IT201900009258A1 - Metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche - Google Patents
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Description
Descrizione di Brevetto per Invenzione Industriale avente per titolo:
“METODO PER LA PREPARAZIONE DI NANOPARTICELLE LIPIDICHE”.
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche.
È noto e ampiamente diffuso l’impiego di nanoparticelle lipidiche in campo farmaceutico per la veicolazione di principi attivi farmaceutici.
Con particolare riferimento al campo farmaceutico sono noti numerosi metodi per la preparazione di nanoparticelle lipidiche.
Una delle tecniche più utilizzate per la produzione di nanoparticelle lipidiche è quella dell’omogeneizzazione ad alta pressione, che può essere effettuata a caldo o a freddo. In entrambi i casi il farmaco viene dissolto o solubilizzato nella matrice lipidica fusa (5-10°C sopra la temperatura di fusione). Nella tecnica di omogeneizzazione a caldo la miscela ottenuta viene dispersa sotto agitazione in una soluzione acquosa di tensioattivo, precedentemente portata alla stessa temperatura dei lipidi. Si ottiene così una pre-emulsione che viene omogeneizzata tramite omogeneizzatori ad alta pressione e successivamente raffreddata per fare cristallizzare i lipidi ed ottenere nanoparticelle lipidiche solide.
La tecnica a caldo non può essere però utilizzata per incorporare nelle nanoparticelle farmaci termolabili, che verrebbero degradati per effetto delle alte temperature, o idrofili, che potrebbero ripartirsi nella fase acquosa durante l’omogeneizzazione.
Tale metodica è stata descritta nel documento brevettuale EP0605497 e presenta numerosi inconvenienti tra i quali qua annoverato il fatto che richiede l’utilizzo di strumenti complessi e costosi, oltre che l’uso di temperature elevate.
A ciò si aggiunge che le elevate forze di cavitazione generate determinano l’alterazione del principio attivo veicolato.
Un alternativo metodo di preparazione è basato sulla formazione di microemulsioni a caldo come precursori delle nanoparticelle lipidiche.
Le microemulsioni sono miscele bifasiche stabili e trasparenti costituite da due liquidi immiscibili, acqua e olio, stabilizzate da un tensioattivo e da un cotensioattivo. In particolare, la dimensione della fase interna le rende idonee come precursori di sistemi nanoparticellari.
Tale metodo, descritto nel documento brevettuale US1993/5250236, consiste nella diluizione della microemulsione in acqua fredda al fine di romperla e causare la precipitazione delle particelle costituite dai lipidi solidificati. Tuttavia, anche tale metodo non è privo di inconvenienti.
Infatti, uno degli svantaggi presentati dal suddetto metodo è correlato alla diluizione della microemulsione iniziale che porta ad ottenere una sospensione diluita di nanoparticelle, a cui si aggiunge il fatto che tale metodo è laborioso da eseguire su larga scala.
Per ovviare almeno in parte a tali inconvenienti è stato messo a punto un metodo di preparazione di nanoparticelle lipidiche, descritto nel documento brevettuale US2006/0292183, che consente di ottenere nanoparticelle lipidiche per semplice raffreddamento di una microemulsione olio in acqua. Tuttavia, questo metodo permette di ottenere una concentrazione di lipide impiegabile per la realizzazione di una microemulsione stabile a caldo e una sospensione di nanoparticelle a freddo, estremamente bassa pari a 0,2% p/v, riducendo notevolmente la possibilità di caricamento del principio attivo.
Un ulteriore metodo di preparazione di nanoparticelle lipidiche, descritto nel documento brevettuale WO 01/64328, consiste nel riscaldamento e nel raffreddamento di una miscela. Tale metodo è basato sul principio dell’inversione di fase che richiede l’uso di tensioattivi non approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) e che ne impediscono la somministrazione parenterale.
Il compito principale della presente invenzione è quello di escogitare un metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche che consenta di preparare nanoparticelle solide in soluzione acquosa concentrata e stabilizzate da tensioattivi e cotensioattivi biocompatibili.
Ulteriore scopo del presente trovato è quello di escogitare un metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche che consenta di semplificare notevolmente le operazioni di preparazione rispetto ai metodi di tipo noto. Altro scopo del presente trovato è quello di escogitare un metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche che consenta di superare i menzionati inconvenienti della tecnica nota nell’ambito di una soluzione semplice, razionale, di facile ed efficace impiego e dal costo contenuto.
Altre caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione di una forma di esecuzione preferita, ma non esclusiva, di un metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche, illustrata a titolo indicativo, ma non limitativo, nelle unite tavole di disegni in cui:
la figura 1 è grafico elaborato in funzione dell’analisi termica di nanoparticelle di trimiristina prodotto con il metodo in accordo con il presente trovato;
la figura 2 mostra il grafico di confronto tra i frattogrammi con rivelazione UV di trimiristina 1, trimiristina 2 e trimiristina 3 prodotte con il metodo secondo il trovato;
le figure 3-5 sono grafici rappresentativi rispettivamente del frattogramma FFF DLS delle nanoparticelle di trimiristina 1, trimiristina 2 e trimiristina 3;
le figure 6 e 7 sono grafici a colonna rappresentativi dell’analisi comparativa realizzata relativamente all’efficacia di inglobamento e caricamento del colorante rispettivamente di Trimiristina 1, Trimiristina 2 e Trimiristina 3 a seguito di separazione per gel filtrazione e separazione per centrifugazione in destrano;
la figura 8 è un grafico a colonna relativo alla citotossicità delle nanoparticelle lipidiche di trimiristina 2;
la figura 9-12 sono grafici a colonna relativi allo studio comparativo inerente alla biodistribuzione delle nanoparticelle lipidiche marcate con 6-cumarina nei ratti Wistar dopo somministrazione endovenosa.
Il presente trovato riguarda un metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche solide.
Si specifica che nell’ambito della presente trattazione con il termine “nanoparticelle” si intendono particelle di dimensioni comprese tra 1 nm e 100 nm.
Secondo il trovato, il metodo comprende la fase di miscelare in un unico contenitore una miscela comprendente una soluzione acquosa con una matrice lipidica solida e con almeno un tensioattivo non-ionico biocompatibile.
Nel seguito, con l’espressione “matrice lipidica” si fa riferimento ad una matrice di natura lipofila, insolubile in acqua e solubile nei solventi organici, bassofondente e avente diversa natura chimica: paraffine, trigliceridi, cere, steroli, acidi grassi, alcooli grassi.
La miscela lipidica solida comprende almeno uno tra trigliceridi, una miscela di esteri alifatici o sterolici.
Preferibilmente, la suddetta miscela comprende idrocarburi.
Vantaggiosamente, il tensioattivo è un polisorbato.
Nel dettaglio, il tensioattivo è scelto dall’elenco comprendente: Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80.
In alternativa, il tensioattivo è un derivato del sorbitano etossilato.
Inoltre, la miscela comprende un cotensioattivo comprendente un estere del sorbitano.
Il cotensioattivo è scelto dall’elenco comprendente: Span 40, Span 60, Span 80.
Il metodo comprende:
- la fase di riscaldare il contenitore a una temperatura di lavoro inferiore a 100°C ad ottenere un’emulsione;
- la fase di raffreddare l’emulsione fino ad una temperatura inferiore a 30°C a ottenere nanoparticelle lipidiche solide di dimensione inferiore a 500 nm.
La matrice lipidica è presente in una concentrazione in peso/volume, valutata rispetto al peso complessivo della soluzione acquosa, compresa tra 0,3% e 5% e preferibilmente tra 0,5% e 4%.
Vantaggiosamente, il tensioattivo è presente in una concentrazione peso/volume, valutata rispetto al peso complessivo della soluzione acquosa, compresa tra 1% e 20% e preferibilmente tra 2% e 16%.
Preferibilmente, il cotensioattivo è presente in una concentrazione in peso/volume, valutata rispetto al peso complessivo della soluzione acquosa, compreso tra 0,5% e 10%, preferibilmente tra 1% e 8%.
È bene puntualizzare che durante la fase di riscaldare, la miscela viene riscaldata fino ad una temperatura superiore al punto di fusione del lipide e al cloud point del tensioattivo, cioè del Tween, ma inferiore al punto di ebollizione dell’acqua.
In queste condizioni il Tween diventa insolubile in acqua, si separa dalla soluzione della medesima e interagisce intimamente con il cotensioattivo, cioè lo Span, e con un lipide fuso. Tale interazione avviene all’interno di un sistema dall’aspetto torbido in cui i componenti non acquosi della miscela si miscelano tra loro.
A seguire, il metodo comprende una fase di purificazione delle nanoparticelle lipidiche solide.
La fase di purificazione è scelta dal gruppo comprendente: cromatografia a esclusione molecolare, sedimentazione e risospensione.
Vantaggiosamente, le nanoparticelle lipidiche solide presentano una dimensione compresa tra 40 nm e 500 nm.
Il presente trovato riguarda, inoltre, l’uso di nanoparticelle lipidiche solide in formulazioni di farmaci a radiofrequenza, di farmaci antitumorali, di radiofarmaci, e in sensori.
In particolare, tali farmaci antitumorali sono farmaci per organi con massa. Si elencano qui di seguito esempi di formulazioni di nanoparticelle lipidiche solide.
ESEMPIO 1
Formulazione di nanoparticelle lipidiche solide di trimiristina e colesteriloleato.
Si elencano nella seguente tabella (Tabella 1) diverse formulazioni di nanoparticelle lipidiche solide ottenute con il procedimento in accordo con il presente trovato e comprendenti un lipide scelto tra trimiristina, colesteril palmitato o tripalmitina.
Tabella 1
Il lipide scelto tra Trimiristina e Colesteril palmitato è stato miscelato con la soluzione acquosa, Tween 20 e Span 80. Tale soluzione è stata riscaldata a 80°C, cioè una temperatura superiore al cloud point del Tween 20.
Successivamente tale soluzione è stata raffreddata a 60°C, il raggiungimento di tale temperatura consente la formazione di una microemulsione.
Si specifica che nell’ambito della presente trattazione, con il termine “microemulsione” si fa riferimento ad una miscela bifasica stabile e di colore trasparente, consistente in due liquidi immiscibili (acqua e olio) stabilizzati da un tensioattivo e in genere da un cotensioattivo.
Nel dettaglio, la microemulsione è limpida e le nanoparticelle lipidiche sono sospese in essa.
A seguire, la microemulsione viene raffreddata fino a temperatura ambiente, determinando la precipitazione di nanoparticelle.
ESEMPIO 2
Analisi termica delle nanoparticelle di trimiristina 2
L’analisi termica è stata condotta mediante calorimetrica a scansione differenziale (DSC) sulle nanoparticelle in sospensione sia precedentemente che successivamente alla fase di purificazione. Nel dettaglio, la fase di purificazione è stata eseguita per esclusione molecolare (tecnica di gel filtrazione con limite di esclusione di 100000 Da).
In particolare, la gel filtrazione rimuove il Tween 20 in eccesso, libero e in micelle.
Come osservabile in figura 1, la microemulsione prima della purificazione non mostra transizioni di fase alla luce del fatto che la temperatura di fusione del lipide ricade nell’intervallo di temperatura di esistenza e stabilità della microemulsione. Invece, il campione purificato dalle micelle mostra una transizione di fusione tipica della trimiristina.
ESEMPIO 3
Analisi dimensionale delle nanoparticelle di trimiristina L’analisi dimensionale delle nanoparticelle di trimiristina (Trimiristina 1, Trimiristina 2, Trimiristina 3) è stata condotta con il Dynamic Light Scattering (DLS).
Nella tabella sottostante (Tabella 2) si riportano i risultati ottenuti:
Tabella 2
L’analisi dimensionale è stata ulteriormente approfondita con la Field Flow Fractionation (FFF) con rivelazione UV e DLS.
La figura 2 mostra il grafico di confronto tra i frattogrammi con rivelazione UV di trimiristina 1, trimiristina 2 e trimiristina 3.
I picchi corrispondenti alla Trimiristina 1, Trimiristina 2 e Trimiristina 3 sono stati ulteriormente analizzati con rivelazione DLS.
Le figure 3, 4 e 5 sono raffigurano il grafico comparativo dei frattogrammi ottenuti con FFF UV.
In particolare, in figura 3 è osservabile il frattogramma FFF DLS delle nanoparticelle di trimiristina 1 caratterizzato da:
- picco 1: 38 nm;
- picco 2: 70 nm;
- picco 3: 136 nm.
Parallelamente, in figura 4 è osservabile il frattogramma FFF DLS delle nanoparticelle di trimiristina 2 caratterizzato da:
- picco 1: 59 nm;
- picco 2: 202 nm.
Ancora, in figura 5 è osservabile il frattogramma FFF DLS delle nanoparticelle di trimiristina 3 caratterizzato da:
- picco 1: 72 nm;
- picco 2: 407 nm.
Dall’analisi di tali grafici di evince che le nanoparticelle di trimiristina 1, che presentano una polidispersione più alta rispetto alla lettura in batch del DLS, risultano composte da una miscela di tra popolazioni. Quelle di trimiristina 2 e 3 invece risultano costituite da una popolazione maggioritaria, con una limitata quantità di nanoparticelle più piccole.
La dimensione media delle nanoparticelle di trimiristina 1 è stata ulteriormente analizzata mediante DLS, dopo essere state purificate con tecniche di esclusione molecolare (gel filtrazione e gel centrifugazione) e, successivamente, sedimentazione (centrifugazione dopo diluzione 1:1 con destrano 30%, seguita da risospensione in acqua del precipitato). La gel centrifugazione ha un limite di esclusione di 100000 Da; ciò significa che tale tipologia di tecnica esclude il Tween 20 in forma monomera e in micelle.
Inoltre, la sedimentazione per centrifugazione separa le nanoparticelle da tutti i componenti idrosolubili.
Tabella 3
ESEMPIO 4
Caricamento e inglobamento di coloranti nelle nanoparticelle di trimiristina, tripalmitina e colesteril palmitato.
Le nanoparticelle lipidiche sono state caricate con due coloranti fluorescenti lipofili: il rosso Nilo e la 6-cumarina.
Tali coloranti sono stati aggiunti al contenitore precedentemente alla fase di riscaldare.
Il colorante in eccesso è stato successivamente rimosso in seguito a sedimentazione spontanea.
L’analisi dell’inglobamento ha tenuto conto di due parametri:
- capacità di carico (cioè il rapporto tra il colorante veicolato e il lipide); - efficienza di inglobamento (cioè il rapporto tra il colorante inglobato nella matrice lipidica e quello totale presente nella formulazione).
Nel dettaglio, le tecniche di misurazione dell’efficienza di inglobamento del colorante nelle nanoparticelle sono: tecniche di esclusione molecolare (gel filtrazione, gel centrifugazione) e sedimentazione.
Allo scopo di valutare l’efficienza di inglobamento sono state analizzate le formulazioni di trimiristina 1, trimiristina 2 e trimiristina 3 caricate con 6-cumarina e rosso Nilo.
Come osservabile in figura 6, la separazione mediante gel centrifugazione ha portato ad un’efficienza di inglobamento superiore a 90%.
I risultati ottenuti mediante gel filtrazione e sedimentazione sono riportati nelle figure 6 e 7. In particolare, la capacità di carico è stata calcolata a seguito di centrifugazione in destrano 30% e risospensione delle nanoparticelle di trimiristina e colesteril palmitato caricate con 6-cumarina. Successivamente, sono stati prelevati 100 microlitri delle nanoparticelle lipidiche sospese e, successivamente, sono state diluite in 900 microlitri di etanolo al fine di estrarre il colorante. Qui di seguito (Tabella 4) si riportano i risultati ottenuti.
Tabella 4
Dai suddetti dati, è evidente come il Colesteril palmitato mostra una capacità di carico sorprendentemente maggiore rispetto alla trimiristina.
ESEMPIO 5
Citotossicità delle nanoparticelle di trimiristina 2.
La citotossicità è stata studiata su linee cellulari tumorali con il saggio MTT dopo 72 ore di incubazione (figura 8).
Infatti, sebbene gli eccipienti utilizzati per la preparazione delle nanoparticelle siano sicuri e biocompatibili, i tensioattivi, a seguito di lunga esposizione sulle cellule possono causare citotossicità. Pertanto, è stato considerato l’effetto del metodo di purificazione dal tensioattivo (Tween 20) sulla citotossicità dopo 72 ore di esposizione. La purificazione è avvenuta tramite le metodiche descritte nell’esempio 3.
Come si può notare in figura 8, la tecnica di purificazione influisce notevolmente sulla citotossicità delle nanoparticelle lipidiche.
La gel filtrazione è, infatti, in grado di assicurare la minore citotossicità. La purificazione per centrifugazione con destrano 30% e risospensione consente di minimizzare la citotossicità soltanto dopo diluizione 1:200 del campione in terreno di coltura.
Ciò fa supporre che la metodica della gel filtrazione sia il più efficace nel rimuovere il tensioattivo. Al contrario, la gel centrifugazione sembra non funzionare a causa del range di esclusione molecolare utilizzato (6000 Da), che non consente di separare le micelle di tensioattivo dalle nanoparticelle.
ESEMPIO 6
Biodistribuzione delle nanoparticelle lipidiche marcate con 6-cumarina nei ratti Wistar (250g) dopo somministrazione endovenosa. Sono state utilizzate le seguenti formulazioni (Figure 9-12):
Tabella 5
I tessuti sono stati omogenati 1:4 con acqua e il sangue centrifugato a 4000 rpm. Plasma e omogenati sono stati diluiti 1:4 con metanolo e centrifugati. Il surnatante è stato successivamente iniettato in HPLC.
Non sembrano esserci differenze nella biodistribuzione di nanoparticelle formulate con lipidi o tensioattivi diversi. Sembra esserci influenza del metodo di purificazione delle nanoparticelle sulla loro biodistribuzione: le particelle purificate con destrano 30% presentano un significativo aumento dell’accumulo a livello cerebrale; ciò è riconducibile alla maggiore concentrazione di tensioattivo residuo presente in sospensione.
Si è in pratica constatato come l’invenzione descritta raggiunga gli scopi proposti.
In particolare, si sottolinea che il particolare accorgimento di prevedere una miscela comprendente una soluzione acquosa con una matrice lipidica solida e con almeno un tensioattivo non-ionico biocompatibile inserita all’interno di un solo contenitore, consente di ottenere nanoparticelle lipidiche solide concentrate, evitando diluizioni.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1) Metodo per la preparazione di nanoparticelle lipidiche, comprendente: - la fase di miscelare in un unico contenitore una miscela comprendente una soluzione acquosa con una matrice lipidica solida e con almeno un tensioattivo non-ionico biocompatibile; - la fase di riscaldare detto contenitore a una temperatura di lavoro inferiore a 100°C ad ottenere un’emulsione; - la fase di raffreddare detta emulsione fino ad una temperatura inferiore a 30°C a ottenere nanoparticelle lipidiche solide di dimensione inferiore a 500 nm.
- 2) Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta matrice lipidica solida comprende almeno uno tra trigliceridi, una miscela di esteri e idrocarburi alifatici saturi.
- 3) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta matrice lipidica solida comprende idrocarburi.
- 4) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto tensioattivo è un polisorbato.
- 5) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto tensioattivo è un derivato del sorbitano etossilato.
- 6) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta miscela comprende un cotensioattivo comprendente un estere del sorbitano.
- 7) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta matrice lipidica è presente in una concentrazione percentuale peso/volume, valutata rispetto al peso complessivo della soluzione acquosa, compresa tra 0,3% e 5% e preferibilmente tra 0,5% e 4%.
- 8) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto tensioattivo è presente in una concentrazione percentuale peso/volume, valutata rispetto al peso complessivo della soluzione acquosa, compresa tra 1% e 20% e preferibilmente tra 2% e 16%.
- 9) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto cotensioattivo è presente in una concentrazione percentuale peso/volume, valutata rispetto al peso complessivo della soluzione acquosa, compreso tra 0,5% e 10%, preferibilmente tra 1% e 8%.
- 10) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che comprende una fase di purificazione di dette nanoparticelle lipidiche solide.
- 11) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta fase di purificazione è scelta dal gruppo comprendente: cromatografia a esclusione molecolare, sedimentazione e risospensione.
- 12) Metodo secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette nanoparticelle lipidiche solide presentano una dimensione compresa tra 40 nm e 500 nm.
- 13) Uso di nanoparticelle lipidiche ottenute secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, in formulazioni di farmaci a radiofrequenza, di farmaci antitumorali, di radiofarmaci, e in sensori.
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| SHAH ROHAN M ET AL: "Physicochemical characterization of solid lipid nanoparticles (SLNs) prepared by a novel microemulsion technique", JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE, ACADEMIC PRESS,INC, US, vol. 428, 4 May 2014 (2014-05-04), pages 286 - 294, XP028850061, ISSN: 0021-9797, DOI: 10.1016/J.JCIS.2014.04.057 * |
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