IT202000014683A1 - Metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale - Google Patents
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Description
METODO PER DETERMINARE LA CONCENTRAZIONE DI UN BATTERIO DI INTERES-
SE IN UNA MATRICE AMBIENTALE
La presente invenzione riguarda un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale. Pi? in particolare, la presente invenzione riguarda un metodo per determinare la concentrazione del batterio della Salmonella spp. in una matrice ambientale di fango disidratato (ad esempio avente circa l?80 % di umidit?), derivante dal processo di depurazione delle acque reflue.
Nella presente descrizione e nelle rivendicazioni che seguono, con il termine ?matrice ambientale? si intende un insieme di strutture complesse degli stati della materia (stato gassoso, liquido, solido) che compongono un determinato ambiente naturale.
Nel seguito della presente descrizione, come si noter?, si far? riferimento principalmente ad applicazioni del metodo secondo l?invenzione, per determinare la concentrazione di Salmonella spp. in una matrice ambientale di fango disidratato. Si deve tuttavia tenere presente che il metodo della presente invenzione pu? essere applicato in qualsiasi altro contesto di analisi microbiologica, in cui si debba determinare la concentrazione di questo o di un altro microrganismo di interesse in una qualunque altra matrice ambientale, rimanendo sempre nell?ambito di protezione della presente invenzione come definito dalle rivendicazioni allegate.
Negli impianti di depurazione delle acque reflue, viene prodotto il fango come derivato del processo depurativo. Il fango derivato da questo tipo di processo pu? comprendere agenti patogeni che possono essere pericolosi per la salute umana e, solitamente, viene quindi avviato allo smaltimento.
In alternativa, il fango derivante dalla depurazione delle acque reflue pu? essere impiegato in agricoltura o in altri settori, ad esempio in silvicoltura, purch? rispetti stringenti parametri chimico-fisici e microbiologici, all?esito di analisi di certificazione che vengono usualmente condotte in laboratorio.
Tra i controlli microbiologici richiesti dalle normative per il riutilizzo del fango, la determinazione della concentrazione di Salmonella spp. (tutte le species) risulta essere tra le pi? importanti, data la natura patogena di questo batterio e le conseguenze negative che pu? avere per la salute dell?uomo.
Si richiede, pertanto, di determinare la concentrazione di questo batterio in una determinata quantit? in peso di fango e, se tale concentrazione supera un valore di soglia prefissato (attualmente fissato a 1000 MPN/g ss - sostanza secca -per la Salmonella spp.), il campione di fango va smaltito. Altrimenti pu? essere impiegato per altri scopi, senza rischio per la salute.
Uno dei metodi attualmente utilizzati per la determinazione della concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, come ad esempio il fango disidratato di cui sopra, comprende le seguenti fasi operative:
(a) preparazione di una sospensione primaria, a partire da un campione della matrice ambientale sotto indagine ? questa fase permette la liberazione dei microrganismi in essa aggregati e la separazione dei cluster microbici;
(b) preparazione di una pluralit? di diluizioni della sospensione primaria in primi contenitori;
(c) pre-arricchimento della sospensione primaria e delle sue diluizioni mediante inoculazione di una quantit? prefissata della sospensione primaria e delle sue diluizioni in rispettivi secondi contenitori, ciascuno contenente una quantit? prefissata di un brodo mediamente selettivo di arricchimento primario ? questa fase favorisce la crescita o moltiplicazione dei microrganismi, tra cui il batterio di interesse eventualmente presente, contenuti nella sospensione primaria o nelle sue diluizioni;
(d) arricchimento della sospensione primaria e delle sue diluizioni cos? prearricchite, mediante inoculazione di una loro quantit? prefissata in un rispettivo terzo contenitore, ciascun terzo contenitore contenendo una quantit? prefissata di un brodo selettivo secondario ? questa fase favorisce la crescita del batterio di interesse ed inibisce, invece, la crescita degli altri microrganismi;
(e) isolamento del batterio di interesse in una o pi? rispettive piastre contenenti un adatto terreno di coltura ? questa fase comprende di strisciare con un?apposita ansa o di isolare, in modo noto, il contenuto di ciascun terzo contenitore su un corrispondente terreno solido specifico e selettivo compreso in una rispettiva piastra, in cui le colonie del batterio di interesse, se presenti, possono essere isolate;
(f) conferma della presenza del batterio di interesse, in ciascun terreno di coltura di ciascuna piastra, mediante l?esecuzione di test di identificazione biochimici e sierologici? questa fase consente di identificare le colonie del batterio di interesse nel terreno di coltura di ciascuna piastra; e
(g) la quantificazione della concentrazione del batterio di interesse, in ciascun terreno di coltura di ciascuna piastra, mediante l?impiego di tecniche di conta note ? questa fase consente di quantificare il numero di batteri di interesse nel campione analizzato.
In base al metodo descritto nelle fasi da (a) ad (g) si pu? quantificare la concentrazione (in gergo tecnico ?titolo?) di Salmonella spp. presente nella matrice ambientale (cio?, nel campione di fango disidratato) esaminata.
Nel caso specifico, la fase (g) di analisi quantitativa sopra indicata si basa tradizionalmente sulla tecnica della conta in MPN (Most Probable Number, numero pi? probabile) di colonie del batterio di interesse, riportata ad esempio nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev.00 dell?Istituto Superiore di Sanit?.
