IT201600098784A1 - Metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura - Google Patents

Metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura

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IT201600098784A1
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Alice Galbiati
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Univ Bologna Alma Mater Studiorum
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Description

DESCRIZIONE
Campo di applicazione
La presente invenzione si riferisce ad un metodo e alla relativa cuvetta per analisi in tempo reale di particelle secrete o endocitate da cellule in coltura, come per esempio gli esosomi o altri prodotti cellulari.
L’invenzione trova quindi utile applicazione nel settore della ricerca biomedica e della diagnostica.
Arte nota
Nel settore della ricerca biomedica l’analisi delle particelle prodotte ed assorbite dalle cellule riveste un ruolo importante per la comprensione dei fenomeni della vita cellulare: esocitosi, secrezione di vescicole, formazione di mammosfere da parte di cellule staminali, o in generale lo studio dell’interazione delle cellule con micro-nanoparticelle biologiche e non biologiche.
Le particelle studiate hanno dimensioni genericamente inferiori al micron e sono per esempio esosomi o altri tipi di vescicole, mammosfere, liposomi, complessi proteici, colloidi o virus.
Come un tecnico esperto del settore può ben sapere, le colture cellulari eseguite nei laboratori prevedono il mantenimento delle cellule in contenitori di plastica opportunamente trattati (fiasche e piastre da coltura), immerse in appropriati mezzi di coltura (detti anche terreni di coltura) liquidi che contengono disciolte le quantità appropriate delle sostanze necessarie, in incubatori che sono in grado di mantenere controllata la temperatura, la pressione parziale dell'anidride carbonica e l'umidità.
In tali condizioni le cellule interagiscono con l’ambiente circostante e riversano o assorbono una serie di particelle nel o dal mezzo di coltura.
Le suddette particelle prodotte o assorbite dalle cellule in coltura sono solitamente analizzate utilizzando comuni tecniche di laboratorio che permettono di misurare caratteristiche fisiche e chimiche associate alle particelle in sospensione in un liquido: ad esempio la dimensione, il potenziale Zeta e la fluorescenza.
Il potenziale Zeta, che è il potenziale a livello dello strato di solvatazione della particella, rappresenta la principale forza d’interazione tra le particelle stesse e tra particelle e cellule. Nel caso delle biomolecole, la misura del potenziale Zeta in funzione del pH consente di determinare il loro punto isoelettrico.
Per l’attuazione di tali misurazioni viene generalmente prelevato un campione di mezzo di coltura dalla coltura cellulare e posto all’interno di particolari cuvette atte ad essere inserite in uno specifico alloggiamento del sistema di misura. Queste cuvette sono solitamente monouso e costituite di materiale plastico trasparente, come il polistirene.
La misura della dimensione viene solitamente eseguita utilizzando la tecnica DLS (Dynamic Light Scattering). Questa tecnica prevede di illuminare il campione con un raggio laser e di misurare le variazioni d’intensità della luce diffusa in funzione del tempo. A parità di temperatura e di viscosità, in funzione della dimensione delle particelle, esse si muovono più o meno velocemente creando più o meno rapide variazioni dell’intensità della luce diffusa. Dalla misura della velocità delle variazioni d’intensità viene calcolato il coefficiente di diffusione delle particelle che tramite l’equazione di Stokes-Eistein viene convertito nel diametro idrodinamico.
La tecnica DLS prevede l’utilizzo di una cuvetta di dimensioni standardizzate e forma parallelepidica avente una porzione superiore aperta per l’inserimento del campione.
Per quanto riguarda invece la misurazione del potenziale Zeta di particelle in sospensione in un liquido, solitamente il campione viene posto all’interno di una particolare cuvetta caratterizzata da un canale ad U atto a contenere il campione e avente alle sue estremità degli elettrodi. Una volta inserita la cuvetta nel sistema di misura, il campione viene illuminato da un raggio laser e allo stesso tempo viene applicato un campo elettrico tra gli elettrodi della cuvetta. Le particelle cariche si spostano verso l’elettrodo di segno opposto, creando una variazione della frequenza della luce diffusa dal campione direttamente proporzionale alla mobilità elettroforetica. Il potenziale Zeta è a sua volta proporzionale alla mobilità elettroforetica.
La tecnica DLS per la misura del diametro idrodinamico e la tecnica di misura del potenziale Zeta utilizzano entrambe un raggio laser che investe il campione ed un detector per rilevare la luce diffusa. Queste due misurazioni possono essere eseguite utilizzando la medesima macchina (es. Z-sizer, Malvern Instruments Ltd). A tale proposito si nota che la- cuvetta con canale ad U per la misura del potenziale Zeta può essere utilizzata in queste tipologie di macchine anche per la misura del diametro idrodinamico.
Relativamente alla misura della fluorescenza, tale misura viene solitamente impiegata per identificare particolari composti fluorescenti (fluorocromi) che possono essere legati attraverso anticorpi specifici a proteine di interesse, oppure usati per marcare le cellule stesse. I fluorocromi hanno la capacità di eccitarsi quando colpiti da un fascio di luce emettendo un segnale fluorescente. Sistemi di citofluorimetria a flusso impiegati per l’analisi in fluorescenza di cellule possono essere impiegati anche per analisi di micro e nanoparticelle come quelle prodotte dalle cellule in coltura.
