IT201800004141A1 - Metodo per la diagnosi di glomerulonefrite membrano-proliferativa mediata da C3NeF - Google Patents

Metodo per la diagnosi di glomerulonefrite membrano-proliferativa mediata da C3NeF Download PDF

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Roberta Donadelli
Marina Noris
Ariela Benigni
Giuseppe Remuzzi
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Description

Descrizione
Forma oggetto della presente invenzione un metodo per la diagnosi di glomerulonefrite membrano-proliferativa (MPGN) mediata da C3NeF in un soggetto. Il metodo comprende:
a) immobilizzazione di C3b in almeno due pozzetti di una piastra;
b) formazione in detti pozzetti del complesso C3bBb che rappresenta la C3 convertasi della via alternativa, dove detta formazione del complesso è mediata dall’aggiunta di IgGs purificate da un campione biologico isolato dal soggetto, paziente e/o sano, in presenza di fattore B (FB), fattore D (FD), Albumina di Siero Bovino (BSA), ioni magnesio;
c) distacco dei complessi formati;
d) corsa elettroforetica in condizioni denaturanti di detti complessi e trasferimento su membrana;
e) rilevamento delle proteina di interesse, Bb, che è uno dei due componenti, C3b e Bb, della C3 convertasi; dove il rapporto tra le intensità misurate per la banda Bb nei campioni raccolti da ciascuno di detti pozzetti è indicativo dell’attività di C3NeF in detto soggetto.
Stato dell’arte
La glomerulonefrite membrano-proliferativa (MPGN) è una nefropatia progressiva cronica che si inquadra nel contesto di una sindrome nefrosica ed è caratterizzata da lesioni della membrana di filtrazione glomerulare e da intensa proliferazione delle cellule glomerulari.
Alla base della nefropatia c’è una iperattivazione della via alternativa del complemento, causata o da alterazioni genetiche nei geni del complemento (forme genetiche) o da alterazioni acquisite (forme acquisite od autoimmuni) dovute alla presenza di autoanticorpi, denominati fattori nefritici C3 (C3NeFs). Circa il 50-80% dei pazienti affetti da MPGN presentano i C3NeFs.
Nella MPGN sono osservati bassi livelli plasmatici di C3 dovuti a consumo di questo fattore, causato dall’attivazione della via alternativa del complemento.
L'attivazione della via alternativa porta alla formazione di C3 convertasi, responsabile della scissione del C3 a C3b. In condizioni normali si verifica continuamente la scissione del C3 circolante a un ritmo lentissimo, con formazione di piccolissime quantità di C3b. Questo, se rimane in circolo, viene inattivato rapidamente a iC3b ad opera della serin proteasi Fattore I; se invece si lega alla superficie di cellule estranee, per esempio cellule batteriche, può associarsi a una proteina plasmatica chiamata fattore B (FB). Il C3b si lega al FB formando il proenzima C3 proconvertasi, C3bB. In questo complesso, il FB diventa suscettibile al taglio del frammento Ba ad opera di una proteasi circolante chiamata Fattore D. Il frammento residuo, Bb, rimane legato al C3b costituendo il complesso C3bBb che rappresenta la C3 convertasi attiva, C3bBb, della via alternativa. La C3 convertasi rappresenta l'enzima chiave della via alternativa del complemento in quanto è in grado di scindere grandi quantità di C3 in C3b e C3a, portando ad una rapida amplificazione del processo di attivazione della via alternativa del complemento, (loop di amplificazione della formazione di C3 convertasi). Per evitare un'eccessiva attivazione della via alternativa del complemento, questa cascata, in condizioni fisiologiche, è mantenuta strettamente sotto controllo da una serie di regolatori sia circolanti che legati alla membrana delle cellule proprie dell'organismo. Il fattore H (FH), una proteina plasmatica, ha un ruolo fondamentale nella regolazione della via alternativa del complemento sia nella circolazione che sulla superficie delle cellule. Il FH determina la dissociazione della C3 convertasi (decay mediato dal FH) e funge da cofattore del fattore I nell'inattivazione del C3b (iC3b).
L'unico regolatore positivo della via alternativa del complemento è rappresentato dalla properdina, una proteina plasmatica che, legandosi al complesso C3bBb, lo stabilizza aumentandone l'emivita.
C3NeF è un autoanticorpo IgG diretto contro i determinanti antigenici espressi sulla C3bBb. C3NeF lega C3bBb e questo legame risulta in una stabilizzazione del complesso C3bBb. Il C3NeF legato alla C3 convertasi ne previene sia il decadimento spontaneo che il decadimento accelerato dal FH. La presenza di C3NeF e la capacità di questo di stabilizzare il complesso è un parametro per la diagnosi di MPGN. Dal punto di vista tecnico, l’analisi di C3NeF presenta ancora forti problematiche. Il metodo tradizionalmente utilizzato per valutare la presenza e l'attività del C3NeF si basa sull'emolisi di globuli rossi di pecora in presenza di fattori del complemento e delle IgG isolate dai pazienti (Fremeaux-Bacchi V et al. Nephrology Dialysis Transplantation, 9 (1994) 1747–1750). Si tratta di un test funzionale che valuta l’effetto finale dell’attivazione del sistema del complemento e non permette di studiare i meccanismi di attivazione.
Jin Seino et al., in Journal of Immunological Methods 159 (1993) 221-227, descrivono un metodo basato sul saggio ELISA per la misura di C3NeF. Il metodo comprende l’immobilizzazione di C3b in piastre ELISA, nelle quali veniva fatto formare il complesso C3bBb in presenza di ioni nichel. Ai pozzetti viene aggiunto il campione di siero in analisi così da misurare l’attività di C3NeF in funzione della quantità di IgG che nel campione di siero si sono legate al complesso C3bBb preformato sulla piastra. Il limite della metodica è rappresentato dall’utilizzo del Nichel, ione che è noto in letteratura stabilizzare soprattutto la C3 proconvertase, C3bB, e solo in misura minore la C3 convertasi, C3bBb. Con questo saggio ELISA, non è possibile distinguere quante IgG si sono legate a C3bB e quante a C3bBb.
Paixao-Cavalcante et al., in Kidney International 82 (2012) 1084–1092, descrivono un metodo ELISA per valutare l'effetto delle IgG/C3NeF limitatamente alla formazione della C3 convertasi, ossia vanno a valutare quanto le IgG facciano formare più o meno convertasi prendendo come riferimento un campione fortemente positivo per i C3NeF. Detta metodica non valuta l’impatto di C3NeF sull'emivita del complesso enzimatico. Detto metodo non discrimina inoltre tra la formazione della C3 proconvertasi e C3 convertasi, laddove entrambe vengono rilevate con un unico segnale dallo stesso anticorpo anti-FB.
Bettoni et al., in J Immunol 199 (2017) 1021-1040, descrivono una metodica che combina micropiastra e Western Blot. La metodica permette di distinguere, grazie alla separazione elettroforetica, la formazione della C3 proconvertasi, visualizzata come banda del FB intero di 93 KDa, e la formazione della C3 convertasi, visualizzata come banda del Bb di 60 KDa. La metodica riportata non descrive però la valutazione del decadimento (decay) della C3 convertasi.
E’ fortemente avvertita l’esigenza di un saggio efficace per una valutazione corretta non solo dei livelli di C3NeF ma anche dell’attività di C3NeF sul decadimento della C3 convertasi, in un ambiente quanto più vicino possibile al contesto fisiologico, così da permettere una diagnosi accurata di patologia.
Descrizione dell’invenzione
Forma oggetto della presente invenzione una metodica combinata piastra – Western Blot per valutare l’effetto stabilizzante di C3NeF, isolato da siero di pazienti, sulla C3 convertasi della via alternativa del complemento.
Descrizione delle figure
Figura 1: immagine WB e relativa quantizzazione del segnale, rappresentativa di una prima forma di realizzazione della metodica secondo la presente invenzione.
Figura 2: immagine WB e relativa quantizzazione del segnale, rappresentativa di una seconda forma di realizzazione della metodica secondo la presente invenzione.
