HUT67159A - Liposomal polysaccharide vaccines - Google Patents

Description

Jelen találmány tárgya eljárások és készítmények mukózai (nyálkahártya) immunválasz indukálására liposzómába zárt polichacharid antigénre.

Az intenzív ellátási lehetőségek, az egyre hatékonyabb antimikróbás szerek és a szigorú profilaktikus terápia ellenére a több szervet vagy szervrendszert érintő fertőzések maradtak legfőbb okai a késői morbiditásnak és mortalitásnak olyan immunoszupresszív történések után, mint pl. trauma, vérzés és égés. Becslések szerint a vérzés, tompa sérülés vagy termikus sérülés utáni 7 napon túl bekövetkezett halálozások 60-88 %-ának oka szepszis. A nosocomialis pneumonia gyakori sérülések után, és gyakran jár együtt több szervet érintő fertőzéssel, illetve morbiditással és mortalitással. Az összes súlyosan sérült beteg 30-70 %-ánál fejlődik ki légúti fertőzés az intenzív osztályon.

A szekretoros immunglobulin A a domináns immunglobulin a mukóza felszíneken, úgy a tüdőben, mint a bélben. A gyomor-bél traktus és a légutak nyálkahártyájában képződő mikroba antigén-specifikus slgA biztosítja a gazdaszervezet védelmét az ezeken az utakon behatoló patogén fertőzések ellen. A nyálkahártyához kapcsolódó fertőzések elleni védekezés leginkább az antigénspecifikus plazmasejtek számával és a nyálkahártya szekretoros antitest szintjével mutat összefüggést, nem pedig a szérum IgG antitest szinttel vagy a lép plazmasejt válaszaival.

Ezzel szemben az slgA szerepe csekély a gazdaszervezet szisztémásán invazív fertőzéseinek (mint pl. a bakteriaemia) * · · 'V leküzdésében.

A nyálkahártyával fedett helyeken (pl. a tüdő, a

Peyerplakkok és a bél lamina propriája) található

T és B sejtek egy általános nyálkahártya-immunrendszert képeznek, és a bakteriális fertőzés elleni védelem kritikus első vonalát alkotják. A mukóza B sejtjei, ellentétben a szisztémás B sejtekkel, elsődlegesen slgA-t termelnek, és a nyálkahártyában az antigén-specifikus antitest válaszok gyakran nem úgy zajlanak le, mint a szisztémás limfoid szervekben, mint pl. a lépben és a nyirokcsomókban. Az egy nyálkahártyáva1 bevont helyről származó slgA válaszok, pl. a bélhez kapcsolódó nyirokszövetből eljutnak más nyálkahártyáho z kapcsolódó limfoid helyekre, mint nyálmirigyek. Az slgA-t szekretáló kahártyával fedett szervek közötti pl. a tüdő, mandulák és plazmasejteknek a nyálezen migrációja képezi az alapját az orális és intranazális immunstratégiáknak, amelyek célja a tüdő immunitásának biztosítása a belélegzett kórokozók ellen. Jellemzően ezt a stratégiát használták fel Mestecky, J. Clin. Immunoi., 7:265, 1987: Liang és mtsai, J.

Immunoi.,

143:484, 1989 és Tamara és mtsai, Vaccine, 7:314,

1989 a vírusfertőzésekkel (pl.

influenzával) kapcsolatos protein-antigén ellenes oltások kifejlesztésénél, ahol a tüdő felszínéről származó fertőzésekkel szembeni megnövekedett ellenállás a tüdő vírusantigén-specifikus szektorok antitest termelésével és a B sejt válasz megnövekedésével jár együtt.

A protein-antigénre adott pulmonális mukóza-immunválasznak az alapszinthez képest több, mint százszorosára • · ·

- 4 való növekedését a kérdéses antigén és egy adjuváns idézi elő, mint pl. a koleratoxin (Elsőn és mtsai, J. Immunoi, 132-2736, 1984), a a glutáraldehiddel dezaktivált koleratoxin (Liang és mtsai, J. Immunoi., 141:1495, 1988) kolera toxin B alegysége (McKenzie és mtsai, J. Immunoi., 133:1818, 1984) és az antigén liposzómába zárt formában való orális vagy intranazális adagolása. Idáig azonban nem közöltek sikereket a bakteriális poliszacharid antigének és adjuvánsok kombinációjával való immunizálásnak sem orális sem intranazális formájával kapcsolatban.

A koleratoxinból származó termékek mint adjuvánsok hatásmechanizmusa úgy tűnik, hogy a koleratoxin B alegységnek a GMJ sejtfelszíni gangliozidokhoz való affinitásán alapszik.

A koleratoxin

B alegység ezen tulajdonsága megnöveli a mukóza sejtekhez

antigének felszabadulását kezdetben egy lokális, majd később egy generalizált mukóza IgA válasszal az illető antigénre. A dezaktivált koleratoxint és a koleratoxin B alegységét alkalmasnak tartották humán orális vakcinának, minthogy nincs szignifikáns toicitásuk. Pontosabban a koleratoxin B alegységét sikeresen használják humán és állati oltóanyagok részeként influenza- és kolera protein-antigének ellen. A liposzómák előnye nem mérgező tulajdonságuk. A liposzómákról kimutatták továbbá néhány rendszerben, hogy orális vagy intranazális alkalmazás esetén a nyálkahártya immunválaszával kapcsolatban immunvédekezést növelő tulajdonságuk van (Gregoriadis, Immunoi. Today, .11:89, 1990: van Rooijen és mtsai, Immunological Adjuvants and Vaccines, • ·

- 5 Gregoriadis, G. Allison, A.C. Poste G (szerkesztők) Plenum

Press, 95-106 oldalak, 1989: Pierce és mtsai, Infect.

Immunoi., 44.:469, 1984). A liposzómális hordozó rendszer potens adjuváns hatása az antigén jelenlétre úgy tűnik legalább részben annak köszönhető, hogy képesek egyesülni a sejtmembránnal, és így tartalmukat direkt módon az intracelluláris antigén-előállító rendszerhez juttatják.

Az immunszuppresszív kezelésben részesülő gazdaszervezet különösen fogékony fertőzésekre a nyálkahártya felszíneken.

Immunszuppressziót okozhat pl.

kemoterápia, trauma, égés és vérzés, különösen a traumás eredetű. A vérvesztés központi tényezője a kórélettani instabilitásnak, ami a sérülést követi, és növeli a fertőzésekkel szembeni fogékonyságot és mortalitást. Noha a vérveszteség nem eredményez változást a T vagy B sejt származékok abszolút vagy relatív számában (pl. CD3+, CD4+, CD8+, Ig+ vagy B220+) a lépben, nyirokcsomókban, csontvelőben, thymusban vagy a tüdőben, a T és B sejtek műküdésében széleskörű változásokat írnak le vérzést követően. A vérzés többszörös rendellenességet okoz az immunműködésekben, beleértve változásokat a citokinek (IL-1, IL-2, IL—3, IL—5, ^-IFN) felszabadulásában (Abraham és mtsai, Circ. Shock, 25:33, 1988: Abraham és mtsai, J. Immunoi., 142:899. 1989), a nitrogénindukált T sejt proliferáció csökkenést, az IL-2 receptor expresszivitás csökkenését (Abraham és mtsai, J. Immunoi., 142:899. 1989: Stephan és mtsai, Arch. Surg., 122:62. 1987) és változásokat a lép (Abraham és mtsai, Cell. Immunoi., 122:208. 1989), a « « bélrendszer (Abraham és mtsai, Cell Immunoi., 128:165, 1990) és tüdő (Robinson és mtsai, J. Immunoi., 145:3734. 1990) B sejt készletében.

Vizsgálatokkal kimutatták a fertőzésekre való fogékonyság növekedését vérzést követően (Esrig és mtsai, Rév. Surg. , .33.:431, 1976, Stepha és mtsai, Arch. Surg. 122:62. 1987). Sajnos ezen vizsgálatok eredményeit nehéz értékelni, mert a vérvesztéses modellek túlságosan immunoszuppresszívek voltak, még akkor is, ha nem történt vérelvonás, és a létrehozott infekció nem állt szoros összefüggésben a klinikumban tapasztalttal. Részletesebben, a korábbiakban ismertetett vérvesztéses modelleknél a hosszabb időre elaltatott állatoknál arteriális katéter bekötés történt, így ezek az állati modellek még vérelvonás nélkül is a mitogén-indukálta limfocita proliferáció (Stephan és mtsai, Arch. Surg., 122:62, 1987), gyulladásos válasz (Abraham és mtsai, Arch. Surg., 119:1154, 1984), csakúgy mint az IL-1 (Ayala és mtsai, Immunology, 70:33, 1990) és az IL-2 (Stephan és mtsai, Surg. Fórum, 37:73, 1986) 70 %-os csökkenését mutatták.

A nyálkahártya felületek, így a légutak és a bélrendszer mukóza felszínének fertőzését előidéző patogén organizmusok közül sok a baktérium, amelyeknél gyakran egy poliszacharid a legkívánatosabb antigén az immunvédekezés szempontjából. Sajnálatosan a poliszacharid antigének általában kevéssé immunogének, még ha szisztémásán alkalmazzuk is őket (Schreiber és mtsai, J. Immunoi., 146:188, 1991). Ez különösen akkor van így, ha a gazdaszervezet immunitása sérült. A szisztémás immunválasz megnövelését a poliszacharid antigénre vonatkozóan elérhetjük azoknak protein vivőanyagokhoz és adjuvánsokhoz való kötésével, vagy antiidiotípus beavatkozás révén (Schreiber és mtsai, J. Immunoi, 144:1023. 1990). Ezzel szemben kevés információ áll rendelkezésre a bakteriális poliszacharidokkal való immunizálásnak a nyálkahártya antigén-specifikus immunválaszára gyakorolt hatásával kapcsolatban. Korábbi vizsgálatok szerint (Abraham és mtsai, Vaccine, In press) ha levánt vagy Pseudomonas aeruginosa 1. típusú poliszacharidját alkalmazták mint bakteriális poliszacharid antigéneket orális immunizálásra adjuvánsként a kolera toxinnal együtt, akkor ez antigén-specifikus tüdő slgA titer emelkedést idézett elő. Azonban nagy mennyiségű (azaz 1 mg) antigén valamint egy toxikus adjuváns alkalmazása volt szükséges a tüdő plazmasejt válaszának kiváltásához.