La citofluorimetria a flusso prevede l’immissione del campione di cellule in sospensione in un sistema fluidico che, facendo passare il campione all’interno di un ugello, determina il passaggio di una cellula alla volta in corrispondenza del punto di misura. La cellula che passa per il punto di misura viene attraversata da un fascio di luce che eccita i fluorocromi. Una volta eccitati i fluorocromi emettono un segnale fluorescente che viene rilevato da dei sensori che ne misurano l’intensità.
Il sistema di citometria a flusso commercialmente denominato FACSCalibur™, prodotto da BD Biosciences, prevede inoltre un dispositivo opzionale per la ricerca biomedica che permette la separazione e l’isolamento delle cellule d’interesse una volta identificate tramite la misura di fluorescenza. Questo dispositivo carica di segno positivo le cellule non fluorescenti e di segno negativo quelle fluorescenti e le convoglia in condotti di raccolta separati attraverso l’applicazione di un campo magnetico appropriato.
Un altro sistema utilizzato per la separazione e il trasporto di particelle è divulgato nel brevetto US 2016/017850 Al di CellPly S.r.l.. Questo sistema prevede un complesso microfluidico che permette di convogliare le cellule in specifici pozzetti di una piastra di coltura. Lo spostamento delle cellule avviene lungo dei condotti caratterizzati dalla presenza di elettrodi sulle pareti esterne. Questi elettrodi vengono utilizzati per generare un campo elettrico aH’interno del condotto tale da trascinare in maniera controllata le cellule.
Pur rispondendo alle attuali esigenze del settore, i suddetti sistemi di analisi definiscono un rigido protocollo d’indagine, limitando l’osservazione ad un campione di particelle secrete o endocitate con riferimento ad un preciso momento temporale.
Inoltre, se è previsto un sistema di separazione sulla base della fluorescenza, non esiste però alcun modo per separare le particelle sulla base della dimensione o della carica.
Il problema tecnico alla base della presente invenzione è, pertanto, quello di escogitare un metodo per l’analisi di particelle in un mezzo di coltura di una coltura cellulare che superi gli inconvenienti riscontrati nell’arte nota, consentendo una maggior flessibilità d’indagine e monitoraggio dei fenomeni di vita cellulare.
Sommario dell' invenzione
L’idea di soluzione che sta alla base della presente invenzione è quella di realizzare una coltura cellulare direttamente all’interno della cuvetta utilizzata per la misura delle caratteristiche delle particelle in sospensione nel mezzo di coltura.
Il problema tecnico precedentemente definito è pertanto risolto da un metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura comprendente le seguenti fasi:
seminare un campione di cellule all’interno di una cuvetta in presenza di un mezzo di coltura;
porre la cuvetta in atmosfera controllata all’interno di un blocco termostatato in modo tale da mantenere in vita il campione di cellule e da promuovere la produzione e/o l’assorbimento di particelle verso e/ o dal mezzo di coltura;
misurare in tempo reale almeno una caratteristica delle particelle immerse in detto mezzo di coltura tramite un blocco per misurazioni di segnale;
interpretare ed analizzare in tempo reale le misure di detta almeno una caratteristica delle particelle per mezzo di un sistema informatico collegato al blocco per misurazioni di segnale.
Si noti che, nel presente contesto, al termine “cuvetta” è attribuito un significato funzionale, genericamente esteso ad un qualsiasi recipiente atto a consentire un’analisi spettrofotometrica e/o spettrofluorimetrica. Il termine “cuvetta” non è quindi da intendersi in alcun modo limitato a forme e/o dimensioni standard attualmente impiegate nel settore. Ad esempio, il metodo sopra delineato può essere eseguito impiegando una fiasca per coltura cellulare, anche di grandi dimensioni, la quale è da considerarsi a tutti gli effetti una cuvetta nel senso sopra espresso.
A fronte delle numerose caratteristiche fisico-chimiche misurabili relative a particelle in sospensione nel mezzo di coltura, il metodo secondo la presente invenzione prevede ad esempio la misurazione della dimensione, del potenziale Zeta e/o della fluorescenza Preferibilmente, come meglio esplicitato in seguito, il metodo comprende altresì una fase di separazione delle particelle sulla base del detto segnale.
La misurazione della dimensione e del potenziale Zeta può essere condotta utilizzando la tecnica della diffusione dinamica della luce.
Mentre un’analisi in fluorescenza è preferibilmente condotta marcando in fluorescenza le particelle immerse nel mezzo di coltura tramite l’impiego di fluorocromi e successivamente misurando l’intensità di un segnale emesso da questi ultimi quando eccitati da un fascio di luce.
Particelle di particolare interesse che si prestano ad essere analizzate con il metodo secondo la presente invenzione sono, ad esempio, gli esosomi. Ciò non escluse di poter identificare, analizzare e/o separare altre micro/nano particelle che rivestono un ruolo importante nei fenomeni della vita delle cellule.
Il metodo può prevedere una fase di separazione delle particelle sulla base del valore della misura di detta almeno una caratteristica servendosi di un blocco separatore.
Nel caso specifico dell’analisi di esosomi, ad esempio, è possibile separare questi in base alla loro dimensione o carica, permettendo analisi specifiche su campioni definiti e purificati (composizione lipidica, proteica e di acidi nucleici degli esosomi prodotti) .
Vantaggiosamente le particelle separate possono essere poi convogliate in rispettivi contenitori mantenuti a temperatura controllata in un blocco frazionatore. Il blocco frazionatore può essere posto all’esterno, integrato o parzialmente integrato all 'interno del blocco separatore.
Le particelle separate vengono preferibilmente estratte dalla cuvetta assieme ad almeno parte del mezzo di coltura che le accoglie.
