HUT70259A - Rfkbp: a novel isomerase and papamycin/fk506 binding protein - Google Patents

Rfkbp: a novel isomerase and papamycin/fk506 binding protein Download PDF

Info

Publication number
HUT70259A
HUT70259A HU9303164A HU9303164A HUT70259A HU T70259 A HUT70259 A HU T70259A HU 9303164 A HU9303164 A HU 9303164A HU 9303164 A HU9303164 A HU 9303164A HU T70259 A HUT70259 A HU T70259A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
rfkbp
protein
rapamycin
gly
sequence
Prior art date
Application number
HU9303164A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9303164D0 (en
Inventor
Matthew W Harding
Original Assignee
Vertex Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharma filed Critical Vertex Pharma
Publication of HU9303164D0 publication Critical patent/HU9303164D0/hu
Publication of HUT70259A publication Critical patent/HUT70259A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány egy olyan, szerkezetileg új, alacsony molekulaτ tömegű emlős eredetű proteinre vonatkozik, amely megköti az FK506-ot. Az újonnan azonosított FK506-kötő protein, amelyet a továbbiakban rapamicin FK506-kötő proteinnek vagy RFKBP-nek (rapamycin FK506 binding protein) nevezünk, a rapamicint is megköti. A rapamicin egy olyan makrolid, amely szerkezetileg rokon• · · · · · · • · · * ·♦ · 4* • ···«· * « ··* ··· · ·· «·· ·
Ságban van az FK506-tal, de nem köti meg az immunszuppresszív ciklosporin A-t. Az RFKBP jelentős mennyiségi szelektivitással köti az FK506-ot (azaz az FK506-ot és a rapamicint szignifikánsan különböző mennyiségi szelektivitással köti meg), és ennélfogva fel lehet használni a rapamicin-szerű szerektől való megkülönböztetésére szűrővizsgálatokban vagy analitikai vizsgálatokban .
A következőkben leírjuk, hogy marha tímuszból egy új FK506 kötő proteint tisztítottunk és vizsgáltunk. (Ennek leírását tartalmazza a 697,113 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés). Ugyancsak leírjuk, hogy egy megfelelő humán cDNS-t klónoztunk humán placenta eredetű cDNS tárból úgy, hogy a tárat egy olyan DNS szondával szűrtük, amelynek a szekvenciája a marha RFKBP aminosavszekvenciáján alapult.
Kimutattuk, hogy a marha tímuszból tisztított új FK506-kötő protein (jele: bRFKBP) az FK506-ot és a rapamicint szignifikáns mennyiségi szelektivitással köti meg, és nem köti a ciklosporin A-t. A bRFKBP egy alacsony molekulatömegű peptid (Mr körülbelül 16.000, SDS-PAGE módszerrel meghatározva, mely cisz-transz prolil-izomeráz aktivitást fejt ki. Ezenkívül meghatároztuk a bRFKBP részleges aminosavszekvenciáját (5.sz. szekvencia). Az aminosavszekvencia analízis kimutatta, hogy a bRFKBP-nek 50 %-nál nagy a r
homológiája az FKBP12-höz az N-terminális szakaszban.
Vizsgáltunk továbbá egy humán cDNS kiónt, melyet az itt leírtak szerint azonosítottunk. Részletesebben kifejtve, a humán klón cDNS inszertumát tisztítottuk, és teljes hosszában szekvenáltuk. A cDNS inszertum körülbelül 562 bp-t tartalmazott (6. sz.
* * · -f • · « · 4 • · ··« · 4 « ···«· « · ·«« • · · « * · » szekvencia). A kódolt protein levezetett aminosavszekvenciáját (7.sz. szekvencia) bemutatjuk. A kódolt protein szekvenciája 142 aminosav csoportból áll, és számított molekulatömege körülbelül 13.200, mely hasonló a marha RFKBP molekulatömegéhez.
Tehát a találmány emlős eredetű FK506-kötő proteinre, részletesebben, nem humán (marha) és humán eredetű FK506-kötő proteinre vonatkozik. A találmány tárgyát képező RFKBP mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti az FK506-ot és a rapamicint. Vonatkozik a találmány az RFKBP-t kódoló DNS-re és RNS-re, az RFKBP-t kötő antitestekre (poliklonális és monoklonális) és az előbb említetteket felhasználó módszerekre. A találmány oltalmi körébe tartoznak az RFKBP-vel homológ és ekvivalens proteinek (azaz azok a proteinek, amelyeknek az aminosavszekvenciája az RFKBP aminosavszekvenciájához lényegében hasonló, de azzal nem azonos, valamint FK506, rapamicin és ciklosporin A kötő tulajdonságaik lényegében ugyanolyanok, mint amilyeneket itt az RFKBPre leírtunk). A találmány vonatkozik még az RFKBP peptidekre (ezek RFKBP fragmentumok, melyek lényegében hasonló, de a teljes RFKBP aminosavszekvenciához képest kisebb aminosavszekvenciát tartalmaznak), továbbá az RFKBP homológok, RFKBP peptidek használatára és az RFKBP homológokat vagy RFKBP peptideket kódoló nukleinsav szekvenciákra és ezek felhasználására.
t
A találmány szerinti RFKBP-t immunszuppresszív vegyületek kimutatására szolgáló szűrővizsgálatokban használhatjuk, mivel az FK506-ot és a rapamicint mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti meg, továbbá felhasználhatjuk a rapamicin-szerű vegyületeknek az FK506-szerű vegyületektől való megkülönbözte·· *·· · « · »··«· · · ··« • · · «· · · tésére. Ezenkívül felhasználhatjuk az RFKBP-t természetben előforduló intracelluláris szubsztrátumok — amelyek más immunszuppressziv szerek cél-szubsztrátumai lehetnek — azonosítására, hogy azonosíthassunk olyan természetes intracelluláris rapamicin-szerű és FK506-szerű molekulákat, amelyek a sejt-anyagcsere belső szabályozó folyamataiban vesznek részt, és hogy az immunszuppresszív gyógyszer-terápiában részesülő egyénekben mérhessük a kiindulási vegyületeket vagy az ilyen vegyületek anyagcsere termékeit. Felhasználható még ellenőrző szűrési technikákban, hogy a kiszemelt immunszuppresszív szerek közül kiemeljük a potenciálisan toxikus vegyületeket.
Az alábbiakban az ábrák rövid magyarázata következik.
Az 1. ábra a marha RFKBP (5.sz. szekvencia) és négy további FKBP, a Neurospora crassa FKBP (l.sz. szekvencia), a humán FKBP12 (2.sz. szekvencia), a marha (bovine) FKBP12 (3.sz. szekvencia) és a Saccharomyces cerevisiae FKBP (4.sz. szekvencia) részleges aminosavszekvenciáját ábrázolja. A függőleges vonalak a jelzett pozícióban az azonos aminosavakat jelentik, a kettőspontok (:) pedig azokat a csoportokat jelzik, melyeknél megfigyelhető, hogy a kristályszerkezetben só-kötéseket képeznek.
A 2. ábra a humán placenta eredetű RFKBP-nek megfelelő teljes hosszúságú cDNS kódoló szálának nukleinsavszekvenciáját ábrázolja, melynek hossza 562 bázispár (6.sz. szekvencia).
A 3. ábrán az RFKBP-nek ORF szekvenciából meghatározott aminosavszekvenciáj a látható. A szekvencia 142 csoport hosszú (7.sz. szekvencia).
