IT202000017125A1 - Composto e composizione farmaceutica per l’uso nel metodo di trattamento delle infezioni da citomegalovirus umano - Google Patents

Description

COMPOSTO E COMPOSIZIONE FARMACEUTICA PER L?USO NEL METODO DI TRATTAMENTO DELLE INFEZIONI DA CITOMEGALOVIRUS UMANO.

DESCRIZIONE

La presente invenzione concerne un composto azolico antifungino ed una composizione farmaceutica comprendente tale composto per l?uso come antivirale nel metodo di trattamento delle infezioni da citomegalovirus umano.

STATO DELL?ARTE

Il citomegalovirus umano (HCMV) ? un beta-herpesvirus ubiquitario che infetta dal 60% all?80% della popolazione umana in tutto il mondo.

Sebbene HCMV causi raramente l?esordio di malattie sintomatiche in individui immunocompetenti, esso ? comunque responsabile di una variet? di gravi malattie nei pazienti immunodepressi.

Inoltre, una volta contratto, HCMV rimane latente all?interno dell?organismo per tutta la durata della vita e pu? riattivarsi in caso di indebolimento del sistema immunitario, anche in pazienti sani (Griffiths P et al., J Pathol 2015).

HCMV ? poi un patogeno opportunista, responsabile di patologie come ad esempio polmonite, malattie gastrointestinali e retiniti, in pazienti con immunodepressione primaria o secondaria.

Oltre a ci?, HCMV rappresenta la principale causa di difetti congeniti, anche gravi, nei neonati, quali sordit? e disturbi al sistema nervoso centrale (Britt WJ et al., Viruses 2018).

HCMV ? infatti trasmissibile dalla madre al feto durante la gravidanza. Inoltre, ? stato suggerito che HCMV possa rappresentare un cofattore per l?esordio di patologie vascolari e di immunosenescenza (Klenerman P et al., Nat Rev Immunol 2016).

Ad oggi non sono disponibili vaccini per prevenire le infezioni da HCMV n? farmaci approvati per il trattamento delle infezioni congenite (Manicklal S et al., Clin Microbiol Rev 2013).

Svantaggiosamente inoltre, negli ultimi anni la cura delle infezioni da HCMV ? stata ulteriormente complicata dall'emergere di ceppi di HCMV resistenti ai farmaci normalmente in uso (Meesing A et al., Drugs 2018).

Ad oggi, solo alcuni agenti antivirali sono approvati per l?uso contro HCMV: ganciclovir (GCV), il suo profarmaco valganciclovir, foscarnet (FOS), aciclovir, il suo profarmaco valaciclovir, cidofovir (CDV), ed il pi? recente letermovir (Mercorelli B et al., Rev Med Virol 2008).

I target dei suddetti agenti antivirali sono essenzialmente le proteine codificate dal virus, in particolare la DNA polimerasi e la terminasi virale (Britt WJ et al., Antiv Res 2018).

Nel dettaglio, GCV, il farmaco anti-HCMV maggiormente utilizzato, e CDV sono analoghi nucleosidici che funzionano come terminatori della sintesi di DNA, mentre FOS inibisce la DNA polimerasi di HCMV mimando la struttura del pirofosfato, un sottoprodotto della reazione di polimerizzazione.

La scoperta di tali agenti antivirali ha contribuito al miglioramento nella gestione della terapia anti-HCMV, tuttavia, i suddetti composti presentano alcuni limiti come, ad esempio, una bassa biodisponibilit?, una tossicit? non trascurabile ed un?efficacia limitata (Mercorelli B et al., Rev Med Virol 2008).

Inoltre, avendo tali farmaci anti-HCMV lo stesso meccanismo d?azione, la comparsa di ceppi virali resistenti ai farmaci, indicata poc?anzi, risulta sempre pi? un problema crescente nella gestione delle malattie da HCMV.

Ancora svantaggiosamente, i ceppi di virus mutanti resistenti a un farmaco spesso manifestano anche resistenza crociata nei confronti di altri farmaci (Villarreal EC et al., Prog Drug Res 2003).

? dunque necessario identificare nuovi composti anti-HCMV che presentino un buon profilo di sicurezza, miglior profilo farmacocinetico rispetto ai farmaci noti in uso e, inoltre, che siano diretti contro target diversi dalla DNA polimerasi virale.

In particolare, esiste la necessit? di nuove composizioni e formulazioni farmaceutiche con una o pi? caratteristiche migliorate rispetto alle composizioni e formulazioni attualmente a disposizione. ? dunque scopo della presente invenzione fornire un nuovo composto ad azione antivirale per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione delle infezioni causate da HCMV.

? inoltre scopo della presente invenzione, che tale composto interagisca con un target differente rispetto ai target dei composti antivirali noti, in modo da fornire un farmaco con un meccanismo d?azione alternativo a quelli noti per la cura e/o prevenzione delle infezioni da HCMV.

? ancora scopo della presente invenzione, che l?uso di tale composto da parte di un soggetto per il trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV non comporti l?insorgenza di ceppi HCMV resistenti a tale composto.

In pi?, ? scopo della presente invenzione che l?uso di tale composto o di una composizione/formulazione farmaceutica comprendente tale composto presenti minori effetti collaterali, rispetto ai medicinali antivirali noti.

Gli scopi detti sono raggiunti dall?uso di un composto azolico antifungino come antivirale nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da citomegalovirus umano, in accordo con la rivendicazione principale.

Gli scopi sono inoltre raggiunti da una formulazione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di tale composto ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile per l?uso come antivirale nel metodo di trattamento e/o di prevenzione delle infezioni da HCMV, in accordo con la rivendicazione 12.

Gli scopi sono ulteriormente raggiunti da una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione del suddetto composto e uno o pi? agenti antivirali ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, inoltre, dall?uso di tale composizione farmaceutica come medicinale, in accordo rispettivamente alle rivendicazioni 13 e 17.

Ulteriori caratteristiche dell?invenzione vengono descritte nelle rivendicazioni dipendenti.

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione saranno evidenti dalla descrizione dettagliata di seguito riportata, e dagli esempi realizzativi forniti a titolo illustrativo e non limitativo.

DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE

Gli inventori della presente invenzione hanno analizzato approfonditamente il meccanismo di replicazione di HCMV nelle cellule umane e le vie metaboliche dell?ospite sfruttate dal virus per ottenere una replicazione efficiente delle particelle virali.

In particolare, lo studio dei pathways cellulari dell?organismo ospite che il virus sfrutta per la propria replicazione rappresenta un'alternativa o un approccio aggiuntivo per l?identificazione di composti ad azione specifica verso tali pathways al fine di trattare le malattie associate all'infezione da HCMV (Munger J et al., Nat Biotechnol 2008), oltre a permettere il superamento dei problemi di resistenza virale.

A tal proposito, gli inventori hanno condotto un?analisi meticolosa sull?utilizzo di composti e farmaci gi? noti per l'identificazione delle vie e dei fattori dell'ospite che svolgono un ruolo durante la replicazione virale di HCMV.

In particolare, ? stato realizzato uno screening massivo sull?azione di farmaci noti nei confronti di HCMV e diversi studi di follow-up in caso di accertata azione antivirale, al fine di identificare nuovi composti e target per il trattamento delle infezioni virali da HCMV.

? stato sorprendentemente individuato che alcuni composti azolici a nota attivit? antifungina presentano anche un?azione antivirale nei confronti di HCMV.

Con il termine ?azoli? si intendono quei composti organici aventi almeno un anello pentatomico N-eterociclico contenente due atomi di azoto, gli imidazoli, oppure tre atomi di azoto, i triazoli.

Tali composti azolici antifungini comprendono in particolare i composti triazolici posaconazolo (PCZ), isavuconazolo (ICZ), itraconazolo (ITZ), fluconazolo (FCZ) e voriconazolo (VCZ), e i composti imidazolici miconazolo (MCZ), ketoconazolo (KTZ), clotrimazolo (CTZ) ed econazolo (ECZ).

I suddetti composti sono noti possedere attivit? antifungina nei confronti di un ampio spettro di funghi patogeni quali ad esempio C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. neoformans, Coccidioides, Histoplasma capsulatum, Aspergillus e altri.

In particolare, ? stato individuato che alcuni composti antifungini a struttura triazolica possiedono elevata attivit? antivirale, come mostrato dai dati delle tabelle 1, 2, e 3.

Preferibilmente, tali composti triazolici sono selezionati nel gruppo comprendente posaconazolo, isavuconazolo, itraconazolo, fluconazolo e voriconazolo.

Tra tali composti triazolici, PCZ e ICZ hanno dimostrato possedere la maggiore attivit? antivirale nei confronti di HCMV.

Tali composti sono stati dunque analizzati pi? nel dettaglio al fine di identificare il loro meccanismo d?azione nei confronti del virus.