Következésképpen igencsak szükség van egy olyan módszerre, amivel a mukózai felszíneket hatékonyan és nem-toxikusan immunizálhatjuk a különféle bakteriális fer tőzések ellen.

Jelen találmány egy ilyen eljárást nyújt egy bakteriális poliszacharid antigén és egy liposzómába záró hordozó kombinálásával.

Felismervén a patogén baktériumok szerepét a nyálkahártya fertőzésekben és a jelenlegi immunizálási technikák terápiás korlátáit, a feltalálók új oltóanyagokat állítottak elő és értékeltek azért, hogy az immunizálás egy hatékonyabb módját fejlesszék ki. Ezek a törekvések az

immunizálás egy olyan új módszerének kifejlesztésében összegeződtek, amely különösen hatékony olyan baktériumok ellen, amelyek a mukózai felszíneken keresztül fertőznek vagy árasztják el a gazdaszervezetet.

Ezt a módszert olyan készítmények felhasználásával fejlesztették ki, amelyek egy liposzómába zárt bakteriális poliszacharid antigént tartalmaznak. Meglepő módon ezek a készítmények és ez az eljárás képessé teszi a gazdaszervezetet arra, hogy egy szignifikáns antigénspecifikus szekretoros immunválaszt nyújtson a liposzómába zárt bakteriális poliszacharida antigén ellen, míg az oltóanyag elleni reakciók minimalizálódnak.

A jelen találmány szerinti eljárás tovább fejleszthető az itt ismertetésre kerülő új liposzómális készítmények felhasználásával. Ezek a készítmények egy liposzómába zárt bakteriális poliszacharid antigént, továbbá egy adjuvánst tartalmaznak. Az adjuváns lehet az antigén része, beépülhet a liposzóma membránjába, vagy lehet mindkettő.

Az ábrák leírása

1. ábra Intranazálisan 38 mg levánt tartalmazó liposzómákkal immunizált egerek anti-leván slgA titerei tüdő-mosófolyadékban. Az egereket a feltüntetett időpontban immunizáltak, 30 %-os vértérfogatveszteséget, majd 1 órával későbbi újraélesztést követően. A kontroll (C) egereket 3 nappal éternarkózisban végzett szívpunkció után immunizáltuk, de nem vettünk vért tőlük. Az eredményeket mint OÜ45o±SEM tüntettük fel a hígitatlan mosófolyadék minták esetén, míg maximális OD-t találtunk következetesen, ha a ·

mintákat hígítás nélkül vizsgáltuk (*p<0,05 a kontrollal szemben).

2. ábra A vérvesztés és újraélesztés hatásai a levánspecifikus tüdő-plazmasejtekre. Az egereket a feltüntetett időpontokban immunizáltuk 30 %-os vértérfogatvesztést, majd 1 órával későbbi újraélesztést követően. A kontroll (C) egereket 3 nappal az éternarkózisban végzett szívpunkció után immunizáltuk, de vért nem vettünk tőlük. Az eredményeket a tüdő-párokból az IgA termelő leván-specifikus és az ossz plazmasejt számmal +SEM tüntettük fel (*p<0,05 és p**<0,01 a kontrollal szemben).

3. ábra Intranazálisan 50 μ% 1 típusú Pseudomonas aeruginosa poliszachariddal (PsA) ill 25 μ% 1 típusú Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot és 0,21 μg (10 μg/kg) IL-2-t (PsA+IL-2) tartalmazó liposzómákkal immunizált vérvesztéses egerek túlélése. Az egereket két órával a vértérfogatuk 30 %-ának elvesztése után immunizáltuk, majd intratrachealisan 4 nappal a vérvesztést követően 5xl0⁷ cfu Pseudomonas aeruginosa 1-es Fischer-Delvin immunotípusával (159231-es vonal) fertőztük meg. Minden csoportba 11 állat tartozott. 10 nappal a tüdőgyulladás kiváltása után a Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot és IL-2-t tartalmazó liposzómákkal intranazálisan immunizált egerek mortalitása szignifikánsan kisebb (p<0,005) az üres liposzómákkal immunizált vagy a Pseudomonas aeurginosa poliszacharidot igen, de IL-2-t nem tartalmazó liposzómákkal immunizált állatcsoportokhoz képest.

A találmány előnyös kivitelezési módozatát az aláb • · · • · • · ♦ • · · ··« biakban részletesen ismertetjük.

A feltalálók készítményeket és eljárásokat fejlesztettek ki állatok immunizálására, melyekkel a mukóza immunválaszát váltják ki egy bakteriális poliszacharid antigénre, ezáltal jelentősen továbbfejleszteték azon korábbi eljárásokat, amelyek ilyen hatás megvalósítását célozzák. Jelen találmány felöleli a fentiek alkalmazását olyan állatok esetén, amelyek olyan fertőzéses megbetegedésben szenvednek, vagy annak kitettek, amely a fertőző ágens és a mukózafelület kontaktusa útján lépnek fel.

A jelen találmány szerint lipszómákat alkalmazunk a bakteriális poliszacharid antigén befogadására. Ha foszfolipideket vizes közegben finoman diszpergálunk, azok megduzzadnak, hidratálódnak és spontán multilamelláris koncentrikus kettősfalú hólyagokká (vesiculákká) alakulnak, melyeknél egy vizes közeg választ el két lipid réteget. Ezekre a rendszerekre mint multilamelláris liposzómákra vagy multilamelláris vesiculákra (MLV) hivatkoznak általában. Átmérőjük kb. 100 nm és 4 μιη között van. Ha az MLV-ket ultrahang éri, kis, kb. 20-50 nm átmérőjű unilamelláris vesiculák (SUV) képződnek, amelyek a belsejükben egy vizes oldatot tartalmaznak.

A liposzómakészítmény általában foszfolipidek, pontosabban magas átalakulási hőmérsékletű foszfolipidek és szteroidok, különösen koleszterok kombinációi általában. Más foszfolipidek vagy más lipidek is használhatok.

A liposzóma előállításra alkalmas lipidekre példák a foszfatidil vegyületek, mint pl. foszfatidil-glicerol, • · * · ·

- 11 foszfatidil-kolin, foszfatidil-szerin, foszfatidil-etanolamin, szfingolipidek, ceretrozidok és gangliozidok. Különösen alkalmasak a diacil-foszfatidil-glicerolok, amelyeknél a lipid csoport 14-18 szénatomszámú, leginkább 16-18 szénatomszámú és telített. Ezen foszfolipidek képviselői közé tartoznak a tojás foszfatidil-kolin, a dipalmitoil-foszfatidil-kolin és a disztearoil-foszfatidil-kolin.

A bakteriális poliszacharid antigént tartalmazó liposzómák előállításánál figyelembe kell venni az antigén liposzómába zárásának hatékonyságát, az antigén labilitását, a keletkezett liposzóma-populáció homogenitását és méreteit, az antigén-lipid arányt, a készítmény permeabilitását és instabilitását, valamint gyógyászatilag elfogadható voltát (Szoka és mtsai, Annual Reviews of Biophysics and Bioengineering, 9:467, 1980, Deamer és mtsai, Liposomes, Marcel Dekker, New York, 1983, 127; Hope és mtsai, Chem. Phys. Lipids, 40:1986).

A találmány különösen hasznos immunválasz kiváltására olyan állatban vagy emberben, akinek immunrendszere károsodott. Egy állat károsodott immunrendszerei alatt nem normál módon működő immunrendszert értünk. Egy állatnál az immunrendszer károsodását előidéző tényezők közé tartoznak például a kemoterápia, a besugárzás, az életkor és élettani traumák, melyeket eredményezhet sokk, súlyos vérveszteség vagy égés.

Számos mikroorganizmus, különösen a baktériumok a mukózai felszíneket használják fel a kezdeti behatolás ill. a fertőzés helyéül. A jelen találmány szerinti liposzómális ··

oltóanyag képes szekretoros immunválasz kiváltására a mukózai felszínen, hogy kompenzálja ezen különböző mikroorganizmusok patogén hatását. A mukózai immunrendszer különböző tagjainak kölcsönös kapcsolata miatt lehetséges az állatot az egyik mukózai felszínen beoltani, és ezzel egy más helyen egy szekretoros immunválaszt kiváltani. Ilyen szövetek, amelyek immunizálhatok és/vagy képesek szekretoros immunválasz produkálására, például a légtraktus, a gyomor-béltraktus, és a vizeletelvezető-traktus, továbbá a mirigyes szervek, mint pl. az emlőmirigyek, nyálmirigyek és könnyelvezető csatornák. így ki lehet váltani egy szekretoros immunválaszt egy gyomor-bélrendszerre patogén kórokozó ellen intranazális immunizálással. Másrészt ki lehet váltani szekretoros immunválaszt a légzőtraktusban a bél, azaz a Peyer plakkok vagy a lamina propria immunizálása révén.

A hatékony immunogén mennyiség a találmányban azt a poliszacharid antigén mennyiséget jelenti, amely szükséges ahhoz, hogy az állatot antitestek képzésére késztesse, amelyek a poliszacharid antigénen jelen lévő epitopokhoz kötődnek.

A találmány szerinti eljárás és készítmények különösen poliszacharid antigénekre való immunizálásra. Az ilyen különböző bakteriális polis^zcharid gének közé tartoznak azok, amelyek az Aerobacter, Kelbalkalmasak bakteriális siella, Proteus, Salmonella,

Shigella, Campylobacter,

Pseudomonas és Streptococcus fajokból, ill.

törzsekből származnak.

Különösen előnyösen alkalmazható a találmány a

Pseudomonas aeruginosa és a

Streptococcus pneumoniae • «

A·· törzsekből származó bakteriális poliszacharidok esetében. Ezek a bakteriális poliszacharid antigének származhatnak egy törzsből vagy szerotípusból vagy lehetnek polivalensek, azaz különböző szerotípusokból származó antigének csoportja. Egy polivalens bakteriális poliszacharid antigén keverék különösen hasznos olyan mikroorganizmusoknál, mint a Pseudomonas aeruginosa és a Streptococcus pneumoniae, ahol különböző szerotípusok szerepelnek a megbetegedés etiológiájában. A poliszacharid antigének különböző baktériumokból történő előállítási technikái ismertek a szakmában járatosak számára, ill. megismerhetők nem elvárható méretű kísérletek végzése nélkül.

A bakteriális poliszacharid antigént tartalmazó liposzóma készítmények tartalmazhatnak adjuvánst is. Az adjuvánsok olyan anyagok, amelyeket felhasználhatunk egy specifikus immunválasz nem specifikus megnövelésére. Általában az adjuvánst és az antigént az immunrednszerbe való juttatás előtt keverjük össze, vagy alkalmazhatjuk külön, de az immunizálandó állatban ugyanarra vánsokat alkotórészeik alapján több

Ezen csoportok közé tartoznak az

Freund-féle teljes és nem teljes a helyre. Az adjucsoportra oszthatjuk.

olaj-adjuvánsok (pl.

olaj-adjuvánsok), az ásványi sók (pl. A1K(SC>4)₂, AlNa(SO4)₂, ANH4(SO)4, szilika, alum, Al(0H)3, Ca3(PO4)₂, kaolin és szén), polinukleotidok (pl. poli- IC és poli- AU savak) és bizonyos természetes anyagok (pl. Mycobacterium tuberculosisból származó D-viasz, a koleratoxin B alegysége, glutáraldehiddel kezelt koleratoxin, valamint a Corynebacterium parvumban,

Bordetellea pertussisban és a Brucella nemzetség tagjaiban található anyagok).

Egyéb, a liposzómális készítményekbe beépíthető adjuvánsok közé tartoznak immunmodulátorok és más biológiai választ befolyásoló anyagok.

A biológiai immunválaszt befolyásoló anyag kifejezés olyan anyagokat takar, amelyek úgy befolyásolják az immunválaszt, hogy annak növekedését váltják ki poliszacharid antigénre. Biológiai választ befolyásoló anyagokra példák közé tartoznak a limfokinek, mint pl. az interleukinok, makrofág aktiváló faktorok, migráció gátló faktor, kolónia stimuláló faktorok és az interferonok. Előnyös interleukinok azok, amelyek direkt hatást gyakorolnak az in vitro B-sejt funkcióra, így a proliferációra, antitest képzésre vagy aktivitásra. Különösen előnyös a IL-2 és az IL-6. Más biológiai választ befolyásoló anyagok is ismertek vagy készen hozzáférhetők a szakmában járatosak számára.

A találmány szerinti liposzómális készítményeket is alakíthatjuk úgy, hogy egy adjuvánst a liposzóma membránjában tartalmazzanak. Előnyös ilyen vegyületek a lipoidális aminokként jellemzettek, melyeket Chang és mtsai fedeztek fel (Arthritis and Rheumatism, 2.1:169, 1978 és Chang és mtsai, Arthritis and Rheumatism, 23:62, 1980) és amelyek itt referenciaként szerepelnek. Különösen előnyös a lipoidális aminok közül az avridin (MN-dioktadecil-N¹, N¹-2-hidroximetil-propán-diamin). Az avridint tartalmazó liposzómák több antigént képesek magukba foglalni és az avridin jelenléte a liposzóma membránjában potenciálja a • ·

- 15 liposzóma adjuváns hatását úgy, hogy jelentősebb mukózai immunválasz érhető el az avridint tartalmazó liposzómákban alkalmazott antigén beadása után. Az avridint és bakteriális poliszacharidot tartalmazó liposzómákat a detergens dialízis technikával állíthatjuk elő Philippot és mtsai változata szerint (Biochem. Biophys. Acta, 734:137. 1983) úgy, hogy nagy unilamelláris liposzómákat nyerjünk, amelyek nagymennyiségű antigén befogadására képesek. A liposzómakészítmények más előállítási technikái, mint pl. a dehidrációs-rehidrációs eljárás (Kirby and Gregoriadis, Biotechnology, 2:979, 1984) ugyancsak magas arányt eredményez az antigén befogadás szempontjából.

A találmány szerint használatos adjuvánstól függetlenül az adjuváns jelen lehet magában a liposzómában, azaz lehet a poliszacharid antigén része, vagy lehet a liposzóma hólyag membránjában, vagy lehet mindkettőben. A szakterületen járatosak számára ismertek azok a technikák, amelyekkel az adjuváns a liposzómába (pl.

komplexet képezve a poliszacharid-antigénnel) vagy a liposzóma membránba zárható. Sok különböző technika létezik az immunizálás időzítésére, ha többszörös immunizálási rendet (protokollt) használunk. A találmány szerinti liposzóma készítményt egynél többször is használhatjuk, hogy növeljük a szekretoros immunválasz szintjét.

Általában egy állatnál alkalmazott poliszacharid antigén dózisa különböző lehet olyan tényezőktől függően, mint pl. kor, általános állapot, nem és ha van, a fertőzés mér téke és egyéb változók, amelyeket a szakterületen járatosak • •4«

- 16 figyelembe vesznek a megfelelő dózis kialakítása során.

Előnyös azonban legalább azokban az esetekben, amikor az állat egy immunoszuppresszív hatású trauma áldozata, mint pl. súlyos vérvesztés, az immunizálást 24-48 órán belül, előnyösen 24 órán belül végezni.

A találmány szerinti antigén készítményeket alkalmazhatjuk akár egyszeri, akár többszöri dózisban, és adagja 10 Mg/ml és 10000 vg/ml között változhat, előnyösen 50 Mg/ml és 5000 μg/ml antigén per dózis, legelőnyösebben 100 /xg/ml és 600 μg/ml antigén per dózis. Általában azok a dózisok előnyösek, amelyek a legmagasabb slgA (szekretoros immunválasz) szintet indukálják a bakteriális poliszacharid antigénre.

Ha egy a biológiai választ befolyásoló anyagot, mint amilyen pl. az interleukin, az antigénnel együtt tartalmaz a liposzóma, a biológiai választ befolyásoló anyag dózisa 0,001 μ9/ιη1 és 1000 μg/ml között változhat, előnyösen kb. 0,01 μg/Inl és 200 μg/ml között, legelőnyösebben kb. 0,05 μg/ml és 50 μg/ml között változik.

Most, hogy általánosságban ismertettük a találmányt, a következő specifikus példákon keresztül még teljesebb érthetőségre törekszünk. Ezek a példák csak illusztrálás céljára szolgálnak, nem pedig a találmány korlátozására, hacsak másképp nem jelezzük.

1. példa

A liposzómába zárt bakteriális poliszacharid antigének immunogenitásának vizsgálata

A vizsgálatokat 8-12 hetes hím BALB/C egereken (Jackson i - .··<.

*·· ·♦ « · · ·

Labs, Bar Harbor, ME) végeztük, hogy meghatározzuk a liposzómákba zárt bakteriális antigénre fellépő szekretoros immunválaszt.

A lipszómákat a detergens dialízis technikával állítottuk elő Philippot és mtsai szerint (Biochem Biophys Acta 734;137. 1983), hogy olyan nagyméretű unilamelláris liposzómákat kapjunk, amelyek nagymennyiségű antigén befogadására képesek. Koleszterolt, foszfatidil-szerint és foszfatidil-kolint (mindengyikból 8 μπιοί/ΐ) kevertünk össze N₂ alatt egy filmre szárítottuk őket, majd további 60 percre egy liofilizálóba helyeztük. A liposzómába zárandó bakteriális poliszacharidot 0,5 ml pufferben (150 mmol/1 NaCl, 10 mmol/1 HEPES (GIBCO), 2 mmol/1 EDTA, pH = 7,4) szuszpendáltuk, és hozzáadtuk a kiszárított lipidekhez. A liposzómákba való bejutás hatékonyságának vizsgálata céljából C¹⁴-gyel jelzett inulint (20 μΐ) adtunk a szuszpenzióhoz. 30 perc múlva 0,24 ml 1 mol/l-es oktil-glukozidot (Calbiochem) adtunk a lipid-antigén keverékhez és alaposan összeráztuk őket. A mintákat dializáló csövekbe helyeztük át (molekulatömeg-határ: 3500) és 100 ml 2,4 g SM-2 Biobeads-t (Biorad) tartalmazó pufferrel szemben dializáltuk. 24 óra múlva a liposzóma készítményt az A5M (Biorad) oszlopra tettük, és a liposzóma frakciót (a hiányzó térfogatban) összegyűjtöttük. A liposzómába jutás hatékonyságát a kezdeti lipid szuszpenzió és a végső liposzóma frakciók C¹⁴ beütéseinek összehasonlításával határoztuk meg. Általában kb. 40 %-os hatékonyságot (leván és 1. típusú Pseudomonas aeruginosa) és %-os hatékonyságot (Streptococcus

pneumoniae 3. típusú poliszacharid (PPS3)) állapítottunk meg. Az unilamelláris liposzómák átlagos mérete 995 + 80 nm volt, amit dinamikus lézerfény szóródás alapján meg Coulter NS4D műszerrel.

Az állatokat intranazálisan immunizáltuk 0,1 ml liposzóma szuszpenziónak az orrlyukakhoz juttatásával, melyet az állat inhalált. A vizsgált antigének az Aerobacter levanicusból (Sigma St. Louis, MO) származó leván (38 vg) a Pseudomonas aeruginosa 1. típusú poliszacharidja (33 μg) voltak.

