HUT75077A - Method of identifying substances with a potential herbicidal or growth-regulatory action by means of vegetable transporter proteins, use of such transporter proteins for this purpose, and substances with a herbicidal or growth-regulatory action identified - Google Patents
Method of identifying substances with a potential herbicidal or growth-regulatory action by means of vegetable transporter proteins, use of such transporter proteins for this purpose, and substances with a herbicidal or growth-regulatory action identified Download PDFInfo
- Publication number
- HUT75077A HUT75077A HU9601653A HU9601653A HUT75077A HU T75077 A HUT75077 A HU T75077A HU 9601653 A HU9601653 A HU 9601653A HU 9601653 A HU9601653 A HU 9601653A HU T75077 A HUT75077 A HU T75077A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- growth
- transporter
- herbicidal
- transport
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
- G01N2430/20—Herbicides, e.g. DDT
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
A találmány tárgyát potenciális herbicid vagy növekedésszabályozó hatású anyagok növényi transzportfehérjék segítségével való azonosítására szolgáló eljárás, ennek alkalmazása, valamint az eljárással azonosítható herbicid vagy növekedésszabályozó hatású vegyületek képezik.
Az új növényvédő szereknél megkövetelik, hogy a jelenleg létező szerekkel ellentétben csekélyebb toxicitást, magasabb fokú környezetbarátságot és fokozott hatást mutassanak. Az ilyen anyagok sikeres megtalálásának valószínűsége a rendelkezésre álló anyagok száma mellett lényegében attól az eljárástól függ, amelyet a hatásos anyagok azonosítására használnak.
A jelenleg használt eljárások többsége azon alapszik, hogy a vegyületeket a herbicid illetve növekedésszabályozó hatásukra tekintettel közvetlenül növényeken vizsgálják, ezért ezek az eljárások rendszerint igen idő- és költségigényesek, és kiterjedt kísérleti felületet követelnek. Következésképpen például kevés vegyületet lehet egyidejűleg vizsgálni.
Ezért szükség van egy olyan eljárásra, amely egyszerűen és gyorsan kivitelezhető, így kellő számú anyagot lehet vizsgálni vele .
Kidolgoztunk tehát egy olyan eljárást, amellyel azok a kémiai vegyületek azonosíthatók, amelyek specifikusan egy növényi transzportfehérjével lépnek kölcsönhatásba. A találmány szerinti eljáráshoz ta-rtozik mindenek előtt ezeknek az anyagoknak egy transzgén organizmuson, — előnyösen egy egysejtű organizmuson, amely egy növényi transzportfehérjét termel funkcionálisan, vagy transzgén sejteken, amelyek egy növényi transzportfehérjét funkcionálisan termelnek — a transzport folyamatok gátlására való vizsgálható. Az így gátló hatásúnak talált vegyületek végül teljes növényeken vizsgálhatók meg.
A transzportfehérjék szó alatt találmányunk keretében olyan fehérjéket értünk, amelyek a növényi sejtekben az anyagok membránokon keresztüli transzportjáért felelősek.
A találmány szerinti eljárás során egy növényi transzportfehérjét integrálunk egy vizsgáló rendszerbe, ami lehetővé teszi a membrántranszport funkciók kvalitatív és kvantitatív mérését biokémiai, mikrobiológiai és fiziológiai mérőmódszerek segítségével. Ennek a vizsgáló rendszernek az alkalmazása lehetővé teszi az olyan hatóanyagok célzott felfedezését, amelyek a növényi transzportfehérjékkel lépnek kölcsönhatásba. Anyagok kölcsönhatása egy transzportfehérjével a transzportfolyamatok gátlását vagy inaktiválódását okozhatja, és ezen kívül maguknak az anyagoknak a transzportálódásához is vezethet.
A transzportfolyamatoknak központi szerepük van a növények teljes anyagcseréjében és gyakran nélkülözhetetlenek a növények növekedésében, ami lehetővé teszi a találmány szerinti eljárás számára, hogy célzottan és nagy valószínűséggel azonosítsa azokat a vegyületeket, amelyek befolyásolják a növények növekedését .
A kölcsönhatás növekedésszabályozó illetve herbicid hatást idézhet elő, ha a kiválasztott anyag a természetes transzportfolyamatokat gátolja. Abban az esetben, amikor a gátló hatású anyag önmaga transzportálódik, az anyag növényvédő szerek, például fungicidek, inszekticidek, nematicidek, akaricidek, külö4 nősen herbicidek és növekedésszabályozók alkotórésze lehet, megnöveli azok mobilitását a növényekben és ezáltal új szereket eredményezhet.
A találmány szerinti vizsgáló rendszer ezen kívül arra is használható, hogy a növényi transzportfehérjéket molekuláris szinten vizsgáljuk.
Ezidáig nincs leírva olyan eljárás, amely növényi transzportfehérjék felhasználásával azonosítana herbicid vagy növekedésszabályozó hatású vegyületeket. Ugyancsak nincs leírva a növényi transzportfolyamatok gátlása herbicidek hatásmechanizmusaként. Továbbá az sem ismert, vajon a növényi transzportfehérjék az anyagcserében elfoglalt helyzetük alapján, például a szaporítószervek ellátásával, érdekes potenciális támadáspontok lehetnének-e herbicid illetve növekedésszabályozó anyagok számára .
A találmány szerinti eljárás egy biokémiai vizsgáló módszert alkalmaz, amelynek első lépésében előnyösen egy egysejtű szervezetet vagy sejttenyészetben fenntartott sejteket használunk. Ennek a vizsgáló módszernek az az előnye, hogy a jelenlegi, a herbicid vagy növekedésszabályozó hatású anyagok azonosítására szolgáló eljárásokhoz képest gyorsan és egyszerűen vitelezhető ki. Továbbá lehetővé teszi azt is, hogy nagy számú anyagot vizsgáljunk meg herbicid vagy növekedésszabályozó hatás szempontjából.
A találmány szerinti eljárásnak az is előnye még, hogy olyan anyagokat azonosíthatunk vele, amelyek egy pontosan meghatározott növényi fehérjével lépnek kölcsönhatásba. Az emberre, állatokra és a környezetre nézve nem kívánatos hatások csökkentése érdekében ez a célfehérje úgy választható meg, hogy működése növényspecifikus legyen.
Célfehérjeként a találmány szerinti eljárásba előnyösen olyan fehérjéket illesztünk, amelyek a növényekben az anyagok membránokon keresztüli transzportjáért felelősek, előnyösen olyan transzportfehérjéket, amelyek növényspecifikusak.
A találmány tárgya tehát egy eljárás olyan anyagok azonosítására, amelyek a növényi transzportfolyamatok gátlásán vagy inaktiválásán alapuló potenciális herbicid vagy növekedésszabályozó hatással rendelkeznek, azzal jellemezve, hogy egy kémiai vegyületet egy növényi transzportfehérjén a transzportfolyamatok gátlására megvizsgálunk, és az így aktívnak talált vegyületet herbicid vagy növekedésszabályozó hatásra vizsgáljuk növényeken, vagy hogy
a) mindenek előtt a transzportfehérjét állítjuk elő egy, az adott transzportfehérjét kódoló DNS - szekvencia heterológ expressziójával egy transzgén organizmusban vagy transzgén sejtekben, majd
b) ezt a rekombináns szervezetet egészként, vagy a transzgén sejteket egy kémiai vegyületnek az említett transzportfehérjével szembeni gátló hatásának vizsgálatára használjuk, és
c) a vegyület aktivitását olyan szervezet vagy sejtek ellen is megvizsgáljuk, amely vagy amelyek nem termelik az említett transzportfehérjét, hogy kizárjuk azt a lehetőséget, hogy a vegyület más hatásmechanizmussal gátolja a szervezeteket vagy sejteket, végül
d) a transzportfehérjével szemben aktív vegyületet herbicid vagy növekedésszabályozó hatásra vizsgáljuk növényeken .
