IT201600111757A1 - Identificazione di molecole incognite tramite l'utilizzo di Indici di Ritenzione in Cromatografia Liquida, Subcritica e Supercritica - Google Patents
Identificazione di molecole incognite tramite l'utilizzo di Indici di Ritenzione in Cromatografia Liquida, Subcritica e SupercriticaInfo
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Description
“Identificazione di molecole incognite tramite l'utilizzo di Indici di Ritenzione in Cromatografia Liquida, Subcritica e Supercritica”,
Al fine di identificare un composto all’interno di una matrice complessa spesso viene utilizzato come parametro di ritenzione il tempo di ritenzione relativo (r) del picco di interesse nei confronti di un composto standard ottenendo così un parametro caratteristico secondo la relazione:
dove t’Ri è il tempo di ritenzione corretto dell’analita, mentre t’R(st) il tempo di ritenzione corretto del picco di riferimento del composto standard. Avendo scelto un picco di riferimento la ritenzione degli altri composti potrà essere espressa in funzione di esso con valori di r più piccoli, più grandi o uguali a seconda della posizione dei vari picchi degli analiti in questione.
Il concetto di ritenzione relativa presenta l’inconveniente della scelta dello standard, in quanto all’interno di un cromatogramma sarebbe impossibile selezionarne uno abbastanza vicino a tutti i composti d’interesse, soprattutto in una matrice complessa, generando così problemi di accuratezza del calcolo.
Il sistema degli indici di ritenzione suggerito da Kovàts nel 1958 [S. Kovàts Helv. Chim Acta, v. 41, p. 1915 (1958)] è un sistema ampiamente diffuso e generalmente accettato, utilizzato come valido supporto nell’identificazione di composti chimici analizzati per gascromatografia (GC). Tale sistema rende possibile la diretta comparazione di dati ottenuti in un laboratorio con quelli di altri laboratori, anche in condizioni di differenti gas di trasporto e velocità lineare di flusso. Kovàts suggerì una scala su base chimica per caratterizzare i differenti composti in base ad un rapporto di tempo utilizzabile a fini identificativi, e propose un metodo per calcolare gli indici di ritenzione basato sulle serie omologhe di idrocarburi usati come picchi di riferimento.
Secondo la definizione di Kovàts, la misura di un composto chimico viene effettuata mediante la comparazione della sua posizione in relazione a quella di idrocarburi paraffinici ad esso prossimi, mediante la seguente relazione:
dove t’Rze t’R(z+ 1)sono i tempi di ritenzione corretti degli alcani che eluiscono immediatamente prima ed immediatamente dopo il composto i e z rappresenta il numero di atomi di carbonio. Convenzionalmente, al fine di evitare l’uso di frazioni decimali, il numero di carboni viene moltiplicato per 100. Il tempo di ritenzione di un soluto è uguale al numero di carboni (× 100) di una ipotetica n-paraffina che dovrebbe presentare lo stesso tempo di ritenzione corretto dello specifico soluto. Così un soluto che ha un indice di ritenzione pari a 1090 eluisce tra l’alcano C10 (I=1000) e quello C11 (I=1100).
Tale relazione vale solo in condizioni di analisi gascromatografiche a temperatura costante (isoterma).
Successivamente tale relazione venne sviluppata per il suo utilizzo in condizioni di programmata di temperatura da Van den Dool e Kratz [H. Van den Dool, P.D. Kratz. J. Chromatogr. A, v. 11, p. 463 (1963)] secondo la formula riportata e gli indici vennero detti indici di ritenzione lineari (LRI) per la loro relazione lineare con i tempi di ritenzione:
dove tRz, tR(z+1) e tRi sono i semplici tempi di ritenzione. Questo approccio è stato proposto anche con altri composti adoperati come riferimento, come quelli appartenenti alla classe degli idrocarburi policiclici aromatici: benzene (indice assegnato 100), naftalene (200), fenantrene (300), crisene (400) e picene (500). Gli indici calcolati con tale serie di riferimento prendono il nome di indici di Lee [M.L. Lee, D.L.Vassilaros, C.M. White, M. Novotny. Anal. Chem., v. 51, p.768 (1979)] dal nome dell’inventore che li utilizzò per la determinazione di composti aventi struttura chimica analoga. Infatti la riproducibilità degli indici di ritenzione aumenta se i composti di riferimento hanno proprietà chimicofisiche simili a quelle degli analiti da determinare. Un ulteriore sistema di indici di ritenzione ampiamente utilizzato è quello che impiega gli esteri metilici degli acidi grassi a numero dispari di atomi di carbonio come serie omologa [F.P.Woodford, C.M. Van Gent. J. Lipid Res., v.1, p. 188 (1960); T.K. Miwa, K.L. Mikolajcazak, F.R. Earle, I.A. Wolff. Anal. Chem., v. 32, p. 1739 (1960)]. In questo caso, poichè la differenza di atomi di carbonio tra due composti successivi della serie omologa è pari a due, l’equazione di Van den Dool e Kratz viene modificata così come segue:
E’ possibile generalizzare l’equazione di Van den Dool, indipendentemente dalla miscela di riferimento impiegata:
dove z è un numero arbitrario associato al composto eluito immediatamente prima dell’analita e n rappresenta la differenza in unità di z tra il composto di riferimento eluito immediatamente prima e dopo l’analita incognito.