Az új FK506-kötő proteint (RFKBP) marha tímuszból tiszti• « • · · • « · 4 4 ·
4««« · • ♦· tottuk (bRFKBP), és kimutattuk, hogy ez a protein egy cisz-transz prolii izomeréz. Aminosavszekvenciája homológ az előzőleg azonosított 11.800 molekulatömegű FK506-kötő protein aminosavszekvenciájával (FKBP12), és köti a rapamicint, de ellentétben az FKBP12-vel, szignifikánsan különböző mennyiségi szelektivitással köti. Ez az új RFKBP nem köti a ciklosporin A-t.
Ezenkívül humán placenta eredetű cDNS tárból RFKBP-t kódoló humán cDNS-t klónoztunk, amelynek nukleinsav szekvenciáját (6.sz. szekvencia) meghatároztuk, és kikövetkeztettük az általa kódolt protein aminosavszekvenciáját (7.sz. szekvencia). A hRFKBP és bRFKBP levezetett aminosavszekvenciái homológok, kivéve a harmadik aminosavat (ez a hRFKBP-ben alanin és a bRFKBP-ben treonin). Ennélfogva indokolt volt arra számítani, hogy a hRFKBP ugyancsak szignifikánsan különböző mennyiségi szelektivitással szintén köti az FK506-ot és a rapamicint, és nem köti a ciklosporin A-t.
Az 1. példában leírjuk, hogy a tímusz citoszol kivonatot egy olyan FK506 affinitás oszlopon engedtük át, amely az FK506 egy amino-származékát — a C32 pozíciónál — tartalmazta. Ennek eredményeként számos olyan proteint kaptunk, amelyeket az FK506 mátrix visszatartott, majd az FK506 oldatba bocsátott. Az oldat a következő körülbelüli molekulatömegű proteineket tartalmazta: 16.000; 28.000; 32.000; 45.000; 55.000; 60.000; 66.000; és r
80.000. A körülbelüli molekulatömeg meghatározásokat SDS-PAGE módszerrel végeztük, 12,5 %-os gélben, amikoris lizozimet (14.400) és a-kimotripszint (21.500) használtunk a relatív vándorlás kalibrálására.
A körülbelül 16.000 molekulatömegű proteint PVDF membránra «4 · · · •· · 4 ·· · ···*·· ·«· • ···· · · · · ·♦ ··· · ·· · 4 * · vittük. Matsudaira módszerével [Matsudaira,P., J.Bioi.Chem. 262 , 10035-10038 (1987)], elektrotranszfer alkalmazásával, majd elvégeztük N-terminális aminosavainak szekvenálását. A belső szekvenciáról további információt kaptunk, amikor a nitrocellulóz vagy PVDF membránhoz kötött proteint endoproteináz lizin C-vel emésztettük, vagy brómciánnal kezeltük, és ezután a kapott peptid fragmentumokat mikroátmérőjű HPLC-vel izoláltuk [P. Matsudaira, A Practical Guide to Protein and Peptide Purification fór Microsequencing, Academic Press (San Diego, 1989)]. Az N-terminális és belső aminosavszekvenciákat az 1. ábra mutatja be (1-5 sz. szekvenciák). A bRFKBP aminosavszekvenciának és az FKBP12 szekvenciának az összehasonlítása azt mutatta, hogy a két protein N-terminális szakaszainak a homológiája 50%nál nagyobb.
Az FK506 mátrixról leoldott homogén bRFKBP enzim tulajdonságait szintén vizsgáltuk. A bRFKBP homogenitását SDS-PAGE módszerrel és izoelektromos fókuszálással határoztuk meg. A 2. példában leírjuk, hogy a bRFKBP peptidil prolii cisz-transz izomerizáló aktivitásnak mérésére Fisher és munkatársai módszerét használtuk. Vizsgáltuk az FKBP12 és a ciklofilin aktivitását is. A 2. példa 1. és 2. táblázatából látható, hogy mind a bRFKBP, mind az FKBP12 előnyben részesíti a nagy hidrofób csoportokat a P^ pozícióban (ahol L>F>U>A). Az 1. és 2. táblázatban közölt eredményekből világosan látható, hogy a három izomeráz funkcionálisan különböző. Különösen előnyösek az RFKBP kötési tulajdonságai a rapamicinhez, FK506-hoz és ciklosporinhoz való kötődése tekintetében.
• 4 · » 4 4 • · 4 ·· I 4 • 44 · 4 · · 4· • 444·· · ···· ·♦· 4 ♦» 44··
- 8 A 2. példában leírjuk továbbá, hogy standard technikák segítségével megvizsgáltuk a rapamicin, FK506 és a ciklosporin A gátló hatását a bRFKBP, FKBP12 és ciklofilin izomeráz aktivitására. A 3. és 4. táblázat bemutatja, hogy az RFKBP Kj_ értéke FK506-ra 180 nM, illetve 38 nM és rapamicinre a 6,3 nM, illetve 3,6 nM. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a rapamicin sokkal hatásosabb izomeráz aktivitás inhibitor, mint az FK506, és hogy a bRFKBP egyáltalában nem köti a ciklosporin A-t. A bRFKBP-t és az FKBP12-t nem gátolja a ciklosporin A, és a ciklofilint nem gátolja a rapamicin.
Annak érdekében, hogy elősegítsük egy bRFKBP-t kódoló DNSsel hibridizáló DNS inszertumot tartalmazó humán cDNS klón izolálását, DNS szondákat terveztünk a 3. példában leírtak szerint. Két degenerált oligonukleotidot (8. és 9. számú szekvencia) terveztünk a meghatározott bRFKBP protein szekvenciájára alapozva. Ezeket a DNS oligomereket használtuk primerek gyanánt a polimeráz láncreakcióban (PCR), amelyet a DNS fragmentum sokszorozása céljából végeztünk. A sokszorozott fragmentumot egy klónozó vektorba klónoztuk be, és meghatároztuk DNS szekvenciáját. E DNS fragmentumot ezután kimetszettük a vektorból, 32P-vel jeleztük, és ezt használtuk egy humán placentáris cDNS tár (Stratagene, katalógus szám: 936203) szűrésére.
A 3. példában leírjuk, hogy egy humán cDNS kiónt azonosítottunk, amely egy a bRFKBP-ben jelenlévő aminosavszekvenciát kódoló DNS fragmentummal hibridizáló, mintegy 600 bp méretű inszertumot tartalmazott. A cDNS kiónt tisztítottuk, és szekvenáltuk. A szekvenciát a 2. ábra mutatja be (6.sz. szekvencia).
- 9 A bRFKBP-t kódoló cDNS szekvencia helyes nyílt leolvasási keretét azonosítottuk (lásd a 3. példát). A kikövetkeztetett aininosavszekvencia — az aminoterminális résztől a karboxiterminális részig — a 3. ábrán látható (7.sz. szekvencia). A levezetett protein 142 aminosavból áll.
A humán placenta eredetű RFKBP következtetésen alapuló aminosavszekvenciája és a marha tímusz eredetű RFKBP kémiailag meghatározott szekvenciája homológok, kivéve a harmadik aminosavat (alanin a hRFKBP-ben és treonin a bRFKBP-ben).