Il batterio della Salmonella ? in grado di riprodursi in un brodo alla Selenite-cistina a 36?1?C, nel brodo di arricchimento-selettivo di Rappaport Vassiliadis a 42?1?C e di produrre colonie tipiche su terreni di isolamento come ad esempio Rambach agar, XLT4 agar, XLD agar a 36?1?C, per cui:
- la fase (a) di preparazione della sospensione primaria comprende di omogenizzare meccanicamente una quantit? prestabilita di fango disidratato con una soluzione salina peptonata sterile di un tipo adatto, ad esempio come indicato nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev.00 dell?Istituto Superiore di Sanit?;
- la fase (b) di diluizione comprende la diluizione, con quantit? prefissate di soluzione salina peptonata sterile di quantit? prefissate di sospensione primaria all?interno di primi contenitori separati, ad esempio come indicato nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev.00 dell?Istituto Superiore di Sanit?;
- la fase (c) di pre-arricchimento comprende la successiva inoculazione di quantit? prefissate di sospensione primaria o delle sue diluizioni, in rispettivi secondi contenitori contenenti un terreno colturale mediamente selettivo, a base di Selenite-cistina. In alternativa alla Selenite-cistina pu? essere impiegata, ad esempio, una soluzione di acqua peptonata tamponata sterile ? questa fase favorisce la crescita (moltiplicazione) dei microrganismi contenuti nella sospensione primaria e viene eseguita seguendo, ad esempio, le indicazioni dei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev. 00 dell?Istituto Superiore di Sanit?;
- la fase (d) di arricchimento, comprende l?arricchimento del contenuto di ciascuno dei secondi contenitori, in un rispettivo terreno selettivo compreso all?interno di un rispettivo terzo contenitore, il terreno selettivo comprendendo brodo di Rappaport Vassiliadis, ad esempio ottenuto come indicato nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev.00 dell?Istituto Superiore di Sanit?, che inibisce la crescita di microorganismi non target e favorisce quella della Salmonella spp.;
- la fase (e), comprende l?isolamento del batterio di interesse eventualmente contenuto in ciascuno dei terzi contenitori, su piastre comprendenti terreni agarizzati specifici e selettivi adatti, ad esempio di Rambach agar, XLT4 agar, XLD agar, e similari, ottenuti come indicato nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev.00 dell?Istituto Superiore di Sanit?;
- la fase (f) di conferma, comprende l?esecuzione di test, ad esempio di test predittivi dell?Ossidasi, dell?Indolo, della colorazione di Gram, test di identificazione biochimica e test di conferma sierologici noti per confermare, per ciascuna piastra, la presenza o meno della Salmonella spp. come organismo da rilevare; e
- la fase (f) di quantificazione, segue la precedente fase (f) di conferma, e comprende la determinazione, per il campione analizzato, di un numero caratteristico (NC) e l?impiego di tale numero caratteristico nella tecnica della conta in MPN (Most Probable Number), per stabilire il numero pi? probabile di batteri di interesse, ad esempio utilizzando una tabella come quella riportata in Figura 7.
L?esecuzione in sequenza delle fasi da (a) a (g) sopra descritte, consente di quantificare la concentrazione di Salmonella spp. nella matrice ambientale esaminata.
Il numero delle diluizioni e il rapporto di diluizione di ciascuna delle diluizioni successive della sospensione primaria contenente il campione di matrice ambientale da analizzare ? indicato, ad esempio, sempre nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev.00 dell?Istituto Superiore di Sanit?, e tiene conto del limite di legge per lo specifico batterio di interesse, previsto nella normativa nazionale.
Il metodo tradizionale sopra descritto per determinare, in generale, la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale e, in particolare, la concentrazione del batterio della Salmonella spp. in una matrice ambientale di fango disidratato, soffre di numerosi inconvenienti.
Esso, infatti, prevede la determinazione statistica del numero di batteri coltivabili presenti in un campione (MPN/g) dopo una serie di passaggi in terreni colturali che richiedono tempi tecnici fisiologici per lo sviluppo e la crescita dei batteri di interesse in ciascun terreno di coltura. Si tratta, dunque, di un metodo laborioso, che richiede l?attuazione di un numero di passaggi con scadenze temporali prestabilite durante un lasso temporale compreso tra i 6 e i 10 giorni, per l?ottenimento del risultato finale. Richiedendo, tra l?altro, dei tempi di esecuzione anche superiori alla settimana, per l?implementazione del metodo si richiede che gli operatori lavorino anche nei giorni festivi, se necessario, con un aggravio dei costi di implementazione.
Inoltre, il metodo tradizionale richiede un elevato quantitativo di materiali impiegati, preventivamente preparati dal laboratorio, che occupano, tra l?altro, un certo ingombro, e che devono essere opportunamente smaltiti, per cui impattano sulla logistica dell?analisi.
Non solo, il metodo tradizionale favorisce il rischio biologico dato che, per poter essere implementato, richiede la moltiplicazione del batterio (patogeno) di interesse.
Si avverte, pertanto, l?esigenza di fornire un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, che risolva i suddetti inconvenienti.
Pi? in particolare, scopo della presente invenzione ? di mettere a disposizione un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, che sia pi? rapido del metodo di determinazione tradizionale.
Un altro scopo della presente invenzione ? di fornire un metodo per la determinazione della concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, che sia pi? semplice da eseguire del metodo di determinazione tradizionale.
Un altro scopo ancora della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, che richieda per la sua esecuzione una quantit? minore di materiali ed in cui i materiali richiesti occupino un ingombro inferiore rispetto al metodo di determinazione tradizionale.
Un ulteriore scopo della presente invenzione ? quello di fornire un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, che sia pi? economico da implementare.
Non ultimo scopo della presente invenzione ? quello di mettere a disposizione un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse che minimizzi il rischio biologico.
Forma oggetto specifico della presente invenzione un metodo per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, comprendente le seguenti fasi operative:
A. Preparare almeno una sospensione primaria di un campione di detta matrice ambientale, ottenendo la disgregazione delle particelle di detta matrice ambientale e la separazione di detto almeno un batterio di interesse, se presente, da detta matrice ambientale;
B. Preparare una o pi? diluizioni di detta almeno una sospensione primaria (2) in rispettivi primi contenitori;
C. Pre-arricchire detta almeno una sospensione primaria e detta una o pi? diluizioni in rispettivi secondi contenitori, ottenendo cos? in ciascun secondo contenitore la moltiplicazione di detto almeno un batterio di interesse, se presente; D. estrarre il genoma del contenuto di ciascun secondo contenitore in un rispettivo terzo contenitore;
E. Preparare, almeno una pluralit? di tubi, ciascun tubo della pluralit? di tubi contenente detto genoma contenuto in un rispettivo terzo contenitore;
F. Applicare a ciascun tubo almeno una procedura di analisi qualitativa, detta procedura di analisi qualitativa essendo configurata per rilevare la presenza o assenza del genoma di detto batterio di interesse, fornendo in uscita per ciascun tubo un corrispondente indice di presenza o assenza di detto genoma di detto batterio di interesse;
G. Sulla base di ciascun indice di presenza o assenza di detto genoma di detto batterio di interesse, applicare una procedura di analisi quantitativa, detta procedura di analisi quantitativa essendo configurata per determinare il valore del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo di campione (MPN/g) e/o del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo (MPN/g ss) di sostanza secca in detto almeno un campione di matrice ambientale.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, detta fase D pu? comprendere, per ciascun secondo contenitore:
- trasferire una quantit? predefinita, opzionalmente inferiore a 2 ml, pi? opzionalmente pari a circa 1 ml, di detta sospensione primaria pre-arricchita o di detta sua diluizione pre-arricchita, in detto rispettivo terzo contenitore;
- aggiungere a detto terzo contenitore una quantit? predefinita di almeno un buffer di lisi, ad una temperatura almeno pari o superiore ad una temperatura minima TMIN, per rompere le cellule ivi contenute; e
- centrifugare, detto almeno un terzo contenitore per almeno un tempo minimo tMIN.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detta fase E di preparare detta almeno una pluralit? di tubi, pu? comprendere:
- trasferire una quantit? predefinita del contenuto di ciascun rispettivo terzo contenitore, opzionalmente inferiore a 5 ? l, pi? opzionalmente pari a 3 ? l, in un rispettivo tubo della pluralit? di tubi contenente detto genoma contenuto in un; e opzionalmente
- aggiungere almeno una quantit? predefinita di almeno un reagente di amplificazione.
Secondo un aspetto aggiuntivo dell?invenzione, detta procedura di analisi qualitativa pu? comprendere per ciascun tubo:
- attendere un intervallo di tempo predeterminato di amplificazione, durante il quale avviene l?amplificazione di detto genoma di detto batterio di interesse in esso eventualmente contenuto, opzionalmente mediante una tecnica di amplificazione isotermica mediata da loop;
- applicare una tecnica di rilevamento di detto genoma cos? amplificato, fornendo in uscita un rispettivo indice di presenza o assenza di detto genoma.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, detta tecnica di rilevamento di detto genoma pu? essere una tecnica fotometrica che comprende, per ciascun tubo:
- rilevare durante detto intervallo di tempo predeterminato di amplificazione, almeno una radiazione luminosa fluorescente da questo emessa, per effetto dell?amplificazione del genoma innescata al termine di detta fase E; e
- fornire in uscita un corrispondente indice di presenza o assenza di detto genoma, sulla base del fatto che detta almeno una radiazione luminosa fluorescente emessa da ciascun tubo cos? rilevata superi o meno almeno un valore di soglia predefinito o abbia o meno un certo andamento temporale.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detta procedura di analisi quantitativa pu? comprendere una tecnica analitica statistica di conteggio indiretto del numero pi? probabile di detti batteri di interesse in detto almeno un campione di matrice ambientale.
Secondo un aspetto aggiuntivo dell?invenzione, detta procedura di analisi quantitativa pu? comprendere:
- determinare, sulla base di ciascun indice di presenza o assenza di detto genoma, un Numero Caratteristico (NC), secondo la tecnica della conta del valore MPN (most probable number); e
- determinare analiticamente, opzionalmente mediante l?interrogazione di un database o la consultazione di una tabella di consultazione, il valore del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo di campione e/o del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo di sostanza secca, in funzione di detto numero caratteristico, di detto rapporto di diluizione e di detto peso percentuale di sostanza secca in detto campione.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, detto almeno un batterio di interesse pu? essere la Salmonella spp.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, detta fase C pu? comprendere di inoculare, in rispettivi secondi contenitori una quantit? prefissata di detta almeno una sospensione primaria o di detta almeno una sua diluizione in una quantit? predeterminata di un terreno mediamente selettivo a base di Selenitecistina e incubare ad una temperatura compresa tra 36?5 ?C, opzionalmente compresa tra 36?4?C, pi? opzionalmente compresa tra 36?1?C per 21?3 ore.
Secondo un aspetto aggiuntivo dell?invenzione, in detta fase D la lisi cellulare del contenuto di detto almeno un terzo contenitore pu? essere eseguita per almeno un intervallo temporale minimo di lisi, opzionalmente compreso tra 25 e 35 min, pi? opzionalmente pari a 30 min ad una temperatura almeno pari o superiore ad una temperatura minima (TMIN), dove TMIN, ? opzionalmente pari a 60?C, pi? opzionalmente pari a 65?C e la centrifugazione di detto almeno un terzo contenitore pu? essere eseguita per un intervallo temporale minimo tMIN opzionalmente inferiore a 10 minuti, pi? opzionalmente pari a 5 minuti, ad una velocit? compresa tra 7500/rpm ed 9000/rpm, opzionalmente pari a 8500 rpm.
La presente invenzione verr? ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue preferite forme di realizzazione, con particolare riferimento alle Figure dei disegni allegati, in cui:
la Figura 1 mostra le fasi principali di un metodo per la determinazione della concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale secondo la tecnica nota;
la Figura 2 ? una rappresentazione delle fasi principali di un metodo per la determinazione della concentrazione di un batterio di interesse, secondo la presente invenzione;
le Figure da 3a a 3e illustrano il materiale e parte della strumentazione che si pu? impiegare nell?implementazione del metodo secondo la presente invenzione; e
la Figura 4 ? una tabella di consultazione, che pu? essere impiegata nell?implementazione del metodo secondo la presente invenzione.
Nelle Figure allegate numeri di riferimento identici saranno utilizzati per elementi analoghi.
Con riferimento ora alle Figure da 2 a 4, si noter? come il metodo per la determinazione della concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale secondo la presente invenzione sia indicato con il numero di riferimento 1 e comprenda una prima fase operativa A di preparazione di una sospensione primaria 2, a partire da un campione di una matrice ambientale, in cui si ottiene la disgregazione delle particelle del campione di matrice ambientale nonch? la separazione del batterio di interesse, se presente nel campione, dalla restante parte di matrice ambientale.
Nel caso specifico della ricerca del batterio della Salmonella spp. in un campione di matrice ambientale di fango disidratato, derivante dalla depurazione delle acque reflue, questa fase A comprende di omogenizzare meccanicamente una quantit? prefissata di matrice ambientale con una soluzione salina peptonata sterile, ad esempio secondo le quantit? indicate nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev. 00 dell?Istituto Superiore di Sanit? oppure secondo altri rapporti prefissati.
Secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, ad esempio, si possono omogenizzare 10-30 gr di fango disidratato, opzionalmente 20 gr, con 150-200 ml, opzionalmente 180 ml, di soluzione salina peptonata sterile.
Successivamente, il metodo 1 della presente invenzione, comprende una fase B di diluizione della sospensione primaria 2 ottenuta alla fase A, in cui in corrispondenti primi contenitori (31, 32, 33) si preparano una o pi? diluizioni successive (21, 22, 23) della sospensione primaria 2, ciascuna diluizione successiva (21, 22, 23) avendo un rispettivo rapporto di diluizione (R1, R2, R3) rispetto alla sospensione primaria 2 (si veda in particolare la Figura 3a).
Secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, i rapporti di diluizione R1, R2, R3 rispetto alla sospensione primaria 2 sono decimali decrescenti, ad esempio rispettivamente pari a 10<-1>, 10<-2>, 10<-3>, anche se, a seconda del caso, la sospensione primaria 2 potrebbe essere diluita ulteriormente e/o secondo rapporti di diluizione del tutto diversi da questi. Ad esempio, il rapporto di diluizione potrebbe essere di 1 a 2 tra una diluzione e la successiva. La preparazione di ciascuna diluizione successiva (21, 22, 23) comprende di inoculare nel rispettivo primo contenitore (31, 32, 33) una quantit? predeterminata di sospensione primaria 2 in una quantit? prefissata di soluzione salina peptonata sterile , per cui al termine della fase B di diluizione si ottengono primi contenitori (31, 32, 33), ciascuno contenente una concentrazione diversa di sospensione primaria 2.
A titolo puramente esemplificativo, secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, si possono ottenere tre diluizioni (21, 22, e 23) della sospensione primaria 2, con rapporti di diluizione R1= 10<-1>, R2= 10<-2>, R3= 10<-3 >come segue:
- una prima diluizione 21 con rapporto di diluizione R1 si ottiene prendendo 10 ml di sospensione primaria 2 e versandoli in un primo contenitore 31 contenente 90 ml di soluzione salina peptonata sterile ,
- una seconda diluizione 22 con rapporto di diluizione R2 si ottiene prendendo 10 ml dal primo contenitore 31 contenente la prima diluizione 21 con rapporto di diluizione R1 e versandoli in un altro primo contenitore 32 contenente 90 ml di soluzione salina peptonata sterile e
- una terza diluizione 23 con rapporto di diluizione R3 si ottiene prendendo 10 ml da quest?ultimo primo contenitore 32 contenente la seconda diluizione 22 diluita con rapporto di diluizione R2 e versandoli in un ulteriore primo contenitore contenente 90 ml di soluzione salina peptonata sterile .
Chiaramente, per ottenere delle ulteriori diluizioni si pu? procedere in modo analogo, prelevando ad esempio 10 ml da un contenitore contenente l?ultima diluizione della sospensione primaria, cio? quella in cui il rapporto di diluizione ? maggiore rispetto ai rapporti di diluizione delle altre diluizioni, e aggiungendolo ad un altro primo contenitore contenente 90 ml di soluzione salina peptonata sterile.
Quindi, il metodo 1 della presente invenzione comprende una fase C di pre-arricchimento, in cui si inocula una quantit? predefinita della sospensione primaria 2 e di ciascuna diluizione successiva (21, 22, 23) della sospensione primaria 2, in uno o pi? rispettivi secondi contenitori (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443), ciascuno contenente almeno una quantit? predefinita di terreno mediamente selettivo; e si lascia incubare ad una certa temperatura per un certo tempo (si veda per riferimento la Figura 3b che illustra i secondi contenitori con la sospensione primaria e le sue diluizioni prearricchite dopo incubazione).
A titolo esemplificativo, secondo una forma preferita dell?invenzione, la fase C di pre-arricchimento comprende:
- inoculare 10 ml di sospensione primaria 2 tal quale (T.Q.) in una pluralit? di, opzionalmente tre, secondi contenitori (401, 402, 403), ciascuno contenente 90 ml di terreno mediamente selettivo, opzionalmente comprendente un brodo alla Selenite-cistina;
- inoculare 1 ml di sospensione primaria 2 tal quale (T.Q.) in una pluralit? di, opzionalmente tre, secondi contenitori (411, 412, 413), ciascuno contenente 9 ml di terreno mediamente selettivo opzionalmente comprendente un brodo alla Selenite-cistina;
- inoculare 1 ml della prima diluizione 21, diluita cio? secondo il rapporto di diluizione R1, in una pluralit? di , opzionalmente tre, secondi contenitori (421, 422, 423), ciascuno contenente 9 ml di terreno mediamente selettivo, opzionalmente comprendente un brodo alla Selenite-cistina;
- inoculare 1 ml della seconda diluizione 22, diluita cio? secondo il rapporto di diluizione R2, in una pluralit? di , opzionalmente tre, secondi contenitori (431, 432, 433), ciascuno contenente 9 ml di terreno mediamente selettivo, opzionalmente comprendente un brodo alla Selenite-cistina;
- inoculare 1 ml della terza diluizione 21, diluita cio? secondo il rapporto di diluizione R3, in una pluralit? di, opzionalmente tre, secondi contenitori (441, 442, 443), ciascuno contenente 9 ml di terreno mediamente selettivo, opzionalmente comprendente un brodo alla Selenite-cistina; e
- incubare i secondi contenitori (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443) contenenti la sospensione primaria 2 o la sospensione diluita (21, 22, 23) cos? pre-arricchita ad una temperatura compresa tra 36?5?C, opzionalmente compresa tra 36?4?C, pi? opzionalmente compresa tra 36?1?C per 21?3 ore.
Vantaggiosamente, a differenza del metodo tradizionale, il metodo 1 della presente invenzione comprende quindi una fase D di estrazione del genoma contenuto in ciascun secondo contenitore (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443).
Pi? in particolare, la fase D comprende (si veda la Figura 3c):
- trasferire una quantit? predefinita, opzionalmente inferiore a 2 ml, pi? opzionalmente pari a circa 1 ml, di sospensione primaria 2 pre-arricchita o di sospensione primaria diluita (21, 22, 23) pre-arricchita contenuta in un secondo contenitore (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443) in un rispettivo terzo contenitore vuoto e sterile (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543);
- aggiungere a ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) una quantit? predefinita, opzionalmente inferiore a 2 ml, pi? opzionalmente pari a circa 1 ml, di almeno un buffer di lisi, per rompere le cellule ivi contenute; e
- centrifugare, allo scopo di separare il surnatante, che comprende il genoma, dal pellet, che contiene detriti cellulari e materiale di varia natura eventualmente presente in ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543).
La fase D si conclude ottenendo la separazione del genoma eventualmente presente in ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) dai detriti cellulari.
Secondo una variante della presente invenzione, l?aggiunta del buffer di lisi e la centrifugazione possono essere eseguite in successione. La lisi, ad una temperatura almeno pari o superiore ad una temperatura minima (TMIN) per almeno un intervallo temporale minimo di lisi (tmin), in un bagno termostatico, e la centrifugazione per almeno un intervallo temporale minimo (tMIN).
Si precisa inoltre che le quantit? di sospensione primaria 2 pre-arricchita o di sospensione primaria diluita (21, 22, 23) trasferite nei rispettivi terzi contenitori vuoti e sterili (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) e le quantit? dei buffer di lisi rispettivamente aggiunti possono anche essere diverse da quelle sopra indicate, purch? tra esse si mantenga il rapporto 1:1.
Nel caso specifico della determinazione della concentrazione del batterio della Salmonella spp., la fase D comprende l?aggiunta a ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) di almeno un buffer di lisi, di un tipo adatto allo scopo e comunemente in commercio, e la lisi cellulare viene eseguita su ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) ed avviene per almeno un intervallo temporale minimo di lisi (tmin), opzionalmente compreso tra 25 e 35 min, pi? opzionalmente pari a 30 min, in un bagno termostatico ad una temperatura almeno pari o superiore ad una temperatura minima (TMIN), dove TMIN ? opzionalmente pari a 60?C, pi? opzionalmente pari a 65?C.
La successiva centrifugazione viene eseguita per un tempo minimo tMIN opzionalmente inferiore a 10 minuti, pi? opzionalmente pari a 5 minuti, ad una velocit? compresa tra 7500/rpm e 9000/rpm, opzionalmente pari a 8500 rpm.
I parametri di esecuzione della fase D sopra riportati consentono una estrazione ottimale del genoma presente nella sospensione contenuta in ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) ), rispetto a corrispondenti metodi normalmente impiegati per l?estrazione del genoma da un campione di tipo analogo a quello della presente invenzione, i quali richiedono invece tempi inferiori e temperature superiori.
Quindi, il metodo 1 della presente invenzione comprende una fase E (si veda la Figura 3d) di preparazione di una pluralit? di tubi (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), ciascuno con una quantit? prefissata, opzionalmente inferiore a 5 ? l, pi? opzionalmente pari a circa 3 ? l, del contenuto di un rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543). Ciascun tubo o provetta (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) comprende anche almeno una quantit? prestabilita di un?altra sostanza, cio? almeno un reagente (Primer in gergo tecnico) con cui il genoma del batterio di interesse, se presente nel contenuto del rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) si mescola. Secondo una variante della presente invenzione, se in ciascun tubo o provetta (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) non fosse gi? presente il suddetto almeno un reagente (primer in gergo tecnico), il metodo 1 della presente invenzione prevederebbe di aggiungere una quantit? prestabilita di tale almeno un reagente che, quindi, verrebbe mescolato al genoma del batterio di interesse, se presente nel contenuto del rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543). Nel caso specifico della Salmonella spp., ciascun tubo o provetta (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) contiene un set di reagenti pronto all?uso denominato Salmonella Screen Glow codice EBT 615 prodotto dalla ENBIOTECH SRL e distribuito da Avantech group SRL.
Successivamente, il metodo della presente invenzione comprende una fase successiva F di applicazione di almeno una procedura di analisi qualitativa (si veda la Figura 3e), configurata per rilevare la presenza o assenza del genoma del batterio di interesse in ciascun tubo o provetta (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643). All?esito di questa fase, si ottiene in uscita, per ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), un corrispondente indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13; I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) correlato alla presenza (segno ?+? nelle successive tabelle) o all?assenza (segno ?-? nelle successive tabelle) del genoma del batterio di interesse nel tubo esaminato.
Secondo un aspetto particolarmente vantaggioso dell?invenzione, la procedura di analisi qualitativa del metodo 1 della presente invenzione comprende l?amplificazione isotermica (o Loop-mediated isothermal amplification o LAMP) del genoma del batterio di interesse, eventualmente presente in ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), innescata al termine della fase precedente E, quando il contenuto di ciascun terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) ? stato trasferito nel rispettivo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) e mescolato con l?almeno un reagente.
Pi? in particolare, questa procedura di analisi qualitativa comprende: - attendere un tempo prestabilito di amplificazione durante il quale avviene l?amplificazione del genoma del batterio di interesse contenuto in ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), innescata al termine della fase precedente; e
- applicare una tecnica di rilevamento della presenza o meno di tale genoma. Si noti che le suddette due fasi di attesa del tempo prestabilito di amplificazione e di applicazione della tecnica di rilevamento della presenza o meno di tale genoma possono essere eseguite contemporaneamente.
Secondo un aspetto particolarmente vantaggioso dell?invenzione, l?amplificazione del genoma del batterio di interesse eventualmente presente in ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) avviene durante un arco di tempo di amplificazione, opzionalmente inferiore a 90 minuti, pi? opzionalmente pari a 60 minuti.
Inoltre, la tecnica di rilevamento impiegata nel metodo 1 della presente invenzione pu? essere una tecnica fotometrica, in base alla quale si rileva, durante l?intervallo di tempo prestabilito di amplificazione, una radiazione luminosa fluorescente emessa da ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), per effetto dell?amplificazione del genoma innescata al termine della fase precedente di preparazione del tubo stesso, quando il genoma eventualmente estratto alla fase D viene mescolato all?almeno un reagente di amplificazione gi? presente o aggiunto nel tubo. La radiazione luminosa fluorescente viene rilevata mediante uno spettro-fluorimetro e il suo andamento temporale viene memorizzato.
Sulla base del fatto che la rispettiva radiazione luminosa fluorescente emessa rilevata dal dispositivo rilevatore superi o meno un valore di soglia predefinito o assuma un andamento temporale predefinito o meno, si fornisce quindi in uscita, per ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) un corrispondente indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13; I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) di presenza o assenza nel tubo esaminato, del genoma del batterio di interesse.
Pi? in particolare, durante questa fase F, l?intensit? della radiazione fluorescente emessa da ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) pu? avere un andamento temporale del tipo a sigmoide, se l?amplificazione del genoma ? avvenuta, con conseguente emissione di fluorescenza ? in questo caso il tubo risulta essere ?positivo? (cio? contiene il genoma di interesse). Al contrario, l?andamento dell?intensit? della radiazione fluorescente emessa pu? essere del tipo lineare, se l?amplificazione del genoma non ? avvenuta (perch? il genoma non ? presente nel tubo esaminato) ? in questo caso il tubo risulta essere ?negativo? (cio? non contiene il genoma di interesse).
Il metodo 1 della presente invenzione, quindi, comprende vantaggiosamente l?applicazione, sulla base di ciascun indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13; I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) di presenza o assenza del genoma del batterio di interesse, determinato alla fase F precedente, di una procedura di analisi quantitativa (fase G), configurata per determinare il valore del numero pi? probabile di batteri di interesse, per grammo di campione (MPN/g) e/o del numero pi? probabile di batteri di interesse per grammo (MPN/g ss) di sostanza secca, nel campione di matrice ambientale esaminata.
A questo riguardo, la procedura di analisi quantitativa comprende una tecnica analitica statistica di conteggio indiretto del numero pi? probabile di batteri di interesse nel campione esaminato. Nello specifico, comprende:
- determinare, sulla base di ciascun indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13; I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) di presenza o assenza di tale genoma, un Numero Caratteristico (NC), secondo la tecnica della conta del valore MPN (most probable number); e
- determinare analiticamente, opzionalmente mediante l?interrogazione di un database o la consultazione di una tabella di consultazione 7, il valore del numero pi? probabile di batteri di interesse per grammo di campione (MPN/g) e/o del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo (MPN/g ss) di sostanza secca, in funzione del numero caratteristico (NC), del rapporto di diluizione (R1, R2, R3) e del peso percentuale di sostanza secca del campione esaminato, ad esempio come indicato nei Rapporti Istisan 14/18 ? ISS F 002B rev. 00 dell?Istituto Superiore di Sanit?.
A titolo puramente esemplificativo, si forniscono nel seguito i dettagli di alcune prove sperimentali condotte applicando sia il metodo tradizionale, che il metodo 1 della presente invenzione, per la determinazione della concentrazione di Salmonella spp. in un campione di fango disidratato derivante dalla depurazione delle acque reflue.
Esempio 1
Metodo tradizionale
Una quantit? prefissata pari a 20 gr di campione di fango disidratato derivante dalla depurazione delle acque reflue ? stata analizzata secondo la metodica tradizionale riassunta in premessa, per la determinazione della concentrazione di Salmonella spp.
Secondo la metodica tradizionale, si sono ottenute alla fase (b) tre diluizioni decimali successive - della sospensione primaria ottenuta alla fase (a) - con rispettivi rapporti di diluzione (10<-1>, 10<-2>, 10<-3>) e si ? proceduto fino alla fase (e) con l?ottenimento di rispettive piastre contenenti, se presente, colonie del batterio della Salmonella spp. nei terreni di coltura Rambach agar e XLT4 agar. Si ? quindi preso nota del numero di piastre in cui ? stata rilevata, mediante i suddetti test di identificazione biochimici e sierologici, la presenza (segno ?+? nella tabella riportata in seguito) o l?assenza (segno ?-? nella tabella riportata in seguito) del batterio di Salmonella spp. e si ? identificato il Numero caratteristico (NC), considerando che, come ? noto, esso corrisponde ad un numero a tre cifre, derivato a partire dai risultati di tre diluizioni successive (corrispondenti alle piastre esaminate) aventi il rapporto di diluizione maggiore, per cui in almeno una piastra ? stata rilevata la presenza del batterio di interesse (in breve, per cui il numero di piastre positive ? >0).
Secondo la metodica tradizionale, si ricorda che il Numero caratteristico NC va determinato, quando ? possibile, scegliendo tre diluizioni successive per le quali i risultati non sono n? totalmente positivi n? totalmente negativi, cio? per le quali non tutte le piastre analizzate rilevano la presenza del batterio oppure non tutte le piastre analizzate rilevano l?assenza del batterio. Se ci? non ? possibile, ? preferibile scegliere le tre diluizioni successive con rapporto di diluizione maggiore, in cui tutte le piastre analizzate rilevano la presenza del batterio. Se meno di tre diluizioni successive mostrano risultati positivi (cio? almeno una piastra in cui ? rilevata la presenza del batterio), per la determinazione del numero caratteristico va considerata la diluizione contenente la concentrazione pi? alta nel campione e le due diluizioni successive. Se ci sono piastre positive (in cui si rileva la presenza del batterio di interesse) solo per una delle diluizioni seriali, per determinare il Numero caratteristico NC va considerata quella diluizione con risultato positivo insieme alle diluizioni negative precedente e successiva.
La Tabella 1 sottostante riporta i risultati ottenuti nella prova sperimentale condotta applicando il metodo tradizionale.
Tabella 1
Sulla base dei risultati ottenuti, si ? determinato che il NC ? pari a 320. Da qui, secondo la metodica tradizionale, per determinare la concentrazione di batterio nel campione esaminato si ? consultata la tabella 7 di consultazione, illustrata in Fig.4, da cui si ? ricavato che per un NC pari a 320, il corrispondente valore MPN/g ? pari a 9,3. Per poter esprimere il risultato come MPN/g ss (sostanza secca) si ? tenuto conto del fattore di diluizione e della % di peso della matrice ambientale 2. In questo caso specifico, con un valore di peso disidratato del 20% e sulla base dei risultati derivati dalle diluizioni eseguite, si ? determinato che il valore in MPN/g ss ? pari a 4650.
Metodo secondo l?invenzione
Secondo il metodo della presente invenzione, ? stato preparato un campione di sospensione primaria 2 contenente 20 gr di fango disidratato derivante dalla depurazione delle acque reflue e 180 ml di soluzione salina peptonata sterile (fase A).
Si ? proceduto come sopra descritto con la preparazione di tre diluizioni decimali successive - della sospensione primaria ottenuta alla fase A - con rispettivi rapporti di diluzione (10<-1>, 10<-2>, 10<-3>) e con la preparazione dei secondi contenitori pre-arricchiti (Fase C). Quindi, alla fase D ? stato estratto il genoma contenuto nei terzi contenitori, utilizzando un adatto buffer di lisi e, incubando in terzi contenitori alla temperatura pari a 65?C per 30 minuti in bagno termostatico si ? ottenuta la rottura delle cellule e la fuoriuscita del genoma dal comparto cellulare. Con la successiva centrifugazione si ? separato il genoma dal resto del materiale che si ? depositato, invece, sul fondo dei terzi contenitori, sotto forma di sedimento (denominato in gergo tecnico pellet).
Si sono quindi preparati i tubi (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) alla fase E, come sopra descritto e si ? eseguita la procedura di analisi qualitativa di cui sopra (fase F), per cui il genoma della Salmonella spp. eventualmente contenuto in ciascun tubo ? stato amplificato mediante tecnologia LAMP ed inoltre si ? rilevata la sua presenza o assenza mediante un sistema per analisi di biologia molecolare (l?ICGENE mini Cat. No. EBT 801, prodotto dalla ENBIOTECH SRL).
Successivamente, ? stata applicata la procedura di analisi quantitativa sopra descritta (fase G), in cui si ? determinato il Numero caratteristico NC, vantaggiosamente sulla base dei risultati della procedura di analisi qualitativa, ottenendo, cos? il valore dell?MPN /g o MPN/g ss.
La Tabella 2 sottostante riporta i risultati ottenuti nella prova sperimentale condotta applicando il metodo tradizionale.
Tabella 2
Anche in questo caso si deriva un NC ed ? pari a 320, cui si associa un valore di MPN/g pari a 9,3, sulla base di quanto riportato nella tabella 7 di consultazione. Tenendo conto della diluizione e del peso disidratato del fango al 20% nel campione di partenza, il valore in MPN/g ss risulta pari a 4650.
Come ? evidente, quindi, il metodo 1 della presente invenzione fornisce lo stesso risultato del metodo tradizionale nella stessa unit? di misura MPN/g ss.
Esempio 2
Con il metodo tradizionale e con il metodo della presente invenzione sopra descritti per la quantificazione della concentrazione di Salmonella spp. sono stati analizzati dieci (10) campioni di fango disidratato, derivanti dalla depurazione delle acque reflue.
La Tabella 3 e l?istogramma che segue riportano i risultati conseguiti.
Tabella 3
Dall?osservazione della Tabella 3 e dell?istogramma, appare del tutto evidente che i risultati dei due metodi sono pressoch? identici. Vi sono delle rare variazioni nei risultati che sono verosimilmente dovuti alla variabilit? sperimentale e/o al fatto che, le procedure di biologia molecolare sono notoriamente pi? sensibili.
Alla luce di quanto sopra appare del tutto evidente che il metodo della presente invenzione risolve i problemi rappresentati in premessa.
Infatti, il metodo 1 della presente invenzione sfrutta vantaggiosamente la combinazione di una procedura di analisi qualitativa (nello specifico la LAMP) e di una procedura di analisi quantitativa (nello specifico la conta MPN), in particolare una elaborazione statistica che consente di avere un risultato quantitativo partendo dal numero caratteristico NC, che esprime sostanzialmente una combinazione di tubi positivi e negativi , per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in un campione di matrice ambientale, in tempi molto pi? rapidi, impiegando meno materiale, ad un costo inferiore e in condizioni di minor rischio biologico.
La Tabella 4 che segue riassume sinteticamente alcuni degli aspetti rilevati dal confronto del metodo 1 della presente invenzione con quello tradizionale.
Tabella 4
Come si pu? notare, il metodo della presente invenzione ? dalle 6 alle 10 volte pi? rapido del metodo tradizionale, grazie alla possibilit? di estrarre, se presente, il genoma del batterio di interesse dal campione di matrice ambientale analizzato e alla possibilit? di identificarlo e quantificarlo mediante la combinazione di una procedura di analisi qualitativa, molto veloce rispetto alle procedure di identificazione tradizionali che richiedono, come si ? descritto in premessa, l?isolamento del batterio su terreni di coltura, dopo aver atteso il tempo necessario alla sua moltiplicazione, e di una procedura di analisi quantitativa. Il metodo della presente invenzione consente di fornire la concentrazione del batterio della Salmonella spp. in un campione di fango disidratato in meno di 24 ore.
Come si noter?, il metodo della presente invenzione consente vantaggiosamente anche di ottenere, grazie alla consultazione della tabella 7, l?incertezza della misura, il che lo rende un metodo del tutto affidabile.
Non solo la procedura sopra descritta rende il metodo della presente invenzione pi? semplice da eseguire rispetto al metodo tradizionale ma, vantaggiosamente, richiede anche l?impiego di una quantit? minore di materiali, che occupano anche ingombro inferiore rispetto al metodo tradizionale e sono quindi pi? facili da gestire dal punto di vista logistico.
Inoltre, da una stima dei costi richiesti per l?esecuzione del metodo, comprendenti non solo il costo del materiale ma anche il costo di ore uomo necessarie per l?esecuzione del metodo, ? emerso che il metodo della presente invenzione consente di risparmiare circa il 25% dei costi richiesti dal metodo tradizionale.
Non ultimo, il metodo della presente invenzione minimizza il rischio biologico. Infatti, dopo la lisi cellulare il batterio patogeno di interesse non ? pi? infettivo; mentre nel metodo tradizionale il rischio biologico ? sempre presente, dato che richiede, per la sua esecuzione, la crescita o moltiplicazione del batterio stesso. In quel che precede sono state descritte le preferite forme di realizzazione e sono state suggerite delle varianti della presente invenzione, ma ? da intendersi che gli esperti del ramo potranno apportare modificazioni e cambiamenti senza con ci? uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.
Claims (10)
1. Metodo (1) per determinare la concentrazione di un batterio di interesse in una matrice ambientale, comprendente le seguenti fasi operative:
A. Preparare almeno una sospensione primaria (2) di un campione di detta matrice ambientale, ottenendo la disgregazione delle particelle di detta matrice ambientale e la separazione di detto almeno un batterio di interesse, se presente, da detta matrice ambientale;
B. Preparare una o pi? diluizioni (21, 22, 23) di detta almeno una sospensione primaria (2) in rispettivi primi contenitori (31, 32, 33);
C. Pre-arricchire detta almeno una sospensione primaria (2) e detta una o pi? diluizioni (21, 22, 23) in rispettivi secondi contenitori (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443), ottenendo cos? in ciascun secondo contenitore la moltiplicazione di detto almeno un batterio di interesse, se presente;
D. estrarre il genoma del contenuto di ciascun secondo contenitore (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443) in un rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543);
E. Preparare, almeno una pluralit? di tubi (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), ciascun tubo della pluralit? di tubi contenente detto genoma contenuto in un rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543);
F. Applicare a ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) almeno una procedura di analisi qualitativa, detta procedura di analisi qualitativa essendo configurata per rilevare la presenza o assenza del genoma di detto batterio di interesse, fornendo in uscita per ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643) un corrispondente indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13;I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) di presenza o assenza di detto genoma di detto batterio di interesse; G. Sulla base di ciascun indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13;I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) di presenza o assenza di detto genoma di detto batterio di interesse, applicare una procedura di analisi quantitativa, detta procedura di analisi quantitativa essendo configurata per determinare il valore del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo di campione (MPN/g) e/o del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo (MPN/g ss) di sostanza secca in detto almeno un campione di matrice ambientale.
2. Metodo (1) secondo la rivendicazione 1, in cui detta fase D comprende, per ciascun secondo contenitore (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443):
- trasferire una quantit? predefinita, opzionalmente inferiore a 2 ml, pi? opzionalmente pari a circa 1 ml, di detta sospensione primaria (2) pre-arricchita o di detta sua diluizione (21, 22, 23) pre-arricchita, in detto rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543); - aggiungere a detto terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) una quantit? predefinita di almeno un buffer di lisi, ad una temperatura almeno pari o superiore ad una temperatura minima TMIN, per rompere le cellule ivi contenute; e
- centrifugare, detto almeno un terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) per almeno un tempo minimo tMIN.
3. Metodo (1) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta fase E di preparare detta almeno una pluralit? di tubi (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643), comprende:
- trasferire una quantit? predefinita del contenuto di ciascun rispettivo terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543), opzionalmente inferiore a 5 ? l, pi? opzionalmente pari a 3 ? l, in un rispettivo tubo della pluralit? di tubi contenente detto genoma contenuto in un (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643); e opzionalmente
- aggiungere almeno una quantit? predefinita di almeno un reagente di amplificazione.
4. Metodo (1) secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detta procedura di analisi qualitativa comprende per ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643):
- attendere un intervallo di tempo predeterminato di amplificazione, durante il quale avviene l?amplificazione di detto genoma di detto batterio di interesse in esso eventualmente contenuto, opzionalmente mediante una tecnica di amplificazione isotermica mediata da loop;
- applicare una tecnica di rilevamento di detto genoma cos? amplificato, fornendo in uscita un rispettivo indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13;I21, I22, I23; I31, I32, I33; I41, I42, I43) di presenza o assenza di detto genoma.
5. Metodo (1) secondo la rivendicazione 4, in cui detta tecnica di rilevamento di detto genoma ? una tecnica fotometrica che comprende, per ciascun tubo (601, 602, 603; 611, 612, 613; 621, 622, 623; 631, 632, 633; 641, 642, 643; 651, 652, 653):
- rilevare durante detto intervallo di tempo predeterminato di amplificazione, almeno una radiazione luminosa fluorescente da questo emessa, per effetto dell?amplificazione del genoma innescata al termine di detta fase E; e
- fornire in uscita un corrispondente indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13; I11, I12, I13; I11, I12, I13; I11, I12, I13; I11, I12, I13) di presenza o assenza di detto genoma, sulla base del fatto che detta almeno una radiazione luminosa fluorescente emessa da ciascun tubo cos? rilevata superi o meno almeno un valore di soglia predefinito o abbia o meno un certo andamento temporale.
6. Metodo (1) secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detta procedura di analisi quantitativa comprende una tecnica analitica statistica di conteggio indiretto del numero pi? probabile di detti batteri di interesse in detto almeno un campione di matrice ambientale.
7. Metodo (1) secondo la rivendicazione 6, in cui detta procedura di analisi quantitativa comprende:
- determinare, sulla base di ciascun indice (I01, I02, I03; I11, I12, I13; I11, I12, I13; I11, I12, I13; I11, I12, I13; I11, I12, I13) di presenza o assenza di detto genoma, un Numero Caratteristico (NC), secondo la tecnica della conta del valore MPN (most probable number); e
- determinare analiticamente, opzionalmente mediante l?interrogazione di un database o la consultazione di una tabella di consultazione (7), il valore del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo di campione (MPN/g) e/o del numero pi? probabile di detti batteri di interesse per grammo (MPN/g ss) di sostanza secca, in funzione di detto numero caratteristico (NC), di detto rapporto di diluizione (R1, R2, R3) e di detto peso percentuale di sostanza secca in detto campione (2).
8. Metodo (1) secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, in cui detto almeno un batterio di interesse ? la Salmonella spp.
9. Metodo (1) secondo la rivendicazione 8, in cui detta fase C comprende di inoculare, in rispettivi secondi contenitori (401, 402, 403; 411, 412, 413; 421, 422, 423; 431, 432, 433; 441, 442, 443) una quantit? prefissata di detta almeno una sospensione primaria (2) o di detta almeno un sua diluizione (21, 22, 23) in una quantit? predeterminata di un terreno mediamente selettivo a base di Selenite-cistina e incubare ad una temperatura compresa tra 36?5 ?C, opzionalmente compresa tra 36?4?C, pi? opzionalmente compresa tra 36?1?C per 21?3 ore.
10. Metodo (1) secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui in detta fase D la lisi cellulare del contenuto di detto almeno un terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) viene eseguita per almeno un intervallo temporale minimo di lisi tmin, opzionalmente compreso tra 25 e 35 min, pi? opzionalmente pari a 30 min ad una temperatura almeno pari o superiore ad una temperatura minima TMIN, dove TMIN, ? opzionalmente pari a 60?C, pi? opzionalmente pari a 65?C ed in cui la centrifugazione di detto almeno un terzo contenitore (501, 502, 503; 511, 512, 513; 521, 522, 523; 531, 532, 533; 541, 542, 543) viene eseguita per un intervallo temporale minimo tMIN opzionalmente inferiore a 10 minuti, pi? opzionalmente pari a 5 minuti, ad una velocit? compresa tra 7500/rpm ed 9000/rpm, opzionalmente pari a 8500 rpm.
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1231280A1 (en) * | 1999-08-25 | 2002-08-14 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | METHOD OF DETECTING AND QUANTITATING MICROORGANISM HAVING SPECIFIC FUNCTION AND ITS GENE FROM NATURAL ENVIRONMENT, NOVEL 16SrRNA GENE DATA AND PROBES |
| US20040241644A1 (en) * | 2003-05-16 | 2004-12-02 | Institute For Environmental Health, Inc. | Enrichment methods for the detection of pathogens and other microbes |
Family Cites Families (1)
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1231280A1 (en) * | 1999-08-25 | 2002-08-14 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | METHOD OF DETECTING AND QUANTITATING MICROORGANISM HAVING SPECIFIC FUNCTION AND ITS GENE FROM NATURAL ENVIRONMENT, NOVEL 16SrRNA GENE DATA AND PROBES |
| US20040241644A1 (en) * | 2003-05-16 | 2004-12-02 | Institute For Environmental Health, Inc. | Enrichment methods for the detection of pathogens and other microbes |
Also Published As
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