HUT77112A

HUT77112A - Kiméragének és eljárás növényi magvak treonintartalmának növelésére

Info

Publication number: HUT77112A
Application number: HU9700033A
Authority: HU
Inventors: Saverio Carl Falco
Original assignee: E.I. Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 1998-03-02
Also published as: ZA955629B; MX9606384A; WO1996001905A1; CA2192550A1; EP0769061A1; AU2963695A; BR9510174A

Description

A találmány tárgya egy bifunkcionális, feedback- szabályozásra nem érzékeny aszpartokináz - homoszerin dehidrogenázt (AK-HDH-t) kódoló kiméragén, amely működőképesen kapcsolódik egy növényi kloroplaszt-tranzitszekvenciához és növényi magspecifikus szabályozó szekvenciákhoz. A találmány tárgyát képezi egy - a kiméragén hasznosításán alapuló - eljárás is, melynek alkalmazásával fokozott mennyiségű treonin termelhető transzformált növények magvaiban.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható javított tápértékű haszonnövények előállítására.

A különféle gabonákból származó emberi táplálék és állati takarmány esszenciális aminosavakra nézve hiányos, például lizinre, a kéntartalmú aminosavakra: metioninra és ciszteinre, valamint treoninra és triptofánra. Számos állat tápanyagfelvételi szükséglete szempontjából a kukoricában a treonin a harmadik leginkább limitáló aminosav, a lizin és a kéntartalmú aminosavak után.

Jelentős erőfeszítéseket teszünk a lizin és a kéntartalmú aminosavak mennyiségének megnövelésére a gabonafélékAktaszárnunk: 84890-7340/PÁ • · · • · *

ben, viszont még kevés kísérlet történt a treonintartalom megnövelésére. Egész magjukra nézve megnövelt koncentrációban tartalmaztak treonint azok a mutáns kukorica- és árpanövények, amelyeket úgy szelektáltak a tenyészetekből, hogy a lizin plusz treonin inhibiciós koncentrációban volt jelen [Hibberd és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 559-563 (1982), Bright és mtsai., Natúré 299, 278-279 (1982)] . Ezekből a növényekből mégsem lettek mezőgazdaságilag elfogadható tenyésznövények és nem kerültek kereskedelmi forgalomba.

Egy kedvezőbb megközelítés növelhetné meg a treonin termelését és felhalmozódását a mezőgazdaságilag elfogadható tenyésznövényekben: a génsebészet. A treonin, a metionin, a lizin és az izoleucin prekurzora az aszpartát. A bioszintézis első lépése az aszpartát foszforilációja, amelyet az aszpartát kináz (AK) végez. Ez az enzim sok szervezetben bizonyult fontos célpontnak a bioszintézis szabályozásában. Úgy gondoljuk, hogy az aszpartátcsalád bioszintézise az elágazási pontok reakcióinál szabályozott, így a treonin esetében az aszpartát-p-szemialdehid redukciója a homoszerin dehidrogenáz (HDH)-enzim segítségével egy fontos pontja lehet a szabályzásnak.

Galili és munkatársai egy E. coli eredetű, lizinre érzékeny AK-enzimet kódoló lysC-gént transzformációval juttattak dohánysejtekbe [Galili és mtsai., Eur. Patent Appl. 91119328.2; Shaul és mtsai., Plánt Physiol. 100,1157-1163 (1992)3 . Az E. coli enzim expressziója kismértékben megnövelte a szabad treonin mennyiségét a transzformált növények • · · leveleiben és magvaiban, de a teljes treonintartalomra kifejtett hatása túl kicsi volt ahhoz, hogy detektálható legyen. Falco egy lizinre nem érzékeny AK-enzimet kódoló mutáns E. coli eredetű lysC-gént izolált. Falco ezt a gént a babphaseolin-promóterhez és egy növényi kloroplaszttranzitszekvenciához kapcsolta és dohányt, valamint canolát transzformált a kiméragénnel. A kiméragén több kópiájának expressziója a transzformált növények magvaiban a teljes treonintartalom szerény növekedéséhez vezetett (WO 93/19190 sz. PCT közzétételi irat). Bár az utóbbi hivatkozásban ismertetett eljárás kismértékű növekedést ér el a treonintartalomban, az igény továbbra is megvan jobb kiméragénekre és olyan eljárásokra, amelyek a magvak treonintartalmát tovább növelik.

A találmány tárgya egy kiméragén, amelyben egy nukleinsavfragmens egy bifunkciós proteint kódol. A protein aszpartát kináz és homoszerin dehidrogenáz aktivitással rendelkezik, és lényegében egyik aktivitás sem érzékeny végtermék-inhibicióra. A gén működőképesen hozzá van kapcsolva egy növényi kloroplaszt-tranzitszekvenciához és egy magspecifikus szabályozó szekvenciához. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a nukleinsavfragmens tartalmazza az E. coli metL génjét. A találmány tárgya továbbá egy növény, amely tartalmazza a fent ismertetett kiméragént, valamint a növény magvai.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás növényi magvak treonintartalmát megnövelésére, amely szerint:

(i) növényi sejteket a fent ismertetett kiméragének egyikével transzformálunk;

(ii) az (i) lépés szerinti transzformált növényi sejtekből magfogásra alkalmas körülmények között termékeny, kifejlett növényeket nevelünk;

(iii) a (ii) lépés szerint előállított utódmagvak közül - a nem transzformált magvakhoz képest - megnövekedett treonintartalmú magvakat szelektálunk.

A találmány tárgyát képezik továbbá a magvak, amelyeket ezzel az eljárással állítottunk elő, és a növények, amelyeket ezekből a magvakból neveltünk.

A találmány még tökéletesebben érthető lesz az alábbi részletes találmányi leírásból, valamint a csatolt ábrák és szekvencialeírások alapján, amelyek szintén a leírás részét képezik.

Az 1. ábra a pBT718-plazmid térképe.

A 2. ábra a pBT726-plazmid térképe.

A 3. ábra a pBT727-plazmid térképe.

A 4. ábra a pBT728-plazmid térképe.

Az 5. ábra a pBT733-plazmid térképe.

A 6. ábra a pBT766-plazmid térképe.

1-2. azonosítószámú szekvenciák: Az 1. példában használjuk mint PCR-láncindító oligonukleotidokat az E. coli metL-gén izolálására és módosítására.

3-3. azonosítószámú szekvenciák: A 2. példában használjuk kukoricaeredetű kloroplaszt-tranzitszekvencia előállítására és a szekvencia E. coli metL-génhez való kapcsolására .

• · «··· ·· « · · · · · · ···· ·· ······ ··

9. azonosítószámú szekvencia: A 4. példában használjuk szójabab-eredetű kloroplaszt-tranzitszekvencia előállítására és a szekvencia E. coli metL-génhez való kapcsolására .

Az alábbi kitanításban nukleinsavfragmenseket, kiméragéneket és eljárásokat írunk le, amelyek alkalmasak transzformált növények magvaiban a treonin felhalmozódásának megnövelésére. A treonin akkumulációjának megnövekedését nem transzformált növények treoninszintjéhez hasonlítjuk.

A találmányi leírás szövegösszefüggésében számos szakmai kifejezést használunk. Az itt használatos nukleinsav kifejezésen nagy molekulát értünk, amely lehet egyszálú vagy kettős szálú, monomerekből (nukleotidokból) épül fel, amelyek cukor-csoportot, foszfát-csoportot és purin- vagy pirimidinbázist tartalmaznak. A nukleinsavfragmens kifejezésen egy adott nukleinsavmolekula egy darabját értjük. Fejlettebb növényekben a genetikus anyag a dezoxiribonuleinsav (DNS), a ribonukleinsav (RNS) pedig az információ átadásában játszik szerepet a DNS-ről a fehérjékre. A genom kifejezésen a genetikus anyag összmennyiségét értjük, amelyet a szervezet mindegyik sejtje tartalmaz. A nukleinsavszekvencia kifejezésen DNSvagy RNS-polimert értünk, amely lehet egyszálú vagy kettős szálú, adott esetben tartalmazhat szintetikus, nem természetes azaz a DNS- vagy RNS-polimerbe beépülni képes módosított nukleotid-bázisokat.

A lényegében hasonló kifejezés DNS-szekvenciákra utal, amelyek csak olyan báziscseréket tartalmazhatnak, melyek nem változtatják meg a kódolt aminosavakat, vagy ha meg is változtatnak egy-két aminosavat, a változások nincsenek hatással a DNS-szekvencia által kódolt fehérje funkcionális tulajdonságaira. Tehát így érthető, hogy a találmány oltalmi köre több szekvenciát foglal magába, mint a példákban említettek. A szekvencia módosításán értünk még olyan változtatásokat is, mint például deléciókat, inszerciókat vagy szubsztitúciókat a szekvenciában, amelyek úgy változtatják meg azt, hogy a kifejeződött fehérjemolekula funkcionális tulajdonságaira alapjában véve nincsenek hatással. Például a génszekvencia olyan megváltoztatását is figyelembe vesszük, amely a genetikai kód degeneráltságát tükrözi, vagy amely kémiailag azonos viselkedést eredményező aminosav kifejeződését hozza létre az adott helyen. így például egy hidrofób aminosav, az alanin kódonja szubsztituálható egy másik, kevésbé hidrofób aminosav, például a glicin kódonjával, vagy egy jobban hidrofób aminosav, például valin, leucin vagy izoleucin kódonjával. Ehhez hasonlóan, egy negatívan töltött aminosav másikra való cseréje esetén, például aszparaginsav cseréje glutaminsavra, vagy egy pozitívan töltött aminosav másikra való cseréje esetén, például lizin cseréje argininra, szintén biológialilag azonos termék keletkezése várható. Az olyan nukleotidokcserék, amelyek a fehérjemolekula N- és Cterminális részében eredményeznek változásokat, várhatóan szintén nem változtatják meg a fehérje aktivitását. Néhány * · esetben kívánatos lehet a szekvencia mutánsainak elkészítése, hogy tanulmányozni lehessen a változtatás hatását a fehérje biológiai aktivitására. A javasolt módosítások mindegyike ismert a technika állása szerint, csakúgy mint a kódolt termékek biológiai aktivitása megmaradásának meghatározása is. Sót szakember számára világos, hogy a találmány szerinti lényegében hasonló szekvenciákat definiálja azok sztringens körülmények között vizsgált (0,lxSSC, 0,1% SDS, 65°C) hibridizálódási képessége a találmány példái szerinti szekvenciákhoz.

A gén kifejezés olyan nukleinsavfragmensre utal, amely specifikus fehérjét expresszál. A nukleinsavfragmens a kódoló régió előtt (5' -végi nem kódoló) és után (3' -végi nem kódoló) szabályzó szekvenciákat tartalmaz. A natív gén kifejezésen természetben megtalálható gént értünk, amelynek saját szabályzó szekvenciája van. A kiméragén kifejezésen olyan gént értünk, amely heterogén szabályzó és kódoló szekvenciákat tartalmaz. Az endogén gén olyan natív gén, amely természetes előfordulási helyén, a genomban található. Az idegen gén egy olyan génre utal, amely természetes körülmények között nem található meg a gazdaszervezetben, de bevihető géntranszfer segítségével.

A kódoló szekvencia egy olyan DNS-szekvencia, amely egy specifikus fehérjét kódol, és nem tartalmaz nem kódoló szekvenciákat.

Az iniciációs kódon és a terminációs kódon a kódoló szekvencia három szomszédos nukleotidját (triplet) jelenti, amely meghatározza a fehérjeszintézis (mRNS8 transzláció) indítását illetve terminációját. Az nyitott leolvasási fázis kifejezés azt az aminosav-szekvenciát jelenti, amely a kódoló szekvencia transzlációs iniciációs és terminációs kódonja között van kódolva.

Az RNS-transzkriptum kifejezés a DNS-szekvencia RNS-polimeráz által katalizált transzkripciójának termékét jelenti. Ha az RNS-transzkriptum a DNS-szekvencia tökéletesen komplementer másolata, a kifejezés elsődleges transzkriptumot jelent, vagy egy RNS-szekvenciát, amely az elsődleges transzkriptum poszttranszkripciós módosításával jött létre. A messenger RNS (mRNS) olyan RNS-t jelent, amelyből a sejt a transzláció során fehérjét szintetizálhat. A cDNS kifejezés egy kettős szálú DNS-t jelent, amelyből az egyik lánc komplementer azzal a mRNS-sel, amelyből reverz transzkripcióval keletkezett. A szensz RNS kifejezés RNS-transzkriptumra utal, az mRNS-t is beleértve .

A leírásban használt megfelelő szabályozó szekvenciák nukleotidszekvenciákat jelentenek, amelyek a kódoló szekvenciától vagy 5' -irányban, vagy azokba ékelődve, vagy azoktól 3' -irányban találhatók. A transzkripciót és/vagy a kódoló szekvencia kifejeződését kontrollálják, potenciálisan összhangban a sejt bioszintetikus rendszerével. Ezek a szabályozó szekvenciák tartalmaznak promótereket, transzlációs vezető szekvenciákat, transzkripciós terminációs szekvenciákat és poliadenilálási szekvenciákat.

A promóter kifejezésen a gén egy - rendszerint a kódoló szekvenciától 5' -irányban található - DNS9 szekvenciarészletét értjük, amely a kódoló szekvencia expresszióját kontrollálja úgy, hogy az RNS-polimeráz felismerőhelye, de más faktorok is szükségesek a megfelelő transzkripcióhoz. A promóter tartalmazhat fehérjetermészetű faktorok kötődésében szerepet játszó DNSszekvenciákat. Ezek a faktorok kontrollálják a transzkripció iniciálásának hatásosságát a fiziológiai és egyedfejlődési állapotnak megfelelően. A promóter enhanszer elemeket is tartalmazhat.

Az enhanszer olyan DNS-szekvencia, amely a promóter aktivitását stimulálja. A promóter eredetileg is tartalmazhatja, vagy lehet egy heterológ elem, amelyet a promóter hatásosságának és/vagy szövetspecifitásának növelésére építettünk be. A konstitutív promóter kifejezésen olyan promótert értünk, amely minden szövetben és állandóan vezérli a génexpressziót. A szövetspecifikus vagy egyedfejlődési állapotra specifikus promóterek a találmányi leírásban szinte kizárólag egy bizonyos szervben, például levelekben vagy magvakban, illetve egy szerv bizonyos egyedfejlődési állapotában, például korai vagy késői embriogenezisben, vezérlik a génexpressziót.

A működőképesen kapcsolt kifejezés egy nukleinsavmolekuia szekvenciáit jelenti, amelyek úgy kapcsolódnak, hogy az egyik funkcióját a többi befolyásolja. Például egy promóter működőképesen kapcsolódik egy struktúrgénhez (például aszpartát kinázt kódoló gén, amely a találmány szerint lizinre nem érzékeny), ha képes befolyásolni a »··· struktúrgén expresszióját (a struktúrgén a promóter transzkripciós kontrollja alatt van).

A találmányi leírásban használt expresszió kifejezésen a gén által kódolt fehérjetermészetű termék előállítását értjük. Pontosabban meghatározva az expresszió kifejezésen a találmány szerinti nukleinsavfragmens(ek)bői származó szensz (mRNS) vagy antiszensz RNS transzkripcióját és stabil felhalmozódását értjük, a sejt fehérjetermészetű komponenseinek működésével összekapcsolódva, amely a szokásostól eltérő mennyiségű fehérjetermészetű terméket eredményez. Az antiszensz gátlás antiszensz RNS-transzkriptumok termelődését jelenti, amelyek képesek megakadályozni a célfehérje kifejeződését. A túltermelés transzgenikus szervezetekben egy géntermék olyan mértékű termelődését jelenti, amely meghaladja a normál vagy nem transzformált szervezetben történő termelődését. A szokásostól eltérő mértékű expresszió transzgenikus szervezetekben egy géntermék olyan mennyiségű vagy arányú termelődését jelenti, amely különbözik a normál vagy nem transzformált szervezetben található mennyiségtől vagy aránytól.

A 3' -végi nem kódoló szekvenciák-on egy gén DNSszekvenciájának azt a darabját értjük, amelyik a poliadenilálási szignált és bármilyen más olyan szabályozó szignált tartalmaz, amely képes befolyásolni a mRNS érését vagy a gén expresszióját. A poliadenilálási szignált rendszerint a prekurzor-mRNS 3' -végéhez kapcsolt poliadenilfarok hatásával jellemezzük.

• · ··« ·

A transzlációs vezető szekvencia egy gén DNSszekvenciájának az a része, amelyik a promóter és kódoló szekvencia között van, átíródik RNS-ra, és megtalálható a teljesen érett mRNS-ben a transzlációs start kódontól 5' irányban. A transzlációs vezető szekvencia hatással van az elsődleges transzkriptum mRNS-sé való érésére, a mRNS stabilitására és a transzláció hatásfokára.

Az érett fehérjén a poszttranszlációs módosítással keletkezett polipeptid láncot értjük, a működési helyhez juttató szignál nélkül. A prekurzor fehérje a mRNS transzlációjának elsődleges terméke. A kloroplasztba juttató szignál egy aminosav-szekvencia, amely az adott fehérjével együtt transzlálódik és azt a kloroplaszthoz irányítja. A kloroplasztba szállító szekvencia egy nukleotidszekvencia, amely a kloroplasztba juttató szignált kódolja.

Végtermék-gátlás vagy feedback-gátlás egy olyan biológiai szabályzó mechanizmus, amelyben a bioszintézisút egy enzimjének katalitikus aktivitása reverzibilisen gátolt a bioszintézisút egy vagy több végtermékének kötődése által, ha a végtermék(ek) koncentrációja elér egy elegendően magas értéket; így lassítja a bioszintézis folyamatát és megakadályozza a végtermék túlzott felhalmozódását.

A transzformáció egy idegen gén bejuttatását jelenti a gazdaszervezet genomjába és azok genetikailag stabil utódait. Növényi transzformációs eljárásokra példa az Agrobacterium-közvetített transzformáció és a részecske12 • · ♦ · · · • · «»· * · • « · · · »· ····· * ·· gyorsított vagy génágyú (gene gun) transzformációs technológia.

A gazdaszervezet azt a sejtet jelenti, amelyet traszformálunk a bevitt genetikai anyaggal.

AK-HDH gének izolálása

A találmány tárgyát bifunkcionális AK-HDH enzimeket kódoló kiméragének képezik. Az enzim egyik katalitikus aktivitása sem érzékeny végtermékgátlásra. A feedbackgátlásra nem érzékeny AK túltermelése megnöveli az aszpartát-eredetű aminosavak keletkezési sebességét az egész bioszintézisútban, pedig nagy koncentrációban vannak jelen a bioszintézis végtermékei, a lizin, a treonin és a metionin. A feedback-gátlásra nem érzékeny bifunkcionális AK-HDH enzim túltermelése a treonin szintéziság felé irányítja az aszpartát-eredetű aminosavak megnövekedett sebességű szintézisét, ezáltal megnöveli a treonin bioszintézisének sebességét.