? stato individuato che l?attivit? antivirale dei composti azolici antifungini si basa sull?inibizione dell?enzima umano citocromo P450 51 (chiamato anche hCYP51 oppure lanosterolo-14?-demetilasi).

Il citocromo P450 ? uno dei citocromi pi? conservati tra gli organismi viventi, oltre ad essere l?unico enzima che catalizza la demetilazione del lanosterolo (Lepesheva GI et al., Biochim Biophys 2007) durante la colesterologenesi e la sintesi degli steroli essenziali regolatori della meiosi cellulare (Debeljak N et al., Arch Biochem Biophys 2003).

L?enzima fungino CYP51 rappresenta il target noto di PCZ e ICZ durante il trattamento delle infezioni micotiche.

Sorprendentemente, gli inventori della presente invenzione hanno scoperto che i composti triazolici interferiscono con l?enzima umano CYP51 inibendo la replicazione di HCMV.

Ulteriormente, ? stato scoperto che l?inibizione del hCYP51 ad opera dei composti azolici PCZ e ICZ causa una diminuzione della carica virale di HCMV, a favore dell?ipotesi che il virus sfrutti tale enzima umano per la propria replicazione.

I composti azolici della presente invenzione rappresentano dunque un nuovo e alternativo strumento terapeutico per la cura e la prevenzione delle infezioni causate da HCMV.

Ulteriormente, essendo il target di tali composti un enzima umano, cio? un enzima dell?organismo ospite, l?uso di tali composti nel metodo di trattamento delle infezioni da HCMV permette di superare i problemi di resistenza virale degli agenti antivirali di tipo noto.

? dunque un oggetto della presente invenzione un composto azolico antifungino o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un suo profarmaco per l?uso come antivirale nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV.

Con il termine ?sale farmaceuticamente accettabile? si intende un sale del suddetto composto azolico antifungino preparato con acidi o basi, organici o inorganici, non tossici, farmaceuticamente accettabili.

Con il termine ?profarmaco? si definisce un composto precursore del suddetto composto azolico che non ? dotato di una sua intrinseca attivit? farmacologica, oppure la cui attivit? farmacologica non ? sufficiente ma che, una volta introdotto nell?organismo, subisce una o pi? biotrasformazioni di tipo chimico o enzimatico che lo trasformano nel composto farmacologicamente attivo.

Un esempio da non considerarsi limitativo di tale profarmaco ? il composto isavuconazonio solfato, profarmaco del composto azolico ICZ.

I composti azolici antifungini testati dagli inventori per la loro capacit? anti-HCMV sono stati i composti posaconazolo, isavuconazolo, itraconazolo, fluconazolo, voriconazolo, miconazolo, ketoconazolo, clotrimazolo ed econazolo.

L?attivit? antivirale di tali composti ? stata valutata mediante saggi di riduzione delle placche (PRA), come riportato negli esempi 2.1, 2.2.1 e 2.2.2.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto azolico ? scelto tra i composti antifungini triazolici.

In particolare, secondo l?invenzione il composto azolico interferisce con l?enzima hCYP51 per inibire la replicazione di HCMV.

Preferibilmente, il suddetto composto ? selezionato nel gruppo comprendente PCZ, ICZ, ITZ, FCZ e VCZ.

Dalle analisi riportate successivamente, i composti che hanno dimostrato possedere una maggiore azione anti-HCMV sono i composti PCZ e ICZ, con una EC50 pari rispettivamente a circa 3,3 ?M e 7 ?M, come mostrato nelle tabelle 1 e 3.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto azolico antifungino per l?uso nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV ? scelto tra PCZ e ICZ.

Secondo un altro aspetto della presente invenzione, il composto azolico antifungino per l?uso nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV ? PCZ.

Come mostrato dal grafico di fig. 1A, vantaggiosamente PCZ possiede un?azione inibitoria della replicazione virale di HCMV del tipo dose-dipendente.

Al fine di valutare se l?attivit? antivirale di PCZ ? dovuta alla sua citotossicit?, ? stata inoltre determinata la citotossicit? di PCZ nei confronti di cellule HFF con il metodo del 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyl tetrazolio bromuro (MTT, Sigma), come riportato nell?esempio 1.3.

Vantaggiosamente, l?attivit? antivirale di PCZ non ? dovuta ad un?azione citotossica, come riportato dai risultati mostrati in tabella 1. Non sono infatti stati riscontrati effetti tossici di PCZ sulla vitalit? cellulare con concentrazioni fino a 250 ?M.

Al fine di valutare lo spettro dell?attivit? antivirale di PCZ, tale composto ? stato inoltre testato su tre differenti ceppi virali di HCMV isolati da campioni clinici (TB40-UL32-EGFP, VR1814 e 388438U), secondo quanto riportato nell?esempio 2.2.1.

Vantaggiosamente, l?attivit? antivirale di PCZ ? indipendente dal tipo di ceppo HCMV target, infatti il valore di EC50 calcolata ? risultata comparabile tra i diversi ceppi, come mostrato in tabella 2.

Ancora vantaggiosamente, PCZ possiede attivit? antivirale nei confronti anche di ceppi HCMV resistenti a farmaci antivirali attualmente in uso come mostrato dai risultati dell?esempio 2.2.1.

In particolare, PCZ ? attivo contro ceppi virali presentanti mutazioni nel gene UL54, noti per essere ceppi di HCMV resistenti a ganciclovir (ceppo 759<r>D100), a ganciclovir e cidofovir (ceppo GDG<r>P53) e a foscarnet e aciclovir (ceppo PFA<r>D100).

PCZ rappresenta dunque uno strumento terapeutico alternativo per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da ceppi di HCMV resistenti ai farmaci noti.

Ancora vantaggiosamente, l?azione antivirale di PCZ nei confronti di HCMV non ? dipendente dalla linea cellulare, infatti, come evidenziato dai risultati mostrati in tabella 2, i valori di EC50 misurati in cellule epiteliali (4,2 ?M), in cellule endoteliali (4,8 ?M) e in fibroblasti (3,7 ?M) sono tra loro comparabili.

Ulteriormente, tali valori di EC50 sono stati determinati con un ceppo di HCMV naturalmente resistente ai farmaci antivirali ganciclovir e cidofovir (ceppo TR), ad ulteriore conferma dell?attivit? antivirale di PCZ nei confronti di ceppi di HCMV resistenti a farmaci inibitori della DNA polimerasi.

Ancora vantaggiosamente, il trattamento delle cellule con PCZ riduce significativamente l?infettivit? della progenie virale di HCMV, con un aumento del rapporto particelle virali/PFU di circa 7-10 volte rispetto alle cellule controllo infettate con HCMV e trattate con DMSO, come mostrato in figura 5B.

Secondo un altro aspetto della presente invenzione, il composto azolico antifungino per l?uso nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV ? ICZ.

Vantaggiosamente, ICZ ha dimostrato possedere un?azione inibitoria contro la replicazione di diversi ceppi di HCMV in cellule HFF, inclusi isolati clinici e ceppi resistenti ai farmaci antivirali attualmente in uso in terapia.

Come visibile dai risultati delle analisi riportate successivamente in tabella 3, ICZ presenta una EC50 di circa 7 ?M calcolata in cellule HFF infettate con HCMV AD169.

Al fine di valutare lo spettro dell?attivit? antivirale di ICZ, tale composto ? stato inoltre testato contro differenti ceppi virali di HCMV, due dei quali erano stati isolati da campioni clinici (TB40-UL32-EGFP e VR1814), secondo quanto riportato nell?esempio 2.2.2.

Vantaggiosamente, l?attivit? antivirale di ICZ ? indipendente dal ceppo di HCMV utilizzato, infatti il valore di EC50 calcolata ? risultata comparabile tra i diversi ceppi, come mostrato in tabella 3.

In particolare, ICZ possiede attivit? antivirale nei confronti di ceppi HCMV isolati da campioni clinici (TB40-UL32-EGFP e VR1814).

Ancora vantaggiosamente, ICZ ? attivo contro i ceppi virali resistenti a ganciclovir e cidofovir (ceppo GDG<r>P53) e a foscarnet e aciclovir (ceppo PFA<r>D100).

ICZ rappresenta dunque un farmaco alternativo per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da ceppi di HCMV, in particolare causate da ceppi resistenti ai farmaci noti.

Secondo l?invenzione, il composto azolico antifungino ? utilizzato nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV.

Secondo un aspetto dell?invenzione, tale metodo di trattamento e/o prevenzione prevede di somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace del suddetto composto.

Con il termine ?somministrare? si intende l?introduzione del composto azolico antifungino della presente invenzione nell?organismo mediante una qualsiasi via di somministrazione nota.

Tale via di somministrazione comprende a titolo di esempio da non considerarsi limitativo la via orale, sublinguale, buccale, rettale, vaginale, oculare, auricolare, nasale, cutanea topica o sistemica e via transdermica, oppure mediante iniezione intramuscolare, endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intranodale o intrasplenica, mediante inalazione o per nebulizzazione.