Az izolált cDNS által kódolt hRFKBP protein enzim tulajdonságai szintén meghatározhatók a 2. példában leírt módszerekkel. Használhatjuk például a Harrison és Stein féle vizsgálati eljárást [R. K.Harrison, R.L. Stein, Biochemistry, 29, 3813-3816 (1990)] a hRFKBP peptidil prolii cisz-transz izomerizációs aktivitásának mérésére, ugyanúgy, ahogyan ezt a bRFKBP-nél is tettük. Mint a 2. példában leírjuk, standard technikákkal határozhatjuk meg az FK506, rapamicin és ciklosporin A gátló hatását az RFKBP izomeráz aktivitására. E két vizsgálat eredménye jól használható az FK506-ra specifikus izomeráz aktivitás bemutatására, mely szelektíven gátolt FK506 és rapamicin jelenlétében.
Tehát itt leírt munkánk eredményeként egy új, emlős eredetű FK506-kötő protein áll rendelkezésre, melynek mérete és kötő specificitása különbözik az előzőleg leírt FKBP12-étől. Ez a protein az immunválaszok szabályozásában kulcsszerepet betöltő prolii cisz-transz izomerázok osztályának egy új tagja, és mint ilyen, felhasználási területe változatos. Az 1. ábrán látható, hogy a marha RFKBP-nek szignifikáns a szekvencia homológiája a négy is10 mert FKBP-vel, és a bRFKBP-t szelektíven gátolja a rapamicin és az FK506.
Izoláltunk továbbá egy olyan cDNS inszertumot tartalmazó humán cDNS kiónt, mely egy bRFKBP aminosavszekvenciát kódoló DNS fragmentummal hibridizál, és kimutattuk, hogy levezetett aminosavszekvenciája lényegében azonos a bRFKBP aminosavszekvenciájával.
A cDNS inszertum által kódolt hRFKBP proteint a 2. ábra mutatja be (6.sz. szekvencia). A humán és a szarvasmarha RFKBP aminosavszekvencia lényegében azonos, és csak egyetlen aminosav különbözteti meg a két proteint. Indokolt volt azt hinni, tekintve, hogy a bRFKBP-nek és a hRFKBP-nek lényegében azonosak a szekvenciái, hogy a hRFKBP ugyanolyan szelektív kötő és gátló tulajdonságokkal rendelkezik, mint a bRFKBP. A találmány szerinti RFKBP proteinek közé tartoznak az analóg és homológ aminosavszekvenciák által meghatározott olyan proteinek, melyek az FK506 és a rapamicin szelektív megkötésére képesek. Ezekhez a proteinekhez tartoznak azok is, amelyek lényegében ugyanolyan kötő képességekkel rendelkeznek, mint a bRFKBP vagy a hRFKBP, és amelyeknek az aminosavszekvenciája deléció, addíció vagy szubsztitúció révén különbözik a bRFKBP vagy a hRFKBP aminosavszekvenciájától. Ezek közé a proteinek közé sorojuk azokat a szekvenciákat, amet lyekben a funkcionálisan azonos értékű aminosav csoportokat olyan csoportokkal szubsztituáljuk a szekvencián belül, amelyek csendes (silent) változást eredményeznek. Például a szekvencián belül egy vagy több aminosav csoportot hasonló polaritású más olyan aminosawal helyettesíthetünk, amely funkcióját tekintve azonos · 4 · * « ·* · « «· 9 • · · · 4 · « · · • ···· · · · · ·· ·« · · · 9 · · · 9 értékű, és így csendes változás jön létre.
Egy szekvencián belüli aminosav szubsztituenséül olyan csoportból választhatunk más aminosavakat, ahová a helyettesítendő aminosav is tartozik. Például: nem poláros (hidrofób) aminosavak a következők: glicin, alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofán és metionin. Poláros aminosavak a következők: szerin, treonin, cisztein, tirozin, aszparagin és glutamin. Töltéssel rendelkező (bázikus) aminosavak: arginin, lizin és hisztidin. Negatív töltéssel rendelkező (savanyú) aminosavak: aszparaginsav, glutaminsav.
A protein szerkezet módosítható még a szekvencián belüli egy vagy több aminosav csoport deléciója, addíciója, inverziója, inszerciója vagy szubsztitúciója révén, ha lényegében nem vonnak le semmit a peptid kívánt funkcionális tulajdonságaiból. A természetben előforduló alléi változatok a módosulatok szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak, ameddig a változás lényegében nem csökkenti a proteinnek azt a képességét, hogy szelektíven köti az FK506-ot vagy a rapamicint.
FK506-ot vagy rapamicint szelektíven kötő módosított RFKBP proteineket előállíthatunk rekombináns technikák használatával, például úgy, hogy a proteint egy olyan vektorból fejezzük ki, mely a proteint kódoló cDNS-t tartalmazza, vagy úgy, hogy a kít vánt proteint kódoló DNS-t mechanikai és/vagy kémiai úton szintetizáljuk ismert technikákat alkalmazva.
A találmány szerinti RFKBP proteinek előállításának egy másik megközelítése esetén peptid szintézist alkalmazunk a proteinnek megfelelő aminosavszekvenciájú peptid vagy polipeptid elké• · ·*44 · ·4 ·«» > · · · 41 • · 4 ··· szítésére. A peptideket vagy az ezzel egyenértékű módosított változatokat közvetlenül szintetizálhatjuk a szintetikus peptid-kémia szilárd vagy folyadék fázisú standard módszereivel. Az RFKBP proteint meghatározó fent említett aminosavszekvencia vagy ennek módosított egyenértékű változata például a Merrifield féle szilárd fázisú eljárással szintetizálható.
Előnyös, ha az RFKBP proteint úgy állítjuk elő, hogy a proteint kódoló DNS-t megfelelő vektor/gazda rendszerbe építjük be, ahol kifejeződik. A DNS szekvenciákat előállíthatjuk kémiai szintézissel vagy nyerhetjük természetes forrásból a rekombináns technológia alkalmazásával.
Számos gazda-vektor rendszert használhatunk a találmány szerinti protein kifejezésére. Gazda-vektor rendszerek többek között a következők: bakteriofág DNS-sel, plazmid DNS-sel vagy kozmid DNS-sel transzformált baktériumok.
A DNS-nek egy expressziós vektorba való beépítésére bármilyen standard rekombináns módszert használhatunk. A rekombináns DNS vektornak egy megfelelő gazdasejtbe való bevezetéséhez bármilyen, e gazdasejthez alkalmas módszer használható, ilyen például a transzformáció, transzdukció, transzfekció vagy elektroporáció, majd a kapott gazdasejtet a találmány szerinti protein kifejezése céljából tenyésztjük.
Vonatkozik a találmány egy RFKBP-szerű aktivitást kifejtő és FK506 és rapamicin kötő képességgel rendelkező proteint kódoló DNS szekvenciát tartalmazó expressziós vektorra, továbbá az ezzel transzformált sejtekre is.
A cDNS klón által kifejezett RFKBP proteint számos diagnosz- • ’ »4 4· ·· · · ·«t ··*·»< a * « • 4··«» « · ·«· ··· · * · »»» ·
- 13 tikai és terápiás célra használhatjuk. Az RFKBP szűrővizsgálatokban is felhasználható, új, természetben előforduló immunszupreszszív vegyületek felkutatására. Az RFKBP-t például ismert technikákkal termelt fermentlevekben olyan vegyületek szűrésére használhatjuk, melyek az RFKBP-hez kötődnek, és így ezek lehetséges immunszuppresszív szerekként jönnek számításba. Az RFKBP felhasználható még meglévő szintetikus vegyületek kötő affinitásának szűrésére, amelyet az immunszuppresszív hatás kiértékelése követ. Azaz az RFKBP szűrővizsgálatban való felhasználása révén a rapamicinszerű immunszuppresszív szereket meg lehet különböztetni az FK506-szerű immunszuppresszív szerektől, mivel különböző a kötődésük, mint ahogy ezt a 2. példa táblázatai mutatják. Ilyen differenciál szűrést nem lehet az előzőleg azonosított FKBP12 használatával végezni, mivel ez hasonló affinitással köti az FK506-ot és a rapamicint (lásd a 3. és a 4. táblázatot). Ha az RFKBP-t szűrésre használjuk, rendszerint megfelelő szilárd hordozóra kötjük, ahogy ezt a diagnosztikai felhasználásokra vonatkozóan a későbbiekben leírjuk. Biztosra vehető tehát, hogy egy olyan vegyület, amely kötődik az RFKBP-hez, egy FK506-szerű vegyület, és ennélfogva immunszupresszív képességekkel rendelkezik.