A tüdő-mosófolyadékot a bronchoalveolaris mosófolyadékok összegyűjtésével nyertük, amelyet 0,5 ml foszfátpuffer (PBS)-szalina tracheába és tüdőbe történő háromszori injektálásával állítottunk elő. Általában kb. 0,4 ml végső térfogatot nyertünk. A mosófolyadékokat lecentrifugáltuk, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket, és -20 °C-on tároltuk a vizsgálatig.

A tüdő-mosófolyadék és a szérum bakteriális poliszacharid antigének elleni antitest képzését vizsgáltuk ELISA technikával (Portnoi és mtsai, Eur. J. Immunoi., 18:571, 1988). A 96 lyukú ELISA tányérokat (Costar, 3590, Cambridge, MA) egy éjszaka alatt 0,05 mol/l-es pH=8 értékű foszfát pufferben lévő 10 Mg/ml koncentrációjú antigénnel vontuk be. Miután a tányérokat PBS-sel mostuk, a lyukakat 1 % ovalbumint tartalmazó PBS-sel telítettük 30 percig 37 °C-on. További PBS-sel történő átmosás után 50 μΐ tüdő-mosófolyadékot vagy szérumot juttattunk az ELISA tányérokra kétszeres hígitási sorozatban, és a tányérokat 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Átmosás után minden lyukhoz peroxidázhoz kötött kecske antiegér antitestet adtunk. További 1 órás inkubálás után a megkötött antitestet H2°2“t és orto-fenil-diamint tartalmazó kromogénnel tettük láthatóvá. A reakciót 20 perc múlva 50 μg 10 %-os SDS-nek minden lyukba történő hozzáadásával állítottuk le, és az 0D-t 450 nm-en fotométerrel mértük (MR 600, Dynatech

Instruments,	Torrance, CA)	egy 410 nm-es korrekciós
szűrővel.
	1. táblázat
Kórokozó	Antigén	Csoportok

Kontroll Immunizált

Aerobacter

levanicus leván	0,046 +	0,017	0,126	+	0,023
Pseudomonas
aeruginosa 1. típus	0,255 +	0,061	0,660	+	0,051
Streptococcus
pneumoniae PPS 2	0,127 +	0,044	0,293	+	0,115
Az 1. táblázat	adatai	azt mutatják,	hogy a mukózai
immunrendszer útján	beoltott	állatok	az adott bakteriális

poliszacharid antigénre szignifikáns specifikus slgA titereket produkálnak, ha az antigén olyan vakcina formájában van jelen, amely a bakteriális poliszacharid antigént magába foglaló liposzómális vivőrendszert hasznosít.

2. példa

Károsodott immunrendszerű állatok immunizálása

A liposzómákba zárt bakteriális poliszacharid antigénnel történő immunizálás hatását vizsgáltuk károsodott immunrendszerű állatokon. Az immunrendszer károsodását egerekben az egér vérvesztéses modell szerint hoztuk létre (Abraham és mtsai, J. Immunoi., 142:899. 1989). Röviden, az egereket éter belélegeztetésével elaltattuk, miután egy fedett tartályba helyeztük őket. A szív punkcióját 30-as tűvel végeztük, és a számított vértérfogat 30 %-át (kb. 0,55 ml egy 20 g-os egérnél) szívtuk le 60 másodperces időtartam alatt. A vért egy fecskendőbe gyűjtöttük, amely 200 U heparint tartalmazott 0,1 ml térfogatban, majd 37 °C-on tartottuk egy órán át, míg az el nem altatott egérbe a retroorbitális plexusba adott injekcióval visszajuttattuk. Ezzel az eljárással lehetséges volt minden kivéreztetett egér életben tartása komplikáció nélkül. Ezután az egerek a ketrecükben lábadoztak. Az éter-narkózis teljes ideje minden esetben kevesebb volt 2 percnél. A mortalitási arány ezzel a vérzéses protokollal kb. 12 %, minden haláleset a vérzést követő 24 óra alatt következett be, legtöbbjük a vérvesztést követő 1 órán belül.

Ez a vérvesztéses modell az éteres narkózissal és szívpunkcióval₍ de vérelvonás nélkül nem eredményezett változást a mitogén-indukálta limfocita-proliferációban, az IL-2R termelésben, a B vagy T limfociták fenotípusos jellemzőiben (a CD3, CD4, CD8, B220, μ, Ly-1 termelésben), a limfokinek (IL-2, IL-3, IL-5, y~- IFN) felszabadulásában, vagy a lép-, bél- vagy tüdő-B sejt klón prekurzor frekvenciákban (Robinson és mtsai, J. Immunoi, 145:3734, 1990). Pontosab21 »··^β ·· ·· ·.

···.>’: ·'··· bán, az előzetes kísérleteknél nem találtunk változást a levánra, vagy a Pseudomonas aeruginosa 1. típusú poliszachariájára specifikus tüdő-B sejt klón prekurzorok számában vagy frekvenciájában azon egereknél, amelyeknél éternarkózis és szívpunkció történt, de vérvétel nem ((Robinson és mtsai, J. Immunoi, 145:3734, 1990) Hasonló módon haemothorax perikardiális résbe történő vérzés, tüdő vagy szív zúzódás jelenléte nem volt tapasztalható az ezt a véreztetéses eljárást túlélő egereknél (Abraham és mtsai, J.

Immunoi,

142:899,

1989). Az állatok kiválasztását, immunizálását és az ELISA technikákat az 1 példában leírtak szerint végeztük

Intraparenchimális tüdő-limfocitákat izoláltunk az előzőekben ismertetettek szerint (Abraham és mtsai,

J.

Immunoi, 144:2117. 1990).

Röviden, három egeret használtunk minden kísérlethez és a tüdő-sej teket analizálás céljára összegyűjtöttük. Miután az egeret nyaki diszlokáció útján megöltük, a mellkast feltártuk, és a tüdő érrendszerét átáramoItattuk 3-5 ml lehűtött (4 °C) PBS-nek a jobb kamrába való fecskendezésével

Ezután a tüdőket kimetszettük, kiterülve a trachea körüli nyirokcsomókat, és kétszer RPMI

1640-nel (GIBCO) átmostuk őket. A tüdőket finoman felvagdostuk, és a szövetdarabkákat RPMI 1640-be helyeztük, ami az alábbiakat tartalmazta: 5 % FSC (GIBCO), penicillin/streptomycin, 10 mmol/1 HEPES, 50 μιηοΐ/ΐ 2-ME (GIBCO), 20 mmol/1 L-glutamin (GIBCO), 20 I/ml kollagenáz (SIGMA) és 1 μg/ml DN-áz (SIGMA) . A 37 °C-on 60 percig történő inkubálást követően a fennmaradó ép szövetet egy 21

-es tűn való átnyomással roncsoltuk. A szövetdarabkákat és az elhalt sejtek nagy részét üveggyapot oszlopon történő gyors szűréssel távolítottuk el, és a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejtlabdát 4 ml 40 %os Percollban (Pharmacia, Uppsala, Svédország) szuszpendáltuk, és 4 ml 80 %-os Percollra szélesztettük. 600 g-vel 15 °C-on 20 percig tartó centrifugálás után a sejteket a belső felületről összegyűjtöttük, RPMI 1640-nel átmostuk és megszámoltuk. Életképességük következetesen nagyobb volt 98 %-nál tripan-blue kirázással meghatározva.

A tüdő teljes ill. leván-specifikus plazmasejtszámának mérése a Sedgwick és Holt (Sedgwick és mtsai, J. Immunoi. Methods, 57:301, 1983) által ismertetett technikához hasonló eljárással történt. Röviden, 96 lyukú laposfenekű ELISA tányérokat vontunk be éjszakai inkubálás során 4 °C-on 50 μΐ/lyuk 0,05 mol/l-es pH = 8-as kálium-foszfát pufferben lévő 10 Mg/ml koncentrációjú levánnal. Ezután a tányérokat PBS-sel mostuk át, és a lyukakat 1 % zselatint tartalmazó PBS-sel telítettük 1 órán át 37 °C-on. További PBS-sel való átmosás után a lyukakba immunizált vagy immunizálatlan egerekből származó intraparenchimális limfocitákat juttattunk glutamint, 2-ME-t, 10 mmol/1 HEPES-t, penicillint/ Streptomycint és 1 % FCS-t tartalmazó RPMI 100 μΐ-ében. A sejtszám/lyuk értéket 10²-10⁶ közötti értékre állítottuk be.

Ezután a tányérokat 37 °C-on 5 %-os C02~ben 5 órán keresztül inkubáltuk. A sejteket ütögetéssel távolítottuk el a tányérról, amit 0,05 % Tween 20 vizes oldatával végzett

lízis követett. 0,05 % Tween tartalmú PBS-sel való átmosás után biotinhoz kötött kecske antiegér teljes Ig-t adtunk a lyukakhoz 1 % zselatintartalmú PBS-ben, és a tányérokat éjszakára 4 °C-on hagytuk. Ezután a tányérokat PBS 0,05 % Tweennel átmostuk, streptavidint alkalin-foszfátázzál együtt adtunk a lyukakhoz. 37 °C-on 1 órán át tartó inkubálást követően a tányérokat átmostuk, és a jelző szubsztrátot, 2,3 mmol/1 5-bróm-4-klór-3-indoil-foszfátot (SIGMA, St. Louis, MO) 0,75 % agarózt tartalmazó 2-amino-2-metil-l-propanolban (SIGMA St. Louis, MO) oldva adtuk minden lyukhoz. 1-2 órás 37 °C-on végzett inkubálást követően a szekretáló sejtek kék foltokként előtűntek és így megszámlálhatókká váltak. A 2040 folt/lyukat termelő sejtek hígítását használtuk fel az antitest-specifikus B sejt/minta teljes számának kvantitatív meghatározására. Ezen vizsgálat érzékenysége és specificitása az antigén-gátlási tesztekben dokumentált, valamint az antigén-specifikus hibridoma sejtvonalakat

tartalmazó értekezésekben	(Klinman és	mtsai, J.	Immunoi.,
141:801, 1988, Sedowick	és	mtsai, J	. Immunoi.	Methods,
87:37, 1986).
A tüdőgyulladást	Dr.	Gerald	Piertől	(Harvard

University, Boston, MA) kapott Pseudomonas aeruginosa 15921 törzsének 1. immunotípusú Fisher-Devlin fajtájának felhasználásával idéztük elő. Miután a baktériumokat tripszines szója-agar tányérokra szélesztettük, hamarosan áttettük őket tripszines szója levesbe, és addig inkubáltuk 37 °C-on, amíg a 10⁹ cfu koncentrációt elértük. A baktériumokat lecentrifugáltuk, kétszer átmostuk lehűtött

PBS-sel, majd PBS-ben reszuszpendáltuk 5xl0⁸, 10⁸, 2xl0⁹ ill 3xlO⁹ cfu/ml koncentráció eléréséig. Az egereket 50 μg/kg intraperitoneálisan beadott pentobarbitállal altattuk el, függőleges helyzetben tartva őket 40 μΐ baktérium szuszpenziót juttattunk a tracheába a szájon keresztül bevezetett 22-es méretű tompa végű tűvel. Az egerek visszakerültek a ketreceibe, és szabadon vehettek magukhoz élelmet és vizet. A halálozást naponta kétszer figyeltük meg. Az egereket 7 napon át tartottuk megfigyelés alatt, de 5 nap után nem fordult elő halálozás.

Az antigén-specifikus tüdő slgA titereket és tüdőplazmasejteket vizsgáló kísérletekben 2 egércsoportot (minden csoport 3 egérből állt) vizsgáltunk az összes kísérleti feltételek között. Minden egér tüdőmosófolyadékából ELISA vizsgálatot végeztünk (azaz 6 mosófolyadékot vizsgáltunk az összes feltétel mellett). Az ELISA foltvizsgálat (spot assay) számára minden három egérből álló csoportból összegyűjtött tüdő-limfocitákat izoláltunk. Az antigén-specifikus plazmasejtek számát tüdőpáronként úgy számítottuk ki, hogy az antigén-specifikus foltok számát 10⁶ tüdő-limfocitánként (amit az ELISA foltvizsgálattal határoztunk meg) a tüdőpárokból izolált sejtek ossz számával szoroztuk be.

Az adatokat mint átlag + standard hiba (SEM) adjuk közre mindegyik kísérleti csoportnál. A csoportok átlagai közötti összehasonlítást 2 csoport közti eltérés esetén a Student t teszttel végezzük. Kettőnél több csoportot használó kísérletek esetén az eltérések vizsgálatára az eltérések • · ·

- 25 egyutas (one way) analízisét használjuk. A túlélési adatokat khi-négyzet és Fisher-féle Exact analízisekkel vizsgáltuk. A p értéket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha 0,05-nél kisebb volt.

A. Az intranazális immunizálás eredményei

Egy általános mukózai immunrendszer létezése miatt (Mestecky és mtsai, J. Clin. Immunoi., 7:265, 1987), ahol az egyik mukózai felszínen fellépő szekretoros antitest válaszok később más mukózarészeken is megtalálhatok, az egereket liposzómába zárt leván bakteriális poliszacharid antigén növekvő mennyiségeivel (1, 5, 10 és 38 Mg) immunizáltuk intranazálisan. Egy héttel később az állatokat leöltük, és a tüdőket a fent leírtak szerint átmostuk és a bakteriális antigén-specifikus slgA titereket ELISA-val vizsgáltuk. Izoláltuk továbbá a tüdő-limfocitákat és a tüdőpáronkénti bakteriális antigén-specifikus plazmasejtek 'Λ .

számát ELISA folt I vizsgálat felhasználásával megszámoltuk. Szérumot is vettünk, és az anti-leván titereket ELISA-val mértük.

Az immunizálatlan egerekben és az 1-10 Mg liposzómába zárt levánnal intranazálisan imunizált állatokban a tüdőiimfociták között nem találtunk leván-specif ikus plazmasejteket

Ezzel szemben 33 leván-specif ikus plazmasejt volt jelen tüdőpáronként

M9 leván tartalmú liposzómával történt intranazális immunizálást követően.

Hasonlóan a leván-specifikus slgA titerek növekedése csak a

Μ9 liposzómába zárt levánnal immunizált egerekben volt megtalálható. (OD₄5_O = 0,126 + 0,023), míg 0,046 + 0,017 az • · ··♦

- 26 immunizált egerekben). Az intranazálisan immunizált egerek bármely csoportjába a nem immunizált csoporthoz képest nem volt található eltérés a szérum antileván titerekben.

B. Vérvesztés hatásai a tüdő-plazmasejt válaszra

Azon célból, hogy a vérvesztés indukálta bakteriális antigénekre adott tüdő-szekretoros antitest válaszok immunszuppreszsziójának hatásait vizsgáljuk, az egerek vértérfogatának 30 %-át elvontuk, majd 1 óra elteltével visszaadtuk.

μg levánt tartalmazó liposzómákat alkalmaztunk intranazálisan a vérvesztést követően előre meghatározott időpontokban. Egy héttel az immunizálást követően tüdőmosó-folyadékokat és tüdő-limfocitákat gyűjtöttünk a levánspecifikus slgA titerek és a plazmasejt számok vizsgálatára. Szérumot is vettünk 1 héttel az immunizálást követően, és mértük az anti-leván titereket. E kísérletek eredményeit az 1. és 2. ábra mutatja.

A három nappal a vérvesztést követően immunizált egerek tüdő-mosófolyadékának anti-leván slgA titerei nem őőkülönböztek a normál vagy kontroll állatokéitól. Azonban a 7 vagy 14 nappal a vérvesztést követően immunizált egerekben az anti-leván slgA titerek szignifikánsan kisebbek voltak (1. ábra). Csökkent leván-specifikus tüdő-plazmasejtszám ugyancsak észlelhető volt de kinetikája valamelyest leván slgA titereiétől. A számában, mind a teljes termelésében több, mint 70 vérvesztés és újraélesztés után, eltért a tüdő-mosófolyadék antileván-specifikus plazmasejtek sejtszámban, mind az IgA %-os csökkenés volt jelen a vérvesztést követő 1-7 napokon, a vérvesztés előtti értékekhez való visszatérés 14 nappal a vérzés után következett be (2. ábra). Ha az immunizálás 3 nappal a vérvesztés után történt, nem volt található leván-specifikus plazmasejt.

A vérvesztés - inkább mint más komponensei a modellnek volt felelős a pulmonális plazmasejtek anti-leván válaszának változásaiért. Az egerek immunizálása 3 nappal az éternarkózist és vérleszívás nélküli szívpunkciót követően (kontroll) nem okozott szignifikáns változást sem

-mosófolyadékok anti-leván slgA titereiben (OD450 a tüdő0,115 +

0,009 a kontroliokban, míg 0,126 +

0,023 a normál csoportban) sem a leván-specifikus tüdő-plazmasej tek számában (35 + 7 a kontroliokban, míg +

a normál csoportban).

A szérum anti-leván titerek a normál, nem véreztetett egerekhez hasonlítva nem mutattak változást a kontroll állatokban vagy bármely időpontban vérvesztést követően.

C. A vérvesztés hatása a tüdőgyulladás túlélésére

A megelőző kísérletek kimutatták, hogy egy bakteriális poliszacharid antigénre adott tüdő-szekretoros antitest és plazmasejt válaszok lecsökkentek a vérvesztést és újraélesztőst követő és 14 nap között. A bakteriális poliszacharidok, így pl.

Pseudomonas aeruginosa poliszacharidjai ellen képződött antitestek védelmet nyújtanak azon kórokozók amelyekből ezeket az antigéneket izoláltuk (Pier és mtsai, Infect

Immunol., 22.:919, 1978, Stein és mtsai. J. Exp. Med. ,

160:1001, 1984). így a jelen eredmények arra utaltak, hogy a tüdő fertőzéssel szembeni ellenállása csökkenhet vérvesztést követően. Ezen feltevés megvizsgálására kísérletes Pseudomonas aeruginosa tüdőgyulladást idéztünk elő normál, vért vesztett és vért vesztett és újra élesztett egerekben Pseudomonas aeruginosa Fisher-Devlin 1 immunotípusú kórokozók növekvő mennyiségeinek a légcsőbe juttatásával.

Az előkezeletlen ill. az éternarkózisnak és vérvétel nélküli szívpunkciónak alávetett egerek esetén nem volt halálozás, ha az egércsoportoknak (n=6) 2xl0⁷ vagy 4xl0⁷ kórokozót adtunk be. Ha az egereknek (n=6) azonban 8xl0⁷ kórokozót adtunk be intratracheálisan, a halálozási arány 83 % volt, és ha 12xl0⁷ kórokozót injektáltunk, a halálozási arány 100 % lett. Az összes egér a fertőzést követő 24 és 96 óra között hullt el. A Pseudomonas aeruginosa kórokozók intratracheális bejuttatása után elhullt egerek tüdejének szövettani vizsgálata egy akut és súlyos tüdőgyulladásnak megfelelő elváltozásokat mutatott.

Ezután az egerekből (n=19) elvontuk teljes vérkészletük 30 %-át. A vért vesztett egerek egyik csoportjánál (n=7) az eltávolított vért 1 órával az elvonás után visszaadtuk. A többi egeret (n=12) újraélesztés nélkül hagytuk. Egy kontroll egércsoportot (n=13) éternarkózisnak és szívpunkciónak vetettük alá, de nem vettünk vért tőlük. 4 nap múlva minden egér légcsövébe 2xl0⁷ Pseudomonas aeruginosa kórokozót juttattunk.

« ·

2. táblázat

Feltételek

Elhaltak Túlélők

Mortalitás száma száma

Kontroll	0	13	0
Kivéreztetett	8	4	67a
Vért vesztett és
újra élesztett	4	3	57a

^a p<0,01 a kontrolihoz képest

A kontroll csoportban egy állat sem hullt el a fertőzést követően. Ezzel szemben a mortalitási arány 67 % volt azoknál az egereknél, akik vért vesztettek a fertőzés előtt 4 nappal, és 57 % volt azoknál, amelyek vért vesztettek, majd újraélesztettük őket (2. táblázat). A halálozási arány az újraélesztett vért vesztett egereknél nem különbözött szignifikánsan a vért vesztett, de újra nem élesztett csoportétól.

Egy másik kísérletet végeztünk az immunizálás túlélésre való hatásának tanulmányozására olyan egereknél, amelyek immunvédekezése vérvesztés folytán csökkent. Ebben a vizsgálatban mind a kontroll, mind az immunizált állatok a fentiek szerint vért vesztettek, majd újra élesztettük őket. Az immunizált csoportban 9 állatot liposzómába zárt • · · · • · · · fe · ··· · · · »··· • · · ·· *« ··

- 30 Pseudomonas aeruginosa 1 típusú poliszachariájával (33 μg) oltottuk be 1 órával a vérvesztést és újraélesztést követően. Az állatok mindkét csoportját 2xl0⁷ virulens Pseudomonas aeruginosa sejt expozíciójának tettük ki 96 órával a vérvesztést és újraélesztést követően. Ezen vizsgálat eredményeit a 3. táblázat mutatja.

3. táblázat

Feltételek N Elhaltak Túlélők Mortalitás száma száma %

Nem immunizált 13 13

100

Immunizált

67* * p<0,05

Amint a 3. táblázat mutatja, az immunizált állatok szignifikánsan emelkedett túlélési szintet (33 %) mutattak a nem immunizált csoport állataihoz viszonyítva. így az intranazális immunizálás liposzómába zárt bakteriális poliszacharida antigénnel szignifikánsan növeli az immunkárosodott állatok túlélését patogén vagy kórházi fertőzés vagy szóródás veszélye esetén.

A 2. és 3. táblázatban ábrázolt kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a vérvesztés, még ha a vér visszaadása követi is, a tüdő antibakteriális B sejt működésének jelentős és elhúzódó depresszióját eredményezi. Az » · · «

- 31 immunizáló bakteriális poliszacharid antigén elleni antitestet termelő tüdő-plazmasejtek számát csökkentnek találtuk a vérvesztést követő 1 és 14 nap között, és a bakteriális antigén-specifikus slgA titerek több mint két hétre lecsökkentek a vérvesztés után. Az anti-leván slgA és leván-specifikus plazmasejtek vérvesztés utáni kinetikája közti eltérés nem meglepő. Minthogy a szekretált antitestek perzisztálhatnak a mukózai felszíneken néhány napig, az antigén-specifikus antitest titerektől nem várható el, hogy azonnal reagáljanak a plazmasejtszám változásokra, hanem inkább késleltetett módon követik a plazmasejtváltozás mintáját. A tüdő B sejt működés ezen abnorma Irtásainak szignifikáns voltát mutatja a megnövekedett fogékonyság a Pseudomonas aeruginosa tüdőgyulladásra a vérvesztést követő

4. napi időpontban, amikor a bakteriális antigén-specifikus tüdő-plazmasejt szám a legalacsonyabb értékén volt.

A feltalálók előző vizsgálatai kimutatták, hogy az újraélesztés nélküli vérvesztés a tüdő, bél és lép kis nyugvó B sejtjeinek (klonalis prekurzorok), - amelyek a bakteriális antigénre az antitesttermelésért felelősek számát és százalékos arányát jelentősen csökkenti. Minthogy a plazmasejtek a B sejt klonális prekurzörökből fejlődnek, a klonális prekurzor készletben fellépő változásokat gyakran követik az antigén-specifikus plazmasejtek előfordulásának párhuzamos változásai. Ezt a helyzetet korábban bemutattuk újraélesztés nélküli vérvesztést követően, ahol a bakteriális antigén-specifikus lép és bél eredetű klonális prekurzorok frekvenciájának csökkenését hasonló * « · · frekvenciacsökkenés követte ezen anatómiai helyek antigénspecifikus plazmasejtjei részéről (Abraham és mtsai, Cell

Immunoi.,

122:208, 1989,

Abraham és mtsai Cell Immunoi.

128:165. 1990). A vért vesztett egereknél a leván és

Pseudomonas aeruginosa 1 típusú poliszacharid bakteriális antigénekre való antitesttermelésért felelős tüdő B sejt és 10 nap között volt észlelhető (Robinson és mtsai, J.

Immunoi.,

145:3734, 1990). A jelen kísérletekben a bakteriáis antigén-specifikus tüdő-plazmasejtszám és az slgA termelés vérvesztést követő csökkenésének időbeli lefolyása hasonló ahhoz, amit az antigén-specifikus B sejt klonális prekurzorok körében találtunk, és ez arra mutat, hogy ezek a vérvesztés indukálta változások a tüdő-plazmasejtek számában és működésében a kis nyugvó inaktív B sejt populáció közt található bakteriális antigén-specifikus B sejt klonális prekurzorok számbeli és frekvenciabeli változásait követik.

A bakteriális antigén-specifikus klonális prekurzorok csökkent számát - amelyek képesek megújulni és plazmasejtté alakulni - limitálhatja a bakteriális fertőzés expozícióját követően a gazdaszervezet ellenálló képessége. A jelen kísérletek azt mutatják, hogy egy ilyen mechanizmus lehet felelős a fertőzésekre való megnövekedett fogékonyságért vérvesztést követően, minthogy a Pseudomonas aeruginosa tüdőgyulladás megnövekedett mortalitása egy adott időpontban történt vérvesztést követően a bakteriális poliszacharid antigén-specifikus B sejt klonális prekurzorok csökkent számával áll összefüggésben a tüdőben, valamint a « « · · · · • · · · » · ··« · * « · ··· ··· · · · · · ·

- 33 bakteriális antigén-specifikus szekretoros antitest képzés képességének megfogyatkozásával.

Az 1 órával a vérvesztést követően újraélesztett állatok ugyanazt a megnövekedett f ogékonyságot mutatták

Pseudomonas aeruginosa tüdőgyulladásra, mint a vért vesztett, de újra nem élesztett egerek. Ezen eredmények eszerint tehát immunválasz abnormalitásait gyorsan és arra utalnak, hogy az irreverzibilis módon a vérvesztés indukálja, és az újraélesztésnek korlátozott befolyása van ezen immunológiai változások módosítására.

A B és T sejtek azon képessége miatt, hogy egyik mukózai felszínről a másikra vándorolnak, nem volt meglepő, hogy a vérvesztést követően a bakteriális antigén-specifikus tüdő-plazmasejtekben bekövetkező változások időbeli lefolyása hasonlított a korábban a bél lamina propriájából izolált plazmasejtekéihez (Abraham és mtsai, Cell Immunoi,

128:165. 1990). Pontosabban mindkét mukózai felszínen a bakteriális antigén-specifikus plazmasejtek csökkent száma volt észlelhető a vérvesztést követő 3. és 14. nap között.

Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy megnövekedett bakteriális antigén-specifikus antitest titerek hozhatók létre a tüdőben, ha a leván bakteriális poliszacharid antigént egy liposzóma-készítményben intranazálisan alkalmazzuk. Az intranazálisan beadott lipszómákba zárt antigén mennyisége - 38 Mg - kb. 30-szor kevesebb volt, mint amennyi orális immunizáláshoz szükséges, hogy a leválspecifikus tüdő plazmasejtek számának ugyanazon növekedését érjük el. Amint azt egy mukózai immunizálási módszertől elvárjuk, a szérum anti-leván titerekben nem találtunk

- 34 változást az immunizált állatokban. Minthogy a liposzómák nem toxikusak, és - amint ebben a leírásban kimutattuk képesek hatékony adjuvánsként hatni a poliszacharid antigénekre való mukózai immunválasz növekedésére, különösen hasznosak lehetnek intranazális és orális vakcina készít ményekben, amelyek célja a kórházi fertőzés megelőzése immunkárosodott kritikus állapotban levő betegeknél.

A kórházi tüdőgyulladások gyakoriak sérülést követően és más kritikus állapotokban. A jelen kísérletek demonstrálják, hogy a vérvesztés, még vérpótlás esetén is változásokat idéz elő a tüdő B sejt működésekben, amelyek elhúzódóak, és összefüggnek a fertőzésre növekedésével ezen a mukózai felszínen.

való fogékonyság

Érdekes módon a bakteriális antigén-specifikus tüdő sejt klonális prekurzorok és plazmasejtek eltűnése nem következik be közvetlenül vérvesztést követően, így plazmasejtté alakulásra és bakteriális antigén-specif ikus antigéntermelésre képes B sejt klonális prekurzorok szignifikáns mennyiségben vannak jelen a tüdőben még a vérvesztést követő első 24 órában. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a közvetlenül a vérvesztést követő immunizálás képes lehet a lényeges bakteriális antigének ellen termelődő tüdő slgA titerek megemelésére, és talán képes lehet a tüdőgyulladással szembeni ellenállóképesség növelésére vérvesztést vagy sérülést követően. Minthogy a jelen kísérletek azt mutatják, hogy az intranazális immunizálás liposzómákba zárt bakteriális poliszacharidokal a tüdő bakteriális antigén-specifikus slgA titereinek • · · · * · ··· · · ·· ··

- 35 megnövekedését eredményezi, arra következtethetünk, hogy ez a megközelítés hasznos lehet kritikus állapotban lévő betegeknél az antibakteriális mukózai immunválasz növelése révén, és ezáltal a kórházi tüdőgyulladás terjedésének csökkenése, valamint ezen légzőszervi fertőzéssel kapcsolatos morbiditás és mortalitás csökkenése révén.

3. példa

A liposzómába zárt bakteriális poliszacharid antigén és interleukin immunoqén hatása

IL-2-nek bakteriális poliszacharid tartalmú liposzómákba történő bejuttatásának hatását vizsgáltuk a tüdő antigén-specifikus szekretoros antitest válaszára úgy, hogy intranazálisan immunizáltunk egereket 25 μg levánt és IL-2 növekvő mennyiségeit (0-0,2 μg, azaz 0-10 μg/kg) tartalmazó liposzómákkal. Egy hét múlva az állatokat leöltük, a tüdőket átmostuk, és a leván-specifikus lg titereket a mosófolyadékban ELISA-val megmértük a fent ismertetettek szerint. Továbbá a tüdőlimfocitákat izoláltuk és ELISA foltvizsgálattal megszámoltuk a teljes és a leván-specifikus plazmasejtek számát tüdőpáronként (lásd 2. példa, Sedgwick és mtsai, J. Immunoi. Methods, 52:301, 1983). Szérumot vettünk, és az anti-leván titereket ELISA-val mértük.

·»·« »4

Λ · ♦ 4 « · «·· ·« · · ··· • 4 » 4 4 ·· · ·

4. táblázat

Leván-specifikus immunválasz IL-2 jelenlétében

Leván-specif ikus

IL-2* Szekretoros Összes tüdő- IgA tüdőés________IgA titerekfe plazmasejt_____plazmasejt________

0,0	0,172	+	0,057	4,0	+	0,5	3,6	+	0,9
0,	1	0,	152	+	0,	029	2,4	+	1,0	2,4	+	1,0
1,	0	0,	290	+	0,	028	9,3	+	1,0	8,3	+	1,0
10	,0	1,	023	+	0,	169	333 ,	0 ±	50,0	296,0	+	43,

^a μg/kg megfelel 0,002, 0,02 és 0,20 Mg-nak, sorrendben ^{b a}450 ± SEM.

Amint a 4. táblázat mutatja, a 10 μ9/]<^ IL-2-t tartalmazó liposzómákkal immunizált egerekben a tüdő-mosófolyadékokban az anti-leván slgA titereket szignifikánsan megnövekedettnek (p<0,01) találtuk. Az 1 Mg/kg IL-2-t tartalmazó liposzómákkal történt immunizálás után ugyancsak kicsi, de szignifikáns (p<0,01) növekedés volt észlelhető a tüdő anti-leván titerekben az egereknél (OD450 0,290 + 0,029), míg 0,172 + 0,057 a kontroll egereknél, amelyeket levánt igen, de IL-2-t nem tartalmazó liposzómákkal immunizáltuk). Kisebb IL-2 dózissal (azaz 0,1 pg/mg) immunizált egereknél nem találtunk elváltozást a tüdő anti-leván slgA titerekben. Ellentétben az immunizált egerekből származó tüdő-mosófolyadékban talált antigén« · * * « · ·«· ·«> 9 ···« • « · · « · · ··· ·· *« ··

- 37 specifikus slgA titerek jelentős megnövekedésével, IL-2 tartalmú liposzómákkal történt intranazális immunizálást követően nem lépett fel változás az antigén-specifikus IgM vagy IgG titerekben. Hasonlóan a szérum antileván titerek az intranazálisan IL-2 tartalmú liposzómákkal immunizált egerek egyik csoportjánál sem változtak szignifikánsan a kontroll, nem immunizált egerekhez képest.

A levánt és 10 Mg/kg IL-2-t tartalmazó liposzómákkal való intranazális imunizálás több, mint 80-szoros növekedést idézett elő a leván-specifikus tüdő-plazmasejtek számában a levánt igen, de IL-2-t nem tartalmazó liposzómákkal történt beoltást követően jelenlevő számához képest. A leván-specifikus tüdő-plazmasejtek több, mint 90 %-a termelt IgA-t. A leván-specifikus tüdő plazmasejtek száma kb. kétszeresére nőtt az 1 Mg/kg IL-2 tartalmú liposzómákkal immunizált állatokban. Az IL-2 alacsonyabb dózisaival beoltott állatokban nem találtunk elváltozást a leván-specifikus plazmasejtek számában a tüdőkivonatokban.

5. táblázat

Az IL-2 hatása a plazmasejtek frekvenciájára

Tüdő-plazmasejtek

IL-2* Teljes___________IqA

0,	0	3712	+	340	3392	+	290
0,	1	2460	+	250	2280	+	210
I,	0	7885	+	660	7470	+	717
10	,0	7408	+	688	6698	+	858

9999 99 ·««« • 9 9 9 99

999 99 99 ·«« • · 9 9 9 99 ·«· «1 ·« ·· * Mg/kg megfelel Ο, 0,002, 0,02 és 0,20 μg-nák._l sorrendben.

Az IL-2 tartalmú liposzómákkal való immunizálás mind a leván-specifikus plazmasejtek relatív frekvenciájának növekedését okozta a tüdőben, mind a tüdő-plazmasejtek teljes számának növekedését, amelyek minden típusú antitestet termelnek. Az IL-2 mentes csak levánt tartalmazó liposzómákkal immunizált állatokban 4+1 leván-specifikus plazmasejt volt 10⁶ izolált tüdő-limfocitából, és az összes tüdő-plazmasejt 0,14 %-a volt leván-specifikus. Ezzel szemben a 10 M9/kg IL-2-t tartalmazó liposzómákkal immunizált egerekben 93 + 11 leván-specifikus plazmasejt volt 10⁶ izolált tüdő-limfocitából, és ezek a levánspecifikus plazmasejtek tartalmazták a tüdő plazmasejt populációjának kb. 4,1 %-át. Továbbá a tüdőpárokból izolált plazmasejtek teljes száma 3712 + 340-ről - amit a csak leván tartalmú liposzómákkal immunizált egerekben mértünk - 7408 + 688-ra nőtt a 10 μ%/}<29 IL-2-t tartalmazó liposzómákkal immunizált egerekben. Megjegyzendő, hogy a liposzómába zárt IL-2 tüdő-plazmasejtszám növelő hatása valamennyire elkülönülőnek tűnik az IL-2 antigén-specifikus plazmasejtszám-növelő adjuváns hatásától. Az intranazális immunizálás 1 M9/kg IL-2 tartalmú liposzómákkal a tüdőplazmasejtek ossz számának növekedését eredményezte, hasonlóan ahhoz, amikor 10 μg/kg IL-2-t tartalmazott a liposzóma (7885 + 66o plazmasejt/tüdőpár az 1 μg/k.g IL-2-t tartalmazó liposzómák esetén, míg 7408 + 688 plazmasejt/tüdőpár a 10 Mű/kg IL-2-t tartalmazó liposzómák «·· 99 · 9 999 · 9 9 9 9 9 ·«· ·· it 99

- 39 esetén). Ezzel szemben, a leván-specifikus plazmasejt/tüdőpár száma több, mint 35-szörösére nőtt, 9 + 1-ről 333 + 50-re, ha a liposzómába zárt IL-2 mennyiségét 1 μg/kgról 10 μg/kg-ra változtattuk.

Minthogy az előző vizsgálatok kimutatták a liposzómába zárt IL-2 potens adjuváns tulajdonságait bakteriális antigén-specifikus szekretoros antitest válaszra a tüdőben, az IL-2 liposzómában való alkalmazásának lehetősége lehetővé teszi az antigén mennyiségének csökkentését, minthogy így is elérhető az antigén-specifikus slgA titerek emelkedése. Ezen elképzelés megvalósítására 2,5 μg levánt és 0,2 μν IL-2-t (azaz 10 μg/kg) tartalmazó liposzómákat állítottunk elő. Ezen liposzóma-készítménnyel történt immunizálást követően nem találtunk szignifikáns növekedést a leván-specifikus slgA titerekben a tüdő-mosófolyadékban a nem immunizált kontrollokéhoz képest, és nem találtunk leván-specifikus tüdő-plazmasejtet sem, ami arra mutat, hogy az IL-2 alkalmazása nem volt képes elegendő mértékben növelni az antitest termelést, hogy az immunizáló antigén tized részére való csökkentését kompenzálja.

Azért, hogy meghatározzuk, hogy a liposzómába zárt IL-2 és levánnal összefüggésben fellépő bakteriális poliszacharid válasz növekedése elérhető-e más bakteriális poliszachariddal, az egereket intranazálisan immunizáltuk Pseudomonas aeruginosa 1 típusú poliszacharidját (25 μg/kg) egyedül, vagy 0,2 μg IL-2-t (azaz 10 μg/kg) is tartalmazó liposzómákkal. Ezen vizsgálatok eredményeit a 6. táblázat tartalmazza.

6. táblázat

Az IL-2 hatása a Pseudomonas aeruginosa poliszacharid (PsA) kiváltotta szekretoros IqA válaszra

Csoport______PsA___________IL-2____Szekretoros IqA titer^b

1	—		0,466	+	0,139
2	25	Mg	0,584	+	0,075
3	25	Mg	0,2 Mga 0,941	+	0,167

^a 10 Mg/kg ^{b A}450 ± ^SEM

Amint az 1. példában bemutattuk, a csak Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot tartalmazó liposzómákkal történt intranazális immunizálás megnövelte az antigén-specifikus slgA titereket a tüdő-mosófolyadékokban az üres liposzómákkal immunizált állatokhoz hasonlítva (00450=0,4666 + 0,139 az üres liposzómáknál, míg 0,584 + 0,075 a Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot tartalmazó liposzómáknál). IL-2 hozzáadása a liposzómákhoz az anti Pseudomonas aeruginosa poliszacharid slgA titereinek szignifikáns növekedését (p<0,01) váltotta ki összehasonlítva akár az üres liposzómákkal immunizált állatoknál talált értékekkel, akár a Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot igen, de IL-2-t nem tartalmazó liposzómákkal immunizált egereknél találtakkal.

Minthogy az IL-4-ről kimutatták, hogy befolyásolja a B sejt érését és antitest képzésre való átalakulását, az IL-4 liposzómában történő alkalmazásának lehetséges adjuváns hatásait feltételeztük. Azonban nem találtunk szignifikáns növekedést az antileván slgA szintekben a tüdő-mosófolyadékokban az intranazálisan 25 μg levánt és 0,2 μg (azaz 10 49/^9) IL-4-et tartalmazó liposzómákkal immunizált egereknél (OD45q=0,183 + 0,075 a kontrolioknál, míg 0,144 + 0,081 az IL-4-et tartalmazó liposzómákkal immunizált egereknél. Továbbá nem találtunk leván-specifikus tüdő-plazmasejteket az ELISA foltvizsgálattal az IL-4-et tartalmazó liposzómákkal immunizált állatokban.

Minthogy nem kívánunk egy adott teóriához kötődni, a Th2 sejtek relatív predominanciája miatt a nyálkahártyafelszíneken lehetséges, hogy az IL-4 megfelelő mennyisége, amely képes a B sejt válaszok indukálására, már jelen van ezeken az anatómiai területeken, és az IL-4 helyi szintjeinek további növekedése nem hoz létre plusz hatást. Nyilvánvaló továbbá, hogy az IL-4, minthogy képes a B sejt válasz korai lépéseinek stimulálásra, gátló hatást is gyakorol a B sejt szaporodásra, különösen amit az IL-2 indukál. Amennyiben ez az eset áll fenn in vivő, akkor, ha az IL-4 magasabb helyi koncentrációját biztosítjuk, ez gátló hatással lehet az antitest termelésre.

További vizsgálatokat végeztünk az IL-2 tartalmú liposzómák tüdőgyulladás elleni védőhatásának értékelésére a korábban ismertetett vérvesztéses modell felhasználásával. Ezekben a kísérletekben az egerek vértérfogatának 30 %-át vontuk el, majd 2 óra múlva intranazálisan vagy 2 5 μg Pseudomonas aeruginosa 1. típusú poliszacharidot egyedül vagy 25 μg Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot és 0,2 μg • · • · ·

- 42 IL-2-t tartalmazó liposzómát alkalmaztunk. 4 nap múlva az egereket intratracheálisan Pseudomonas aeruginosával fertőztük meg.

A nem immunizált egereknél és a levánt és IL-2-t tartalmazó liposzómákkal immunizált egereknél a mortalitás

100 % volt a Pseudomonas aeruginosa tüdőgyulladás kiváltása után (3. ábra). Nem volt szignifikánsan több a túlélés a

Pseudomonas aeruginosa poliszacharidot igen, de

IL-2-t nem tartalmazó liposzómákkal történt immunizálás után az egereknél.

csökkent az intranazálisan

Pseudomonas aeruginosa poliszachariudot és 10 μg IL-2-t tartalmazó liposzómákkal immunizált egereknél (p<0,005).

hisztopatológiai (szövettani) vizsgálatok akut konszolidatív (masszív) és vérzéses tüdőgyulladást mutattak Gram negatív pálcák jelenlétével a tüdőben mind az immunizált, mind a nem immunizált egereknél, amelyek a baktériumok intratracheális bejuttatását követően hullottak el.

Az egerek intranazális immunizálása IL-2-t és Pseudomonas aerugionsa poliszacharidot tartalmazó liposzómákkal szignifikáns védelmet nyújtott egy olyan pneumonia modell esetében, amely 100 %-os letalitású a nem immunizált egerek nél. Megjegyzendő, hogy a beoltás IL-2-t és egy más organizmusból származó (Aerobacter levanicum) bakteriális poliszacharidot (leván) tartalmazó liposzómákkal nem volt hatékony a Pseudomonas aeruginosa tüdőgyulladás ellen, ami azt mutatja, hogy a liposzómákkal történő immunizálással elért védőhatás nem a tüdő-immunválasz nem specifikus növekedésének köszönhető. A tüdőgyulladás kiváltására felhasznált baktériumok mennyisége a jelen kísérletekben (5xl0⁷ cfu) több, mint kétszerese volt a korábbiakban alkalmazottnak, amikor a 100 %-os mortalitás a nem immunizált állatoknál ugyancsak megtalálható volt. A korábbi vizsgálatokban azt találtuk, hogy a liposzómába zárt Pseudomonas aeruginosa poliszacharid IL-2 nélkül részleges védelmet volt képes biztosítani a tüdőgyulladás okozta mortalitással szemben. A jelen kísérletekben ezen készítmény esetén a védekezés hiánya valószínűleg a tüdőgyulladást okozó baktériumok nagyobb mennyiségének és a liposzómába zárt poliszacharid kisebb mennyiségének (25 μg, míg 33 μg volt az előző vizsgálatoknál) köszönhető.

Azért, hogy más interleukinok hatékonyságát értékeljük, az IL-2 és vizsgálatokat

IL-4-gyel kapcsolatban leírtakhoz hasonló végeztünk rekombináns humán IL-6 és poliszacharid antigén kombinációjának felhasználásával.

Az eredményeket a 7. táblázat mutatja.

7. táblázat

Az IL-6 hatása a leván-specifikus immunválaszra

Az IL-6 alkalma-³ zott mennyisége

Leván-specifikus % leván-specifikus plazmasejt/tüdő- tüdő-plazmasejtek pár

Teljes IqA

0,0	9	8	0,13
0,1	29	19	2,04
1,0	106	96	1,89
5,0	61	41	1,77

« · ·

- 44 μ9/)<9 megfelel Ο, 0,002, 0,02, 0,10 μg-nak sorrendben

Minden esetben hím BALB/c egereket immunizáltunk intranazálisan 25 μg levánt és humán rekombináns IL-6 fent feltüntetett mennyiségeit tartalmazó szuszpenzió 50 μΐ-ével. 5 nap múlva a tüdőket eltávolítottuk, a tüdő-limfocitákat megtisztítottuk, és a leván-specifikus tüdő-plazmasejt/tüdőpár számot ELISA foltvizsgálat felhasználásával vizsgáltuk, amint azt korábban ismertettük. Amint itt látható, az IL-6 alkalmazása a liposzómában a leván-specifikus tüdő-plazmasejtek számának jelentős megnövekedését eredményezte, így az IL-6 liposzómában történő alkalmazása egy effektív adjuváns hatást mutatott.

Az adatok szerint az antigén-specifikus tüdőplazmasejtek %-os aránya kb. 15-szörösére intranazálisan alkalmazott liposzómák IL-6-ot tartalmaztak

A leván-specifikus tüdő-plazmasejtek %-os arányát úgy számoltuk ki, hogy elosztottuk a 10⁴ izolált tüdő limfocitára eső leván-specifikus tüdő-plazmasejtek számát a

10^ izolált tüdő-limfocitára eső összes specificitású tüdő plazmasejtek számával.

A találmányt teljességében ismertettük, a szakmában járatosak számára világos, hogy sok változtatás és módosítás tehető anélkül, hogy a találmány értelmétől és felhasználási területétől eltérnénk.

Claims (35)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás egy poliszacharid antigénre adott nyálkahártyái immunválasz indukálására állatokban, azzal jellemezve, hogy az állatnak az antigén hatékony immunogén mennyiségét tartalmazó liposzómát adagolunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az állatok immunrendszere károsodott.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adagolás az immunkárosodást követő 48 órán belül, előnyösen az immunkárosodást követő kb. 24 órán belül történik.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a liposzóma tartalmaz továbbá egy adjuvánst is.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a liposzóma membránjában helyezkedik el.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy lipoidális amin.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipoidális amin az avridin.
8. 8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a liposzómán belül helyezkedik el.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy biológiai válasz módosító.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biológiai válasz módosító egy interleukin.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, * * “« ·· *· ·· • · « « « · ··· ·· · · ··· ··· ·· ·« ·· hogy az interleukin IL-2 vagy IL-6.
12. 12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a poliszacharid antigénnel komplexet alkot.
13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliszacharid antigén egy bakteriális poliszacharid.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakteriális poliszacharid polivalens.
15. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakteriális poliszacharid egy Gram-negatív organizmusból származik.
16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Gram-negatív organizmus a Pseudomonas nemzetség tagja.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az organizmus a Pseudomonas aeruginosa.
18. 18. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bakteriális poliszacharid egy Gram-pozitív organizmusból származik.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Gram pozitív organizmus a Streptococcus nemzetség egy tagja.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az organizmus a Streptococcus pneumoniae.
21. 21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a liposzómát enterálisan adagoljuk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enterális adagolás nazális vagy orális úton történik.

    -Μ - ♦ ··< * · ít · V • ·»·!>· • · * ·· · «··· • · · · · ·« ·«
23. 23. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy állatként embert alkalmazzunk.
24. 24. Készítmény, ami egy poliszacharid antigénre adott nyálkahártyái immunválasz indukálására használható állatban, azzal jellemezve, hogy az antigén effektív immunogén mennyiségét tartalmazza egy liposzómában, ahol kívánt esetben legalább egy adjuváns ugyancsak jelen van.
25. 25. A 24. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy az adjuváns a liposzóma membránjában helyezkedik el.
26. 26. A 25 igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy lipodális amin.
27. 27. A 26. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a lipoidális amin az avridin.
28. 28. A 24 igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a liposzóma belsejében helyezkedik el.
29. 29. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy biológiai válasz módosító.
30. 30. A 29. igénypont szerinti készítmény, azzal jelle mezve, hogy a biológiai válasz módosító egy interleukin.
31. 31. A 30. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az interleukin IL-2 vagy IL-6.
32. 32. A 28. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a poliszacharid antigénnel komplexet alkot.
33. 33. A 24. igénypont szerinti készítmény, azzal jelle mezve, hogy egy adjuváns helyezkedik el a liposzóma membrán-

    - 48 jában, és egy adjuváns van a liposzóma belsejében.
34. 34. A 33. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a liposzóma membránjában elhelyezkedő adjuváns és a liposzóma belsejében lévő adjuváns különbözőek.
35. 35. A 24. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a liposzóma unilamelláris.