Preferibilmente, tale via di somministrazione ? la via orale.

Con il termine ?soggetto? si intende un individuo. Si specifica che, il ?soggetto? pu? includere, ad esempio, animali domestici, come gatti, cani, ecc., bestiame (ad es. bovini, cavalli, suini, pecore, capre, ecc.), animali da laboratorio (ad es. topi, conigli, ratti, porcellini d?India, ecc.), mammiferi, mammiferi non umani, primati, primati non-umani, roditori, uccelli, rettili, anfibi, pesci e qualsiasi altro animale.

Il soggetto ? preferibilmente un mammifero come un primate o un uomo, pi? preferibilmente il soggetto ? un umano.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il soggetto ? un soggetto pediatrico.

Con il termine soggetto pediatrico si intende un individuo di et? compresa tra la nascita e i diciotto anni, come definito nel regolamento (CE) N. 1901/2006.

Con il termine ?quantit? terapeuticamente efficace? si intende la quantit? del composto azolico sufficiente a trattare l?infezione qui intesa di un soggetto, ma sufficientemente bassa da evitare effetti secondari gravi, in un ragionevole rapporto rischio/beneficio, secondo l?intento dei criteri medici.

Tale quantit? terapeuticamente efficace pu? dipendere da diversi fattori quali, a titolo di esempi non limitativi, la via di somministrazione scelta, la severit? della malattia da trattare, l?et?, la statura, il peso e la condizione fisica del soggetto da trattare, la storia medica del soggetto da trattare, la durata del trattamento, la natura di terapie concomitanti, gli effetti terapeutici desiderati.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto azolico antifungino dell?invenzione ? in forma di formulazione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di tale composto azolico o di un suo sale farmaceuticamente accettabile o di un suo profarmaco come definito precedentemente, ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Con il termine "eccipiente farmaceuticamente accettabile" si intende un composto o una sua miscela ottimale per l'utilizzo in una formulazione allestita per il trattamento e/o la prevenzione di una malattia, in particolare delle infezioni da HCMV.

Eccipienti idonei a tale utilizzo sono edulcoranti, diluenti, disaggreganti, glidanti, coloranti, leganti, lubrificanti, stabilizzanti, adsorbenti, conservanti, tensioattivi, umettanti, aromi, ammorbidenti, sostanze filmogene, emulsionanti, bagnanti, ritardanti di rilascio, colloidi, composti non permeanti, conservanti e loro miscele, e altri di per s? noti nel settore farmaceutico.

L?esperto del settore ? in grado di stabilire se e quanto determinati eccipienti farmaceutici possono servire ad una o pi? funzioni in relazione a quanto essi sono presenti nella formulazione, a quali altri eccipienti sono presenti e alla via di somministrazione della formulazione.

Pi? specificatamente, la formulazione farmaceutica della presente invenzione pu? essere formulata in una forma adatta alla somministrazione orale oppure parenterale o topica.

Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione orale sono compresse, capsule, polveri, sciroppi, elisir, sospensioni, soluzioni, emulsioni, bustine e cachets o formulazioni adatte per inalazione come aerosol, soluzioni o polveri.

Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione topica sono crema, unguento, pomata, soluzione, sospensione, collirio, ovulo, aerosol, spray, polvere e gel.

Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione parenterale sono soluzione tampone acquosa e sospensione oleosa. Si specifica che per somministrazione parenterale si intende la somministrazione per via intramuscolare, endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intranodale o intrasplenica.

Preferibilmente, la suddetta formulazione dell?invenzione ? in forma adatta alla somministrazione orale.

Vantaggiosamente, sia PCZ che ICZ sono composti approvati per terapia clinica (come antifungini) per la somministrazione sistemica, in particolare tramite somministrazione orale.

Ancora vantaggiosamente, PCZ e ICZ sono composti azolici utilizzati in terapia anche per l?uso in soggetti pediatrici.

PCZ e ICZ rappresentano dunque dei farmaci anti-HCMV alternativi a quelli noti utilizzabili per il trattamento clinico delle infezioni causate da HCMV in soggetti pediatrici.

Fa parte della presente invenzione anche l?uso di tale formulazione nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV. Vantaggiosamente, i composti azolici della presente invenzione sono farmaci gi? approvati per l?uso nell?uomo come antifungini, a sostegno del fatto che il loro utilizzo come antivirali in forma di formulazioni farmaceutiche presenti una minima tossicit? in vivo.

In particolare, fa parte della presente invenzione l?uso di tale formulazione in una forma adatta alla somministrazione orale nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV.

Ancora, fa parte della presente invenzione, l?uso di tale formulazione nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV in soggetti pediatrici.

Gli inventori hanno sorprendentemente scoperto che la combinazione del composto azolico dell?invenzione, o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un suo profarmaco, e uno o pi? agenti antivirali produce un effetto sinergico nel prevenire e/o trattare la condizione patologica associata all?infezione da HCMV in un soggetto.

Con il termine ?agente antivirale? si intende una qualsiasi molecola o composizione in cui la molecola o la composizione ? utile per curare infezioni virali.

Con il termine ?effetto sinergico? si intende che l?effetto terapeutico di una combinazione comprendente due o pi? agenti ? maggiore dell?effetto terapeutico di un trattamento in cui viene utilizzato un singolo agente da solo. Inoltre, l?effetto sinergico di una combinazione di uno o pi? agenti permette l?utilizzo di un dosaggio pi? basso di uno o pi? degli agenti e/o una somministrazione meno frequente dei suddetti agenti al soggetto. La possibilit? di utilizzare dosaggi pi? bassi di un agente e/o di somministrare il suddetto agente meno frequentemente riduce la tossicit? associata alla somministrazione del suddetto agente a un soggetto senza ridurre l?efficacia del suddetto agente nel prevenire, gestire o curare la malattia o la condizione patologica. Inoltre, un effetto sinergico pu? risultare in una migliore efficacia degli agenti nel prevenire, gestire o curare la malattia o le condizioni patologiche.

Inoltre, l?effetto sinergico di una combinazione di uno o pi? agenti pu? evitare o ridurre effetti collaterali avversi o indesiderati associati all?uso di uno degli agenti da soli.

Secondo un aspetto dell?invenzione dunque, il composto azolico ? utilizzato in un metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV che prevede di somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione del suddetto composto azolico antifungino o di una formulazione farmaceutica come descritta poc?anzi e di un agente antivirale.

Secondo un aspetto dell?invenzione, tale agente antivirale ? selezionato nel gruppo comprendente ganciclovir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, fomivirsen, maribavir, derivati alcossialchilici del cidofovir come esadecilossipropil-cidofovir (CMX001) e analoghi, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hidrossi-2-(fosfonometossi)propil]adenina (HPMPA) come octadecilossietil-HPMPA, esadeciloossipropil-HPMPA e analoghi, derivati alcossialchilici di 1-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]citosina (HPMPC) come octadecilossietilHPMPC, esadecilossipropil-HPMPC e analoghi, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]guanina (HPMPG) come octadecilossietil -HPMPG, esadecilossipropil-HPMPG e analoghi, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]-2,6-diaminopurina (HPMPDAP) come octadecilossietil -HPMPDAP, esadecilossipropil-HPMPDAP e analoghi e derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hydroxy-2-(phosphonomethoxy)propyl]-2-amino-6-ciclopropilaminopurina (HPMP-cPrDAP) come octadecilossietil-HPMP-cPrDAP, esadecilossipropil-HPMP-cPrDAP e analoghi, e letermovir.

Preferibilmente, il suddetto agente antivirale ? un agente inibitore della DNA polimerasi virale o della terminasi virale.

Pi? preferibilmente, il suddetto agente antivirale ? ganciclovir (GCV). ? stato sorprendentemente scoperto che, in presenza del composto azolico antifungino, in particolare in presenza di PCZ, la potenza di GCV nei confronti di HCMV ? circa 10 volte maggiore rispetto ad un trattamento con la sola somministrazione di GCV (EC50 di GCV in presenza di PCZ = 0,13 ?M contro EC50 di GCV in presenza di DMSO = 1,44 ?M, fig. 6).

Vantaggiosamente, PCZ agisce sinergicamente con il ganciclovir, nell?inibire la replicazione di HCMV a concentrazioni che sono inferiori alle loro rispettive EC50 come singoli farmaci e che sono raggiungibili nel plasma di pazienti sottoposti al trattamento con tali farmaci.

Ulteriormente, per valutare l?effetto inibitorio combinato di PCZ e GCV sulla replicazione di HCMV, sono stati effettuati saggi di riduzione delle placche con combinazioni di diverse dosi dei due composti.

Come mostrato dai risultati riportati in tabella 5, la combinazione di PCZ e GCV risulta in un?azione antivirale sinergica in tutte le combinazioni testate.

Infatti, il valore di Combination Index (CI) calcolato mediante metodo Chou & Talalay (Chou TC, Pharmacol Rev 2006) ? risultato essere in tutti i casi <0,9.