A találmány szerinti eljárás általában minden, a növényekben előforduló transzportfehérjén, illetve transzportfehérjét kódoló DNS-szekvencián alkalmazható.
A vegyület membránokon keresztüli transzportjáért felelős különböző transzportfehérjéket már azonosították a növényekben és részben az ilyen transzportfehérjéket kódoló DNS-szekvenciák is rendelkezésre állnak.
így például a szacharóz-transzporter közvetlenül kimutatható intakt növényekből, illetve izolált levélszövetekből. A szacharóz - felvétel emellett pH-függő [Giaquinta, Natúré,267, 369-370 (1977); Annu. Rév. Plánt Physiol. 34, 347-387 (1983);
Delrot és Bonnemain, Plánt Physiol. 67 , 560-564 (1981)] . A pklór-merkuri-benzil-szulfonsav és a dietil-pirokarbonát a transzporterek nagy hatású gátlószerei [Bush, Plánt Physiol. 89, 1318-1323 (1989)] . A növényi szaharóz-transzportért kódoló
DNS-szekvenciákat is leírták már például burgonyából (p62 illetve StSUTl) és spenótból (S21 illetve SoSUTl) [WO 94/00574 számú nemzetközi szabadalmi leírás; Riesmeier és munkatársai, Plánt Cell _5_, 1591-1598 (1993); EMBO J. 11, 4705-4713 (1992)], lúdfűből (Arabidopsis thaliana; sucl- és suc2-gén; EMBL-génbank X75365 letéti szám), nagy útifűből (Plantago major; EMBL-génbank X75764 letéti szám), paradicsomból (Lycopersicon esculentum; X82275 letéti szám) és dohányból (Nicotiana tabacum; EMBL génbank X82276 és X82272 letéti számok) . A szacharóz - transz porter esetében sikerrel járt a transzportért kódoló, spenótból és burgonyából származó cDNS-szekvenciák klónozása egy mesterséges komplementációs rendszer kifejlesztésével Saccharomyces cerevisiae-ben [Riesmeier és munkatársai, EMBO J. 11, 4705-4713 (1992); Plánt Cell, 5, 1591-1598 (1993)].
Aminosav-transzportért ugyancsak izoláltak már növényekből. A magasabbrendű növényekkel rokon Chlorella zöldalga legalább három különböző, szabályozott aminosavtranszport-rendszerrel rendelkezik [Sauer és Tanner, Plánt Physiol. 7 9, 750764 (1985)]. Emellett létezik egy aktív transzporter is, amihez egy H+-ATP által létrehozott protongrádiens szolgáltatja az energiát.
A magasabbrendű növényekben közvetett módon, a fa- és a háncsszövet összetételének vizsgálatából lehet egy passzív transzportra (könnyített diffúzió) következtetni. Ezzel ellentétben sikeresen lehetett a ricinus sziklevelének háncsszövetével illetve gyökerének faszövetével aminosavakat szelektíven és koncentráció-grádienssel szemben felvetetni [Schobert és Komor, Planta 177, 342-349 (1989); Planta 181, 85-90 (1990)]. Legalább négy, független H+-kotranszportert sikerült kimutatni különböző növényfajokból izolált vezikulumokból [Li és Bush, Plánt Physiol . 94, 268-277 (1991)].
Élesztők aminosav-transzport mutánsaival, komplementációval sikerült az Arabidopsis thaliana ureid- és aminosavpermeáz-génjeit izolálni és jellemezni, így például azokat a cDNSszekvenciákat, amelyek az AAP1 és AAP2 aminosav-transzportere8 két kódolják [Frommer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 0 , 5944-5948 (1993) ; Kwart és munkatársai, Planta J. 4_, 993-1002 (1993); WO 94/01559 számú nemzetközi szabadalmi leírás] .
Egy komplementációs eljárással, az shr3 élesztő-mutánst használva — amelynek endogén aminosav-transzportere nem működik a sejtmembránon keresztül [Ljungdahl és munkatársai, Cell 71 463-478 (1992)] — sikerült egy sor további, növényekben aminosav-transzportereket kódoló DNS-szekvenciát izolálni, így például az Arabidopsis thaliana AAP3 (EMBL-génbank X77449 letéti szám), AAP4 (X77500), AAP5 (X77501), AAT1 (X71787) és NTR1 (X77503) aminosav-transzportereinek cDNS-szekvenciáit.
Ismertek továbbá növényi ammónium-transzportért kódoló cDNS-szekvenciák is, például az Arabidopsis thaliana AMT1 ammónium- transzporterét kódoló cDNS [Ninnemann és munkatársai, EMBO J. 13 , 3464-3471 (1994) ; P 43 37 597,9 számú német szabadalmi leírás; EMBL-génbank X75879 letéti szám].
A membránkötött transzportfehérjék génjeinek klónozását már az említett példákon kívül is többször leírták. Elvben több, különböző módon lehet a membránfehérjék génjeit klónozni. A vörösvérsejtek glükóztranszporter-génjének izolálásakor például a cDNS-klónok azonosítása a fehérjék tisztításával sikerült [Mueckler és munkatársai, Science 229, 941-945 (1985)]. Sokszor viszont 'a membrántranszporterek tisztítása annyira nehéz, hogy más módszert kell alkalmazni, például a heterológ expressziót oocitákban. [Hediger és munkatársai, Natúré 330, 379381 (1987)] . Növényi plazmalemma H+-ATP-áz gént a homológia folytán állati- és gomba-génekhez klónoztak. Növényi glükóztranszporter-gént izoláltak Chlorella-ból különböző cDNS-szűrő módszerekkel [Sauer és munkatársai, EMBO J. 8., 3045-3050 (1990)]. A Chlorella-ból származó egyik cDNS-klónt használták fel heterológ mintaként több magasabbrendű növény glükóztransz porter-génjének klónozásához [Sauer és munkatársai (1990)] . A kloroplasztisz trióz-foszfát-transzlokátorát (TPT) a DIDS inhibitorán keresztül radioaktivitással jelölve, a jelzett fehérjét izolálták és szekvenálták. A peptid-szekvencia egy részén szintetikus oligonukleotidot állítottak elő, amit mintaként használtak a TPT-t kódoló cDNS-ek izolálásához [Flügge és munkatársai, EMBO J. 8, 39-46 (1989)].
A már ismert DNS-szekvenciák, amelyek növényi transzportfehérjéket kódolnak, további transzportfehérjéket kódoló DNS-szekvenciák növényekből való izolálásához és azonosításához használhatók fel a szokásos molekulárbiológiai technikákkal.
A találmány szerinti eljárásban előnyösen olyan géneket használunk, amelyek azokat a transzportfehérjéket kódolják, amelyek a növények növekedéséhez nélkülözhetetlenek. A megfelelő transzportfehérjék gátlása így a növekedés akadályoztatásához vezet. Amennyiben az érintett transzportfehérjéket kódoló DNSszekvenciák rendelkezésre állnak, kimutatásuk például expreszsziójuk segítségével, az érintett gének antiszensz gátlásával történhet transzgén növényekben [Willmitzer, Trends Génét. 4, 13-18 (1988)]. Az ilyen transzgén növények előállításának technikája ismert a szakemberek előtt. így például egy, a trifoszfát-transzlokátort kódoló antiszensz DNS úgy mutatható ki az expresszión keresztül, hogy a fehérjék termelődésének már egy csekély csökkenése is drasztikus növekedésgátláshoz vezet a növényekben [Riesmeier és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6160-6164 (1993)]. Ugyanígy mutatható ki a szacharóztranszporter is, ahol az aktivitás csökkenése erős növekedésgátláshoz vezet burgonyanövényeken. Ezen kívül az érintett növények levelei is károsodnak és alig vagy nem képeznek gumókat [Riesmeier és munkatársai, EMBO J. 13 , 1-7 (1994)] . Mivel a szaporítószervek is erősen károsodnak, elvárható, hogy egy megfelelő herbicid ne csak a növények növekedését gátolja, hanem a szaporodásukat is csökkentse. Várhatóan hasonló a helyzet az ammónium- és aminosav-transzport esetében is, amelyek az anyagcserében esszenciális nitrogén-transzportot végzik.
A leírt esszenciális funkciók alapján találmányunk előnyös megvalósításának látjuk az aminosavak, a szacharóz és az ammónium transzportfehérjéinek célfehérjékként való felhasználását annak érdekében, hogy potenciálisan növényspecifikus hatóanyagokat találjunk, különösen a fent egyenként megnevezett transzportfehérjék felhasználását.
A megfelelő gének, amelyek a transzportfehérjéket kódolják, ismert molekulárgenetikai eljárásokkal nyerhetők az olyan szervezetekből vagy sejtekből, amelyekben egy működőképes transzportfehérje kifejeződése biztosított.
Az a) eljárás-lépésben megnevezett szervezet előnyösen egy egysejtű szervezet. Az egysejtű szervezetet úgy választjuk meg, hogy könnyen tenyészthető legyen és a transzportfehérje kifejeződése megfelelő legyen. Erre a célra különösen alkalmasak a mikroorganizmusok, mint a baktériumok, gombák és élesztők. A találmány szerinti eljáráshoz megfelelőek a növényi sejtek tenyészetei vagy kallusztenyészetek is éppúgy, mint az állati sejttenyészetek, különösen az oocita-tenyészetek, előnyösen a Xenopus-oociták tenyészete.
Egy növényi transzportfehérje-gént tartalmazó transzgén sejteket illetve az azokat tartalmazó rekombináns szervezeteket mint egészeket is beilleszthetjük egy vizsgáló módszerbe, vagy használhatunk izolált membránokat vagy tisztított transzportfehérjéket is. Ezek a rekombináns organizmusok (baktériumok, gombák és élesztők) és transzgén sejtek találmányunk tárgyát képezik .
Egy gén, amely egy transzportfehérjét kódol, ezen kívül egy szervezet egy meghatározott mutánsába is bevihető, amely a megfelelő transzportfehérje működése nélkül növekedésképtelen [Riesmeier és munkatársai, EMBO J. 11, 4705-4713 (1992)]. Egy ilyen mutáns alkalmazása azért különösen előnyös, mert a rekombináns szervezet növekedése egy alkalmas tápközegen a transzporterek működőképességének felel meg és így a vizsgált anyagok hatása a membrántranszportra kvantitatív módon leírható. A növekedési tesztre jellemző a különösen egyszerű kivitelezhetőség és az anyagok gyors átfuttatása. Emiatt előnyös a megfelelő mutánsok használata, mint amilyenek például a szacharóztranszporter- [SUSY7; Riesmeier és munkatársai, EMBO J. 11, 4705-4713 (1992)], az aminosavtranszporter- [élesztőmutáns 22574d és JT16; Frommer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5944-5948 (1993); élesztőmutáns shr3; Ljungdahl és munkatársai,
Cell 71, 463-478 (1992)] és az ammóniumtranszporter- [Ninnemann és munkatársai, EMBO J. 13 , 3464-3471 (1994)] mutánsok.
Találmányunk szerint az említett szervezet vagy sejtek a szóban forgó transzporter-génekkel lettek transzformálva. A rekombináns szervezet illetve a transzgén sejtek közismert mikrobiológiai módszerekkel tetszés szerint szaporíthatok és így korlátlan mennyiségben állnak rendelkezésre egy vizsgáló rendszerbe való illesztéshez. Anyagok herbicid és/vagy növekedésszabályozó tulajdonságokra való vizsgálatához egy többlépcsős eljárásmód az előnyös: először rekombináns szervezeteket vagy transzgén sejteket tenyésztünk tápközegben, ahol egy esszenciális növekedési szubsztrátot úgy választunk meg, hogy csak a vizsgálandó transzporteren keresztül juthasson a sejtekbe és ezen kívül ne legyen más szubsztrát a tápközegben, ami azt funkcionálisan helyettesíthetné. Egy szacharóz-transzporter esetében például a tápközegben a szacharóz az egyedüli szénforrás, egy aminosav-transzporter esetében a tápközegben egy aminosav van, ami a sejtek egyetlen szén- vagy nitrogénforrásául szolgál, és egy ammónium-transzporter esetében a tápközegben az ammónium az egyetlen nitrogénforrás. A vizsgálandó anyagokat a szaporodási fázis alatt adjuk a tápközeghez és a sejtek szaporodását szokásos módszerekkel meghatározzuk.
Ahhoz,, hogy egy anyagnak egy membrántranszporterrel való specifikus kölcsönhatását kimutassuk és a más hatásmechanizmusokat, mint a növekedésgátlás okát, kizárhassuk, az anyagnak a következő feltételeket kell teljesítenie:
1) a rekombináns sejteknek az anyag hozzáadása után félreért13 hetetlenül csökkent szaporodást kell mutatniuk, mint az anyag hozzáadása nélkül;
2) ugyanazon organizmusnál az anyag hozzáadása nem gátolhatja a szaporodást, ha egy másik szubsztrát jelen van a tápközegben, amely a transzporter tulajdonképpeni szubsztrátját a sejtekben funkcionálisan helyettesíteni képes, és önmaga nem az érintett transzporteren keresztül jut be a sejtbe. Az élesztősejtek például képesek vagy szacharózon, vagy egy aminosavon, mint szénforráson, szaporodni. Nitrogénforrásként az élesztők alternatív módon vagy egy aminosavat, vagy ammóniumiont hasznosítanak.
Ha egy anyag teljesíti a fent leírt követelményeket, úgy egy biokémiai tesztben vizsgáljuk tovább. Ebben a vizsgálatban a természetes szubsztrátnak vagy a gátló anyagoknak a membránon való átlépését mérjük. Ehhez egész élesztősejteket vagy izolált membrán-vezikulumokat használhatunk. A transzporter-szubsztrát vagy a gátló anyag átjutását a membránon úgy határozhatjuk meg, hogy a szubsztrátot vagy anyagot a feltárt sejtekből izoláljuk és szokásos analitikai módszerekkel megmérjük. Általában a szubsztrátot vagy az anyagot radioaktivitással jelölt formában adjuk és később sugárzása alapján analizáljuk. A szubsztrát és a gátló anyag koncentrációjának változtatásával, szokásos biokémiai módszerekkel, a gátlás típusa is meghatározható. A továbbiakban megvizsgáljuk, hogy vajon maga az anyag transzportálódik-e a transzporteren keresztül.
Ha egy anyag a fenti követelményeket kielégíti, úgy minden további biokémiai vizsgálat nélkül, közvetlenül teljes növénye14 ken vagy megfelelő növényi részeken vizsgálhatjuk herbicid hatását, vagy a növényekben való mobilitását. Ehhez ismert herbológiai és élettani módszereket alkalmazhatunk.
