi sono gli unici alcool autorizzati per uso alimentare o cosmetico. The extraction process of polyamines from a natural matrix according to the invention involves three essential steps: basic treatment of the starting natural matrix, extraction of the polyamines with ethyl or propyl alcohol and salification/crystallisation of the polyamines. The limitation to ethyl or propyl alcohol? justified by the fact that these are the only alcohols authorized for food or cosmetic use.
La matrice naturale utilizzata come materiale di partenza pu? essere qualsiasi matrice naturale ricca in poliammine, come ad esempio una matrice alimentare. A titolo esemplificativo si citano germe di grano, soia, formaggio stagionato, crusca di riso, funghi, th?, mango, legumi, carne, mais, cereali integrali e verdure. The natural matrix used as starting material can be any natural matrix rich in polyamines, such as a food matrix. By way of example, wheat germ, soy, aged cheese, rice bran, mushrooms, tea, mango, legumes, meat, corn, whole grains and vegetables are mentioned.
Al fine di ottimizzare l?efficienza di estrazione, ? opportuno che la matrice naturale scelta come fonte di poliammine venga sfarinata o quanto pi? possibile finemente macinata. Dal momento che a pH fisiologico le poliammine si presentano sotto forma di policationi, ? necessario un trattamento con base forte per convertire quantitativamente le poliammine nella loro forma basica libera. Le poliammine in forma di base libera sono infatti molto solubili sia in acqua che in alcool etilico e propilico, mentre in forma cationica sono solubili solo in soluzioni acquose. La base forte pu? essere quindi selezionata fra tutte quelle che dimostrano forza basica superiore a quella delle poliammine stesse, ossia con un pKb ? 4, come, a titolo di esempio NaOH, KOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, BA(OH)2, LiOH, Sr(OH)2, N(CH3)4OH, guanidina). Pi? preferibilmente la base forte ? solubile sia in acqua sia in alcool etilico e/o alcool propilico, ed ancor pi? preferibilmente ? adatta ad un utilizzo alimentare o comunque ammessa nella lavorazione di alimenti. Un ulteriore criterio di preferibilit? ? la capacit? della suddetta base forte di rilasciare in soluzione molteplici ioni OH<- >per unit? formula. In order to optimize the extraction efficiency, ? should the natural matrix chosen as a source of polyamines be floured or as much as possible? as finely ground as possible. Since at physiological pH polyamines occur in the form of polycations, ? Strong base treatment is required to quantitatively convert the polyamines to their free basic form. Polyamines in free base form are in fact very soluble both in water and in ethyl and propyl alcohol, while in cationic form they are soluble only in aqueous solutions. The strong base can therefore be selected among all those which demonstrate a basic strength superior to that of the polyamines themselves, ie with a pKb ? 4, such as, for example, NaOH, KOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2, BA(OH)2, LiOH, Sr(OH)2, N(CH3)4OH, guanidine). Pi? preferably the strong base ? soluble both in water and in ethyl alcohol and/or propyl alcohol, and even more? preferably ? suitable for food use or in any case permitted in food processing. Another criterion of preference? ? the capacity? of the aforementioned strong base to release multiple OH<- > ions in solution per unit? formula.
Nelle condizioni adottate nell?esempio sperimentale riportato nel seguito, il miglior candidato ? stato identificato nell?idrossido di calcio, il quale, oltre a possedere i requisiti elencati, dimostra il vantaggio di essere non volatile, facilmente reperibile sul mercato e a bassi costi. Under the conditions adopted in the experimental example reported below, the best candidate ? been identified in calcium hydroxide, which, in addition to meeting the requirements listed, demonstrates the advantage of being non-volatile, easily available on the market and at low cost.
La quantit? di base necessaria alla reazione, che dipende dalle propriet? chimiche della sostanza basica scelta, ? il quantitativo utile a spostare il pH della matrice in condizioni alcaline, almeno oltre pH 8,0, preferenzialmente sopra pH 10,0. Si ? inoltre trovato che in questa fase pu? essere conveniente lavorare in condizioni di leggero eccesso di base. The quantity? of basis necessary for the reaction, which depends on the properties? chemicals of the basic substance chosen, ? the amount useful to shift the pH of the matrix under alkaline conditions, at least above pH 8.0, preferably above pH 10.0. Yes ? also found that in this phase pu? be convenient to work in conditions of slight excess of base.
Nel caso riportato come esempio sperimentale, si sono utilizzati 20 grammi di Ca(OH)2 per ogni chilogrammo di germe di grano trattato. In the case reported as an experimental example, 20 grams of Ca(OH)2 were used for each kilogram of treated wheat germ.
Se la matrice naturale ? un solido secco (come nel caso del germe di grano) ? conveniente l?aggiunta di una piccola quantit? di acqua, utile sia a sciogliere e disperdere omogeneamente il composto basico, sia a fornire un opportuno ambiente protico per la reazione acido-base che deve avvenire. La quantit? di acqua necessaria dipende dalla natura della matrice naturale, ma in generale ? opportuno utilizzare la minima quantit? utile a bagnarla completamente mantenendola lavorabile. Nel caso del germe di grano macinato, risultano appropriati da 0,2 a 1 litro di acqua per chilogrammo di solido, preferenzialmente da 0,5 a 0,7 litri per chilo. If the natural matrix ? a dry solid (as in the case of wheat germ) ? is it convenient to add a small quantity? of water, useful both for dissolving and homogeneously dispersing the basic compound, and for providing a suitable protic environment for the acid-base reaction that must take place. The quantity? of water required depends on the nature of the natural matrix, but in general? appropriate to use the minimum amount? useful to wet it completely keeping it workable. In the case of ground wheat germ, 0.2 to 1 liter of water per kilogram of solid is appropriate, preferably 0.5 to 0.7 liters per kilogram.
La miscela sopra descritta viene preferibilmente miscelata con cura per almeno 15 minuti, idealmente 30 minuti, per permettere alla reazione acido-base di avvenire fino a completezza. The above described mixture is preferably mixed carefully for at least 15 minutes, ideally 30 minutes, to allow the acid-base reaction to take place until complete.
La successiva fase di estrazione viene eseguita in etanolo o propanolo. ? preferibile utilizzare etanolo o propanolo con un grado di purezza compreso fra 80% in volume e 100 % in volume, pi? preferibilmente compreso fra 95 % e 98 % in volume. L?etanolo o il propanolo viene aggiunto alla miscela precedentemente descritta e mescolato con essa vigorosamente per omogeneizzare al meglio i componenti. La quantit? di etanolo o propanolo necessaria dipende dalle caratteristiche della matrice naturale (quali le caratteristiche di bagnabilit?, assorbimento, granulometria, ecc.), ma in generale, nel caso dell?etanolo, ? preferibile impiegare da un minimo di 2 a 20 volte il peso della matrice da estrarre, pi? preferibilmente tra gli 8 e i 15 equivalenti in peso, ancor pi? preferibilmente 10 e 12 equivalenti in peso. Nel caso riportato come esempio sperimentale, si sono utilizzati 12 litri di etanolo 95 % di grado alimentare per chilogrammo di germe di grano processato. The next extraction step is performed in ethanol or propanol. ? preferable to use ethanol or propanol with a degree of purity between 80% by volume and 100% by volume, more? preferably between 95% and 98% by volume. Ethanol or propanol is added to the previously described mixture and vigorously mixed with it to best homogenize the components. The quantity? of ethanol or propanol required depends on the characteristics of the natural matrix (such as the characteristics of wettability?, absorption, granulometry, etc.), but in general, in the case of ethanol,? preferable to use a minimum of 2 to 20 times the weight of the matrix to be extracted, more? preferably between 8 and 15 weight equivalents, even more? preferably 10 and 12 weight equivalents. In the case reported as an experimental example, 12 liters of 95% food grade ethanol were used per kilogram of processed wheat germ.
? preferibile mantenere la miscela sotto agitazione per almeno 30 minuti, pi? preferibilmente per 1 ora, per permettere all?alcool di estrarre la maggior quantit? possibile di poliammine dalla matrice. La temperatura non sembra essere un parametro critico per il processo di estrazione, ma per alcune matrici potrebbe rivelarsi conveniente lavorare a temperature diverse da quella ambientale (ad esempio, quando la matrice da estrarre ? termolabile o per evitare la formazione di fasi gel). ? it is preferable to keep the mixture under stirring for at least 30 minutes, more? preferably for 1 hour, to allow the alcohol to extract the greatest quantity? possible of polyamines from the matrix. Temperature does not seem to be a critical parameter for the extraction process, but for some matrices it could be convenient to work at temperatures other than the ambient one (for example, when the matrix to be extracted is thermolabile or to avoid the formation of gel phases).
Per aumentare l?efficienza di estrazione o ridurre i tempi di processo ? possibile ricorrere a tecnologie gi? note nel settore, quali estrazione assistita da ultrasuoni o cavitazione. To increase extraction efficiency or reduce process times ? Is it possible to use technologies already? known in the industry, such as ultrasound assisted extraction or cavitation.
Terminata la fase di estrazione, la fase solida della matrice viene separata e rimossa, mentre la fase alcolica, contenente le poliammine, viene raccolta. La separazione delle fasi avviene anche spontaneamente, ma la fase liquida pu? essere efficacemente separata per mezzo di filtrazione, precipitazione, centrifugazione, filtropressatura o altre tecnologie note nel settore. Nell?esempio sperimentale fornito nel seguito, la separazione ? stata effettuata mediante filtrazione sottovuoto utilizzando comune vetreria da laboratorio e filtri di carta. After the extraction step, the solid phase of the matrix is separated and removed, while the alcoholic phase, containing the polyamines, is collected. The separation of the phases also occurs spontaneously, but the liquid phase can? be effectively separated by filtration, precipitation, centrifugation, filter pressing or other technologies known in the art. In the experimental example provided below, the separation ? was carried out by vacuum filtration using common laboratory glassware and paper filters.
Un passaggio essenziale nel procedimento di estrazione dell?invenzione ? rappresentato dalla separazione selettiva delle poliammine contenute nell?estratto alcolico ottenuto. Aggiungendo una quantit? opportuna di reagente acido all?estratto alcolico, le poliammine vengono convertite in sali, che sono estremamente meno solubili nell?alcool, e che quindi si separano spontaneamente per precipitazione o cristallizzazione. Qualunque acido potrebbe essere usato per condurre questa reazione (a titolo di esempio si citano acido solforico, acido fosforico, acido cloridrico, acido ossalico, acido citrico, acido carbonico, acido acetico, acido malico). Tuttavia sono preferibili acidi con buona solubilit? in alcol etilico e/o propilico, acidi edibili o comunque ammessi nelle lavorazioni alimentari, cos? come sono maggiormente indicati acidi che rilasciano controioni noti per formare sali scarsamente solubili (quali ad esempio solfati, fosfati, ossalati, carbonati). Nel processo riportato come esempio sperimentale ? stato scelto acido fosforico come candidato ottimale; questo acido risponde infatti ai requisiti sopracitati ed inoltre ? non volatile, ? economico, ? facilmente reperibile e dimostra i migliori risultati in termini di resa di cristallizzazione. La quantit? di acido richiesta dipende da diversi fattori, come ad esempio la base selezionata per le fasi precedenti, il volume di etanolo o propanolo utilizzato, la forza dell?acido, ecc., ma in generale dovrebbe essere sufficiente a neutralizzare tutta l?alcalinit? della soluzione di estrazione e abbassare il pH fino a valori acidi, preferenzialmente sotto pH 5,5. I migliori risultati sono stati ottenuti per valori di pH = 3,5. Nell?esempio riportato vengono utilizzati 2,5 ml di acido fosforico (85 % di purezza) per ogni litro di estratto alcolico. An essential step in the extraction process of the invention ? represented by the selective separation of the polyamines contained in the alcoholic extract obtained. By adding a quantity If an acid reagent is added to the alcoholic extract, the polyamines are converted into salts, which are extremely less soluble in alcohol, and which then separate spontaneously by precipitation or crystallization. Any acid could be used to carry out this reaction (by way of example sulfuric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, oxalic acid, citric acid, carbonic acid, acetic acid, malic acid are cited). However, are acids with good solubility preferable? in ethyl and/or propyl alcohol, edible acids or otherwise permitted in food processing, so? as more indicated are acids which release counterions known to form poorly soluble salts (such as for example sulphates, phosphates, oxalates, carbonates). In the process reported as an experimental example ? phosphoric acid was selected as an optimal candidate; in fact, this acid meets the above requirements and also ? non-volatile, ? economic, ? readily available and demonstrates the best results in terms of crystallization yield. The quantity? of acid required depends on several factors, such as for example the base selected for the previous phases, the volume of ethanol or propanol used, the strength of the acid, etc., but in general it should be sufficient to neutralize all the alkalinity? of the extraction solution and lower the pH to acidic values, preferably below pH 5.5. The best results were obtained for pH values = 3.5. In the example shown, 2.5 ml of phosphoric acid (85% purity) are used for each liter of alcoholic extract.
Immediatamente, all?aggiunta dell?acido, si osserva formazione di opalescenza dovuta alla precipitazione dei sali di poliammine insolubili. ? preferibile lasciare la soluzione a riposo per un tempo sufficiente a permettere la completa precipitazione dei sali (ad esempio circa 24 ore). In talune condizioni, quali quelle descritte nell?esempio sperimentale, i sali di poliammine si riarrangiano formando cristalli macroscopici, pi? facili da raccogliere. I sali di poliammine cos? ottenuti possono essere separati dalla soluzione alcolica e quindi recuperati tramite filtrazione, decantazione, centrifugazione, drenaggio, o altre tecniche note nel settore. Questo ultimo passaggio si dimostra estremamente vantaggioso in quanto permette di ricavare l?attivo di interesse senza dover gestire tutte le altre sostanze estraibili portate in soluzione. Ad esempio, per ottenere un estratto solido, questo passaggio evita di dover ricorrere a tecniche di concentrazione ed essiccazione dell?estratto liquido estremamente lunghe, complesse ed energivore (sono necessari pi? di 0,7 kWh per evaporare 1 litro di acqua pura, ma, nel caso di un estratto vegetale l?energia richiesta sarebbe ancora maggiore). Si evitano inoltre problematiche legate alla lavorazione di miscele che via via che si vanno a concentrare diventano melasse viscose e igroscopiche. In ultimo, questo passaggio garantisce di ottenere un titolo di attivo estremamente pi? elevato, dato che questo non sar? diluito in tutte le altre sostanze estratte. Immediately, upon addition of the acid, opalescence formation is observed due to the precipitation of insoluble polyamine salts. ? it is preferable to leave the solution at rest for a sufficient time to allow the complete precipitation of the salts (for example about 24 hours). Under certain conditions, such as those described in the experimental example, the polyamine salts rearrange themselves forming macroscopic crystals, more? easy to collect. The salts of polyamines cos? obtained can be separated from the alcoholic solution and then recovered by filtration, decantation, centrifugation, drainage, or other techniques known in the sector. This last step proves to be extremely advantageous as it allows the active ingredient of interest to be obtained without having to manage all the other extractable substances brought into solution. For example, to obtain a solid extract, this step avoids having to resort to extremely long, complex and energy-intensive concentration and drying techniques of the liquid extract (more than 0.7 kWh are needed to evaporate 1 liter of pure water, but , in the case of a plant extract the energy required would be even greater). Furthermore, problems related to the processing of mixtures which gradually become viscous and hygroscopic molasses are avoided. Ultimately, this step ensures that you obtain an extremely more active title. high, since this will not be? diluted in all other extracted substances.
Dalle condizioni riportate negli esempi sperimentali su germe di grano si ottiene una resa media in peso dell?1% (da 1 kg di germe si raccolgono quasi 10 g di cristalli) e un titolo in spermidina nei cristalli del 7-11 % in peso. From the conditions reported in the experimental examples on wheat germ, an average yield by weight of 1% is obtained (almost 10 g of crystals are collected from 1 kg of germ) and a spermidine titre in the crystals of 7-11% by weight.
Pertanto, nell?ambito dell?invenzione rientra una composizione di poliammine da germe di grano, dette poliammine includendo spermidina ed eventualmente spermina, in cui la composizione presenta un titolo in spermidina di almeno il 7% in peso, preferibilmente compreso fra il 7% e l?11% in peso. Therefore, the scope of the invention includes a composition of polyamines from wheat germ, called polyamines including spermidine and optionally spermine, wherein the composition has a spermidine content of at least 7% by weight, preferably between 7% and 1 ?11% by weight.
I vantaggi osservati col procedimento della presente invenzione rispetto ai procedimenti di estrazione descritti nello stato della tecnica sono riassunti qui di seguito. The advantages observed with the process of the present invention over the extraction processes described in the state of the art are summarized below.
Innanzitutto, ? stato possibile scalare il processo industrialmente (scala 50 kg), ottenendo risultati in linea con i dati di laboratorio. First of all, ? it was possible to scale the process industrially (50 kg scale), obtaining results in line with laboratory data.
In confronto ai metodi noti o ai prodotti disponibili identificati sul mercato, il procedimento dell?invenzione permette di ottenere un titolo in principio attivo nettamente superiore: si ? ottenuto dalla lavorazione di germe di grano un titolo di principio attivo medio del 10 % in peso, contro uno 0,15 % in peso garantito da altri produttori o lo 0,5 %-0,6 % massimo citato fra gli esempi di US2014/0378708 A1. Va inoltre sottolineato che il titolo di principio attivo medio del 10 % ottenuto col procedimento dell?invenzione ? riferito alla sola spermidina, mentre i valori riportati negli esempi di US2014/0378708 A1 considerano il totale delle poliammine. Compared to the known methods or to the available products identified on the market, the process of the invention allows to obtain a much higher titre in active ingredient: yes? obtained from the processing of wheat germ an average active ingredient content of 10% by weight, against a 0.15% by weight guaranteed by other manufacturers or the maximum 0.5%-0.6% cited among the examples of US2014/ 0378708 A1. It should also be emphasized that the average active principle titre of 10% obtained with the process of the invention ? referred to spermidine alone, while the values reported in the examples of US2014/0378708 A1 consider the total of polyamines.
Col procedimento di estrazione dell?invenzione, inoltre, non sono richieste tecniche di concentrazione/essiccazione estremamente energivore. Furthermore, with the extraction process of the invention, extremely energy-intensive concentration/drying techniques are not required.
Una volta separati i cristalli di poliammine, il liquido alcolico di estrazione ottenuto col procedimento dell?invenzione pu? essere recuperato per distillazione e riutilizzato per ulteriori cicli di estrazione. Inoltre, il residuo solido che ne rimane contiene potenzialmente altri estratti di interesse commerciale. Once the polyamine crystals have been separated, the alcoholic extraction liquid obtained with the process of the invention can be recovered by distillation and reused for further extraction cycles. Furthermore, the remaining solid residue potentially contains other extracts of commercial interest.
Lavorando con una soluzione alcolica basica, le fasi di filtrazione sono molto semplificate rispetto a soluzioni acquose acide, dato che i carboidrati spesso presenti nelle matrici naturali in queste condizioni non formano fasi gel (dette mucillagini). Working with a basic alcoholic solution, the filtration phases are much simplified compared to acidic aqueous solutions, given that the carbohydrates often present in the natural matrices in these conditions do not form gel phases (called mucilages).
Non si ottiene una concentrazione di eventuali contaminanti presenti nella matrice di estrazione. A concentration of any contaminants present in the extraction matrix is not obtained.
Gli esempi sperimentali che seguono sono forniti a puro titolo illustrativo e non limitativo della portata dell?invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni. The following experimental examples are provided purely by way of illustration and not as a limitation of the scope of the invention as defined in the annexed claims.
ESEMPIO 1 EXAMPLE 1
Il processo estrattivo ? stato eseguito su un quantitativo di germe di grano in scala di laboratorio. The extraction process? was performed on a laboratory-scale quantity of wheat germ.
Per 100 grammi di germe di grano, si ? applicata la seguente procedura: For 100 grams of wheat germ, yes? applied the following procedure:
? Macinazione ? Grinding
? aggiunta di 2 g di Ca(OH)2 e 65 ml di acqua e miscelazione per 15 minuti. ? addition of 2 g of Ca(OH)2 and 65 ml of water and mixing for 15 minutes.
? Aggiunta di 1,2 litri di alcol Etilico 98 %, 1 ora in miscelazione meccanica ? Addition of 1.2 liters of 98% ethyl alcohol, 1 hour in mechanical mixing
? Filtrazione e rimozione del solido (si ottiene circa 1 litro di estratto alcolico) ? Filtration and removal of the solid (about 1 liter of alcoholic extract is obtained)
? Aggiunta all?estratto alcolico di 2,5 ml di H3PO4 (85 % purezza) ? Addition to the alcoholic extract of 2.5 ml of H3PO4 (85% purity)
? sedimentazione di 18 ore ? 18 hour sedimentation
? raccolta dei cristalli tramite filtrazione ? resa ottenuta = 1,1 % in peso (1,1 g di cristalli da 100 g di germe di grano) ? collection of crystals by filtration ? yield obtained = 1.1% by weight (1.1 g of crystals from 100 g of wheat germ)
? Titolo di purezza dei cristalli ottenuto (sola spermidina) 7,4 % ? Crystal purity titre obtained (spermidine only) 7.4 %
ESEMPIO 2 EXAMPLE 2
Il processo estrattivo ? stato eseguito su un lotto di 50 kg di germe di grano su cui sono stati riscontrati i seguenti pesticidi: Ciproconazolo 0,007 ? 0,003 mg/kg, Clorpirifos 0,008 ? 0,003 mg/kg, Difenilammina (tracce), Piperonil butossido 0,112? 0,047 mg/kg, Pirimifos metile 0,178 ? 0,075 mg/kg, Tebuconazolo 0,035 ? 0,015 mg/kg. L?analisi multiresiduale svolta sui cristalli di estratto dallo stesso lotto non ha evidenziato la permanenza di alcun composto. The extraction process? was performed on a 50 kg batch of wheat germ on which the following pesticides were found: Ciproconazole 0.007 ? 0.003 mg/kg, Chlorpyrifos 0.008 ? 0.003 mg/kg, Diphenylamine (traces), Piperonyl butoxide 0.112? 0.047 mg/kg, Pirimifos methyl 0.178 ? 0.075 mg/kg, Tebuconazole 0.035 ? 0.015mg/kg. The multiresidue analysis carried out on the crystals of the extract from the same batch did not reveal the permanence of any compound.
Sui 50 chilogrammi di germe di grano, ? stata applicata la seguente procedura: On the 50 kilograms of wheat germ, ? the following procedure was applied:
? Macinazione ? Grinding
? aggiunta di 1 kg di Ca(OH)2 e 25 litri di acqua e miscelazione per 30 minuti. ? addition of 1 kg of Ca(OH)2 and 25 liters of water and mixing for 30 minutes.
? Aggiunta di 500 litri di alcol Etilico 95 %, 1 ora in miscelazione meccanica ? Addition of 500 liters of 95% ethyl alcohol, 1 hour in mechanical mixing
? Filtrazione e rimozione del solido ? Filtration and solid removal
? Aggiunta all?estratto alcolico di 1,25 l di H3PO4 (85 % purezza) ? Addition to the alcoholic extract of 1.25 l of H3PO4 (85% purity)
? sedimentazione di 24 ore ? 24 hour sedimentation
? raccolta dei cristalli tramite filtrazione ? resa ottenuta = 0,7 % in peso ? collection of crystals by filtration ? yield obtained = 0.7% by weight
? Titolo di poliammine ottenuto nei cristalli spermidina = 11,1 %, spermina =3,8 % ESEMPIO 3 ? Title of polyamines obtained in the crystals spermidine = 11.1%, spermine =3.8% EXAMPLE 3
Il processo estrattivo ? stato eseguito su un quantitativo di fave di soia in scala di laboratorio. The extraction process? was performed on a laboratory-scale quantity of soybeans.
Per 50 grammi di fave di soia macinate, si sono applicate le seguenti procedure: For 50 grams of ground soybeans, the following procedures were applied:
? Macinazione ? Grinding
? aggiunta di 1 g di Ca(OH)2 e 25 ml di acqua e miscelazione per 15 minuti. ? addition of 1 g of Ca(OH)2 and 25 ml of water and mixing for 15 minutes.
? Aggiunta di 0,6 litri di alcol Etilico 98 %, 1 ora in miscelazione meccanica ? Addition of 0.6 liters of 98% ethyl alcohol, 1 hour in mechanical mixing
? Filtrazione e rimozione del solido (si ottengono circa 0,5 litri di estratto alcolico) ? Aggiunta all?estratto alcolico di 1,25 ml di H3PO4 (85 % purezza) ? Filtration and removal of the solid (about 0.5 liters of alcoholic extract are obtained) ? Addition to the alcoholic extract of 1.25 ml of H3PO4 (85% purity)
? sedimentazione di 20 ore ? 20 hour sedimentation
? raccolta dei cristalli tramite filtrazione ? resa ottenuta = 1,25 % in peso (0,62 g di cristalli da 50 g di soia) ? collection of crystals by filtration ? yield obtained = 1.25% by weight (0.62 g of crystals from 50 g of soy)
? Titolo di purezza dei cristalli ottenuto (sola spermidina) 1,3 % ? Crystal purity titre obtained (spermidine only) 1.3 %
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| US8906653B2 (en) * | 2008-01-23 | 2014-12-09 | Basf Se | Method for fermentatively producing 1,5-diaminopentane |
| US20140378708A1 (en) | 2011-10-04 | 2014-12-25 | Toyobo Co., Ltd. | Method for producing polyamine composition from plant |
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Patent Citations (2)
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