Vantaggiosamente, assieme all?effetto sinergico della combinazione del composto azolico e GCV, non ? stata riscontrata alcuna evidente citotossicit?, a favore dell?ipotesi che la riduzione del numero di placche virali sia dovuto alla combinazione dell?azione antivirale di due composti con target e meccanismo di azione differenti.

Ancora vantaggiosamente, oltre alla diminuzione del numero di placche virali, l?uso combinato di PCZ con GCV ha dimostrato diminuire anche le dimensioni delle suddette placche.

Vantaggiosamente, anche per quanto riguarda il composto azolico ICZ, gli esperimenti preliminari di trattamento di cellule infettate con HCMV con GCV da solo e in combinazione con ICZ hanno dimostrato che la combinazione di GCV con ICZ ha un certo effetto sinergico contro la replicazione virale .

Fa dunque parte della presente invenzione anche una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di un composto azolico antifungino o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un suo profarmaco, come definito precedentemente, e uno o pi? agenti antivirali ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Preferibilmente, la composizione farmaceutica dell?invenzione comprende un composto triazolico antifungino come definito precedentemente.

Pi? preferibilmente, tale composto triazolico ? selezionato tra PCZ e ICZ.

Secondo un aspetto della composizione farmaceutica dell?invenzione, il composto triazolico ? PCZ.

Secondo un altro aspetto della composizione farmaceutica dell?invenzione, il suddetto composto triazolico ? ICZ.

Secondo un ulteriore aspetto della composizione farmaceutica dell?invenzione, essa comprende una combinazione di PCZ e ICZ e uno o pi? agenti antivirali ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Secondo un aspetto dell?invenzione, tali uno o pi? agenti antivirali sono selezionati nel gruppo comprendente ganciclovir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, fomivirsen, maribavir, derivati alcossialchilici del cidofovir come esadecilossipropil-cidofovir (CMX001) e analoghi, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hidrossi-2-(fosfonometossi)propil]adenina (HPMPA) come octadecilossietil-HPMPA, esadeciloossipropil-HPMPA e analoghi, derivati alcossialchilici di 1-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]citosina (HPMPC) come octadecilossietil-HPMPC, esadecilossipropil-HPMPC e analoghi, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]guanina (HPMPG) come octadecilossietil -HPMPG, esadecilossipropil-HPMPG e analoghi, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]-2,6-diaminopurina (HPMPDAP) come octadecilossietil -HPMPDAP, esadecilossipropil-HPMPDAP e analoghi e derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hydroxy-2-(phosphonomethoxy)propyl]-2-amino-6-ciclopropilaminopurina

(HPMP-cPrDAP) come octadecilossietil-HPMP-cPrDAP, esadecilossipropil-HPMP-cPrDAP e analoghi, e letermovir.

Preferibilmente, il suddetto agente antivirale ? un agente inibitore della DNA polimerasi virale o della terminasi virale.

Pi? preferibilmente, tali uno o pi? agenti antivirali comprendono ganciclovir.

? oggetto della presente invenzione anche l?uso di tale composizione farmaceutica come medicinale.

Vantaggiosamente, secondo l?invenzione, tale composizione farmaceutica ? usata come antivirale nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV in modo da ottenere i vantaggi citati poc?anzi.

Ancora, fa parte della presente invenzione, l?uso di tale composizione nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da HCMV in soggetti pediatrici.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

- Le figure 1A e 1B mostrano la suscettibilit? di HCMV al trattamento con i composti azolici antifungini PCZ, KTZ, FCZ, ITZ e VCZ. Saggi di riduzione delle placche sono stati effettuati in cellule HFF infettate con HCMV e trattate con dosi differenti dei composti indicati (in concentrazione da 0,1 a 25 ?M) oppure infettate e trattate con GCV come controllo. I trattamenti con PCZ e KTZ mostrano un effetto inibitorio della replicazione del virus HCMV AD169 del tipo dosedipendente (figura 1A).

I trattamenti con FCZ, ITZ e VCZ non hanno mostrato un effetto inibitorio della replicazione virale significativo (figura 1B). ITZ ? stato testato solo fino alla concentrazione di 10 ?M a causa della sua bassa solubilit?. Nei grafici i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di almeno tre esperimenti indipendenti in duplicato;

- la figura 2 mostra che PCZ inibisce in modo dose-dipendente la replicazione di differenti ceppi HCMV, indicati in figura. Saggi di riduzione delle placche sono stati effettuati in cellule HFF infettate con i ceppi HCMV indicati in figura e trattate con PCZ a dosi differenti (in concentrazione da 0,1 a 25 ?M). Nei grafici i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti in duplicato;

- le figure 3A, 3B e 3C mostrano che l?inibizione dell?enzima hCYP51 dell?ospite influenza la replicazione di HCMV. (R)-N-(1-(3,4'-difluoro

[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-(1H-imidazol-1-yl)ethyl)-4-(5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamide (VFV), PCZ e VCZ inibiscono l?attivit? enzimatica dell?enzima hCYP51 purificato (reazione di 2 minuti). Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti in duplicato (figura 3A). Saggi di riduzione delle placche sono stati inoltre effettuati su cellule HFF infettate con i ceppi HCMV AD169 e trattate con VFV inibitore dell?enzima hCYP51 a dosi differenti (in concentrazione da 0,1 a 25 ?M). Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di almeno tre esperimenti indipendenti in duplicato (figura 3B). Inoltre sono stati effettuati saggi di riduzione della progenie virale che mostrano che il trattamento con VFV inibisce in modo dose-dipendente la progenie virale in cellule HFF infettate con HCMV. Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di quattro esperimenti indipendenti in duplicato (figura 3C);

- le figure 4A, 4B e 4C mostrano che l?espressione di hCYP51 viene attivata dall?infezione da HCMV. In figura 4A ? mostrata l?attivazione del promotore dell?enzima hCYP51 in cellule U-373 MG di controllo non infettate (mock) o cellule infettate con HCMV AD169 o infettate con HCMV inattivato mediante radiazioni UV. I dati sono espressi come Relative Luciferase Units (LU/FU, RLU) ossia come unit? di Luciferasi normalizzate per le unit? di fluorescenza ottenute dall?espressione del gene reporter co-trasfettato eGFP. Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti in duplicato. I valori sono stati analizzati statisticamente mediante analisi ANOVA a una via seguita da test di Tukey per la comparazione multipla. ***p?0,0001; ****p<0,0001. In figura 4B sono mostrati i dati relativi all?mRNA di hCYP51 in cellule HFF infettate con HCMV, ottenuti dall?analisi qPCR ai tempi indicati in figura. L?mRNA di UL54 ? stato analizzato ed utilizzato come controllo della progressione dell?infezione a 24 e 48 h p.i. I valori di mRNA sono stati normalizzati rispetto ai valori di GAPDH cellulare e l?espressione genica ? stata riportata come quantificazione relativa (RQ) rispetto al campione controllo (cellule mock per hCYP51 e cellule infettate con HCMV a 24 h p.i. per UL54). Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti in duplicato. In figura 4C ? mostrata l?analisi dell?espressione proteica di hCYP51 e della proteina virale IEA durante la replicazione del virus. La proteina hCYP51 dell?ospite e l?antigene virale IE (IEA) sono stati analizzati mediante Western Blot in cellule HFF non infettate (mock, M) ed in cellule HFF infettate con HCMV a MOI = 0,5 PFU/cell ai tempi post-infezione indicati (h p.i.). La ?-actina ? stata usata come proteina controllo del caricamento. I pesi molecolari sono espressi in kDalton sulla sinistra;

- le figure 5A e 5B mostrano gli effetti dell?inibizione dell?enzima hCYP51 sulla replicazione di HCMV e sull?infettivit? virale. In figura 5A viene mostrato come l?inibizione farmacologica dell?enzima hCYP51 determini una riduzione del numero di genomi virali in cellule HFF infettate con HCMV a MOI di 0,5 PFU/cellula e trattate con 10 ?M PCZ o VFV, o DMSO 0,1% come controllo, per 120 h. Le copie genomiche di HCMV nel surnatante di ogni campione sono state quantificate tramite qPCR. Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti in quadruplicato. I dati sono stati analizzati mediante analisi ANOVA a una via seguita da test di Dunnett per la comparazione multipla. ***p<0,001; **p<0,005 rispetto al controllo (campione infettato e trattato con DMSO). In figura 5B ? mostrato che l?inibizione farmacologica di hCYP51 riduce l?infettivit? delle particelle virali. Il rapporto particella/PFU ? stato ottenuto dividendo il numero di genomi di HCMV determinati nei surnatanti derivati da cellule HFF infettate con HCMV a MOI 0,5 PFU/cellula e trattate con i composti da saggiare (determinato tramite qPCR) con il titolo di particelle virali ottenuto dallo stesso volume di campione (determinato tramite titolazione in nuove cellule HFF). Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di tre esperimenti indipendenti in quadruplicato. I dati sono stati analizzati mediante analisi ANOVA a una via seguita da test di Dunnett per comparazione multipla. *p<0,05; **p<0,005 rispetto al controllo (campione infettato e trattato con DMSO);