A találmány szerinti eljárással azonosított vegyületek, amelyek herbicid és/vagy növekedésszabályozó hatással bírnak növényeken, valamint azok más herbicidekkel, növekedésszabályozókkal, inszekticidekkel, akaricidekkel, fungicidekkel és a mezőgazdaságban szokásosan használt segédanyagokkal készült formulációi ugyancsak találmányunk tárgyát képezik.
A találmány szerinti eljárással olyan anyagok is azonosíthatók, amelyek a transzportfehérjék (transzporterek) által jutnak át a növényi sejtmembránon. Ezek az anyagok ugyancsak a találmány tárgyát képezik.
Az eljárás olyan kémiai szerkezetek azonosítására is szolgálhat, amelyek különösen jól transzportálódnak a növényekben. A jó mobilitás képessége a növényvédő szereknél, mint amilyenek a herbicidek és az inszekticidek, különösen kívánatos.
A találmány szerinti eljárás használható továbbá transzportálható kémiai szerkezetek azonosítására szolgáló vizsgáló rendszerként is. Mivel a szacharóz- és az aminosav-transzporter a fő transzportrendszerek a szerves molekulák számára a membránokban, az élesztő-rendszer például egyszerű tesztként használható a szerves molekulák növényekben való mobilitásának vizsgálatára. Előnyös^ ezért egy többlépcsős eljárásmód: először egy szaporodás-tesztben lehet az idegen anyagok felvételét vizsgálni. Erre építve lehet a közvetlen transzport-méréseket intakt élesztőn vagy izolált membránokon, a pontosabb vizsgálat érdé15 kében elvégezni. Kontrolként mindig olyan élesztők szolgálnak, amelyekben a transzporter nincs gátolva. Az élesztők mellett itt más szervezeteket, különösen egysejtű szervezeteket és különösen állati vagy növényi sejtek tenyészeteit használhatjuk.
A transzport specifikus gátoltsága esetén a transzgén élesztő csökkent szaporodása figyelhető meg. A transzporterek vizsgálatán keresztül jobban megérthetjük, milyen jellemzők kellenek a transzportálhatósághoz. Egy sor olyan anyag esetében, amelyek a hiányzó transzportálhatóság következtében mindeddig peszticidként hatástalanok voltak, lehetségessé válik a molekulák olyan kémiai módosítása, hogy elnyerjék ezeket a jellemzőket és jobban a hatás helyére jussanak. Ugyancsak elképzelhető, hogy a transzportért molekulárbiológiai módszerekkel vagy mutációval úgy változtassuk meg, hogy a növényvédő szerek, mint például az inszekticidek és a herbicidek jobban transzportálódjanak a membránokon keresztül. A megváltoztatott transzportfehér j e-gének ezután a növényekbe visszajuttathatók.
Az olyan transzportfehérjék, amelyek a növényvédő szereket a növényi sejtmembránon át transzportálják, ugyancsak találmányunk tárgyához tartoznak.
Hasonlóképpen a találmány tárgyát képezik azok a növényvédő szerek, különösen herbicidek és növekedésszabályozók, amelyek a növényi transzportrendszert gátolják, ahol a növényi transzportrendszer (transzporter) például a szacharóz-, az ammónium- vagy az aminosav-transzporter.
A vizsgáló rendszer a vegyületek azonosítása mellett más fontos kérdések vizsgálatára is alkalmazható, például milyen ezen fehérjék szerkezeti felépítése és hogyan ismerik fel a szubsztrátjukat, azaz milyen összefüggés van a szerkezet és a funkció között, és általában hogyan oszlik el anyag egy szervezetben. A módszerek, amelyekkel a leírt transzporterek izolálása és jellemzése megvalósítható, felhasználhatók más fehérjék (például iontranszporterek vagy állati rendszerek transzportfehérjéi) izolálására és hasonló módon történő vizsgálatára is.
A következő alkalmazási példák a találmány tárgyát világítják meg anélkül, hogy behatárolnák azt. A példákban a növényi szacharóz-, aminosav- illetve ammónium-transzporterek alkalmazását írjuk le olyan vegyületek azonosítására, amelyek ezekre a transzporterekre gátlólag hatnak.
Alkalmazási példák
1. példa. Növényi aminosav-transzporter gátlószereinek azonosítása
A növényi aminosav-transzporter gátlószereinek azonosításához transzportvizsgálatokat végzünk a 22574d élesztőmutánson [Jauniaux és Grenson, Env. J. Biochem. 190, 39-44 (1990)], ami egy mutációt hordoz az aminosav-permeáz génjében, illetve a JT 16 élesztőmutánson [Tanaka és Fink, Gene 38.,205-214 (1985)] , amely nem képes a hisztidin felvételére.
Ezeket a mutánsokat a növényi aminosav-transzportért kódoló, és az élesztősejtekben működőképes transzportért kifejező cDNS-szekvenciákkal transzformáljuk. A szóban forgó cDNS-szekvenciák az Arabidopsis thaliana AAP1 illetve AAP2 aminosav17 transzportereit kódolják [Frommer és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 , 5944-5948 (1993); Kwart és munkatársai, Plánt J. 4, 993-1002 (1993)].
A mérésekhez a fenti mutánsok sejtjeit 28 °C hőmérsékleten, minimáltáptalajbán (NAAG + 5 mmól/1 prolin) neveljük és a logaritmikus fázisban (ODgQQ=0,6) nyerjük ki. A sejteket 10 percig centrifugáljuk 4000/perc fordulattal, 4 °C hőmérsékleten és kétszer mossuk AUB-puferrel (módosított AAB-puffer, Ljungdahl és munkatársai). A sejtkoncentrációt ODgQQ = 25 értékre állítjuk be.
| A táptalajok és | pufferek a következők: | ||
| NAAG-táptalaj: | 1,7 | g/1 élesztő-nitrogénbázis | aminosavakkal és |
| ammónium-szulfáttal. | |||
| SDGlu-táptalaj : | 10 | g/1 glükóz | |
| 20 | g/1 agaróz | ||
| 6 , 7 | g/1 élesztő-nitrogénbázis | aminosavakkal. | |
| SDsuc-táptalaj: | 20 | g/1 glükóz | |
| 20 | g/1 agaróz | ||
| 6,7 | g/1 élesztő-nitrogénbázis | aminosavakkal | |
| 20 | g/1 szacharóz | ||
| 20 | g/1 agaróz. | ||
| AUB-puffer: | 10 | mmól/1 MES | |
| 2 | mmól/1 magnézium-klorid | ||
| ‘ 0, 6 | mmól/1 szorbit. |
A sejtszuszpenzió 100 μΐ-éhez 100 μΐ 1 mmól/l-es prolinoldatot (18,5 kBq L-[14C]-prolin) és a vizsgált vegyület különböző koncentrációit adjuk. 20, 60, 120 és 180 másodperc eltelté18 vei 50 μΐ-es mintákat veszünk, amiket 4 ml jéghideg AUB-pufferrel felhígítunk és üvegrost szűrőn átszűrünk. Az aspecifikusan kötődött L- [14C] -prolin eltávolítására a sejteket kétszer mossuk 4-4 ml jéghideg vízzel. Az üvegszűrőkön visszamaradó radioaktivitást végül folyadékszcintillátorral mérjük. A radioaktivitás a sejtek által felvett, radioaktivitással jelölt prolin mennyiségét tükrözi.
Kontrolként megmérjük a radioaktivitással jelölt prolin felvételét egy potanciális gátlószer hozzáadása nélkül. Kontrolként szolgálnak továbbá a 22574d és JT 16 mutánsok olyan sejtjei, amelyek nincsenek a növényi aminosav-transzportert kódoló cDNS-szekvenciákkal transzformálva.
A kísérletek eredményeit, amelyeket a 22457d-AAP2, az Arabidopsis thalíana AAP2 aminosav-transzporterét kifejező mutánssal kaptunk, a következő 1. táblázatban mutatjuk be:
1. táblázat
Vizsgált Koncentráció Aktivitás a kontrolhoz képest vegyület (%)
| CCCP | 10 | gmól |
| DNP | 0,1 | mmól |
| DEPC | 1 | mmól |
| Azetidin-2 -karboxilát | 10 | mmól |
| D-prolin | 10 | mmól |
| 15,6 | ±2,1 |
| 7,6 | ± 1,6 |
| 3,1 | ± 1,2 |
| 62 | |
| 90 |
A kísérletekhez aminosav-transzportert élesztőtörzs sejtjeit az AAP2 cDNS-szekvenciával transzformála 22457d kódoló juk és a radioaktivitással jelölt prolin felvételét vizsgáljuk különböző vegyületek jelenlétében. Megadjuk a különböző vizsgált vegyületeket, azok koncentrációit, valamint a transzporterek aktivitását %-ban a potenciális inhibitort nem tartalmazó kontrolhoz képest.
Azokat a vegyületeket, amelyek specifikus gátló hatást mutatnak az AAP2 aminosav-transzporteren, egész növényeken vizsgáljuk herbicid illetve növekedésszabályozó hatásra.
2. példa. A Spinacia oleracea szacharóz-transzportere gátlószereinek azonosítása
A spenót szacharóz-transzporterét gátló hatású vegyületek azonosításához a SUSY7 élesztőtörzs [Riesmeier és munkatársai, EMBO J. 11, 4705-4713 (1992)] sejtjeit használjuk fel. E törzs sejtjeit a spenót S21 (SoSUTl) szacharóz-transzporterét kódoló, és a sejtekben egy működőképes transzportért biztosító cDNSszekvenciával transzformáljuk.
Az élesztősejteket minimáltáptalajbán (SD + 2 térfogat% szacharóz, pH=3,8) neveljük 28 °C hőmérsékleten, és a logaritmikus fázisban (ODgQQ=0,6) nyerjük ki. A sejteket 10 percig centrifugáljuk 4000/perc fordulattal és kétszer mossuk SD-táptalajjal. A sejtek nedves tömege alapján a koncentrációt 50 g/l-re állítjuk be SD-táptalajjal és a szuszpenziót 200 μΐ-es térfogatokra osztjuk. A tulajdonképpeni reakcióhoz a sejteket 5 percig 10 mmól' glükózzal inkubáljuk és az elegy pH-ját MESpufferrel 3,8-ra állítjuk be. A reakciót 200 μΐ 0,2 mmólos, SDtáptalajban készített [14C]-szacharózoldat (3 mCi/mmól, pH = 3,8) hozzáadásával indítjuk meg. 20, 60, 180 és 240 másodperc elteltével 70 μΐ-es mintákat veszünk és 4 ml jéghideg vízbe pipettázva a reakciót megszakítjuk. A sejteket üvegrost szűrőn szűrjük és kétszer mossuk jéghideg vízzel. A szűrőn visszamaradó radioaktivitást végül folyadékszcintillátorral mérjük. A vizsgálandó vegyületeket 30 másodperccel a szacharóz hozzáadása előtt adjuk a reakcióelegyhez.
Kontrolként megmérjük a radioaktivitással jelölt szacharóz felvételét egy potanciális gátlószer hozzáadása nélkül. Kontrolként szolgálnak továbbá a SUSY7 törzs olyan sejtjei, amelyek nincsenek a spenót szacharóz-transzporterét kódoló cDNS-szekvenciával transzformálva.
A transzportmérések eredményeit a következő 2. táblázatban mutatjuk be:
2. táblázat
Vizsgált Koncentráció Aktivitás a kontrolhoz képest vegyület (%)
| CCCP | 10 | μιτιόΐ | 10 |
| PCMBS | 0,1 | mmól | 21 |
| DEPC | 0,5 | mmól | 6 |
| palatinóz | 2 | mmól | 85,0 |
| mannóz | 2 | mmól | 86,5 |
| tagatóz | 2 | mmól | 104,7 |
| melicitóz | 2 | mmól | 97,2 |
| raffinóz | 2 | mmól | 110,3 |
| galaktóz | 2 | mmól | 97,7 |
| cellobióz | 2 | mmól | 99,4 |
| melibióz | 2 | mmól | 92,3 |
2. táblázat (folytatás)
Vizsgált Koncentráció Aktivitás a kontrolhoz képest vegyület (%) altróz a-laktóz β-laktóz a-fenil-glükóz mmól mmól mmól mmól
80, 6
81,8 94,9
1-amino-2,3-dihidroxi-4-(hidroxi-metil)-ciklopentán
1,0 mmól/1
1-adenozil- 2 -(hidroxi-metil)-3-ciklopentén 1,0 mmól/1
Megadjuk a különböző vizsgált vegyületeket, azok koncentrációit, valamint a transzporterek aktivitását %-ban a potenciális inhibitort nem tartalmazó kontrolhoz képest. Azokat a vegyületeket, amelyek specifikus gátló hatást mutatnak az S21 (SoSUTl) szacharóz-transzporteren, egész növényeken vizsgáljuk herbicid illetve növekedésszabályozó hatásra.
A szacharóz-transzporter azonosított gátlószerei közül néhánynak, például a PCMBS-nek, herbicid hatása van növényeken.
3. példa. A Solanum tuberosum szacharóz-transzportere gátlószereinek azonosítása
A burgonya szacharóz-transzporterét gátló hatású vegyületek azonosításához a SUSY7 élesztőtörzs [Riesmeier és munkatársai, EMBO J. 11, 4705-4713 (1992)] sejtjeit használjuk. E törzs sejtjeit a burgonya P62 (StSUTl) szacharóz-transzporterét kódoló [WO 94/00574 nemzetközi szabadalmi leírás; Riesmeier és munkatársai, Plánt Cell 5, 1591-1598 (1993)], és a sejtekben egy működőképes transzportért biztosító cDNS-szekvenciával transzformáljuk. A kapott élesztőtörzs a SUSY-7-P62 (StSUTl).
Az élesztősejteket minimáltáptalajbán (SD + 2 térfogat% szacharóz, pH=3,8) neveljük, 28 °C hőmérsékleten, és a logaritmikus fázisban (ODg0Q=0,6) nyerjük ki. A sejteket 10 percig centrifugáljuk 4000/perc fordulattal és kétszer mossuk SD-táptalaj jal. A sejtek nedves tömege alapján a koncentrációt 50 g/l-re állítjuk be SD-táptalajjal és a szuszpenziót 200 μΐ-es térfogatokra osztjuk. A tulajdonképpeni reakcióhoz a sejteket 5 percig 10 mmól glükózzal inkubáljuk és az elegy pH-ját MESpufferrel 3,8-ra állítjuk be. A reakciót 200 μΐ 0,2 mmólos, SDtáptalajban készített [14C] - szacharózoldat (3 mCi/mmól, pH=3,8) hozzáadásával indítjuk meg. 20, 60, 180 és 240 másodperc elteltével 70 μΐ-es mintákat veszünk és 4 ml jéghideg vízbe pipettázva a reakciót megszakítjuk. A sejteket üvegrost szűrőn szűrjük és kétszer mossuk jéghideg vízzel. A szűrőn visszamaradó radioaktivitást végül folyadékszcintillátorral mérjük. A vizsgálandó vegyületeket 30 másodperccel a szacharóz hozzáadása előtt adjuk a reakcióelegyhez.
Kontrolként megmérjük a radioaktivitással jelölt szacharóz felvételét egy potenciális gátlószer hozzáadása nélkül. Kontrolként szolgálnak továbbá a SUSY7 törzs olyan sejtjei, amelyek nincsenek a, burgonya szacharóztranszporterét kódoló cDNS-szekvenciával transzformálva.
A transzportmérések eredményeit a következő 3. táblázatban mutatjuk be:
* · • · · • ···· • · ···· . táblázat
Vizsgált Koncentráció Aktivitás a kontrolhoz képest vegyület (%)
| CCCP | 10 μσιόΐ | 9 |
| PCMBS | 0,1 mmól | 20 |
| 2,4-DNP | 0,1 mmól | 3 |
| DEPC | 0,5 mmól | 6 |
| N-etil-malein- - imád | 1 mmól | 22 |
| palatinóz | 2 mmól | 102 |
| tagatóz | 2 mmól | 103 |
| raf f inóz | 2 mmól | 110 |
| β-laktóz | 2 mmól | 91 |
| a-fenil-glükóz | 2 mmól | 7 |
Megadjuk a különböző vizsgált vegyületeket, azok koncentrációit, valamint a transzporterek aktivitását %-ban a potenciális inhibitort nem tartalmazó kontrolhoz képest. Azokat a vegyületeket, amelyek specifikus gátló hatást mutatnak a P62 (StSUTl) szacharóz-transzporteren, egész növényeken vizsgáljuk herbicid illetve növekedésszabályozó hatásra.
A szacharóz-transzporter azonosított gátlószerei közül néhánynak, például a PCMBS-nek, herbicid hatása van növényeken.
4. példa. A szacharóz-transzporter szubsztrátspecificitásának vizsgálata
A szubsztrátspecificitás és a Km értékének meghatározását a burgonya szacharóztranszporterét kifejező SUSY7-pP62 (StSUTl) • · · ·
- 24 élesztőtörzsön [Riesmeier és munkatársai, Plánt Cell 5, 15911598 (1993)] végezzük el. A 3. példa szerinti eljárást alkalmazzuk azzal az eltéréssel, hogy a szubsztrát koncentrációját változtatjuk és nem használunk potenciális gátlószert. A [14C] szacharóz felvételének háttéraktivitását olyan SUSY7 élesztőtörzsön vizsgáljuk, amelyben a transzporter nem fejeződik ki. Ez a törzs a mérés időtartama alatt nem vesz fel mérhető menynyiségű [14C]-szacharózt.
Eredmények: Km(szacharóz)=1 mmól, Km(maltóz)=10 mmól.
5. példa. A szacharóztranszport aktivitása
A Solanum tuberosum P62 (S + SUT1) szacharóz-transzporterének szacharóz-szállító aktivitása az élesztősejtek glükózzal, sztachiózzal és adeninnel való serkentése útján fokozható. A transzportaktivitás hasonló fokozódása érhető el a pH értékének 3,8-ra való csökkentésével a méréskor.
Az aktiválás meghatározásához a transzport mérését a 3. példa szerint végezzük azzal az eltéréssel, hogy a sejteket nem 5 percig inkubáljuk 10 mmól glükózban, hanem 5 percig különböző koncentrációjú glükóz-, sztachióz- illetve adenin-oldatokban. Kontrolként olyan élesztősejtek szolgálnak, amelyeket nem inkubálunk ilyen oldatokkal. A következő 4. táblázatban megadjuk a szacharóztranszport aktiválódását a glükóz, sztachióz illetve adenin különböző koncentrációinak hatására.
• · ·
- 25 4 . táblázat
Aktivitás a kontrol %-ában 0,2 mmól/1 2 mmól/1
| glükóz | 89 | + | 5 | 90 | + | 3 |
| sztachióz | 144 | + | 9 | 101 | + | 8 |
| adenin | 141 | + | 5 | 225 | + | 6 |
A sztachióz alacsonyabb koncentrációkban serkenti a szacharóz transzportját, magasabb (>0,4 mmól/1) koncentrációknál ez a hatás megfordul és a sztachióz csökkenteni kezdi a felvételt. Az adenin esetében lineáris összefüggés van az adenin koncentrációja és a szacharóztranszport fokozódása között. Kompetíciós vizsgálatokkal ki lehet mutatni, hogy mely területek a fontosak a transzporter szacharóz-affinitásában.
6. példa. Növényi ammónium-transzporter crát lőszereinek azonosítása
A növényi ammónium-transzporter gátlószereinek azonosításához a transzportméréseket a szerkezetileg analóg metil-aminnal végezzük, mivel radioaktivitással jelölt ammóniumvegyület nem kapható a kereskedelemben.
A kísérletekhez a Σ 26972c [Dubois és Grenson, Mól. Gén. Génét. 175, 67-76 (1979)] élesztőtörzset használjuk, amely mutációkat hordoz az MEP1 és MEP2 ammónium-permeáz-génjeiben.
Az élesztősejteket egy növényi ammónium-transzportért kódoló és az élesztősejtekben egy működőképes transzporter kifejeződését biztosító cDNS-szekvenciával, szokásos módszerekkel transzformáljuk. Erre a célra az Arabidopsis thaliana AMT1 transzporterét [Niemann és munkatársai, EMBO J. 13 , 3464-3471 (1994)] használjuk. A sejteket NAAG-táptalajban [2 % glükóz, 1,7 g/1 nitrogén-bázis aminosavakkal és ammónium-szulfáttal (Difco), 500 gg/ml L-prolinnal kiegészítve], 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük és a logaritmikus fázisban (ODgoo=0'^) nyerjük ki. Végül a sejteket 10 percig centrifugáljuk 4000/perc fordulattal, 4°C hőmérsékleten, kétszer mossuk 20 mmólos nátriumfoszfát pufferrel (pH=7), és ezután a koncentrációt ODgQQ=8-ra állítjuk be. A sejtszuszpenziót 200 μΐ-es térfogatokra osztjuk szét. A tulajdonképpeni mérés előtt 5 perccel az élesztőt 100 mmól glükóz hozzáadásával aktiváljuk és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció megindításához 100 μΐ sejtszuszpenziót adunk 100 μΐ reakcióelegyhez (20 mmól nátrium-foszfát puffer, pH=7; 18,5 kBq [14:C] -metil-amin (NEN) ; 100 μπιόΐ metil-amin; a vizsgálandó vegyület a táblázat szerint). A reakció megindítása után 10, 60, 120 és 180 másodperccel 50 μΐ-es mintákat veszünk, 4 ml jéghideg, 5 mmólos metil-amin-oldatba tesszük és üvegrost szűrőn át szűrjük. A szűrőket 8 ml metil-amin-oldattal mossuk, majd a szűrőn maradt radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mérjük. A gátlószereket 60 másodperccel a glükóz előtt adjuk az elegyhez.
Kontrolként radioaktivitással jelölt metil-amin felvételét mérjük meg egy potenciális inhibitor hozzáadása nélkül. Kontrolként szolgálnak továbbá a Σ 26972c élesztőtörzs olyan sejtjei, amelyek nincsenek transzformálva.
Az eredményeket a következő 5. táblázat mutatja be:
• · · · · . táblázat
Vizsgált Koncentráció Aktivitás a kontrolhoz képest vegyület (%) nincs 100 metil-amin 500 μπιόΐ 40 dimetil-amin 500 μιτιόΐ 89 trimetil-amin 500 μσιόΐ 89 etil-amin 500 μιηόΐ 93 kálium-klorid 500 μπιόΐ 98 rubídium-klorid 500 μτηόΐ 96 cézium-klorid 500 μσιόΐ 98 ammónium-klorid 500 μπιόΐ 10 cikloheximid 10 μg/ml 85 antimycin-A 10 μg/ml 8 DCCD 200 μπιόΐ 15 2,4-DNP 100 μπιόΐ 18 CCCP 10 μπόΙ 40
Megadjuk a különböző vizsgált vegyületeket, azok koncentrációit, valamint a transzporter aktivitását %-ban a potenciális inhibitort nem tartalmazó kontrolhoz képest.
Azokat a vegyületeket, amelyek specifikus gátló hatást mutatnak az AMT1 ammónium-transzporteren, egész növényeken vizsgáljuk herbicid illetve növekedésszabályozó hatásra.
A vizsgált ammónium-transzporter azonosított gátlószerei közül néhánynak, például a metil-aminnak herbicid hatása van növényeken.
7. példa. Az Arabidopsis thaliana AMT1 ammónium-transzportere szubsztrátspecif icifásának mecrha táró zása A szubsztrátspecificitás és a Km értékének meghatározását az AMT1 növényi ammónium-transzportért kifejező Σ 26972c élesztőtörzsön [Dubois és Grenson, Mól. Gén. Génét. 175, 67-76 (1979)] végezzük el. A 6. példa szerinti eljárást alkalmazzuk azzal az eltéréssel, hogy a metil-amin-szubsztrát koncentrációját változtatjuk és nem használunk potenciális gátlószert. A [14C]-metil-amin felvételének háttér-aktivitását olyan élesztőtörzsön vizsgáljuk, amelyben a transzporter nem fejeződik ki. A transzportrendszernek az ammónium iránti affinitását a metilamin transzportjának különböző ammóniumkoncentrációk általi gátlásából számítjuk ki (inhibitor-konstans Kj_) .
Eredmények: Km (metil-amin) =65 μπιόΐ, Kj_ (ammónium) <10 μιηόΐ.
Claims (2)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás olyan anyagok azonosítására, amelyek potenciális herbicid vagy növekedésszabályozó hatással bírnak, amely egy növényi transzportfolyamat gátlásán vagy inaktiválásán alapszik, azzal jellemezve, hogy egy kémiai vegyüietet egy növényi transzportfehérjén a transzportfolyamat gátlására megvizsgálunk, és az így aktív vegyület herbicid vagy növekedésszabályozó hatását egész növényen kipróbáljuk.
- 2. Eljárás olyan anyagok azonosítására, amelyek potenciális herbicid vagy növekedésszabályozó hatással rendelkeznek, amely egy növényi transzportfolyamat gátlásán vagy inaktiválásán alapszik, azzal jellemezve, hogya) mindenek előtt a transzportfehérjét állítjuk elő egy, az adott transzportfehérjét kódoló DNS-szekvencia heterológ expressziójával egy transzgén organizmusban vagy transzgén sejtekben, majdb) ezt a rekombináns szervezetet egészként, vagy a transzgén sejteket egy kémiai vegyületnek az említett transzportfehérjével szembeni gátló hatásának vizsgálatára használjuk, ésc) a vegyület aktivitását olyan szervezet vagy sejtek ellen .is megvizsgáljuk, amely vagy amelyek nem termelik az említett transzportfehérjét, hogy kizárjuk azt a lehetőséget, hogy a vegyület más hatásmechanizmussal gátolja a szervezeteket vagy sejteket, végüld) a transzportfehérjével szemben aktív vegyüietet herbicid vagy növekedésszabályozó hatásra vizsgáljuk növényeken.• · · · • · · · · • ·······♦ • · » ····· · · · · ·
3 . Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a transzporter egy szacharóz-transzporter. 4 . Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve hogy a transzporter egy aminosav-transzporter. 5 . Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve hogy a transzporter egy ammónium-transzporter. 6 . Az 1. - 5. igénypontok szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a transzgén szervezet egy egysejtű szervezet. 7 . Az 1. - 6. igénypontok szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az egysejtű szervezet baktérium, gomba vagy élesztő. 8 . Az 1. - 6. igénypontok szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a sejteknél növényi sejtekről van szó. 9 . Az 1.-6. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a sejteknél állati sejtekről van szó. 10 . Az 1.-6. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a sejteknél oocitákról van szó. 11 . Az 1.-6. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy a sejteknél Xenopus-oocitákról van szó. 12 . Az 1. - 11. igénypont szerinti eljárással azonosítható, herbicid és/vagy növekedésszabályozó hatású anyagok, kivéve a következő vegyületeket: karbonil-cianid-3-(klór-fenil)-hidrazon (CCCP), 2,4-dinitro-fenol (2,4-DNP), dietil-pirokarbonát (DEPC) 4-klór-merkuri-benzi1-szülfonsav (PCMBS), dicikloalkil-karbodiimád (DCCD), antimycin A, ammónium-klorid, a-fenil-glükóz, Netil-maleinimid és az (I) és (II) képletű vegyületek.13. Az 1. - 11. igénypont szerinti eljárással azonosítható, herbicid és/vagy növekedésszabályozó hatású anyagok, amelyek a transzportfehérjék által átjutnak a sejtmembránon, kivéve a következő vegyületeket: karbonil-cianid-3-(klór-fenil)-hidrazon (CCCP), 2,4-dinitro-fenol (2,4-DNP), dietil-pirokarbonát (DEPC) 4-klór-merkuri-benzil-szulfonsav (PCMBS), dicikloalkil-karbodiimid (DCCD), antimycin A, ammónium-klorid, α-fenil-glükóz, Netil-maleinimid és az (I) és (II) képletű vegyületek.14. A 12. igénypont szerinti, herbicid és növekedésszabályozó hatóanyagok alkalmazása növényvédő szerként más herbicidekkel, inszekticidekkel, fungicidekkel, akaricidekkel, némáticidekkel és a mezőgazdaságban szokásos segédanyagokkal együtt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4343527A DE4343527A1 (de) | 1993-12-16 | 1993-12-16 | Verfahren zur Identifizierung von Stoffen mit potentieller herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung mittels pflanzlicher Transporterproteine, Verwendung der Transporterproteine sowie Substanzen mit herbizider und wachstumsregulatorischer Wirkung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9601653D0 HU9601653D0 (en) | 1996-08-28 |
| HUT75077A true HUT75077A (en) | 1997-04-28 |
Family
ID=6505562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9601653A HUT75077A (en) | 1993-12-16 | 1994-12-15 | Method of identifying substances with a potential herbicidal or growth-regulatory action by means of vegetable transporter proteins, use of such transporter proteins for this purpose, and substances with a herbicidal or growth-regulatory action identified |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5750362A (hu) |
| EP (1) | EP0734525B1 (hu) |
| JP (1) | JP3693672B2 (hu) |
| KR (1) | KR960706639A (hu) |
| AT (1) | ATE194033T1 (hu) |
| AU (1) | AU701626B2 (hu) |
| CA (1) | CA2179062A1 (hu) |
| DE (2) | DE4343527A1 (hu) |
| DK (1) | DK0734525T3 (hu) |
| ES (1) | ES2148480T3 (hu) |
| GR (1) | GR3033942T3 (hu) |
| HU (1) | HUT75077A (hu) |
| PT (1) | PT734525E (hu) |
| UA (1) | UA41386C2 (hu) |
| WO (1) | WO1995016913A1 (hu) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4439748A1 (de) * | 1994-10-31 | 1996-05-02 | Inst Genbiologische Forschung | Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen |
| DE19805334A1 (de) * | 1998-02-11 | 1999-08-12 | Otogene Biotechnologische Fors | Verfahren zur Entwicklung eines pharmazeutischen Wirkstoffes |
| AU3474899A (en) | 1998-04-09 | 1999-11-01 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Sucrose transporters from plants |
