HUT71783A - Crucifer acc-synthase, gene coding it, the promoter of the gene, and recombinant methods for production of acc-synthase and transgenic plants expressing acc-synthase - Google Patents
Crucifer acc-synthase, gene coding it, the promoter of the gene, and recombinant methods for production of acc-synthase and transgenic plants expressing acc-synthase Download PDFInfo
- Publication number
- HUT71783A HUT71783A HU9501087A HU9501087A HUT71783A HU T71783 A HUT71783 A HU T71783A HU 9501087 A HU9501087 A HU 9501087A HU 9501087 A HU9501087 A HU 9501087A HU T71783 A HUT71783 A HU T71783A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- cell
- plant
- acc synthase
- gene
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8249—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving ethylene biosynthesis, senescence or fruit development, e.g. modified tomato ripening, cut flower shelf-life
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
A találmány tárgyát rekombináns növényi nukleinsavak és polipeptidek képezik.
A találmány tárgyát közelebbről egy keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptidet kódoló lényegében tiszta DNS, egy éretlen növényi szövetekben működőképes etilénnel indukálható promóter, a lényegében tiszta ACC-szintáz-polipeptid, valamint rekombináns eljárások képezik, ACC-szintáz és ACC-szintázt termelő transzgenikus növények előállítására.
A találmány tárgyát képezik továbbá az etilénnel indukálható promótert alkalmazó más eljárások is, például rekombináns fehérjék és RNS-molekulák expresszálására, valamint növényekben olyan etilénnel indukálható események szabályozásra, mint például a gyümölcsérés és öregedés, különösen a növényi egyedfejlődés korai stádiumaiban.
A légnemű növényi hormon, az etilén, nagy hatással bír a növények növekedésére és egyedfejlődésére [Yang és mtsai.: Ann. Rév. Plánt Physiol. 35, 155, (1984)]. Az etilén szintézise a növény életének sok különböző szakaszában indukálódik, többek között a csírázáskor, levélhulláskor, a növényi szervek elöregedésekor és gyümölcséréskor. Az etilén szintézis sebessége jelentősen fokozódik különböző stresszbehatásokra, mint például sérülés, extrém hőmérsékletek, szárazság, elárasztás és különböző vegyi behatások. Ezek közül a hatások közül sok mezőgazdasági szempontból igen fontos.
Magasabbrendű növényekben az etilén közvetlen prekurzora a háromtagú gyűrűs aminosav, az 1-amino-ciklopropán-l-karbonsav. Ennek a háromtagú gyűrűs aminosavnak a szintézisét az 1-amino-ciklopropán-l-karboxilát szintáz (S-adenozil-L-metionin metil-tioadenozin-liáz, EC 4.4.1.14) katalizálja, amit általában ACC-szintáznak neveznek. Az etilén termelődés bioszintézisében ez a szintetikus lépés a sebességmeghatározó lépés.
A találmány tárgyát általánosságban keresztes virágúakból (például ArabidopsisbóV) származó ACC-szintáz-polipeptidet kódoló lényegében tiszta
DNS-preparátumok (például genomi DNS, cDNS vagy szintetikus DNS) képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá vektorok, gazdasejtek (például növényi sejtek), valamint transzgenikus növények és magjaik, melyek a fenti lényegében tiszta ACC-szintáz-DNS-t tartalmazzák. A találmány különböző előnyös megvalósítási módjai szerint a gazdasejt valamilyen prokarióta sejt, például E. coli vagy Agrobaktérium, vagy még előnyösebben eukarióta sejt, például valamely transzgenikus növényi sejtből származó transzformáns növényi sejt.
A találmány tárgyát képezik továbbá lényegében tiszta DNSpreparátumok is, melyek tartalmaznak valamely éretlen növényi szövetekben működőképes, etilénnel indukálható promótert.
A találmány előnyös megvalósítási módjai szerinti promoter ACCszintáz-promóter, például keresztes virágúakból származó ACC-szintáz promoter, amilyen például az Arabidopsis ACC-szintáz-promótere. A találmány tárgyát képezik továbbá transzgenikus növények, melyek olyan transzgént tartalmaznak, amely magába foglal egy ilyen etilénnel indukálható promótert, amely éretlen növényi szövetekben működőképes. A találmány tárgyához tartoznak az említett transzgenikus növények magjai és sejtjei is.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan transzgenikus növények, melyek olyan transzgént tartalmaznak, amely magába foglal egy mutáns keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-DNS-szekvenciát. A találmány tárgyához tartoznak az említett transzgenikus növények magjai és sejtjei is.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás rekombináns keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptid előállítására, mely eljárás a következő lépéseket foglalja magába: (a) előállítunk expresszálásra alkalmasan pozícionált, keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptidet kódoló DNS-sel transzformált sejteket, (b) a transzformált sejteket a bevitt DNS expresszálására alkalmas körülmények között tenyésztjük, és (c) izoláljuk a rekombináns keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptidet.
-4A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás növényben lejátszódó etilén-indukálta esemény gátlására, mely eljárás a következő lépéseket foglalja magába: (a) egy transzgenikus növénybe, a transzgenikus növény sejtjeiben történő expresszálásra alkalmasan pozícionált, keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptidet kódoló DNS-t juttatunk, és (b) a transzgenikus növényt a bevitt DNS expresszálására alkalmas körülmények között növesztjük. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a gátlandó esemény többek között lehet a gyümölcsérés, a gyümölcs kifejlődése, az öregedés és/vagy a sejtfejlődés.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás valamely vegyület valamely sejtben történő indukált előállítására, mely eljárás a következő lépéseket foglalja magába: olyan sejtet állítunk elő, amely a vegyületet funkcionálisan éretlen növényi szövetekben működőképes, etilénnel indukálható promóterhez kapcsolva kódoló DNS-t tartalmaz; és a sejthez a vegyület termelődésének indukálása céljából etilént adunk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a fenti eljárás a vegyület izolálását is magába foglalja.
A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint a vegyület valamely rekombináns fehérje, a sejt által normálisan termelt fehérje vagy valamely RNS-molekula; a sejt növényi sejt; a sejt olyan transzgenikus növényből származik, amely tartalmaz egy vagy több olyan sejtet, amely transzgénként a találmány szerinti etilénnel indukálható promótert tartalmazza.
A találmány tárgyát képezi végül a lényegében tiszta keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptid is. A polipeptid előnyösen tartalmaz egy 1. ábrán bemutatottal lényegében azonos aminosav-szekvenciát ( szekvenciazonosító szám: 1. és 2.). Legelőnyösebben a polipeptid egy keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptid, például az Arabidopsis ACCszintáz-polipeptid.
···«
-5A “keresztes virágúak” kifejezés alatt valamennyi olyan növényt kell érteni, amelyet általában a keresztes virágúak családjába sorolnak, például a következő könyvek szerint: Gray: “Manual of Botany”, American Book Company, N. Y. (1950); “Hortus Third: A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the U. S. and Canada”, Macmillan, (1976); és Simmons, N. W.: “Evolution of Corp Plants” (1986). A keresztes virágúak családja sok mezőgazdaságilag hasznosított növényt - mint például brokkoli, káposzta, kelbimbó, repcemag, kelkáposzta, kínai kelkáposzta, karfiol, torma és Arabidopsis - magába foglal.
Az “ACC-szintáz” kifejezés alatt olyan ACC-szintáz-polipeptidet kell érteni, amely képes katalizálni az AdoMet (s-adenozil-metionin) ACC-vé (1amino-ciklopropán-1-karbonsav) és MTR-ré (5-metil-tioribóz) történő enzimatikus átalakítását, amint azt Yang és mtsai. leírták (lásd fent).
A “polipeptid” kifejezés alatt valamennyi aminosavláncot értünk, a lánc hosszától és az esetleges poszttranszlációs módosításoktól (például glikozilálás vagy foszforilálás) függetlenül.
A “lényegében azonos” kifejezés alatt azt értjük, hogy egy polipeptid vagy egy nukleinsav egy referencia polipeptid vagy nukleinsav vonatkozásában legalább 80 %, előnyösen 85 %, előnyösebben 90 % és legelőnyösebben 95 % homológiát mutat.
Polipeptidek vonatkozásában a referencia szekvenciák hossza általában legalább 16 aminosav, előnyösen legalább 20 aminosav, előnyösebben legalább 25 aminosav, legelőnyösebben pedig legalább 35 aminosav lesz. Nukleinsavak vonatkozásában a referencia szekvenciák hossza általában legalább 50 nukleotid, előnyösen legalább 60 nukleotid, előnyösebben legalább 75 nukleotid, legelőnyösebben pedig legalább 110 aminosav lesz.
A homológia mértékét tipikusan szekvenciaanalízis-szoftver segítségével állapítjuk meg (például “Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group”, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 »·«· ·· ····
-6University Avenue, Madison, WI 53705). Az ilyen szoftverek a különböző szekvenciák közötti hasonlóságot úgy állapítják meg, hogy a szekvenciák azonossá tételéhez szükséges különböző szubsztitúciók, deléciók és egyéb módosítások alapján meghatározzák a homológia mértékét. Az alábbi pontosvesszővel elválasztott - csoportok tagjai közötti szubsztitúciókat tipikusan konzervatív szubsztitúcióknak nevezzük: glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; aszparaginsav, glutaminsav, aszparagin, glutamin; szerin, treonin; lizin, arginin; és fenilalanin, tirozin.
“Lényegében tiszta polipeptid” alatt olyan ACC-szintáz-polipeptidet értünk, melyet elválasztottunk természetes kísérő komponenseitől. Tipikusan: egy polipeptid preparátumot akkor nevezünk lényegében tisztának, ha legalább 60 tömeg-%-os és mentes azoktól a fehérjéktől és természetes szerves anyagoktól, melyek a természetben vele asszociáltan fordulnak elő. Az ACCszintáz preparátum előnyösen legalább 75, előnyösebben legalább 90, és legelőnyösebben legalább 99 tömeg-%-os ACC-szintáz-polipeptidre nézve. Lényegében tiszta ACC-szintáz-polipeptidet előállíthatunk például természetes forrásából (például növényi sejtből) történő extrakcióval; az polipeptidet kódoló rekombináns nukleinsav expresszálásával; vagy a fehérje kémiai szintézise útján. A preparátum tisztaságát bármely megfelelő módszer alkalmazásával - mint például oszlopkromatográfia, poliakrilamidgélelektroforézis vagy HPLC-analízis - mérhetjük.
Akkor mondjuk, hogy egy fehérje lényegében mentes természetes kísérő komponenseitől, ha el van választva azoktól a szennyeződésektől, melyek természetes állapotában együtt találhatók vele. Ezért a kémiailag szintetizált vagy a természetes előfordulási helyétől különböző sejtben termeltetett fehérje lényegében mentes természetes kísérő komponenseitől. Ennek megfelelően, az eukarióta szervezetekből származó, de E. coliban vagy más prokaríótában termeltetett fehérjéket lényegében tiszta fehérjéknek tekintjük.
···» <·
-7“Lényegében tiszta DNS” alatt olyan DNS-t értünk, amely mentes azoktól a génektől, melyek a DNS-t annak az élőlénynek a természetes genomjában körülveszik, amelyikből a DNS származik. Éppen ezért az említett kifejezés jelent például vektorba, autonóm módon replikálódó plazmidba, vírusba és prokarióta vagy eukarióta genomba épített rekombináns DNS-t, valamint önállóan létező molekulákat (például PCR-amplifikációval vagy restrikciós endonukleázos emésztéssel előállított cDNS- vagy genomi DNSfragmentumok), melyek más szekvenciáktól függetlenek. A fenti kifejezés olyan rekombináns DNS-eket is magába foglal, melyek olyan hibridgének részei, mely gének más polipeptid szekvenciákat is kódolnak.
A “mutáns ACC-szintáz-polipeptid” kifejezés alatt olyan polipeptidet kell érteni, melynek kódoló DNS-szekvenciájában (a vadtípushoz képest) bármilyen változás van. Az ilyen változások bekövetkezhetnek például kémiai ráhatás, mint például röntgen sugárzás vagy más mutagenezis folytán, vagy genetikai manipuláció és pároztatás vagy más genetikai információcsere következtében. A mutáció lehet például báziscsere, deléció, inszerció, inverzió, transzlokáció vagy duplikáció. Az ilyen mutáns ACC-szintáz-polipeptidek inaktívak vagy csökkent ACC-szintáz aktivitásúak, szokásosan alkalmazott ACC-szintáz aktivitásmérési vizsgálati eljárásokkal mérve [például Yu és mtsai.: Arch. Biochem. Biophys. 198, 280 (1979); Lizada és mtsai.: Anal. Biochem. 100, 140 (1979); vagy van dér Straeten és mtsai.: Eur. J. Biochem. 182, 639 (1989)].
Előnyösen az ilyen mutáns ACC-szintáz-polipeptidek (a) a vadtípushoz képest jelentősen (azaz legalább 25 %-kal) csökkent aktivitásinak, vagy (b) a vadtípushoz képest sokkal (azaz legalább 25 %-kal) kevesebb polipeptid keletkezik belőlük (például Westem-blot-analízissel vizsgálva).
“Transzformált sejtek” alatt olyan sejteket értünk, amelybe vagy amelynek ősébe (a jelen leírás vonatkozásában) rekombináns DNS eljárások alkalmazásával ACC-szintáz-polipeptidet kódoló DNS-molekulát építettek.
-8Az “expresszálásra alkalmasan pozícionálva” kifejezés alatt azt kell érteni, hogy a DNS-molekula olyan DNS-szekvencia közvetlen szomszédságában van elhelyezve, amely alkalmas arra, hogy a DNS-molekula transzkripcióját és transzlációját vezérelje (azaz például képes elősegíteni egy ACC-szintáz-polipeptid, egy rekombináns fehérje vagy egy RNS-molekula termelődését).
“Riportergén” alatt olyan gént értünk, melynek expressziós mértéke mérhető; ilyen gének lehetnek - igényünk korlátozása nélkül - β-glükuronidáz (GUS), luciferáz, kloramfenikol transzacetiláz (CAT) és β-galaktozidáz.
A “promóter” kifejezés alatt azt a minimális hosszúságú szekvenciarészletet értjük, ami a transzkripció vezérléséhez még éppen elégséges. A találmány tárgyát képezik azok a promóterelemek is, melyek elégségesek ahhoz, hogy éretlen növényi szövetekben a promóter-fuggő génexpressziót etilénnel indukálhatóvá tegyék. Az ilyen promóterelemek elhelyezkedhetnek a natív gén 5’- és 3’-régióiban is.
Az “éretlen növényi szövet” kifejezés jelenthet bármely növényi szövetet, melyet a mag nedvességgel való átitatódása és kicsírázása, valamint a virágok kialakulása közötti időben nyertünk ki.