Számos AK- és AK-HDH-gént izoláltak és szekvenáltak. Például az E. coli eredetű thrA-gént [Katinka és mtsai.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5730-5733 (1980)], az E. coli eredetű metL-gént [ Zakin és mtsai., J. Bioi. Chem. 258, 3028-3031 (1983)], az E. coli eredetű lysC-gént [ Cassan és mtsai., J. Bioi. Chem. 261, 1052-1057 (1986)] és a S.

cerevisae-eredetű HOM3-gént [Rafalski és mtsai., J. Bioi. Chem. 263, 2146-2151 (1988)] . Az E. coli eredetű thrA-gén egy bifunkcionális fehérjét, AKI-HDHI-enzimet kódol. A fehérje aszpartokináz és a homoszerin dehidrogenáz- aktivitását a treonin gátolja. Az E. coli eredetű metL-gén szintén « ** egy bifunkciós fehérjét kódol, AKII-HDHII-enzimet, és a fehérje mind aszpartokináz mind homoszerin dehidrogenáz aktivitása nem érzékeny a bioszintézisút valamennyi végterméke által okozott esetleges gátlásra. Az E. coli eredetű lysCgén az AKIII-enzimet kódolja, amely szenzitiv a lizingátlásra. Az élesztőeredetű H0M3-gén AK-enzimet kódol, amely treoninra szenzitiv.

Az említett mikrobiális gének közül az AKII-HDHIIenzimet kódoló E. coli eredetű metL-gén előnyös. Ahogyan már említettük, ezt a gént már izolálták és szekvenálták. így könnyen kinyerhetjük a E. coli génjének DNS-jából szakemberek által jól ismert technikák segítségével, például PCR segítségével, amelyben a láncindító oligonukleotid egy publikált DNS-szekvencia.

Ismerünk növényi mutánsokat, amelyek lizinre nem érzékeny AK-HDH-enzimet expresszálnak. Lizin- plusz treoninrezisztens árpamutánst írtak le, amelyben két, egymással kötést nem létesítő génben volt mutáció, amely két különböző, lizinre nem érzékeny AK-izoenzimet eredményezett [ Bright és mtsai., Natúré 299, 278-279 (1982), Rognes és mtsai., Planta 157, 32-38 (1983), Arruda és mtsai., Plánt Phsiol. 7 6, 442-446 (1984)] . Lizin- plusz treoninrezisztens kukorica-sejtvonal AK-aktivitása kevésbé volt érzékeny a lizingátlásra, mint a szülő sejtvonal [Hibberd és mtsai., Planta 148, 183-187 (1980)] . Az azt követően izolált lizinplusz treoninrezisztens kukoricamutánsban a gén másik helyén volt a változtatás, és szintén lizinre nem érzékeny AK-enzimet termelt [ Diedrick és mtsai., Theor. Appl. Génét.

·♦*· _e t ·* ’«·* ···· · <* * ·· ’

9, 209-215 (1990), Dotson és mtsai., Planta 182, 546-552 (1990)] . Dohánylevelekben kétféle AK-enzim található, egy lizinre érzékeny és egy treoninra érzékeny. Lizin- plusz treoninrezisztens dohány mutánsát írtak le, amely csak lizinre nem érzékeny AK-enzimet expresszált [ Frankard és mtsai., Theor. Appl. Génét. 82, 273-283 (1991)] .

Ezek a növénymutánsok szolgálhatnak a feedbackgátlásra nem érzékeny AK-HDH-enzimet kódoló gének forrásaként, így ezeket alkalmazzuk a találmány szerinti kitanítás alapján, hogy megnöveljük a treonin felhalmozódását transzformáit növények magvaiban. Répából származó AK-enzim részleges aminosav-szekvenciáját közölték [ Wilson és mtsai., Plánt Physiol. 97, 1323-1328 (1991)] . Ezt az információt felhasználva egy sorozat degenerált DNS-szekvencia tervezhető, szintetizálható és alkalmazható hibridizációs próbaként, lehetővé téve a répaeredetű AK-gén izolálását. A répaeredetű AK-gént nemrégiben izolálták és meghatározták a nukleotidszekvenciáját [Matthews és mtsai., U.S.S.N. 07/746705 (1991)] . Ez a gén szekvenciája alapján PCR segítségével izolálható, és hibridizációs próbaként alkalmazható a fentebb leírt lizinre nem érzékeny AK-HDH-enzimet kódoló gén izolálására.

Kiméragének összeállítása az AK-HDH-enzim expressziója céljából növények magvaiban

A trecnin magvakban történő bioszintézisének megnövelése érdekében megfelelő szabályzószekvenciák állnak rendelkezésre kiméragének készítésére, amelyek az AK-HDHenzimet kódoló szakasz nagymértékű, magspecifikus • · · · • · · · · · • · expresszióját teszik lehetővé. A natív szabályzószekvenciák cseréje két dolgot eredményez: 1) bármilyen pleiotrópiás hatás megakadályozását, amelyek a feleslegben lévő szabad treonin felhalmozódása miatt hathatnak a növény vegetatív növekedésre, mivel a kiméragén(ek) nem fejeződnek ki a transzformált növények vegetatív szöveteiben; 2) az enzim (ek) nagymértékű expresszálását a magvakban.

Idegen gének expressziója növényekben jól ismert [ De Blaere és mtsai. Meth. Enzymol. 143, 277-291 (1987)] . Az AK-HDH-mRNS megfelelő mértékű expresszálásához különböző kiméragének alkalmazása szükséges, amelyek különböző promótereket használnak. Ilyen kiméragének gazdanövényekbe juttathatók vagy egy expressziós vektorral, vagy egynél több vektor egymás utáni használatával. Az AK-HDH-gének expressziójára alkalmas heterológ gazdaszervezetek egy előnyös csoportját az eukarióta gazdaszervezetek alkotják, különösen a magasabbrendű növények sejtjei. A magasabbrendű növények és a belőlük származó magvak közül különösen előnyös a szójabab, a repcemag (Brassica napus, B. campestris) , a napraforgó (Helianthus annus), a gyapot (Gossypium hirsutum) , a kukorica, a dohány (Nicotiana Tubacum), a lucerna (Medicago sativa), a búza (Triticum sp) , az árpa (Hordeum vulgare), a zabfélék (Avena sativa, L) , a cirok (Sorghum bicolor) , a rizs (Oryza sativa) és a takarmányfüvek. A növényekben történő expresszáláshoz a fenti növényekben működő szabályzó szekvenciákat alkalmazzuk.

···· ·· ····· · ··

A kódoló szekvencia expressziójának vezérlésére választott promóter eredete nem kritikus addig, ameddig elegendő traszkripciós aktivitása van ahhoz, hogy a találmány szerint kifejeződjön az AK-HDH-gént kódoló, transzlációra alkalmas mRNS a kívánt gazdaszervezet szövetében.

Előnyös promóternek azok számítanak, amelyek a fehérje kifejeződését specifikusan a magvakban teszik lehetővé. Ez azért lehet különösen hasznos, mert a magvak az elsődleges forrásai a növényi aminosavaknak, és a magspecifikus expresszálás mentes minden potenciális károsító hatástól a többi (magvaktól különböző) szervben. A magspecifikus promóterekhez tartoznak, de nem korlátozva a találmány oltalmi körét, például a mag tartalékfehérjéinek promóterei. A mag tartalékfehérjéi szigorúan szabályozottak, szinte kizárólag csak a magvakban fejeződnek ki, nagymértékben szervspecifikusan és az egyedfejlődési állapotnak megfelelően [ Higgins és mtsai., Ann. Rév. Plánt Physiol. 35, 191221 (1984); Goldberg és mtsai., Cell 56, 149-160 (1989); Thompson és mtsai., BioEssays 10, 108-113 (1989)] . Sőt, különböző mag-tartalékfehérje fejeződhet ki a mag különböző egyedfejlődési állapotában.

Jelenleg számos példa ismert magi tartalékfehérjegének magspecifikus expressziójára transzgenikus kétszikű növényekben. Például kétszikű növényekből származó gének esetén, baberedetű β-phaseolin [ Sengupta-Goplalan és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3320-3324 (1985); Hoffman és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 11, 717-729 (1988)], baberedetű lektin [Voelker és mtsai., EMBO J. 6, 3571-3577 • · · · · · • · (1987)] , szójabab-eredetű lektin [Okamuro és mtsai., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83, 8240-8244 (1986)], szójababeredetű Kunitz-féle tripszin inhibitor [ Perez-Grau és mtsai., Plánt Cell 1., 1095-1109 (1989)], szójabab-eredetű β-conglycinin [ Beachy és mtsai., EMBO J. £, 3047-3053 (1985); Barker és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 458-462 (1988); Chen és mtsai., EMBO J. 7, 297-302 (1988); Chen és mtsai., Dev. Génét. .10, 112-122 (1989); Naito és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 11, 109-123 (1988)], borsóeredetű vicilin [ Higgins és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 11, 683-695 (1988)] , borsóeredetű convicilin [ Newbigin és mtsai., Planta 180, 461 (1990)] , borsóeredetű legumin [ Shirsat és mtsai., Mól. Gén. Genetics 215, 326 (1989)], repceeredetű napin [ Radke és mtsai., Theor. Appl. Génét. 75, 685-694 (1988)] , egyszikű növényekből származó gének esetében például kukoricaeredetű 15 kD-molekulatömegű zein [ Hoffman és mtsai., EMBO J. 6, 3213-3221 (1987); Schernthaner és mtsai., EMBO J. Ί_, 1249-1253 (1988); Williamson és mtsai., Plánt Physiol. 88, 1002-1007 (1988)], árpaeredetű β-hordein [ Marris és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 10, 359-366 (1988)] és búzaeredetű glutenin [ Colot és mtsai., EMBO J. 6, 3559-3564 (1987)] . Ráadásul a magspecifikus gének promóterei, amelyek működőképesen vannak kapcsolva a heterológ kódoló szekvenciákhoz a kiméragén-konstrukciókban, megtartják az expressziót vezérlő időbeli és térbeli paramétereiket a transzgenikus növényekben. Ilyen például a phaseolinpromóter vagy az Arabidosis-eredetű 2S-albumin promóterének a brazildió-eredetű 2S-albumint kódoló szekvenciához törté18

nő kötése és az így kialakított konstrukció kifejezése dohányban, Arabidopsisb&n vagy Brassica napusban [ Altenbach és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 13, 513-522 (1989); Altenbach és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 18, 235-245 (1992); De Clercq és mtsai., Plánt Physiol. 94, 970-979 (1990)] , baberedetű lektin és baberedetű β-phaseolin promótereinek alkalmazása luciferáz kifejezésére [ Riggs és mtsai., Plánt Sci. 63, 4757 (1989)] , és búzaeredetű glutenin promóterének alkalmazása klóramfenikol acetiltranszferáz kifejezésére [ Colot és mtsai., EMBO J. 6, 3559-3564 (1987)] .

A találmány szerinti nukleinsavfragmensek expressziójához néhány alaposan jellemzett szójabab-eredetű magi tartalékfehérje-gént használunk, például a Kunitz-féle tripszin inhibitor génjét [ Jofuku és mtsai., Plánt Cell 1_, 1079-1093 (1989); Perez-Grau és mtsai., Plánt Cell 1, 10951109 (1989)} , glycinin-gént [Nielson és mtsai., Plánt Cell 1, 313-328 (1989)] , β-conglycinin-gént [ Harada és mtsai., Plánt Cell 1^, 415-425 (1989)] . A szójabab-eredetű βconglycinin tartalékfehérje a' - és β-alegységének génjében található promóter különösen hasznos az AK-HDH-mRNS transzgenikus növények szikleveleiben történő expresszálásához a szójababmag közepes-kései egyedfejlődési állapotában [Beachy és mtsai., EMBO J. 4, 3047-3053 (1985); Barker és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 458-462 (1988); Chen és mtsai., EMBO J. J_, 297-302 (1988); Naito és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 1_1, 109-123 (1988)], mivel a) transzgenikus magvakban nagyon kicsi az expressziójukat befolyásoló pozíciós hatás, és b) a két promóter különböző, «· * · időfüggő szabályzás alatt áll: a gén a' -alegységének promótere néhány nappal korábban expresszálódik, mint a βalegység génjének promótere.

A találmány szerinti nukleinsavfragmensek expresszálásában különösen hasznos lehet néhány alaposan jellemzett kukorica magjában található tartalékfehérje génjeiből származó promóter, például a 10 kD-méretű zein endospermiumspecifikus promótere [ Kirihara és mtsai., Gene 71, 359-370 (1988)], a 27 kD-méretű zein-promóter [ Prat és mtsai., Gene 52, 51-49 (1987); Gallardo és mtsai., Plánt Sci. 54, 211281 (1988)] és a 19 kD-métetű zein-promóter [Marks és mtsai., J. Bioi. Chem. 260, 16451-16459 (1985)] . A említett promóterek relatív transzkripciós aktivitását a kukoricában már publikálták [ Kodrzyck és mtsai., Plánt Cell 1., 105114 (1989)] , amely alapja volt a kukoricában alkalmazható promóter kiválasztásának kiméragén-konstrukciók számára. Kukoricsírában történő expresszáláshoz egy erősen csíraspecifikus promóter, a GLBl-génből származó promóter is alkalmazható [ Kriz, Biochemical Genetics 27, 239-251 (1989); Wallace és mtsai., Plánt Physiol. 95, 973-975 (1991)] .

Várható, hogy enhanszerek vagy enhanszerszerű genetikai elemek beépítése más promóterkonstrukciókba az AK-HDHgének megnövekedett mértékű elsődleges transzkripcióját eredményezik, így elérik a találmány célkitűzését. Ezek lehetnek víruseredetű enhanszerek, például ilyen található a 35S-promóterben [ Odell és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 10, 263272 (1988)] , az opin-génekből származó enhanszerek [ Fromm és mtsai., Plánt Cell 1, 977-984 (1989)] , vagy minden egyéb • 4 * ' * · · * <« 4 ··- ·· • * · · « » · _ 20 - *....... ** forrásból származó enhanszer, amely megnövekedett transzkripciót eredményez, ha működőképesen kapcsolódik a találmány szerinti nukleinsavfragmenshez.

Különös fontossága van a β-konglicinin a-alegységének génjéből izolált DNS-szekvenciának, amely egy konstitutív promóter hatékonyságának 40-szeres magspecifikus növekedését éri el [ Chen és mtsai., EMBO J. 7, 297-302 (1988); Chen és mtsai., Dev. Génét. 10, 112-122 (1989)] . Szakember könynyedén képes izolálni ezeket a genetikai elemeket és inszertálni azokat bármilyen gén promóter-régiójába, hogy a promóter segítségével megnövelje a magspecifikus expressziót transzgenikus növényekben. Ilyen genetikai elem bármilyen magspecifikus génbe való inszerciója az expresszió idejét megnöveli a mag fejlődése alatt transzgenikus növényekben, ha a gén máskor expresszálódik, mint a β-konglicinin-gén.

Bármelyik 3'-végi nem-kódoló régió képes biztosítani a poliadenilálási szignált és más szabályzó szekvenciát, amely szükséges lehet az AK-HDH-enzimet kódoló régió megfelelő expressziójához, elérve a találmány célkitűzését. Ez lehet bármelyik tartalékfehérje 3' -vége, például a baberedetű phaseolin-gén 3' -vége, a szójabab-eredetű βkonglicinin-gén 3' -vége; víruseredetű gének 3' -vége, például a karfioleredetű mozaikvírus 35S- vagy a 19Stranszkriprurnának 3' -vége, az opin szintetáz-gén 3'-vége, a ribulóz-1,5-bifoszfát karboxiláz vagy a klorofill-a/b-kötó fehérje génjének 3' -vége, vagy bármilyen más eredetű szekvencia 3' -vége, amelyet alkalmazva az biztosítja a ··· • · · · nukleinsavszekvenciában a szükséges szabályzó információkat a promóter/kódoló régió megfelelő expressziójához, amelyhez az működőképesen kapcsolódik. Számos példa létezik a szakirodalomban a különböző 3' -végi nem-kódoló régiók alkalmazhatóságára [például Ingelbrecht és mtsai., Plánt Cell _1, 671-680 (1989)] .

Intracelluláris lokalizációt kódoló DNS-szekvenciákat kapcsolhatunk az AK-HDH-enzimet kódoló szekvenciához, ha a fehérje találmány szerinti megfelelő expresszálása ezt megkívánja. A növényi aminosavakat bioszintetizáló enzimek a kloroplasztban találhatók és így azok kloroplasztba juttató szignállal együtt szintetizálódnak. A bakteriális fehérjéknek, mint például az E. coli eredetű AKII-HDHII enzimnek nincs ilyen szignálja. Ezért egy kloroplaszt-tranzitszekvenciát fuzionálhatunk a kódoló szekvenciához. Előnyös kloroplaszt-tranzitszekvencia a ribulóz-1,5-bifoszfát karboxiláz kis alegységének kloroplaszt-tranzitszekvenciája, amely például szójabab-eredetű [ Berry-Lowe és mtsai., J. Mól. Appl. Génét. 1^, 483-498 (1982)] , ha kétszikű növényekben alkalmazzuk, és kukoricaeredetű [ Lebrun és mtsai., Nucleic Acid Rés. 15, 4360 (1987)] , ha egyszikű növényekben alkalmazzuk.

Kiméragének növényekbe juttatása Szakember számára különböző eljárások (például transzformáció) ismertek egy DNS-szekvencia magasabbrendű növények eukarióta sejtjeibe való bejuttatására (lásd EPOpublikációk 0 295 959 A2 és 0 138 341 Al). Ezek tartalmazzák az Agrobacterium spp.-eredetű Ti- és Ri-plazmidokat al22 • · · · kalmazó transzformációs vektorokon alapuló eljárásokat is. A Ti-plazmidot alkalmazó vektorok magasabbrendű növények transzformáinak, az egyszikű és kétszikű növényeket is beleértve, például a szójabab, a gyapot és a repce [ Pacciotti és mtsai., Bio/Technology 3, 241 (1985); Byrne és mtsai., Plánt Cell, Tissue and Organ Culture ($, 3 (1987); Sukhapinda és mtsai., Plánt Mól. Bioi. 8, 209-216 (1987); Lorz és mtsai., Mól. Ge. Génét. 199, 178 (1985); Potrykus, Mól. Gén. Génét. 199, 183 (1985)] .

Más transzformációs eljárások is szakember rendelkezésére állnak, például az idegen DNS-konstrukciók közvetlen felvétele (lásd 0 295 959 A2 sz. EPO-publikáció) , elektroporáció [ lásd Fromm és mtsai., Natúré (London) 319, 791 (1986)] , vagy nagysebességű ballisztikus bombázás a nukleinsavkonstrukciókkal borított fémrészecskékkel [ lásd Kline és mtsai., Natúré (London) 327, 70 (1987); 4945050 sz.-ú US. szabadalom] . A transzformált sejteket szakember képes regenerálni.

Különösen fontosak azok a nemrégiben leírt eljárások, amelyek idegen gének kereskedelmileg fontos növényekbe történő transzformálását írják le, például repcemagba [ lásd De Block és mtsai., Plánt Physiol. 91, 694-701 (1989)] , napraforgóba [ Everett és mtsai., Bio/Technology 5, 1201 (1987)], szójababba [ McCabe és mtsai., Bio/Technology 6, 923 (1988); Hinchee és mtsai., Bio/Technology 6, 915 (1988); Chee és mtsai., Plánt Physiol. 91, 1212-1218 (1989); Christou és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7500-7504 (1989)] és • · · · · · kukoricába [ Gordon-Kamm és mtsai., Plánt Cell 2j 603-618 (1990); Fromm és mtsai., Biotechnology 8, 833-839 (1990)] .

Kiméragének expressziója transzformált növényekben

A kiméra-AK-HDH-gén magvakban történő expressziójának és az expresszió magvak aminosavtartalmában megmutatkozó következményeinek analizálására a magból őrleményt készíthetünk szakember által ismert, alkalmas eljárással. Az őrleményt részlegesen vagy teljesen zsírmentesíthetjük hexános extrakcióval, ha szükséges. Fehérjeextraktumot készíthetünk az őrleményből és AK- vagy HDH-enzimaktivitásokat mérhetünk. Ezzel egyidejűleg bármilyen más fehérje tesztelhető szakemberek által jól ismert immunológiai módszerekkel. A magvak szabad aminosav-összetételének meghatározása céljából a szabad aminosavakat extrahálhatjuk az őrleményből, és analizálhatjuk szakemberek által jól ismert eljárások alkalmazásával [Bieleski és mtsai., Anal. Biochem. 17, 278-293 (1966)] . Az aminosav-összetétel bármilyen, kereskedelemben elérhető aminosav-analizátoron meghatározható. A magvak teljes aminosav-összetételének meghatározása céljából, az őrlemény fehérjék által kötött és szabad aminosavtartalma savasan hidrolizálható, így a fehérjék által kötött aminosavakat felszabadulnak és az összetétel meghatározható bármilyen, kereskedelemben elérhető aminosavanalizátorcn. Az AK-HDH-fehérjét kifejező és a vad típusnál magasabb ~reonintartalmú magvakat azonosíthatjuk és tenyészthetjük.

A találmány további ismertetése az alábbi példákon keresztül cörténik, amelyekben minden koncentráció és szá24 zalék tömeg szerinti, a fok pedig Celsius-fok, hacsak másképpen nem definiáljuk. Bár az alábbi példák a találmány előnyös megvalósítási módjait ismertetik, kizárólag szemléltetésre szolgálnak. A fenti diszkusszió és az alábbi példák alapján szakember számára nyilvánvaló a találmány lényege, és az igényelt oltalmi körtől és a találmányi gondolattól való eltérés nélkül képes azt megváltoztatni és módosítani a különböző alkalmazási módoknak és körülményeknek megfelelően.

1. példa

Az E. coli eredetű metL-gén izolálása és az AKII-HDHIIenzim túlzott mértékű kifejezése E. coliban

Az E. coli eredetű metL-gén egy bifunkcionális fehérjét kódol, az AKII-HDHII-enzimet; az enzim AK- és a HDHaktivitása érzéketlen a bioszintézisút bármely végterméke által okozott gátlásra. Az E. coli eredetű metL-gént már izolálták és szekvenálták [ Zakin és mtsai., J. Bioi. Chem. 258, 3028-3031 (1983)] . A találmány szerinti metL-gént tartalmazó DNS-fragmenst a LE392-jelű E. coli törzs genomiális DNS-éből izoláltuk és módosítottuk PCR segítségével. A következő PCR-láncindító oligonukleotidokat terveztük és szintetizáltuk:

CF23=szekvencia azonosító szám: 1:

5' -GAAACCATGGCCAGTGTGATTGCGCAGGCA-3'

CF24=szekvencia azonosító szám: 2:

5' -GAAAGGTACCTTACAACAACTGTGCCAGC-3' «Μ «·«· o c ♦··· ··· — ΖΟ ···· -· ···· · * «·

A láncindító oligonukleotidok egy Ncol-hasítóhelyet juttattak a génbe, amely transzlációs iniciációs kódont tartalmaz az AKII-HDHII-fehérje amino-terminálisánál. A restrikciós hasítóhely és a kigészítő kódon bejuttatása céljából egy alanint kódoló GCC-kódont is kapcsoltunk a fehérje aminoterminálisához. A láncindító oligonukleotidok egy Kpnlkötőhelyet is bejuttattak közvetlenül a transzlációs stopkódon után.

A PCR-t a Perkin-Elmer cégtói vásárolt Cetus-kittel hajtottuk végre a forgalmazó cég utasításai alapján, egy ciklizáló termosztátban, amelyet ugyanettől a cégtől szereztünk be. A láncindító oligonukleotidok koncentrációja 10 μΜ volt, és a termociklus paraméterei a következők voltak: 94° 1 perc, 50° 2 perc, 72° 8 perc 10 cikluson át, majd 94° 1 perc, 72° 8 perc 30 cikluson át.

Négy különböző koncentrációban alkalmazott DNS-templátokkal végzett reakció mindegyike a várt 2,4 kb méretű DNSfragmenst eredményezte, néhány más kisebb fragmenssel együtt. A négy PCR-reakciókeveréket egyesítettük, majd megemésztettük Ncol- és KpnI-enzimmel, és a 2,4 kb méretű fragmenst tisztítottuk és izoláltuk agaróz gélből.

A metL-gén E. coliban tervezett nagymértékű expressziójához egy pET-3a-alapú expressziós vektort készítettünk [ Rosenberg és mtsai., Gene 56, 125-135 (1987)] , amely a bakteriofág eredetű T7-RNS polimeráz/T7-promótert tartalmazó rendszert alkalmazza. Először a pET-3a-vektorban az EcoRI- és a HindlII-hasítóhelyeket az eredeti pozíciónál levágtuk, a végeket DNS-polimeráz Klenow-fragmensével ki26 egészítettük és újra összeligáltuk. Egy EcoRI- és HindlIIhasítóhelyet tartalmazó oligonukleotid-adaptort inszertáltunk a pET-3a-vektorba a BamHI-hasítóhelynél. így jött létre a pET-3aM-vektor, amely egy pótlólagos egyedi klónozóhelyet tartalmaz, ahol géneket lehet inszertálni az expressziós vektorba. Azután a transzlációs iniciációs helynél lévő Ndel-hasitóhelyet alakítottuk át Ncolhasítóhellyé oligonukloetid-irányított mutagenezissel. A pET-3aM-vektor DNS-szekvenciája ennél a szakasznál: 5' CATATGG, ezt átalakítottuk 5' -CCCATGG-szekvenciára, így létrehoztuk a pBT430-plazmidot. Ezt a plazmidot tovább módosítottuk egy KpnI-hasítóhely bejuttatásával az Ncolhasítóhelytől 3' -irányban (szintézisirányban), kiegészítő oligonukleotid-szakasz alkalmazásával.

A korábban kapott 2,4 kb méretű, Ncol- és Kpnlenzimmel emésztett metL-fragmenst inszertáltuk a módosított pBT340-expressziós vektorba, amelyet előtte Ncol- és Kpnlenzimmel kezeltünk. 8 klónból izoláltunk DNS-at, amely tartalmazta a 2,4 kb méretű fragmenst az expressziós vektorban, és transzformáltuk azokat BL21(DE3)-jelű expressziós gazdatörzsbe.

A tenyészeteket ampicillint (100 mg/L) tartalamzó TBtápközegben növesztettük 37°C-on egy éjszakán át. A sejteket centrifugálással különítettük el, és újra felszuszpendáltuk az eredeti térfogat 1/25-részében, 50 mM NaCl; 50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA pufferben, lefagyasztottuk 20°C-ra, felolvasztottuk 37°C-on, és a sejteket ultrahanggal tártuk fel jeges vízfürdőben. A szonikált lizátumot • ·· • · • · centrifugáltuk 4°C-on, 5 percig, 12.000 RPM fordulatszámmal. A felülúszót eltávolítottuk, és a csapadékokat a fenti pufferben szuszpendáltuk fel.

A felülúszót teszteltük HDH-enzimaktivitásra, hogy azonosítsuk a funkcionális enzimet termelő kiónokat. A HDHaktivitásokat a következőképpen mértük:

HDH mérési eljárás:

Törzsoldatok	1,0 ml	0,20 ml	Végkonc
0,2 M KPO₄, pH 7, 0	500 μΐ	100 μΐ	100 mM
3,7 M KC1	270 μΐ	54 μΐ	1, 0 Μ
0,5 M EDTA	20 μΐ	4 μΐ	10 mM
1,0 M MgCl₂	10 μΐ	2 μΐ	10 mM
2 mM NADPH	100 μΐ	20 μΐ	0,20 mM

Keveréket készítettünk a fenti reagensekből a mérések számának megfelelő mennyiségben. Ha a mérés térfogata 1 ml, a fenti keverékből 0,9 ml-t használtunk, ha 0,2 ml (tenyésztő tálcában végzett mérés esetén), akkor 180 μΐ-t.

A fentiek szerint adtunk:

1,0 M ASA, 1,0 N HCl-ben 1 μΐ 0,2 μΐ 1,0 mM a reakciókeverék feléhez; a másik fele ASA nélkül volt a vak sejtextraktum 10-100 μΐ 2-20 μΐ kiegészítés vízzel: 1,0 ml-re 0,2 ml-re

Az enzimet tartalmazó sejtextraktum hozzáadásával indítottuk a reakciót. Körülbelül 30°-on inkubáltuk, és a NADPHoxidációt követtük 340 nm-en. 1 egység enzimaktivitás 1 ··· ·· «··· · · pmol NADPH-t oxidál percenként 30°C-on 1 ml reakciótérfogatban .

A nyolc közül négy extraktumnak volt HDH aktivitása, messze felülmúlva a nem transzformált E. coli gazdatörzs enzimaktivitását. Ebben a négyben azután megmértük az AKaktivitást is. Az AK-aktivitást a következőképpen mértük:

AK mérési eljárás:

Keverék a méréshez (12x1,0 ml-hez vagy 48x0,25 ml-hez):

2,5 ml H₂O

2,0 ml 4 Μ KOH

2,0 ml 4 M NH₂OH-HC1

1,0 ml 1 M Tris-HCl pH 8,0

0,5 ml 0,2 Μ ATP (121 mg/ml 0,2 M NaOH-ban feloldva) μΐ 1 M MgSO₄

A keverék pH-ja 7-8 között volt.

A 1,5 ml-es eppendorf-centrifugacsövek tartalma:

MACRO-mérés MICRO-mérés

keverék	0, 64 ml	0,16 ml
0,2 M L-aszpartát	0,04 ml	0,01 ml
sej textraktum	5-120 pl	1-30 μΐ
kiegészítés vízzel:	0,8 ml-re	0,2 ml-re

A csöveket 30°C-on inkubáltuk 30-60 percig.

A szín kifejlesztéséhez a keverékhez adtunk:

FeCl₅-reagenst 0,4 ml 0,1 ml

FeCl₅-reagens összetétele: 10% FeCl₃	50 g
3, 3%	TCA	15,5 g
0,7%	HC1	35 ml HC1

500 ml vízben.

• ·

A reakciókeveréket 2 percig centrifugáltuk eppendorfcentrifugában.

Az OD-t 540 nm-en olvastuk le.

Két sejtextraktumnak szintén magas AK-aktivitása volt. Ezután a két extraktum AK- és HDH-aktivitásának végtermék-gátlását teszteltük a bioszintézisút végtermékeivel, lizinnel, treoninnal és metioninnal. Az 5. számú klón extraktumának sem az AK-, sem a HDH-aktivitását nem gátolta a 30 mM-os koncentrációban alkalmazott bármelyik végtermék.

Számos extraktum felülúszó és pellet-részét analizáltuk SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel. Az 5. számú klón extraktumában, mind a pellet mind a felülúszó-részben Coomassie blue festéssel látható fő fehérjekomponens molekulatömege körülbelül 85 kD, ami az AKII-HDHII-enzim várható mérete. Az 5. számú kiónból származó pBT718-plazmidban (1. ábra) található metL-gént használtuk a további munkákhoz. Az 5. számú kiónból származó AKII-HDHII-fehérjét elküldtük a Hazelton Research Facility céghez (310 Swampridge Road, Denver, PA 17517), hogy nyúl-ellenanyagot állítsanak elő a fehérje ellen.

2. példa

Kiméragén-konstrukciók E. coli eredetű metL-gének traszformált kukorica csírájában és endospermiumában történő kifejezésére

A következő kiméragéneket állítottuk elő kukoricába történő transzformálás céljából:

globulin-l-promóter/mcts/metL/globulin-1 3' -régió

glutelin-2-promóter/mcts/metL/NOS 3' -régió

A globulin-l-promótert és a 3' -végi szekvenciát a Clontech cégtől vásárolt kukoricaeredetű genomiális DNSkönyvtárból izoláltuk, a glubulin-l-gén publikált szekvenciáját felhasználva oligonukleotid próbák alkalmazásával [ Kriz és mtsai., Plánt Physiol. 91, 636 (1989)] . A klónozott szegmens tartalmazta a promóter-fragmenst, amely 1078 nukleotid kiterjedésű az ATG-transzlációs iniciációs kódontól 5' -irányban; az egész globulint kódoló szekvencia, beleértve az intronokat és a 3' -végi szekvenciát is, 803 bázispár kiterjedésű a transzlációs stop-kódontól. A globulin-l-et kódoló szekvencia más kódoló szekvenciákra való cseréje érdekében egy Ncol-hasítóhelyet építettünk az ATGstart-kódonhoz, és KpnI- és Xbal-hasítóhelyeket építettünk a transzlációs stop-kódontól 3'-irányban PCR-t alkalmazva, így keletkezett a pCC50-vektor. Ez a második Ncolhasítóhely a globulin-l-promóter fragmensében. A globulin-1 génkazettát HindlII-hasítóhelyek szegélyezik.

A glutelin-2-promótert kukoricaeredetű genomi DNSkönyvtárból klónoztuk PCR alkalmazásával, a publikált szekvencia alapján készített láncindító oligonukleotidok segítségével [ Reina és mtsai., Nucleic Acids Rés. 18, 6426-6426 (1990)] . A promóterfragmens 1020 nukleotid kiterjedésű volt az ATG-transzlációs iniciációs kódontól 5'-irányban. Egy Ncol-hasítóhelyet építettünk be PCR segítségével az ATGstarthelyhez közvetlen transzlációs fúziók lehetővé tétele céljából. A BamHI-hasítóhelyet a promóter 5^Z -végéhez építettük be. Az 1,02 kb méretű BamHI/NcoI-promóterfragmenst • · • · ♦ ··· ♦· • · · · · · « ···· ·· ····· · · · klónoztuk egy előzőleg elkészített növényi expressziós vektor BamHI/NcoI-hasítóhelyeket tartalmazó részébe, helyettesítve a 35S-promótert, így keletkezett a pML90-vektor. Ez a vektor tartalmazza a glutelin-2-promótert, amely a GUSkódoló részhez és a NOS-3' -véghez kapcsolódik.

A növényi aminosavakat bioszintetizáló enzimek a kloroplasztokban találhatók és így kloroplasztba juttató szignállal együtt szintetizálódnak. A bakteriális fehérjéknek nincs ilyen szignáljuk. A kloroplaszt-tranzitszekvenciát (cts) így tehát az E. coli eredetű metL-kódoló szekvenciához fuzionáltuk a továbbiakban ismertetésre kerülő kiméragénekben. Kukorica esetében a kukoricaeredetű ribulóz-1,5-difoszfát karboxiláz kis alegységének cts-ját alkalmaztuk [ Lebrun és mtsai, Nucleic Acid Rés. 15, 4360 (1987)] és mcts-szekvenciának neveztük.

A 3. és a 4. azonosítószámú oligonukleotid-szekvenciákat, amelyek a kukoricaeredetű kloroplasztba juttató szignál karboxi-terminálisát tartalmazták, hőkezeltük, így Xbal/Ncol-kompatibilis végek keletkeztek, ezt azután poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítottuk, és inszertáltuk az Xbal/NcoI-enzimekkel emésztett pBT718 plazmidba (1. ábra). A hibátlan szekvencia inszercióját DNSszekvenálással igazoltuk, és így a pBT725-plazmidot kaptuk. A kukoricaeredetű kloroplasztba juttató szignál befejezéséhez annak amino-terminális részét kell inszertálnunk, amelyet a pBT580-plazmiddal végeztünk.

A pBT580-plazmidot a következőképpen készítettük: a

3. és a 4. azonosítószámú oligonukleotidokat (lásd fent) • »* ·*·· ·· _ — w - - w w W -- 32 - .......... * ·' hőkezeltük, ezzel Xbal/NcoI-kompatibilis végeket kaptunk, poliakriamid-gélelektroforézissel tisztítottuk, és inszertáltuk az Xbal/NcoI-enzimekkel emésztett plazmidba, amely tartalmazta az E. coli eredetű lysC-gént, így a kukoricaeredetű kloroplasztba juttató szignál karboxi-terminális részét fuzionáltuk az AKIII-fehérjéhez, és megszüntettük az Ncol-hasítóhelyet. A hibátlan szekvencia inszercióját DNSszekvenálással igazoltuk, és így a pBT556-plazmidot kaptuk. Az 5. és a 6. azonosítószámú oligonukleotidokat, amelyek a kloroplasztba juttató szignál középső részét kódolják, hőkezeltük, ezzel BglII/Xbal-kompatibilis végeket kaptunk, poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítottuk, és inszertáltuk a BglII/Xbal-enzimmel emésztett pBT556-plazmidba. A hibátlan szekvencia inszercióját DNS-szekvenálással igazoltuk, és így kaptuk a pBT557-plazmidot. A 7. és a 8. azonosítószámú oligonukleotidokat, amelyek a kloroplasztba juttató szignál amino-terminalis részét kódolják, hőkezeltük, ezzel Ncol/Af111-kompatibilis végeket kaptunk, poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítottuk, és inszertáltuk a Ncol/Aflll-enzimmel emésztett pBT557-plazmidba. A hibátlan szekvencia inszercióját DNS-szekvenálással igazoltuk, és így kaptuk a pBT558-plazmidot. így a teljes mctsszekvenciát a lysC-génhez fuzionáltuk.

A mcts/lysC-M4-kódoló szekvenciát a pBT558-plazmidból izoláltuk és inszertáltuk az NcoI/Smal-enzimekkel emésztett pML90-plazmidba (készítését lásd fent), így kaptuk a pBT580-plazmidot. A pBT580-plazmidot emésztettük BamHI/Xbal-enzimekkel, amely egy 1,14 kb méretű fragmenst ··«« · eredményezett, amely tartalmazta a glutelin-2-promótert plusz a kukoricaeredetű kloroplasztba juttató szignál amino-terminálisát. Ezt a fragmenst inszertáltuk az előzőleg BglII/Xbal-enzimekkel emésztett pBT725-plazmidba, így kaptuk a pBT726-plazmidot (2. ábra), amelyben teljessé vált az mcts-szekvencia fúziója a metL-kódoló szekvenciával.

A globulin-l-promóter/mcts/metL/globulin-1 3' -régió kiméragén készítése a következő volt:

A 2,6 kb méretű NcoI/KpnI-fragmenst, amely az mcts/metLkódoló szekvenciát tartalmazta, a pBT726-plazmidból izoláltuk, és inszertáltuk az Ncol(részlegesen)/KpnI-enzimekkel emésztett pCC50-plazmidba, így kaptuk a pBT727-plazmidot (3. ábra).

A glutelin-2-promóter/mcts/metL/NOS 3' -régió kiméragén készítése a következő volt:

A 2,6 kb méretű NcoI/KpnI-fragmenst, amely az mcts/metLkódoló szekvenciát tartalmazta, a pBT726-plazmidból izoláltuk, és inszertáltuk ugyanezen enzimekkel emésztett pML90plazmidba (lásd fent), így kaptuk a pBT728-plazmidot (4. ábra).

3. példa

Kukorica transzformálása kiméragénekkel, amelyek E. coli eredetű metL-gént expresszálnak csírában és endospermiumban

Kukoricát traszformáltunk a következő kiméragénekkel:

globulin-l-promóter/mcts/metL/globulin-1 3' -régió vagy glutelin-2-promóter/mcts/metL/NOS 3' -régió.

• · · ·

A Streptomyces hygroscopicus-eredetű. bakteriális bargént, amely a glufosinát gyomirtószer-rezisztenciát okozza [ Thompson és mtsai., The EMBO Journal 6, 2519-2523 (1987)] , használtuk szelekciós markerként a kukorica transzformációjához. A bar-gén transzlációs kódonját megváltoztatták GTGről ATG-re, a megfelelő növényi transzlációs iniciáció céljából [De Block és mtsai., The EMBO Journal 6, 2513-2518 (1987)] . A bar-gént a karfiol-mozaikvírusból származó 35Spromóter vezérelte, a terminációs és a poliadenilálási szignál pedig az Agróbactérium tumefaciens-eredetű oktopin szintetáz-génből származott.

Embriogén kalluszkultúrákat indítottunk egy II. típusú kallusz szövetkultúra-válasz adására nemesített kukorica-tenyészvonal magjaiból kivágott fejletlen (körülbelül 1,0-1,5 mm-es) csírákból. A csírákat 10-12 nappal a beporzás után vágtuk ki és helyeztük tengely-oldalukkal lefelé agarózzal szilárdított Nő-táptalajra [ Chu és mtsai., Sci. Sin. 18, 659-668 (1974)] , amelyet 1,0 mg/L 2,4-D-vel (N61,0) egészítettünk ki. A csírákat sötétben, 27°C-on tartottuk. Laza állagú, csírájukban lévő, szomatikus procsírákat és szomatikus csírákat tartalmazó differenciálatlan sejjtömegből álló kalluszok fejlődtek ki a szuszpenzor struktúrákon, amelyek éretlen csírák szkutellumából proliferálódtak. Embriogén kalluszklónokat izoláltunk az egyedi csírákból, azonosítottuk és átoltottuk azokat N6-l,0 táptalajra minden második-harmadik héten.

Géneket részecskebombázás alkalmazásával juttattunk kallusztenyészetek sejtjeibe. Biolistic™PDS-1000-He ké35 szüléket (BioRAD Laboratories, Hercules, CA) használtunk ezekhez a kísérletekhez.

Restrikciós endonukleázos emésztéssel linearizált cirkuláris plazmid-DNS-at vagy DNS-at csaptunk ki aranyrészecskék felszínére. Két vagy három különböző plazmidból származó DNS-at csaptunk ki együtt, az egyik a kukorica traszformációjához szükséges szelekciós markert kódolta, egy másik pedig egy kiméragént tartalmazott, amely a treonin magvakban történő akkumulációjára alkalmas. Mindegyik DNS-ból 2,5 gg-ot (vízben oldottuk 1 mg/ml-es koncentrációban) adtunk 25 μΐ vízben szuszpendált (60 mg aranyrészecske 1 ml vízben) aranyrészecskéhez (átlagos átmérője 1,0 gm volt). Kálcium kloridot (25 μΐ-t a 2,5 M-os oldatból) és spermidint (10 gl-t az 1,0 M-os oldatból) adtunk azután a DNS-arany-szuszpenzióhoz, 3 perc alatt vortexezés közben. Az aranyrészecske-szuszpenziót azután mikrocentrifugában centrifugáltuk 1 másodpercig és a felülúszót eltávolítottuk. Az aranyrészecskéket 1 ml abszolút etanolban szuszpendáltuk fel, újra centrifugáltuk és a felülúszót eltávolítottuk. Végül az aranyrészecskéket 25 gl abszolút etanolban szuszpendáltuk fel és kétszer szonikáltuk 1-2 másodpercig. Öt gl DNS-sel burkolt aranyrészecskét helyeztünk a készülék makrohordozó-lemezére és hagytuk, hogy az etanol elpárologjon és a DNS-sel burkolt aranyrészecskék megszáradjanak a lemezen.

Csírájukban lévő kalluszokat helyeztünk egy körkörös, 4 cm átmérőjű területre egy 100x20 mm-es petricsésze közepére, amely N6-l,0 táptalajt tartalmazott,

0,25 M szorbitollal és 0,25 M mannitollal kiegészítve. A szövetet

4-6 órával a bombázás előtti előkezelésként helyeztük a táptalajra és a bombázás alatt is ott tartottuk. A 4-6 órás előkezelés után a szövetet tartalmazó petricsészét a PDS1000-He-készülék kamrájába helyeztük. A kamrában ezután 28-29 Hginch vákuumot állítottunk elő. A makrohordozót hélium- sokkhullámmal gyorsítottuk fel szakadómembrán alkalmazásával, amely akkor szakadt át, amikor a He-nyomás a sokkoló csőben elérte a 1080-1100 psi-t. A szövet körülbelül 8 cm-re volt a fékezőernyőtől. Öt-hét szövetet tartalmazó tálcát bombáztunk a DNS-sel borított aranyrészecskékkel. A bombázás után a kalluszszöveteket szorbitollal és mannitollal kiegészített N6-l,0 táptalajra helyeztük.

A bombázás után 3-5 nappal a szövetet 2 mg/ml bialaphost tartalmazó N6-l,0 szelekciós táptalajra helyeztük. Minden szövetet kéthetente helyeztünk friss bialaphost tartalmazó N6-l,0 táptalajra. 6-12 hét múlva azonosítottuk az aktívan növekvő kalluszklónokat. A kalluszokat ezután MS-alapú táptalajra tettük át, amely elősegítette a növény regenerálódását.

4. példa

Kiméragén-kcnstrukciók E._coli_eredetű metL-gén expresszálására transzformált szójabab magvaiban

A következő kiméragént állítottuk elő szójababba történő transzformálás céljából:

phaseolin 5' -régió/cts/metL/phaseolin 3' -régió

Transzformált szójababban történő expresszióhoz egy magspecifikus expressziós egységet használtunk, amely a Phaseolus vulgáris-babfajból származó phaseolin magspecifikus tartalékfehérje β-alegységét kódoló gén promóteréből és transzkripciós terminációs kódonjából állt [ Doyle és mtsai., J. Bioi. Chem. 261, 9228-9238 (1986)] . A phaseolin expressziós egység körülbelül 500 nukleotidot tartalmazott a transzlációs iniciációs kódontól számítva 5' -irányban, és körülbelül 1650 nukleotidot a phaseolin transzlációs stop kódonjától számítva 3'-irányban. Az 5'- és a 3' -régió között találhatók az egyedüli Ncol- (amely az ATGtranszlációs iniciációs kódont tartalmazza), Smal-, Kpnlés Xbal-restrikciós hasítóhelyek. Az egész expressziós egység HindlII-hasítóhelyekkel van körülvéve.

A phaseolin-5' -régió/cts/metL/phaseolin-3' -régió kiméragén készítése:

A metL-kódoló szekvenciát tartalmazó 2,4 kb méretű NcoI/KpnI fragmenst a pBT718-plazmidból (lásd fent) izoláltuk és inszertáltuk az NcoI/KpnI-enzimekkel szintén emésztett pUC18-vektorba, amely a magspecifikus expressziós egységet tartalmazta, így kaptuk a pBT733-plazmidot (5. ábra).

A növényi, aminosavakat bioszintetizáló enzimek a kloroplasztban találhatók és ezért a kloroplasztba juttató szignállal szintetizálódnak. A bakteriális AKII-HDHIIfehérjének nincs ilyen szignálja. Ezért tehát egy kloroplaszt-tranzitszekvenciát (cts) fuzionáltunk az E. coli erdetű metL-gént kódoló szekvenciához a kiméragénben. Az alkalmazott cts-szekvencia, azonosítási száma 9., azonos • · · · ·

volt a szójabab-eredetű ribulóz-1,5-difoszfát karboxiláz kis alegységének cts-jával [Berry-Lowe és mtsai., J. Mól. Appl. Génét. 1, 483-498 (1982)] . A cts-szekvencia Ncolhasítóhellyel volt szegélyezve így inszertálhattuk a pBT733-plazmid metL-magspecifikus expressziós egységébe, így kaptuk a pBT766-plazmidot (6. ábra).

5. példa

Szójabab transzformációja phaseolin/cts/metL-kiméragénnel

A szomatikus csírák indukciója céljából, 3-5 mm hoszszúságú szikleveleket vágtunk le A2872-jelű szójababtenyészetből vett sterilizált felszínű, fejletlen magvakról, azokat 26°C-on tenyésztettük fényben vagy sötétben agar-táptalajon (SBl vagy SB2) 6-10 hétig. A szomatikus csírákat, amelyek a másodlagos csírákat hozták létre, kivágtuk és folyékony tápközegbe (SB55) helyeztük. A korai globuláris állapotban lévő csíraként szaporodó szomatikus csírák csoportjainak ismételt szelekciója után a szuszpenziókat az alábbiakban leírt módon tartottuk fenn.

A csírájukban lévő szójabab-szuszpenziós tenyészeteket 35 ml folyékony tápközegben (SB55) tartottuk fennt, rázógépen, 150 rpm-el, 26°C-on fluoreszcens fénnyel, 16:8 óra nap/éjszaka arányban. A tenyészetekből szubtenyészeteket készítettünk minden második héten, körülbelül 35 mg szövetet inokulálva a 35 ml folyékony tápközegbe.

A csírájukban lévő szójabab-szuszpenziós tenyészeteket részecskeágyú-bombázás alkalmazásával transzformáltuk [ Kline és mtsai., Natúré (London) 327, 70 (1987); 4945050 • · · · · sz. U.S. szabadalom] . Du Pont Biolistic™ PDS1000/HE készüléket (hélium retrofit) alkalmaztunk ezekhez a transzformációkhoz .

A szójabab-transzformációhoz használt szelekciós marker a karfiol-mozaikvírus 35S-promóteréból [ Odell és mtsai., Natúré 313,810-812 (1985)], (az E. coli eredetű) pJR225-plazmidból származó hygromicin foszfotranszferázgénból [ Gritz és mtsai., Gene 25, 179-188 (1983)] és az Agrobacterium tumefaciens-ből származó Ti-plazmidban található T-DNS nopalin szintetáz-génjének 3' -régiójából állt. A magspecifikus expressziós egységet (phaseolin-5' régió/cts/metL/phaseolin-3' -régió, lásd 4. példa) egy körülbelül 4,5 kb méretű HindlII-fragmensként izoláltuk a pBT766-plazmidból (6. ábra). Ezt a fragmenst inszertáltuk a markergént hordozó vektor egyedüli HindlII-hasítóhelyébe, így kaptuk a pBT767-plazmidot.

Az aranyrészecske-szuszpenzió (1 μπι méretű aranyrészecskéket tartalmazott és koncentrációja 60 mg/ml volt) 50 μΐ-nyi térfogatához a leírt sorrendben adtuk a következő anyagokat: 5 μΐ DNS (lgg/pl) , 20 μΐ spermidin (0,1 M) és 50 μΐ CaCl₂ (2,5 M). A keveréket három percig kevertettük, 10 másodpercig centrifugáltuk mikrocentrifugában és a felülúszót eltávolítottuk. A DNS-val borított részecskéket azután egyszer mostuk 400 μΐ 70%-os etanollal és 40 μΐ vízmentes etanollal szuszpendáltuk fel. A DNS-részecskeszuszpenziót háromszor szonikáltuk egyenként egy másodpercig. Öt μΐ DNS-el borított aranyrészecskét tettünk azután mindegyik makrohordozó lemezre.

fc «·» « · ·

Körülbelül 300-400 mg kéthetes szuszpenziós kultúrát helyeztünk egy üres 60x15 mm-es petri-csészébe és a maradék folyadékot egy pipettával eltávolítottuk a szövettől. Rendszerint minden egyes transzformációs kísérletben körülbelül

5-10 szövetet tartalmazó tálcát bombáztunk. A membrán szakadási nyomását 1100 psi-re állítottuk és a kamrában a vákuum 28 Hginch volt. A szövetet körülbelül 3,5 inchre helyeztük a védőernyőtől, és háromszor bombáztuk. A bombázás után a szövetet megfeleztük és visszatettük folyadékba, és a fentieknek megfelelően tenyésztettük.

Öt-hét nappal a bombázás után a folyékony tápközeget friss SB55-re cseréltük, és 11-12 nappal a bombázás után 50 mg/ml hygromicint tartalmazó friss SB55-tápközegre. A szelekciós táptalajt hetente frissítettük. Hét-nyolc nappal a bombázás után zöld, transzformált szövetet lehetett megfigyelni a nem traszformált, nekrotikus embriogén csoportokból kinőve. Az izolált zöld szövetet eltávolítottuk és inokuláltuk külön-külön edényben, hogy új, kiónok szerint tenyésztett, transzformált csíraszerű állapotban lévő szuszpenziós kultúrákat hozzunk létre. Minden egyes tenyészvonalat független transzformációként kezeltünk. Ezekből a szuszpenziós kultúrákból szubkultúrákat hoztunk létre, és fejletlen csírák csoportjaiként tartottuk fent azokat, vagy regeneráltuk egész növénnyé az egyes szomatikus embriók és kicsiráztatásával és megérlelésével.

·· »-Μ· ·ν* -J ->*«.. « » — / 1 · ·· * ♦* ·· *4 ± — · · · · · · · »«·? .· ·«·« · 3 «4

Táptalajok :

SB55-törzsoldatok (gramm/liter):

MS-szulfát lOOxtömény MS halogenidek lOOxtömény

MgSO₄.7H₂O	37,0	CaCl₂ .H₂O	44,0
MnSO₄.H₂O	1, 69	KI	0, 083
ZnSO₄.7H₂O	0, 86	CoCl₂.6H₂O	0,00125
CuSO₄.5H₂O	0,0025
MS Ρ,Β,Μο lOOxtömény	MS FeEDTA lOOxtömény
KH₂PO₄	17,0	Na₂EDTA	3,724
h₃bo₃	0, 62	FeSO₄.7H₂O	2, 784
Na₂MoO₄.2H₂O	0, 025

B5-vitamin törzsoldat g m-inozitol

100 mg nikotinsav

100 mg piridoxin-HCl g tiamin

SB55 (1 literbe) ml mindegyik MS törzsoldatból ml B5-vitamin törzsoldat

0, 8 g NH₄NO₃

3, 033 g KNO₃ ml 2,4-D (10 mg/ml törzsoldat) 60 g szacharóz 0,667 g aszparagin pH 5,7 • ·

-V

SB103 (1 literbe)	SBl (1 literbe)
MS sók	MS sók
6% maltóz	B5-vitaminok
750 mg MgCl₂	0,175 M glükóz
0,2% Gelrite	20 mg 2,4-D
pH 5,7	0,8% agar
SB2	pH 5,8

ugyanaz, mint az SBl,

kivéve 40 mg/1 2,4-D

• ·

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAAACCATGG CCAGTGTGAT TGCGCAGGCA 30

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 29 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAAAGGTACC TTACAACAAC TGTGCCAGC 29

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 43 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris • ·

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGAAGCCT CGGCAACGTC AGCAACGGCG GAAGAATCCG GTG 43

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 43 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGCACCGG ATTCTTCCGC CGTTGCTGAC GTTGCCGAGG CTT 43

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCCCATGG CGCCCCTTAA GTCCACCGCC AGCCTCCCCG TCGCCCGCCG

CTCCT 55

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 55 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTAGAGGAGC GGCGGGCGAC GGGGAGGCTG GCGGTGGACT

CATGG

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 59 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATGGCGCCC ACCGTGATGA TGGCCTCGTC GGCCACCGCC

TCCAGGGGC

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 59 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

TAAGGGGCGC

GTCGCTCCGT ···

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTAAGCCCCT GGAACGGAGC GACGGCGGTG GCCGACGAGG CCATCATCAC

GGTGGGCGC 59

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 174 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCATGGCTTC GCCGGTGCCG	CTCAATGATC	TCCTCCCCAG	CTGTTACCAC	CGTCAACCGT 60
GCATGGTTGC	TCCATTCACC	GGCCTCAAAA	GCATGGCTGG	CTTCCCCACG
AGGAAGACCA				120
ACAATGACAT	TACCTCCATT	GCTAGCAACG	GTGGAAGAGT	ACAATGTGCC

ATGG

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Kiméragén, amely növényi kloroplaszt-tranzitszekvenciához és magspecifikus szabályozó szekvenciához működőképesen hozzákapcsolt bifunkcionális, végtermékgátlásra nem érzékeny aszpartokináz és homoszerin dehidrogenáz aktivitású fehérjét kódoló nukleinsavfragmenst tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti kiméragén, amely E. coli eredetű metL-gént magába foglaló nukleinsavfragmenst tartalmaz .
3. Növény, amely genomjában 1. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz.
4. Mag, amely genomjában 1. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz.
5. Eljárás növényi magvak treonintartalmának - a transzformálatlan növények magjaiban található szinthez képest történő - megnövelésére, azzal jellemezve, hogy:

(i) növényi sejteket 1. igénypont szerinti kiméragénnel transzformálunk;

(ii) az (i) lépés szerinti transzformált növényi sejtekből magfogásra alkalmas körülmények között termékeny, kifejlett növényeket nevelünk;

(iii) a (ii) lépés szerint előállított utódmagvak közül - a nem transzformált magvakhoz képest - megnövekedett treonintartalmú magvakat szelektálunk.
6. Növény, amely 5. igénypont szerinti eljárás szerint lett előállítva.

·» 48
7. Növény, amely genomjában 2. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz.
8. Mag, amely genomjában 2. igénypont szerinti kiméragént tartalmaz.
9. Eljárás növényi magvak treonintartalmának megnövelésére, azzal jellemezve, hogy:

(i) növényi sejteket 2. igénypont szerinti kiméragénnel transzformálunk;

(ii) az (i) lépés szerinti transzformált növényi sejtekből magfogásra alkalmas körülmények között termékeny, kifejlett növényeket nevelünk;

(iii) a (ii) lépés szerint előállított utódmagvak közül - a nem transzformált magvakhoz képest - megnövekedett treonintartalmú magvakat szelektálunk.
10. Növény, amely 9. igénypont szerinti eljárással lett előállítva.