Az RFKBP-t alapként használhatjuk FK506-szerű molekulák tervezésénél azáltal, hogy az RFKBP aktív kötő helyét (helyeit) meghatározzuk és jellemezzük, és ennek alapján egy olyan molekulát tervezünk, mely kötődik e kötőhely(ek)hez, és megállapítjuk e kötésiek) immunválaszt gátló képességét.
A legújabban azonosított RFKBP-t diagnosztikai célokra szintén fel lehet használni. Az RFKBP-t például rá lehet vinni szilárd hordozóra különböző olyan kémiai kapcsolási technikákkal, amelyek az inért mátrixhoz — ilyen az Affigel (BioRad) vagy a bróm-ciánnal kezelt Sepharose (Pharmacia) — kapcsolnak olyan aminosav csoportokat, mint a metionin, lizin, cisztein és triptofán. Az RFKBP-t hordozó szilárd hordozót ezután összehozzuk olyan egyénektől származó szövetkivonatokkal vagy testfolyadékokkal — mint a vér és vizelet — akik FK506 immunszuppresszív kezelést kaptak. A beadott FK506 vegyület vagy metabolitjai kimutatását és/vagy mennyiségi mérését ismert módszerekkel végezhetjük el, például spektrofotometriás méréssel vagy szcintillációs számlálással.
Az RFKBP-t olyan természetes intracelluláris FK506-szerű molekulák (és más olyan molekulák, melyek immunszuppresszív-szerű aktivitást fejtenek ki) azonosítására is fel lehet használni, amelyek a celluláris immunitásban és metabolizmusban végbemenő belső szabályozási folyamatokban működnek. Az RFKBP ezenkívül felhasználható olyan természetes intracelluláris anyagok azonosítására, amelyek más új immunszuppresszív szerek célvegyületei lehetnek.
Végül az RFKBP-t úgy is módosíthatjuk, hogy erősítjük kötőképességét és/vagy immunszuppresszív tulajdonságait. Az ilyen módosításokat (például csonkíthatjuk a szekvencia hosszát) ismert módszerekkel végezhetjük el, ilyen például a helyre irányuló mutagenezis.
A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük. E példákkal azonban nem kívánjuk korlátozni a találmány oltalmi körét.
1. példa:
A bRFKBP tisztítása.
Fretz és munkatársai leírása szerint [H.Fretz et al., J.Am.
Chem.Soc., 113, 1409-1411 (1991)] előállítottuk az FK506 egy amino-származékát — a C32 pozícióban — majd Affigel 10 gyantára kötöttük, hogy egy FK506 affinitás mátrixhoz jussunk (a gyanta 1 ml-e körülbelül 1 mg FK506-ot kötött meg). Marha tímusz citoszol kivonatot készítettünk a következőképpen: a szövetet folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottuk, ebből 75 g-nyit 1 mM PMSF-et és 5 mM DTT-t tartalmazó 100 mM kálium-foszfát oldatban, Waring homogenizátorban homogenizáltunk 60 másodpercig (PMSF = fenil-metil-szulfonil-fluorid; DTT = ditiotreitol). A kivonatot először 20.000 ford/perc mellett, ezután 100.000 ford/perc mellett centrifugálással derítettük. A citoszol kivonatot ezután egy 5 ml-es FK506 affinitás oszlopra vittük, és 0,2 ml/perc átfolyási sebességet alkalmaztunk. Az oszlopot 0,1 % Tween detergens tartalmú foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal (PBS) alaposan átmostuk, majd FK506-tal (200 μg/ml foszfát puffer) és ezután 6 M guanidin-hidrokloriddal eluáltuk. A leoldódott proteineket 10 mM trisz oldattal (pH=7,0) szemben teljesen kidializáltuk, és a dializátumot egyenlő részekre elosztva liofilizáltuk. SDS-PAGE analízissel kimutattuk, hogy az FK506 mátrix számos proteint viszf szatartott, amelyeket az FK506 ezután oldatba vitt.
2. példa:
A bRFKBP enzimes tulajdonságainak meghatározása.
Az enzimes tulajdonságok meghatározása céljából az FK506
X ·· *> · • 9 9 ··· • ···» · · »·· · »» • 99 • · ·· ··· * mátrixról leoldott proteineket reverz típusú HPLC-vel, C4 oszlopon (Vydac) választottuk el. Az RFKBP homogenitását SDS-PAGE módszerrel és N-terminális aminosav szekvenálással határoztuk meg. A prolii cisz-transz izomeráz aktivitást a Fisher és munkatársai által leírt vizsgálattal határoztuk meg, amikoris szubsztrátumként szukcinil-Ala-Leu-Pro-Phe-p-nitro-anilint használtunk [B.Fisher et al., Natúré, 337, 476-478 (1989)]. Egy tipikus kinetikai kísérletet végeztünk 1,0 ml végtérfogatban 100 mM trisz (pH=7,8) oldatban, 15°C-on. Enzim és szubsztrátum koncentrációk: izomeráz: 5-20 nM; kimotripszin: 100 μg/ml; peptidil szubsztrátum: 30 μΜ. A reakció lefolyását egy HP Model 8452A Diódé Array spektrofotométerrel ellenőriztük, 405 nm-es 5 percen át mért abszorpció változásokkal. Meghatároztuk az elsőrendű reakciósebességi állandókat, és a Kj_ értékeket a FITKIN (P.Kuzmic, Wisconsin Egyetem) adat analizáló programmal számítottuk ki. Az eredményeket az 1-4. táblázatok tartalmazzák. Az 1. és a 2. táblázat a bRFKBP peptidil prolii cisz-transz izomeráz aktivitásának specifikus aktivitását tartalmazza különböző peptid szubsztrátumok mellett. A 3. és 4. táblázat cisz-transz prolii izomeráz aktivitásokat tartalmaz, valamint Kj_ értékeket. FK506 esetén a Kj_ értéke 180, illetve 38 nM, rapamicin esetén 6,3, illetve 3,6 nM. A Kj_ értékek szerint jelentős a különbség az FK506 és a rapamicin f
kötési preferenciája között. Ezzel szemben az FKBP12 értéke FK506-tal 0,4 és 0,5 nM, rapamicinnel 0,2 és 0,25 nM. Ugyanezeket a vizsgálatokat alkalmazhatjuk a hRFKBP specificitásának a meghatározására.
♦χ :
• 49 • · ·· *·· ·
1. táblázat
A bRFKBP, FKBP12 és a ciklofilin peptidil-prolil cisz-transz izomerázok összehasonlítása Suc-Ala-Xaa-Pro-Phe-p-nitro-anilin szekvenciájú szubsztrátumok használatával.
