IT202000021559A1 - Dosaggio ottimizzato di proteine via smartphone o altro dispositivo economico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Dell?invenzione avente per TITOLO: ?Dosaggio ottimizzato di proteine via smartphone o altro dispositivo economico?
FINALITA?
L?invenzione ha i seguenti obiettivi:
- ottenere misurazioni precise della concentrazione di una proteina, una molecola o un epitopo (porzione molecolare dotata di una precisa struttura o pool di strutture (per es. se da NMR) particolari in campioni biologici.
-abbattere i costi per la rilevazione di analiti.
-rendere possibile l?autotest a casa dei pazienti mediante anticorpi.
STATO DELLA TECNICA
Le tecniche che si avvalgono dei fenomeni di risonanza plasmonica di superficie possono essere di tipo spettrofotometrico UV-VIS e Raman. Fermo restando un picco dello spettro di assorbimento dipendente dalla struttura e dalle dimensioni di nanoparticelle di specifici materiali (Au, Ag, Pd, Cu etc.) ? possibile misurare uno shift del picco spettrale mediante spettrofotometria. Tale shift si rileva in concomitanza con l?adsorbimento di molecole sulla superficie del metallo (1, 2)). Le nanoparticelle possono essere anche immobilizzate su di una superficie. Il che ha permesso lo sviluppo di sensori basati su fibra ottica (sulla cui sezione sono immobilizzate le nanoparticelle (3). Esistono comunque gi? sensori economici basati su smartphone (sia come detector che come fonte luminosa monocromatica), che si basano sulla rilevazione della riduzione dell?intensit? della luce incidente su una superficie ricoperta da nanoparticelle (4). Tale metodo di rilevazione ? essenzialmente lo stesso della tecnologia BIAcore, che determina anche un angolo di deviazione della luce (5).
DESCRIZIONE
La tecnica descritta in questo documento si basa sulla rilevazione del wavelenght-shift di nanoparticelle di metalli nobili (Au, Ag) con eventuale core ferromagnetico in sospensione oppure nanoparticelle di metalli nobili (Au, Ag) adese ad una superficie. La struttura dell?apparato ? composta da una o pi? fonti di luce monocromatica come dei diodi led o dei diodi laser. La luce nelle lunghezze d?onda prescelte, passando per il campione incubato con nanoparticelle, genera una serie di valori di assorbanza. Si ha quindi a disposizione una serie di punti (A1,A..,An) per cui passa lo spettro di assorbanza delle nanoparticelle. Registrando ancora le assorbanze in istanti successivi, ? possibile avere un nuovo set di assorbanze (B1,B?,Bn) e cos? via per gli istanti successivi. Al termine dell?incubazione, quando non vi sono variazioni significative di assorbanza, sar? possibile effettuare un?operazione di correlazione di ogni pool con il pool di riferimento. La curva dei valori di correlazione contro il tempo determiner? lo stato del legame dell?analita alle nanoparticelle ed anche il livello di saturazione. Il vantaggio risulta nella possibilit? di utilizzare pi? lunghezze d?onda (anche in serie temporizzate), anche con poche parti elettroniche, terminanti in un?uscita analogica (ad es. jack) da collegare anche ad un dispositivo smartphone. E? attendibile anche una minore preparazione del campione rispetto ai metodi presenti nell?arte, specialmente in caso di particelle in sospensione.
Dettagliatamente, le nanoparticelle in soluzione, prive di ligandi sulla propria superficie mostrano un spettro che viene esemplificato in figura 1.i per un determinato istante iniziale t0. In tale istante, la curva spettrale passa per i punti a, b e c, che individuano l?assorbanza per le lunghezze d?onda A,B e C (maiuscolo). Una volta che dei ligandi si sono legati alle nanoparticelle, sia direttamente che indirettamente (es su molecole esposte in superficie dalle nanoparticelle), la loro sospensione assume uno spettro esemplificato dalla figura 1.ii, in cui la curva spettrale passa nell?istante tn, per i punti d, e, f. Lo spostamento verso destra del punto pi? alto della curva tradizionalmente si misura sull?asse delle ascisse (wavelength) e si misura in nanometri (nm) e si pu? utilizzare per stimare eventi di legame sulla superficie delle nanoparticelle.
Il metodo proposto allo scopo di monitorare la quantit? e la cinetica del legame di un analita, direttamente con le nanoparticelle citate in 1 o con altre molecole leganti situate sulle nanoparticelle e che si compone delle seguenti fasi:
a. Sospensione delle nanoparticelle in un solvente o opportuno buffer, dotato o meno di agenti bloccanti come BSA, plasma, siero o altra composizione.
b. Aggiunta con eventuale agitazione, alle nanoparticelle di una aliquota dello stesso solvente o sistema chimico utilizzato per il campione da analizzare contenente o meno analiti.
c. Misurazione, in un istante t0, dei valori di assorbanza per un numero arbitrario di lunghezze d?onda A, B, C, etc, in modo di ottenere una serie S(t0) di valori VA(t0), VB(t0), VC(t0), Vetc(t0) ordinati in base alla lunghezza d?onda usata, in maniera crescente oppure decrescente (Fig 2. T)
d. Eventualmente, un?agitazione del campione. e. Per un numero arbitrario di istanti tn dopo t0, misurazione delle assorbanze alle lunghezze d?onda A, B, C, etc. ottenendo, per ogni tn, una serie S(tn) di valori di assorbanza VA(tn), VB(tn), VC(tn), Vetc.(tn), come nel punto c e ripetendo il punto d prima di ogni misurazione. (Fig 2 T) f. Per ogni istante tn, calcolare un valore di correlazione tra la serie S(t0) e la serie S(tn), utilizzando a scelta un metodo tra cui quello di Pearson, Spearman o altri metodi.
g. Associare ad ogni istante tn (Fig 2 P), il valore dell?indice di correlazione (Fig2 P) ottenuto in f, ottenendo cos? una o pi? curve. (Fig 2 G).
La correlazione ? un?operazione che serve a determinare quanto simili tra loro siano due serie di dati. I metodi pi? comuni sono quelli di Pearson, Spearman e quelli utilizzati dai principali fogli di calcolo come Microsoft Excel.
La correlazione pu? essere calcolata, ad esempio con la seguente formula:
Il valore ottenuto da questa operazione di correlazione, produce il grafico G per ogni istante del tempo.
Nell?esempio in Fig.2, si mostra il procedimento di calcolo per l?istante tn dell?esperimento E1 nel grafico G. Dunque ? possibile visualizzare la cinetica di legame del ligando alle nanoparticelle, cos? come il raggiungimento di un livello di saturazione della curva della correlazione, che permette di risalire alla concentrazione.
Il vantaggio della presente invenzione ? quello di effettuare velocemente ed economicamente il principale metodo di rilevazione dello spostamento del picco di assorbanza, solitamente effettuato utilizzando uno spettrofotometro per l?analisi multispettrale e che richiede tempo per la misurazione di ogni singola lunghezza d?onda, oltre ad avere una limitata risoluzione in termini di nanometri.
La strumentazione pu? essere molto semplice (Fig.3) e necessitare solamente di:
- Una fonte di una o pi? lunghezze d?onda monocromatiche (1)
- Una o pi? celle trasparente in cui la sospensione di nanoparticelle viene attraversata dalla luce (2).
- Un agitatore (4)
- Un sistema di controllo della temperatura (3)
- Un detector luminoso (5) per rilevare la luce passata attraverso.
- Un trasduttore (6) che trasmette i segnali del detector a un computer interno oppure, in forma analogica o digitale ad un computer esterno (11) o a uno smartphone (8) in forma digitale (usb, 10) o analogica (jack audio, 9).
- Un computer interno in grado di controllare i precedenti elementi (7) e calcolare assorbanza e correlazione.
Claims (8)
1. Un sistema di rilevazione spettrofotometrica che pu? essere formato da:
a. una o un numero discreto di fonti luminose di differenti lunghezze d?onda
b. una cella per l?incubazione l?agitazione, il controllo della temperatura
c. un detector, da utilizzare per la rilevazione di spettri parziali e la loro correlazione nel tempo con uno spettro di controllo in vari momenti nel tempo.
d. Un eventuale computer in grado di controllare e monitorare i precedenti elementi.
e. Un trasduttore in grado di inviare i dati misurati o calcolati dagli altri elementi, come segnale analogico o digitale ad uno smartphone, un personal computer o il computer di cui in d tramite porta usb, jack audio o altra connessione.
2. Un metodo da utilizzarsi con il sistema in 1, allo scopo di monitorare la quantit? e la cinetica del legame di un analita, direttamente con le nanoparticelle citate in 1 o con altre molecole leganti situate sulle nanoparticelle e che si compone delle seguenti fasi:
a. Sospensione delle nanoparticelle in un solvente o opportuno buffer, dotato o meno di agenti bloccanti come BSA, plasma, siero o altra composizione.
b. Aggiunta con eventuale agitazione, alle nanoparticelle di una aliquota dello stesso solvente o sistema chimico utilizzato per il campione da analizzare contenente o meno analiti.
c. Misurazione, in un istante t0, dei valori di assorbanza per un numero arbitrario di lunghezze d?onda A, B, C, etc, in modo di ottenere una serie S(t0) di valori VA(t0), VB(t0), VC(t0), Vetc(t0) ordinati in base alla lunghezza d?onda usata, in maniera crescente oppure decrescente.
d. Eventualmente, un?agitazione del campione. e. Per un numero arbitrario di istanti tn dopo t0, misurazione delle assorbanze alle lunghezze d?onda A, B, C, etc. ottenendo, per ogni tn, una serie S(tn) di valori di assorbanza VA(tn), VB(tn), VC(tn), Vetc.(tn), come nel punto c e ripetendo il punto d prima di ogni misurazione.
f. Per ogni istante tn, calcolare un valore di correlazione tra la serie S(t0) e la serie S(tn), utilizzando a scelta un metodo tra cui quello di Pearson, Spearman o altri metodi.
g. Associare ad ogni istante tn, il valore dell?indice di correlazione ottenuto in f, ottenendo cos? una o pi? curve.
3. Sistema e metodo di cui ai punti 1 e 2, in cui le nanoparticelle in 1 sono immobilizzate su di un supporto trasparente.
4. Sistema e metodo di cui ai punti 1 e 2, in cui le nanoparticelle in 1 hanno diametri compresi tra gli 1 e i 1000 nm.
5. Sistema e metodo di cui ai punti 1 e 2, in cui le nanoparticelle in 1 sono di forma sferica, quasi sferica, bastoncellare, elissoidale oppure triangolare o di altre forme.
6. Sistema e metodo di cui ai punti 1 e 2, in cui le nanoparticelle in 1 possono possedere un guscio metallico ed un nucleo polimerico, di ossido metallico o nonmetallico tipo silice, diossido di titanio, allumina o altri materiali.
7. Sistema e metodo di cui ai punti 1 e 2, in cui le nanoparticelle in 1 possono presentare sulla propria superficie anticorpi monoclonali, policlonali, aptameri ad RNA, DNA, lipidi, polisaccaridi, oppure altre molecole leganti.
8. Sistema e metodo di cui ai punti 1 e 2 in combinazione con un software in grado di effettuare, dirigere ed effettuare le misurazioni e le operazioni di cui al punto 2, comprendente routine di:
a. Controllo dell?agitatore del sistema in 1.
b. Control of temperature as in 1.
c. Produzione di un numero discreto di lunghezze d?onda monocromatiche come specificato in 1 e 2.
d. Lettura delle assorbanze come specificato in 1 e 2.
e. Calcolo dei valori di correlazione come specificato in 1 e 2.
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