In GC, la combinazione degli LRI e la ricerca spettrale in database di spettri ottenuti tramite tecniche di ionizzazione ad impatto elettronico conduce a identificazioni certe per l’alta riproducibilità sia degli LRI che degi spettri di massa ad impatto elettronico (EI-MS). Inoltre alcuni database commerciali che contengono migliaia di spettri EI-MS tengono conto anche degli LRI, rendendo il processo di identificazione veloce e automatico, oltre che altamente affidabile. In particolare, gli LRI vengono utilizzati come filtro secondario nel confronto tra lo spettro dell’analita d’interesse e quelli dei composti contenuti nel database di spettri di massa in modo tale che i risultati della ricerca della similarità spettrale vengano limitati a quei componenti che hanno dati di ritenzione compresi nel range stabilito.
Per quanto riguarda l’utilizzo di indici di ritenzione in cromatografia liquida (LC), sono stati proposti diversi approcci tra gli anni ’80 e ’90. Il primo tentativo si attribuisce a Baker e Ma [J.K. Baker, C-Y. Ma. J. Chromatogr. A, v.169, p.107 (1979)] che proposero l’uso della serie di alcan-2-oni dall’acetone al 2-tricosanone come miscela di riferimento; poiché le analisi vennero effettuate in modalità di eluizione isocratica, la formula originale di Kovats fu impiegata per il calcolo degli indici di ritenzione (Eq.1). Tre anni dopo Smith [Smith, R.M. J. Chromatogr. A, v. 216, p.313 (1982)] suggerì l’uso di una serie omologa di alchilarilchetoni, vantaggiosi rispetto agli alcan-2-oni per le loro maggiori proprietà assorbenti nell’ultravioletto. In questi lavori e in altri successivi, è stata valutata sia l’influenza della fase stazionaria che quella della composizione della fase mobile concludendo che l’utilizzo degli indici di ritenzione era possibile solo dopo standardizzazione delle condizione sperimentali, operazione più difficile in LC che in GC, considerato il maggior numero di combinazioni fase stazionaria/fase mobile che la prima tecnica offre rispetto alla seconda. Dalla fine degli anni '80 fino all'inizio degli ultimi decenni, la standardizzazione dei metodi LC ha suscitato l'interesse di altri gruppi di ricerca; tra questi Bogusz e collaboratori hanno descritto l'uso di 1-nitroalcani, dal nitrometano all’ 1-nitroottano, per il calcolo dell'indice di ritenzione, poiché, rispetto alla serie dei chetoni alchil arilici, presentano una migliore copertura dello spazio cromatografico in condizioni di fase inversa [M. Bogusz, R. Aderjan. J. Chromatogr. A, v. 435, p. 43 (1988)]. Bogusz ha sviluppato un metodo LC generale per lo screening tossicologico e, dal momento che ha utilizzato una separazione a gradiente di eluizione, impiegò l’equazione di Van den Dool and Kratz per il calcolo degli LRI (Eq. 2) [M. Bogusz, M. Wu. J. Anal. Toxicol., v. 15, p.188 (1991)]. Tuttavia, i nitroalcani non sono facilmente reperibili e non sono particolarmente stabili a pH elevati. I limiti incontrati con l'uso di ciascuna delle serie omologhe (basso assorbimento UV, limitata copertura dello spazio cromatografico e scarsa reperibilità e stabilità chimica), la minore riproducibilità dei tempi di ritenzione in LC rispetto a GC e le differenze nella strumentazione o anche nell’impaccamento delle colonne hanno ostacolato la diffusione di database di indici di ritenzione sia all’interno dello stesso laboratorio che a livello interlaboratorio. Pertanto, la ricerca in tale campo è stata abbandonata nell’ultimo decennio e l’identificazione in LC risulta ancora una grossa sfida per i ricercatori, considerando anche la bassa riproducibilità e lo scarso livello di informazioni che contraddistinguono gli spettri di massa ottenuti con tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica (API) che usualmente sono accoppiate a metodi LC.