Al fine di garantire un continuo ed adeguato apporto di sostanze nutritive che contribuiscono al mantenimento della vitalità delle cellule in coltura, il volume di mezzo di coltura contenuto nella cuvetta può essere mantenuto costante da un blocco dedicato, che integra nella cuvetta una quantità di mezzo di coltura pari alla quantità di mezzo di coltura estratto.
Il problema tecnico precedentemente definito è altresì risolto da una cuvetta per un metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura come sopra descritto, la suddetta cuvetta definisce internamente almeno una camera di coltura atta a contenere un campione di cellule in presenza di un mezzo di coltura, in cui almeno una superficie interna della camera di coltura è trattata con una sostanza atta a favorire l’adesione cellulare; la cuvetta comprende inoltre un’apertura di semina per l’inserimento del campione di cellule all’interno di detta camera di coltura.
La suddetta apertura di semina può coincidere con l’apertura superiore della cuvetta oppure essere ricavata ad hoc su una parete laterale, ad ogni modo deve essere tale da poter seminare dall’esterno il campione di cellule garantendo l’accesso alla superficie interna trattata della camera di coltura.
La suddetta cuvetta può essere costituita da un semplice contenitore trasparente, ovvero del tipo tradizionalmente impiegato nella misura della dimensione delle particelle. In questo caso, la modifica saliente rispetto all’arte nota consta nel trattamento della superficie interna per l’adesione cellulare.
In alternativa, la cuvetta può essere del tipo tradizionalmente impiegato per la misura del potenziale Zeta, ovvero comprendere un canale ad U atto ad ospitare almeno parte del mezzo di coltura contenuto nella cuvetta e una coppia di elettrodi per l’applicazione di una campo elettrico all’interno del canale ad U.
In questo caso, la camera di coltura - dotata di almeno una superficie interna opportunamente trattata per l’adesione cellulare -può essere realizzata in comunicazione con il canale ad U, preferibilmente al disotto di questo.
Per garantire la protezione delle cellule dal campo elettrico, la cuvetta può vantaggiosamente comprendere anche dei mezzi di isolamento reversibile della camera di coltura rispetto al canale ad U sovrastante; i mezzi di isolamento vengono azionati durante la misura del potenziale Zeta in modo tale da isolare ermeticamente il campione di cellule dal campo elettrico applicato al canale ad U.
La superficie interna trattata della cuvetta può essere vantaggiosamente realizzata in modo tale da essere rimossa dal resto della cuvetta al fine di recuperare il campione di cellule al termine dell’analisi delle particelle.
Data la necessità nel trattamento di cellule in coltura di evitare contaminazioni esterne, la cuvetta è preferibilmente di tipo monouso.
La cuvetta pronta all’utilizzo è mantenuta sterile all’interno di un involucro; prima dell’utilizzo viene estratta dall’involucro e, una volta terminata l’analisi, viene smaltita e non riutilizzata per un altro campione al fine di evitare contaminazioni.
La cuvetta comprende preferibilmente almeno un coperchio per realizzare, in uso, la chiusura sterile della cuvetta stessa.
Le caratteristiche e i vantaggi del dispositivo e del metodo secondo l'invenzione risulteranno dalla descrizione, fatta qui di seguito, di alcuni esempi di realizzazione dati a titolo indicativo e non limitativo con riferimento ai disegni allegati.
Breve descrizione dei disegni
La figura 1 rappresenta uno schema dei blocchi funzionali integrati in un sistema per l’attuazione del metodo secondo l’invenzione;
la figura 2 rappresenta una vista in prospettiva di una cuvetta, preposta all’analisi di dimensione, per il metodo secondo l’invenzione con coperchio sollevato;
la figura 3 A rappresenta una vista frontale della cuvetta di figura 2 con coperchio in posizione di chiusura;
la figura 3B rappresenta una proiezione assonometrica obliqua a 45° della cuvetta di figura 2;
la figura 4 rappresenta una vista in prospettiva della cuvetta di figura 2 con una prima variante forata del coperchio;
la figura 5 rappresenta una vista dall’alto del coperchio della cuvetta di figura 4;
la figura 6 rappresenta una vista laterale del coperchio di figura 4 con condotti di aspirazione/ rabbocco inseriti nei fori;
la figura 7 rappresenta una vista in prospettiva della cuvetta di figura 2 con una seconda variante forata del coperchio;
la figura 8 rappresenta una vista dall’alto del coperchio della cuvetta di figura 7;
la figura 9 rappresenta una vista laterale del coperchio di figura 7 con condotti di aspirazione/ rabbocco inseriti nei fori;
la figura 10 rappresenta una vista in prospettiva di una cuvetta, preposta all’analisi di potenziale Zeta, secondo l’invenzione;
la figura 11 rappresenta una vista frontale della cuvetta di figura 10;
la figura 12 rappresenta una vista laterale della cuvetta di figura 10;
la figura 13 rappresenta una vista laterale parzialmente sezionata della cuvetta di figura 10;
la figura 14 rappresenta un particolare della parte superiore della cuvetta di figura 10 con coperchi sollevati con condotti di aspirazione /rabbocco inseriti;
la figura 1 5 rappresenta una vista prospettica di un coperchio di figura 14 con condotto di aspirazione/rabbocco inserito;
i la figura 16 rappresenta una vista prospettica di un coperchio
della cuvetta di figura 10;
la figura 17 rappresenta il particolare di figura 14 con
coperchi realizzati in una variante;
t la figura 18 rappresenta una vista frontale della cuvetta di
figura 10 che mostra mezzi di isolamento incorporati nella cuvetta
stessa;
la figura 19A rappresenta una vista frontale della parte
inferiore della cuvetta di figura 10 che mostra un particolare dei mezzi
di isolamento di figura 18 in una configurazione aperta;
la figura 19B rappresenta una vista frontale della parte
inferiore della cuvetta di figura 10 che mostra un particolare dei mezzi
di isolamento di figura 18 in una configurazione chiusa;
la figura 20 rappresenta una vista frontale di un particolare
della parte inferiore della cuvetta di figura 10 con una variante dei
mezzi di isolamento illustrati in dettaglio in conformazione aperta;
la figura 21 rappresenta una vista frontale di un particolare
della parte inferiore della cuvetta di figura 10 con i mezzi di isolamento
illustrati in dettaglio in conformazione chiusa da meccanismo a pistone
integrato nello strumento;
la figura 22 rappresenta una vista frontale di un particolare
della parte inferiore della cuvetta di figura 10 con un’altra variante dei
mezzi di isolamento illustrati in dettaglio, comprendente un occlusore
gonfiabile con ago integrato nello strumento utilizzato per immettere aria nell’occlusore;
la figura 23A rappresenta una vista dell’alto dell’occlusore
gonfiabile sgonfio con inserito l’ago all’interno (conformazione aperta);
ΐ la figura 23B rappresenta una vista dell’alto dell’occlusore
gonfiabile gonfio con inserito l’ago all’interno (conformazione chiusa) .
Descrizione dettagliata
Durante la seguente descrizione verrà utilizzato il termine
particella per indicare indistintamente qualsiasi molecola o sostanza
biologica e non biologica, preferibilmente ma non necessariamente producibile o assorbibile da una cellula in coltura. Aldilà dell’analisi dei
prodotti cellulari, il metodo può infatti essere anche usato per la separazione di diverse particelle in una preparazione, ovvero per la purificazione massiccia di particelle di dimensioni e carica definite
Con riferimento alle figure da 2 a 23, con i numeri di riferimento l e i’ sono state identificate delle cuvette da impiegare in un
metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in t | coltura, in accordo con la presente invenzione. i Eventuali riferimenti posizionali impiegati nella descrizione, comprendenti indicazioni quale anteriore o posteriore, davanti o dietro,
inferiore o superiore, sotto o sopra, o analoghe locuzioni, saranno
sempre riferiti all’orientamento delle pareti precedentemente detto, corrispondente a quanto illustrato in figure 2, 4, 7, 10 e 18.
Dette cuvette 1, 1’ sono preferibilmente sterilizzabili con raggi
gamma e costituite di materiale plastico trasparente, come il polistirene,
che permette il passaggio della luce. In una versione non totalmente
monouso, le pareti laterali della cuvetta potrebbero altresì essere in
quarzo.
In una prima forma di realizzazione, illustrata in figure 2-9, la
cuvetta 1 è specificamente preposta per misure di dimensione delle
particelle.
La cuvetta 1 si concreta sostanzialmente in un contenitore
scatolare, indicativamente a forma di parallelepipedo a base quadrata,
definito da pareti che racchiudono una camera di coltura 7. Come
mostrato in figura 2, 3A e 3B, la cuvetta presenta in particolare una
parete anteriore 2, una parete posteriore 3 contrapposta alla parete
ί anteriore 2, due pareti laterali tra loro contrapposte 4a e 4b, un fondo, I che definisce in particolare una base di semina 5, e un’apertura
superiore 6. La cuvetta 1 comprende inoltre un coperchio 8, 8’, 8”
removibile atto a coprirne l’apertura superiore 6 in modo tale da
impedire il passaggio di microorganismi che potrebbero contaminare il
contenuto della camera di coltura 7.
La base di semina 5 è preferibilmente in polistirene, e
presentare una superficie interna 5a rivestita con polilisina per favorire
l’adesione cellulare su di essa.
Altri materiali e/o sostanze noti nel settore possono essere
impiegati in alternativa, da soli o in combinazione per promuovere*l’adesione cellulare. Si citano, a solo titolo esemplificativo: lisina, ;fibronectina e collagene. ;Come un tecnico esperto del settore potrà ben comprendere, ;nel momento in cui la cuvetta 1 viene riempita con una sospensione di cellule poste in un mezzo di coltura, il trattamento della superficie interna 5a favorisce l’adesione delle cellule su di essa stimolando la proliferazione e la vitalità cellulare. Se la coltura cellulare viene mantenuta in atmosfera controllata (37°C; 5%C02) le cellule si mantengono in vita e sono in grado di portare avanti processi di secrezione e assorbimento di particelle dal mezzo di coltura. ;In alternativa, la cuvetta 1 può prevedere una base di semina 5 removibile, per il recupero del campione di cellule al termine dell’analisi eseguita secondo il metodo della presente invenzione. ;L’introduzione del campione di cellule avviene in questa forma di realizzazione attraverso un’apertura di semina 9 coincidente con l’apertura superiore 6; una volta introdotte le cellule insieme al mezzo di coltura all’interno della camera di coltura 7 viene posizionato il coperchio 8, 8’, 8”. ;Nelle figure 2, 3A e 3B, la cuvetta 1 presenta una variante non forata del coperchio 8. ;Nelle figure 4, 5 e 6, la cuvetta 1 presenta una prima variante forata del coperchio 8’, nel quale sono realizzati un foro di aspirazione 8a e un foro di rabbocco 8b. Nei due fori sono inseriti per interferenza rispettivamente un condotto di aspirazione IOa per l’aspirazione dalla camera di coltura 7 del mezzo di coltura con in sospensione le particelle e un condotto di rabbocco 10b per l’integrazione di nuovo mezzo di coltura all’interno della camera di coltura 7. I fori di aspirazione 8a e rabbocco 8b sono posizionati lungo una diagonale del quadrato che definisce la sagoma del coperchio 8’. ;Nelle figure 7, 8 e 9, la cuvetta 1 presenta una seconda variante forata del coperchio 8”, laddove fori di aspirazione 8a e rabbocco 8b sono posizionati in una configurazione alternativa, lungo una mediana del quadrato. ;In una seconda forma di realizzazione, illustrata in figure 10-23, la cuvetta 1’ è specificamente preposta per misure di potenziale Zeta. ;Nella descrizione di tale forma di realizzazione, gli elementi e le caratteristiche uguali o funzionalmente simili sono identificati con i medesimi riferimenti numerici precedentemente adottati, e per la loro descrizione si fa riferimento al testo precedente. ;A differenza della cuvetta 1 della precedente forma di realizzazione, la cuvetta Γ presenta un canale ad U 11 che determina una riduzione della capienza della camera di coltura 7 ed un’alterazione nella parte superiore della cuvetta 1 ’ dalla forma parallelopipeda, secondo caratteristiche tipiche delle cuvette associate alla misura del potenziale Zeta. ;In particolare, il canale ad U 11 è delimitato dalla parete anteriore 2, dalla parte posteriore 3 e dalle due pareti laterali 4a e 4b, e delimita superiormente la camera di coltura 7 con cui è posto in comunicazione tramite un passaggio 12. ;Ciascuna parete laterale 4a e 4b presenta una sporgenza laterale 13 in corrispondenza della quale è posizionato un elettrodo 14. ;Si nota in particolare come la presenza della camera di coltura 7 al disotto del condotto ad U 1 1 rappresenti una modifica saliente rispetto alle analoghe cuvette dell’arte nota, che al disotto del canale ad U 11 presentano un fondo pieno non utilizzabile allo scopo qui descritto. ;La cuvetta 1’ comprende inoltre una superficie superiore di chiusura 15 sulla quale sono ricavati il foro di aspirazione 8a e il foro di rabbocco 8b del mezzo di coltura. ;Il foro di aspirazione 8a e il foro di rabbocco 8b coincidono con le due aperture di estremità del canale ad U 11. ;La figura 10 mostra una coppia di coperchi per foro 16 utilizzati per la chiusura del foro di aspirazione 8a e del foro di rabbocco 8b. ;In alternativa sul foro di aspirazione 8a e sul foro di rabbocco 8b possono essere posti rispettivamente un coperchio di foro di aspirazione 16a attraversato da un condotto di aspirazione 10a e un coperchio di foro di rabbocco 16b attraversato da un condotto di rabbocco 10b, come mostrato in figura 14 e 15. La figura 17 mostra una forma di realizzazione alternativa del coperchio di foro di aspirazione 16a’ e del coperchio di foro di rabbocco 16b’. ;A differenza della cuvetta 1 della precedente forma di realizzazione, nella cuvetta Γ l’apertura di semina 9 è ricavata su una delle pareti laterali 4a o 4b in corrispondenza della camera di coltura 7, ovvero in prossimità della base di semina 5, e presenta un coperchietto interno in silicone richiudibile 9 a (visibile in figura 11). ;La cuvetta Γ comprende inoltre mezzi di isolamento 17 della camera di coltura 7 atti ad occludere il passaggio 12 che pone in comunicazione il canale ad U 11 con la camera di coltura 7. ;Come mostrato nelle figure 18, 19A e 19B, in una prima variante, dei mezzi di isolamento 17 si concretano in un’asta rigida preferibilmente in plastica e avente forma di elle. La suddetta asta rigida comprende un tratto verticale 17a che corre internamente lungo la parete anteriore 2 della cuvetta 1’, un occlusore orizzontale 17b solidale con l’estremità inferiore del tratto verticale 17a e posto in corrispondenza ed inseribile per interferenza nel passaggio 12, e un prolungamento orizzontale 17c del tratto verticale 17a in corrispondenza dell’estremità superiore del tratto verticale 17a, parallelo all’occlusore orizzontale 17b e fuoriuscente attraverso un’apertura ricavata nella parte anteriore 2 della cuvetta 1 ’. ;L’asta rigida comprendente il tratto verticale 17a, il prolungamento 17c e l’occlusore 17b costituisce il sistema di leva che realizza il meccanismo di funzionamento di questi mezzi di isolamento 17. Nel momento in cui il prolungamento 17c viene spinto verso l’interno della cuvetta Γ esso determina un avanzamento del tratto orizzontale 17b che va ad occludere ermeticamente il passaggio 12 (figura 19B). Un movimento in direzione opposta del prolungamento 17c determina invece una riapertura del passaggio 12 (figura 19A). ;I mezzi di isolamento 17 così come appena descritti risultano integrati aH’interno della cuvetta e presentano un meccanismo di funzionamento che si presta ad essere attuato manualmente. Una tale conformazione della cuvetta trova utile applicazione laddove lo strumento non venga integrato in un blocco termostatato, ovvero risulti ;accessibile all’operatore durante le fasi del metodo descritto. ;Nelle figure 20-21 è rappresentata una forma di realizzazione ;alternativa dei mezzi di isolamento 17’. ;I mezzi di isolamento 17’ prevedono un occlusore orizzontale ;17b’ che può essere inserito dall’esterno della cuvetta 1’ all’interno di un ;canale 70 che sfocia nel passaggio 12 e un coperchio di gomma 70a ;incernierato alla parete del passaggio 12. ;La figura 20 rappresenta mezzi di isolamento 17’ in ;conformazione aperta in cui il coperchio di gomma 70a occlude j l’accesso del canale 70 al passaggio 12, mentre la figura 21 rappresenta I ì i mezzi di isolamento 17’ in conformazione chiusa per isolare le cellule ;durante la misura in cui l’occlusore orizzontale 17b’ è inserito nel ;canale 70 determinando la rotazione del coperchio in gomma 70a che va ;ad occludere il passaggio 12. L Nelle figure 23A e 23B è rappresentata un’ulteriore forma di ;realizzazione dei mezzi di isolamento 17” comprendente un occlusore ;gonfiabile 17b” avente una cavità interna 18 delimitata da un materiale ;£ espandile (es. gomma) che garantisce il gonfiaggio dell’occlusore 17b” ;quando viene iniettata aria in pressione nella cavità 18. ;La cavità 18 è posta in comunicazione con l’esterno della ;cuvetta 1’ tramite un condotto di gonfiaggio 18b all’interno del quale è ;posto un setto 18a. ;Il gonfiaggio dell’occlusore 17b” avviene tramite l’inserimento ;dall’esterno di un ago 19 entro il suddetto condotto di gonfiaggio 18b, ;attraverso il setto 18a, fino al raggiungimento della cavità 18. L’ago 19 è connesso ad un sistema con compressore, posto esternamente alla cuvetta Γ, che eroga l’aria in pressione per il gonfiaggio dell’occlusore 17b”. ;La figura 23A mostra i mezzi di isolamento 17” in una configurazione aperta in cui l’occlusore gonfiabile è sgonfio e non occlude il passaggio 12. Per realizzare la configurazione di chiusura, l’ago 19 è inserito dall’esterno entro il condotto di gonfiaggio 18b e attraversando il setto 18a raggiunge la cavità 18; a questo punto viene azionato il sistema con compressore che, insufflando aria nella cavità attraverso l’ago 19, gonfia l’occlusore 17b” fino alla completa occlusione del passaggio 12. ;La figura 23B invece mostra i mezzi di isolamento 17” in una configurazione chiusa in cui l’occlusore gonfiabile è gonfio ed il passaggio 12 è chiuso. ;Le ultime due forme di realizzazione dei mezzi di isolamento 17’ e 17” prevedono un meccanismo di funzionamento che necessità di un sistema di attuazione esterno alla provetta che interagisce con essa ed è controllato dal sistema informatico 22. ;Di seguito, con riferimento alla figura 1, si descrive il metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura secondo la presente invenzione, che impiega le cuvette l e i’ descritte in precedenza. ;Il metodo prevede innanzitutto la semina di un campione di cellule sospese in un mezzo di coltura liquido all’interno della camera di coltura 7 della cuvetta 1, 1’. Una volta introdotte nella camera di coltura 7, le cellule tenderanno a depositarsi aderendo alla superficie interna 5a della base di semina 5. ;In caso di utilizzo della cuvetta 1’, il procedimento di semina deve essere tale da riempire solo la camera di coltura 7 (mantenendo un volume di terreno di semina al di sotto del canale 12) per la semina delle cellule, dopo circa 2h dalla semina le cellule aderiscono allo strato di polilisina 5a ed il resto del terreno di coltura può essere inserito fino a riempire completamente il canale ad U solo successivamente (in questo modo le cellule non finiscono nel canale ad U). ;Una volta introdotte nella camera di coltura 7, le cellule tenderanno a depositarsi aderendo alla superficie interna 5a della base di semina 5. ;La cuvetta 1, 1’ viene poi inserita aH’interno di un blocco termostatato 20 di incubazione. Il suddetto blocco termostatato 20 consiste in un camera incubatrice che ospita la cuvetta 1, 1’ all’interno della quale è mantenuta un’atmosfera controllata in termini di temperatura, pressione parziale della CO2e umidità per mezzo di un sistema di condizionamento tipico degli incubatori per colture cellulari noti. ;Nel blocco termostatato è preferibilmente mantenuta una temperatura di 37°C e una pressione parziale della CO2pari al 5% tali da mantenere in vita le cellule. Le cellule in coltura entro la cuvetta 1, 1’ posta in atmosfera controllata trovano una condizione ottimale per proliferare e interagire con il mezzo di coltura circostante producendo e/ o assorbendo particelle. ;Il metodo secondo la presente invenzione prevede inoltre la misurazione di caratteristiche fisico- chimiche delle particelle in sospensione nel mezzo di coltura posto entro la cuvetta 1, 1’. L’attuazione delle misurazioni avviene in un blocco per misurazioni di segnale 21 che si relaziona con il blocco termostatato 20 in modo tale da eseguire le misurazioni senza alterare le condizioni dell’atmosfera controllata nel blocco termostato 20. ;Il blocco per misurazioni di segnale 21 può essere posto integrato o parzialmente integrato all’interno del blocco termostato 20. ;Un sistema informatico 22, come per esempio un computer o un tablet, in cui sono installati gli specifici software per l’analisi e l’elaborazione in tempo reale dei dati relativi alle misurazioni, è collegato al blocco per misurazioni di segnale 21. Il sistema informatico 22 permette inoltre di implementare le misurazioni secondo le necessità dell’operatore. ;In una forma di realizzazione preferita del metodo, le misurazioni eseguite sono relative alla dimensione e al potenziale Zeta e fluorescenza delle particelle in sospensione nel mezzo di coltura all’interno della cuvetta 1 , 1 ’. ;Per la misurazione della dimensione e del potenziale Zeta, il blocco per misurazioni del segnale 21 comprende i sistemi di misura descritti nell’arte nota per la misurazione del diametro idrodinamico e del potenziale Zeta di particelle in sospensione in un liquido. ;La cuvetta 1’, a differenza della cuvetta 1 che non può essere usata per la misura del potenziale Zeta, può essere utilizzata sia per la misura di dimensione che del potenziale. ;Per quanto riguarda la misurazione del potenziale Zeta, prima di effettuare la misura, il mezzo di coltura presente nel canale ad U 11 della cuvetta 1’ viene isolato dalla camera di coltura 7. L’isolamento viene attuato previo azionamento dei mezzi di isolamento 17, 17’ e 17” che determina la chiusura ermetica del passaggio 12 tra il canale ad U 1 1 e la camera di coltura 7. ;Come un esperto del settore può ben comprendere, il suddetto isolamento risulta di fondamentale importanza per proteggere le cellule adese sulla base di semina 5 della camera di coltura 7 mantenendo il campo elettrico utilizzato per la misura del potenziale Zeta entro il canale ad U 11. ;Il metodo prevede inoltre la possibilità di eseguire un’analisi di fluorescenza delle particelle in sospensione nel mezzo di coltura. A tale scopo il blocco per misurazioni del segnale 21 comprende inoltre un sistema di citofluorimetria a flusso. ;Per eseguire un’analisi di fluorescenza, le particelle in sospensione nel mezzo di coltura necessitano di essere preventivamente marcate con dei fluorocromi specifici. ;Durante l’analisi di fluorescenza il mezzo di coltura viene prelevato dalla cuvetta 1, 1’ tramite il condotto di aspirazione 10a e convogliato verso sistema fluidico dello strumento di citofluorimetria a flusso. Terminata l’analisi di fluorescenza le particelle possono essere separate in base al loro segnale dal blocco separatore. ;Nella forma di realizzazione preferita del metodo qui descritta, il metodo comprende inoltre la separazione delle particelle analizzate sulla base di almeno una delle caratteristiche fisico-chimiche misurate. Detta fase di separazione è ad ogni modo da considerarsi opzionale, anche se fortemente preferibile per ottenere dei campioni separati in cui è presente una sola specie di particella (dimensione definita o potenziale definito) . ;La separazione delle particelle avviene tramite un blocco separatore 23 che separa le particelle sulla base del valore della misura di dimensione, di potenziale Zeta o di fluorescenza. I criteri con cui viene eseguita la separazione delle particelle vengono impostati dall’utente tramite il computer 22 che è connesso anche al blocco separatore 23. ;La separazione delle particelle eseguita nel blocco separatore 23 prevede preferibilmente la cattura delle particelle all’in terno di un capillare che aspira lentamente il mezzo di coltura incanalando le particelle in fila l’una all’altra, la misura specifica sulla singola particella incanalata e la successiva separazione della particella sulla base del valore misurato. ;Le particelle separate nel blocco separatore 23 vengono poi stoccate in un blocco frazionatore 24 che mantiene le particelle separate all’interno di diversi contenitori mantenuti a una temperatura controllata. ;Il blocco separatore 23 può integrare un dispositivo come quello utilizzato dalla macchina FACSCalibur™ secondo l’arte nota che permette di selezionare le particelle sulla base della misura di ;fluorescenza; ovvero non appena viene eseguita dal blocco per ;misurazioni di segnale 21 la misura di fluorescenza sulla singola ;| particella, essa viene convogliata in contenitori separati in base al ;segnale misurato. ;Per eseguire la separazione delle particelle in base alla ;dimensione o al potenziale Zeta, le particelle sono estratte dalla cuvetta ;1, 1’ tramite il condotto di aspirazione IOa lungo il quale vengono ;incanalate. Il blocco per misurazioni di segnale 21 prevede inoltre un ;k sistema di misura della dimensione e/o del potenziale Zeta di ciascuna ;particella che attraversa il condotto. Una volta eseguita la misurazione, ;il blocco separatore 23 provvede a indirizzare la particella direttamente ;in un determinato contenitore del blocco frazionatore 24 sulla base ;dell’esito della misurazione di dimensione o di potenziale Zeta. ;II blocco separatore 23 può vantaggiosamente servirsi di un ;sistema del tipo divulgato da CellPly che permette il trasporto di ;particelle all’interno di condotti servendosi del campo elettrico generato ;da elettrodi posizionati sulla parete esterna del condotto. ;Le particelle separate vengono estratte dalla cuvetta 1, 1’ ;insieme ad una parte del mezzo di coltura contenuto nella camera di ;coltura 7. ;Il mezzo di coltura estratto viene puoi integrato da un blocco ;per il mantenimento del volume costante 25 che pompa nuovo mezzo di ;coltura all’interno della camera di coltura 7 della cuvetta 1 , 1 ’ tramite il ;condotto di rabbocco 10b garantendo il mantenimento di un volume di ;;* mezzo di coltura costante all’interno della camera di coltura 7 per l’intero tempo di analisi.
Un metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura secondo l’invenzione risolve il problema tecnico e consegue numerosi vantaggi, tra cui innanzitutto quello di prevedere la coltura delle cellule direttamente all’interno della cuvetta utilizzata per le misurazioni delle caratteristiche delle particelle. Al contrario le cuvette attualmente utilizzate non sono studiate per consentire la crescita cellulare.