Figura 3: immagine WB e relativa quantizzazione del segnale, rappresentativa di una terza forma di realizzazione della metodica secondo la presente invenzione.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
La metodica secondo la presente invenzione comprende la formazione, in pozzetti, di complessi C3bBb, il distacco degli stessi e la valutazione, mediante analisi Western Blot, dell’intensità della banda Bb corrispondente alla formazione della C3 convertasi. Tipicamente, si utilizzano pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
In particolare, detta metodica comprende la formazione di complessi C3bBb in pozzetti, dove la formazione di detti complessi avviene in presenza di ioni Magnesio, ottenendo così un valore definito baseline. Per valutare l'effetto stabilizzante del C3NeF sulla C3 convertasi, in pozzetti aggiuntivi i complessi di C3 convertasi formatisi in presenza di IgGs/C3NeFs, vengono incubati in assenza (decay spontaneo) o in presenza di FH (decay mediato dal FH). L'attività stabilizzante del C3NeF viene misurata dopo il distacco di detti complessi dai pozzetti e corsa elettroforetica degli stessi, valutando il rapporto tra le intensità di Bb prima (baseline) e dopo il decadimento di detto complesso C3bBb.
In una prima forma di realizzazione, la metodica secondo la presente invenzione comprende:
a) immobilizzazione C3b nei pozzetti di una piastra, preferibilmente da 96 micropozzetti;
b) aggiunta in detti pozzetti di IgGs purificate da un campione biologico isolato da un soggetto, paziente e/o sano, in presenza di FB, FD, BSA e ioni magnesio così da formare il complesso C3bBb; c) distacco dei complessi formati;
d) corsa elettroforetica di detti complessi, con dissociazione, grazie alle condizioni denaturanti (presenza di SDS), delle due componenti della C3 convertasi, C3b e Bb, e trasferimento delle stesse su membrana;
e) rilevamento della proteina di interesse, Bb, a ottenere un valore definito baseline caratterizzato dal fatto che a detto passaggio b) di aggiunta di IgG purificate viene fatta seguire, in uno o più pozzetti, dopo un passaggio di lavaggio, un’ulteriore incubazione in presenza oppure in assenza del FH, dove il rapporto tra l’intensità misurata per la banda Bb nei campioni sottoposti a detta ulteriore incubazione e la banda Bb baseline è indicativa dell’attività di C3NeF.
Detta metodica è indice di una positività del soggetto in analisi allorquando si registrino valori dell’intensità di banda Bb dopo detta ulteriore incubazione pari ad almeno il 34, o almeno il 35, preferibilmente almeno il 37% dei valori misurati rispetto al baseline dello stesso campione, e/o valori dell’intensità di banda Bb dopo ulteriore incubazione in presenza di FH pari ad almeno il 9, o almeno il 10, preferibilmente almeno il 12% dei valori misurati come baseline dello stesso campione.
Preferibilmente, detto passaggio a) di immobilizzazione è effettuato utilizzando C3b umano purificato (Complement Technology, Inc. USA) diluito in tampone PBS, con incubazione per una notte (ON) a 4°C. Dopo lavaggio con PBS, i siti non specifici vengono bloccati, tipicamente incubando in PBS, BSA 1%, 0,1% Tween per 1h a 37°C e successivo lavaggio con tampone di lavaggio (8.1 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 0.1% Tween20, 25 mM NaCl e 10 mM MgCl2).
Preferibilmente, in detto passaggio b) i pozzetti con il C3b immobilizzato vengono incubati per 12 minuti a 25°C, con IgG 100 �g/ml, FB 1000 ng/ml, FD 10 ng/ml in un tampone contenente 8.1 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 0.1% Tween20, 0.5 % BSA, 10 mM MgCl2 e 75 mM NaCl.
Preferibilmente, in detto passaggio c) detti complessi vengono staccati incubando in EDTA 10 mM, SDS 1% per 1 h a temperatura ambiente (RT).
Preferibilmente, detta corsa elettroforetica di cui al passaggio d) avviene su gel di poliacrilamide al 10% con aggiunta di 0.1% SDS (condizione denaturante) e in condizioni riducenti, ottenute con beta-mercaptoetanolo al 3%. Al termine della corsa elettroforetica, le proteine vengono trasferite su membrana e detta membrana è una membrana PVDF (Biorad, Inc. USA). Le proteine vengono evidenziate con l'anticorpo primario goat antihuman FB (Quidel) diluito 1:10000 in tampone tris (TBS) supplementato con 5% non-fat milk e 0.1% Tween20 (blocking buffer), incubando per tutta la notte a 4°C, seguito da legame con anticorpo secondario costituito da IgGs anti-goat coniugate a HRP (Vector Laboratories, 1:10000) per 1h a temperatura ambiente. Il segnale viene letto con il sistema ECL (Amersham).
La quantificazione dell’intensità della banda (analisi densitometrica) di 60kDa, corrispondente alla proteina Bb, è stimata usando il software NIH ImageJ (National Institutes of Health, USA).
Per valutare l’effetto delle IgGs purificate sul decadimento del complesso C3bBb, alcuni dei pozzetti vengono altresì incubati, preferibilmente per 32 minuti, in presenza del tampone, così da valutare il decadimento spontaneo, oppure in presenza di FH, preferibilmente 2.640 ng/ml, così da valutare il decadimento FH-mediato. Dopo lavaggi con la soluzione di lavaggio, si procede come indicato sopra al distacco dei complessi rimanenti e alla separazione elettroforetica e successiva rilevazione delle bande. Su uno stesso gel, vengono fatti correre i campioni baseline e i campioni sottoposti alla successiva incubazione, con o senza FH.
Il risultato che si ottiene dal rapporto di intensità della banda a 60 kDa dopo il decadimento e prima del decadimento è indicativo dell’attività di C3NeF nel campione in analisi.
In una seconda forma di realizzazione, la metodica secondo la presente invenzione prevede l’aggiunta di dette IgG purificate durante il passaggio di decadimento. In detta forma di realizzazione, dette IgG non vengono aggiunte durante detto passaggio b) di formazione del complesso.
Detta seconda forma di realizzazione comprende i seguenti passaggi:
a) immobilizzazione C3b nei pozzetti di una piastra; b) aggiunta in detti pozzetti del FB, FD, BSA e ioni magnesio;
c) in almeno un primo di detti pozzetti, passaggio di formazione complesso e decadimento che comprende lavaggio e incubazione con IgGs purificate da un campione biologico da un soggetto in assenza e/o in presenza di FH e, in almeno un secondo di detti pozzetti, passaggio di formazione complesso e decadimento che comprende lavaggio e incubazione con IgGs purificate da un campione controllo in assenza e/o presenza in di FH;
d) distacco dei complessi formati;
e) corsa elettroforetica in condizioni denaturanti di detti complessi, con dissociazione delle due componenti C3b e Bb, e trasferimento su membrana; f) rilevamento delle proteina di interesse, Bb, a ottenere un valore riferito ai campioni ottenuti nei pozzetti nei quali è stato effettuato il passaggio di decadimento in presenza di IgGs isolate da paziente e un valore riferito ai campioni ottenuti nei pozzetti nei quali detto passaggio di decadimento è avvenuto in presenza di IgGs isolate da un controllo.
Il metodo comprende altresì la misura del rapporto dell’intensità di detta banda Bb dopo il decadimento in presenza delle IgGs del campione dal soggetto in analisi con l’intensità di detta banda Bb dopo il decadimento avvenuto in presenza di IgG di controllo, con o senza FH.
In una forma preferita, in detto passaggio c) vengono predisposti almeno due pozzetti per il campione dal soggetto in analisi, ove FH viene aggiunto ad uno dei due pozzetti e almeno due pozzetti per il campione controllo, ove FH viene aggiunto ad uno dei due pozzetti.
Viene considerato positivo il campione nel quale detto rapporto tra campione del soggetto in analisi e campione controllo è almeno 1,6, o almeno 1,7, preferibilmente almeno 1,9 in assenza di FH (decadimento spontaneo) e almeno 2, o almeno 2,1, preferibilmente almeno 2,3 in presenza di FH (decadimento mediato dal FH).
In una terza forma di realizzazione, la metodica secondo la presente invenzione permette di valutare l’effetto combinato della properdina. In questa forma di realizzazione, durante detto passaggio b) della metodica secondo la prima forma di realizzazione, properdina è aggiunta al pozzetto. Il rapporto di intensità tra le bande Bb prima e dopo il decadimento viene misurato e i risultati sono considerati positivi per valori superiori al 39%, o al 40%, preferibilmente al 41%, o al 42% in assenza di FH o superiori all’8%, preferibilmente al 9%, o al 10% in presenza di FH.