RFKBP1 FKBP121 Ciklofilin2
Szubsztrátum Tétel 1 Tétel 2
ALPF 7,2 + 2,8 2,6 2,7
ALPF 0,66 0,620 1,39
ALPF 0,44 0,028 0,92
AVPF 0,17 0,170 3,18
AAPF 0,05 0,053 3, 18
^cat/^m x 106 (M_1s“ 4)
115°C-on meghatározva
210°C-on meghatározva
2. táblázat
Az FKBP12 és a bRFKBP peptidil prolii cisz-transz izomeráz specificitása a Suc-Ala-Xaa-Phe-p-NA szubsztrátumokkal szemben.
M 4s -1 15° C-on)
Xaa FKBP12 bRFKBP
Leu 4,33 x 106 2,08 X 106
Phe 2,17 X ΙΟ8 ’ 6,65 X 105
Val 9, 17 X 105 9,24 X 104
Alá 3,17 X 105 1, 10 X 105
Lys 1,60 X 105 4,20 X 105
Gly 3, 50 X 103 9,28 X 103 (becsült)
1, 56 X 104 (becsült)
• · ·
3. táblázat
A bRFKBP, FKBP12 és a ciklofilin cisz-transz prolii izomeráz aktivitásának rapamicinnel, FK506-tal és ciklosporin A-val történő gátlását kifejező IC50 értékének összehasonlítása.
(IC = inhibitory concentration = gátló koncentráció)
Inhibitor RFKBP FKBP12 Ciklofilin
Rapamicin 6,3 nM 0,2 nM NG*
FK506 180 nM 0,4 nM NG
Ciklosporin A NG NG 2,0 nM
*NG = 420 nM koncentrációnál nem gátol.
4. táblázat
Az FKBP12 és a bRFKBP peptidil prolii cisz-transz izomeráz aktivitásának gátlása FK506-tal és rapamicinnel.
(Kj nM-ban kifejezve; 15°C-on)
Inhibitor FKBP12 bRFKBP bRFKBP/FKBP hányados
FK506 0,5 38 80
Rapamicin 0,25 3,6 14
3. példa f
A hRFKBP cDNS klónozása.
Két degenerált oligonukleotidot (8.sz., illetve 9.sz. szekvencia) terveztünk az előzőleg meghatározott bRFKBP szekvencia alapján, melyet egy Applied Biosystems féle 380A DNS szintetizá19 ·ί· **!* ’ ‘ · · ·· torral szintetizáltunk. A degenerált oligonukleotidokat printerekként használtuk fel polimeráz lánc reakcióban (PCR) (Mullis és Faloona, 1987). Egy gtll humán tímusz cDNS tárból (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA., USA) — miután a fágot 80°Con 20 percig lizáltuk — származó egy körülbelül 270 bp méretű fragmentumot amplifikáltunk. A fragmentumot a TA Cloning pCR vektorba (Invitrogen, San Diego, CA., USA) szubklónoztuk, majd 11 potenciálisan rekombináns telepet szúrtunk ki, amelyeket egy éjszakán át kanamicint (50 mg/ml) tartalmazó és X-gal-lal (50 mg/ml-es oldatból 30 ml) bekent LB lemezeken tenyésztettünk.
Minden egyes telepet kanamicin tartalmú 5 ml Luria levesbe (Luria Broth=LB) oltottunk, és a tenyészeteket egy éjszakán át 37°C hagytuk növekedni.
Minden tenyészetből DNS-t tisztítottunk Quiagen tip-20 oszlop használatával, a gyártó cég (Quiagen, Inc., Chatsworth, CA., USA) előírásai szerint. Az egyes inszertumok nukleotid szekvenciáját didezoxi módszerrel (Sanger et al., 1977) Sequenase Version 2.0 kit (United States Biochemical, Cleveland, OH., USA) segítségével határoztuk meg. Szekvenáltunk három olyan oligonukleotid prímért, amelyek a vektor klónozó helyéhez közel hibridizáltak. A primerek közül kettő, az M13 reverse és az M13 forward kereskedelemben kapható: a harmadik prímért (lO.sz.
r szekvencia) a vektor szekvencia alapján szintetizáltuk úgy, hogy ez a klónozó helytől távolabb hibridizáljon, mint az M13 forward primer.
Három klón tartalmazott olyan DNS inszertumot, amelyekben a
DNS szekvenciák megfeleltek az ismert peptidszekvenciáknak. Az
egyik rekombináns klón EcoRI és Hindin endonukleázzal (New England Biolabs, Beverly, MA., USA) emésztettük, és az inszertumot 2 %-os NuSieve GTG alacsony olvadási hőmérsékletű agaróz horizontális gélben /FMC Bioproducts, Rockland, ME., USA) tisztítottuk. A tisztított DNS fragmentumot 32P-vel jeleztük, egy kereskedelmi oligojelző kit (Pharmacia-LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ., USA) segítségével. A jelzett fragmentumot használtuk a /t<Jtll humán tímusz cDNS tár szigorúan meghatározott körülmények közötti szűrésére (Sambrook et al., 1989). Egy pozitív kiónt szelektáltunk, melyet két további szűréssel újból tisztítottunk.
A körülbelül 600 bp méretű inszertumot PCR-rel szokszoroztuk, felhasználva a Agtll forward és reverse primereket (New England Biolabs), majd szekvenáláshoz a TA Cloning pCR vektorba szubklónoztuk. A nukleotid szekvencia vizsgálatából kitűnt, hogy nem volt stop kodon az ismert nyílt leolvasási keretben, ami azt mutatja, hogy a cDNS 3'-vége nem volt teljes. A cDNS inszertumot 32P-vel jeleztük, és egy humán placenta eredetű cDNS /\.ZapII gyűjtemény (Stratagene, La Jolla, CA., USA) szondázására használtuk szigorúan meghatározott körülmények mellett. Huszonkét kezdeti pozitív kiónból nyolcat újra szűrtünk, és két klónból kimetszettük az inszertumokat az előállító cég által ajánlott technológia szerint. A klónozott inszertumok teljes DNS szekvenciáját Sequenase Version 2.0 kit segítségével határoztuk meg. Mindegyik inszertum egy körülbelül 16 kD tömegű proteint határoz meg, amely a kémiailag meghatározott peptid szekvenciának felel meg.
4. példa:
A hRFKBP DNS szekvenciájának meghatározása.
Egy teljes hosszúságú, hRFKBP-t (2. ábra) kódoló cDNS-t izoláltunk humán placenta eredetű cDNS gyűjteményből, ahogyan ezt a 3. példában leírtuk. E cDNS 562 bp hosszú szekvenciája (6.sz. szekvencia) 426 nukleotidból álló nyílt leolvasási keretet tartalmaz, amely az ATC iniciációs kodonnál kezdődik, és a TAA kodonnál végződik. A nyílt leolvasási keretet 30 bp hosszú 5' nem transzlatált szekvencia és 106 bp hosszú 3' nem transzlatált szekvencia határolja.
5. példa:
A hRFKBP levezetett aminosavszekvenciája.
A humán placentáris RFKBP kikövetkeztetett aminosavszekvenciáj a egy 142 csoportból álló proteint (7.sz. szekvencia) határoz meg, melynek előrelátható molekulatömege 15.700. Az első 22 N-terminális csoport nincs jelen a természetből izolált marha tímusz proteinben. Ez a feltételezett vezér- vagy szignál-szekvencia leszakad, és ekkor egy 120 csoportból álló érett protein keletkezik, melynek előrelátható molekulatömege 13.200. A hRFKBP levezetett aminosavszekvenciája és a bovin tímusz RFKBP kémiailag meghatározott szekvenciája egymással homológ, kivéve, hogy a harmadik aminosav a hRFKBP-ben alanin, a bRFKBP-ben viszont treonin.
A következőkben megadjuk a leírás során említett 1-10.számú szekvenciák jellemzőit és részletes leírását.
1.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 119 aminosavmaradék
b) típus: aminosavszekvencia
d) topológia: lineáris
ii) Molekulatípus: protein xi) A szekvencia leírása:
Thr 1 Ile Pro Gin Leu 5 Asp Gly Leu Gin Ile 10 Glu Val Gin Gin Glu 15 Gly
Gin Gly Thr Arg Glu Thr Arg Arg Gly Asp Asn Val Asp Val His Tyr
20 25 30
Lys Gly Val Leu Thr Ser Gly Lys Lys Phe Asp Alá Ser Tyr Asp Arg
35 40 45
Gly Glu Pro Leu Asn Phe Thr Val Gly Gin Gly Gin Val Ile Lys Gly
50 55 60
Trp Asp Glu Gly Leu Leu Gly Met Lys Ile Gly Glu Lys Arg Lys Leu
65 70 75 80
Thr Ile Alá Pro His Leu Alá Tyr Gly Asn Arg Alá Val Gly Gly Ile
85 90 95
Ile Pro Alá Asn Ser Thr Leu Ile Phe Glu Thr Glu Leu Val Gly Ile
100 105 110
Lys Gly Val Gin Lys Gly Glu
115
2.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 107 aminosavmaradék
b) típus: aminosavszekvencia
d) topológia: lineáris
ii) Molekulatípus: protein xi) A szekvencia leírása:
Gly 1 Val Gin Val Glu 5 Thr Ile Ser Pro Gly 10 Asp Gly Arg Thr Phe 15 Pro
Lys Arg Gly Gin Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gin Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Alá
50 55 60
Gin Met Ser Val Gly Gin Arg Alá Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Alá Tyr Gly Alá Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Alá Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
3.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 107 aminosavmaradék
b) típus: aminosavszekvencia
d) topológia: lineáris
ü) Molekulatípus: protein
xi) A : szekvencia leírása:
Gly 1 Val Gin Val Glu 5 Thr Ile Ser
Lys Arg Gly Gin 20 Thr Cys Val Val
Gly Lys Lys 35 Phe Asp Ser Ser t Arg 40
Val Leu 50 Gly Lys Gin Glu Val 55 Ile
Gin 65 Met Ser Val Gly Gin 70 Arg Alá
Alá Tyr Gly Alá Thr 85 Gly His Pro
Leu Ile Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu
100 105
Pro Gly 10 Asp Gly Arg Thr Phe 15 Pro
His 25 Tyr Thr Gly Met Leu 30 Glu Asp
Asp Arg Asn Lys Pro 45 Phe Lys Phe
Arg Gly Trp Glu 60 Glu Gly Val Alá
Lys Leu Thr 75 Ile Ser Pro Asp Tyr 80
Gly Ile 90 Ile Pro Pro His Alá 95 Thr
• ·
4.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 113 aminosavmaradék
b) típus: aminosavszekvencia
d) topológia: lineáris
ii) Molekulatípus: protein xi) A szekvencia leírása:
Ser 1 Glu Val Ile Glu Gly 5 Asn val Lys Ile 10 Asp Arg Ile Ser Pro 15 Gly
Asp Gly Alá Thr Phe Pro Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Ile His Tyr
20 25 30
Thr Gly Thr Leu Glu Asn Gly Gin Lys Phe Asp Ser Ser Val Asp Arg
35 40 45
Gly Ser Pro Phe Gin Cys Asn Ile Gly Val Gly Gin Val Ile Lys Gly
50 55 60
Trp Asp Val Gly Ile Pro Lys Leu Ser Val Gly Glu Lys Alá Arg Leu
65 70 75 80
Thr Ile Pro Gly Pro Tyr Alá Tyr Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Leu
85 90 95
Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Val
100 105 110
Asn
5.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 99 aminosavmaradék
b) típus: aminosavszekvencia
d) topológia: lineáris
ii) Molekulatípus: protein xi) A szekvencia leírása:
• ·
Thr 1 Gly Thr Glu Gly 5 Lys Gly Lys Leu Gin 10 Ile Gly Val Lys Lys 15 Arg
Val Asp His Cys 20 Pro Ile Lys Ser Arg 25 Lys Gly Asp Val f Leu 30 HÍS Met
His Tyr Thr 35 Gly Lys Leu Glu Asp 40 Gly Thr Glu Phe Asp 45 Ser Ser Leu
Pro Gin 50 Asn Gin Pro Phe Val 55 Phe Ser Leu Gly Thr 60 Gly Gin Val Ile
Lys 65 Gly Trp Asp Gin Gly 70 Leu Leu Gly Met Cys 75 Glu Gly Glu Lys Arg 80
Lys Leu Val Ile Pro 85 Ser Glu Leu Gly Tyr 90 Gly Glu GArg Gly Alá Pro 95
Pro Lys Ile
6.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 562 bázispár
b) típus: nukleinsavszekvencia
c) szálasság: kettős
d) topológia: lineáris
ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) xi) A szekvencia leírása:
GTTGACTCCG GGTCCTGACA GGGCCGAGGG CACTGTCCCA GGGGAAGCTG AGCCCTTTGT CAGGGGCTGC ATCCGAGCTA GTGCAACCCT GAGCTGTAAC CCAGACTGTT
GGGGCGCGGC GTACTGTCCA CAAAAGGAAG TCAAATCGCG GAAGATGGGA CTTCTCCCTT TGGGGATGTG GGGTATGGAG GGTGTTCGAG CAGACTGGGG CCAAAAAAAA
GAGGAGAGAC TCTGCCTGAG CTGCAGATCG CAAAGGGGAT CAGfAGTTTGA GGCACAGGCC TGAGGGGGAA AGCGGGGAGC GTGGAGCTGC AGGGGCAGGG AACAAAAAAC
ATGAGGCTGA CGCCGTGGCC GGGTCAAGAA GTCCTGCACA CAGCAGCCTG AGGTCATCAA AAGCGCAAGC TCCCCCAAAG TCAAAATAGA GGAGAGGCCC AAAAACAAAC
GCTGGTTCCG ACGGCCACGG GCGGGTGGAC TGCACTACAC CCCCAGAACC GGGCTGGGAC TGGTGATCCC ATTCCAGGCG GCGACGAACT CCATCAGGGA AAAAAAACAC
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
TTAAAAGCCA AG
562
• · • ·· «
7.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 142 aminosavmaradék
b) típus: aminosavszekvencia
d) topológia: lineáris
ii) Molekulatípus: protein xi) A szekvencia leírása:
Met 1 Arg Leu Ser Trp 5 Phe Arg Val Leu Thr 10 Val Leu Ser Ile Cys 15 Leu
Ser Alá Val Alá Thr Alá Thr Gly Alá Glu Gly Lys Arg Lys Leu Gin
20 25 30
Ile Gly val Lys Lys Arg Val Asp His Cys Pro Ile Lys Ser Arg Lys
35 40 45
Gly Asp Val Leu His Met His Tyr Thr Gly Lys Leu Glu Asp Gly Thr
50 55 60
Glu Phe Asp Ser Ser Leu Pro Gin Asn Gin Pro Phe Val Phe Ser Leu
65 70 75 80
Gly Thr Gly Gin Val Ile Lys Gly Trp Asp Gin Gly Leu Leu Gly Met
85 90 95
Cys Glu Gly Glu Lys Arg Lys Leu Val Ile Pro Ser Glu Leu Gly Tyr
100 105 110
Gly Glu Arg Gly Alá Pro Pro Lys Ile Pro Gly Gly Alá Thr Leu Val
115 120 125
Phe Glu Val Glu Leu Leu Lys Ile Glu Arg Arg Thr Glu Leu
130 135 140
8.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 29 bázispár
b) típus: nukleinsavszekvencia
c) szálasság: egyes
d) topológia: lineáris
ix) jelleg:
a) b) c) d) név/kulcs: módosított bázis helyzet: 3 azonosítási módszer: kísérleti egyéb információk: /bizonyítás / módosított bázis = 1 = kísérleti
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 6
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis - 1
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 9
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 15
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 19
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) jelleg:
a) b) c) d) név/kulcs: módosított bázis helyzet: 21 azonosítási módszer: kísérleti egyéb információk: /bizonyítás / módosított bázis = 1 = kísérleti
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 27
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
xi) A szekvencia leírása:
ACNGGNACNG ARGGNAARNG NAARYTNCA
9.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 23 bázispár
b) típus: nukleinsavszekvencia
c) szálasság: egyes
d) topológia: lineáris
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 3
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 9
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) j elleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 12
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) j elleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 18
c) azonosításai módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1
ix) j elleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 19
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti
/ módosított bázis = 1 ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 20
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti / módosított bázis = 1 ix) jelleg:
a) név/kulcs: módosított bázis
b) helyzet: 21
c) azonosítási módszer: kísérleti
d) egyéb információk: /bizonyítás = kísérleti / módosított bázis = 1 xi) A szekvencia leírása:
TCNCCRTANC CNARZTCNNN NGG
10.számú szekvencia:
i) A szekvencia jellemzői:
a) hossz: 18 bázispár
b) típus: nukleinsavszekvencia
c) szálasság: egyes
d) topológia: lineáris xi) A szekvencia leírása:
CGATAATGCG GTCGACCG

Claims (19)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Emlős eredetű homogén protein, azzal jellemezve, hogy mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti az FK506-ot és a rapamicint, és nem köti a ciklosporin A-t.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti homogén protein, azzal jellemezve, hogy marha eredetű, és relatív molekulatömege 16.000.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti homogén protein, azzal jellemezve, hogy részben az 5.sz. aminosavszekvencia határozza meg.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti homogén protein, azzal jellemezve, hogy FK506 esetén Kj_ értéke körülbelül 38 nM, és rapamicin esetén Kj_ értéke körülbelül 3,6 nM.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti homogén protein, azzal jellemezve, hogy emberi eredetű, és relatív molekulatömege 13.200.
  6. 6. Emlős eredetű cDNS klón, azzal jellemezve, hogy a cDNS inszertumával hibridizáló egy DNS fragmentum szekvenciája olyan proteint kódol, amely mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti az FK506-ot és a rapamicint, és nem köti a ciklosporin A-t.
  7. 7. Emlős eredetű cDNS klón, azzal jellemezve, hogy a cDNS inszertumával hibridizáló DNS fragmentum szekvenciája (6.sz. szekvencia) egy az RFKBP-ben jelenlévő aminosavszekvenciát kódol.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti cDNS klón, azzal jellemezve, hogy cDNS inszertuma a 7.sz. aminosavszekvenciát kódolja.
  9. 9. Izolált DNS, azzal jellemezve, hogy a DNS, mellyel hibridizál, egy olyan proteint kódol, amely mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti az FK506~ot és a rapamicint, és nem köti a ciklosporin A-t.
  10. 10. Emlős eredetű izolált DNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy egy olyan proteint kódol, amely mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti az FK506-ot vagy a rapamicint, és nem köti a ciklosporin A-t.
  11. 11. Egy 10. igénypont szerinti izolált DNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy marha eredetű.
  12. 12. Egy 10 igénypont szerinti izolált DNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy emberi eredetű.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti izolált DNS szekvencia, azzal jellemezve, hogy a 6.sz. nukleotid szekvenciát tartalmazza.
  14. 14. DNS expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy DNS szekvenciája (6.sz. szekvencia) egy olyan emlős eredetű proteint kódol, amely mennyiségileg szignifikáns szelektivitással köti az FK506-ot vagy a rapamicint.
  15. 15. Egy 14. igénypont szerinti expressziós vektorral transzformált sejt.
  16. 16. Eljárás FK506-szerű anyagok azonosítására, azzal jellemezve, hogy a következő lépésekből áll:
    a) a vizsgálandó anyagot és a szilárd hordozóhoz kötött RFKBP-t összehozzuk;
    b) az a) lépés termékét olyan körülmények közé helyezzük, melyek az RFKBP kötéséhez és azokhoz az anyagokhoz, melyek az RFKBP-t kötik, megfelelőek; és
    c) meghatározzuk, hogy az RFKBP és az RFKBP-t kötő anyag között létrejött-e a b) lépésben a kötés, mely kötés egy FK506szerű anyag jelenlétére utal.
  17. 17. a 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, .: :
    • · • · · ··· · hogy az RFKBP-t úgy kötjük szilárd hordozóhoz, hogy kémiai kötést létesítünk egy aminosavmaradékkal.
  18. 18. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az FK506-szerű anyag nem rapamicin-szerű anyag.
  19. 19. Eljárás FK506 és FK506-szerű anyagok kimutatására biológiai mintákból, azzal jellemezve, hogy a következő lépéseket tartalmazza:
    a) a szilárd hordozóhoz kötött RFKBP-t összehozzuk a biológiai mintával;
    b) az a) lépés termékét olyan körülmények közé helyezzük, amelyek az RFKBP kötéséhez és azokhoz az anyagokhoz, melyek az RFKBP-t kötik, megfelelőek; és
    c) meghatározzuk, hogy az RFKBP és az RFKBP-t kötő anyag között létrejött-e a b) lépésben a kötés, amely kötés az FK506 jelenlétére utal.
HU9303164A 1991-05-08 1992-05-07 Rfkbp: a novel isomerase and papamycin/fk506 binding protein HUT70259A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69711391A 1991-05-08 1991-05-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9303164D0 HU9303164D0 (en) 1994-03-28
HUT70259A true HUT70259A (en) 1995-09-28

Family

ID=24799862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303164A HUT70259A (en) 1991-05-08 1992-05-07 Rfkbp: a novel isomerase and papamycin/fk506 binding protein

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0584217A1 (hu)
JP (1) JPH06510902A (hu)
AU (1) AU2007192A (hu)
CA (1) CA2102117A1 (hu)
FI (1) FI934901A (hu)
HU (1) HUT70259A (hu)
WO (1) WO1992019745A1 (hu)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993023548A2 (en) * 1992-05-20 1993-11-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated METHOD OF DETECTING TISSUE-SPECIFIC FK506 BINDING PROTEIN MESSENGER RNAs AND USES THEREOF
US5846981A (en) * 1993-05-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
US5798355A (en) * 1995-06-07 1998-08-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
US5482850A (en) * 1993-10-29 1996-01-09 New England Biolabs, Inc. Method for identifying anti-parasitic compounds
US5457182A (en) * 1994-02-15 1995-10-10 Merck & Co., Inc. FK-506 cytosolic binding protein, FKBP12.6
IL112873A (en) 1994-03-08 2005-03-20 Wyeth Corp Rapamycin-fkbp12 binding proteins, their isolation and their use
US5696135A (en) 1995-06-07 1997-12-09 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
US5859031A (en) * 1995-06-07 1999-01-12 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US5801197A (en) * 1995-10-31 1998-09-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
US5786378A (en) * 1996-09-25 1998-07-28 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioesters
US6218424B1 (en) 1996-09-25 2001-04-17 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic ketone and thioester compounds and uses
US5801187A (en) * 1996-09-25 1998-09-01 Gpi-Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters and amides
US5846979A (en) 1997-02-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic esters, amides, thioesters, and ketones
US6271244B1 (en) 1998-06-03 2001-08-07 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked urea or carbamate of heterocyclic thioester hair growth compositions and uses
US6274602B1 (en) 1998-06-03 2001-08-14 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioester and ketone hair growth compositions and uses
US5945441A (en) 1997-06-04 1999-08-31 Gpi Nil Holdings, Inc. Pyrrolidine carboxylate hair revitalizing agents
US6187796B1 (en) 1998-06-03 2001-02-13 Gpi Nil Holdings, Inc. Sulfone hair growth compositions and uses
US6187784B1 (en) 1998-06-03 2001-02-13 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivative hair growth compositions and uses
US6852496B1 (en) 1997-08-12 2005-02-08 Oregon Health And Science University Methods of screening for agents that promote nerve cell growth
US5968921A (en) * 1997-10-24 1999-10-19 Orgegon Health Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US6274617B1 (en) 1998-06-03 2001-08-14 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic ester and amide hair growth compositions and uses
US6172087B1 (en) 1998-06-03 2001-01-09 Gpi Nil Holding, Inc. N-oxide of heterocyclic ester, amide, thioester, or ketone hair growth compositions and uses
US6335348B1 (en) 1998-08-14 2002-01-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Nitrogen-containing linear and azepinyl/ compositions and uses for vision and memory disorders
US6333340B1 (en) 1998-08-14 2001-12-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule sulfonamides for vision and memory disorders
US6218423B1 (en) 1998-08-14 2001-04-17 Gpi Nil Holdings, Inc. Pyrrolidine derivatives for vision and memory disorders
US6395758B1 (en) 1998-08-14 2002-05-28 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule carbamates or ureas for vision and memory disorders
US6399648B1 (en) 1998-08-14 2002-06-04 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic ester, amide, thioester, or ketone for vision and memory disorders
US6384056B1 (en) 1998-08-14 2002-05-07 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioesters or ketones for vision and memory disorders
US6506788B1 (en) 1998-08-14 2003-01-14 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked urea or carbamate of heterocyclic thioesters for vision and memory disorders
US6337340B1 (en) 1998-08-14 2002-01-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Carboxylic acids and isosteres of heterocyclic ring compounds having multiple heteroatoms for vision and memory disorders
US6339101B1 (en) 1998-08-14 2002-01-15 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of N-heterocyclic carboxylic acids or isosteres for vision and memory disorders
US7338976B1 (en) 1998-08-14 2008-03-04 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters or amides for vision and memory disorders
US6376517B1 (en) 1998-08-14 2002-04-23 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivatives for vision and memory disorders
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
DE19907598A1 (de) * 1999-02-22 2000-08-24 Schulz Burkhard DNA Sequenz kodierend ein FKBP ähnliches Protein, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend dieses Protein sowie Mutanten in Arabidopsis für dieses Gen, die in der Ausprägung der Pflanzenarchitektur, der Reaktion gegenüber Brassinosteroiden und ihren Verbindungen und durch Ethylen vermittelten Gravitropismus der Wurzel defekt sind
US6734211B1 (en) 1999-07-09 2004-05-11 Oregon Health & Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US20050186577A1 (en) 2004-02-20 2005-08-25 Yixin Wang Breast cancer prognostics
US8021849B2 (en) 2004-11-05 2011-09-20 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Methods and kits for the determination of sirolimus in a sample
US7189582B2 (en) 2005-04-27 2007-03-13 Dade Behring Inc. Compositions and methods for detection of sirolimus
US7883855B2 (en) 2006-07-21 2011-02-08 Abbott Laboratories Immunosuppressant drug extraction reagent for immunoassays
WO2008082984A2 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Non-denaturing lysis reagent for use with capture-in-solution immunoassay
US7914999B2 (en) 2006-12-29 2011-03-29 Abbott Laboratories Non-denaturing lysis reagent
JP5450092B2 (ja) 2006-12-29 2014-03-26 アボット・ラボラトリーズ 全血中の分子または薬物の検出のための診断検査
WO2008082982A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Abbott Laboratories Improved assay for immunosuppressant drugs

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68929334T2 (de) * 1988-06-23 2005-08-18 Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth Verfahren zumm Assay von Endotoxin-Konzentration
EP0379342B1 (en) * 1989-01-19 1994-10-05 Merck & Co. Inc. New FK-506 cytosolic binding protein
WO1991004321A1 (en) * 1989-09-25 1991-04-04 President And Fellows Of Harvard College Receptor for fk-506

Also Published As

Publication number Publication date
JPH06510902A (ja) 1994-12-08
WO1992019745A1 (en) 1992-11-12
FI934901A0 (fi) 1993-11-05
AU2007192A (en) 1992-12-21
HU9303164D0 (en) 1994-03-28
FI934901A (fi) 1993-11-05
EP0584217A1 (en) 1994-03-02
CA2102117A1 (en) 1992-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT70259A (en) Rfkbp: a novel isomerase and papamycin/fk506 binding protein
Tropschug et al. Isolation and sequence of an FK506-binding protein from N. crassa which catalyses protein folding
US6713607B2 (en) Effector proteins of Rapamycin
US5457182A (en) FK-506 cytosolic binding protein, FKBP12.6
WO1993007269A1 (en) ISOLATION OF AN Mr 52,000 FK506 BINDING PROTEIN AND MOLECULAR CLONING OF A CORRESPONDING HUMAN cDNA
CA2050300C (en) Tnf-inhibiting proteins and the preparation thereof
EP0654530A2 (en) Ubiquitin carrier enzyme E2-F1, purification, production and use
US5525523A (en) Binding method for FK-506- and rapamycin-like drugs with a novel immunophilin
US5447852A (en) DNA encoding cyclophilin C, and recombinant methods employing it
US5763590A (en) Isolation of an Mr 52,000 FK506 binding protein and molecular cloning of a corresponding human cDNA
US20100055715A1 (en) Nucleic and amino acid sequences of prokaryotic ubiquitin-like protein and methods of use thereof
JPH11253173A (ja) 新規ヒスチジンキナーゼ
US6649395B1 (en) Tyrosine-containing cyclophilin and related methods
US7153947B2 (en) Ixodes salivary anticomplement protein
US7271005B2 (en) Modulation of bacterial membrane permeability
GB2279349A (en) Human FKBP-38 protein
AU775722B2 (en) Effector proteins of rapamycin
JP2004530411A (ja) 抗菌化合物の同定方法
JPH09173087A (ja) Ａｔｐおよび核酸に結合し、ヘリカーゼおよびａｔｐアーゼの性質を有すると推定される蛋白質
EP1109566A1 (en) Gcp
JPH08322576A (ja) プロテアソームアクチベーター
JP2002233365A (ja) クローンｈｗｈｈｊ２０
CA2612869A1 (en) Effector proteins of rapamycin
JPH11290083A (ja) 新規蛋白質

Legal Events

Date Code Title Description
DFA9 Temporary prot. cancelled due to abandonment