L’invenzione presentata è la rivisitazione del sistema degli indici di ritenzione come uno strumento di identificazione prezioso in LC, sfruttando la più alta riproducibilità da lotto a lotto di colonne e strumentazioni sviluppate negli ultimi decenni. In particolare, sono stati selezionati come analiti target i triacilgliceroli (TAGs), a causa della loro estrema complessità, importanza biologica e per il loro profilo LC molto regolare in fase inversa con solventi non acquosi. A tal fine, è stato messo a punto un metodo UHPLC (ultra high performance LC) che utilizza due colonne con particelle della fase stazionaria monodisperse sub-2 �m (diametro particellare pari a 1.9 �m, 100×2.1 mm, L×ID) accoppiate in serie, al loro flusso ottimale (0.4 mL/min), raggiungendo durante il gradiente di eluizione (gradiente lineare di 105 minuti da 100% acetonitrile a 50:50 v:v acetonitrile:2-propanolo, mantenuto per 20 minuti) una contropressione pari a 1000 bar. Tale metodo ha permesso la separazione efficiente dei TAGs sia in miscele semplici (oli vegetali) che complessi (oli di pesce, campioni di grasso animale e campioni biologici) in tempi ridotti rispetto a metodi precedentemente sviluppati. In particolare, il nuovo metodo ha mostrato una peak capacity (numero di picchi separati con alta risoluzione) di 162 in 125 minuti, contro valori di 170 e 210 in tempi significativamente superiori, rispettivamente 168 e 220 minuti per la separazione di oli di pesce e campioni di latte, ottenuti in precedenti lavori [P. Dugo, M. Beccaria, N. Fawzy, P. Donato, F. Cacciola, L. Mondello. J. Chromatogr. A, v.1259, p.227 (2012); M. Beccaria, G. Sullini, F. Cacciola, P. Donato, P. Dugo, L. Mondello. J. Chromatogr. A, v. 1360, p. 172 (2014)]. I cromatogrammi ottenuti per uno degli oli vegetali più complessi (olio di semi di lino) e per uno dei campioni con più elevato numero di TAGs identificati (olio di menadi) sono mostrati in TAV.1, A e B rispettivamente, per dimostrare l’alta efficienza cromatografica del metodo sviluppato. L’elenco delle abbreviazioni con cui sono indicati i vari acidi grassi nei TAGs è riportato in TAV.2.
Una miscela di 7 TAGs semplici composti da acidi grassi a numero dispari di atomi di carbonio, dal TAG trieptanoina (C7C7C7) al TAG tridecanonanoina (C19C19C19) è stata impiegata come serie omologa attribuendo ad ogni composto un valore z pari al suo partition number, PN, uguale al numero di atomi di carbonio (CN) sottratti del doppio del numero di doppi legami (DB) presenti nelle catene carboniose degli acidi grassi che costituiscono il TAG (PN=CN-2DB), tale che z abbia quindi valori compresi tra 21 e 57. Poiché la differenza di z tra due composti successivi è pari a 6 e una modalità di eluizione a gradiente è stata impiegata, l’Eq. 4 con n=6 è stata utilizzata per il calcolo degli LRI. Tale miscela copre l’intero intervallo di eluizione delle specie di triacilgliceroli contenute nei campioni analizzati, ma può essere estesa a specie a catena più corta (fino alla triformina, C1C1C1) o più lunga a seconda del metodo cromatografico impiegato e della composizione del campione investigato.
Il database di LRI costruito contiene un totale di 205 TAGs. Ogni valore di LRI è accompagnato dalla variabilità ottenuta per il corrispondente TAG nei diversi campioni iniettati. Ovviamente, minore è tale variabilità, minore è la probabilità di un’erronea attribuzione dei picchi, soprattutto nel caso di composti che eluiscono in tempi molto vicini. In quest’ottica, la risoluzione cromatografica assume un’importanza chiave per il successo di tale nuovo sistema identificativo. Essa si può esprimere attraverso il numero di separazione (SN) che esprime il numero di picchi che possono essere risolti all’interno di due TAGs consecutivi della serie omologa:
Applicando tale equazione alla regione compresa tra i composti z=39 e z=45, SN risulta pari a 25, indicando che 25 picchi possono essere efficientemente risolti tra i composti C13C13C13 e C15C15C15; la differenza di indici di ritenzione tra due picchi adiacenti deve essere pertanto pari a 600/(SN+1), uguale in questo caso a 23, valore non superiore all’ampiezza del range di LRI ottenuta per quasi tutti i composti. Ciò è significativo perché se due picchi adiacenti hanno una differenza di LRI pari a 23 ed una variabilità dell’indice inferiore a ± 11.5, non potrà verificarsi nessuna errata identificazione. Ciò è valido per tutte le regioni del cromatogramma, dimostrando la validità dell’invenzione qui presentata. A dimostrazione di quanto descritto, la TAV.3 riporta i TAGs più comuni identificati nei vari campioni investigati, con i rispettivi valori di LRI, espressi come valore medio ± variabilità ottenuta e il valore di SN per ogni coppia di TAGs della serie omologa, da cui è possibile dedurre la massima variabilità tollerata.
La stessa conclusione si può comunque trarre da considerazioni riguardanti l’ampiezza alla base dei picchi degli analiti. Infatti, essendo l’ampiezza media wb = 0.8 min (48 s) e 1 LRI = 25 min/600 = 0.042 min (2.52 s), dove 25 min è la differenza tra i tempi di ritenzione di C13C13C13 e C15C15C15, una variabilità di LRI pari a ± 11 unità, corrispondenti a 0.462 min (ca.30 secondi), risulta minore di wb. Tale risultato indica che ogni LRI corrisponde solo al TAG che occupa una specifica posizione nel cromatogramma.
Il sistema di LRI o I (a seconda che si tratti di separazioni cromatografiche ottenute in modalità di eluizione isocratica o gradiente) qui proposto può chiaramente essere impiegato indipendentemente dalla strumentazione impiegata e dal metodo analitico utilizzato; un confronto tra risultati ottenuti con metodi che differiscono notevolmente per l’impiego di diverse colonne (stessa composizione chimica della fase stazionaria, ma diverse dimensioni), diversa composizione della fase mobile e diverso rivelatore è stata già effettuato, mostrando risultanti incoraggianti.
Una parte integrante di tale invenzione è costituita dallo sviluppo di un algoritmo che permette di effettuare esclusivamente ricerche in database di LRI, tralasciando del tutto i dati spettrali.
In particolare, il nuovo software è stato testato su analisi effettuate con strumenti di diversa tipologia (HPLC, UHPLC, nanoLC) accoppiati a diversi tipi di rivelatori (ELSD, API-MS, EI-MS). Il software restituisce una lista di candidati più o meno ristretta a seconda della complessità della regione di interesse, nonché delle co-eluizioni che interessano ogni gruppo di analiti. Nel caso in cui la tecnica LC sia accoppiata a rivelatori API-MS, l’interpretazione degli spettri di massa può scremare la lista di candidati, secondo un procedimento opposto a quello GC-MS. Qualora invece la tecnica LC sia accoppiata a spettrometri EI-MS, il processo di identificazione è analogo a quello GCMS e può essere effettuato con i medesimi software.
Pertanto, è possibile concludere che nei primi due casi il parametro LRI è fondamentale per effettuare ricerche automatiche e veloci in banche-dati, mentre nell’ultimo caso tale nuovo parametro diviene complementare allo spettro EI-MS generando un’identificazione altamente affidabile.
Claims (1)
- “Identificazione di molecole incognite tramite l'utilizzo di Indici di Ritenzione in Cromatografia Liquida, Subcritica e Supercritica”, a nome di: 1. L’utilizzo di una serie omologa di riferimento costituita da triacilgliceroli semplici composti da acidi grassi a numero dispari di atomi di carbonio, scelti a seconda del metodo cromatografico impiegato e della composizione del campione investigato, per il calcolo di Indici di Ritenzione in Cromatografia Liquida o con l’utilizzo di fluidi allo stato super/sub critico quale ad esempio l’anidride carbonica 2. Il calcolo degli Indici di Ritenzione utilizzando la serie di triacilgliceroli a numero di carbonio dispari di cui alla rivendicazione 1 ed applicando una delle due equazioni: a seconda se trattasi di separazioni isocratiche o a gradiente, o nel caso di separazioni con porzioni isocratiche e a gradiente tramite l’utilizzo simultaneo di entrambe ed attribuendo arbitrariamente a z valori corrispondenti al partition number PN dei triacilgliceroli della serie omologa (PN=CN-2DB, dove CN e DB sono rispettivamente la somma del numero degli atomi di carbonio e dei doppi legami presenti nelle catene carboniose degli acidi grassi). 3. L’uso degli Indici di Ritenzione, di cui alle rivendicazione 1 e 2, per l’esatta determinazione della natura chimica di composti incogniti anche tramite l’utilizzo di software e database dedicati 4. L’utilizzo degli Indici di Ritenzione nella ricerca di spettri di massa ottenuti con tecniche di Impatto Elettronico (EI) o a Pressione Atmosferica (API) per discriminare molecole con identiche frammentazioni ed utilizzando appositi software per la costruzione di database contenenti lo spettro di massa e l’Indice di Ritenzione con una finestra di selezione �LRI o �I in modo da scartare composti con identici frammenti di massa ma con Indici di Ritenzione diversi. 5. L’utilizzo degli Indici di Ritenzione, di cui alle rivendicazioni 1 e 2, la cui ripetibilità di determinazione sia inferiore alla larghezza alla base dei picchi dei composti incogniti
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