Mantenendo la cuvetta in atmosfera controllata è possibile mantenere in vita la coltura cellulare e quindi analizzare le particelle contenute nel mezzo di coltura nel tempo garantendo in questo modo un monitoraggio continuo del fenomeno oggetto di studio senza danneggiare l’integrità del campione di cellule e di particelle.
Vantaggiosamente, il metodo secondo l’invenzione permette la separazione delle particelle contenute nel mezzo di coltura in base alle caratteristiche fisico-chimiche quali la dimensione, il potenziale Zeta e la fluorescenza.
La suddetta caratterizzazione delle particelle protratta nel tempo, può essere impiegata per studiare la variazione nel tempo del numero di determinate particelle contenute nel mezzo di coltura.
In particolare, quest’ultimo tipo di analisi è utile per costruire le cosiddette curve di up-take relative all’assorbimento nel tempo di determinate particelle da parte delle cellule in coltura oppure per eseguire una titolazione della quantità di virus prodotto da cellule infettate nel tempo monitorando l’aumento del numero di particelle prodotte nel mezzo di coltura che corrispondono alla dimensione del virus, ma anche la variazione nel tempo del numero e composizione (diametro e potenziale) delle particelle secrete/esocitate dalle cellule.
Vantaggiosamente, il metodo secondo la presente invenzione può inoltre prevedere l’utilizzo della tecnica di citofluorimetria a flusso per caratterizzare e/o separare le particelle andando ad individuare in tempo reale particolari strutture marcate con fluorocromi appartenenti alle particelle, come per esempio proteine o acidi nucleici contenuti in esosomi prodotti dalle cellule.
Ovviamente, al trovato sopra descritto un tecnico del ramo, allo scopo di soddisfare esigenze contingenti e specifiche, potrà apportare numerose modifiche e varianti, tutte peraltro contenute nell’ambito di protezione dell’invenzione quale definito dalle seguenti rivendicazioni.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per l’analisi di particelle secrete e/o endocitate da cellule in coltura comprendente le seguenti fasi: seminare un campione di cellule all’interno di una cuvetta (1, 1 ’j in presenza di un mezzo di coltura; porre detta cuvetta (1, 1’) in atmosfera controllata all 'interno di un blocco termostatato (20) in modo tale da mantenere in vita il campione di cellule e da promuovere la produzione e/o l’assorbimento di particelle verso e/o dal mezzo di coltura; misurare in tempo reale almeno una caratteristica di dette particelle immerse in detto mezzo di coltura tramite un blocco per misurazioni di segnale (21); interpretare ed analizzare in tempo reale le misure di detta almeno una caratteristica di dette particelle per mezzo di un sistema informatico (22) collegato a detto blocco per misurazioni di segnale (21).
  2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, comprendente inoltre la seguente fase: separare dette particelle sulla base del valore della misura di detta almeno una caratteristica servendosi di un blocco separatore (23).
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, dette particelle separate essendo convogliate in rispettivi contenitori mantenuti a temperatura controllata in un blocco frazionatore (24).
  4. 4. Metodo secondo una delle rivendicazioni 2 o 3, laddove le particelle separate vengono estratte dalla cuvetta (1, 1’) assieme ad almeno parte del mezzo di coltura che le accoglie; il volume di detto mezzo di coltura contenuto in detta cuvetta (1, 1’) essendo mantenuto costante da un blocco per il mantenimento del volume costante (25) che integra nella cuvetta (1, 1") una quantità di mezzo di coltura pari alla quantità di mezzo di coltura estratto dalla cuvetta (1, 1’).
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, laddove detta almeno una caratteristica è la dimensione, il potenziale Zeta e/o la fluorescenza.
  6. 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, laddove dette particelle sono esosomi.
  7. 7. Cuvetta (1, 1’) per l’analisi di particelle cellulari, atta ad essere impiegata in un metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti; detta cuvetta (1, 1’) definendo internamente almeno una camera di coltura (7) atta a contenere un campione di cellule in presenza di un mezzo di coltura, almeno una superficie interna (5a) di detta camera di coltura (7) essendo trattata con una sostanza atta a favorire l’adesione cellulare; detta cuvetta (1, 1’) comprendendo inoltre un’apertura di semina (9) per l’inserimento del campione di cellule all’interno di detta camera di coltura (7) .
  8. 8. Cuvetta (1, 1’) secondo la rivendicazione 7, detta cuvetta (1, Γ) comprendendo almeno un coperchio (8, 8’, 8”) per realizzare la chiusura sterile della cuvetta (1, Γ) stessa.
  9. 9. Cuvetta ( l’) secondo la rivendicazione 7 o 8, comprendente inoltre un canale ad U (11) atto ad ospitare almeno parte del mezzo di coltura contenuto nella cuvetta (l’) e comunicante con detta camera di coltura (7), e una coppia di elettrodi (14) per applicazione di una campo elettrico all’interno di detto canale ad U (11).
  10. 10. Cuvetta secondo la rivendicazione 9, comprendente inoltre mezzi di isolamento (17, 17’ e 17”) reversibile di detta camera di coltura (7) rispetto a detto canale ad U (11) sovrastante, detti mezzi di isolamento (17, 17’ e 17”) essendo azionati durante la misura del potenziale Zeta in modo tale da isolare ermeticamente il campione di cellule dal campo elettrico applicato a detto canale ad U (11).
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