A “funkcionálisan kapcsolt” kifejezés azt jelenti, hogy egy gén és egy szabályozó szekvencia (szekvenciák) oly módon vannak összekapcsolva, ami lehetővé teszi a génexpressziót, amennyiben a szabályozó szekvenciádhoz a megfelelő molekulák (például transzkripciós aktivátor fehérjék) hozzákapcsolódnak.
A “növényi sejt” kifejezés minden félig-áteresztő membránhoz kötött, önálló szaporodásra képes, plasztidot tartalmazó sejtre vonatkozik. Amennyiben a tovább szaporítás kívánatos, szükséges, hogy a sejtnek sejtfala is legyen. A leírásban használt növényi sejt kifejezés - nem korlátozó értelemben - jelent alga-, cianobaktérium-, szuszpenziós magtenyészetből ···· ·*
-9származó, embrió-, merisztémás régió, kalluszszövet eredetű, levél-, gyökér-, hajtás-, gametofita-, sporofita-, pollen- és mikrospórasejteket.
A “transzgén” kifejezés jelent minden olyan DNS-darabot, melyet mesterségesen juttattak egy sejtbe, és részévé vált a sejtből kifejlődött élő szervezetnek. Az ilyen transzgén lehet részben vagy teljesen heterológ (azaz idegen) a transzgenikus szervezet számára, de lehet a szervezet valamely endogén génjével homológ is.
Minden olyan sejtet “transzgenikusnak” nevezünk, amely tartalmaz egy olyan DNS-darabot, melyet mesterségesen juttattak a sejtbe, és amely részévé válik a sejtből kifejlődő élő szervezetnek. A leírásban használt értelemben a transzgenikus szervezetek általában transzgenikus növények, és a mesterségesen bejuttatott DNS (a transzgén) általában a nukleáris vagy plasztidgenomba van beépülve.
Az “etilénnel indukálható promóter” kifejezés alatt olyan promótert értünk, melynek aktivitása etilénnel vagy egyenértékű vegyülettel, például propilénnel végzett kezelés hatására fokozódik.
A találmány szerinti megoldás további sajátságai és előnyös jellemzői világossá válnak majd az előnyös megvalósítási módok további leírása valamint a szabadalmi igénypontok ismertetése alapján.
A következőkben röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra az A. thaliana ACC-szintáz-gén (AThACCl; szekvenciaazonosító szám: 1) nukleotid szekvenciáját és kikövetkeztetett aminosav-szekvenciáját mutatja, valamint a gén parciális cDNS-szekvenciáját (AThACC2; szekvenciaazonosító szám: 2). (A) Az AThACCl (szekvenciaazonosító szám: 1) DNS és aminosav szekvenciája. Az exonok szekvenciáját nagybetűvel írtuk, a nem-kódoló régiók szekvenciáját pedig kis betűkkel. A G-box központi magját a feltételezett CAAT- és TATA-boxokat, valamint a poliadenilációs szignálokat bekeretezéssel jelöltük. Az egyéb ACCszintáz promóterekhez legnagyobb hasonlóságot mutató - rövid fordított ismét- 10— · ·· · t · · • ···-.· Λ ·!· ’··’ · ··*· lődést tartalmazó - régiót aláhúzással jelöltük, csakúgy mint a hosszú timin- és adenin-ismétlődéseket. A kikövetkeztetett aminosavsorrendet az egybetűs kód alkalmazásával adtuk meg. Az aktív centrumnak megfelelő régiót bekeretezéssel jelöltük. (B) Az AThACC2 (szekvenciaazonosító szám: 2) DNS- és aminosav-szekvenciája.
A 2. ábra a következő növények genomi DNS-ének gélblot-analízisét mutatja: A. thaliana, Oriza sativa (Cv. Taipei), Lycopersicon exculentum (Cv. Orlando), és Nicotiana tabacum. Áz ábra A-részén balról jobbra haladva a következő növények DNS-einek analízis-eredményeit láthatjuk: A. thaliana (C24ökotípus), 1 pg össz-DNS; A. thaliana, 1 pg nukleáris DNS; rizs, 3 pg nukleáris DNS; paradicsom, 5 pg össz-DNS; dohány, 20 pg nukleáris DNS. A DNS-t BglII-vel (B) vagy EcoRI-el (E) emésztettük. A filtert 65 °C-on az AThACClgén egy 2,2 kb-os P-jelzett BamHI-fragmensével hibridizáltuk. A rádióaktív gélt 12 órán keresztül villanással érzékenyített filmmel autoradiografáltuk. Az ábra B-része balról jobbra haladva az Xbal-gyel és EcoRI-gyel emésztett A. thaliana DNS (Lansberg erecta ökotípus) analízisének eredményeit mutatja. A filtert 60 °C-on egy PCR-fragmenssel hibridizáltuk, amely a gén 3540-3905. bázispárjai közötti szakaszát tartalmazta, amely szekvenciarészlet nagyrészt a nem transzlálódó 3'-régióba esik. Az autoradiográfiát öt napon keresztül végeztük, villanással érzékenyített filmmel.
A 3. ábrán az AthACCl-gén reverz transzkripciós PCR-analízisét láthatjuk különböző Arabidopsis szervekből, valamint az érett növényből etilénnel történő kezelés után izolált össz-RNS-en. Az ábra A-részén látható PCRanalízist az AthACCl-génre specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával hajtottuk végre (PCR3 és PCR14). 1. sáv: 500 bázispáros marker, 2 sáv: fiatal levelek, 3. sáv: gyökerek, 4. sáv: virágok, 5. sáv: érett zöld becőtermések,
6. sáv: érett becőtermések, 7. sáv: aszott csíranövények, 8. sáv: érett növények,
9. sáv: azonos a 8. sávval, azzal a különbséggel, hogy az analízist két órás etilénnel történő kezelés után végeztük, 10. sáv: négyórás kezelés után, 11 sáv:
···· · · · ···♦ ·· • · * · · · · » · · · « · nyolcórás kezelés után, 12. sáv: 12 órás etilén kezelés után. Az ábra B-részén látható PCR-analízist ugyanúgy végeztük, mint az ábra A-részén láthatót, azzal a különbséggel, hogy nem-specifikus láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk. (PCR19 és PCR20). A sávok számozása azonos az ábra A-részén látható sávok számozásával.
A 4. ábrán az AthACCl-gén expressziójának reverz transzkripciós analízise látható sérült fiatal Arabidopsis-\QVQ\s\^oo\. izolált össz-RNS-en. Az ábra A-részén a PCR-analízist specifikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával hajtottuk végre (PCR22 és PCR24). 1. sáv: fiatal levelek, 2. sáv: sebesülés után 30 perccel, 3. sáv: sebesülés után 60 perccel, 4. sáv: sebesülés után 90 perccel, 5. sáv: sebesülés után két órával, 6. sáv: sebesülés után 3 órával, 7. sáv: sebesülés után 4 órával, 8. sáv: sebesülés után 8 órával, 9. sáv: az AthACCl-gént hordozó kozmid DNS 5 ng-ján végrehajtott kontrollkísérlet. Az ábra B-részén látható PCR-analízist ugyanúgy hajtottuk végre, mint az ábra Arészén láthatót, azzal a különbséggel, hogy nem-specifikus láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk (PCR19 és PCR20). A sávok számozása megegyezik az ábra A-részén látható sávok számozásával. Az alábbiakban a találmány tárgyát képező Arabidopsis-ÁCC-szintázt kódoló genomi DNS és cDNS klónozását és jellemzését fogjuk leírni. Az alábbi példát a találmány szerinti példa pontosabb ismertetése céljából közöljük, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
Áz Arabidopsis ACC-szintázt kódoló genomi DNS és cDNS izolálása
Egy hagyományos eljárásokkal előállított A. thaliana (Kolumbia ökotípus) kozmidkönyvtárat szintén a hagyományos eljárások alkalmazásával, paradicsom ACC-szintáz-polipeptid szekvenciájából származtatott degenerált oligonukleotidokkal vizsgáltunk át (Van Dér Straeten és mtsai., lásd fent). Az izolált genomi szekvenciákat pUC18-plazmidba szubklónoztuk és a DNSszekvencia-analízist a Sanger-féle eljárással végeztük. A könyvtár átvizsgálásának eredményeként izoláltuk és azonosítottuk az AthACCl-gént, más ACC
- 12szintázokhoz való hasonlatossága alapján. Az l.A ábrán láthatjuk az AthACCl-gén genomi szekvenciáját (5613 bázispár; szekvenciaazonosító szám: 1). A megadott szekvencia tartalmaz 1430 bázispárt az iniciációs kódontól 5’-irányban és 1993 bázispárt a stop kódontól 3’-irányban. A feltételezett CAAT- és TATA-boxokat [Joshi: Nucl. Acids Rés. 15, 6643 (1987)], valamint a potenciális poliadenilációs helyeket [Dean és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 14, 2229 (1986)] a szekvenciában megjelöltük. A gén három intront tartalmaz, az intronok határain konszenzus dinukleotidok találhatók [Csank és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 18, 5133 (1990)]. Az exon-intron kapcsolódási pontok pozíciói azonosak a paradicsom ACC-szintáz-génben találhatókkal [Rottmann és mtsai.: J. Mól. Bioi. 222, 937 (1991)]. Az AthACCl-gén promóterrégióját a CPACClA-gén - amely gén a cukkini megfelelő fehérjéjét kódolja [Huang és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7021 (1991)] promóterével összehasonlítva a legnagyobb hasonlóságot az 525-730. nukleotidok közötti régióban találtuk. Érdekes, hogy ez a régió részben átfed a Lycopersicon esculentum LE-ACC2-promóterének legnagyobb hasonlóságot mutató régiójával [Yip és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 2475 (1992)], ami az AThACCl-jelű gén 661-827 bázispárjai között található. Találtunk az AThACCl-génben egy 13 bázispár hosszúságú szekvenciát (903-915), amely a cukkini negyedik exonjában is megtalálható és 77 %-os hasonlósággal az LEACC2-gén promóterében is messze 5’-irányban. Az AThACCl-promótert más etilénnel indukálható promóterekkel [Van Dér Straeten és mtsai.: Plánt Genetic Engineering, szerk.: Biswas, B. B. és Harris, J. R., Plenum, NY, 279326. old., (1991)] összehasonlítva találtunk az 5'-régióban néhány rövid szekvenciarészletet, amely jelentős hasonlóságot (70-80 %) mutatott a vizsgált promóterekkel. A vinla [Stanford és mtsai.: Mól. Gén. Génét., 215, 200 (1989) ] és wunla [Logeman és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 219, 81 (1989)] elnevezésű sebesülésre indukálódó promóterek 91 %-ban hasonlónak bizonyultak az AthACCl-gén sorrendben 918-929. és 1170-1180. bázispárok közötti régió
- 13ival. Az auxin-reszponzív szabályozóelemekhez nem találtunk jelentős hasonlóságot. Érdemes megjegyezni, hogy a 340. pozícióban találtunk egy myc-szeru kötőhelyet [Blackwell és mtsai.: Science 230, 1149 (1990)], melynek szekvenciája hasonlít néhány fény által szabályozott promóterben található G-box magjának szekvenciájához [Giuliano és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7089 (1988); Schulze-Lefert és mtsai.: EMBO J. 8, 651 (1989)], valamint a búza-EM-gén (29) abszcisszasav-reszponzív szabályozóelemében és az LEACC2-promóterben található G-box-szekvenciákhoz [Rottmann és mtsai., fent]. Ezen felül az AthACCl-gén nem-transzlálódó 5’-régiója és 2. intronja tartalmaz hosszú timin- [Kosambi, Ann. Eugen: 12, 172 (1944); 36 nukleotid] és adenin-ismétlődéseket (15 nukleotid, a startkódon közelében).
Amint az 1. ábrán látható, az AthACCl-gén genomi kiónja egy 496 aminosavat tartalmazó polipeptidet kódol. Ennek a polipeptidnek a számított molekulatömege 54,6 kDa és az izoelektromos pontja 7,3. Az enzim aktív centrumát tartalmazó 12 aminosav hosszúságú régió azonos a paradicsom (TACCI vagy pCW4A; Van Dér Straeten és mtsai., lásd fent) a sütőtök [Nakajima és mtsai.: Plánt Cell Physiol 31, 1021 (1991)], és a cukkini [Sato és mtsai.: J. Bioi. Chem. 266, 3752 (1991)] ACC-szintázának megfelelő régiójával. Ezen felül minden eddig megklónozott ACC-szintáz esetén a szubsztrát megkötésében résztvevő 12 aminosav közül 11 azonos az aminotranszferázokban a kofaktor kötésért felelős régió aminosavaival. Ez az eredmény megerősíti azt a feltételezést, hogy az ACC-szintázok és az aminotranszferázok evolúciósán kapcsoltak [Rottman és mtsai.: mint fent].
Az 1. táblázatban összefoglaljuk a különböző fajokból származó ACCszintázok közötti aminosav és nukleotid szekvencia hasonlóságokat. A táblázat azokat az ACC-szintáz-géneket tartalmazza, melyeket már teljes hosszúságukban megklónoztak.
- 14Referencia
1. táblázat
Enzim
Nukleotid Aminosav azonosság, % azonosság, %
| TACC1 (paradicsom) | 68 | 75 | Van Dér Straeten és mtsai.: Proc. |
| TACC2 (paradicsom) | 66 | 71 | Natl. Acad. Sci., USA, 87, 4589, (1990) Olson és mtsai.:Proc. |
| CMW33 (sütőtök) | 67 | 71 | Natl. Acad. Sci., USA, 88, 5340, (1991) Nakajima és mtsai.: |
| CMA101 (sütőtök) | 68 | 64 | Plánt Cell Physiói., 31,1021, (1990) Nakagawa és mtsai.: |
| CPACCIA (cukkini) | 67 | 72 | Plánt Cell Physiol., 32,1153, (1991) Huang és mtsai.: |
| CARACC3 (szegfű) | 65 | 73 | Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 7021,(1991) Park és mtsai.: Plánt |
Mól. Bioi. 18, 388, (1992)
- 15A C24-ökotípusból virágspecifíkus cDNS-könyvtárat létesítettünk szokásos eljárások alkalmazásával. A könyvtárat az A. thaliana ACC-szintáz cDNS-gén (AthACCl) 2,2 kb-os BamHl-fragmensével vizsgáltuk át (szintén szokásos eljárásokat alkalmazva), amely fragmens tartalmazta az enzim első 140 aminosavát kódoló régiót, valamint a két első intront.
Izoláltuk egy másik Arabidopsis ACC-szintáz-gén részleges cDNS-ét is egy virágspecifikus cDNS-könyvtárból hidridizációs próbaként egy 2,2 kb-os BamHI-fragmenst alkalmazva, és ezt a gént AthACC2-nek neveztük. A gén szekvenciáját az 1. ábra B-részén láthatjuk (szekvenciaazonosító-szám: 2). A szekvencia 159 nukleotidja 79 %-ban azonos az AthACCl-gén megfelelő régiójával. Az ilyen mértékű különbség a szekvenciákban feltehetően nem írható a különböző ökotípusok genomjában általában meglevő különbségek számlájára (Kolumbia, C24-gyel összehasonlítva). Az említett régióban a kikövetkeztetett aminosav szekvenciák közötti azonosság 83 %-os.
Az Tm^ztZop^z^-ACC-szintáz-multigéncsalád, és kapcsolata egyéb növényi ACC-szintáz-génekkel.
A különböző ACC-szintáz-gének jelenlétét az Arabidopsis genomjában a genomi DNS gélblot-analízise útján igazoltuk (2. ábra). Az AthACCl-gén az ACC-szintáz-géncsalád tagja, de nem mutat nagymértékű hasonlóságot a család egyetlen más tagjához sem. Arabidopsis DNS-t (mind nukleáris, mind összDNS-t) hibridizáltattunk az AthACCl-gén 2,2 kb-os BamHl-fragmensével, erősen sztringens körülmények között. A kísérlet eredményeképp azonosítottunk egy 2,7 kb-os hibridizáló BlglI-fragmenst, valamint egy 5,0 és egy 6,5 kbos EcoRI-fragmenst, melyek hibridizációs intenzitása a BglII-fragmensének fele volt (2.A ábra). Ez a kísérleti eredmény egyetlen hibridizálódó gén jelenlétére utal, és az eredmények megfelelnek az AthACCl restrikciós térképe alapján várhatóknak. A kapott eredmények igazolására az Arabidopsis genomi DNS-ét hibridizáltuk az 1,1 kb-os BamHI-fragmenssel (amely a kódoló régió kb. 75 %-át tartalmazta), valamint egy 350 bázispáros PCR-fragmenssel, amely
- 16főleg a nem transzlálódó 3’-régióból számlázó szekvenciákat tartalmazott (2.B ábra). Ez utóbbi hidridizációs kísérletek eredményeként az EcoRI-sávban egyetlen 6,5 kb-os hibridizáló csíkot észleltünk az Xbal-sávban pedig egy 12 kb-os csíkot. Amikor a kísérletet kevésbé sztringens körülmények között megismételtük (53 °C), hibridizációs próbaként a 2,2 és 1,1 kb-os kódoló régióból származó szekvenciákat tartalmazó BamHI-fragmenseket alkalmazva az autoradiagramon megjelent néhány újabb hibridizáló csík is, ami arra utalt, hogy a genomban jelen vannak az ACC-szintáz-géncsalád egy tagjai is. Ezen felül az is megállapítható volt, hogy az AthACCl-gén viszonylag jelentősen különbözik a rizs, a paradicsom és a dohány ACC-szintáz-génjeitől, mivel erősen sztringens körülmények között nem tapasztaltunk kereszthibridizációt (2.A ábra), kevéssé sztringens körülmények között azonban halvány hibridizációs csíkok jelentek meg. A fenti leírás alapján, valamint az 1. ábrán látható nukleinsav szekvencia segítségével könnyen izolálható bármely keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptidet kódoló cDNS közismert hibridizációs és egyéb vizsgálati eljárások alkalmazásával [Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley és Sons (1989)].
Az AthACCl-gén térképezése restrikciós fragmens hosszúság polimorfizmuson (RFLP-n) alapuló eljárással
Az RFLP-térképezést Nam és mtsai. eljárása alapján végeztük [Plánt Cell X, 699 (1989), AthACCl-gént hordozó plazmidot használva hibridizációs próbaként] a kapott szegregációs adatokat a Mapmarker komputer program segítségével analizáltuk [Lander és mtsai.: Genomics 1, 174 (1987)] és a legnagyobb valószínűségű rekombinációs frakciókat minden egyes szomszédos marker-pár esetén centimorgan távolsággá transzformáltuk a Kosambi függvény alapján [Kosambi, mint fent].
Clal restrikciós enzim alkalmazásával egy Kolumbia és egy Landsberg erecta polimorfikus csík mutatott megfelelő szegregációt, és ugyanabba a lókuszba térképeződtek. Ezt az RFLP-t pw4-nek neveztük. A pw4 egy revi
- 17deált RFLP-térképen az 1. kromoszóma csúcsára térképeződik 0,0 centimorgan távolságban a telomer-proximális régióba. Ez az RFLP 34,7 centimorgannal a szintén telomer-proximális RFLP-5972 fölé térképeződik, amely Nam és mtsai. publikált géntérképén 0,0 centimorganhoz térképeződött (lásd fent).
Az AThAACl-gén expresszióiának tanulmányozása reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (RT-PCR-rel)
A. Thaliana (C24-ökotípus) növényeket termesztettünk 22 °C-on, 60 % relatív nedvességtartalom mellett, fehér fluoreszcens fénynél (fotoperiódus: 16 óra világos / 8 óra sötét, fényáram: 75 pmol x m’ x s' ). 3-5 hetes növényekről származó fiatal leveleket szikével megsebesítettünk. Az idősebb leveleket 8-12 hetes növényekről szedtük. Kísérleti mintaként csak fehér színű még nem öregedő szirmokkal bíró virágokat alkalmaztunk. A vizsgált érett becőtermések színe sárgától világosbarnáig változott és érett magokat tartalmaztak. Az érett zöld becőtermések nem mutatták klorofillveszteség jeleit. A 6-8 hetes virágzó A. thaliana növényeket vagy azonnal lefagyasztottuk, vagy etilénindukció céljából leforrasztott tartályba helyeztük és 2-12 órán keresztül folyamatos etilénáramban tartottuk őket (9 liter/óra, 10 ppm). Az auxinos kezelést úgy végeztük, hogy a 7 napos, kevéssé fejlett csíranövényeket 0,5 mmól/1 indol-ecetsavat (IAA) tartalmazó 50 mmól/l-es nátrium-foszfát-pufferben (pH = 7,0) 4 óráig áztattuk.
Szakirodalomból ismert eljárás szerint össz-RNS-t izoláltunk [Rodriquez-Pousada és mtsai.: Technique 2, 292 (1990)]. Az RT-PCR-eljárást Góbiét és mtsai. módszere szerint végeztük [Nucleic Acids Rés. 17, 2144 (1989)] kisebb módosításokat végrehajtva. Röviden összefoglalva: 10 pg összRNS-t (a mennyiségét pontosan meghatároztuk) összekevertünk a 3’oligonukleotiddal 50 μΐ lx-es töménységű pufferben [7,2 mmól/1 Tris-HCl (pH = 8,8), 16,6 mmól/1 ammóniumszulfát, 2 mmól/1 magnéziumklorid, marhaszérum-albumin (nukleázmentes) 1,68 mg/ml koncentrációban, 0,72 % 2merkaptoetanol], majd a reakcióelegyet 85 °C-on öt percig inkubáltuk, amit 5 ···· · ·· ···· ·· ···· · ·· · • · · · · · » · · · ♦ · ·
-18perces 45 °C-os inkubálás követett. A reakcióedényeket ezután jeges vízfürdőbe helyeztük, és 50-50 μΐ reakcióelegyet adtunk beléjük. Reakcióelegy összetétele a következő volt: 5’-oligonukleotid, lx-es töménységű puffer, 2,5 egység polimeráz (Beckman, Somerset, NJ), 16 egység madár-mieloblasztózis-vírus reverz transzkriptáz (Promega, Madison, WI), 20 egység RN-azin (Promega), és 0,2 mmól/1 valamennyi dNTP-ből. A reverz transzkripciót 45 percig tartó 40 °C-os inkubálással végeztük, amit közvetlenül a PCR-reakció követett (30-35 ciklust hajtottunk végre következők szerint: 1,5 perc 94 °C-on, 1,5 perc 50 °Con, és 45 perc 72 °C-on). Reakciókat egy PHC-2-típusú ciklizáló termosztátban végeztük (Techme, Cambridge, UK).
A PCR-termékeket 0,8-1 %-os agarózgélben TAE-pufferben végzett elektroforézissel analizáltuk, majd Hybond-N-membránra biotoltuk őket. A következő három oligonukleotid párt alkalmaztuk PCR-indító oligonukleotidokként:
Első pár:
PCR14 5'-TATAGTCTTTCTAAAGATATGGGACTT-3' (2953-2979. bp) (Szekvenciaazonositó szám:3),
PCR3 5'-GTCGTCGGAAACTTAGTCGA-3' (1297-2316. bp) (Szekvenciaazonositó szám: 4).
Második pár: (szekvenciájuk nagy mértékben konzervált régiókból származik, nem-specifikus):
PCR20 5' -CTCATTCCCTCCCGTACTA-3' (2297-2316. bp) (Szekvenciaazonositó szám: 5),
PCR19 5'-CTCTAAAACCAGGAAGTCCC-3' (2992-2973. bp) (Szekvenciaazonosító szám: 6).
Harmadik pár (az AthACC 1 -re specifikus).
PCR22 5'-TCGACTAAGTTTCCCACGAC-3' (3537-3556. bp) (Szekvenciazonositó szám: 7),
PCR24 5'-GTCGAAATTGAATTATTCCA-3' (3758-3738. bp) (Szekvenciaazonositó szám: 8).
A kísérleti adatokat minden esetben két független kísérletből nyertük.
Mivel a Northem-blot-analízis (RNS-blot) érzékenységre túl kicsi ahhoz, hogy alkalmazásával nagyon kis mennyiségben jelen levő mRNS-eket (mint például az AthACCl mRNS-t) kimutathassuk, az mRNS szintek vizsgálatára RT-PCR-eljárást alkalmaztunk [Deiidow és mtsai.: Gene Anal. Techn. 11, 636 (1989), Buck és mtsai.: BioTechniques 11, 636 (1991)]. Annak érdekében, hogy a különböző kísérletek eredményeit egymással kvantitatív módon összehasonlíthassuk, minden esetben kisszámú PCR-ciklust hajtottunk végre. Bizonyos esetekben a Northem-blot kísérleteket olyan hibridizációs próbával hajtottuk végre, amelyről feltételezhető volt, hogy az adott indukciós körülmények között konstans jeleket ad. Az ACC-szintáz-mRNS-ek vagy kizárólag az AthACCl-mRNS jelenlétének mennyiségi kimutatásához különféle oligonukleotid kombinációkat állítottunk elő, melyek szekvenciáját az AthACCl-gén nem-transzlálódó 3’-régiójából származtattuk. A 3. ábrán különböző össz-RNS mintákon a PCR3 és PCR14 láncindító oligonukleotidok alkalmazásával végrehajtott RT-PCR-reakció DNS-gélblotjának képét láthatjuk. Az alkalmazott láncindító oligonukleotidok nagy valószínűséggel specifikusan amplifikálják az AthACCl-cDNS-t, mivel a PCR3-oligonukleotid szekvenciája a gén kódoló régiójának 3’-végéről származik, amely régióban az ACCszintázok közismerten rendkívül divergensek. Fiatal levelekből és virágokból kiindulva rendkívül magas jelet kaptunk, a gyökerek azonban alig látható jelet adtak, a becőtermésekből és az aszott csíranövényekből pedig semmilyen jelet nem kaptunk (3.A ábra 1-7. sávok). PCR19- és PCR20-jelű konzervált szekvenciájú oligonukleotidok alkalmazásával azonos mintázatot kaptunk (3.B ábra
1-7. sávok).
Amikor érett növényeket folyamatos 10 ppm-es etilénáramba helyeztünk, korai indukciót tapasztaltunk (2 óra, 3.A ábra, 9. sáv), de nyolc óra eltel-20 tével az RNS mennyiség csaknem visszatért az indukálatlan szintre (11. sáv). Fontos megjegyezni, hogy a kontroll növények egyáltalán nem adtak jelet (3.A ábra, 8. sáv). A harmadik láncindító oligonukleotid pár alkalmazásával is azonos hibridizációs mintázatot kaptunk. Amennyiben érett növényeket folyamatos 10 ppm-es etilénáramba helyeztünk, korai indukciót tapasztaltunk. Az első csúcsot 2 óra elteltével kaptuk és egy második erős indukciós jelet kaptunk 12 óra elteltével. 7 napos kevéssé fejlett csíranövények indol ecetsavval történő kezelése nem vezetett az AthACCl-gén jelentős indukciójához.
A 4. ábrán az Arabidopsis thaliana ACC-szintáz mRNS-szintjének változását láthatjuk sérülés hatására. A 4.A ábrán egy DNS-gélblotot láthatunk, amely a 3 láncindító oligonukleotid pár alkalmazásával előállított mintázatokról készült. Ez az oligonukleotid pár az AthACC-mRNS-t amplifikálja specifikus módon. A 30 perc és 8 óra eltelte közötti időben kapott jelek nagyságát a sebesülés jelentős mértékben nem változtatta meg. Amennyiben azonban a nemspecifikus láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk (2. pár) világosan észlelhető indukciót tapasztaltunk. Az indukciós csúcsot a sebesülés után 4 órával kaptuk (4.B ábra).
Következőkben általánosságban leírjuk az A. thaliana ACC-szintázgéncsalád egy tagjának (AthACCl) klónozását, valamint egy másik ACCszintáz-génnek (AthACC2) megfelelő részleges cDNS klónozását. Az ACCszintáz multigéncsalád létezését Arabidopsisban. a genomi DNS gélblotanalízisével igazoltuk, amelyből az is kiderült, hogy az AthACCl-gén a család többi tagjával meglehetősen távoli rokonságban áll. A gén promóter szekvenciájának analízise alapján hasonlóságokat találtunk más promóterekhez. A legfigyelemreméltóbb hasonlóságot egyrészt a paradicsom ACC-szintáz LE-ACC2génjének promóterével [Rottman és mtsai.: mint fent] és a cukkini CP-ACClagénjének promóterével [Huang és mtsai.: mint fent] találtuk, a vizsgált promóter 661-730 bázispárjait tartalmazó régióban. Ezen felül a promótertől messze 5’-irányban (340-345. bp) találtunk egy G-box központi magnak megfe-21 lelő szekvenciaelemet. Mindkét esetben csak feltételezzük, hogy az azonosított szabályozó szekvenciaelemek valóban részt vesznek a génkifejeződés szabályozásában.
A kikövetkeztetett aminosav szekvenciát más ACC-szintáz fehérjék szekvenciájával összehasonlítva kitűnt, hogy a gén rendelkezik a korábban publikált [Dong és mtsai.: Plánt Cell Physiol. 32, 25 (1991)] sajátságokkal, és az egyéb szekvenciákkal való hasonlóság mértéke 71 és 75 % között mozgott (1. táblázat).
Nem ismert annak pontos mechanizmusa, hogy az ACC-szintáz-gének indukciója hogyan eredményezi az etilén bioszintézis megindulását. Fiziológiai adatokból [Yang és mtsai.: mint fent] arra lehet következtetni, hogy legalább három ACC-szintáz-osztály létezhet: egy érés és öregedés függő, egy auxinnal indukálható és egy stresszel indukálható. Mindazáltal egy legújabban közzétett, paradicsom ACC-szintáz-génekkel foglalkozó publikáció [Yip és mtsai.: mint fent] alapján feltételezhető, hogy az egyes ACC-szintáz-gének szerepe nem korlátozható kizárólag egyetlen funkcióra. A jelen leírásban közölt kísérleti adatok alátámasztják, hogy az Arabidopsis fajban az ACC-szintáz-géncsalád komplex regulációs rendszerrel rendelkezik. Az AthACCl-gén elsősorban fiatal levelekben és virágokban expresszálódik, de nem fejeződik ki sem érett növények leveleiben, sem érett zöld vagy teljesen érett becőtermésekben (3. ábra). Az AthACCl-gén expressziója rozetta levelekben szintén szünetel és csak a reproduktív fázisban kapcsolódik be. Érdekes, hogy az AthACCl-mRNS-szint magával etilénnel is befolyásolható. Az érett növények etilénnel végzett kezelése hatására az AthACCl mRNS két óra elteltével halmozódott fel, míg az ACCszintáz-géncsalád kétfázisos aktiválást mutatott, az egyik aktiválási csúcs két óra után, a másik pedig 12 órával a kezelés után jelent meg (3. ábra). Már az AthACCl-gén láthatólag öregedő levelekben van kapcsolódva, ez továbbra is tisztázásra szorul: az AthACCl-gén játszik-e valamilyen szerepet az öregedés vagy a korai öregedési fázis megindulásában. Ezen felül azt találtuk, hogy az • · ·
-22AthACCl-gén nem indukálható sérüléssel, legalábbis fiatal szövetekben nem. Ez a megfigyelés ellentmondásban van az ACC-szintáz-mRNS-ek akkumulációjának általában megfigyelt mintázatával, ahol az akkumulációs csúcs 4 óra után detektálható (4. ábra).
ACC-szintáz-polipeptid expressziói a
A találmány szerinti polipeptideket előállíthatjuk egy megfelelő gazdasejt megfelelő, teljes hosszúságú vagy részleges ACC-szintáz-cDNS-t (például a fent leírt cDNS-t) a tartalmazó expressziós vektorral végrehajtott transzformációja útján.
A molekuláris biológia területén járatos szakember számára kézenfekvő, hogy a fenti rekombináns polipeptidet a nagy számú ismert expressziós rendszer bármelyikének alkalmazásával előállíthatjuk, a találmány szerinti megoldás alkalmazása szempontjából nem lényeges, hogy pontosan melyik gazdasejtet alkalmazzuk. Az ACC-szintáz-polipeptidet termeltethetjük prokarióta gazdasejtben (például E. coli sejtben), eukarióta sejtben (például Saccharomyces cerevisae sejtben) emlős sejtben, (például COS-1- vagy NIH-3T3-sejtben) vagy számos növény sejtjeinek bármelyikében, ezek a növények lehetnek például anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk - algák, fásszárú növények, dísznövények, mérsékelt övi gyümölcsöt termő növények, trópusi gyümölcsöket termő növények, zöldségfélék, hüvelyesek, egyszikűek, kétszikűek és valamennyi kereskedelmileg vagy mezőgazdaságilag jelentős növény. Alkalmas növényi gazdasejtek fontos példáiként megemlítjük a Chlamydomonast, a tűlevelűeket, a petúniát, a paradicsomot, a burgonyát, a dohányt, az Arabidopsis-t, a salátát, a napraforgót, a repcét, a lent, a gyapotot, a cukorrépát, a zellert, a szóját, a lucernát, a Medicago-t, a lótuszt, a Vigna-t, az uborkát, a sárgarépát, a tojásgyümölcsöt, a karfiolt, a tormát, hajnalkát, a nyárfát, a mogyorót, az almát, a spárgát, a rizst, a kukoricát, a kölest, a hagymát, az árpát, a csomós ebirt, a zabot, a rozst és a búzát.
-23• ·
A felsorolt sejtek sokféle forrásból hozzáférhetők, ezek többek között: az American Type Culture Collection (Rockland, MD); a Chlamydomonas Culture Collection (Duke University, Dorham, NC); és valamennyi vetőmag kereskedelemmel foglalkozó vállalat, mint például: W. Atlee Burpee Seed Co. (Warminster, PA); Park Seed Co. (Greenwood, SC); Johnny Séd Co. (Albion, ME); és Northrup King Seeds (Hartsville, SC). Alkalmas gazdasejtek leírását és beszerzési fonásaik megjelölését megtalálhatjuk többek között a következő kézikönyvekben és publikációkban is: Vasil, I. K.: Cell Culture and Somatic Cell genetics of Plants, a Laboratory Procedures and Their Applications I-III. kötetei (Academic Press, New York, 1984); Dixon, R. A.: Plánt Cell Culture - A Practical Approach (IRL Press, Oxford University, 1985); Green és mtsai.: Plánt Tissue and Cell Culture (Academic Press, New York, 1987); valamint Gasser és Fraley: Science 244, 1293 (1989).
Prokariótákban történő expresszié céljából az ACC-szintáz-DNS-t funkcionálisan szabályozó elemekhez kapcsolva vektorba építjük úgy, hogy az alkalmazott szabályozó elemek képesek legyenek az expressziót vezérelni az alkalmazott gazdasejtben. Kívánt esetben a kódoló szekvencia 5'-végénél tartalmazhat valamely ismert szignál-szekvenciát, amely alkalmas arra, hogy az expresszált fehérjének a gazdasejt periplazmájába történő kiválasztását irányítsa, megkönnyítve ezzel a termeltetett fehérje kinyerését és tisztítását. A leggyakrabban alkalmazott prokarióta gazdasejtek az E. coli különböző törzseiből származnak, mindazáltal egyéb mikroorganizmusok is alkalmazhatók. A találmány szerinti megoldás kivitelezésekor olyan plazmidvektorokat alkalmazunk, melyek a gazdasejttel kompatíbilis fajból származó replikációs origóval, szelektálható markergénekkel és szabályozó szekvenciákkal rendelkeznek. Az alkalmazható vektorok példáit megtalálhatjuk Pouwels és mtsai. (lásd fent), valamint Ausubel és mtsai. (lásd fent) közleményeiben. Az általánosan alkalmazott prokarióta szabályozó szekvenciákat (melyeket szabályozó elemeknek is neveznek) a leírásban úgy definiáljuk, hogy a kifejezés magába foglalja a transz·· * ·
- 24 kripció megindulásához szükséges promótert, valamint adott esetben az operátort és a riboszóma-kötőhelyet is. A prokarióta expresszió vezérlésére általánosan használt promóterek többek között a következő gének promóterei: bétalaktamáz (penicillináz), laktóz-operon [lac; Chang és mtsai.: Natúré 198, 1056 (1977)], triptofán-operon [Trp; Goeddel és mtsai.: Nucl. Acids Rés. 8, 4057 (1980)]. Általánosan alkalmazzák még a toc-promóterrendszereket és a lambdafágból származó PL~promótert és az N-gén riboszóma-kötőhelyét [Simatake és mtsai.: Natúré 292, 128 (1981)].
Amennyiben az expresszióra eukarióta gazdasejtet alkalmazunk, a transzformáció vagy transzfekció módja valamint az expressziós vektor megválasztása az alkalmazni kívánt gazdasejtrendszer tulajdonságaitól fog függeni. Alkalmas transzformációs és transzfekciós módszerek leírásait megtalálhatjuk többek között a következő publikációkban: Ausubel és mtsai. (lásd fent); Weissbach és Weissbach: Methods fór Plánt Molecular Biology (Academic Press, 1989); Gelvin és mtsai.: Plánt Molecular Biology Manual (Kluwer Academic Publishers, 1990); Potrykus, I.: Annu. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Biology 42, 205 (1991); valamint BioRad (Hercules, CA): Technical Bulletin #1687 (Biolistic Partiele Delivery Systems). Alkalmas expressziós vektorokra többek között a következő kiadványokban találhatunk példákat: Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Pouwels, P. H. 1985, és lásd fent: 1987); Gasser és Fraley (lásd fent); Clontech Molecular Biology Catalog (Catalog 1992/93 Tools fór the Molecular Biologist, Palo Alto, CA); valamint egyéb idézett hivatkozásokban.
Az egyik előnyös eukarióta expressziós rendszer a pMAMneo expressziós vektorral (Clontech, Palo Alto, CA) transzformált 3T3-egérfíbroblasztgazdasejt. A pMAMneo expressziós vektor a következő lényeges összetevőket tartalmazza: egy dexamethasone-nal indukálható MMTV-LTR-promóterhez kapcsolt RSV-LTR-enhanszer, egy SV40 replikációs origó (amely képes a vektor fennmaradását biztosítani emlős expressziós rendszerekben), egy szelek···· ··
-25tálható neomycin-rezisztenciagén, valamint SV40-eredetű splicing- és poliadenilációs helyek. Az ACC-szintáz-polipeptidet kódoló DNS-szakaszt a pMAMneo-vektorba olyan irányban kell beépíteni, ami az expressziót lehetővé teszi. Az expressziós rendszerből ezután a rekombináns ACC-szintáz fehérjét a későbbiekben elmondottak szerint kell izolálni. A pMAMneo expressziós vektorral együtt alkalmazható egyéb el gazdasejtek például a COS- és a CHOsejtek (ATCC deponálási számok sorrendben: CRL 1650 és CCL 61).
A fentiektől eltérően, ACC-szintáz-polipeptidet termeltethetünk stabilan transzfektált emlőssejtvonalakkal is. Számos, emlőssejtek stabil transzfektálására alkalmas sejtvonal hozzáférhető bárki számára, lásd például Pouwels és mtsai. közleményét (mint fent). Az ilyen transzfektált sejtvonalak előállítására szolgáló eljárások is közismertek, lásd például : Ausubel és mtsai. (mint fent). A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az ACCszintáz-polipeptidet kódoló cDNS-t egy dihidrofolát reduktáz (DHFR-) gént tartalmazó expressziós vektorba klónozzuk. A plazmid és vele együtt az ACCszintázt kódoló gén gazdasejt-kromoszómába történő integrálódására a gazdasejtek táptalajához adott 0,01-300 pmol/l metotrexáttal szelektálunk (lásd Ausubel és mtsai. fenti közleményét). Ezt a domináns szelekciót a legtöbb sejttípusban végre lehet hajtani. A rekombináns fehérje expressziójának mértékét fokozni lehet a transzfektált gén DHFR-közvetítette amplifikációjával. Génamplifikációkat hordozó sejtvonalak szelektálására alkalmas eljárásokat találhatunk Ausubel és mtsai. közleményében (mint fent). Az ilyen eljárások általában magukba foglalnak egy fokozatosan növekvő koncentrációjú metotrexátot tartalmazó táptalajokban végrehajtott hosszú tenyésztési lépést. Az említett célra általánosan alkalmazott DHFR-t hordozó expressziós vektorok például a pCVSEII-DHFR és a pAdD26SV(A) (lásd Ausubel és mtsai., mint fent). A fent leírt gazdasejtek mindegyike és előnyösen mindegyik DHFRdeficiens CHO-sejtvonal (például a CHO-DHFR’-sejtek) azok között a gazdasejtek között van, melyek előnyösen alkalmazhatók stabilan transzfektált sejtek «· · • «· «
-26DHFR-rel végzett szelekciójára vagy DHFR-közvetítette génamplifikációs eljárásokhoz.
Az ACC-szintáz-polipeptidet legelőnyösebben stabilan transzfektált növényi sejtvonallal vagy transzgenikus növénnyel termeltetjük. Számos növényi sejtek stabil transzfektálására és transzgenikus növények előállítására alkalmas vektor hozzáférhető bárki számára. Ilyen vektorok leírásait megtalálhatjuk többek között a következő közleményekben: Pouwels és mtsai. (mint fent); Weissbach és Weissbach (mint fent); valamint Gelvin és mtsai. (mint fent). Az ilyen sejtvonalak előállítására alkalmas eljárások példáit megtalálhatjuk többek között a következő közleményekben: Weissbach és Weissbach (mint fent); valamint Gelvin és mtsai. (mint fent). A növényi expressziós vektorok általában tartalmaznak (1) valamely megklónozott növényi gént, amely 5'- és 3'-végi szabályozó szekvenciák vezérlése alatt áll és (2) valamely domináns szelektálható vektort. Az ilyen növényi expressziós vektorok kívánt esetben tartalmazhatnak még promóterszabályozó régiót (például olyan régiót, mely a promótert indukálhatóvá vagy konstitutívvá, környezet által vagy egyedfejlődésileg szabályozhatóvá, vagy pedig sejt- vagy szövetspecifikussá teszi), transzkripciós iniciációs starthelyet, riboszóma-kötőhelyet, és/vagy poliadenilációs szignált.
A találmány szerinti megoldásban előnyösen alkalmazható promóterek egy példája a caulimovíms-promóter, például egy karfiol mozaik vírus (CaMV) promótere. Ezek a promóterek a legtöbb növényi szövetben nagy mértékű expressziót váltanak ki, és aktivitásuk nem függ vírus által kódolt proteinektől. A CaMV-ből izolálható mind 35S- mind pedig 19S-promóter. A legtöbb növényi szövetben a CaMV-35S-promóter erős promóterként működik [lásd például Odell és mtsai.: Natúré 313, 810 (1985)]. A CaMV-promóter igen aktív egyszikűekben is [lásd például Dekeyser és mtsai.: Plánt Cell 2, 591 (1990); Terada és Shimamoto: Mól. Gén, Génét. 220, 389 (1990)]. Ezen felül, ennek a promótemek az aktivitása tovább fokozható (2-10-szeresre) a CaMV-35Spromóter szekvenciájának megduplázásával [lásd például Kay és mtsai.:
·· « ·
-27Science 236, 1299 (1987); Ow és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4870 (1987); valamint Fang és mtsai.: Plánt Cell 1, 141 (1989)].
Alkalmas növényi promóterek további példái - anélkül, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk -: a nopalin szintáz promóter [An és mtsai.: Plánt Physiol. 88, 547 (1988)] és az oktopin szintáz promóter [Fromm és mtsai.: Plánt Cell 1, 977(1989)].
A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban kívánatos lehet, hogy az ACC-szintáz-génterméket megfelelő szövetben, megfelelő mennyiségben vagy megfelelő egyedfejlődési fázisban termeltessük. Különböző, saját szabályozó szekvenciáikban kódolt egyedi sajátságokkal rendelkező promóterek széles választéka áll ebből a célból rendelkezésünkre, melyekről kimutatták, hogy környezetileg, hormonálisán és/vagy egy edfej lődésileg szabályozottak. Ezek közé tartoznak (1) hőmérsékletileg szabályozott promóterek [lásd például Callis és mtsai.: Plánt Physiol. 88, 965, (1988)], (2) fény által szabályozott promóterek [például a borsó rbcS-3A-promóter, Kuhlemeier és mtsai.: Plánt Cell 1, 471 (1989); a kukorica rbcS-promóter, Schaffner és mtsa.: Plánt Cell 3, 997 (1991); valamint a borsóban azonosított klorofill a/b-kötő fehérje génjének promótere, Simpson és mtsai.: EMBO J. 4, 2723 (1985)], (3) hormonálisán szabályozott promóterek [például a búza EM-génjéből származó abszcisszasav-reszponzív szekvenciák, Marcotta és mtsai.: Plánt Cell 1, 969 (1989)], (4) sebesüléssel indukálható promóterek [például a wuz/7-promóter, Siebertz és mtsai.: Plánt Cell
I, 961 (1989)], valamint szervspecifikus promóterek [például a gumóspecifikus tárolófehérje génjének promótere, Roshal és mtsai.: EMBO J. 6, 1155 (1987); a kukorica 23 kDa-os zein-protein-gén promótere, Schemthaner és mtsai.: EMBO
J. 7, 1249 (1988), valamint a zöldbab béta-phaseolin-gén promótere, Bustos és mtsai.: Plánt Cell 1, 839 (1989)].
A növényi expressziós vektorok adott esetben tartalmazhatnak RNSprocessziós szignálokat is, például olyan intronokat, melyekről kimutatták, hogy fontosak a hatékony RNS-szintézis és felhalmozódás szempontjából
-28[Callis és mtsai.: Genes and Dev. J, 1183 (1987)]. Az RNS-splicingszekvenciák elhelyezkedése növényekben rendkívül jelentősen befolyásolhatja a transzgén expressziójának mértékét. Ennek figyelembevételével elhelyezhetünk a transzgénben egy intront az ACC-szintáz-polipeptidet kódoló szekvenciától 5'- vagy 3'-irányban, a génexpresszió mértékének szabályozása céljából.
A már említett 5'-végi szabályozó régiókon felül az expressziós vektorok tartalmazhatnak olyan szabályozó elemeket is, melyek általában a növényi gének 3'-végi régióiban találhatók [Thomburg és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 744 (1987); An és mtsai.: Plánt Cell j,, 115 (1989)]. Tartalmazhatja például az expressziós vektor a 3'-végi terminátor régiót az mRNS stabilitásának fokozása céljából. Egy ilyen alkalmas terminátor régió kialakítható például a paradicsom PI-II-terminátor-régiójából. Ezen felül, egyéb általánosan használt terminátorok is alkalmazhatók, mint például az oktopin és nopalin szintáz megfelelő régióiból származó terminátorok.
A növényi expressziós vektor tipikusan tartalmaz egy domináns szelektálható markergént is, amely alkalmas a transzformált sejtek azonosítására. Növényi rendszerekben alkalmazható markergének lehetnek például antibiotikum rezisztenciáért felelős fehéijék génjei, ilyenek többek között a következő antibiotikumokkal szembeni rezisztenciáért felelős gének: hygromycin, kanamycin, bleomycin, G418, streptomycin és spectinomycin. Fotoszintézis-deficiens törzsekben alkalmazhatunk fotoszintézisben résztvevő fehérjéket kódoló géneket is szelektálható markéiként. Végül, alkalmazhatunk szelektálható markerként herbicidrezisztencia-géneket is. Alkalmas herbicidrezisztencia-gén például a phosphinothricin acetiltranszferáz enzimet kódoló bar-gén, amely rezisztencia kialakulását idézi elő a Basta® márkanevű széles spektrumú herbiciddel szemben (Hoechst AG, Frankfurt, Germany).
A szelektálható markerek alkalmazását megkönnyíti, ha meghatározzuk az alkalmazott növényi sejt érzékenységének mértékét az adott szelektáló ágenssel szemben, valamint azt a koncentrációt amely már a legtöbb - ha nem valameny-29-
nyi - transzformált sejtet is megöli. A dohány transzformálásakor például a következő koncentrációtartományokban alkalmazhatjuk a szelektáló ágenseket: 75-100 pg/ml (kanamycicn), 20-50 pg/ml (hygromycin) vagy 5-10 pg/ml (bleomycin). A herbicidrezisztencián alapuló transzformáns szelekció egy alkalmas stratégiáját megtalálhatjuk Vasil és mtsai. már idézett közleményében.
A molekuláris biológiában, különösen a növények molekuláris biológiájában jártas szakember számára kézenfekvő, hogy a génexpresszió mértéke nem csak az alkalmazott promóterkombinációtól, RNS-processziós szignáloktól és terminátorelemektől függ, hanem attól is, hogy ezeket a szabályozó elemeket miként alkalmazzuk a szelektálható markergén expressziója mértékének fokozására.
A növények transzformációja
A növényi expressziós vektor megalkotását követően számos közismert eljárás rendelkezésünkre áll a rekombináns genetikai anyag gazdanövénybe juttatására, transzgenikus növény előállításának céljából. Alkalmazható transzformációs módszerek többek között: (1) ^groúacterzM/n-közvetítette transzformáció [A. tumefaciens vagy A. rhizogenes; lásd például: Lichtenstein és Fuller: “Genetic Engineering”, 6. kötet, szerk.: P. W. J. Rigby, London, Academic Press (1987); valamint Lichtenstein, C. P. és Draper, J.: “DNA Cloning”, II. kötet, szerk.: D. M. Glover, Oxford, IRL Press (1985)], (2) részecskebejuttatásos módszer [lásd például: Gordon-Kamm és mtsai.: Plánt Cell 2, 603 (1990); vagy BioRad Technical Bulletin 1687, mint fent], (3) mikroinjektálásos eljárások [lásd például: Green és mtsai., mint fent], (4) polietilén glikol (PEG) alkalmazásán alapuló eljárások [lásd például: Draper és mtsai.: Plánt Cell Physiol. 23, 451 (1982); vagy például Zhang és WU, Theor. Appl. Génét. 76, 835 (1988)], (5) liposzóma által közvetített DNS-felvétel [lásd például: Feeman és mtsai.: Plánt Cell Physiol 25, 1353 (1984)], (6) elektroporációs eljárások [lásd például: Gelvin és mtsai.: mint fent; Dekeyser és mtsai.: mint fent; vagy Fromm ···· »1*1 • * · ··«»» ··« • · · · · · -30- ’··* ·:·’··* : ·:·· és mtsai.: 319, 791 (1986)] és (7) a vortexeléses eljárás [lásd például: Kindle, mint fent].
A következő példán keresztül az Agrobacterium-közveútette növényi transzformációt mutatjuk be. A növényi sejtek genomjába bejuttatandó gének manipulálását célzó eljárást két fázisban hajtjuk végre. Az első fázisban minden klónozási és DNS-módosítási lépést E. coli-ban végzünk, majd a plazmidot, amelyik az előállított génkonstrukciót tartalmazza, konjugáció útján Agrobacteriumba juttatjuk. A második fázisban az így kialakított Agrobacterium törzset alkalmazzuk a növényi sejtek transzformálására. Az elmondottak értelmében az alkalmas növényi expressziós vektor általában tartalmaz egy Agrobacteriumban működőképes replikációs origót, valamint egy nagy kópiaszámot biztosító E. coli replikációs origót is. Ez a megoldás lehetővé teszi, hogy a transzgéneket egyszerű eljárásokkal előállítsuk és teszteljük E. coli-ban, még mielőtt azokat növényi sejtek transzformálása céljából Agrobacteriumba juttatnánk. A vektor hordozhat egynél több rezisztenciagént, egyet a baktériumban történő szelektálás céljaira, például egy streptomycin-rezisztenciagént és egy másikat, amelyik majd a növényi sejtekben fog kifejeződni, például egy kanamycin rezisztenciáért felelős enzimet kódoló gént, vagy egy herbicidrezisztenciagént. A vektoron találhatóak ezen felül restrikciós endonukleáz hasítási helyek, amelyek lehetővé teszik, hogy egy vagy több transzgént funkcionálisan kapcsolva a megfelelő szabályozó szekvenciák mellé építsünk, valamint tartalmaz irányított T-DNS-határolószekvenciákat is, amelyek - azáltal, hogy az Agrobacterium transzfer rendszere felismeri őket - meghatározzák a vektor azon régióját, mely a növénybe át fog kerülni.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a növényi sejteket transzformálhatjuk úgy is, hogy olyan volfrámból készült mikrolövedékeket lövünk beléjük, amelyekre előzőleg kicsaptuk a klónozott DNS-t. A belövésre alkalmazott Holisztikus berendezés (Bio-Rad, Herkules, CA) a következőképpen működik: egy puskaporos töltet (22 kaliberes Power Piston Tool Charge) • ·· » 4 ·» *«··*· ··«· · · 4· • 4 4 ♦ ·*
-31- ·..· : .:..
vagy egy sűrített levegővel működő berendezés a műanyagból készült makrolövedéket keresztüllövi a puska csövén. A kicsapott DNS-t tartalmazó volfrám-mikrorészecskék szuszpenziójának egy alikvot-részét elhelyezzük a műanyag makrolövedék elülső részén. Ezután a makrolövedéket egy akrilműanyagból készült megállítótálcán lőjük keresztül, amely tálcán akkora lyuk található, hogy a makrolövedék nem fér át rajta. Ennek az eljárásnak az lesz az eredménye, hogy a műanyagból készült makrolövedék belecsapódik a megállítólemezbe, a volfrám-mikrolövedékek azonban folytatják az útjukat a cél felé a megállítólemezben található lyukon keresztül. A találmány szerinti megoldásban a mikrolövedékek célpontja lehet bármely növényi sejt, szövet, mag vagy embrió. A mikrolövedékek által a sejtekbe juttatott DNS vagy a sejtmagba, vagy a kloroplasztiszba integrálódik.
Elmondhatjuk, hogy ma már különböző transzgének növényi sejtekbe való juttatása és expresszálása szakember számára rutinfeladat. Ez az eljárás a génkifejeződési tanulmányok alapvető eszköztárába tartozik és alkalmazzák javított növényfajták kialakítására is mezőgazdasági vagy kereskedelmi célból. Transz genikus növények regenerációja
A növényi expressziós vektorokkal transzformált növényi sejtekből transzgenikus növényeket regenerálhatunk. Regenerálható növény például egyetlen sejtből, kallusz szövetből vagy levéllemezkékből az általánosan használt növényi szövettenyésztési technikák alkalmazásával. A szakirodalomból ismeretes, hogy csaknem valamennyi növényből származó különböző sejtekből, szövetekből és szervekből szövettenyésztéssel lehetséges teljes növényt regenerálni. Növények regenerálására alkalmas technikák leírását megtalálhatjuk többek között a következő hivatkozásokban: [Vasil, mint fent; Green és mtsai.: mint fent; Weissbach és Weissbach, mint fent; és Gelvin és mtsai.: mint fent],
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a megklónozott ACC-szintáz-polipeptidet kódoló gént a 35S-CaNV-promóter és a nopalin szintáz terminátor szabályozása alatt tartalmazó és szelektálható markergént • ·»· · ·· »4 ··*· • 44 4 · 9 99 « 4 · h ♦* • · * 9 9 ♦· ·· «44 *4 «*··« (például kanamycin rezisztenciagén) is hordozó vektort Agrobacteriumba juttatunk. A levéllemezkék transzformációját (például dohány-levéllemezkék transzformációját) vektorhordozó Agrobacterium törzzsel Horsch és mtsai. közleménye szerint hajtjuk végre [Science 227, 1229 (1985)]. A feltételezett transzformánsokat kanamycint (például 100 μg/μl) tartalmazó növényi szövettenyésztő táptalajon néhány hét (például 3-5 hét) elteltével szelektáljuk. A kanamycin rezisztens hajtásokat ezután olyan növényi szövettenyésztő táptalajra helyezzük át, amely nem tartalmaz gyökérképződést kiváltó hormonokat. Ezután kiválasztjuk kanamycin rezisztens növényeket üvegházi termesztésre. Kívánt esetben a transzgenikus növényekből önmegtermékenyítéssel nyert magokat talajmentes tápközegbe helyezzük és üvegházban neveljük fel őket. A kanamycin rezisztens leszármazottakat ezután úgy szelektáljuk, hogy a felületükön sterilezett magokat hormonmentes, kanamycint tartalamazó táptalajba ültetjük. A transzgén beépülését hagyományos eljárásokkal igazoljuk (lásd például: Ausubel és mtsai.: mint fent; Gelvin és mtsai.: mint fent).
Azokat a transzgenikus növényeket, melyek a szelektálható markergént expresszálják, megvizsgáljuk a transzgén jelenlétére vonatkozóan, általánosan alkalmazott immunbiot és DNS-hibrizidációs eljárásokkal. Minden egyes pozitívnak bizonyult transzgenikus növény valamint annak transzgenikus leszármazottjai egyedinek tekintendők az azonos transzgénnel kialakított egyéb transzgenikus növényekhez viszonyítva. A transzgén integrációja a növény genomi DNS-ébe a legtöbb esetben véletlenszerű és az integráció helye alapvetően befolyásolhatja a transzgén expressziójának mértékét, valamint szövetspecifítását és egyedfejlődési szabályozottságát. Az elmondottak értelmében általában minden egyes transzgén vonatkozásában számos különálló transzgenikus leszármazási vonalat megvizsgálunk, hogy azonosíthassuk és kiválaszthassuk azokat a növényeket, amelyek számunkra a legkedvezőbb expressziós mintázattal rendelkeznek.
-33A transzgenikus leszármazási vonalakat a transzgén expressziójának mértéke alapján értékeljük. Az expressziót először RNS-szinten határozzuk meg, hogy azonosítsuk és mennyiségi sorrendbe állítsuk az expresszió szempontjából pozitív növényeket. Az RNS-analízisekhez általánosan használt eljárásokat alkalmazunk, többek között PCR-amplifikációs vizsgálati eljárásokat is, melyekhez olyan láncindító oligonukleotid molekulákat használunk, melyeket úgy terveztünk, csak a transzgénről átíródott RNS-templátokat amplifikálják, és alkalmazunk oldatban végrehajtott hibridizációs eljárásokat is, melyekhez transzgén-specifikus hibridizációs próbákat használunk (lásd például: Ausubel és mtsai.: mint fent). Az RNS-pozitív növényeket ezután fehérjeexpresszió szempontjából Western-immunbiot eljárással analizáljuk ACC-szintáz specifikus ellenanyagok alkalmazásával (lásd például: Ausubel és mtsai.: mint fent). Ezen felül általánosan használt in situ hibridizációs és immuncitokémiai eljárásokat is alkalmazhatunk a transzgenikus szöveten belül az expresszió pontos helyének lokalizálása céljából. Ezekben az eljárásokban transzgén-specifikus hibridizációs próbákat és ellenanyagokat alkalmazunk.
Amennyiben a rekombináns ACC-szintáz-polipeptid valamely sejtben vagy transzgenikus növényben expresszálódik (például a fent leírtak szerint), a termelődött fehérjét izolálhatjuk például affinitás kromatográfia alkalmazásával. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint kromatográfiás oszlophoz immobilizálhatunk egy anti-ACC-szintáz ellenanyagot, és az így kialakított kromatográfiás oszlop alkalmazásával izolálhatjuk a termelődött polipeptidet. Az ACC-szintázt tartalmazó termelősejtek lízisét és frakcionálását - az affinitás kromatográfiát megelőzően - közismert eljárások alkalmazásával végezhetjük (lásd például: Ausubel és mtsai.: mint fent). Izolálás után kívánt esetben a rekombináns fehérjét tovább tisztíthatjuk, például nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia (HPLC) alkalmazásával [lásd például: “Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry And Molecular Biology”, szerk.: Work és Burdon, Elsevier (1980)].
-34···· « ··«· ·· • ·· 6 · · * · „ * t · · · * • · · V · » * «· ·<· ·· ♦ ····
A fentiekben ismertetett általánosan alkalmazott polipeptid-expressziós és tisztítási eljárásokat alkalmazhatjuk ACC-szintáz fragmensek vagy analógok előállítására is.
A találmány tárgyának egyéb megvalósítási módjai szerint azonban a kívánt eredmény lehet csupán a transzgén kifejeződése a növényi sejtben vagy az előállított transzgenikus növényben. Ilyen megvalósítási módok lehetnek például az ACC-szintáz által szabályozott gyümölcsérés előidézése vagy transzgenikus növény normális egyedfejlődésének megváltoztatása.
ACC-szintáz promóterek
A növényi gének expressziójának mértéke a különféle sejttípusok egyedfejlődési fázisainak, valamint a különböző környezeti faktorok és hormonális jelzések függvényében változik, a találmány szerinti promóterek (beleértve valamennyi génszabályozó szekvenciát) a legelőnyösebben mezőgazdasági vagy kereskedelmi szempontból fontos növényfajták javítására vagy megváltoztatására alkalmazhatók. Amint azt a fentiekben kifejtettük, a keresztes virágúakból származó ACC-szintáz expressziója az egyedfejlődés korai szakaszaiban egyedfejlődésileg szabályozott. Az ACC-szintáz-expresszió etilénnel indukálható, viszont nem reagál auxin vagy sebesülés hatására. Az elmondottak értelmében a találmány szerinti ACC-szintázt kódoló nukleinsav-szekvenciák magukba foglalják azokat a szabályozó szekvenciákat is, melyek elősegítik a gén expresszióját az etilén-fitohormon hatására, az egyedfejlődés különböző meghatározott fázisaiban.
Annak érdekében, hogy meghatározhassuk az éretlen növényi szövetekben történő, etilénnel indukálható expresszióhoz szükséges minimális hosszúságú promoter szekvenciát, az ACC-szintáz szabályozó szekvenciákon funkcionális analízist hajtunk végre. Ezeket a vizsgálati eljárásokat végrehajthatjuk csak átmenetileg transzformált növényi sejteken vagy az általánosan használt módszerek alkalmazásával előállított transzgenikus növényeken is (lásd például: Gelvin és mtsai.: mint fent). A funkcionális analízis végrehajtása során olyan • •99
9· ···« V* * * · ^ · . . i : : .·
- 35 - ” *·* ” * ···· szabályozó szekvenciaelemeket keresünk, melyek más eukarióta gének expressziójával kapcsolatban fontosnak bizonyultak, például 5'-irányban elhelyezkedő aktiváló szekvenciákat vagy enhanszer-elemeket [amelyek szabályozhatják például a szövetspecifikus vagy indukálható expressziót; Wasyllyk B. CRC Rév. 23, 77 (1988)]. A génexpresszió szempontjából fontos egyéb szabályozóelemek többek között az RNS-processziós szignálok, a 3'-terminátorrégiók és maguk a kódoló szekvenciák is.
Az ACC-szintáz promóter specifikus regulációs elemeinek azonosítása céljából a promóter régióból 5'-irányú deléciókat tartalmazó fragmenseket állítunk elő, és ezeket vagy átmeneti transzformáción alapuló vizsgálati eljárásokkal vagy transzgenikus növényekben in vivő vizsgálati eljárásokkal vizsgáljuk. Az 5'-végi deléciós fragmenseket tartalmazó kiméra-transzgének előállítását a szokásosan alkalmazott eljárások szerint végezzük (lásd például: Ausubel és mtsai.: mint fent). Ez után a vad-típusú promótert, valamint a deléciós fragmenseket egy riportergénhez fuzionáltatjuk, például a β-glükoronidázgénhez (GUS); [lásd például: Jefferson, Plánt. Mól. Bioi. Rep. 316 387 (1987)] valamely növényi expressziós vektorban és a vektort önmagában ismert eljárás szerint megfelelő gazdasejtekbe juttatjuk (lásd fent). Ezeket az expressziós vektorokat azután Agrobacteriumba. transzformáljuk és a transzformált Agrobacteriumokkal növényi anyagot transzformálunk, például levéllemezkéket (lásd például: Gelvin és mtsai.: mint fent). A regenerálódott hajtásokat szelektáló ágenst, például kanamycint tartalmazó táptalajban szelektáljuk. A transzgenikus palántákat gyökereztetés után talajba ültetjük és szabályozott körülmények között felneveljük őket.
Az elsődleges transzformánsokat azután etilénnel indukálható GUSaktivitásra vizsgáljuk az egyedfejlődés korai fázisaiban, vagy úgy, hogy a GUSaktivitást kvantitatív módon meghatározzuk, vagy a későbbiekben ismertetendő histokémiai festéssel. Kontrollként nem-transzformált növényeket alkalmazunk. Az etilénnel végzett indukciót úgy hajthatjuk végre, hogy a transzformánsokat a * í · · · · • · · · · · 9 ·· «·· ·· · ··«· lezárt konténerbe helyezzük, ahol folyamatos, kb. 1-50 1/óra vagy 1-100 ppm etilén áramnak tesszük ki őket 1-24 órán keresztül.
A GUS-aktivitás fluorimetriás analízisét növényi sejtekből készített protoplasztokban vagy transzgenikus növényekben közismert eljárások alkalmazásával végezhetjük. Ettől eltérő módon az analízis végezhető tisztítatlan növényi kivonatokban is, például Jefferson (lásd fent) eljárása alapján, olyan kivonatokat alkalmazva, melyek proteintartalom szempontjából azonos töménységűek [lásd például: Bradford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)]. A különböző növényi szövetekben jelenlévő GUS-mennyiséget a 4-metil-umbelliferilglükuronid enzimatikus 4-metil-umbelliferonná való átalakulása alapján mérjük, a mérést fluoriméterben kvantitatívan végezzük (például Perkin-Elmer LS 2B fluoriméterben, Norwalk, CT). A fluoriméteren tipikusan 455 nm kibocsátási és 365 gerjesztési hullámhosszt állítunk be. A GUS-aktivitást általában pikomól / pg fehérje / perc egységekben fejezzük ki (lásd például: Jefferson mint fent).
A fentiektől eltérő módon a GUS-aktivitást mérhetjük in situ hisztokémiai festéssel is, például a következők szerint. Teljes szöveteket és a transzgenikus növényekből származó vékony metszeteket, valamint a nemtranszformált kontroll növények szöveteit megfestjük 5-bróm-4-klór-3-indolilβ-D-glukoronilsawal (X-gluc; Research Organics Inc., Cleveland, OH) történő inkubáció útján a következő közleményekben leírtak szerint: Jefferson és mtsai.: EMBO J 6 3901 (1987); Galagher: “GUS Protocols” (1992). A szövetkészítményeket 37 °C-on 2 mmól/1 X-gluc-ot tartalmazó 0,1 mól/1 nátriumfoszfát-pufferben (pH = 7,0). Inkubáljuk, majd metszeteket készítünk. A transzformált növényekben a GUS-aktivitás könnyen azonosítható azáltal, hogy a riportergént expresszáló sejtekben indigókék csapadék látható. A megfestett metszeteket adott esetben mikroszkóposán vizsgáljuk világoshátteru vagy sötéthátteru optikát alkalmazva.
-37A találmány szerinti megoldás alkalmazása
Amennyiben egy transzformált növényi sejtbe keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-gént juttatunk be, az lehetővé teszi az etilén által szabályozott egyedfejlődési események manipulálását. A találmány szerinti keresztes virágúakból származó ACC-szintázt expresszáló transzgenikus növények például alkalmazhatók az etilén-bioszintézis egyszerű és költségkímélő megváltoztatására, és ezáltal bármely etilénnel indukálható, növényi egyedfejlődés során lejátszódó esemény befolyásolására, például az Öregedés vagy a gyümölcsérés befolyásolására vagy szabályozására.
A találmány tárgyát képezik olyan szabályozó nukleinsav szekvencia elemek is, melyek a növényi egyedfejlődés korai fázisaiban etilénnel indukálhatok. Az ilyen szekvenciák alkalmasak arra, hogy például transzgenikus növényekben különböző rekombináns fehéijék termelődését vagy RNS-molekulák átíródását elősegítsék. Az ily módon előidézett génexpresszió etilénnel indukálható és az egyedfejlődés bizonyos periódusaira korlátozható.
A találmány egyéb megvalósítási módjai
A keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptid valamennyi biológiailag aktív fragmense és analógja szintén a találmány tárgyát képezi. A biológiailag aktív kifejezés alatt azt értjük, hogy az illető fragmens vagy analóg rendelkezik bármely olyan in vivő vagy in vitro aktivitással, amely az 1. ábrán bemutatott ACC-szintáz-polipeptidre jellemző. Mivel az ACC-szintáz számos különböző fiziológiás sajátsággal rendelkezik és mivel az ilyen sajátságok az ACC-szintáz molekula különböző részleteihez kapcsolhatók, a találmány tárgyát képezi minden olyan ACC-szintáz fragmens vagy ACC-szintáz-analóg, amely bármely ACC-szintáz-aktivitást kimutató biológiai vizsgálati eljárásban aktívnak mutatkozik, például a Yang és mtsai. által leírt vizsgálati eljárásokban (lásd fent). Egy biológiailag aktív ACC-szintáz fragmens vagy analóg rendelkezik a vad-típusú ACC-szintáz-polipeptid valamely aktivitásának legalább 10 %-ával, előnyösen 40 %-ával és előnyösebben 90 %-ával.
Az ACC-szintáz-polipeptidek előnyös analógjai (vagy azok biológiailag aktív fragmensei) többek között azok, melyek szekvenciája a vad-típusú szekvenciától csak konzervatív aminosav-szubtitúciókban tér el, azaz olyan szubtitúciókban, ahol valamely aminosavat egy más hasonló sajátságú aminosavra cserélünk (például valint glicinre, arginint lizinre stb.), valamint azok, melyekben egy vagy több olyan nem-konzervatív aminosav szubsztitúció, deléció vagy inszerció található, amely nem szünteti meg a polipeptid biológiai aktivitását.
Az ACC-szintáz-analógok különbözhetnek a természetben előforduló ACC-szintáz-polipeptidtől egyrészt aminosav szekvenciájukban, másrészt tartalmazhatnak olyan módosítást is, amely nem érinti az aminosav szekvenciát, vagy előfordulhat bennük mindkét módosítás is. A találmány szerinti ACCszintáz-analógok természetben előforduló ACC-szintáz-polipeptid szekvenciájának 20 aminosav hosszúságú szekvenciarészletével, előnyösen 40 aminosav hosszúságú szekvenciarészletével, még előnyösebben pedig a teljes szekvenciájával általában legalább 70 %-ban, előnyösen 80 %-ban, előnyösebben 90 %bán és legelőnyösebben 95 vagy inkább 99 %-ban homológok.
Az elsődleges aminosav-szekvenciában található eltérések lehetnek genetikai variációk, mind természetesek, mind pedig mesterségesen indukáltak. A találmány tárgyát képezik azok az analógok is, amelyekben előfordulnak nemtermészetes aminosavak is, például D-aminosavak vagy természetben elő nem forduló szintetikus aminosavak, mint például β- vagy γ-aminosavak. Az eddigiektől eltérően a peptid-molekula stabilitása fokozható például ciklizálás útján. Szintén a találmány tárgyát képezik a keresztes virágúakból származó ACCszintáz-polipeptidek in vivő vagy in vitro kémiai módosításával előállított polipeptidek. Ilyen kémiai módosítások lehetnek például az acetilálás, a metilálás, a foszforilálás, a karboxilálás vagy a glikozilálás.
A lényegében teljes hosszúságú polipeptideken kívül a találmány tárgyát képezik még a polipeptidek biológiailag aktív fragmensei is. A leírásban hasz-39 nált értelemben a fragmens kifejezés - amennyiben azt egy polipeptidre alkalmazzuk - legalább 20 aminosav hosszúságú, tipikusan legalább 40 aminosav hosszúságú és előnyösebben legalább 60 aminosav hosszúságú fragmenst jelöl. Az ACC-szintáz-polipeptid fragmensei előállíthatok a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. Azt, hogy egy adott fragmens rendelkezik-e valamely ACC-szintázra jellemző biológiai aktivitással, a leírásban feltárt eljárások alkalmazásával dönthetjük el. A találmány tárgyát képezik olyan ACCszintáz-polipeptidek is, amelyek tartalmaznak olyan aminosavakat is, melyek nem szükségesek a biológiai aktivitás szempontjából, például olyan aminosavakat, amelyek alternatív mRNS-splicing révén vagy egyéb alternatív proteinprocessziós események során kerültek a molekulába.
-40A SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ ADATOK:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
| HOSSZÚSÁG: | 5613 |
| TÍPUS: | nukleinsav |
| SZÁLAK SZÁMA: | egy |
| TOPOLÓGIA: | lineáris |
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIAAZONOSÍTÓ SZÁM:
| GATCCCAAAA | AACAATGGGT | TCGTTGGTTT | TGTTTGAAAG | TGTAGATGTA | ACGACTCCAA | 60 |
| ATAGCCAAAA | GTTGATATCT | TCAGTCTATA | TTATTGAGAT | CTTATGTCCC | CCCTGTAATT | 120 |
| AATTTTTCCA | GCAATGCGTG | CTTAAAGAAT | ATTGTTTGAG | ACTTTAGTTA | TTGTAATACG | 180 |
| ACATTAGTAT | AAGTAGAGCC | AAAATCAGAT | TTTAATATCT | TTAGTCTTAA | GACATGAAAC | 240 |
| AAGATTAAGA | AAATACCTTG | TTTTCAAAGA | AAACGGTTAT | AAAAAGGAGG | ATTTGAGTTT | 300 |
| TTGACATTCA | GACGATAAAA | ATTATGAACT | AGGTCTAGTC | ACGTGGTCGA | CGCGTGAGAG | 360 |
| TTTCCGGCGT | GAACTGCAAG | TAAAATCACG | TAGAGCATGT | GATTGACTTG | ACCAAAGAGT | 420 |
| CCAAACCCAC | CAACTACAAA | AAAAAATCAA | GATATAAATA | ACTAACTCTC | ACTAGTCACT | 480 |
| AATATAATTT | TTCATTACAA | TTCATATATG | ATCTACTAAC | AATTGTTGTG | GTTATACAAA | 540 |
| CAAAAAATTT | ATTTTTCGTA | AGACGGAAAT | TTTGAAATCA | AATTCCTCAA | CACTCAAATG | 600 |
| AATATTCAGT | AGTAGTTTAT | CAATGACTAG | ATTAGATATT | TCTTAACGCC | AGTCAAATTT | 660 |
| TGGAATTATG | TGGAGGACGT | ACGTTTATAC | ATGTGCAGAC | TACAACATAC | CAAATGTTTT | 720 |
| ATTAAACCAA | ATTACAATGT | TGCAAATTGG | TCTATTCTTT | TGAATAATCT | GATACATTTT | 780 |
| ATCTCATAAC | TTTCTTCCTT | TTTATTTGAA | TTCAATCAAA | TAATATTCTC | CACATCCCCA | 840 |
| ACCTTCTTTT | TTTTTTTGCA | TGACTAAGTA | GTTTAAGGTC | AACATTTTTC | ATAAGAAGTT | 900 |
| GCTTAGAAAT | AGCCTTGGGT | TCAAATAAAA | TACACATGAT | TTTCCCGTTT | CCACCAATAA | 960 |
| ATCCCAATGG | ATTTTAATAC | TGAAACGGAA | ATCAATGCGA | AACTATTGGA | GTAAGACCAA | 1020 |
| TTTATTCATC | TTAATCTACC | AAATTCGATA | CGATATGTTT | AATACAAGGG | AGATTGATGC | 1080 |
| TAGCAAAACA | CAACCATCTT | AATTTTTTTT | tttttttttt | AATTAGAAAT | TCCCTTCCCA | 1140 |
| AATGGTAATT | CAATCGTAAC | AAAAGTACGT | TTTGAAATAT | TGTTTTGGAT | GGAGATTTTT | 1200 |
| TCCTTGGTTC | GCTTGTTACT | TTTCACTTGT | TTCATCAAAT | CCTAACTCCT | TTTATTTTGG | 1260 |
| ACCCCACATC | AACTTTATTT | GGTCTCCTCA | AGGTTTCTGT | TTCAACTCCT | ATATAAAAGC | 1320 |
| AAATAACTCA | TACGTTAATT | AGTACACACC | ACAAAAACTT | GTATAAGATC | AATATCGATA | 1380 |
| CCCCCAAAAA | AAAAAAAAAA | CAGCTACAAA | GAAGTGAGAA | TTGACACAGC | AAATGGGTCT | 1440 |
| TCCGGGAAAA | AATAAAGGTG | CAGTTTTGTC | GAAGATAGCG | ACTAACAATC | AACACGGAGA | 1500 |
| GAACTCAGAG | TACTTTGATG | GATGGAAAGC | TTACGACAAA | GATCCTTTTC | ATCTTTCCCG | 1560 |
| TAACCCCCAT | GGGATCATCC | AAATGGGTCT | TGCAGAGAAT | CAGGTACAGA | TTATATATAA | 1620 |
| TCCAATAAAT | CATGTTATAT | GTTGTTGTCG | TTGTGCATGA | ACTTCCATCT | ATTAGCTATT | 1680 |
| ATATATGAAC | ACGTATACAC | ATCAAGCTAA | TACCTTTTTT | TCTTCTTTTC | AAGTCAAGTT | 1740 |
| AAATACTTAA | TAACACATTT | TTCTAAACTT | CTTACAGCTT | TGCTTAGATT | TGATCAAAGA | 1800 |
| TTGGGTCAAA | GAGAACCCAG | AAGCTTCTAT | TTGCACCCTT | GAAGGTATTC | ATCAGTTTAG | 1860 |
| CGACATCGCT | AATTTCCAAG | ACTACCATGG | TCTTAAGAAG | TTTAGACAGG | TACTATAAAT | 1920 |
| CATTCATTAT | TCAGATATCT | TGTAATCAGC | TACGGACATA | TTAGAAAAAC | AATTTTTACA | 1980 |
| TGGAAAGTTA | ATAACACCTC | TAAACAATCA | GTTGATATGA | TCTGCATAAG | AAAAACAAAT | 2040 |
| TCAGTCGTGG | ΤΤ*ΓΊ* TT T”r*r*r | Ί^Γ | TTTTTTGTTA | AAGATTCGTG | 2100 | |
| TTGCATTTAA | TTAGTAACTT | ATTTTATAAA | CTTATCCCTA | ATATAAATTT | TGGAATTGAA | 2160 |
| GGCAATTGCA | CATTTCATGG | GAAAAGCTAG | AGGTGGAAGA | GTGACTTTTG | ATCCGGAGAG | 2220 |
| GGTGGTTATG | AGCGGAGGAG | CCACCGGAGC | CAATGAAACA | ATCATGTTCT | GCCTTGCGGA | 2280 |
| TCCCGGCGAC | GTTTTCCTCA | TTCCCTCCCC | GTACTATGCC | GCGTAAGCAT | TGTTAAAAAC | 2340 |
| ATTAATCACA | TTTTTAAGAG | AAAATAGTAC | TAGTATATGA | TAATGGATAA | TGGTTAGGAC | 2400 |
| AGATTTCATT | AATGTTACTT | TCACATACTT | TTTTGGGGTT | AACAAATTCT | AAATCGAAAT | 2460 |
| GAGTTATTAG | TATCAAGTTT | TGACTCTTTT | GCCAAACTTT | ATCACACGTG | TACGATATAT | 2520 |
| CCATTCAATA | GCGGTTTTAA | TTGAACGACA | AGCTCTCATA | CGTGTGATAA | TTAATGATTT | 2580 |
| AATCCTTTCC | GCAGATTTGA | TAGAGACTTG | AGGTGGCGGA | CAGGTGTCGA | GATAATCCCG | 2640 |
| GTTCCTTGTT | CAAGCTCCGA | CAATTTCAAA | TTAACCGTTG | ACGCCGCGGA | ATGGGCTTAT | 2700 |
| AAAAAAGCCC | AAGAGTCCAA | TAAAAAAGTC | AAAGGTCTGA | TTTTGACCAA | CCCATCAAAT | 2760 |
| CCACTCGGTA | CAATGTTGGA | TAAGGACACA | CTCACGAACT | TGGTCCGGTT | TGTCACGAGG | 2820 |
| AAGAACATTC | ACCTAGTCGT | CGACGAGATC | TACGCCGCCA | CAGTCTTCGC | CGGAGGAGAT | 2880 |
| TTCGTGAGCG | TTGCTGAGGT | GGTCAATGAT | GTGGACATCT | CCGAAGTCAA | CGTTGACTTG | 2940 |
| ATTCACATTG | TCTATAGTCT | TTCTAAAGAT | ATGGGACTTC | CTGGTTTTAG | AGTCGGGATA | 3000 |
| GTCTATTCTT | TCAATGACTC | GGTCGTGTCT | TGCGCAAGAA | AAATGTCAAG | TTTCGGACTT | 3060 |
| GTTTCGTCTC | AGACACAACT | CATGCTTGCT | TCGATGTTGT | CCGATGATCA | GTTTGTGGAT | 3120 |
| AATTTTCTAA | TGGAAAGCTC | GAGAAGGTTG | GGGATAAGGC | ATAAAGTTTT | TACCACGGGG | 3180 |
| ATCAAGAAAG | CAGATATTGC | TTGTTTGACA | AGCAACGCTG | GTTTATTTGC | GTGGATGGAT | 3240 |
| TTGAGACATC | TACTGAGAGA | TCGTAACTCG | TTTGAATCTG | AGATCGAGCT | TTGGCATATA | 3300 |
| ATCATCGATA | GAGTTAAGCT | CAATGTGTCT | CCTGGCTCTT | CCTTCCGTTG | CACGGAACCT | 3360 |
| GGATGGTTTA | GGATTTGCTT | TGCCAACATG | GACGATGATA | CTCTCCATGT | GGCGCTTGGA | 3420 |
| CGGATCCAAG | ATTTCGTGTC | TAAGAACAAG | AACAAGATCG | TCGAGAAAGC | ATCTGAAAAT | 3480 |
| GATCAGGTAA | TCCAGAACAA | GAGTGCTAAA | AAGCTGAAAT | GGACGCAGAC | CAATCTTCGA | 3540 |
| CTAAGTTTCC | GACGACTTTA | CGAGGATGGT | CTCTCGTCTC | CAGGGATAAT | GTCACCACAC | 3600 |
| TCACCTCTTC | TCCGAGCATG | AAAATCTTAA | GGCATAACGT | CTGAGAGATT | GGATTAACTC | 3660 |
| GTCCGCGTTT | CACTCCGTGT | TAATTAATCT | TAAATTAGTA | AGTGATTAAG | TAAATGTTTT | 3720 |
| TTCTTTCATT | GTAAGATTGG | AATAATTCAA | TTTCGACATT | AGGGTTGTTT | TTGACGGCCA | 3780 |
| GCTTTTTTCC | TGGGGTCAAA | TGGTAACTTT | TAAGATTTTA | TGTGTTTGAT | TCTGTTTCTT | 3840 |
| TTTTCCGCTT | AGGATTTTAA | TCGATGGATT | GTCCTAGTGG | TGCTGGTGTG | TAGCATATAT | 3900 |
| GCTTTTCTTA | TATGTTTTTG | TGTGTAATAA | ATGAAACATT | GTCTTTTGAT | AAGGATCACC | 3960 |
| AGAGTTTATT | AGTTGGGGAG | GTTGATAATG | TTTTGTGAGT | AATGGAGGAT | TTGTTAACCT | 4020 |
| AATTTATTCG | ATTTTTTCTA | GAACCGCATT | TTCTTGTTCG | CCCAATACGT | CACACGAGCA | 4080 |
| TGCCAACATG | CCTATCCTTT | TTCTAAAATA | ATCATTATAT | GTACTAAATT | GAACATCCGA | 4140 |
| TTATACAGAG | ATATAATCAA | TAAATGCATG | TTAAGTTTTA | TATCTTGGAA | TTTGCCTTAG | 4200 |
| CCTATCATAT | TGTGGGTGAT | GAAAGATTCA | TCAGCATTTC | AGCTGCACCA | AATATGATTA | 4260 |
| AATTCAACTT | ATTATTTTGT | TACAAAGTGA | CAAATTTGCT | TAGAATAATC | AGCTATCAAA | 4320 |
| CATGATGACG | TCTCCATCAA | TTATTCAA.TA | ATCGTCAGCT | TTCTTTCCCC | TTTTTCTTTG | 4380 |
| TTAATGATAA | ACCGTCAGCT | TGAATGTTAT | AGTATTTATT | TTTGGTCCTC | TTTTGGTAAA | 4440 |
| CCATTAGCTA | TTATTTGATA | AAATTTACAG | ATCTCAGATT | GATAAATTTG | TTACATATAT | 4500 |
| TATATGCTAC | TACGACTTTG | TTAGGTAATT | AAGTGCTGAT | GGTAAGGCGT | GCTTTGGGCC | 4560 |
| GCCTCTTAGC | TGATATTGAT | ACTACACACA | CGAACAAAAA | TATATATATA | TAAGACAAAA | 4620 |
| ATCAAATTTG | ATACTTGGAA | ACAACGGTTT | GATCCTTTTC | ACACAGAATA | ATATGTATCT | 4680 |
| GGATAATATA | T AGAT AT CT C | TGTCTAATTA | TAATCATCGA | CATTATCGTC | GTCATCATCA | 4740 |
| GTCACAAGTC | ACAACCAATT | CATGATCATC | AACAGTAGGT | TACGAAACAT | GATCAAGTTA | 4800 |
| TATATTTATT | TTGTTTGGTA | GAAAAAATGA | CATGGGCAAG | TTTTTTTTTA | TATATATATA | 4860 |
| GTGAATCCTC | TTTTTAATAT | TCAAGGGAAC | TTTTTTCTGT | CTTGGATTTT | GTTTTGACTC | 4920 |
| TAAATAATTC | AATACGGCAT | AAATTGAAAA | TGATGAAATA | CCAAATTAAG | TTTTCACATG | 4980 |
| CTCCTTTTAG | GTGGCTACCT | ACCAAAATGT | TTTTGACATT | TGCATTTGGT | TTGAGCCACA | 5040 |
| ACTTGATCTA | TGACATTTAC | AATGCACTTG | GTTACGTGAA | GACTATTTTT | AGTAATATAT | 5100 |
| CTTTTAACAA | AAAAAAAGAT | ATATTTTCAA | TAATCTTTTG | GTGTCGAAAA | AGAAAGAAGT | 5160 |
| TTGTATGTGG | CCGAGATACG | GGCATTTTTA | TTCTTAAGTG | GTTTCTAGAT | TTTTTATTTT | 5220 |
| TTTTGTTTAG | aataaattta | GAACTTCACT | TTATGCTATT | ATCCCCTGAA | ATACAGGTAC | 5280 |
| ATTTGTGAAG | AAACTAAATA | AAAATTAGAA | CAATTAAAAA | CGCTTTACCT | TCTCCTCTTA | 5340 |
| CAAAATTTCT | AAAAGTGACT | CATCAGATGA | TCATGAAGGC | CATGCCCTTT | GCTTCGCGCA | 5400 |
| AAACAGAAGT | AAAGATAAAT | TATCAAGTTT | ACAGCTGAAA | TGTTAATAAG | CCGCCCAACA | 5460 |
| ACATTTATTC | ACCTAAGCTA | GCACCCACAT | ACATTTAAAA | ATATATATAT | TGACCAGATT | 5520 |
| ATGAAAAAAC | TTTGACAATA | ACATAGTTAT | GAAATATACA | TAACCTTAAG | AAGAAGATGA | 5580 |
| CCAGGTTATG | AAATAGCAAA | ATCGAATAAA | AAC | 5613 |
Α 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ ADATOK:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
| HOSSZÚSÁG: | 496 |
| TÍPUS: | aminosav |
| SZÁLAK SZÁMA: | nem értelmezhető |
| TOPOLÓGIA: | nem értelmezhető |
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIAAZONOSÍTÓ SZÁM: 2
| Met 1 | Gly | Leu | Pro | Gly 5 | Lys | Asn | Lys | Gly | Alá Val 10 | Leu | Ser | Lys | Ile Alá 15 | ||
| Thr | Asn | Asn | Gin | His | Gly | Glu | Asn | Ser | Glu | Tyr | Phe | Asp | Gly | Trp | Lys |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Alá | Tyr | Asp | Lys | Asp | Pro | Phe | His | Leu | Ser | Arg | Asn | Pro | His | Gly | Ile |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ile | Gin | Met | Gly | Leu | Alá | Glu | Asn | Gin | Leu | Cys | Leu | Asp | Leu | Ile | Lys |
| Asp | Trp | Val | Lys | Glu | Asn | Pro | Glu Alá | Ser | Ile | Cys | Thr | Leu | Glu | Gly | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ile | His | Gin | Phe | Ser | Asp | Ile | Alá | Asn | Phe | Gin | Asp | Tyr | His | Gly | Leu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Lys | Lys | Phe | Arg | Gin | Alá | Ile | Alá | His | Phe | Met | Gly | Lys | Alá | Arg | Gly |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Gly | Arg | Val | Thr | Phe | Asp | Pro | Glu | Arg | Val | Val | Met | Ser | Gly | Gly | Alá |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Thr | Gly | Alá | Asn | Glu | Thr | Ile | Met | Phe | Cys | Leu | Alá | Asp | Pro | Gly | Asp |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Val | Phe | Leu | Ile | Pro | Ser | Pro | Tyr | Try | Alá | Alá | Phe | Asp | Arg | Asp | Leu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Arg | Trp | Arg | Thr | Gly | Val | Glu | Ile | Ile | Pro | Val | Pro | Cys | Ser | Ser | Ser |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Asp | Asn | Phe | Lys | Leu | Thr | Val | Asp | Alá | Alá | Glu | Trp | Alá | Tyr | Lys | Lys |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Alá | Gin | Glu | Ser | Asn | Lys | Lys | Val | Lys | Gly | Leu | Ile | Leu | Thr | Asn | Pro |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ser | Asn | Pro | Leu | Gly | Thr | Met | Leu | Asp | Lys | Asp | Thr | Leu | Thr | Asn | Leu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Val | Arg | Phe | Val | Thr | Arg | Lys | Asn | Ile | His | Leu | Val | Val | Asp | Glu | Ile |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Tyr | Alá | Alá | Thr | Val | Phe | Alá | Gly | Gly Asp | Phe | Val | Ser | Val | Alá | Glu | |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Val | Val | Asn | Asp | Val | Asp | Ile | Ser | Glu | Val | Asn | Val | Asp | Leu | Ile | His |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Ile | Val | Tyr | Ser | Leu | Ser | Lys | Asp | Met | Gly | Leu | Pro | Gly | Phe | Arg | Val |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Gly | Ile | Val | Tyr | Ser | Phe | Asn | Asp | Ser | Val | Val | Ser | Cys | Alá | Arg | Lys |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Met | Ser | Ser | Phe | Gly | Leu | Val | Ser | Ser | Gin | Thr | Gin | Leu | Met | Leu | Alá |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Ser | Met | Leu | Ser | Asp | Asp | Gin | Phe | Val | Asp | Asn | Phe | Leu | Met | Glu | Ser |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Ser | Arg | Arg | Leu | Gly | Ile | Arg | His | Lys | Val | Phe | Thr | Thr | Gly | Ile | Lys |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Lys | Alá | Asp | Ile | Alá | Cys | Leu | Thr | Ser | Asn | Alá | Gly | Leu | Phe | Alá | Trp |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Met | Asp | Leu | Arg | His | Leu | Leu | Arg | Asp | Arg | Asn | Ser | Phe | Glu | Ser | Glu |
| 370 | 375 | 380 |
| He | Glu | Leu | Trp | His | He | He | He | Asp | Arg | Val | Lys | Leu | Asn | Val | Ser |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Pro | Gly | Ser | Ser | Phe | Arg | Cys | Thr | Glu | Pro | Gly | Trp | Phe | Arg | Ile | Cys |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Phe | Alá | Asn | Met | Asp | Asp | Asp | Thr | Leu | His | Val | Alá | Leu | Gly | Arg | He |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Gin | Asp | Phe | Val | Ser | Lys | Asn | Lys | Asn | Lys | He | Val | Glu | Lys | Alá | Ser |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Glu | Asn | Asp | Gin | Val | He | Gin | Asn | Lys | Ser | Alá | Lys | Lys | Leu | Lys | Trp |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Thr | Gin | Thr | Asn | Leu | Arg | Leu | Ser | Phe | Arg | Arg | Leu | Tyr | Glu | Asp | Gly |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Leu | Ser | Ser | Pro | Gly | Ile | Met | Ser | Pro | His | Ser | Pro | Leu | Leu | Arg | Alá |
| 485 | 490 | 495 |
Α 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ ADATOK:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
| HOSSZÚSÁG: | 159 |
| TÍPUS: | nukleinsav |
| SZÁLAK SZÁMA: | egy |
| TOPOLÓGIA: | lineáris |
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIAAZONOSÍTÓ SZÁM: 3
CAGGCGATTG CGACGTTTAT GGAGAGAGCG AGAGGCGGGC GGGTGAGGTT TGAGGCGGAG 60
AGGGTGGTGA TGAGCGGAGG AGCCACCGGA GCAAATGAGA CGATCATGTT CTGTCTTGCT 120
GATCCCGGCG ACGCTTTTCT CGTCCCTACT CCTTATTAT 159
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA VONATKOZÓ ADATOK:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
| HOSSZÚSÁG: | 53 |
| TÍPUS: | aminosav |
| SZÁLAK SZÁMA: | nem értelmezhető |
TOPOLÓGIA:
nem értelmezhető
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SZEKVENCIAAZONOSÍTÓ SZÁM: 4
| Gin | Alá | Ile | Alá | Thr | Phe | Met | Glu |
| 1 | 5 | ||||||
| Phe | Glu | Alá | Glu | Arg | Val | Val | Met |
| 20 | |||||||
| Glu | Thr | Ile | Met | Phe | Cys | Leu | Alá |
| 35 | 40 |
Pro Thr Pro Tyr Tyr
| Arg | Alá | Arg | Gly | Gly | Arg | Val | Arg |
| 10 | 15 | ||||||
| Ser | Gly | Gly | Alá | Thr | Gly | Alá | Asn |
| 25 | 30 | ||||||
| Asp | Pro | Gly | Asp | Alá | Phe | Leu | Val |
| 45 |
♦ *
Claims (23)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Lényegében tiszta DNS, azzal jellemezve, hogy keresztes virágúakból származó ACC-szintáz-polipeptidet kódol.
- 2. Az 1. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy genomi DNS vagy cDNS.
- 3. Az 1. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy Arabidopsiseredetű.
- 4. Vektor, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti DNS-t tartalmaz és képes vezérelni a DNS által kódolt fehérje expresszióját a vektort tartalmazó sejtekben.
- 5. Sejt, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti DNS-t vagy 4. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
- 6. Az 5. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy növényi eredetű.
- 7. Transzgenikus növény, annak magja vagy sejtje, azzal jellemezve, hogy1. igénypont szerinti DNS-t vagy 4. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
- 8. Lényegében tiszta DNS, azzal jellemezve, hogy etilénnel indukálható és éretlen növényi szövetekben működőképes promótert tartalmaz.
- 9. A 8. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy ACC-szintáz promótert tartalmaz.
- 10. A 9. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy keresztes virágúakból származó ACC-szintáz promótert tartalmaz.
- 11. A 10. igénypont szerinti DNS, azzal jellemezve, hogy Arabidopsiseredetű promótert tartalmaz.
- 12. Transzgenikus növény, annak magja vagy sejtje, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti promoter transzkripciós szabályozása alatt álló DNS-szekvenciát magába foglaló transzgént tartalmaz.
- 13. Transzgenikus növény, annak magja vagy sejtje, azzal jellemezve, hogy mutáns ACC-szintázt kódoló DNS-szekvenciát magába foglaló transzgént tartalmaz.
- 14. Eljárás keresztes virágúakból származó rekombináns ACC-szintázpolipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) előállítunk egy keresztes virágúakból származó ACC-szintázpolipeptidet kódoló DNS-t expresszálható módon beépítve tartalmazó sejtet;(ii) a sejtet a beépített DNS expressziójára alkalmas körülmények között tenyésztjük; és (iii) elkülönítjük a keresztes virágúakból származó rekombináns ACCszintáz-polipeptidet.
- 15. Eljárás etilénnel indukálható esemény gátlására növényben, azzal jellemezve, hogy egy transzgenikus növénybe keresztes virágúakból származó ACCszintáz-polipeptidet kódoló DNS-t építünk a növény valamely sejtjében történő expresszióra alkalmas módon; és a transzgenikus növényt a beépített DNS expressziójára alkalmas körülmények között termesztjük.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy etilénnel indukálható eseményként a gyümölcsérést, a gyümölcsérés előrehaladását vagy az öregedést gátoljuk.
- 17. Eljárás valamely vegyület valamely sejtben történő indukált előállítására, azzal jellemezve, hogy olyan sejtet állítunk elő, amely a vegyületet kódoló DNS-t funkcionálisan a 8. igénypont szerinti promóterhez kapcsolva tartalmazza; és a vegyület termelődésének indukálása céljából a sejtet etilénnel érintkeztetjük.
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vegyületként rekombináns fehérjét, a sejtben természetesen termelődő fehérjét vagy RNS molekulát állítunk elő.
- 19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtként növényi sejtet alkalmazunk.
- 20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtként a 10. igénypont szerinti promótert transzgénként tartalmazó transzgenikus növényből származó sejtet alkalmazunk.
- 21. Lényegében tiszta ACC-szintáz-polipeptid, azzal jellemezve, hogy keresztes virágúakból származik.
- 22. A 21. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy az Arabidopsis családból származik.
- 23 A 22. igénypont szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy tartalmaz az 1. ábrán bemutatottal (szekvenciazonosító szám: 1. és 2.) lényegében azonos aminosav-szekvenciát.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96248192A | 1992-10-15 | 1992-10-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9501087D0 HU9501087D0 (en) | 1995-06-28 |
| HUT71783A true HUT71783A (en) | 1996-02-28 |
Family
ID=25505928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501087A HUT71783A (en) | 1992-10-15 | 1993-10-13 | Crucifer acc-synthase, gene coding it, the promoter of the gene, and recombinant methods for production of acc-synthase and transgenic plants expressing acc-synthase |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5908971A (hu) |
| EP (1) | EP0690919A1 (hu) |
| JP (1) | JPH08506003A (hu) |
| AU (1) | AU5442894A (hu) |
| CA (1) | CA2146161A1 (hu) |
| CO (1) | CO4230141A1 (hu) |
| HU (1) | HUT71783A (hu) |
| IL (1) | IL107239A0 (hu) |
| MX (1) | MX9306435A (hu) |
| WO (1) | WO1994008449A1 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0779926A1 (en) * | 1994-09-02 | 1997-06-25 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Transgenic plants expressing acc oxidase genes |
| US5998702A (en) * | 1994-12-30 | 1999-12-07 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Transgenic plants expressing ACC synthase gene |
| US6043409A (en) * | 1995-06-07 | 2000-03-28 | Seminis Vegetable Seeds, Inc. | Transgenic plants expressing ACC oxidase genes |
| NZ500741A (en) * | 1997-04-09 | 2001-06-29 | Ministry Of Agriculture And Fo | Inducible plant promoters selected from apple beta-galactosidase (ABG1) or 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (ACC synthase) |
| AUPP557298A0 (en) * | 1998-08-31 | 1998-09-17 | University Of Queensland, The | A novel plant promoter and uses therefor |
| US20030186278A1 (en) * | 2001-12-11 | 2003-10-02 | Joseph Mitchell | Methods for the identification of inhibitors of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase expression or activity in plants |
| CA2529658C (en) * | 2003-06-23 | 2017-09-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Engineering single-gene-controlled staygreen potential into plants |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA885916B (en) * | 1987-09-15 | 1989-04-26 | Gen Hospital Corp | Pathogenesis-related proteins in plants |
| GB8916213D0 (en) * | 1989-07-14 | 1989-08-31 | Ici Plc | Dna constructs,cells and plants derived therefrom |
| MX9100993A (es) * | 1990-09-10 | 1992-05-04 | Us Agriculture | Secuencia de adn aislado y enzima acido 1-aminociclopropan-1-carboxilico sintasa,recombinante |
| US5512466A (en) * | 1990-12-26 | 1996-04-30 | Monsanto Company | Control of fruit ripening and senescence in plants |
| GB9105420D0 (en) * | 1991-03-14 | 1991-05-01 | Ici Plc | Expression of genes in transgenic plants |
| GB9211440D0 (en) * | 1992-05-29 | 1992-07-15 | Ici Plc | Expression of genes in transgenic plants |
-
1993
- 1993-10-11 IL IL107239A patent/IL107239A0/xx unknown
- 1993-10-13 HU HU9501087A patent/HUT71783A/hu unknown
- 1993-10-13 WO PCT/US1993/009816 patent/WO1994008449A1/en not_active Application Discontinuation
- 1993-10-13 AU AU54428/94A patent/AU5442894A/en not_active Abandoned
- 1993-10-13 EP EP93924927A patent/EP0690919A1/en not_active Withdrawn
- 1993-10-13 CA CA002146161A patent/CA2146161A1/en not_active Abandoned
- 1993-10-13 JP JP6510256A patent/JPH08506003A/ja active Pending
- 1993-10-14 CO CO93413932A patent/CO4230141A1/es unknown
- 1993-10-15 MX MX9306435A patent/MX9306435A/es unknown
-
1995
- 1995-06-05 US US08/463,418 patent/US5908971A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU5442894A (en) | 1994-05-09 |
| US5908971A (en) | 1999-06-01 |
| JPH08506003A (ja) | 1996-07-02 |
| MX9306435A (es) | 1994-07-29 |
| EP0690919A4 (en) | 1995-11-16 |
| EP0690919A1 (en) | 1996-01-10 |
| HU9501087D0 (en) | 1995-06-28 |
| WO1994008449A1 (en) | 1994-04-28 |
| IL107239A0 (en) | 1994-01-25 |
| CA2146161A1 (en) | 1994-04-28 |
| CO4230141A1 (es) | 1995-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5689042A (en) | Transgenic plants with altered senescence characteristics | |
| CN111763682B (zh) | ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高及穗位高中的用途 | |
| ES2263214T3 (es) | Gen rht del trigo para el control genetico del crecimiento y desarrollo vegetal. | |
| US20020116735A1 (en) | Nucleic acids encoding a plant enzyme involved in very long chain fatty acid synthesis | |
| EP0837624A1 (en) | Delayed ripening tomato plants | |
| US6294716B1 (en) | Plants having modified response to ethylene by transformation with an ETR nucleic acid | |
| US10704054B2 (en) | Modulation of seed vigor | |
| AU699431B2 (en) | Crucifer AFT proteins and uses thereof | |
| AU2006314535A1 (en) | EMP4 gene | |
| US6639130B2 (en) | Plant sterol reductases and uses thereof | |
| AU722002B2 (en) | Plant sugar sensors and uses thereof | |
| HUT71783A (en) | Crucifer acc-synthase, gene coding it, the promoter of the gene, and recombinant methods for production of acc-synthase and transgenic plants expressing acc-synthase | |
| WO1997048793A9 (en) | Plant sterol reductases and uses thereof | |
| AU3574699A (en) | Method of dwarfing plants | |
| US6720476B2 (en) | CTR1 homologue from melon | |
| AU758678B2 (en) | Plant sugar sensors and uses thereof | |
| CA2380955C (en) | Plants having modified response to ethylene | |
| US6841722B1 (en) | Nucleic acid encoding the arabidopsis SSE1 protein and a method of using it to modify plant storage reserves | |
| WO2000061735A1 (en) | Modification of plant storage reserves | |
| WO2003091441A1 (en) | Sfr2 protein encoding gene |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |