IT201800006166A1

IT201800006166A1 - Un metodo per la valutazione dello stress ossidativo in campioni biologici e dispositivo per realizzare tale metodo

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Publication number: IT201800006166A1
Application number: IT102018000006166A
Authority: IT
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2018-06-08
Publication date: 2019-12-08
Also published as: EP3578973A1

Description

UN METODO PER LA VALUTAZIONE DELLO STRESS OSSIDATIVO

IN CAMPIONI BIOLOGICI E DISPOSITIVO PER REALIZZARE TALE METODO

Campo dell’Invenzione

La presente invenzione è nel campo delle analisi biomediche, e si riferisce in particolare a un metodo per la valutazione dello stress ossidativo in un campione biologico di un paziente, e a un dispositivo per realizzare questo metodo.

Stato dell’Arte

Le specie reattive dell’ossigeno (nel seguito anche ROS, acronimo derivante dall’espressione inglese Reactive Oxygen Species) sono specie chimiche reattive contenenti ossigeno che possono comprendere o meno elettroni spaiati.

Le ROS hanno breve emivita; sono prodotte da cellule aerobiche durante i loro processi metabolici (ad esempio nella respirazione mitocondriale) e reagiscono rapidamente estraendo elettroni da altre molecole, ossidandole, formando composti molto reattivi, spesso più reattivi delle specie di partenza che li hanno formati. Pertanto, a causa della loro natura e di queste reazioni in cui sono coinvolte, le ROS danneggiano tutte le principali macromolecole biologiche (lipidi, proteine, DNA, carboidrati), influenzando così lo stato redox di cellule, tessuti e fluidi corporei. Esempi di ROS sono perossidi, superossidi, radicali idrossile, e ossigeno singoletto.

In condizioni fisiologiche le ROS sono presenti a livello cellulare dove sono in equilibrio con molecole antiossidanti. Quando questo equilibrio viene a mancare per scarsità di molecole antiossidanti e/o a causa di un eccessivo accumulo di specie ROS, si può verificare una condizione definita “stress ossidativo”. Lo stress ossidativo è una condizione presente in numerose condizioni patologiche (da malattie acute come l’infarto del miocardio a malattie croniche come morbo di Alzheimer, aterosclerosi, tumori) e fisiologiche (esercizio fisico, invecchiamento, alimentazione). Caratteristica comune a molte malattie, infatti, è la produzione e l’accumulo di ROS, che si manifesta anche in occasione di danni ambientali. Tale accumulo di ROS può indurre severi danni cellulari quindi disfunzioni fisiologiche fino alla morte cellulare.

Senza arrivare a tali condizioni estreme, un danno ossidativo seppur limitato può aver luogo tuttavia anche in condizioni normali, sebbene i meccanismi che vi stanno dietro siano ancora scarsamente compresi. Cresce inoltre il numero di evidenze che suggeriscono come il danno ossidativo possa essere causato dalle specie ROS come una delle prime cause determinanti dell’invecchiamento e dell’accorciamento della durata della vita.

Tali conoscenze sul ruolo delle ROS nei processi patologici ha indotto laboratori di ricerca e ricercatori clinici a studi sempre più approfonditi per capire meglio la chimica del danno indotto da specie ossidanti, e per poter utilizzare le informazioni così ricavate per progettare nuove strategie e proteggere meglio l’organismo dalle conseguenze patofisiologiche causate dallo stress ossidativo.

A oggi sappiamo così che, in caso di stress ossidativo, la cellula attiva dei meccanismi di difesa quali attivazione o silenziamento dei geni che codificano per enzimi antiossidanti, fattori di trascrizione e proteine strutturali. Inoltre, si è osservato che lo stress ossidativo aumenta con l’età, con l’accumulo di prodotti dell’ossidazione dei lipidi, acidi nucleici, proteine, zuccheri e steroli causando in ultima analisi disfunzioni cellulari e rendendo il corpo più suscettibile ad agenti dannosi esterni.

Per le motivazioni sopra esposte è evidente come sia di fondamentale importanza, per la valutazione dello stato di salute di un paziente e anche per la prevenzione di future malattie, avere a disposizione un metodo efficace per la valutazione dello stress ossidativo in un campione biologico.

I metodi attualmente disponibili per la valutazione delle ROS nei campioni biologici, quali sangue, plasma, siero, urine ecc., si basano tutti sulla determinazione dei prodotti di ossidazione delle principali macromolecole biologiche, ossia lipidi, proteine, e DNA. Altre metodiche attualmente disponibili sono metodiche fluorimetriche, colorimetriche e luminometriche, che consentono di misurare soltanto cambiamenti relativi di specie reattive piuttosto che consentirne una quantificazione in termini assoluti.

A oggi, il metodo che è considerato il “gold standard” per la determinazione diretta delle specie radicaliche è la risonanza paramagnetica elettronica (Electric Paramagnetic Resonance, EPR), una tecnica spettroscopica in grado di individuare e quantificare specie chimiche contenenti uno o più elettroni spaiati. Questa tecnica necessita però di una strumentazione molto sofisticata e costosa e non è quindi adatta alla routine diagnostica laboratoristica.

L’esigenza di poter disporre di un metodo e di una strumentazione semplice da usare e di costo ridotto, che garantisca comunque una valutazione affidabile degli stati di stress ossidativo dovuti alla presenza di ROS, è dunque fortemente sentita nel settore.

Sommario dell’Invenzione

Scopo della presente invenzione è pertanto un metodo per la valutazione in vitro di uno stato di stress ossidativo associato a ROS e un dispositivo per mettere in pratica questo metodo, che risolve i problemi tecnici messi in luce sopra per le metodiche note, permettendo in particolare di ridurre i costi in termini di reagenti e strumenti necessari.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo e relativo dispositivo per la valutazione in vitro di uno stato di stress ossidativo associato a ROS, che consente di realizzare in un modo accurato misure quantitative delle specie reattive dell’ossigeno in un campione biologico di un paziente, fornendo un risultato affidabile sul grado di stress ossidativo del paziente stesso.

Questi e ulteriori scopi sono rappresentati dal metodo per la valutazione in vitro dello stato di stress ossidativo di un paziente e dal relativo dispositivo secondo la presente invenzione, le cui caratteristiche essenziali sono definite nelle rivendicazioni indipendenti qui allegate. Ulteriori importanti caratteristiche del metodo e del dispositivo secondo l’invenzione sono definite nelle rivendicazioni dipendenti.

Breve Descrizione delle Figure

Le caratteristiche e i vantaggi del metodo e del dispositivo per la valutazione di uno stato di stress ossidativo secondo la presente invenzione, saranno chiaramente illustrate nella seguente descrizione a titolo di esempio non limitante di loro forme realizzative, anche con riferimento alle figure annesse in cui:

- la Figura 1 mostra uno schema a blocchi che illustra in modo schematico la struttura di una forma realizzativa preferita del dispositivo secondo l’invenzione;

- la Figura 2 mostra in forma di istogramma i valori di impedenza misurati in campioni ematici di soggetti sani e di pazienti in stato di stress ossidativo con il metodo e il dispositivo dell’invenzione, secondo quanto descritto nell’Esempio 1 che segue; - la Figura 3 mostra, in forma di istogramma, i valori di impedenza misurati in campioni ematici di soggetti sani e di pazienti in stato di stress ossidativo con il metodo e il dispositivo dell’invenzione, secondo quanto descritto nell’Esempio 2 che segue.

Descrizione Dettagliata dell’Invenzione

Gli inventori hanno trovato una correlazione tra i valori di impedenza misurati in campioni di fluidi biologici di un soggetto e le quantità di marcatori di stress ossidativo dosati negli stessi fluidi, quali in particolare lipidi ossidati, proteine carbonilate, capacità antiossidante totale, livelli di ROS intracellulari ed extracellulari.

La presente invenzione fornisce dunque un metodo alternativo e più economico, semplice e rapido per determinare il grado di stress ossidativo in un paziente misurando in particolare i valori di impedenza di un campione ematico del paziente, o di altri suoi campioni biologici. La determinazione del grado di alterazione dello stato ossidativo nei fluidi biologici correlato alle misure di impedenza negli stessi fluidi, che è alla base del presente metodo, rappresenta uno strumento utile per la diagnosi, il monitoraggio e la prognosi di malattie acute e croniche a cui è associato uno stato di stress ossidativo, nonché un interessante e affidabile strumento per valutare più in generale lo stato di salute di un paziente.

La presente invenzione fornisce inoltre un dispositivo basato sulla misura dei valori di impedenza in campioni di fluidi biologici, in particolare di sangue e derivati, che consente di valutare lo stato di stress ossidativo di un paziente testando un suo campione di siero del paziente in un modo molto semplice e veloce, con misure che si sono dimostrate riproducibili e ripetibili nel tempo.

Un dispositivo per la valutazione di uno stato di stress ossidativo in un soggetto secondo l’invenzione comprende:

− una unità di campionamento e misura di impedenza su un fluido biologico del soggetto sotto esame, destinata a raccogliere i campioni di fluidi e a effettuare la misura di impedenza tramite una coppia di elettrodi che vengono immersi nei campioni da testare;

− una unità di elaborazione collegata all’unità di campionamento e misura è in grado di raccogliere ed elaborare i dati provenienti da detta unità tramite un circuito integrato, per ottenere corrispondenti valori di impedenza dei campioni testati, e inviarli a uno schermo per la visualizzazione dai dati.

Nell’ambito della presente invenzione, per “campione biologico” o “fluido biologico” si intende qualsiasi fluido biologico prelevato al soggetto sotto esame, preferibilmente sangue e suoi derivati, come il siero o il plasma.

Secondo l’invenzione, l’unità di campionamento e misura comprende un contenitore per il campione fluido da testare e una coppia di elettrodi atti a essere immersi in questo fluido, che sono preferibilmente realizzati, o comunque rivestiti, con un metallo nobile, quale in particolare oro o platino, così da minimizzare i processi di ossidazione che potrebbero alterare la misura e da garantire la minima interazione chimico-fisica con il campione biologico sotto esame.

Nel presente dispositivo, il campione di fluido biologico da testare può essere vantaggiosamente convogliato dall’esterno all’unità di campionamento e misura tramite una pompa e un sistema di tubazioni che lo lasciano fluire attraverso tubazioni e regolano l’afflusso del campione nell’unità di campionamento e misura. Opzionalmente, prima di procedere alla misura, il campione può essere inoltre centrifugato e/o filtrato, oppure può essere sottoposto ad altro trattamento per eliminare porzioni di campione che potrebbero interferire con la misura.

L’unità di elaborazione nel presente dispositivo comprende un circuito integrato che è in grado di raccogliere ed elaborare i segnali elettrici misurati nei campioni e inviarli a uno schermo.

In un aspetto preferito di questa invenzione, il presente dispositivo, invece di inviare i dati elaborati direttamente a uno schermo, comprende inoltre una unità di controllo comprendente un microcontrollore, quale un microcontrollore ARM (Advanced RISC Machine), opportunamente programmato in modo da gestire la trasmissione e l’archiviazione dei dati elaborati in una memoria locale oppure in una stazione remota. Per “stazione remota” si intende qui in particolare un personal computer oppure un dispositivo intelligente (smart device) che, secondo una forma realizzativa preferita dell’invenzione, può anche generare messaggi di impostazione, attraverso il microcontrollore, per l’unità di campionamento e misura e/o per l’unità di elaborazione.

Come illustrato schematicamente in Figura 1, tale forma realizzativa del presente dispositivo comprenderà anche un software per la gestione del microcontrollore.

L’impedenza è generalmente definita come l’opposizione totale che un circuito, o più in generale un oggetto, offre al flusso di corrente alternata (AC) a una data frequenza. Molti metodi sono noti per la misura di impedenza; il più appropriato può essere scelto secondo i requisiti e le condizioni delle misure, come la copertura di frequenza o l’accuratezza della misura richieste. L’unità di campionamento e misura del presente dispositivo, e l’unità di elaborazione a essa collegata possono essere costruite con una adatta struttura hardware con un software e una piastra di base interdigitata oppure una striscia tampone fatta di un metallo nobile, come l’oro, come supporto per i campioni da testare. Adatti esempi di una unità di campionamento e misura dell’impedenza e di una unità di elaborazione collegata sono ad esempio quei sistemi descritti in “AGILENT IMPEDANCE MEASUREMENT HANDBOOK” 4a edizione; oppure descritti da Ackman J.J. et al.1984 Critical Reviews in Biomedical Engineering 11 (4), pp. 281-311; Chen S.W. et al. 2012 Biosensors and Bioelectronics 33(1), pp. 196-203; Dvorskij, V.Ya. et al. 1998 Izvestiya VUZ: Radioelektronika 41 (7), pp.75-77.

Nella presente invenzione le misure di impedenza sono tipicamente condotte in regime di corrente alternata (AC) a una frequenza compresa nell’intervallo da 10 Hz fino a 100 kHz con una risoluzione di almeno 1 Hz, così da minimizzare l’interazione e gli effetti di polarizzazione di quelle sostanze ancora presenti nel sangue, nel siero, o in altro fluido biologico testato, che potrebbero venire polarizzate se sottoposte a un voltaggio costante; in questo modo le proprietà del fluido biologico sotto esame sono conservate al massimo grado.

La quantità di fluido biologico tipicamente testata nel presente dispositivo può variare da alcuni L ad alcune decine di L. I valori di impedenza misurati per tali volumi possono andare da 100 Ω a 10000 Ω, con i parametri di misura per realizzare tali misure di impedenza in un intervallo di frequenza per realizzare uno spazzolamento di frequenza oppure a una singola frequenza a seconda delle esigenze del test, con l’ampiezza dei segnali sul campione che può essere fissata ad esempio tra 200mVpp e 2 Vpp.

Il presente metodo per la valutazione di uno stato di stress ossidativo in un soggetto comprende i seguenti stadi:

-porre in contatto un campione di un fluido biologico precedentemente prelevato a detto soggetto con un supporto munito di elettrodi;

-misurare l’impedenza di detto fluido, ottenendo un valore di misura per l’impedenza; -verificare se il valore di misura ottenuto per l’impedenza di detto fluido biologico è al di fuori oppure è compreso in un intervallo di valori di riferimento misurati in una popolazione sana; e

-stabilire di conseguenza se detto soggetto rispettivamente si trova o meno in uno stato di stress ossidativo.

Per “intervallo di valori di riferimento” nell’ambito della presente invenzione si intende l’intervallo di valori costituito dalla media±2DS (Deviazione Standard) corrispondente al 95% dei valori misurati in una popolazione sana.

Gli esperimenti condotti dalle Richiedenti e descritti di seguito hanno mostrato che il presente metodo e dispositivo sono efficaci nell’individuare e quantificare le specie radicaliche nel sangue di soggetti sotto esame, o suoi derivati. Tali esperimenti hanno infatti dimostrato che il metodo e il dispositivo di questa invenzione permettono di effettuare misure che sono strettamente correlate con la concentrazione di ROS nel campione biologico esaminato, mettendo in evidenza in particolare come alti valori di impedenza corrispondano a bassi valori di ROS nel campione.

I vantaggi del presente dispositivo sono rappresentati in primo luogo dalla semplicità e rapidità della misura, nonché dalla economicità della metodica rispetto alle tecniche note, sia in termini di reagenti utilizzati sia in termini di strumentazione. Tra l’altro, nel presente metodo l’unico trattamento fatto prima della misura di impedenza può essere la preparazione di siero o plasma per centrifugazione del campione di sangue intero di un paziente, e opzionalmente una filtrazione, mentre non sono richiesti né reagenti né altre procedure particolari.

Un ulteriore vantaggio del metodo dell’invenzione è l’affidabilità e la riproducibilità dei risultati ottenuti.

Ancora un ulteriore vantaggio del presente metodo è che esso è completamente affidabile e ripetibile anche se realizzato con piccoli volumi di fluidi biologici, pari a circa 15-20 L, senza bisogno quindi di prelevare grosse quantità di sangue o altri fluidi dal paziente in esame.

Infine, un ulteriore vantaggio di questa invenzione è che il dispositivo dell’invenzione è realizzabile in piccole dimensioni, con parti usa e getta, ed è automatizzabile.

Il dispositivo e il relativo metodo dell’invenzione, per quanto sopra illustrato, potranno trovare applicazione nella diagnosi/prognosi/terapia di numerose malattie in forma acuta o cronica, ma anche come strumento di diagnosi o di ricerca utile nelle tecniche di riproduzione assistita, medicina dello sport, nutrizione, invecchiamento, e in qualsiasi altro settore in cui il ruolo dello stress ossidativo è stato ampiamente dimostrato dalla letteratura scientifica.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1

Sono state effettuate misure di impedenza con il dispositivo dell’invenzione a 30 kHz su campioni ematici in gocce del volume di 20 L ciascuna da due gruppi di soggetti. Un primo gruppo era costituito da 40 soggetti con segni di stress ossidativo sistemico causato da patologie infiammatorie in corso ed evidenziato dalla diminuzione della capacità antiossidante totale e dall’aumento della perossidazione lipidica (Capacità antiossidante totale: 15.2±2.8 mM equivalenti di Trolox<®>; Perossidazione lipidica: 1.12±0.56 μM di malondialdeide (MDA)). Un secondo gruppo, utilizzato come controllo, era costituito da 40 soggetti sani (senza alterazioni dello stato redox sistemico evidenziato da: capacità antiossidante totale: 23.6±2.4 mM equivalenti di Trolox<®>e perossidazione lipidica: 0.41±0.21 μM di MDA.

