IT202000012577A1 - Composizione farmaceutica per l’inibizione chimica di tgs1 come trattamento terapeutico per le telomeropatie - Google Patents
Composizione farmaceutica per l’inibizione chimica di tgs1 come trattamento terapeutico per le telomeropatie Download PDFInfo
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Description
"COMPOSIZIONE FARMACEUTICA PER L?INIBIZIONE CHIMICA DI TGS1
COME TRATTAMENTO TERAPEUTICO PER LE TELOMEROPATIE?
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un inibitore dell?enzima TGS1 (trimethylguanosine synthase 1), in particolare Sinefungin, per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri. L?invenzione si riferisce anche ad una composizione farmaceutica comprendente tale inibitore e uno o pi? eccipienti.
Tale inibitore pu? essere impiegato per il trattamento terapeutico di condizioni patologiche caratterizzate e/o causate da un eccessivo accorciamento dei telomeri (telomeropatie). La presente invenzione fornisce inoltre un metodo in vitro per aumentare il dosaggio di TERC e favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o in tessuti ottenuti da pazienti affetti da suddette patologie.
STATO DELL?ARTE
Le telomeropatie includono una variet?? di malattie genetiche causate da mutazioni nei geni che codificano per proteine che regolano la stabilita? dei telomeri e l?attivita? della telomerasi, l?enzima che mantiene costante la lunghezza dei telomeri proteggendo dalla senescenza cellulare e dall?apoptosi (Niewisch, M.R. & Savage, S.A. Expert Rev Hematol, 2019). Le telomeropatie, tra cui la discheratosi congenita (DC) l'anemia aplastica, la fibrosi polmonare idiopatica, la sindrome di Hoyeraal?Hreidarsson, sono malattie genetiche accomunate da un simile difetto primario: telomeri eccessivamente corti e forte riduzione del potenziale replicativo di diversi tipi di cellule staminali (Niewisch, M.R. & Savage, S.A. Expert Rev Hematol, 2019). Particolarmente colpite sono le cellule staminali della linea ematopoietica, con conseguente sviluppo di anemia ed immunodeficienza. Una delle principali speranze di trattamento terapeutico consiste nell?identificazione di strategie che possano controbilanciare le cause di disfunzionalita? telomerica e favorire l?allungamento dei telomeri nelle cellule dei pazienti (Boyraz, B. et al. J. Clin Invest 126, 2016; Fok, W.C. et al. Blood 133, 2019). Al momento non esistono trattamenti efficaci che agiscano direttamente sui fattori causativi della patologia ed il trapianto rappresenta l?unica speranza di alleviare gli effetti specifici causati dal danneggiamento dei tessuti.
Uno dei meccanismi principali nella patogenesi delle telomeropatie e? rappresentato da un basso dosaggio di TERC, la componente ad RNA dell?enzima telomerasi, che comporta la riduzione della sua attivita?, con conseguente accorciamento progressivo dei telomeri. Il deficit di TERC e? causato da perdita di funzione ed aploinsufficienza per il gene che codifica l?RNA TERC o da mutazioni recessive nei geni che codificano per PARN e Dyskerin, due proteine essenziali per la maturazione e per la stabilita? dell?RNA TERC. Mutazioni in questi tre geni sono trovate ad alta frequenza nei pazienti DC. La caratterizzazione delle mutazioni nei geni PARN e Dyskerin e l?aploinsufficienza di TERC hanno rivelato che anche una lieve riduzione del dosaggio di questo RNA ha conseguenze fenotipiche molto severe e comporta un drastico accorciamento dei telomeri (Armanios, M. & Blackburn, E.H. Nat Rev Genet 13, 2012).
Una potenzialita? terapeutica molto promettente e? rappresentata dall?identificazione di meccanismi che aumentino il dosaggio di TERC, al fine di controbilanciare il progressivo accorciamento dei telomeri nelle cellule dei pazienti. L'interesse verso l?identificazione di nuovi trattamenti efficaci e? enorme.
I trattamenti attualmente disponibili per le telomeropatie (ad esempio il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, nel caso di malattie con insufficienza del midollo osseo, come la DC) non agiscono direttamente sul fattore causativo primario, cio?? i telomeri corti. Specificatamente, non sono noti composti con efficacia riconosciuta, che possano essere utilizzati per stimolare l?allungamento telomerico nel trattamento di pazienti con telomeropatie e mirati a controbilanciare il deficit causato da un ridotto dosaggio dell?RNA della telomerasi.
La possibilit?? di rigenerare i telomeri nelle cellule dei pazienti, per aumentarne il potenziale replicativo, rappresenta un?eccellente opportunit?? terapeutica.
Sinefungin
Sinefungin e? un inibitore di diverse metiltransferasi specifiche per gli acidi nucleici, che utilizzano l?Adenosil Metionina (Ado-Met) quale donatore di gruppi metilici. Il meccanismo d?azione consiste nella competizione con Ado-Met per il legame al sito donatore di gruppi metilici presente sull?enzima (Schluckebier, G. et al. J Mol Biol 265, 1997). Diversi studi hanno dimostrato che la Sinefungin possiede propriet?? antimicrobiche (Yadav M.K. et al. Biomed Res Int, 2014) ed antivirali (Zhao Z. et al. BMC Bioinformatics 17, 2016; Hercik K. et al. Arch Virol 162, 2017) queste ultime determinate dalla capacita? di questa molecola di bloccare l?attivita? delle metiltransferasi che aggiungono gruppi metilici al cap presente all?estremit? 5? degli RNA virali (RNA guanine-N7 methyltransferase) (Pugh C.S. et al. J. Biol Chem 253, 1978; Zheng S. et al. J Biol Chem 281, 2006; Li J. et al. J Virol 81, 2007). La molecola ha mostrato anche efficacia antifungina, mediata dall?inibizione degli enzimi mRNA cap guanine-N7 methyltransferase e Ado-Met synthase (Zheng S. et al. Nucleic Acids Res 35, 2007). Gli enzimi coinvolti nella pathway di modificazione del cap al 5? sono differenti nei virus, nei funghi e nei mammiferi e Sinefungin inibisce con efficacia dieci volte superiore, l?enzima cap methyltransferase fungino rispetto all?ortologo umano (Chrebet G.L. et al. J Biomol Screen 10, 2005). Sinefungin ha mostrato attivita? inibitoria contro i protozoi del genere Leishmania (Bhattacharya A. et al. Mol Cell Biol 12, 1992), Trypanosoma (McNally K.P. & Agabian N. Mol Cell Biol 12, 1992), Plasmodium (Trager W. et al. Exp Parasitol 50, 1980) e su Entamoeba histolytica (Ferrante A. et al. Trans R Soc Trop Med Hyg 78, 1984). Il trattamento con Sinefungin ha aumentato la sopravvivenza di topi infettati con Toxoplasma gondii (Ferrante A. et al. C R Acad Sci III 306, 1988) e con vari isolati di Leishmania (Avila J.L. Am J Trop Med Hyg 43, 1990; Paolantonacci P. et al. Antimicrob Agents Chemother 28, 1985), senza mostrare effetti tossici clinicamente rilevabili. Tuttavia, effetti nefrotossici sono stati rilevati in due studi con dosi elevate, condotti in capre (Zweygarth E. et al. Trop Med Parasitol 37, 1986) e cani (Robert-Gero M. et al. NATO ASI Series book series (NSSA, volume 171) Leishmaniasis, 1989). Sono stati sviluppati e testati diversi analoghi della Sinefungin (Devkota K. et al. ACS Med Chem Lett 5, 2014; Zheng W. Et al. J Am Chem Soc 134, 2012; Liu Q. et al. Bioorg Med Chem 25, 2017; Niitsuma M. et al. J Antibiot (Tokyo) 63, 2010; Tao Z. et al. Eur J Med Chem 157, 2018), per ottimizzarne le proprieta? antiparassitarie. La sua similarita? con la S-adenosil-metionina, rende la Sinefungin un potenziale coadiuvante terapeutico nella homocystinuria, in qualita? di stabilizzante cinetico della cystathionine beta-synthase (Majtan T. et al. Biochimie 126, 2016). Inoltre, il trattamento con Sinefungin in un modello murino per la fibrosi renale, ha determinato un miglioramento della patologia, tramite la sua attivita? inibitoria su SET7/9 lysine methyltransferase (Sasaki K. et al. J Am Soc Nephrol 27, 2016).
Uno studio finalizzato alla caratterizzazione della metilazione del cap dei trascritti virali di HIV, dimostra che, in cellule umane, Sinefungin inibisce la RNA hypermethylase TGS1 (Yedavalli V.S. & Jeang K.T. Proc Natl Acad Sci 107, 2010). TGS1 trimetila il cap di monomethylguanosina di vari tipi di RNA trascritti dalla polimerasi II, tra cui gli snRNA, gli snoRNA, diversi RNA virali e l?RNA della telomerasi. ? stato dimostrato che TGS1 e? implicata nella biogenesi dell?RNA della telomerasi in S. cerevisiae e S. pombe (Franke J. Et al. J Cell Sci 121, 2008; Tang W. Et al. Nature 484, 2012). Yedavalli et al. dimostrano che il trattamento con Sinefungin inibisce il trasporto nucleo-citoplasmatico di trascritti non spliceati o parzialmente spliceati del virus HIV, limitandone l?attivita? infettiva (Yedavalli V.S. & Jeang K.T. Proc Natl Acad Sci 107, 2010).
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Il ruolo della Sinefungin quale inibitore di TGS1 non e? stato ulteriormente esplorato e non sono mai stati condotti saggi in cellule umane, finalizzati a testare l?effetto della Sinefungin su TERC o su altri RNA target di TGS1.
Dopo estensiva sperimentazione, gli inventori hanno trovato che l?RNA-hypermethylase TGS1 (Trimethylguanosine synthase 1), che trimetila il cap di monomethylguanosine di TERC e? un regolatore negativo del dosaggio di questo RNA e mutazioni in TGS1 inducono un considerevole aumento dell?attivit? della telomerasi e allungamento dei telomeri in cellule in coltura.
L?invenzione si basa sulla scoperta che l?inibizione chimica dell?enzima TGS1 in cellule umane in coltura, mediante un agente inibitore, stabilizza l?RNA TERC, prevenendone la degradazione e determinando un aumento della quantita? disponibile per l?incorporazione nella telomerasi ed una conseguente stimolazione dell?attivita? telomerasica, che porta ad un netto allungamento dei telomeri.
In particolare, gli inventori hanno dimostrato che Sinefungin, un analogo della S-adenosilmetionina, ? un agente inibitore dell?attivita? metiltransferasica di TGS1, come suggerito da studi precedenti (Yedavalli V.S. & Jeang K.T. Proc Natl Acad Sci 107, 2010).
Tali studi rappresentano una novit?? assoluta nel campo della regolazione della biogenesi della telomerasi e dimostrano che l?inibizione di TGS1 per via genetica o chimica, in particolare tramite Sinefungin, determina un incremento del dosaggio di TERC, individuando TGS1 come un target terapeutico per le patologie causate da ridotta attivita? della telomerasi e accorciamento eccessivo dei telomeri. Alla luce degli effetti di tali trattamenti, questa scoperta ha un?enorme potenzialita? di applicazione in ambito terapeutico.
Pertanto, un primo aspetto della presente invenzione ? un inibitore dell?enzima TGS1, in particolare Sinefungin, per uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie. Un secondo aspetto della presente invenzione ? una composizione comprendente un inibitore dell?enzima TGS1 e uno o pi? eccipienti. Grazie ai suoi componenti attivi, la composizione oggetto della presente invenzione consente di fornire un miglioramento delle patologie associate e/o causate da telomeropatie grazie all?efficacia dell?inibitore dell?enzima TGS1.
Un terzo aspetto della presente invenzione ? un metodo in vitro per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o tessuti umani. Detto metodo comprende l?isolamento delle cellule e/o dei tessuti ottenuti da pazienti affetti da una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie, seguito dal trattamento di dette cellule e/o tessuti con un inibitore dell?enzima TGS1 o con una composizione comprendente detto inibitore e uno o pi? eccipienti.
Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1.
Modello che illustra l?azione della Sinefungin sulla telomerasi. TGS1 regola negativamente l?abbondanza della componente ad RNA della telomerasi, TERC. La Sinefungin, inibendo TGS1, determina un incremento del dosaggio di TERC, che risulta in un aumento del numero di subunita? di telomerasi attiva e conseguente allungamento dei telomeri.
Figura 2.
Sinefungin, analogo della S-adenosil-metionina, inibisce la reazione di ipermetilazione catalizzata da TGS1. (A) Saggio in vitro di ipermetilazione effettuato incubando 1 ?g di GST-TGS1 ricombinante o GST con 50 ?M [<3>H-CH3]AdoMet (SAM) e con 5 mM m<7>GTP (MMG), in presenza o meno di 100 ?M Sinefungin. Aliquote della miscela di reazione sono poste su cellulosapolietileneimmina e i prodotti di reazione sono risolti mediante TLC. L?incorporazione di <3>H-CH3 nei derivati metilati di MMg (DMG o TMG) ? quantificata mediante conteggio in scintillazione liquida. (B) Reazioni di controllo effettuate senza proteina o GST. (C) Viene mostrata l'entit? del trasferimento di <3>H-metile al cap dinucleotide.
Figura 3.
Sinefungin determina un aumento del dosaggio di hTR e un allungamento dei telomeri. (A, E) analisi qRT-PCR dei livelli di hTR su RNA di cellule UMUC3 (A) o della linea cellulare HeLa PARN KO (E), trattati o no con 50 ?M Sinefungin per 10 giorni. Le barre rappresentano la variazione dei livelli di hTR nelle cellule trattate e nelle cellule non trattate, ottenuta da tre replicati.
(B,D,F) Determinazione della lunghezza telomerica mediante analisi Telomere Restriction Fragment analysis (TRF, condotto secondo i metodi descritti in Roake, C.M. et al. Mol Cell 74, 2019) in due tipi cellulari caratterizzati da telomeri corti: la linea cellulare tumorale UMUC3 e le cellule HeLa carenti di TGS1 o di deadenylase PARN.
(B,D) L?analisi TRF ? stata effettuata sul DNA genomico estratto da cellule UMUC3 TGS1-proficient (UMUC3 parentale, TGS1 WT) oppure TGS1-deficient (TGS1 R1, TGS1 R2), trattate o no con Sinefungin in coltura per il tempo indicato (tutte le linee cellulari hanno mostrato un tempo di raddoppiamento comparabile nel corso dell?esperimento). Un allungamento dei telomeri si verifica nelle cellule di controllo trattate (si confrontino i lanes 1 e 2 nei pannelli B-D) ma non nei cloni mutati TGS1 R1 e R2 trattati (confrontare il lane 4 contro lane 5 e 7 contro 8 in D). Non si osserva alcun allungamento dei telomeri nelle cellule parentali non trattate (corsie 9-10).
(F) Le cellule HeLa PARN KO sono state trattate o meno con 50 ?M di Sinefungin per il tempo indicato in cultura. A causa dei ridotti livelli della componente RNA della telomerasi, la lunghezza telomerica media ? pi? corta nelle cellule PARN KO (lane 13) che nella linea cellulare HeLa parentale
(4.5 kb vs 7.5kb). Dopo 46 giorni di trattamento con Sinefungin, si osserva un allungamento dei telomeri nelle cellule HeLa PARN KO (lanes 1 and 2).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
GLOSSARIO
I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato.
Con l?acronimo TGS1 nella presente descrizione si indica la proteina Trimethylguanosine synthase 1 caratterizzata da attivit? metitransferasica, ovvero la capacit? di trasferire gruppi metilici da una molecola donatrice ad un accettore. In maniera pi? specifica TGS1 si riferisce all?enzima umano (vedi Uniprot Q96RS0 (TGS1_HUMAN)). Tale enzima ? specifico per il residuo guanina (G), per esempio ? coinvolto nella trimetilazione del cap di monomethylguanosina di vari tipi di RNA trascritti dalla polimerasi II, tra cui gli snRNA, gli snoRNA, diversi RNA virali e l?RNA della telomerasi.
L?acronimo TERC, anche conosciuto come TR, hTR o TER, nella presente domanda indica la componente RNA del complesso dell?enzima telomerasi (telomerase RNA component). La componente TERC ? anche nota come ?regione stampo?, poich? funge infatti da template per l?elongazione dei telomeri operata dalla telomerasi (trascrittasi inversa). La sequenza nucleotidica di TERC, che ? costituita prevalentemente da residui di citosina (C) e adenosina (A), ? complementare alla sequenza telomerica specie-specifica, e favorisce perci? l?appaiamento tra l?estremit? telomerica di un cromosoma e il sito catalitico del complesso enzimatico, guidando la corretta sintesi del DNA telomerico.
Con il generico termine ?telomeropatie? nella presente invenzione, sono indicate tutte le patologie e/o sindromi che sono caratterizzate e/o causate da un accorciamento dei telomeri. Tali patologie includono tutte le malattie che sono causate da mutazioni in geni direttamente implicati nel metabolismo dei telomeri, note come ?telomeropatie primarie?, quelle che presentano simile sintomatologia, ma sono causate da geni che controllano la riparazione del DNA, note come ?telomeropatie secondarie? (Opresko, P.L. & Shay, J.W. Ageing Res Rev 33, 2017), ma anche tutte le condizioni e/o disturbi per le quali e? stato dimostrato che i telomeri corti rappresentano un fattore di suscettibilita? (Armanios, M. Mutat Res 730, 2012), come ad esempio l?enfisema polmonare (Stanley, S.E. et al. J Clin Invest 125, 2015).
Con ?lunghezza telomerica media? (abbreviata come ltm) si fa riferimento alla lunghezza media delle regioni terminali di un cromosoma, costituite da DNA altamente ripetuto. Poich? tale grandezza fisica ? riferita a sequenze di DNA a doppio filamento, essa ? misurata generalmente in base al numero di coppie di basi che costituiscono dette sequenze (abbreviate come pb, o bp o bps). Spesso la dimensione di tali sequenze richiede l?utilizzo dell?abbreviazione ?kbp?, pari a mille paia di basi. La lunghezza telomerica media varia tra le diverse specie. Negli umani, i telomeri hanno una lunghezza media compresa tra 12-15 kb alla nascita. I telomeri si accorciano rapidamente durante l?infanzia, e in seguito si riducono di circa 0-100 bp ogni anno durante l?et? adulta, con una velocit? che varia in base al tipo di cellula, esposizione a stress ossidativo o psicologico, e altri fattori che includono mutazioni in geni direttamente implicati nel metabolismo dei telomeri, o in geni che controllano la riparazione del DNA.
Come sopra menzionato, un aspetto della presente invenzione si riferisce ad un inibitore dell?enzima TGS1 (Trimethylguanosine synthase 1), per uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie. L?enzima TGS1 che trimetila il cap di monomethylguanosine di TERC e? un regolatore negativo del dosaggio di questo RNA, perci? l?inibizione di TGS1 induce un considerevole aumento del dosaggio della componente RNA della telomerasi TERC e determina un allungamento dei telomeri nelle cellule umane.
Secondo un aspetto della presente invenzione, l?agente inibitore dell?enzima TGS1 ? un inibitore competitivo della S-adenosil metionina. Esempi non limitanti di agenti inibitori idonei ad essere impiegati nella presente invenzione possono essere scelti tra i composti riportati nella Tabella 1.
Tabella 1
L?inibitore dell?enzima TGS1 secondo la presente invenzione ? preferibilmente Sinefungin, inibitore dell?attivit? metiltransferasica. Sinefungin ? un nucleoside naturale, analogo della S-adenosil metionina, e presenta la seguente struttura:
La presente invenzione si riferisce anche ad una composizione comprendente detto inibitore dell?enzima TGS1 secondo una delle forme qui descritte e uno o pi? eccipienti.
Un esempio non limitante di composizione secondo la presente invenzione comprende eccipienti scelti tra quelli normalmente noti nello stato della tecnica quali diluenti (ad esempio calcio fosfato bibasico, lattosio, cellulosa microcristallina e derivati della cellulosa), assorbenti, adsorbenti, lubrificanti, leganti, disgreganti, tensioattivi, antiossidanti, conservanti, emulsionanti, umettanti, chelanti, e loro miscele.
La composizione secondo la presente invenzione pu? inoltre includere composti protettivi che potrebbero, in alcuni casi, facilitare il trasporto e/o rilascio specifico dell?inibitore nelle cellule di interesse. Tali composti potrebbero includere qualsiasi sistema di trasporto farmacologico noto nel settore, per esempio polimeri biocompatibili, sistemi microparticellari, liposomi, materiali nanostrutturati, capsule fotosensibili, nanoparticelle, lipidi cationici.
Le forme di somministrazione della composizione della presente invenzione includono, ma non sono ad esse limitate: via orale, via intra-arteriosa, via intranasale, via intraperitoneale, via endovenosa, via intramusculare, via subcutanea, o via transdermica.
Secondo un aspetto della presente invenzione, l?incremento della lunghezza telomerica media determinato dall?inibitore dell?enzima TGS1 o da una composizione comprendente tale inibitore in accordo ad una qualunque delle formulazioni qui descritte, sar? almeno pari a 0.5 kb.
La presente invenzione si riferisce inoltre all?uso dell?inibitore dell?enzima TGS1 o delle composizioni comprendenti detto inibitore in accordo ad una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte, nella prevenzione e/o nel trattamento di tutte le patologie caratterizzate da telomeri corti, riportate in Tabella 2.
Tra queste patologie vi sono le malattie causate da mutazioni in geni direttamente implicati nel metabolismo dei telomeri (telomeropatie primarie), o quelle con sintomatologia simile, ma causate da geni che controllano la riparazione del DNA (telomeropatie secondarie) (Opresko, P.L. & Shay, J.W. Ageing Res Rev 33, 2017). Queste categorie includono ma non sono limitate a: anemia aplastica, sindrome di Coats plus, discheratosi congenita, sindrome di Hoyeraal-Hreidarsson, leucemia acuta, fibrosi polmonare idiopatica, sindrome di Revesz, atassia telangectasia, sindrome di Bloom, sindrome di Werner, disordini RECQL4, progeria di Hutchinson-Gilford.
Altre patologie caratterizzate da telomeri corti includono quelle condizioni per le quali e? stato dimostrato che i telomeri corti rappresentano un fattore di suscettibilita? (Armanios, M. Mutat Res 730, 2012): queste includono fibrosi polmonare idiopatica, polmonite interstiziale aspecifica, bronchiolite obliterante polmonite organizzata, polmonite da ipersensibilit? cronica, fibrosi interstiziale, enfisema polmonare, enfisema polmonare combinato con fibrosi polmonare, macrocitosi, citopenia, aplasia midollare, ipoaplasia midollare, sindrome mielodisplastica, leucemia mieloide acuta, aumento di transaminasi, atrofia, fibrosi, cirrosi criptogenetica.
Tabella 2.
Condizioni cliniche caratterizzate da telomeri corti, che potrebbero beneficiare del trattamento (modificato da Armanios, M. Mutat Res 730, 2012; Stanley, S.E. et al. J Clin Invest 125, 2015).
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda l?uso in vitro di un inibitore dell?enzima TGS1 per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o tessuti umani.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione ? un metodo in vitro per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o tessuti umani, detto metodo comprendente un passaggio di trattamento di cellule in coltura e/o tessuti con un inibitore dell?enzima TGS1 o con una composizione comprendente detto inibitore e uno o pi? eccipienti, in cui dette cellule e/o detti tessuti sono ottenute da pazienti affetti da una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
Esempi specifici non limitanti di cellule trattabili in vitro con il metodo secondo la presente invenzione includono cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule del sistema nervoso, cellule del sangue, cellule del sistema immunitario, cheratinociti, fibroblasti, o mioblasti. Le cellule trattate secondo il metodo in vitro della presente domanda, potrebbero includere cellule tumorali e/o cellule non-tumorali. In un aspetto della presente invenzione le cellule trattate sono preferibilmente cellule staminali pluripotenti indotte e/o cellule utilizzate per produrre cellule staminali pluripotenti indotte, poich? tali cellule sono in grado di differenziarsi in diverse linee cellulari.
Il metodo descritto nella presente domanda potrebbe essere impiegato per il trattamento in vitro di cellule utilizzate in numerose applicazioni, tra cui terapia cellulare autologa o eterologa, ingegneria tissutale, crescita di organi artificiali, generazione di cellule staminali pluripotenti indotte, o tecniche di differenziazione cellulare.
Le cellule staminali pluripotenti indotte derivate dai pazienti potrebbero essere trattate con l?inibitore di TGS1 per ottenere una sorgente di cellule autologhe in cui i telomeri sono stati riportati ad una lunghezza ottimale, al fine di incrementare il successo del trapianto. Questa strategia permetterebbe di evitare le problematiche correlate alla compatibilita? del donatore che si riscontrano frequentemente nei trapianti di cellule staminali allogeniche. Qualora il trattamento si rivelasse ben tollerato a livello dell?organismo, potrebbe costituire un?alternativa al trapianto, che consentirebbe di migliorare la prognosi dei pazienti nei casi in cui il trapianto non e? praticabile. Le concentrazioni del composto inibitore saranno determinate in base alla risposta del particolare tipo cellulare in opportuni saggi tossicologici, finalizzati a valutare i dosaggi minimi del composto in esame, in grado di produrre un incremento dell?RNA TERC ? 1,5 fold dopo 1 settimana di trattamento e senza causare variazioni nel tasso di crescita. La misurazione dell?allungamento telomerico relativo andr? valutata dopo un mese di trattamento e verr? considerato significativo un aumento della lunghezza ? 0.5 kb rispetto alle cellule di controllo non trattate.
Per il trattamento in vitro, il composto o la composizione potranno essere somministrati utilizzando qualsiasi tecnica compresa nello stato della tecnica nell?ambito della biologia cellulare, coltura cellulare, coltura tissutale, o simili. Il trattamento secondo il metodo della presente invenzione potrebbe essere effettuato una o pi? volte in base alla percentuale di estensione telomerica desiderata. In un aspetto della presente invenzione il trattamento in vitro delle cellule e/o tessuti potrebbe durare non pi? di 96 ore, non pi? di 72 ore, non pi? di 48 ore, non pi? di 36 ore, non pi? di 24 ore, non pi? di 18 ore, non pi? di 12 ore, non pi? di 8 ore, o anche tempi minori. Secondo un aspetto della presente invenzione tale metodo per uso in vitro include anche (a) l?estrazione del DNA genomico dalle cellule in coltura e (b) l?analisi della lunghezza telomerica media (ltm). Tale analisi pu? essere effettuata mediante ?Telomere Restriction Fragment? (TRF).
? anche qui descritto un metodo in vivo comprendente i passaggi del metodo in vitro secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte ed un passaggio preliminare di ottenimento delle cellule e/o tessuti da pazienti e/o un passaggio successivo al trattamento di reinfunsione di tali cellule trattate.
Il metodo in vitro secondo una qualunque delle forme di realizzazione della presente invenzione potrebbe essere altres? impiegato per valutare e selezionare composti inibitori dell?enzima TGS1 alternativi, potenzialmente utilizzabili per la prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
? pertanto oggetto della presente invenzione anche un metodo di screening in vitro per l?identificazione di un composto candidato per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie, comprendente i passaggi di:
(i) determinare l?attivit? metiltransferasica dell?enzima TGS1 in presenza e in assenza di detto composto candidato;
(ii) trattare cellule in coltura e/o tessuti con detto composto candidato in cui dette cellule e/o detti tessuti sono caratterizzate da telomeropatie;
(iii) analizzare la lunghezza telomerica media prima e dopo detto passaggio (ii) di trattamento, dove un aumento della lunghezza telomerica media dopo detto passaggio di trattamento indica che detto composto ? idoneo per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
Secondo una forma di realizzazione del metodo di screening in vitro della presente invenzione, detto passaggio (i) di determinazione dell?attivit? metiltransferasica dell?enzima TGS1 pu? essere condotto mediante saggio di ipermetilazione.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto saggio di ipermetilazione comprende i passaggi di: (a) mettere in contatto detto enzima TGS1 con un composto donatore di gruppi metilici e con un substrato, in presenza o in assenza di detto composto candidato;
(b) separare e quantificare i derivati metilati di detto substrato prodotti.
In una forma di realizzazione preferita del metodo di screening in vitro secondo la presente invenzione, detto enzima TGS1 utilizzato ? un enzima TGS1 ricombinante fuso ad un tag GST, e immobilizzato su un supporto solido, quale, ad esempio, biglie di glutatione, detto composto donatore di gruppi metilici ? [<3>H-CH3]Adenosil-metionina (Ado-Met), detto substrato ? m<7>GTP (MMG).
Secondo un aspetto dell?invenzione, in detto passaggio (b) del saggio di ipermetilazione, la separazione dei derivati metilati di detto substrato prodotti pu? essere effettuata mediante cromatografia su strato sottile (TLC), mentre la loro quantificazione pu? essere effettuata mediante conteggio in scintillazione liquida.
In una forma di realizzazione del metodo di screening in vitro secondo la presente invenzione, detto passaggio (iii) di analisi della lunghezza telomerica media pu? essere condotto mediante ?Telomere Restriction Fragment? (TRF) a seguito di estrazione del DNA genomico dalle cellule in coltura.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detto metodo di screening in vitro pu? includere anche un ulteriore passaggio di determinazione del dosaggio dell?RNA della telomerasi, ad esempio mediante qRT-PCR e Northern Blotting, successivo a detto passaggio (iii) di trattamento, dove un aumento del dosaggio dell?RNA della telomerasi indica che detto composto ? idoneo per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
Il metodo di screening in vitro secondo una qualsiasi delle forme ivi descritte pu? anche includere un passaggio di determinazione dell?attivit? catalitica della telomerasi, ad esempio mediante ?Telomere repeats amplification protocol? (TRAP), in presenza e in assenza di detto composto candidato, dove un aumento dell?attivit? catalitica della telomerasi indica che detto composto ? idoneo per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
ESEMPI
STUDI IN VITRO
Il meccanismo identificato, oggetto della presente invenzione, e? illustrato nel modello in Figura 1. Nell?esperimento riportato in Figura 3, si dimostra che Sinefungin e? estremamente efficace nell?indurre allungamento dei telomeri. Sinefungin e? stata somministrata a due linee cellulari con telomeri molto corti, gia? precedentemente caratterizzate: le cellule UMUC3 e cellule HeLa mutanti per l?enzima deadenylase PARN, uno dei fattori causativi della DC; nelle cellule trattate con Sinefungin, si osserva un cospicuo allungamento dei telomeri.
Saggio di ipermetilazione in vitro con enzima GST-TGS1 ricombinante
La capacit? di Sinefungin di inibire l?attivit? metil-transferasica dell?enzima TGS1 ? stata valutata mediante un saggio di ipermetilazione in vitro utilizzando l?enzima TGS1 ricombinante fuso alla proteina GST. Dopo aver purificato TGS1-GST da cellule batteriche, ancora immobilizzato su biglie di glutatione, oppure GST sola, ? stato effettuato il saggio in presenza o in assenza di Sinefungin, utilizzando [<3>H-CH3]AdoMet come donatore metilico e m<7>GTP (MMG) come substrato. Come mostrato in Figura 2A, nelle miscele di reazione contenenti l?enzima wild-type (WT) (GST-TGS1, linea blu), sono stati rivelati due picchi, molto probabilmente corrispondenti ai prodotti del trasferimento metilico sul substrato m<7>GTP che viene convertito in m<2,7>GTP (DMG) e in m<2,2,7>GTP (TMG). Nelle reazioni non contenenti alcuna proteina, o nelle reazioni contenenti solo biglie GST (Figura 2B), ? stato rivelato soltanto un picco, corrispondente verosimilmente alla mobilit? cromatografica di [<3>H-CH3]AdoMet. Quando Sinefungin 100 ?M ? stato aggiunto alle miscele di reazione, ? stato rivelato soltanto un picco co-migrante con [<3>H-CH3]AdoMet (Figura 2A, linea rossa), a conferma dell?abilit? di Sinefungin di inibire l?attivit? metil-transferasica di TGS1 (Figura 2C).
Trattamento di cellule UMUC3 con Sinefungin
Gli effetti di Sinefungin sono stati testati sulla linea cellulare tumorale della vescica UMUC3, caratterizzata da livelli di hTR limitanti per l?attivit? della telomerasi e da telomeri corti (Xu L. & Blackburn E.H. Mol Cell 28, 2007). Le cellule UMUC3 sono state trattate con Sinefungin 100 ?M per 10 giorni, e sono quindi stati determinati i livelli di RNA hTR. Le cellule trattate hanno mostrato un aumento dei livelli di hTR pari a 1.5 volte superiore rispetto a quello delle cellule mutanti trattate (Figura 3A), ad indicare che l?inibizione chimica di TGS1 ha un effetto sul dosaggio di hTR del tutto paragonabile a quello indotto da mutazioni nell?enzima TGS1. In particolare, ? stato osservato un allungamento dei telomeri quando le cellule UMUC3 sono state coltivate in presenza di Sinefungin per oltre 15 raddoppi di popolazione (Figura 3B). Per confermare che Sinefungin ? in grado di colpire specificatamente l?enzima TGS1, ? stato testato un trattamento con Sinefungin su cloni di cellule UMUC3, caratterizzati da mutazioni CRISPR-indotte in TGS1 (Chen et al.) (Figura 3C), all?interno delle quali si ha un allungamento dei telomeri nel tempo a causa di una deficienza di TGS1 (Figura 3D). Cellule controllo e cellule mutanti sono state coltivate per 46 giorni in presenza o in assenza di Sinefungin. Al contrario delle cellule di controllo, non ? stato osservato un ulteriore allungamento dei telomeri nelle cellule UMUC3 mutanti per l?enzima TGS1 trattate con Sinefungin (Figura 3D, si confrontino i lanes 4 e 5, 7 e 8). Questa osservazione dimostra che l?effetto di Sinefungin sulla lunghezza telomerica ? una conseguenza dell?inattivazione di TGS1.
Trattamento di cellule HeLa PARN KO con Sinefungin
Gli effetti di Sinefungin sono stati testati su cellule HeLa mutanti per l?enzima deadenylase PARN (PARN KO), uno dei fattori causativi della discheratosi congenita (Tummala et al., 2015) (Roake C. M. et al. Mol cell 74, 2019). Le cellule PARN KO, ottenute nel laboratorio di S. Artandi (Stanford University), sono caratterizzate da telomeri corti, dovuti ai livelli ridotti della componente RNA della telomerasi. Dopo 10 giorni di trattamento con Sinefungin, si ? osservato un aumento significativo dei livelli di hTR nelle cellule PARN KO (Figura 3E). Inoltre, come fattore indicativo dell?efficacia del trattamento con Sinefungin in cellule caratterizzate da livelli ridotti di hTR, si ? osservato un sostanziale incremento della lunghezza telomerica nelle cellule PARN KO dopo 46 giorni di trattamento con Sinefungin (Figura 3F).
CONCLUSIONI
La presente invenzione si basa sulla scoperta che l?uso di inibitori dell?attivit? metiltransferasica dell?enzima TGS1, in particolare Sinefungin, determina un aumento del dosaggio della componente RNA della telomerasi e favorisce un allungamento dei telomeri. La Sinefungin e? in commercio, ma non e? mai stata testata su cellule umane con la finalita? di stimolare la telomerasi ed indurre allungamento dei telomeri. Nella presente invenzione qui descritta si ? verificato l?effetto dell?inibizione di TGS1 su sei diversi tipi di cellule immortalizzate di derivazione tumorale, dimostrandone l?efficacia nell?allungamento dei telomeri.
Alla luce di tali effetti terapeutici, la presente invenzione propone un metodo in vitro per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o tessuti umani, derivati da pazienti affetti da patologie caratterizzate e/o causate da telomeropatie.
Claims (34)
1. Inibitore dell?enzima TGS1 per uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
2. Inibitore per uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto inibitore ? un inibitore competitivo dell?Adenosil Metionina.
3. Inibitore per uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto inibitore ? scelto tra Sinefungin, S-adenosil-omocisteina (SAH), A9145c, ciclosinefungin, 5?-S-(2-metilpropil) adenosina (SIBA), 5?-S-(1-metilpropil) adenosina (ISOSIBA), 5?-S-metiltio-metil adenosina, aza-S-adenosil-metionina, aza-S-adenosil-metionina carbociclica, N-metil Sinefungin, N-etil Sinefungin, N-propil Sinefungin, N-benzil Sinefungin, 6?-metileneamino Sinefungin (GMS) o 6?-homoSinefungin (HSF), benzoxaborolo AN5568 (SCYX-7158), o cicloalcani analoghi di Sinefungin, quale 6?(S)-9-(5?,6?,7?-Deossi-6?-amino-7?-ciclopropil-?-D-eptafuranoside-1?)adenina.
4. Inibitore per uso secondo la rivendicazione 1, in cui detto inibitore ? il Sinefungin.
5. Inibitore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri.
6. Inibitore per uso secondo la rivendicazione 5 per favorire un aumento della lunghezza telomerica media almeno pari a 0.5 kb.
7. Inibitore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detta patologia ? una telomeropatia primaria e/o secondaria.
8. Inibitore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detta patologia ? scelta tra anemia aplastica, sindrome di Coats plus, discheratosi congenita, sindrome di Hoyeraal-Hreidarsson, leucemia acuta, fibrosi polmonare idiopatica, sindrome di Revesz, atassia telangectasia, sindrome di Bloom, sindrome di Werner, disordini RECQL4, progeria di Hutchinson-Gilford.
9. Inibitore per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detta patologia ? scelta tra fibrosi polmonare idiopatica, polmonite interstiziale aspecifica, bronchiolite obliterante polmonite organizzata, polmonite da ipersensibilit? cronica, fibrosi interstiziale, enfisema polmonare, enfisema polmonare combinato con fibrosi polmonare, macrocitosi, citopenia, aplasia midollare, ipoaplasia midollare, sindrome mielodisplastica, leucemia mieloide acuta, aumento di transaminasi, atrofia, fibrosi, cirrosi criptogenetica.
10. Composizione comprendente un inibitore dell?enzima TGS1
per uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie e uno o pi? eccipienti.
11. Composizione per uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto inibitore ? un inibitore competitivo dell?Adenosil Metionina.
12. Composizione per uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto inibitore ? scelto tra Sinefungin, S-adenosil-omocisteina (SAH), A9145c, ciclosinefungin, 5?-S-(2-metilpropil) adenosina (SIBA), 5?-S-(1-metilpropil) adenosina (ISOSIBA), 5?-S-metiltio-metil adenosina, aza-S-adenosil-metionina, aza-S-adenosil-metionina carbociclica, N-metil Sinefungin, N-etil Sinefungin, N-propil Sinefungin, N-benzil Sinefungin, 6?-metileneamino Sinefungin (GMS) o 6?-homoSinefungin (HSF), benzoxaborolo AN5568 (SCYX-7158), o cicloalcani analoghi di Sinefungin, quale 6?(S)-9-(5?,6?,7?-Deossi-6?-amino-7?-ciclopropil-?-D-eptafuranoside-1?)adenina.
13. Composizione per uso secondo la rivendicazione 10, in cui detto inibitore ? il Sinefungin.
14. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 13 per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri.
15. Composizione per uso secondo la rivendicazione 14 per favorire un aumento della lunghezza telomerica media almeno pari a 0.5 kb.
16. Composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 15, in cui detta patologia ? una telomeropatia primaria e/o secondaria.
17. Composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 15, in cui detta patologia ? scelta tra fibrosi polmonare idiopatica, polmonite interstiziale aspecifica, bronchiolite obliterante polmonite organizzata, polmonite da ipersensibilit? cronica, fibrosi interstiziale, enfisema polmonare, enfisema polmonare combinato con fibrosi polmonare, macrocitosi, citopenia, aplasia midollare, ipoaplasia midollare, sindrome mielodisplastica, leucemia mieloide acuta, aumento di transaminasi, atrofia, fibrosi, cirrosi criptogenetica.
18. Composizione per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 10 a 17, in cui detta composizione ? somministrata per via orale, intra-arteriosa, intranasale, intraperitoneale, endovenosa, intramusculare, subcutanea, o transdermica.
19. Uso in vitro di un inibitore dell?enzima TGS1 per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o tessuti umani.
20. Uso secondo la rivendicazione 19, in cui detto inibitore ? scelto tra Sinefungin, S-adenosil-omocisteina (SAH), A9145c, ciclosinefungin, 5?-S-(2-metilpropil) adenosina (SIBA), 5?-S-(1-metilpropil) adenosina (ISOSIBA), 5?-S-metiltio-metil adenosina, aza-S-adenosil-metionina, aza-S-adenosil-metionina carbociclica, N-metil Sinefungin, N-etil Sinefungin, N-propil Sinefungin, N-benzil Sinefungin, 6?-metileneamino Sinefungin (GMS) o 6?-homoSinefungin (HSF), benzoxaborolo AN5568 (SCYX-7158), o cicloalcani analoghi di Sinefungin, quale 6?(S)-9-(5?,6?,7?-Deossi-6?-amino-7?-ciclopropil.
21. Metodo in vitro per aumentare il dosaggio dell?RNA della telomerasi (TERC) e per favorire un aumento della lunghezza dei telomeri in cellule e/o tessuti umani, comprendente un passaggio di trattamento di cellule in coltura e/o tessuti con un inibitore dell?enzima TGS1 o con una composizione comprendente detto inibitore e uno o pi? eccipienti, in cui dette cellule e/o detti tessuti sono ottenute da pazienti affetti da una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
22. Metodo secondo la rivendicazione 21, in cui detto inibitore ? un inibitore competitivo dell?Adenosil Metionina.
23. Metodo secondo la rivendicazione 21, in cui detto inibitore ? scelto tra Sinefungin, S-adenosil-omocisteina (SAH), A9145c, ciclosinefungin, 5?-S-(2-metilpropil) adenosina (SIBA), 5?-S-(1-metilpropil) adenosina (ISOSIBA), 5?-S-metiltio-metil adenosina, aza-S-adenosil-metionina, aza-S-adenosil-metionina carbociclica, N-metil Sinefungin, N-etil Sinefungin, N-propil Sinefungin, N-benzil Sinefungin, 6?-metileneamino Sinefungin (GMS) o 6?-homoSinefungin (HSF), benzoxaborolo AN5568 (SCYX-7158), o cicloalcani analoghi di Sinefungin, quale 6?(S)-9-(5?,6?,7?-Deossi-6?-amino-7?-ciclopropil-?-D-eptafuranoside-1?)adenina.
24. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 23, in cui detto inibitore ? il Sinefungin.
25. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 24, in cui detta patologia ? scelta tra fibrosi polmonare idiopatica, polmonite interstiziale aspecifica, bronchiolite obliterante polmonite organizzata, polmonite da ipersensibilit? cronica, fibrosi interstiziale, enfisema polmonare, enfisema polmonare combinato con fibrosi polmonare, macrocitosi, citopenia, aplasia midollare, ipoaplasia midollare, sindrome mielodisplastica, leucemia mieloide acuta, aumento di transaminasi, atrofia, fibrosi, cirrosi criptogenetica.
26. Metodo per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 25, in cui dette cellule sono cellule staminali pluripotenti indotte e/o cellule utilizzate per produrre cellule staminali pluripotenti indotte.
27. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 26, in cui detto metodo comprendente un ulteriore passaggio di estrazione del DNA genomico dalle cellule in coltura trattate e analisi della lunghezza telomerica media.
28. Metodo di screening in vitro per l?identificazione di un composto candidato per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie, comprendente i passaggi di:
(i) determinare l?attivit? metiltransferasica dell?enzima TGS1 in presenza e in assenza di detto composto candidato;
(ii) trattare cellule in coltura e/o tessuti con detto composto candidato in cui dette cellule e/o detti tessuti sono caratterizzate da telomeropatie;
(iii) analizzare la lunghezza telomerica media prima e dopo detto passaggio (ii) di trattamento, dove un aumento della lunghezza telomerica media dopo detto passaggio di trattamento indica che detto composto ? idoneo per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una patologia caratterizzata e/o causata da telomeropatie.
29. Metodo di screening in vitro secondo la rivendicazione 28, in cui detto passaggio (i) ? condotto mediante saggio di ipermetilazione.
30. Metodo di screening in vitro secondo la rivendicazione 29, in cui detto saggio di ipermetilazione comprende i passaggi di:
(a) mettere in contatto detto enzima TGS1 con un composto donatore di gruppi metilici e con un substrato, in presenza o in assenza di detto composto candidato;
(b) separare e quantificare i derivati metilati di detto substrato prodotti.
31. Metodo di screening in vitro secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 28 a 30, in cui detto enzima TGS1 ? un enzima TGS1 ricombinante fuso ad un tag GST.
32. Metodo di screening in vitro secondo la rivendicazione 31, in cui detto enzima TGS1-GST ricombinante ? immobilizzato su biglie di glutatione.
33. Metodo di screening in vitro secondo la rivendicazione 30, in cui detto enzima TGS1 ? un enzima TGS1 ricombinante fuso ad un tag GST e immobilizzato su biglie di glutatione, detto composto donatore di gruppi metilici ? [<3>H-CH3] adenosil-metionina, detto substrato ? m<7>GTP (MMG).
34. Metodo di screening in vitro secondo la rivendicazione 33, in cui in detto passaggio (b) detta separazione ? effettuata mediante cromatografia su strato sottile (TLC) e detta quantificazione ? effettuata mediante conteggio in scintillazione liquida.
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