L’ambito di tutela della presente invenzione è definito dalle rivendicazioni. Gli esempi che seguono hanno il solo scopo di mostrare alcune forme di realizzazione della metodica secondo la presente invenzione e non sono in alcun modo da intendersi come limitative dell’ambito di tutela dell’invenzione stessa.
Esempio 1: analisi dell’attività C3NeF in campioni da soggetti sani o patologici
I complessi di C3 convertasi, C3bBb(Mg<2+>) sono stati formati incubando a 25°C per 12 minuti i pozzetti nei quali era stato immobilizzato C3b, con FB, FD e MgCl2, in presenza di C3NeF-IgG purificati da un paziente MPGN (IgG paziente) o da un controllo sano (IgG controllo). Il decadimento (decay) spontaneo o mediato da FH è stato monitorato dopo ulteriore incubazione per 32 minuti a 25°C in assenza o in presenza di FH, rispettivamente. I risultati dell’analisi WB sono riportati in Figura 1. La quantità di C3 convertasi formata è stata calcolata come rapporto tra la densitometria della banda Bb dopo il decay e la densitometria della banda corrispondente al baseline * 100.
Analizzando la media ����Dev Std dei risultati ottenuti testando 26 campioni ottenuti da donatori sani, vengono considerati positivi i campioni nei quali si osserva una banda Bb residua dopo il decadimento maggiore del 36% rispetto al baseline, laddove detto decadimento sia stato fatto avvenire in presenza di FH, o maggiore del 11% rispetto al baseline, laddove detto decadimento sia stato fatto avvenire in presenza di FH.
Esempio 2: analisi dell’attività C3NeF, dove IgG sono aggiunte durante il processo di decadimento.
I complessi di C3 convertasi, C3bBb(Mg<2+>) sono stati formati incubando a 25°C per 12 minuti i pozzetti nei quali era stato immobilizzato C3b, con FB, FD e MgCl2. I complessi una volta formatisi sono stati incubati in presenza di C3NeF-IgG purificati da un paziente MPGN (paz A) o da un controllo sano (CTR) e sottoposti a decadimento spontaneo o mediato da FH con ulteriore incubazione per 32 minuti a 25°C in assenza o in presenza di FH, rispettivamente. I risultati dell’analisi WB sono riportati in Figura 2. La quantità di C3 convertasi formata è stata calcolata come rapporto tra la densitometria della banda Bb dopo il decay in presenza delle IgG del paziente e la densitometria della banda Bb dopo il decadimento in presenza delle IgG del controllo.
Esempio 3: effetto combinato di properdina
I complessi di C3 convertasi, C3bBb(Mg<2+>), sono stati formati incubando a 25°C per 12 minuti i pozzetti nei quali era stato immobilizzato C3b, con FB, FD, MgCl2 e properdina in presenza di C3NeF-IgG purificati da due pazienti MPGN (paz A, paz B) o da un controllo sano (CTR). Il decadimento spontaneo o mediato da FH è stato monitorato mediante ulteriore incubazione per 32 minuti a 25°C in assenza o in presenza di FH, rispettivamente. I risultati sono riportati in figura 3. La quantità di C3 convertasi formata è stata calcolata come rapporto tra la densitometria della banda Bb dopo il decadimento e la densitometria della banda corrispondente al baseline x 100.

Claims (11)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la diagnosi di glomerulonefrite membrano-proliferativa (MPGN) mediata da C3NeF in un soggetto che comprende: a) immobilizzazione di C3b in almeno due pozzetti; b) formazione in detti pozzetti del complesso C3bBb dove detta formazione del complesso è mediata dall’aggiunta di IgGs purificate da un campione biologico del soggetto e/o dal controllo in presenza di fattore B (FB), fattore D (FD), ioni magnesio; c) distacco dei complessi formati; d) corsa elettroforetica in condizioni denaturanti di detti complessi e trasferimento su membrana; e) rilevamento della proteina di interesse, Bb; dove il rapporto tra le intensità misurate per la banda Bb nei campioni raccolti da ciascuno di detti pozzetti è indicativo dell’attività di C3NeF in detto soggetto.
  2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, dove in detto passaggio b) detti pozzetti comprendono altresì Albumina di Siero Bovino (BSA).
  3. 3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, che comprende: a) immobilizzazione di C3b in almeno due pozzetti; b) formazione in detti pozzetti del complesso C3bBb, mediata dall’aggiunta di IgGs purificate da un campione biologico del soggetto e/o dal controllo, in presenza di FB, FD, BSA e ioni magnesio; c) distacco dei complessi formati; d) corsa elettroforetica in condizioni denaturanti di detti complessi e trasferimento su membrana; e) rilevamento delle proteina di interesse, Bb, a ottenere un valore definito baseline; caratterizzato dal fatto che a detto passaggio b) di aggiunta di IgGs purificate viene fatta seguire, in uno o più pozzetti, preferibilmente dopo un passaggio di lavaggio, un’ulteriore incubazione in presenza oppure in assenza di FH, dove il rapporto tra l’intensità misurata per la banda Bb nei campioni sottoposti a detta ulteriore incubazione e la banda Bb baseline è indicativo dell’attività di C3NeF in detto campione.
  4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 3, dove durante detto passaggio b) è aggiunta altresì properdina.
  5. 5. Il metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, che comprende: a) immobilizzazione di C3b in almeno due pozzetti; b) aggiunta in detti almeno due pozzetti di FB, FD, BSA e ioni magnesio; c) in almeno un primo di detti pozzetti, passaggio di formazione complesso e decadimento che comprende lavaggio e incubazione con IgGs purificate da detto campione in assenza e/o in presenza di FH e, in almeno un secondo di detti pozzetti, passaggio di formazione complesso e decadimento che comprende lavaggio e incubazione con IgGs purificate da un controllo in assenza e/o in presenza di FH; d) distacco dei complessi formati; e) corsa elettroforetica in condizioni denaturanti di detti complessi e trasferimento su membrana; f) rilevamento della proteina di interesse, Bb, a ottenere un valore di Bb riferito a detto almeno un primo pozzetto nel quale è stato effettuato il passaggio di decadimento in presenza di IgGs isolate da detto soggetto e un valore di Bb riferito a detto almeno un secondo pozzetto nel quale detto passaggio di decadimento è avvenuto in presenza di IgGs isolate da un controllo, dove il rapporto dell’intensità di detta banda Bb riferita a detto almeno un primo pozzetto nel quale è stato effettuato il passaggio di decadimento in presenza di IgGs isolate da detto soggetto e l’intensità di detta banda Bb riferita a detto almeno un secondo pozzetto nel quale detto passaggio di decadimento è avvenuto in presenza di IgGs isolate da un controllo, con o senza FH è indicativo dell’attività di C3NeF in detto soggetto.
  6. 6. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5, dove detto campione è un campione di siero.
  7. 7. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, dove detto rilevamento è effettuato utilizzando un anticorpo anti humanFB.
  8. 8. Il metodo secondo la rivendicazione 3, dove valori dell’intensità di banda Bb dopo detta ulteriore incubazione pari ad almeno il 34, o almeno il 35, preferibilmente almeno il 37% rispetto ai valori misurati nel baseline dello stesso campione sono indicativi di positività di detto soggetto per la MPGN.
  9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione 3, dove valori dell’intensità di banda Bb dopo ulteriore incubazione in presenza di FH pari ad almeno il 9, o almeno il 10, preferibilmente almeno il 12% dei valori misurati come baseline nello stesso campione sono indicativi di positività di detto soggetto per la MPGN.
  10. 10. Il metodo secondo la rivendicazione 4, dove valori del rapporto di intensità tra le bande Bb prima e dopo il decadimento superiori al 39%, o al 40%, preferibilmente al 41%, o al 42% in assenza di FH o superiori all’8%, preferibilmente al 9%, o al 10% in presenza di FH sono indicativi di positività di detto campione per la MPGN.
  11. 11. Il metodo secondo la rivendicazione 5, dove valori di detto rapporto pari ad almeno 1,6 o almeno 1,7, preferibilmente almeno 1,9 in assenza di FH e ad almeno 2, o almeno 2,1, preferibilmente almeno 2,3 in presenza di FH sono indicativi di MPGN.
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