I valori di impedenza misurati con il dispositivo e metodo di questa invenzione, riportati in Figura 2 in forma di istogramma per i due gruppi di soggetti (controlli sani: 1123±97 Ω; soggetti con stress ossidativo sistemico: 682±84 Ω), sono risultati significativamente correlati (p<0.05) con i livelli dei marcatori di stress ossidativo presi in esame, ossia lipidi ossidati (r=0.66) e capacità antiossidante totale (r=0.80), misurati mediante metodiche fotometriche/fluorimetriche.

Esempio 2

Su 10 campioni ematici di soggetti sani (senza alterazioni dello stato redox sistemico) sono state condotte le seguenti prove.

Prova A: concentrazioni crescenti di 2,2’-azobis(2-ammidinopropano)dicloridrato (nel seguito “AAPH”), un azo-composto noto per la sua capacità di generare specie radicaliche, sono state aggiunte ai suddetti campioni ematici, andando a misurarne poi l’impedenza con il dispositivo di questa invenzione. Come mostrato in Figura 3, negli istogrammi bianchi, all’aumentare della concentrazione dell’AAPH aggiunto, si è osservata una conseguente diminuzione dei valori di impedenza misurati a 30 kHz (10 mM AAPH: 2544±300 Ω; 20 mM AAPH: 1823±287 Ω; 40 mM AAPH: 1124±241 Ω; 100 mM AAPH: 432±88 Ω).

Prova B: Lo stesso esperimento è stato condotto in presenza dell’antiossidante Trolox<®>, aggiunto ai campioni in quantità tale da ottenere una concentrazione finale di 40 M, un analogo idrosolubile della Vitamina E. In presenza di questo antiossidante è stato misurato un significativo aumento del valore di impedenza, come mostrato in Figura 3, istogrammi in nero (10 mM AAPH: 4577±688 Ω; 20 mM AAPH: 4255±741 Ω; 40 mM AAPH: 4288±755 Ω; 100 mM AAPH: 4188±822 Ω).

Questi esperimenti hanno permesso di verificare che ad alti valori di impedenza corrispondono basse concentrazioni di radicali liberi nei campioni e che le due grandezze sono strettamente correlate.

La presente invenzione è stata descritta sopra con riferimento alle sue forme di realizzazione preferite, ma ulteriori forme di realizzazione preferite possono esistere, tutte comprese in uno stesso core inventivo, come definito dall’ambito delle rivendicazioni annesse.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la valutazione di uno stato di stress ossidativo in un soggetto, comprendente i seguenti stadi: -porre in contatto un campione di un fluido biologico precedentemente prelevato a detto soggetto con un supporto munito di elettrodi; -misurare l’impedenza di detto fluido, ottenendo un valore di misura per l’impedenza; -verificare se il valore di misura ottenuto per l’impedenza di detto fluido biologico è al di fuori oppure è compreso in un intervallo di valori di riferimento misurati in una popolazione sana; e -stabilire di conseguenza se detto soggetto rispettivamente si trova o meno in uno stato di stress ossidativo.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto supporto munito di elettrodi è un supporto realizzato o rivestito con un metallo nobile che forma una coppia di elettrodi.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto metallo nobile è scelto tra oro e platino.
4. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta misura di impedenza è condotta in regime di corrente alternata (AC) a una frequenza che varia tra 10 Hz e 100 kHz con una risoluzione di almeno 1 Hz. 6. Un dispositivo per la valutazione di uno stato di stress ossidativo secondo un metodo come definito nelle rivendicazioni 1-5, detto dispositivo comprendendo: − una unità di campionamento e misura comprendente un contenitore per un campione di un fluido biologico di detto soggetto, e una coppia di elettrodi atti ad essere immersi in detto campione; − una unità di elaborazione collegata a detta unità di campionamento e misura atta a raccogliere ed elaborare i dati provenienti da detta unità di campionamento e misura tramite un circuito integrato, per ottenere corrispondenti valori di impedenza dei campioni testati, e inviarli a uno schermo per la visualizzazione dei dati. 7. Il dispositivo secondo la rivendicazione 6, comprendente inoltre una centrifuga e un dispositivo filtrante in detto contenitore per l’ottenimento di siero da sangue intero quando detto campione di fluido biologico consiste di sangue intero. 8. Il dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 o 7, comprendente inoltre una pompa per convogliare detto campione di fluido biologico dall’esterno a detta unità di campionamento e misura e regolarne l’afflusso. 9. Il dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-8, in cui detta coppia di elettrodi è realizzata o rivestita in un metallo nobile scelto tra oro e platino. 10. Il dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6-9, comprendente inoltre una unità di controllo comprendente un microcontrollore atto a gestire la trasmissione e l’archiviazione di dati, elaborati da detta unità di elaborazione, in una memoria locale oppure in una stazione remota.