- la figura 6 mostra che il trattamento con una dose terapeutica di PCZ aumenta l?attivit? anti-HCMV di GCV. ? mostrata l?attivit? antivirale di GCV contro HCMV ceppo AD169 in assenza (+ DMSO) o in presenza (+ PCZ) di 3 ?M di PCZ, determinata mediante saggio della riduzione delle placche. Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di almeno tre esperimenti indipendenti in duplicato;

- la figura 7 mostra la quantificazione dell?induzione di hCYP51 in cellule HFF infettate con HCMV. ? stata analizzata la sovraespressione della proteina hCYP51 dell?ospite in cellule HFF infettate con HCMV AD169 mediante Western blot e analisi densitometrica condotta con il software ImageJ. Il segnale di hCYP51 ? stato normalizzato rispetto al segnale della proteina ?-actina e riportato in grafico rispetto al campione non trasfettato. Nel grafico i dati rappresentano le medie ? deviazioni standard (barre di errore) di quattro esperimenti indipendenti. I dati sono stati analizzati mediante analisi ANOVA a una via seguita da test di Dunnett per comparazione multipla. ***p=0,0001; ****p<0,0001, rispetto al controllo (cellule mock);

- in figura 8 ? mostrata l?analisi mediante immunofluorescenza di hCYP51 e di proteine virali durante l?infezione da HCMV in cellule vive. La proteina hCYP51 dell?ospite e l?antigene virale IE (IEA) sono stati rilevati mediante immunofluorescenza su cellule HFF non infettate (NI) e cellule HFF infettate con HCMV a MOI = 0,25 PFU/cell ai tempi post-infezione indicati (h p.i.). Draq5 ? stato usato per la colorazione dei nuclei. Le frecce bianche nel pannello delle immagini a 24 e 48 h p.i. indicano i nuclei delle cellule HFF non infettate che si trovano nello stesso campo delle cellule infettate con HCMV. La progressione del ciclo replicativo di HCMV ? confermata dall?aspetto reniforme dei nuclei delle cellule infettate con HCMV a 48h p.i.

Esempi

Gli esempi seguenti vengono riportati al fine di fornire all?esperto del settore una completa pubblicazione e descrizione di come i composti, le composizioni e le formulazioni della presente invenzione sono stati valutati. Tali esempi sono da intendersi puramente esemplificativi e non limitativi.

Esempio 1. Materiali e metodi

Esempio 1.1. Materiali, cellule e virus

Ganciclovir (GCV), foscarnet (FOS), e tutti i composti azolici antifungini utilizzati erano della ditta Sigma-Aldrich. Cidofovir (CDV, Vistide) era della ditta Gilead Sciences. VFV ((R)-N-(1-(3,4'-difluoro-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-(1H-imidazol-1-yl)ethyl)-4-(5-phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl)benzamide) ? stato sintetizzato presso la Vanderbilt University, secondo il metodo riportato in Lepesheva G et al., Tetrahedron Lett 2017. Per i saggi cellulari, uno stock 100X di VFV ? stato preparato in 25% DMSO/34% 2-idrossipropil-?-ciclodestrina (Sigma) in acqua (v/v).

Le cellule Human Foreskin Fibroblast (HFF), ARPE-19, e U-373 MG sono state acquistate dall?American Type Culture Collection (ATCC) e coltivate in Dulbecco modified Eagle?s medium (DMEM) (Life Technologies) addizionato di 10% siero fetale bovino (FBS, Life Technologies), 100 U/ml penicillina, e 100 ?g/ml streptomicina solfato (P/S, Life Technologies).

Le cellule Human dermal microvascular endothelial cells (HMVECs) (CC-2543) sono state acquistate da Clonetics e coltivate in endothelial growth medium (EGM) (Clonetics). Le colture cellulari sono state mantenute a 37?C in atmosfera umidificata addizionata con 5% CO2.

HCMV (ceppo AD169) ? stato acquistato da ATCC. HCMV ceppo TB40E-UL32-EGFP (gentile concessione di C. Sinzger, Universit? di Ulm, Germania) ? stato descritto precedentemente (Sampaio KL et al., J Virol 2005). HCMV ceppo VR1814 (gentile concessione di G. Gerna, IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia) ? stato ottenuto da un da un campione clinico di un?infezione congenita, come descritto in Revello MG et al., J Infect Dis 2001. HCMV ceppo 388438U ? stato isolato da un campione clinico di urina presso l?Unit? Operativa di Microbiologia e Virologia dell?Azienda Ospedaliera dell?Universit? di Padova. I ceppi HCMV resistenti ai farmaci antivirali sono stati ottenuti da NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (Rockville, MD, USA) come descritto precedentemente (Mercorelli B et al., Antimicrob Agents Chemother 2009). HCMV TR ? stato ricostituito mediante trasfezione in cellule HFF con il corrispondente TR-BAC preparato dal ceppo clinico TR resistente a GCV e CDV isolato da un campione oculare (Murphy E et al., Proc Natl Acad Sci Usa 2003). La ricostituzione del ceppo TR BAC-derivato in fibroblasti permette di generare particelle virali infettive che mantengono la capacit? di infettare sia cellule epiteliali che endoteliali (Cavaletto N et al., J Virol 2015).

Esempio 1.2 Saggio di riduzione delle placche

Saggi di riduzione delle placche (PRA) con HCMV sono stati effettuati secondo quanto descritto precedentemente (Loregian A et al., Antimicrob Agents Chemother 2010). In breve, cellule HFF, ARPE-19 e HMVEC sono state seminate ad una densit? di 1,5x10<5 >cellule per pozzetto, in piastre da 24 pozzetti. Il giorno successivo, le cellule di ciascun pozzetto sono state infettate con 80 Plaque Forming Unit (PFU) di virus in DMEM senza siero a 37?C. Dopo 2 h p.i., gli inoculi sono stati rimossi, le cellule sono state lavate e sono stati aggiunti i medium contenenti varie concentrazioni di ciascun composto, 2% FBS e 0,6% di metilcellulosa. Dopo 10 giorni di incubazione a 37?C, i monostrati cellulari sono stati fissati, colorati con cristal violetto e le placche virali sono state contate.

Esempio 1.3 Saggio di citotossicit?

La citotossicit? dei composti testati ? stata determinata mediante metodo con 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Sigma-Aldrich) come descritto precedentemente (Loregian A et al., Chem Biol 2006).

Esempio 1.4 Saggi di riduzione della progenie virale

Per la realizzazione dei saggi di riduzione della progenie virale, cellule HFF sono state seminate ad una densit? di 2x10<4 >cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti, incubate overnight, ed infettate il giorno seguente con HCMV AD169 a MOI = 0,1 PFU/cell. Dopo l?adsorbimento virale per 2 h a 37?C, le cellule sono state lavate ed incubate con 0,2 ml di medium contenente 5% FBS in assenza o in presenza dei composti testati. Le piastre sono state dunque incubate per 5 giorni a 37?C e sottoposte ad un ciclo di congelamento/scongelamento. I titoli virali sono stati determinati mediante trasferimento di un?aliquota di 0,1 ml da ciascun pozzetto ad un monostrato di cellule HFF in piastre da 96 pozzetti, seguito da diluizione seriale 1:5 nella piastra. Le cellule sono state incubate per 7 giorni e, alla fine dell?incubazione, sono state fissate, colorate ed ? stato determinato il numero di placche.

Esempio 1.5 Saggi enzimatici in vitro

La proteina umana CYP51 ricombinante e il suo corrispondente redox NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) sono stati espressi in Escherichia coli e purificati secondo quanto riportato precedentemente (Hargrove TY et al., J Lipid Res 2016). La miscela di reazione conteneva 0,5 ?M hCYP51 e 1,0 ?M CPR, 100 ?M L-?-1,2-dilauroyl-snglycerophosphocholine, 0,4 mg/ml isocitrate dehydrogenase, e 25 mM sodium isocitrate in 50 mM tampone potassio di fosfato (pH 7,2) con 10% glicerolo (v/v). Dopo aggiunta di ([3-3H])lanosterolo radiomarcato (circa 4000 dpm/nmol; disciolto in 45% HPCD, w/v, concentrazione finale di 50 ?M) e inibitori (in concentrazione 0,1 - 20 ?M), la miscela risultante ? stata pre-incubata per 30 s a 37?C in bagno vibrante. La reazione ? stata iniziata dall?aggiunta di 100 ?M di NADPH e terminata dall?estrazione degli steroli con 5 ml di etil acetato. Gli steroli estratti sono stati essiccati, disciolti in metanolo e analizzati mediante sistema di HPLC a fase inversa (Waters) dotato di detector ?-RAM (INUS Systems) utilizzando una colonna NovaPak octadecylsilane (C18) e un gradiente lineare con acqua/acetonitrile/metanolo (1,0:4,5:4,5, v/v/v) (solvente A) e CH3OH (solvente B), crescente da 0 a 100% B per 30 min ad un flusso di 1,0 ml/min. I valori di IC50 sono stati calcolati mediante GraphPad Prism 6, e mostrati in grafico con la percentuale di lanosterolo convertito contro la concentrazione dell?inibitore ed interpolazione delle curve con regressione non-lineare (log(inhibitor) vs risposta normalizzata ? pendenza variabile).

Esempio 1.6 Plasmidi

Il plasmide pCYP51-luc, contenente la regione del promotore ?314/+343 del gene human CYP51 (hCYP51) situata a monte del gene reporter della luciferasi ? stato gentilmente fornito da D.

Rozman (Centre for Functional Genomics and Bio-Chips Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine University of Ljubljana, Slovenia) ed ? stato precedentemente descritto (Halder SK et al., Mol Endocrinol 2002). I plasmidi pGAPDH-eGFP, contenenti la regione del promotore del gene cellulare GAPDH a monte del gene enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) sono stati descritti precedentemente (Cornely OA et al., J Antimicrob Chemother 2017) e usati come controllo della trasfezione.

Esempio 1.7 Trasfezione cellulare e infezione di HCMV

Per gli esperimenti di trasfezione/infezione con HCMV, cellule U-373 MG sono state fatte crescere in piastre da 24 pozzetti e sono state co-trasfettate utilizzando fosfato di calcio (Calcium Phosphate Transfection Kit, Sigma) con 1 ?g di plasmide pCYP51-luc e 0,2 ?g di plasmide pGAPDH-eGFP come controllo per la normalizzazione dell?efficienza di trasfezione. Il giorno successivo, le cellule trasfettate sono state non infettate (mock) oppure infettate con HCMV AD169 a MOI = 0,5 PFU/cell per 2 h e incubate con medium con 5% FBS. Dopo 48h, l?attivit? della luciferasi e l?espressione di eGFP sono state misurate. In tutti gli esperimenti, i valori sono stati normalizzati mediante divisione dei valori di unit? di luciferasi (LU) per i valori di fluorescenza (FU) ottenuti dall?espressione di eGFP ed espressi come relative luciferase units (LU/FU, RLU).

Per l?inattivazione con UV, ? stata seguita la procedura riportata precedentemente (Chaumorcel M et al., J Virol 2012). In breve, HCMV diluito in DMEM senza siero ? stato esposto per 8 min a luce Ultravioletta (VL-6MC, 254 nM, 6w) ad una distanza di 4 cm. L?avvenuta inattivazione del virus ? stata valutata mediante immunofluorescenza.

Esempio 1.8 Quantificazione dell?espressione genica

Cellule HFF sono state seminate in piastre da 6 pozzetti ad una densit? di 6x10<5 >cellule/pozzetto e incubate overnight a 37?C.

In caso di infezione, il giorno successivo le cellule sono state infettate con HCMV AD169 a MOI = 1 PFU/cell per 2 h e successivamente incubate con medium al 5% di FBS. L?RNA totale ? stato estratto dai campioni raccolti a tempi differenti utilizzando il total RNA Purification Plus Kit (Norgen Biotek) secondo il protocollo fornito dalla ditta produttrice. Il cDNA ? stato generato dall?RNA (2 ?g) utilizzando random primers (Applied Biosystems) e M-MLV reverse transcriptase (Applied Biosystems). La reazione di qPCR ? stata effettuata con reagente SYBR green (Applied Biosystems), secondo le istruzioni fornite dalla ditta produttrice, con sistema 7900 HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Sono stati utilizzati primer per hCYP51, GAPDH, e HCMV UL54.

Le sequenze dei primer utilizzati sono elencate nella lista di seguito: SEQ. ID. NO.1:

hCYP51 forward primer CAGGTTGGCTGCCTTTGC

SEQ. ID. NO.2:

hCYP51 reverse primer CTTGATTTCCCGATGAGCTCTGT

SEQ. ID. NO.3:

UL54 forward primer GACACTGTACGGCAGAAAAGCCGGCTC SEQ. ID. NO.4:

UL54 reverse primer ACAGCATTCGTGCGC

SEQ. ID. NO.5:

GAPDH forward primer AGCCACATCGCTCAGACAC

La quantificazione dell?espressione genica ? stata determinata usando il ?comparative ?CT method? (??CT) utilizzando l?espressione del gene GAPDH per la normalizzazione dei valori.

Esempio 1.9 Western Blot

Per l?analisi Western blot dell?induzione di hCYP51 durante infezione con HCMV, cellule HFF sub-confluenti seminate in piastre da 6 pozzetti sono state infettate con HCMV AD169 a MOI = 0,5 PFU/cell. L?intero estratto proteico cellulare ? stato ottenuto a differenti tempi post-infezione come descritto precedentemente (Mercorelli B et al., Cell Chem Biol 2016) e analizzato mediante Western blot con gli anticorpi primari anti-IE1/IE2 (Argene-Biosoft), anti-hCYP51 (Sigma) e anti-Actina (Sigma).

Gli immunocomplessi sono stati visualizzati mediante anticorpi secondari coniugati HRP-Rabbit IgG (H+L) (Santa Cruz), HRP-Mouse IgG (H+L) (Santa Cruz).

L?analisi densitometrica ? stata effettuata con software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Esempio 1.10 Immunofluorescenza e microscopia confocale

Per l?analisi al microscopio confocale a scansione laser, cellule HFF sono state infettate con HCMV AD169 a MOI = 0,25 PFU/cell. A tempi differenti, le cellule sono state fissate con 4% paraformaldeide in PBS 1X per 15 min a temperatura ambiente e permeabilizzate con 0,1% Triton X-100 in PBS per 20 min a temperatura ambiente. Dopo lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con 4% FBS in PBS per 1 h a temperatura ambiente e poi incubate con gli anticorpi primari riportati nell?esempio precedente, diluiti in FBS 4% in PBS 1X per 1 h a 37?C in agitazione.

Le cellule sono state poi lavate con 4% FBS in PBS 1x e incubate con anticorpi secondari Alexa FluorTM 488 Rabbit IgG (H+L) (Invitrogen), Alexa FluorTM 546 Mouse IgG (H+L) (Invitrogen) per 1 h a 37 ?C. I nuclei sono stati visualizzati mediante incubazione per 20 min con Draq5 (1:8000 in PBS 1X). Le cellule sono state visualizzate usando un microscopio Nikon Eclipse Ti-E.

Esempio 1.11 Determinazione del rapporto particelle virali/PFU Per la determinazione del rapporto particelle/PFU di HCMV prodotte in presenza dei composti testati, cellule HFF sono state seminate ad una densit? di 2x10<4 >cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti, incubate overnight, e infettate il giorno successivo con HCMV AD169 a MOI = 0,5 PFU/cell. Dopo adsorbimento del virus per 2 h a 37?C, le cellule sono state lavate e incubate con 0,2 ml di terreno di coltura contenente 5% FBS in presenza o in assenza dei composti testati. Le piastre sono dunque state incubate 5 giorni a 37?C. Al termine dell?incubazione, 0,05 ml del surnatante sono stati usati per determinare il numero di particelle virali prodotte alle varie condizioni dell?esperimento, mentre 0,05 ml sono stati utilizzati per determinare il titolo virale su nuove cellule HFF in monostrato come descritto precedentemente, per determinare il numero di PFU presenti in un uguale volume di surnatante.

Per la determinazione delle particelle virali, 0,05 ml di surnatante sono stati incubati con 0,2% SDS e proteinasi K per 1 h a 56?C e poi per 15 min a 95?C per inattivare la proteinasi K. Successivamente, il DNA virale ? stato estratto con il DNA purification kit (Promega) e quantificato mediante qPCR come descritto precedentemente. Il rapporto particelle/PFU ? stato determinato dividendo il numero dei genomi di HCMV per il numero di PFU determinato nello stesso volume di surnatante derivato dallo stesso campione.

Esempio 1.12 Quantificazione del genoma virale

Per la quantificazione dei genomi di HCMV in 0,05 ml di surnatante ottenuto da diversi campioni raccolti a 120 h p.i., ? stata effettuata l?analisi con Real-Time PCR quantitativa (qPCR) come descritta precedentemente (Mercorelli B et al., Antimicrob Agents Chemother 2009). Il numero di genomi virali ? stato normalizzato rispetto alle copie geniche della ?-globina cellulare.

Le sequenze dei primer utilizzati per ?-globina sono:

SEQ. ID. NO.6:

?-globin forward primer AGGGCCTCACCACCAACTT

SEQ. ID. NO.7:

?-globin reverse primer GCACCTGACTCCTGAGGAGAA

Esempio 1.13 Studi di combinazioni di farmaci

Per valutare l?effetto combinato di PCZ e GCV sulla replicazione di HCMV AD169, sono stati effettuati dei saggi di riduzione delle placche, secondo quanto riportato precedentemente all?esempio 1.2 utilizzando 0,25X, 0,50X, 1X, 2X, e 4X EC50 per ogni combinazione di PCZ e GCV in rapporto equipotente. Gli effetti della combinazione dei due farmaci ? stata valutata mediante metodo Chou-Talalay (Chou TC, Pharmacol Rev 2006) con il software CalcuSyn, versione 2.0 (Biosoft, Cambridge).

Esempio 1.14 Analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state realizzate utilizzando il software GraphPad Prism versione 6.0.

Esempio 2. Risultati

Esempio 2.1 Attivit? anti-HCMV di composti azolici antifungini

I composti azolici antifungini dell?invenzione sono stati analizzati mediante saggio PRA secondo le modalit? riportate all?esempio 1.2, per la valutazione della loro attivit? anti-HCMV.

I risultati ottenuti sono mostrati nelle tabelle 1 e 3 e in figura 1A. ? possibile notare che nelle cellule HFF, PCZ, KTZ, e ICZ presentano un effetto inibitorio dose-dipendente della replicazione del virus HCMV ceppo AD169.

Per escludere che tale attivit? antivirale fosse dovuta ad un effetto citotossico, sono stati valutati gli effetti del trattamento con PCZ sulla vitalit? di cellule HFF non infettate mediante saggio MTT secondo quanto riportato all?esempio 1.3.

Dai risultati ottenuti, mostrati in tabella 1, ? possibile notare che l?attivit? antivirale di PCZ non ? dovuta ad una corrispondente attivit? citotossica.

Tabella 1

a 50% Concentrazione Efficace, la concentrazione di composto che inibisce al 50% la formazione di placche virali, determinata con saggi di riduzione delle placche contro HCMV AD169 in cellule HFF. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da almeno tre esperimenti indipendenti in duplicato. GCV ? stato incluso come controllo positivo.

b Concentrazione di composto che produce 50% di citotossicit?, determinata con saggio MTT in cellule HFF. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da due esperimenti indipendenti in duplicato.

c SI, Indice di Selettivit?, determinato come rapporto tra CC50 e EC50. N.D., Non Determinato.

Esempio 2.2.1 Attivit? anti-HCMV ad ampio spettro di PCZ e altri composti azolici antifungini

Per valutare lo spettro dell?attivit? anti-HCMV di PCZ e altri composti azolici antifungini, sono stati eseguiti saggi PRA, secondo le modalit? riportate all?esempio 1.2, su differenti ceppi di virus HCMV, tra cui tre ceppi isolati clinicamente (TB40-UL32-EGFP, VR1814 e 388438U). I risultati, riportati in figura 2 e in tabella 2, mostrano che l?attivit? antivirale di PCZ non dipende dal ceppo HCMV, infatti i valori di EC50 ottenuti dal trattamento di PCZ contro differenti ceppi sono tra loro comparabili.

Inoltre i saggi PRA sono stati ripetuti anche con ceppi HCMV resistenti a farmaci inibitori della DNA polimerasi virale (759<r>D100, PFA<r>D100, GDG<r>P53 e TR).

Vantaggiosamente, PCZ inibisce completamente la replicazione dei ceppi virali mutati nel gene UL54, con mutazioni che conferiscono al ceppo virale cross-resistenza ai farmaci GCV e cidofovir oppure ai farmaci foscarnet e aciclovir (tabella 2, ceppi 759<r>D100 e PFA<r>D100 rispettivamente).

Inoltre, l?attivit? antivirale di PCZ non dipende dal tipo di cellula che viene infettata da HCMV, infatti i valori di EC50 di PCZ misurati contro il ceppo TR in cellule epiteliali, endoteliali e fibroblasti sono tra loro comparabili (tabella 2).

Tabella 2

<a >50% Concentrazione Efficace, la concentrazione di composto che inibisce al 50% la formazione di placche virali, determinata con saggi di riduzione delle placche contro HCMV in cellule HFF e contro HCMV ceppo TR in cellule epiteliali (ARPE-19) ed endoteliali (HMVECs). I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da almeno tre esperimenti indipendenti in duplicato.

<b >GCV ? stato incluso come controllo positivo in tutti i ceppi, ad esclusione del ceppo PFA<r>D100, per il quale ? stato utilizzato foscarnet.

N.D., Non determinato.

Esempio 2.2.2 Attivit? anti-HCMV ad ampio spettro di ICZ

Per valutare lo spettro dell?attivit? anti-HCMV di ICZ sono stati eseguiti saggi PRA, secondo le modalit? riportate all?esempio 1.2, su differenti ceppi di virus HCMV, tra cui due ceppi isolati clinicamente (TB40-UL32-EGFP e VR1814).

I risultati riportati in tabella 3, mostrano che l?attivit? antivirale di ICZ non dipende dal ceppo HCMV, infatti i valori di EC50 ottenuti dal trattamento di ICZ contro differenti ceppi sono tra loro comparabili. Inoltre, i saggi PRA sono stati ripetuti anche con ceppi HCMV resistenti a farmaci inibitori della DNA polimerasi virale (PFA<r>D100 e GDG<r>P53).

Vantaggiosamente, ICZ inibisce la replicazione dei ceppi virali mutati nel gene UL54, con mutazioni che conferiscono al ceppo virale crossresistenza ai farmaci foscarnet e aciclovir (tabella 3, ceppo PFA<r>D100), oppure cross-resistenza ai farmaci ganciclovir e cidofovir (tabella 3, ceppo GDG<r>P53).

Tabella 3

<a >50% Concentrazione Efficace, la concentrazione di composto che inibisce al 50% la formazione di placche virali, determinata con saggi di riduzione delle placche contro HCMV in cellule HFF. I valori riportati rappresentano le medie dei dati derivanti da almeno tre esperimenti indipendenti in duplicato.

b Concentrazione di composto che produce 50% di citotossicit?, determinata con saggio MTT in cellule HFF. I valori riportati rappresentano le medie dei dati derivanti da tre esperimenti indipendenti in duplicato.

N.D., Non determinato.

Esempio 2.3 Effetto del trattamento con PCZ sulla progenie virale e correlazione dell?attivit? anti-HCMV con l?inibizione di hCYP51 dell?ospite da parte di PCZ

? stato valutato l?effetto del trattamento con PCZ sulla produzione di progenie virale.

In tabella 4 sono mostrati i risultati ottenuti.

Il trattamento con PCZ inibisce la produzione di progenie virale in modo dose-dipendente, in altre parole diminuisce la replicazione del virus.

? stata inoltre analizzata l?influenza dell?enzima hCYP51 sulla replicazione virale di HCMV mediante saggi di inibizione enzimatica in vitro.

I risultati ottenuti sono mostrati in tabella 4 e in figura 3A.

Sia VFV, un noto inibitore di hCYP51, che PCZ inibiscono la velocit? di conversione iniziale del lanosterolo, presentando una IC50 rispettivamente di 0,5 e 8 ?M.

Questo effetto inibitorio non ? stato invece riscontrato nel trattamento con VCZ (IC50>100 ?M) che ? stato usato come controllo negativo. VFV ? stato inoltre testato mediante saggio PRA e i risultati ottenuti mostrano che VFV possiede un?attivit? inibitoria dose-dipendente sulla replicazione di HCMV (figura 3B), sebbene possegga un valore di EC50 maggiore rispetto a quello ottenuto da PCZ (13,3 ?M contro 3,3 ?M, valori ottenuti dal saggio PRA). Tuttavia, considerando l?elevata natura idrofobica di VFV (LogP 5,4), ? ragionevole ipotizzare che VFV non fosse del tutto solubilizzato nel medium con metilcellulosa utilizzato durante i saggi PRA. Pertanto sono stati eseguiti anche dei saggi di riduzione della progenie virale mediante trattamento con VFV (figura 3C). ? risultato che VFV possiede un elevato effetto inibitorio della replicazione virale, con una EC50 compresa nel range del basso micromolare, a conferma che hCYP51 ? un enzima necessario per la produzione di progenie virale di HCMV.

Tabella 4

<a >50% Concentrazione Efficace, la concentrazione di composto che inibisce al 50% la formazione di placche virali, determinata con saggi di titolo virale in cellule HFF. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da quattro esperimenti indipendenti in duplicato.

b 90% Concentrazione Efficace, la concentrazione di composto che inibisce al 90% la formazione di placche virali, determinata con saggi di titolo virale in cellule HFF. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da quattro esperimenti indipendenti in duplicato.

c 50% Concentrazione Inibitoria, la concentrazione di composto che causa la diminuzione al 50% del tasso di conversione del lanosterolo, determinato mediante ricostituzione dell?attivit? di hCYP51 in vitro, con una reazione di 2 min. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da tre esperimenti indipendenti in duplicato e calcolati utilizzando GraphPad Prism 6.0 (dose-risposta-inibizione). N.D., Non Determinato.

Esempio 2.4 L?infezione da HCMV attiva l?espressione di hCYP51 Al fine di valutare gli effetti dell?infezione da HCMV sulla modulazione del promotore di hCYP51 nell?ospite, cellule U-373MG sono state trasfettate con un plasmide contenente un gene reporter sotto controllo del promotore di hCYP51 e successivamente infettate con HCMV, secondo quanto riportato negli esempi 1.6 e 1.7.

Come si nota dal grafico di figura 4A, l?infezione da HCMV ha attivato il promotore di hCYP51 di circa 40 volte.

Tale attivazione non ? invece presente nelle cellule trasfettate con HCMV inattivato mediante radiazioni UV, che ? in grado di entrare nelle suddette cellule ma non di esprimere i propri geni, a sostegno dell?ipotesi che sono necessarie proteine del virus sintetizzate de novo per l?attivazione del promotore di hCYP51 (figura 4A).

? stato inoltre osservato che, durante le prime fasi di replicazione virale di HCMV, ? presente un incremento dei livelli di mRNA di hCYP51 di circa 2 volte (figura 4B) e un accumulo della proteina corrispondente (figure 4C, 7 e 8). Assieme, questi risultati supportano l?ipotesi che l?infezione da HCMV attiva l?espressione genica di hCYP51.

Esempio 2.5 Inibizione dell?enzima hCYP51 durante la replicazione di HCMV riduce l?infettivit? della progenie virale

? stato determinato il rapporto particelle virali/PFU di particelle virali di HCMV libere rilasciate da cellule HFF infettate da HCMV e trattate con i composti PCZ, VFV oppure DMSO come controllo secondo quanto riportato nell?esempio 1.11 e assumendo che ciascuna particella virale (indipendentemente dall?infettivit? della stessa) contenga un genoma.

Come mostrato dai grafici delle figure 5A e 5B, il trattamento di cellule HFF infettate con HCMV per 120 h con PCZ o VFV riduce significativamente sia il numero di genomi HCMV che il livello di infettivit? della progenie virale, con un aumento di circa 7-10 volte del rapporto particelle/PFU rispetto alle cellule infettate trattate con solo DMSO.

Si ritiene dunque che l?attivit? enzimatica di hCYP51 risulti necessaria al fine di una replicazione virale produttiva e potrebbe contribuire alla produzione di particelle virali infettive.

Esempio 2.6 GCV e PCZ agiscono sinergicamente contro la replicazione di HCMV nelle cellule infettate

? stata testata, mediante saggio PRA e secondo le modalit? riportate nell?esempio 1.13, l?efficacia antivirale dell?agente antivirale GCV in assenza e in presenza di PCZ alla concentrazione di 3 ?M, che rappresenta una dose approssimativamente equivalente alla concentrazione media di PCZ rinvenibile nel plasma di soggetti trattati con PCZ (Clark NM et al., Sem Resp Critical Care Med 2015).

Vantaggiosamente, in presenza di PCZ, GCV ? risultato circa 10 volte pi? potente nei confronti di HCMV rispetto al trattamento in assenza di PCZ e con il solo solvente DMSO (EC50 0,13 ?M per la combinazione GCV PCZ contro 1,44 ?M per GCV DMSO, figura 6).

I risultati, riassunti anche in tabella 5, mostrano che GCV e PCZ hanno un effetto antivirale che ? sinergico a tutte le combinazioni testate. Infatti il valore del Combination Index (CI) calcolato mediante il metodo di Chou (Chou TC, Pharmacol Rev 2006) ? risultato essere in tutti i casi <0,9 (tabella 5).

Ulteriormente, non ? stato osservato alcun effetto citotossico evidente nel trattamento combinato di tali due composti.

Tabella 5

<a >Multipli o sottomultipli della EC50 per GCV e PCZ che risultano in un

rapporto di concentrazioni equipotenti tra i due farmaci in combinazione.

I valori di EC50 sono stati determinati mediante saggio PRA per HCMV AD169 in cellule HFF per ciascun composto da solo o in combinazione a concentrazioni comprese tra 0,25 e 4 volte il rapporto equipotente dei composti in base al rapporto 1:1,33 approssimato dai valori di tabella 1.

<b >Combination Index, ottenuto dall?analisi computazionale con software Calcusyn. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da tre esperimenti indipendenti in triplicato.

<c >Effetto della combinazione dei composti definito come: sinergismo molto forte per CI<0,1; sinergismo forte per 0,1<CI<0,3; sinergismo per 0,3<CI<0,7; sinergismo moderato per 0,7<CI<0,9, in accordo a Chou TC, Pharmacol Rev 2006.

Oltre ad una riduzione nel numero assoluto di placche formate, ?

stata osservata anche una riduzione delle dimensioni delle placche

virali quando GCV ? stato usato in combinazione con PCZ.

Gli indici di riduzione della dose calcolati sono mostrati in tabella 6.

Tabella 6

<a >Concentrazione di composto necessaria per l?inibizione della replicazione virale nella misura indicata, determinata con saggio PRA in cellule HFF infettate. I valori riportati rappresentano le medie ? SD dei dati derivanti da tre esperimenti indipendenti in triplicato.

<b >Indice di riduzione della dose, cio? il valore simulato della riduzione della dose necessaria per ciascun composto usato in combinazione rispetto alla dose necessaria per ottenere lo stesso effetto inibitorio con il composto usato da solo.

Quindi, PCZ e GCV dimostrano possedere una potente attivit? antivirale sinergica senza un corrispondente aumento della tossicit?. La terapia in combinazione con GCV fornisce dunque una strategia terapeutica nuova con cui trattare e/o prevenire le malattie causate dall?infezione da HCMV e al tempo stesso tale terapia riduce la tossicit? del composto e la comparsa di ceppi mutanti resistenti ai farmaci.

Claims (18)

RIVENDICAZIONI

1) Composto azolico antifungino o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un suo profarmaco per l?uso come antivirale nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da citomegalovirus umano.

2) Composto per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto composto ? un composto antifungino triazolico.

3) Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto composto interferisce con l?enzima umano citocromo P450 51 per inibire la replicazione del citomegalovirus umano.

4) Composto per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto composto ? scelto tra posaconazolo e isavuconazolo.

5) Composto per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto composto ? posaconazolo.

6) Composto per l?uso secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto composto ? isavuconazolo.

7) Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto metodo di trattamento prevede di somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace di detto composto, detto soggetto essendo preferibilmente un mammifero.

8) Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto metodo di trattamento prevede di somministrare ad un soggetto una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di detto composto e di un agente antivirale.

9) Composto per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto agente antivirale ? selezionato nel gruppo comprendente ganciclovir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, fomivirsen, maribavir, derivati alcossialchilici del cidofovir, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hidrossi-2-(fosfonometossi)propil]adenina (HPMPA), derivati alcossialchilici di 1-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]citosina (HPMPC), derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]guanina (HPMPG), derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]-2,6-diaminopurina (HPMPDAP), derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hydroxy-2-(phosphonomethoxy)propyl]-2-amino-6-ciclopropilaminopurina (HPMP-cPrDAP) e letermovir.

10) Composto per l?uso secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto agente antivirale ? ganciclovir.

11) Composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 10, caratterizzato dal fatto che detto soggetto ? un soggetto pediatrico.

12) Formulazione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di un composto o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un suo profarmaco come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile per l?uso nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da citomegalovirus umano.

13) Composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di un composto o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un suo profarmaco, come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, e uno o pi? agenti antivirali ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

14) Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione precedente, caratterizzata dal fatto che detti uno o pi? agenti antivirali sono selezionati nel gruppo comprendente ganciclovir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir, aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, fomivirsen, maribavir, derivati alcossialchilici del cidofovir, derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hidrossi-2-(fosfonometossi)propil]adenina (HPMPA), derivati alcossialchilici di 1-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]citosina (HPMPC), derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]guanina (HPMPG), derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-idrossi-2-(fosfonometossi)-propil]-2,6-diaminopurina (HPMPDAP), derivati alcossialchilici di 9-(S)-[3-hydroxy-2-(phosphonomethoxy)propyl]-2-amino-6-ciclopropilaminopurina (HPMP-cPrDAP) e letermovir.

15) Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 o 14, caratterizzata dal fatto che detti uno o pi? agenti antivirali sono inibitori della DNA polimerasi virale o della terminasi virale.

16) Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 15, caratterizzata dal fatto che detti uno o pi? agenti antivirali comprendono ganciclovir.

17) Composizione farmaceutica come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni da 13 a 16 per l?uso come medicinale.

18) Composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione precedente, come antivirale nel metodo di trattamento e/o prevenzione delle infezioni da citomegalovirus umano.