| AU6082399A (en) * | 1998-09-15 | 2000-04-03 | Syngenta Participations Ag | Uracil permease from arabidopsis as herbicidal target gene |
| US6583337B1 (en) * | 1998-11-10 | 2003-06-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Plant glucose-6-phosphate translocator |
| AU3286500A (en) * | 1999-03-05 | 2000-09-28 | Syngenta Participations Ag | Herbicide target genes and methods |
| US6300091B1 (en) | 1999-03-05 | 2001-10-09 | Syngenta Participations Ag | Herbicide target genes and methods |
| AU7703400A (en) * | 1999-09-14 | 2001-04-17 | Xenoport, Inc. | Substrates and screening methods for transport proteins |
| EP1307479A2 (en) * | 2000-06-28 | 2003-05-07 | Syngenta Participations AG | Herbicide target genes and methods |
| DE10036671A1 (de) * | 2000-07-27 | 2002-02-21 | Frommer Wolf Bernd | Nucleinsäuren, mit deren Hilfe Pflanzen mit verändertem Metabolit-Gehalt erzeugt werden können |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5225323A (en) * | 1988-11-21 | 1993-07-06 | Baylor College Of Medicine | Human high-affinity neurotransmitter uptake system |
| DE4220759A1 (de) * | 1992-06-24 | 1994-01-05 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen für Oligosaccharid-Transporter, Plasmide, Bakterien und Pflanzen enthaltend einen Transporter sowie Verfahren zur Herstellung und Transformation von Hefestämmen zur Identifikation des Transporteers |
| DE4222315A1 (de) * | 1992-07-05 | 1994-01-13 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter |
| DE4337597C2 (de) * | 1993-10-28 | 2002-07-18 | Aventis Cropscience Gmbh | DNA-Sequenzen für Ammoniumtransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen, Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltend den Transporter |
-
1993
- 1993-12-16 DE DE4343527A patent/DE4343527A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-12-15 JP JP51653895A patent/JP3693672B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-15 DE DE59409407T patent/DE59409407D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-15 WO PCT/EP1994/004174 patent/WO1995016913A1/de active IP Right Grant
- 1994-12-15 KR KR1019960703182A patent/KR960706639A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-12-15 EP EP95904481A patent/EP0734525B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-15 HU HU9601653A patent/HUT75077A/hu unknown
- 1994-12-15 AT AT95904481T patent/ATE194033T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-12-15 UA UA96072819A patent/UA41386C2/uk unknown
- 1994-12-15 US US08/663,222 patent/US5750362A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-15 AU AU13148/95A patent/AU701626B2/en not_active Ceased
- 1994-12-15 CA CA002179062A patent/CA2179062A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-15 PT PT95904481T patent/PT734525E/pt unknown
- 1994-12-15 ES ES95904481T patent/ES2148480T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-15 DK DK95904481T patent/DK0734525T3/da active
-
2000
- 2000-07-12 GR GR20000401627T patent/GR3033942T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU701626B2 (en) | 1999-02-04 |
| WO1995016913A1 (de) | 1995-06-22 |
| JPH09506512A (ja) | 1997-06-30 |
| DK0734525T3 (da) | 2000-08-28 |
| EP0734525A1 (de) | 1996-10-02 |
| KR960706639A (ko) | 1996-12-09 |
| AU1314895A (en) | 1995-07-03 |
| CA2179062A1 (en) | 1995-06-22 |
| DE59409407D1 (de) | 2000-07-27 |
| DE4343527A1 (de) | 1995-06-22 |
| ES2148480T3 (es) | 2000-10-16 |
| US5750362A (en) | 1998-05-12 |
| HU9601653D0 (en) | 1996-08-28 |
| ATE194033T1 (de) | 2000-07-15 |
| EP0734525B1 (de) | 2000-06-21 |
| PT734525E (pt) | 2000-11-30 |
| GR3033942T3 (en) | 2000-11-30 |
| UA41386C2 (uk) | 2001-09-17 |
| JP3693672B2 (ja) | 2005-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Samborski et al. | Metabolic changes in detached wheat leaves floated on benzimidazole and the effect of these changes on rust reaction | |
| Monachello et al. | Two anion transporters AtClCa and AtClCe fulfil interconnecting but not redundant roles in nitrate assimilation pathways | |
| Kundu et al. | Piriformospora indica recruits host-derived putrescine for growth promotion in plants | |
| Yates et al. | Bacterial bioluminescence as a bioassay for mycotoxins | |
| HUT75077A (en) | Method of identifying substances with a potential herbicidal or growth-regulatory action by means of vegetable transporter proteins, use of such transporter proteins for this purpose, and substances with a herbicidal or growth-regulatory action identified | |
| Tegg et al. | Enhanced resistance to the cellulose biosynthetic inhibitors, thaxtomin A and isoxaben in Arabidopsis thaliana mutants, also provides specific co-resistance to the auxin transport inhibitor, 1-NPA | |
| MacWilliams et al. | AcDCXR is a cowpea aphid effector with putative roles in altering host immunity and physiology | |
| Devine et al. | Uptake and accumulation of the herbicides chlorsulfuron and clopyralid in excised pea root tissue | |
| Mayer et al. | An elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea influences the membrane potential of soybean cotyledonary cells | |
| EP0923648A1 (en) | Gene conferring disease resistance in plants and uses thereof | |
| Negi et al. | Effect of trifluralin and nitralin on mitochondrial activities | |
| Lokeshwari et al. | Effect of Aphis odinae (Hemiptera: Aphididae) infestation on sugars and amino acid content in mango | |
| Sacchi et al. | Efflux and active re-absorption of glucose in roots of cotton plants grown under saline conditions | |
| Tripuranthakam et al. | Development of a mitochondrial respiratory electron transport bioindicator for assessment of aromatic hydrocarbon toxicity | |
| Godinho et al. | Physiological genomics of multistress resistance in the yeast cell model and factory: Focus on MDR/MXR transporters | |
| Zahoor et al. | Satranidazole: mechanism of action on DNA and structure-activity correlations | |
| Moussatos et al. | AAL toxin-induced physiological changes in Lycopersicon esculentum Mill: differential sucrose transport in tomato lines isogenic for the Asc locus | |
| Tegg et al. | Mechanisms of thaxtomin A-induced root toxicity revealed by a thaxtomin A sensitive Arabidopsis mutant (ucu2-2/gi-2) | |
| Kundu et al. | Piriformospora indica employs host’s putrescine for growth promotion in plants | |
| Koteyeva et al. | Structural diversity in salt excreting glands and salinity tolerance in Oryza coarctata, Sporobolus anglicus and Urochondra setulosa | |
| Mohamed et al. | Striga asiatica seed conditioning and 1‐aminocyclopropane‐1‐carboxylate oxidase activity | |
| Tarasenko et al. | Plant mitochondrial subfractions have different ability to import DNA | |
| GUO et al. | Inhibition of Na+, K+-ATPase in housefly (Musca domestica L.) by terpinen-4-ol and its ester derivatives | |
| Blanke et al. | Respiration and plasma membrane ATPase in strawberry stolons | |
| Wu | Tissue specificity of cytosolicK^+retention,Na^+extrusion, and vacuolarNa^+sequestration traits in the context of differential salinity stress tolerance in barley and wheat |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |