HUT67007A

HUT67007A - Preparations containing biologically activ agent wich are absorbed in the superior intestinal tract of animals

Info

Publication number: HUT67007A
Application number: HU9400190A
Authority: HU
Inventors: Thomas Sai Ying Ko
Original assignee: Enzacor Pty Ltd
Priority date: 1991-07-24
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 1995-01-30
Also published as: JPH06511237A; CA2114122A1; US5484609A; SG42865A1; HU9400190D0; EP0596962A1; RU2113220C1; RU94016167A; WO1993001800A1; NZ243722A; EP0596962A4

Description

A találmány tárgya új gyógyszerkészítmény, továbbá eljárás biológiailag aktív anyagok vékonybél traktusban történő kibocsátására, illetve eljárás állatokban bélrendszeri patogének okozta megbetegedések kezelésre.

Az állatokban a vékonybél traktus jelentős szerepet játszik különféle biológiailag aktív vegyületek abszorpciójában, amelyek például az emésztett tápanyag komponensek, az antibiotikumok, a vitaminok, stb.

A biológiailag aktív anyagok gyakran savra érzékenyek és így lebomlásuk vagy inaktiválódásuk megtörténhet, miközben a vékonybél traktus felé haladva a gyomron áthaladnak még azelőtt, mielőtt a vékonybél traktusban abszorbeálódnának vagy bioaktivitásuk jelentkezne .

Korábban javasolták, hogy bélben oldódó bevonatokat alkalmazzanak, amelyek savval szemben ellenállóak/lúgos közegben oldható anyagok, mint például cellulóz-acetát-ftálát és így biztosítsák, hogy a biológiailag aktív anyagok a gyomron minden veszély nélkül áthaladjanak a későbbi bél traktusban történő felszabadulásuk irányába. Fiatal állatokban, például malacokban a bélben oldódó bevonattal ellátott anyagok áthaladási sebessége a bél traktuson olyan gyors lehet, hogy a bélben oldódó bevonat nem bomlik le, emiatt a bélben oldódó bevonattal ellátott anyagok nem szabadulnak fel vagy a biológiailag aktív anyagok felszabadulása nem kívánatos bél traktusban, mint például a vastagbélben történik meg.

Ezen túlmenően a biológiailag aktív anyagok, mint például a proteázok elfogadhatatlan ízűek lehetnek, illetve a szájüregben, valamint a nyelőcsőben irritációt és gyulladást okozhatnak.

Célunk az volt, hogy olyan készítményt és eljárást dolgozzunk ki, amely hatásosan és megfelelő módon elősegíti, hogy a biológiailag aktív anyagok az állatok béltraktusába eljussanak.

A találmány tárgya egyrészt egy készítmény, mely magában foglal (i) egy granulátumot, amely a biológiailag aktív anyagot valamely gyenge bázissal együtt tartalmazza és részben bevont, egy, a bélnedvekben oldható késleltetett kibocsátást biztosító bevonattal;

(ii) egy savasságot biztosító adalékanyagot, amelynek pH értéke oldatban 1,5-6 közötti; és (iii) egy gélképző adalékanyagot.

A találmány tárgya továbbá készítmény, azzal jellemezve, hogy egy savas gélt tartalmaz, amelynek pH értéke körülbelül 1,5-6 közötti és mikrogranulátumot tartalmaz, amely valamely proteint és gyenge bázist tartalmaz és részben bevonattal ellátott, ahol a bevonat egy, a bélnedvekben oldható késleltetett hatóanyagkibocsátást biztosító anyag.

A biológiailag aktív anyag lehet valamely fehérje, mint például enzim, növekedési faktor, cytokin vagy hormon. Amennyiben az enzim valamely fehérjebontó enzim, ez előnyösen bromelin, papain, ficin, kimotripszin, tripszin, ribonukleáz, karboxi-peptidáz A vagy B, vagy subtilisin. Legelőnyösebben alkalmazható a bromelin. A növekedési faktorok lehetnek növekedési hormon, inzulin és hasonlók.

A jelen találmány szerinti készítmény leírásában protein elnevezés alatt a peptidek szokásos körét is értjük. Általában egy peptid 2-100 aminosavat tartalmaz és egy protein (fehérje) 100 vagy ennél több aminosavat tartalmaz.

A biológiailag aktív anyagok lehetnek nem protein típusúak és lehetnek például vitaminok, kofaktorok, fémionok, antibioti- 4 kumok vagy hasonló anyagok.

A biológiailag aktív anyagokat általában finom részecske formában alkalmazzuk, amely lehet például por forma.

A gyenge bázis elnevezés alatt valamely lúgos kémhatást elődidéző szert értünk, amely lehet például dikálcium-foszfát, káclium-karbonát, kálcium-hidrogénkarbonát, aluminium-hidroxid, nátrium-hidrogénkarbonát és hasonlók. Előnyösen a gyenge bázis kevéssé oldható. A gyenge bázist általában finom részecske formában alkalmazzuk a megfelelő közegben történő oldódás céljából, amely közeg lehet például a gyomornedv. A gyenge bázis és a biológiailag aktív anyag egymáshoz keverhető, amennyiben ezek mindegyike részecske formájú, azelőtt, mielőtt bevonatot alkalmaznánk .

Granulátumokat képezhetünk úgy, hogy a biológiailag aktív anyagok és a puffer segédanyagok keverékét részecske formában részben bevonjuk részecske formában egy késleltetett hatóanyagkiboncsátást biztosító anyaggal (amely más néven bélben oldódó bevonatként ismert), amely anyag a béltraktus nedveiben oldható. A fluidizált részecskéket spré eljárással vonhatjuk be egy késleltetett kibocsátást bizotsító anyag oldatával. A spré bevonás segítségével a fluidizált részecskékből képzett granulátumok mérete (amely eljárást fluid ágyban hajtunk végre) szabályozható és ez függ a részecskeáram sebességétől és a bevonó oldat spré nyomásától. Például a gyors granulátum áram és a magas spré nyomás kis granulátumokhoz vezet. A granulátumok általában 50-500 mikrométer közötti átmérőjűek, és ezek a granulátumok mikrogra nulátumoknak tekinthetők.

'< 4

A találmány szerinti granulátumok csak részben bevontak a késleltetett hatóanyagkibocsátást biztosító anyaggal. Ez a találmány fontos jellemzője, mivel ez teszi lehetővé azt, hogy a biológiailag aktív anyag a bél traktusban gyorsan felszabaduljon. A részleges bevonat előállítást általában úgy érhetjük el, hogy fluidizált anyag, spré bevonási eljárást alkalmazunk. A bevonat kiterjedését mikroszkópiái granulátum analízissel határozhatjuk meg. Általában a granulátumok felületének 10-90%-a bevont a késleltetett hatóanyagkibocsátást biztosító anyaggal. Előnyösen a bevonat mértéke a granulátum felületének 50-80%-a, amely a késleltetett hatóanyag kibocsátást biztosító bevonatot tartalmazza.

A késleltetett hatóanyagkiboncsátást biztosító anyagok olyan anyagok lehetnek, amelyek lényegében áthatolhatatlanok és megőrzik integritásukat körülbelül 6.0 pH érték alatti körülmények között és amelyek lebomlanak, oldódnak, áthatolhatóvá válnak vagy elvesztik szerkezeti integritásukat bázikus pH érték esetében, amely körülbelül pH 7.0 feletti érték. Ilyen anyagok például a cellulóz-acetát-ftalát, egyéb típusú bélben oldódó bevonatok és hasonlók.

A savasságot biztosító segédanyagokat részecske formában adagolhatjuk és oldódás során, amely vizes oldatot képez, ezek az anyagok körülbelül 1.5-6 érték közötti, előnyösen körülbelül 3.5-6 érték közötti pH értéket biztosítanak. Bármely nem toxikus segédanyag, amely ezt a feltételt teljesíti a találmány tárgykörébe értendő. Ilyen savas körülményeket biztosító segédanyagok például lehetnek a citromsav, a tej sav, a borkősav, a borostyánkősav, az oxálsav, a fumársav, a butánsav, a sósav, a propionsav és hasonlók.

A gélképző segédanyagokat ugyancsak általában részecske formában alkalmazzuk és ezek az anyagok képesek gél-mátrix kialakítására megfelelő körülmények között, amely körülmények lehetnek valamely vizes vagy szerves oldatban történő (mint például glicerinben vagy polietilén-glikolban) képzett elegy. Ilyen gélképző szerek például a karagének, az alginátok, a polivinil-pirolidon (PVP), a metil-metakrilát, amely epében oldható zsírsavakkal szubsztituált, a dextrán és hasonlók. Savas gél keletkezik úgy, hogy valamely gél-mátrixot savas oldatban vagy valamilyen savas pH értéket biztosító segédanyag jelenlétében, amelyet a fentiekben leírtunk, hidratálunk vagy diszpergálunk.

A találmány tárgya egy olyan részecskeforma, amely granulátumok keveréke, ahol a granulátumban részecske formájú savasságot biztosító segédanyag és gél-képző segédanyag található. Ebben a formában a készítmény könnyen tárolható és szállítható. Abban az időpontban, amikor biológiailag aktív hatóanyag bél traktusban valamely állatban történő kibocsátását kívánjuk megvalósítani, kis mennyiségű vizet vagy más nem toxikus oldatot adunk a fenti készítményhez és így egy savas gélt képzünk (amely úgy alakul ki, hogy savas körülményeket biztosító segédanyag jelenlétében a gélképző segédanyag géllé alakul), ahol ebben mikrogranulátumok találhatók. Ezt az eljárást alkalmazzuk amikor egy savas gél készítményt állítunk elő az alábbiaknak megfelelően.

A készítmény (i)-(iii) komponenseinek aránya a találmány szerinti megvalósítás során általában nem kizárólagos fontosságú, azonban például lehet körülbelül 10:1:1 arány, amely tömegarány alapon számított. Hasonlóan a biológiailag aktív anyag aránya a puffer segédanyaggal szemben nem döntő befolyású, azonban lehet

1:4 tömeg/tömeg arány.

A találmány szerinti készítmény ezen túlmenően egy vagy több antibiotikumot tartalmazhat. Amennyiben a találmány szerinti készítmény a megvalósításnak megfelelően granula formájú, az antibiotikum por vagy granula formájú lehet, amelyet az egyéb komponensekkel elegyítünk. Amennyiben a találmány szerinti készítmény a megvalósításnak megfelelően gél formájú, az egy vagy több antibiotikum vegyületet általában a gél mátrix előállítása során oldjuk és így általában a gél-mátrixban egyenletesen elosztott.

A találmány szerinti készítményben bármely ismert antibiotikum csoport alkalmazható, amely lehet például egy vagy több antibiotikum, mint például penicillin, cefalosporin, eritromicin, tetraciklin, tienamicin, neomicin és hasonlók, illetve ezek származékai, amelyek antibiotikus aktivitással rendelkeznek.

Mint az alábbiakban ismertetjük, valószínűleg az antibiotikumok szinergikus hatást fejtenek ki a jelen találmány szerinti készíténnyel, különösen abban az esetben, amennyiben a biológiailag aktív anyag proteáz és amennyiben ezt bél baktériális fertőzések kezelésére alkalmazzuk, amely fertőzések különféle betegségállapotokkal járnak együtt.

A találmány tárgya továbbá eljárás valamely biológiailag aktív anyag felső vékonybél traktusban történő felszabadítására állatokban, azzal jellemezve, hogy az állatoknak a fent leírt készítményt adagoljuk. Amennyiben a találmány szerinti készítmény gél forma, ezt közvetlenül adagolhatjuk az állatnak. Amennyiben a készítmény részecske forma, ezt először megfelelő oldattal elegyítjük vagy ebben diszpergáljuk, és így egy képzünk, majd ezt a gélt adagoljuk az állatnak.

A találmány tárgya továbbá eljárás állatokban bélpatogének és/vagy bélpatogén fertőzéssel együttjáró betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy az állatoknak a fent leírt készítmény terápiásán hatásos mennyiségét orális úton adagoljuk. A készítény előnyösen valamely proteázt, például bromelint tartalmaz, kívánt esetben egy vagy több antibiotikummal együttesen. Más megvalósítási mód szerint egy vagy több antibiotikumot adagolhatunk párhuzamosan vagy lényegében párhuzamosan az állatoknak.

A bél patogének, amelyek a találmány szerinti eljárással kezelhetők, baktériumok, vírusok vagy paraziták lehetnek. Például ilyen patogének lehetnek az enterotoxigén Escherichia coli, a Shigella, a Yersinia, a Pleisiomonas, a Vibrios, az Aeromonas, a Campylobacter, a rotavirus, a Cryptosporidia vagy Coccidosis.

A találmány tárgya továbbá eljárás valamely állatban hasmenés kezelésre, azzal jellemezve, hogy az állatnak egy olyan készítményt adagolunk, amely azzal jellemezhető, hogy savas gél, amelynek pH értéke 1.5-6 közötti, forma, ahol a gél forma mikrogranulátumot tartalmaz, amely mikrogranulátum egy fehérjebontó enzim tartalmú gyenge bázissal együttesen és részben késleltetett hatóanyagkibocsátást biztosító bélnedvekben oldódó bevonattal ellátott. Kívánt esetben a készítmény tartalmazhat egy vagy több antibiotikumot vagy egy vagy több antibiotikumot adagolhatunk párhuzamosan vagy lényegében egyidőben, a készítmény adagolásával.

Bármely állat, előnyösen valamely emlős, mint például ember, disznó, szavasmarha, ló, birka, madarak, hal vagy rákfélék kezelhetők a találmány szerinti eljárással. Különösen előnyösen kezelhetők az egygyomrú állatok, mint például a sertés vagy a fiatal• « · · • · « · « · · • · ·♦·· «· • · · · · · · ,

- 9 korú ember, illetve a nem kifejlett kérődzők, mint például a borjú.

A találmány szerinti különféle megvalósítási formák közül előnyös alkalmazás az egygyomrú illetve a nem kifejtett kérődző állatokra történő felhasználás azonban a találmány szerinti eljárás ugyancsak alkalmazható vízi tenyészetek esetében olyan bél betegségek kezelésére, amelyek halak illetve rákfélék körében fordulhatnak elő (amely állatokat például intenzív módon tenyészthetik tavakban, tartályokban és hasonlókban). A fehérjebontó enzimeket tartalmazó készítmények úgy hatnak, hogy eltávolítják a hall illetve a rákfélék beleiben az adéziós helyeket, amelyek a patogének számára rendelkezésre állnak, továbbá az egész szervezetre érvényes immun hatást eredményeznek.

Amennyiben a találmány szerinti készítményt emberek esetében alkalmazzuk, a találmány szerinti készítmény valamely italba, mint például vízbe vagy körülbelül 4-7 pH értékre puffereit oldatba keverhető. Az ember esetében alkalmazott mikrogranulátum bevonásának mértéke általában körülbelül 20%.

A találmány szerinti valamely savas gél orális adagolása bármely szokásos módon megvalósítható. Például a gélt az állat szájüregébe önthetjük vagy injektálhatuk. Más eljárás szerint a gélt valameilyen élelemmel együtt adagoljuk vagy ezzel elkeverjük, amely lehet például állati táplálék.

Valamely állat számára adagolt savas gél mennyisége abból a célból, hogy egy biológiailag aktív hatóanyagot az állat béltraktusába juttassunk vagy hasmenést kezeljünk, általában nem döntő befolyású, továbbá nem döntő befolyású az adagolás gyakorisága és ez függ több tényezőtől, mint például az állat tömegé10

tői és egészségi állapotától, az állat tápláltsági fokától, a kezelendő betegségtől és hasonlóktól és ezt általában a gazdálkodó vagy az állatorvos vagy az orvos határozza meg. Példáule egy malacnak 1-5 ml valamely savas gélt adagolhatunk injekcióstű segítségével a szájüregbe. Ugaancsak példaként a találmány szerinti készítmény hatásos mennyisége lehet körülbelül 0.01 g/kg testtömely - körülbelül 5 g/kg testtömeg közötti mennyiség.

A biológiailag aktív fehérjebontó enzimek hatásos eljuttatása a felső vékonybél traktusba a találmány szerinti készítmény segítségével kimutathatóan azt eredményezi, hogy a bélmembrán patogén számára rendelkezésre álló receptorai lebomlanak (valószínűleg proteolízis útján) (amely receptorok például lehetnek az E. coli K88 patogén baktérium receptorai), illetve a belekben a toxin receptorok is lebomlanak. A találmány szerinti proteáz tartalmú készítmények limitálják a test természetes fiziológiáját, mivel ezek emésztő enzimeket tartalmaznak és időlegesen eltávolítják az utóbél felülethez kötődő bakteriális és egyéb patogén receptorokat. Az ilyen receptorok nélkül a patogén szervezetek nem tudnak kolóniát képezni a kapcsolódó bél felületén. Anélkül pedig, hogy nagyszámú kolóniát képeznének, a patogén mikrobák nem tudnak betegséget előidézni. Ez az egyedi hatás, amelynek során a mikrobiológiai betegséget úgy akadályozzuk meg, hogy a gazda egyedet és nem a patogént módosítjuk, kiküszöböli az antibiotikumok alkalmazásának szokásos hátrányát, azt, hogy mikrobiológiai antibiotikum rezisztencia jön létre.

Ezen túlmenően azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti készítmény hatásosan alkalmazható olyan patogén mikrobák ellen is, amelyeknek nincs ismert adéziós mechanizmusa vagy receptora ·· *

- 11 [mint például a protozoa paraziták, és vírusok, például a rotavirus és a transzferálható gastroenteritis vírus (TGE)]. Ez utóbbi hatás azt jelzi, hogy a találmány szerinti készítmények különösen azok, amelyek proteáz, azaz fehérjebontó enzimet tartalmaznak, (amely lehet például növényi és állati fehérjebontó enzim, mint például bromelin, papain, ficin, kimotripszin, tripszin, ribonukleáz, subtilisin, karboxi-peptidáz A vagy B és hasonlók), mint nem specifikus immuno stimulánsok is hathatnak.

A találmány szerinti készítmény immuno-stimuláns hatásának mechanizmusát nem sikerült kideríteni. Ez az immuno-stimuláns hatás specifikus is lehet egy adott patogénra, ebben az esetben úgy véljük, hogy ez nem specifikus jellegű és együtt jár az IgG megnövekedett képződésével.

A fent leírt proteáz tartalmú készítmények alkalmazása antibiotikumokkal kombinálva szinergikus hatást eredményezhet a bél mikrobás fertőzések kezelésében. Ez a szinergikus kölcsönhatás valószínűleg azért jön létre, mert nem specifikus hatás jelentkezik, amelynek során a fentieknek megfelelően az antitest válasz megnövekszik és ez kiegészíti az antibiotikumok mikroba ellenes hatását. Ugyancsak kimutattuk, hogy a fent leírt készítmények, amelyek valamely proteázt, azaz fehérjebontó enzimet és valamely antibiotikumot tartalmaznak, megnövelik az antibiotikum szervezetben! abszorpcióját a bél traktusban. Ennek a hatásnak mechanizmusa nem ismert. Ez a hatás ugyancsak fellép abban az esetben is ha antibiotikumokat adagolunk egyidőben vagy lényegében egyidőben a találmány szerinti savas gél készítménnyel együttesen a fent leírt egyik találmány szerinti eljárás megvalósításának értelmében.

• · · Λ

A találmány szerinti proteáz, azaz fehérjebontó enzim tartalmú enzim készítmények széles spektrumú hasmenés ellenes hatást is kifejtenek, továbbá elősegítik a testtömeg növekedést illetve a mortalitás csökkenést az állatokban, amennyiben ezeknek adagoljuk, különösen nem kifejlett egygyomrú állatok, mint például malacok esetében.

A találmány tárgya továbbá eljárás állatokban immunrendszer nem stimulálásának előidézésére, azzal jellemezve, hogy egy állatnak orálisan olyan készítményt adagolunk, amely egy savas gélt tartalmaz, amelynek pH értéke körülbelül 1.5-6 közötti és mikrogranulátumot tartalmaz, amely mikrogranulátum valamely biológiailag aktív anyag, előnyösen fehérjebontó enzim, egy gyenge bázissal együttesen és amely részlegesen bevonattal ellátott, ahol a bevonat hatóanyagkibocsátást csökkentő bélnedvekben oldható anyag. A fehérjebontó enzim lehet állati vagy növényi eredetű és lehet például valamely proteáz, mint például bromelin, papain, ficin, kimotripszin, tripszin, ribonukleáz, karboxipeptidáz A vagy B vagy suptilisin és hasonlók.

Mint az alábbi példákból nyilvánvaló, a találmány szerinti proteáz tartalmú készítmények jelentős csökkenést eredményeznek a patogén bél flórában. Ez a nem várt jellemző lehetővé teszi, hogy az állat béltraktusát újra kolonizáljuk nem patogén előnyös baktériumokkal, mint például lactobacilli, streptococci és hasonlók, amelyeket egészséges állatokból nyerhetünk.

A találmány tárgya eljárás, azzal jellemezve, hogy orális úton adagolunk egy állatnak egy olyan készítményt, amely savas gél formájú, ahol a savas gél pH értéke körülbelül 1.5-6 közötti és amely mikrogranulátumot tartalmaz, ahol a mikrogranulátum

- 13 valamely proteáz enzimből áll egy gyenge bázissal együttesen és amely mikrogranulátum részben bevonattal ellátott, ahol a bevonat a bél nedvekben oldódó késleltetett hatóanyagkibocsátást biztosító anyag, majd ezt követően a fenti állatnak orálisan mikroorganizmusokat adagolunk, amely mirkoorganizmusok egy vagy több bélflóra komponenst tartalmazhatnak, amely komponenseket egészséges állatokból nyerünk.

A találmány szerinti fenti eljárás során állatoknak adagolt mikroorganizmusok úgynevezett probiotic anyagok és a savas gél készítménnyel egyidőben vagy röviddel ezután, mint például több perccel - 24 órával később adagolhatok.

A probiotic anyagok adagolhatok fagyasztott, szárított mikroorganizmus formában vagy más alkalmas formában, mint például tápanyag oldat formában, mikroorganizmus szuszpenzió és hasonló formákban.

A találmány tárgya továbbá a fent leírt savas gél vagy részecske készítmény keverékben szokásos állati tápanyagokkal, amelyek a szakirodalomban jól ismertek, mint például labdaccsá alakított tápanyag, szoptatás-elválasztás utáni tápanyag és hasonlók.

A jelen találmány szerinti készítmény különféle jellemzői különösen előnyösek a következőkből eredően:

1. A kis részecskeméretű, azaz 50-500 gm közötti granulátumok biztosítása a fentiek szerint (ezeket a részecskéket nevezzük mikrogranulátumnak) késlelteti a hatóanyag kibocsátást a szájüregben (így védi a szájüreget a proteáz, azaz fehérjebontó enzimek, mint például a bromelin hatásától), illetve ugyanezt eredményezi a gyomorban is. A kis részecskeméret ezen túlmenően elősegíti a gyomorban történő áthaladást.

2. Az a jellemző, hogy a granulátum belsejében a pH értéket pufferelés segítségével 3-6 közötti értékre állítjuk be, inhibiálja a gyomorban található pepszin fehérjebontó aktivitását, semlegesíti a gyomor pH értékét, inhibiálja a savra érzékeny biológiailag aktív anyagok, mint például a proteázok inaktiválását és biztosítja a biológiailag aktív anyag, mint például a fehérjebontó enzim a bromelin optimális pH értékének fenntartását.

3. A granulátumok hatóanyagkibocsátást késleltető anyaggal történő részleges bevonata biztosítja, hogy a biológiailag aktív anyagot a savas inaktiválástól megvédj ük és lehetővé teszi a biológiailag aktív hatóanyag fokozatos kibocsátását a vékonybél traktuson belül a nyombéltől kezdődően, továbbá a rossz ízt maszkírozza. A bélben oldódó bevonattal teljes mértékben bevont granulátumok esetenként nem teszik lehetővé a biológiailag aktív hatóanyag felszabadulását, különösen a nem kifejlett egygyomrú vagy kérődző állatokban és így ez a biológiailag aktív anyag kiürülhet vagy a felszabadulása a bélrendszer nem megfelelő helyzetében történhet meg. Nem várt módon a hatóanyagkibocsátást késleltető anyaggal történő részleges bevonat képzés nem eredményezi a biológiailag aktív hatóanyagok gyomorban történő inaktiválódását. Ez valószínűleg amiatt valósítható meg mert a puffer hatást is biztosítjuk, amelyet a fenti 2. pontban írtunk le.

4. A savas pH-t előidéző hatóanyag javítja illetve növeli az állat nyálképzését és a fogyaszthatóságot elősegíti, továbbá csökkenti a gyomor pH értéket, ennélfogva biztosítja a késleltetett hatóanyagkibocsátást biztosító anyag integritását a gyomor-

5. Mivel a készítmény gél formájú, a gélképző szer csökkenti a granulátumból történő diffúziót és a granulátumot könnyű folyású szuszpenzió formában tartja. A gél továbbá biztosítja a szájüregbeni nyálkahártya védelmét azzal, hogy megakadályozza a szabad enzim (vagy más biológiailag aktív hatóanyag) diffúzióját a granulátumokból. A gélben a savas anyag jelenléte elősegíti a nyálképződést illetve az elfogadható íz érzetet.

A találmány szerinti készítményt és eljárást az alábbi példákon részeletesen bemutatjuk. A példák nem jelentik a találmány tárgykörének korlátozását.

1. példa

A készítmények előállítási eljárása:

Az alábbi fehérjebontó bromelin enzimet tartalmazó készít ményeket állítjuk elő:

(i) granulátum:

Bromelin

Dikálcium-foszfát tömeg/tömeg%

Cellulóz-acetát-ftálát

100 tömeg/törneg% (ii) savas pH hatóanyag:

Citromsav 5 tömeg/tömeg% a granulátum tömegére vonatkoztatva (iii) gélképző szer:

Karboxi-metil-cellulóz 10 tömeg/tömeg% a granulátum tömegére vonatkoztatva *·*· **·# «4 *♦ • · 4 · « • · · · * · · ····♦* *

Élj árás:

1. 1 kg cellulóz-acetát-ftalátot 10 liter vízben diszpergálunk.

2. Nátrium-karbonátot vagy nátrium-hidroxidot adagolunk kívánt mennyiségben az 1. lépésben képzett oldathoz és így nátrium-cellulóz-ftálát (nátrium-CAP) oldatot állítunk elő, amelynek pH értéke kb. 6.5.

3. 2.5 kg bromelint és 6.5 kg dikálcium-foszfátot töltünk egy spré bevonó tartályba, amely lehet Glatt (trademark) vagy aeromatic (trademark) spré bevonó berendezés. A port fluidizáljuk és 50°C hőmérsékletre melegítjük.

4. A nátrium-CAP elegyet a fluidizált porra permetezzük 2 bar (200 KPa) nyomás alkalmazásával, majd 30 percen át hagyjuk száradni.

5. A részlegesen bevont anyagot ezután 0.6 kg citromsavval és kg karboxi-metil-cellulózzal elegyítjük standard kezverőberendezésben.

A fluidizált részecske spré bevonása különösen előnyösen szabályozható és részlegesen bevont granulátumok állíthatók elő. Abból a célból, hogy részleges bevonást valósítsunk meg, a biológiailag aktív anyag/gyenge bázis bevonatban alkalmazott tömegaránya általában kb. 1:0.1 vagy l:<0.1 közötti.

A kapott granulátum készítményt a későbbi példákban Detach névvel jelöljük.

ml Detach dózist állítunk elő úgy, hogy körülbelül 4 ml vizet adagolunk 1 g (körülbelül 1 ml térfogat) granulátumhoz, és így 5 ml össztérfogatot nyerünk.

t , r

2. példa

Bromelin bél traktuson történő áthaladási idejének meghatározása, ahol a bromelint egyetlen 5 ml térfogatú Detach dózis formában alkalmazzuk, amely Detach 1 g granulátumot tartalmaz, amelyhez vizet adagoltunk, hogy a savas gél bázist előállítsuk nem elválasztott malacot, amelyek 4 hetesek elhelyeztünk egy megfelelő ketrecben, majd csoportokra osztottunk véletlenszerűen és egyes csoportokat Detach kezelésnek vetettünk alá illetve nem kezeltünk és így kontroll csoportot képeztünk. Általában 1 kontroll malacra 2 kezelt malacot számítottunk. A malacokat mesterséges tejjel napi két alkalommal etettük (minden esetben 500 ml tejet adagoltunk).

A kísérlet kezdetekor valamennyi malacot a Detach kezelt csoportban orálisan tápláltuk olyan táplálékkal, amely egy 5 ml standard dózis Detach tartalmú (amely olyan szuszpenzió, ami 1 g vízben oldott granulátumot tartalmaz, és így savas gél alapot képez). Az inokulálást követő 1, 12, 28, 48, 72 és 144 óra elteltével 3-3 véletlenszerűen kiválasztott malac csoportot (amelyben 2 kezelt és 1 kontroll állat található) barbiturát túladagolással elpusztítottunk, majd a vékonybélt eltávolítottuk. A vékonybélből 10 cm hosszú részeket metszettünk ki 5 helyzetben: nyombél, csipőbél alsó-rész, középső éhbél és ezen helyzetek közötti középpont. Ezeket a kimetszett mintákat azonnal -20°C hőmérsékleten tároltuk.

A kísérletsorozat befejezésekor a bél szekciókat, amelyet az egyes malacokból nyertünk, megolvasztottuk majd hosszanti irányban felnyitottuk és a nyálkahártya felületet üveglep segítsé18 *·*ί * « ··« «« ··»♦<♦ · ·♦ ·· ·♦ «* gével· lekapartuk. 0.2 g nyálkahártya kaparékot 1.8 ml higitási pufferben (WDB) szuszpendáltuk, amely foszfát puffereit fiziológiás sóoldatot (PBS, O.lm, pH 7.2) tartalmazott, amihez 0.05 térfogat/térfogat% Tween 30 anyagot 0.25 tömeg/térfogat% marha szérum albumint (BSA) etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA < 1 mm) és 0.1 tömeg/térfogat% nátrium-azidot adagoltunk. A kaparék szuszpenziót ezután bromelin jelenlétében enzim immuno próba segítségével analizáltuk (EIA, 1. eljárás az alábbiakban leírtaknak megfelelően) . A próba érzékenységét korábban meghatároztuk és egy 2 ng, amennyiben ugyanennyi enzimet, amely a Detach-ban található, azonban foszfát puffereit fiziológiás sóoldatban szuszpendált titrálás segítségével vizsgáltunk.

Az 1 és 12 óra időtartamon belül a dózis adagolása után elpusztított malacokban valamennyi béltraktus analízisében azt tapasztaltuk, hogy a Detach dózisokból bromelin jelenléte nyilvánvaló. Bromelin jelenléte nyilvánvaló a 28 óra múlva elpusztított malacok egyikében (a 4 és 5 helyzetekben kizárólagosan). Nem tapasztaltunk emésztőrendszeri anyag jelenlétet a kontroll malacokban, amelyeket EIA reakciónak vetettünk alá és nem tapasztaltunk semmilyen ilyen anyag jelenlétet a 48 óra után elpusztított állatokban vagy az ezt követően elpusztított mintákban.

Következtetés:

A bromelin áthaladási ideje a malacok vékonybél traktusán hasonló a tápanyag áthaladási idejéhez. A bromelin könnyen kibocsátható a béltraktusban.

*: ···: ···: .·· .··.

! - · * ··· ** _* ··*·♦< · *·♦ *V ·* «· «·

1. eljárás:

A Bromelin enzim immuno próba:

Lemezek: Nunc. (márkanév)

Lemez bevonat: Bromelin anti IgG, amely nyulakban tenyésztett, 2 órán át/37°C értéken karbonátban bevont; hidrogénkarbonát puffer (0.05m, pH 9.6, amely 10 μς/πιΐ IgG tartalmú) 100 mg/üreg. A bevont lemezt a felhasználás előtt 4°C hőmérsékleten tároltuk.

Tesztvizsgálati minták:

Bél kaparék, amely 1:10 tömeg/térfogat arányban hígított a hígító pufferben (WDB, a fent leírt puffer).

percen át 37°C hőmérsékleten inkubáit.

Konjugátum:

Avidin ureáz (Allelix Inc., Mississaugu, Toronto, Canada) 1:400 térfogat/térfogat hígításban konjugát pufferben (Chandler, D.S. és munkatársai, Vet Microbiol, 11: 153-161, 1986).

percen át 37°C hőmérsékleten inkubáit.

Szubsztrát:

Ureáz szubsztrát oldat (CSL; Parkville). 540nm értéken leolvasva (körülbelüli érték).

3. példa

Detach hatása a bél K88 receptor aktivitásra

Az E. coli K88 receptor jellemzőnek tekinthető számos protein vagy glikoprotein receptor molekula esetében, amely molekulák kimutathatóan kritikus szerepet játszanak fontos mikrobiológiai vékonybél megbetegedés patogenezisében. A bélbolyh határmembránon elhelyezkedő receptorokról kimutatták, hogy résztvesznek a patogén kötődésben (kolonizálásban), a sejtbevezetés20 '··« ··«· φφ • · ·9 Λ · ····φ • ♦ * « « * ·· ·· ··«φ* ben illetve a toxin szállításban. Ezen receptorok közül legalább néhányról kimutatták, például a K88 receptorról, hogy könnyen inaktiválhatók fehérjebontó enzimek segítségével, beleértve azokat a proteázokat is, amelyek normális esetben is aktívan jelen vannak a vékonybélben. (Wellwood, R., Biochim, Biophys. Acta 632: 326-335, 1980; Staley, T.E. és Wilson, J.B., Mól. Cell. Biochem 52: 177-189, 1983; Mouricourt, M.A. és Julién R.A., Infect. Immun., 55: 1216-1233, 1987).

A malacokat egy Y alakú rozsdamentes acél csípő fisztulával láttuk el a születés utáni 7-14. napon.

A malacokat egy szoptatási elválasztó sík ketrecben tenyésztettük és rekonstituált tejjel tápláltuk legalább 4 hetes korukig.

A K88 receptor aktivitást enzim immunopróba segítségével (Chandler 1986, lásd fent, a továbbiakban DPEIA) meghtároztuk. Bél mintákat gyűjtűttünk legalább 10 térfogat/térfogat%-os WDB oldatba, amelyhez 0.1 tömeg/térfogat% TI vegyületet adagoltunk. Ezt a puffért WDB/TI puffernek nevezzük.

Folyamatos mintavételi eljárást alkalmaztunk. A mintavétel úgy történt, hogy egy 4 ml belső átmérőjű tefloncsövet csatlakoztattunk. a fisztula csavarmenetes végéhez, másik végét pedig egy csőhöz csatlakoztattuk, amelyre egy lassan mozgó (0.5-1.0 ml/perc) perisztatikus szivattyú csatlakozott. Ez a cső vezetett a mintavételi csőbe. Ezek a mintavételi csövek 1 ml WDB/TI puffért tartalmaztak és frakciószedőben voltak elhelyezve. A frakciószedő általában a kromatográfiás oszlopok esetében fehérjekémiában alkalmazott frakciószedő lehet (Frac 100, Pharmacia). Jeget helyeztünk abba az edénybe a napi mintavétel indulásakor, ’ ₄ r ·· • 99 • I ·

·· amely a csövek tárolóját vette körül. Valamennyi mintavételi csőbe a szivattyú 10 perc időtartamon át kibocsátott mintáját gyűjtöttük. Hogy a fisztulára kifejtett húzóerőt csökkentsük a mintavételnél a cső malac és szivattyú közötti tömegét (amely szegekre szerelt) egy egyensúlyi súly segítségével felfüggesztettük .

Detach kezelés:

A malacokból mintát vettünk a Detach kezelés előtt 24-48 óra időtartamon át abból a célból, hogy a receptor aktivitás alapvonalát meghatározzuk. Ezután a malacokat 30 perccel a reggeli táplálás előtt 5 ml Detach szuszpenzióval (amely 1 g granulátumot tartalmaz) kezeltük. Ezt követően a mintavételt további 48-72 óra időtartamon át folytattuk.

Eredmények:

A kezelés után közvetlenül 3 nap időtartam alatt körülbelül 1000 mintát gyűjtöttünk. A malacokat tej diétán tartottuk. Sokkal több mintát vettünk közbenső periódusokban, és így lehetővé tettük, hogy sokkal világosabb de alapvetően hasonló receptor aktivitás minta jöjjön létre in vivő körülmények között.

A Detach kezelés előtti közvetlen időszakból illetve a

Detach kezelés utáni időtartamból vett mintákkal kapcsolatos eredményeket, amely mintákat folyamatos mintavétellel nyerjük a malacokból, az 1. táblázatban bemutatjuk. A kezelés utáni receptoraktivitás csökkenés tapasztalható és ezt a csökkenést egy egyutas variációs analízissel határoztuk meg, ahol a kezelés után 0-1 és 1-2 napon belül statisztikusan jelentős (P = 0.05) értéket mértünk. Ezek az adatok bizonyítják a korábbi megfigyeléseinket, amelyek azt mutatják, hogy különféle patogén adéziókra, a brome» t

- 22 - '· lin lebontó hatást fejt ki (beleértve a K88 receptort), valamint ilyen hatást fejt ki toxinokra és ezek bél receptoraira in vitro kísérletekben. A kísérlet ugyancsak bizo-nyítja azt a feltételezést, hogy receptor lebontó bromelin kapacitás van jelen, ami bizonyítja, hogy a Detach különféle emésztőrendszeri fertőzések megelőzésére alkalmas.

1. táblázat

Folyamatos mintavételnek alávetett malacok: K88 receptor aktivitás bél tartalom mintákban, amelyeket a gyógyszeres kezelés előtt és után 3 napon át gyűjtöttünk (A folyamatos mintavétel során a malacokat tej diétán tartottuk)

K88 receptor aktivitás*

Malac #

Kezelés	előtt (0-1 nap)	Kezelés (1-2 nap)	utáni (2-3 nap)
	(-3-0 nap)
1	DETACH	0.71 + /-0.11	0.19+/-0.15	0.33+/-0.29	0.17+/-0.19
		(21)	(16)	(40)	(15)
1	DETACH	0.28 + /-0.14	0.34+/-0.21	0.05 + /-0.10
		(79)	(30)	(24)
2	DETACH	0.28+/-0.22	0.08+/-0.08	0.11+/-0.15	0.06+/-0.09
		(68)	(42)	(38)	(42)
2	DETACH	0.55+/-0-19	0.11+/-0.10
		(39)	(25)
3	DETACH	0.30+/-0.17	0.15+/-0.10	0.23+/-0.20	0.24+/-0.24
		(78)	(34)	(15)	(35)

* Átlag abszorpciós értékek, amelyeket a bél tartalom mintákból nyertünk, amikor KPEIA kezelésnek vetjük alá ezeket. A táblázatban mutatott értékek átlagos abszorpció (A540) +/- standard deviáció értékek. Az egyes időperiódusok alatt gyűjtött minták számát zárójelben adjuk meg az abszorpció értékek alatt.

4. példa

Megelőző hasmenés kezelés hosszabb időtartamon át (az élet

6. napjától az elválasztás napjáig, amely körülbelül a 21. nap)

Számos külső helyszíni vizsgálatot végeztünk abból a célból, hogy kimutassuk a Detach kezelés hatásosságát a malac hasmenés megelőző kezelésében. Ezek a kísérletek azt jelzik, hogy a Detach kezelés hozzájárul az elválasztás utáni hasmenés kezeléséhez is (amely hasmenés általában K88 + E. coli együttműködéséből ered) egyetlen orális dózis alkalmazásával. Ezen túlmenően a Detach kezelés hatásosnak bizonyult elválasztás előtti (Sucker = szopási) meghajtási malacbetegség kezelésére ugyancsak egyetlen orális dózisformában. Az elválasztás előtti meghajtási betegség általában rotavírus vagy coccidial fertőzés következménye, ez általában krónikus képlékeny hasmenéssel jelentkezik és a malac körülbelül 1 hetes korában indul és további 1-3 héten át tart. Annak ellenére, hogy ez a betegség nagyjából krónikus természetű, egyetlen dózis Detach a betegség szokásos kora előtt adagolva, azaz olyan időszakban adagolva, amikor általában a hasmenés szimptómák szokásosan megjelennének a betegség kivédését eredményezi.

Élj árások:

A kísérletek céljára alkalmazott farm kereskedelmi tenyésztő farm volt, amely közép-nyugat Victoria államban, Australia helyezkedik el.

A malacokat és az emséket változó módon helyeztük a Detach kezelt vagy kontroll csoportokba.

A vizsgálat során összesen 30 szopós malacot alkalmaztunk:

Detach kezelt csoportba és 15 kontroll csoportba tartozott.

A malacokat gondnokságba vettük 3 napos koruk előtt bármely időpontban és ebben az időpontban meghatároztuk testtömegüket.

A Detach kezelt csoportba tartozó malacokat egyetlen orális dózis 5 ml Detach kezelésnek vetettük alá a 6. napon. A kontroll csoportot nem kezeltük Detach hatóanyaggal.

A szopós malacokat az elválasztási ketrecbe történő áthelyezés napján újra lemértük.

A hasmenés gyakoriságát meghatároztuk illetve maghatároztuk az adott kezelést és az elválasztásig létrejött mortalitást.

Ezen túlmenően meghatároztuk a kezelést, a mortalitást és a testtömeg növekedést.

Eredmények:

Az elválasztásig nyert eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.

- t

2. táblázat

	Az	elválasztásig	nyert	eredmények
Emsék	Detach	Kontroll Eltérés mért
	(+S.D	.)	(+S.D	·)
Malacok száma/
ágyban (3 nap)	9.87	(1.66)	9.73	(1.16)	0.745
Malac tömeg-3 nap (kg)	1.66	(0.09)	1.71	(0.15)	0.532
Mortalitás (hasmenés)	0.07	(0.26)	0.07	(0.26)	0.938
Hasmenés kezelés/ágy	4.2	(1.93)	22.67	(6.38)	<0.001
Malac elválasztáskor (kg)	8.05	(0.45)	5.97	(0.48)	<0.001
Elválasztás napja	30.00	(2.2)	29.27	(1.67)	0.41
Az elválasztásig test-
tömeg növekedés	6.38	(0.45)	4.25	(0.54)	<0.001
Napi élőtömeg növekedés	213	(0.17)	145	(19)	<0.001

Az eredmények jelentőségét úgy számoltuk, hogy variációs analízist végeztünk a malac/ágy és a 3 nap testtömeg variánsok illetve alkalmas esetben kovariánsok felhasználásával. Az elválasztási kort rendkívül hasonlónak találtuk és ezt általában a tenyésztőtelep vezetésének gyakorlata szerint alkakítottuk ki és nem az egyes malacok fejlődését vettük figyelembe. Ennek ellenére a másik jelentős kritérium, a betegség kezelésben elért csökkenési eredmény, 82%.

A vizsgálat világosan kimutatja, hogy az egyetlen dózis

Detach kezelés igen hatásos az elválasztás előtti hasmenés megelőzésében. Valamennyi meghatározó kritérium esetében jelentős javulást tapasztaltunk a kezelés során. Az elválasztáskor elért

testtömeg 2 kg értékkel növekedett és a betegség kezelés a kezelt malacokban (szopós malacok) a betegséget 80%-kal csökkentette. A mortalitás hiánya nem tette lehetővé ezen paraméter összehasonlítását .

Annak ellenére, hogy a Detach farmakológiailag rövid ideig hat, bármely korai dózis Detach adagolás hatásosnak bizonyul az elválasztás időpontjáig.

A vizsgálatból kitűnik, hogy annak ellenére, hogy nincs klinikai vagy fejlődési bizonyíték arra, hogy az elválasztás előtti hasmenéssel szemben mit tudunk elérni, egyetlen elválasztás előtti Detach dózis előnyösen alkalmazható dózis a tenyésztésben. A Detach kezelés hatásossága az elválasztás előtti hasmenés kezelésében ebből a kísérletből nyilvánvaló.

További 5 vizsgálatot végeztünk (az adatok nem jelzettek) abból a célból, hogy a Detach kezelés hatásosságát kimutassuk az elválasztás előtti (szopós) hasmenés megelőzésében. Ezen vizsgálatok során 5 ml Detach dózist (az 1. példa szerintieknek megfelelően) alkalmaztunk 5 napon át a születés után orális injekcióstűn keresztül történő adagolás formájában. Ezek a vizsgálatok nyilvánvalóan kimutatták, hogy az elválasztás előtti hasmenés nagymértékben csökken, továbbá más előnyök is jelentkeztek az elválasztás utáni hasmenés előfordulásában. A Detach kezelt malacok ezen túlmenően növelt testtömeg növekedést is mutattak és általános egészségi állapotuk is javult, valamint a betegségek száma is csökkent.

Hisztológiai vizsgálatok számos kontroll és kezelt malac esetében azt mutatták, hogy jelentős számú malac rotavírus pozitív volt illetve az elhalálozás utáni mintákban coccidia patogének találhatók. Ezzel szemben a Detach kezelt malacok nem mutattak ilyen fertőzést.

Számos további vizsgálatot végeztünk abból a célból, hogy kimutassuk a Detach hatását az elválasztás utáni hasmenés megelőzésében malacokban. Ezekben a vizsgálatokban összesen 1705 malacot alkalmaztunk, amelyek közül 502 negatív kontrollként, 100 pozitív kontrollként, 503 pedig 1 g Detach gél formával kezelt állatként szerepelt (az 1. példa szerint) és 600 egyéb kezeléseknek alávetett volt. A Detach hatásosságát ezek a vizsgálatok nyilvánvalóan bizonyították. Egyetlen állat sem puszult el E. coli által előidézett hasmenésben egyetlen dózis Detach alkalmazása esetén. Csak 2 Detach kezelt állat pusztult el hasmenésben, ugyanakkor 16 kontroll vagy antibiotikummal kezelt állat pusztult el ilyen betegségben. Ezen túlmenően a Detach igen aktívnak bizonyult az adott kezelés esetében mért mortalitás vonatkozásában. Valószínűleg a legjelentősebb megfigyelés az, hogy a háromszoros csökkenés jelentkezik, amikor elválasztás utáni hasmenésre fejtünk ki hatást.

5, példa

A bél autotoxikációt előállító Escherichia coli (ETEC) jelentős kórok a humán hasmenés betegségben, amelyet kimutattak (Sussman, Μ., The Virulence of E. coli, Reviews of Methods, Soc, Gén. Micro, 1985). Ezek a mikroorganizmusok azzal jellemezhetők, hogy egy vagy két hőlabilis (LT) vagy hőstabil (ST) enterotoxin képzésére alkalmasak (Gaastra, W. and de Graaf, F.K., Micro. Rév. 46: 129-161 (1982). Bizonyos törzsek ezen túlmenően antigén kolónia képző faktorokat (CFA) vagy oszlopokat képeznek, amik lehetővé teszik az ETEC törzsek adézióját a bél nyálkahártyához. Ezek elősegítik a kolonizálódást és lehetővé teszik azt, hogy az enterotoxinok a cél hámsejt közelébe kerüljenek (Gaastra és munkatársai, mint fent).

A kísérletben Spira és munkatársai RITARD modeljét írjuk le (Infect. Immun. 32: 739-747, 1981), amely alkalmas arra, hogy az 1. példában leírt Detach készítmény hatásosságát kimutassa in vivő kísérletekben, amelynek során a CFA/I pozitív E. coli kötődésének csökkentését mutatjuk be nyúl bél nyálkahártyához.

Anyagok és eljárások:

Állatok:

A kísérletben egyetlen tenyészetből származó mindkét nemű új zélandi fehér tenyésztésű nyulakat alkalmazunk. Testtömegük általában 1.5-2.7 kg közötti.

Baktérium:

A kísérletben alkalmazott ETEC törzsek eredetileg Bangladesben izoláltak hasmenésben szenvedő betegkből. A H10407 törzs (szerotípus O78:K88:H11) és a mutáns törzs származék a H10407p D.C. Evans által szolgáltatott (Houston, Texas) (infect. Immun. 19: 727-736, 1978). Az E1392/75 7A (szerotípus 06:K15:H16) törzset B. Rowe (London U.K.) szolgáltatta. Az H10407 törzs ST és LT toxint is termel és az antigén CFA/I kolonizáló faktort is tartalmazza. A H10407p törzs ST és LT anyagokat is termel, azonban nem termel CFA/I anyagot. Az E1392/75 7A törzs egy nem oszlop törzs és nem spontán laboratóriumi toxigén származék a CFA/II* E. coli 1392 törzs esetében (Sack, R.B. és munkatársai, Infect. Immun. 56: 378-394, 1988) és nem mutatott kolonizálási készséget, ezenkívül nem idézett elő a RITARD modelben hasmenést (Wanke,

C.A. és munkatársai, Infect. Immun. 55: 1924-1926, 1987).

A törzseket CFA agarba inokuláltuk (Evans, mint fent) és

37°C hőmérsékleten éjszakán át növesztettük. Ezután a baktériumot kigyűjtöttük, majd steril foszfát puffereit fiziológiás sóoldattal mostuk (O.Olm, pH 7.2; PBS). Ezután a kívánt optikai sűrűség méréshez hígítottuk. A baktérium koncentrációt életképes sejt számlálással határoztuk meg. (kétszeres vér agar lemezek alkalmazásával PBS-ben végzett sorozathigítás segítségével). Valamenynyi tenyészetet CFA/I és LT termelés vonatkozásában vizsgáltuk specifikus enzim immunpróba (EIA) segítségével a nyúl inokulálás után.

RITARD model:

A RITARD módéit Spira és munkatársai dolgozták ki (lásd fent). Ezt a módéit alkalmaztuk kisebb módosításokkal, amelyeket az alábbiakban ismertetünk. Az inokulálás előtt a nyulak felét mindenegyes csoportból (1. táblázat) orális adagban 0.42 g granulátum 1. példa szerinti készítménnyel kezeltük, amely készítmény Detach néven ismert, majd ezt követően 18 órán át éheztettük, miközben kívánság szerint ivóvizet adtunk nekik.

A betegség megfigyelése:

A nyulakat hasmenés kialakulása vonatkozásában figyeltük, megfigyeltük ezek gyengeségét, illetve óránként bekövetkező elpusztulásukat az inokulálás utáni első 24 óra időtartam alatt. A nyulakat egyenként hasmenés szempontjából kategóriákba soroltuk és 0-3 számmal jelöltük, ahol 0 azt jelenti, hogy nem alakul ki hasmenés; 1 jelentése enyhe hasmenés, amely a normálisnál lágyabb székletet eredményez; 2 jelentése közepes hasmenés legalább három nedves ürülékkel; és 3 jelentése súlyos hasmenés, amely számos nedves ürüléket jelent. Széklet lemosott mintát gyűjötttünk, amikor a székelés megtörtént illetve rektális törléssel székletmintát vettünk, a székletet nem jelző nyulakból. Az inokuláló törzsek jellemző E. coli kolóniába tartozó törzsek voltak morfológia vonatkozásában is és EIA próba alapján is.

Szövetminta vétel:

A fertőzés után 24 órával valamennyi állatot elpusztítottuk és a vékonybélvől üregen belüli folyadékmintát mértünk. Az eutanáziával elpusztított vagy elpusztult nyulakban a vékonybél traktusban a nagy mennyiségű folyadéktérfogat (nagyobb mint 60 ml) azt jelzi, hogy a pusztulás fő oka a hasmenés volt. A vékonybél traktusból 2 x 3 cm méretű metszeteket vettünk 5 pontról, amelyek a nyombél (SÍ), a közeli éhbél (S2) közép éhbél (S3), a távoli éhbél (S4) és a csőpőbél (S5). Valamennyi szegmenst hosszanti irányban felnyitottuk és alaposan kimostuk PBS steril oldattal, abból a célból, hogy meghatározzuk a szorosan kötött baktériumokat illetve a mosás után maradó baktériumokat és így meghatározzuk az összes baktériumszámot. Kvantitatív mennyiségű tenyészetet készítettünk úgy, hogy a szövetet 1 percen át homogenizáltuk Sorvall homogenizátor segítségével, amelyet teljes sebességen alkalmaztunk. Ezután PBS oldatban higítási sorozatot készítettünk és ebből 25 μΐ alikvot részeket egy vér agar és CFA agar lemezre inokuláltunk. A lemezetket 18 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáltuk, majd az 1 cm szövetre eső baktériumszámot meghatároztuk. Egyéb mintákat azonnal hisztológiai vizsgálat céljára feldolgoztunk úgy, hogy ezeket 10%-os semlegesre puffereit formaiinban fixáltuk. Miután a mintákat paraffinba ágyaztuk, hematoxilin-eozin festés és szövet Gram festés próbát végeztünk.

Statisztikai analízis:

A baktérium számokat lóg formában transzformáltuk, hogy a varianciát stabilizáljuk és Genstat 5 eljárással analizáljuk. A Detach védelem hatásosságát Fortran-Finney módszerrel határoztuk meg, amely program meghatározza a kemoterápiás tesztvizsgálatból a hatásosságot (%) (Finney, D.J., Statistical Method in biological Assay, Pub. Charles Griffin and Company Ltd., 1952).

Eredmények:

Különféle nyúlcsoportoknak 1 x 10¹^ különféle E. coli törzs baktériumot és steril PBS oldatot adagoltunk abból a célból, hogy 24 órán át tartó inkubálási periódusban megfigyeljük a hasmenés válászfüggvényt. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. Különféle E. coli enterotoxint és kolonizációs faktor kombinációt alkalmaztunk, beleértve a pilláit enterotoxin törzset (H10407) és az egyszerű enterotoxigén törzset (H10407/p) illetve egy nem pilláit nem eterotoxin típusú törzset (E1392/97/7A). PBS kontrollt is alkalmaztunk, abból a célból, hogy a sebészet hatását illetve a Detach hatást megfigyeljük baktéri-umos fertőzés nélkül.

A 10 ml steril PBS oldattal kezelt nyulak közül egyetlen egy sem mutatott hasmenést. Egyetlen nyúl sem mutatott hasmenést, amelyet nem pilláit H10407/p és E1392/75/7A törzzsel fertőztünk. A boncolás során a vékonybél gyomorkapu záróizom és csípővakbél csatlakozás közötti szakaszában a folyadéktérfogat 10-50 ml közötti volt.

A 8 kontroll (Detach anyaggal nem kezelt) nyúl közül, amelyet H10407 törzzsel fertőztünk, 7 elpusztult vagy bőséges víztartalmú hasmenést mutatott. Boncolás során ezen állatok vékonybél traktusában a folyadéktérfogat 20-105 ml közötti volt. A vékony és vastagbélben található együttes térfogat ugyanekkor 130-165 ml közötti volt (összehasonlítva az E1392/75/7A, a H10407/p és a PBS anyaggal kezelt nyulakban található 10-50 ml térfogattal).

A H10407 fertőzés előtt Detach hatóanyaggal kezelt nyulak közül egyetlen egy pusztult el. Ez a nyúl a fertőzés után 11 órával pusztult el, miután egyetlen lágy ürüléket képzett. A Detach hatóanyaggal kezelt további 6 nyúl közül egyetlen sem szenvedett hasmenésben és többségük (6 közül 4) 24 órán belül is megfelelő konzisztenciájú székletet termelt. Boncoláskor a vastagbél tartalma szilárd volt és a vékonybél traktusban felgyülemlett folyadék mennyisége 16-60 ml közötti érték.

3. táblázat

Detach kezelt illetve nem kezelt és különféle ETEC törzsekkel fertőzött nyulak hasmenés válaszfüggvénye

Csoport	Törzs	Adhezin	Toxin	Kezelés	Hasmené;
A	H10407^b	CFA/I⁺	ST⁺LT⁺	D	1/7^C
				C	7/8^d
B	H1070p	CFA/I	ST⁺LT⁺	D	1/4^C
				C	1/4^C
C	E1392/75	CFA/II	STLT“	D	0/4
	7A			C	0/4
D	PBS			D	0/4
				C	0/4

s válasz⁵ ·· ··« *

- 33 a = a hasmenésben szenvedő vagy elpusztult állatok száma / a tesztvizsgálatnak alávetett állatok összes száma b = 5 nyúl, amely az analízisből kimaradt amiatt, hogy nem hasmenéssel kapcsolatos módon pusztult el c = enyhe hasmenés d = a fertőzést túlélt nyúl, a 3 helyzetben a kolóniaszám

5.8 x 10⁹ e = elpusztult Detach kezelt nyúl, a 3 helyzetben a kolóniaszám

1.2 x 10⁷

Baktérium adézió:

Valamennyi állaton kvantitatív tenyészetet hoztunk létre abból a célból, hogy a fertőző baktérium adézióját vizsgáljuk a vékonybél különböző területein. Valamennyi mintát steril PBS oldattal mostuk abból a célból, hogy a bél nyálkahártyához adézióval csatlakozó baktériumokat megfigyeljük. A fertőző batkériumok minden vizsgált helyen megtalálhatók. A legerősebb kolóniát a CFA/I⁺ H10407 törzs képezte. A Detach által nem kezelt nyulakban a CFA/I⁺ baktérium különböző helyzetekben mért átlagértéke viszonylag alacsony az SÍ, S2, S4 és S5 helyzetekben (8.7 x 10⁷,

6.2 x 10⁷, 1.04 x 10® és 6.2 x 10® kolóniaképző egység (CFU/cm sorrendben) és jelentősen magasabb érték az S3 helyzetben (6.2 x 10⁹). Az eredményeket a 4. táblázatban mutatjuk be. Az alábbi analízisben a 3 helyzet tenyészeteit alkalmaztuk összehasonlítás céljából.

A Detach kezelt nyulakban a nyálkahártyához kötött CFA/I⁺ baktériumszám 1.3 x 10⁴ (minimális szám) - 1.2 x 10⁷ CFU/cm érték volt (átlagérték 2.6 x 10® CFU/cm). Ez 2000szer-nél kisebb CFU/cm értéket jelent a kontroll nyulakkal szemben, amelyeket ugyanilyen ··♦· ·»·· « · értéket jelent a kontroll nyulakkal szemben, amelyeket ugyanilyen törzzsel fertőztünk (p<0.05). A 4. táblázatban bemutatjuk a Detach kezelt és a nem kezelt állatok közötti kolóniaszám különbséget.

A példa eredményeiből nyilvánvaló, hogy a Detach készítmények jelentősen csökkentik a bél flórát. Feltehető, hogy az elpusztult illetve a hiányzó bélflóra a patogén mikroorganizmusoknak felel meg. Az ilyen mikroorganizmusokat helyettesíthetjük előnyös mikroorganizmusokkal, mint például olyan mikroorganizmusokkal, amelyek egészséges állatokból származnak. Ilyen mikroorganizmusok, amelyet probiotic névéi nevezzük és ezek lehetnek streptococcusok és lactobacillusok.

A CFA/I” H10407/p törzzsel fertőzött nyulak vékonybél nyálkahártyájához kötött baktériumszám 1.3 x 10⁴ CFU/cm (minimális számlálás) - 6.6 x 10⁷ CFU/cm érték olyan nyálban, amely enyhe hasmenésben szenved (átlagérték 1.6 x 10⁷ CFU/cm). A CFA/II kolóniák száma hasonló mértékű, ahol a (CFU/cm) kolóniák száma

1.3 x 10⁴ (minimális számlálás) - 1.3 x 10θ (átagérték egyenlő 3.9 x 10⁷ érték közötti). Nem tapasztalható jelentős baktériumszám különbség a Detach kezelt és a nem kezelt állatok között, amennyiben bármely nem pilláit törzzsel fertőzöttek.

A steril PBS kezelésnek alávetett állatok esetében viszonylag kis számú baktéria található a vékonybélben (átlagérték = 1.3 x 10⁴ CFU/cm).

4. táblázat

Állatonként 10¹¹ CFU fertőzés (RITARD) után a vékonybél átlagos kolonizálás száma

Kolonizálás

Csoport Törzs

Kezelés

SÍ

S3

S5

A	H10407	D	2.9	X	10⁶	3.2	X	10⁶	7.1	X	10
		C	8.7	X	10⁷	6.2	X	10⁹	6.2	X	10
B	H10407p	D	1.0	X	10⁸	2.3	X	10⁷	1.2	X	10
		C	1.9	X	10⁷	1.2	X	10⁷	1.8	X	10
C	E1392/75 7A	D	6.1	X	10⁶	1.6	X	10⁷	5.9	X	10
		C	7.5	X	10⁶	5.0	X	10⁷	2.1	X	10
D	PBS	D	2.0	X	10⁶	5.9	X	10⁵	5.6	X	10
		C^a	3.2	X	10⁵	1.3	X	10⁶	1.2	X	10

a = kivéve az olyan nyulat, amely igen erős kolonizációt mutat

A baktériumok bélsár kiválasztása:

A nyulakból a székletképzés után a székletből mintát vettünk. Valamennyi állatban azt tapasztaltuk, hogy a fertőző baktérium a székletben kiürült. Rektális székletmintát vettünk boncolás során. Valamennyi állatban a fertőző törzs jelenlétét tapasztaltuk a végbélben, beleértve azokat is, amelyek nem képeztek székletet a kísérlet befejezése előtt. Valamennyi esetben a tenyésztett kolóniák 100%-a a fertőző törzsekhez tar tozott .

» · ' ₄ <

- 36 Hlsztolóqia:

A vékonybél szövetek hisztológiai vizsgálatát végeztük el és valamennyi nyúl esetében azt tapasztuk, hogy fénymikroszkópia esetében nem jelentkezik nyálkahártya rendellenesség. A mikroszervezetek jelenlétét csak ritkán láthatjuk a nyálkahártyán, ami azt jelzi, hogy a baktériumok bizonyos területen kötöttek és nem egyenletesen elosztottak a bél traktusban.

Eredmények értékelése:

A szakirodalomban jól ismert, hogy a patogenezis igen hasonló mechanizmuséi emberekben és állatokban ETEC fertőzések esetében. A legtöbb ETEC törzs emberi vagy állati eredetű körben először az adézió során felgyülemlik adézió céljára, majd ezután a vékonybélben kolóniákat képez. Mindkét fajta esetében a hasmenés betegség úgy jön létre, hogy megfelelő mennyiségű enterotoxin képződés történik.

A kísérletben kimutattuk, hogy a Detach orális adagolása, amely egy proteáz készítmény, sikeresen, csökkenti a hasmenés vagy hasmenés által indukált elhalálozás mértékét, CFA/I⁺ H10407 baktériummal fertőzött nyulakban ezt 86%-kal csökkenti (a 7 állat közül 6 esetében). A kontroll nyulak esetében, amelyek nem kaptak Detach kezelést 87% (a 8 állat közül 7) elpusztult vagy súlyos hasmenésben szenvedett.

Wanke és munkatársai (lásd fent) közleményükben leírták, hogy a hasmenéses fertőzés klinikai szimptómáinak határértéke 10® CFU/cm vékonybél szakasz. Ebben a vizsgálatban az olyan nyulak esetében, amelyeket olyan baktériumtörzsekkel fertőztek, amelyek nem ismert kolonizálási faktorral rendelkeznek, nem mutatkozott hasmenés és a kolóniaképzés a 10⁷ határérték alatti volt. Ezekben *4 ·»·* ·«·« ··

- 37 a nyulakban nem tapasztaltak kolonizálási koncentráció eltérést a kezelt csoportok között. Más eljárás esetében a Detach kezelésnek alá nem vetett nyulak, amelyek pilláit H10407 fertőzöttek voltak, olyan baktérium kolóniát mutattak, amelynek szintje jóval a 10' fenti érték feletti (átlagérték = 6.2 x 10⁹) . A Detach kezelt nyulak, amelyeket ugyanilyen baktériumtörzzsel fertőztünk, csak olyan mértékben képeztek kolóniát, mint ami olyan baktériumokkal figyelhetünk meg, amelyek nem képeznek ismert CFA kolóniákat (átlagérték = 2.6 x 10θ). Az eredményekből nyilvánvaló, hogy az orális úton adagolt Detach kezelés hatásos a nyúl nyálkahártya felület módosításában, és így a CFA/I⁺ baktérium kolonizálás jelentősen csökkentett (p<0.05).

A nyulak esetében nyert eredmények kiterjeszthetők minden további nélkül emberek esetére is, mivel a humán és az állati ETEC fertőzések patogenezise igen hasonló. Ebből eredően a nyúl standard modellként szolgálhat humán bakteriális fertőzések vizsgálatában.

A humán betegek kezelése Detach készítménnyel ennélfogva védelmet kell jelentsen például az enterotoxigén Escherichia coli betegségek kezelésében. A védelem abból adódik, hogy a meghatározó humán ETEC hasmenés kialakulásában szerepet játszó egyedek viluráns szaporodását biztosító bél receptorokat a kezelés lebont ja/módosít ja, amely például a virulens kolonizációs faktor antigéneket jelenti. Ezek a CFA/I, a CFA/II, a CFA/III és a CFA/IV.

Az általunk végzett kísérletek (az adatok nem jelzettek) azt mutatták, hogy humán egyedek esetében a vékonybél anyag kezelése egy proteáz (papain) enzimmel nagymértékű csökkenést eredménye38 • *·♦♦ ·*·♦ ·· ·· : · · « · * ί · · · ·< ·· • _ ♦ ·· ·· · · ··· ** ·· ·· «« zett az enterotoxigén Eschericia coli baktérium adézióban és különösen csökkentette a CFA/I és az enterotoxin kötődését a bél preparátumokhoz, továbbá teljes inhibiálást eredményezett a CFA/II kötődésében. Az adatok azt jelzik, hogy a Detach készítmény hatásos kell legyen embereken in vivő kezelésben és védelmet jelent az enterotoxigén E. coli által okozott betegségekkel szemben.

6. példa

A Detach kezelés után megnövekedett globulin koncentráció

A kísérletet abból a célból hajtottuk végre, hogy a humán fiziológiát másoljuk egy malac modellben, abból a célból, hogy meghatározzuk a nagydózisú Detach (nagyobb mint 1 g) hatását a szérum biokémiai jellemzőire. A tízszeres dózisértéket választottuk abból a célból, hogy meghatározzuk a szérum globulin koncentráció változását.

Kísérlet:

A kísérletben 15 10-16 hetes malacot alkalmaztunk.

A csoport - 8 malac nem kezelt

E csoport - 7 malac, amely 10 g Detach dózissal kezelt 3 alkalommal naponta 2 vagy 5 napon át.

A szérum biokémiai jellemzőit a kezelés előtt illetve kezelés után mindkét csoportban összehasonlítottuk és ezzel meghatároztuk, hogy a kezelés milyen hatást fejt ki a fenti j ellemzőre.

Eredmények:

Azt tapasztaltuk, hogy jelentős (p = 0.043) növekedés tapasztalható a szérum globulin koncentrációban, amennyiben a ma« ♦

lacokat nagy dózisú Detach készítménnyel kezeljük. Kisebb dózis Detach (kisebb mint 10 g) alkalmazása nem eredményezett jelentős változást (az adatok nem jelzettek).

Ezután a globulin koncentrációt tovább is vizsgálatuk. Az alfa-, a béta- és a gamma-globulin koncentrációkat analizáltuk elektroforézis segítségével cellulóz-acetát és kvantitatív denzitométer alkalmazásával.

Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be.

5. táblázat

Szérum globulin koncentráicók

Malac szám

Kezelés

Gamma növekedés

204

202

242

240

228

224

217

t

- 40 A gamma-globulin átlagos növekedése 170%, az alfa- és béta-globulin koncentrációk a malac mintákon belül változtak, ennélfogva ezen értékekből következtetés nem vonható le. Az eredmények azonban konzisztensek voltak a gamma-globulin koncentrációk változásával .

A gamma-globulin koncentráció változását a kezelés előtti és kezelés utáni értékek vonatkozásában a két csoportban variancia analízissel vizsgáltuk. A növekedés statisztikusan jelentős (P = 0.03, 0-99.5%). Az antigén specificitás (és az antitest osztály) a gamma-globulinok esetében azonban még nem meghatározott.

Az eredmények azt mutatják, hogy a szérum gamma-globulin koncentrációja növekszik, azonban ez lehetséges, hogy nem specifikus gamma-globulin koncentráció növekedés a Detach adagolás után. A szérum IgG koncentrációjának kövekedése ugyancsak szerepet játszhat a nyálkahártya immunitásban. Ez magyarázhatja azt is, hogy igen széles mikrobaellenes spektrummal rendelkezik a Detach adagolás, amely hatást megfigyeltük bakteriális, vírusos és protozoa fertőzés esetében is.

7. példa

Hasmenés megelőzése borjúkban

A vizsgálatot Warragul közelében hajtottuk végre Victoria államban abból a célból, hogy meghatározzuk milyen mértékben képes a Detach kezelés megakadályozni illetve megelőzni fiatal borjúkban a hasmenés kialakulását. A vizsgálatot a tavasz végi borjú növekedési szezonban hajtottuk végre Gippsland-on, ahol a fő fertőző mikroorganizmus a néhány utóbbi évben a Cryptosporidia volt.

.J...

- 41 A vizsgálatot 6 tejtermelő farmon végeztük. Valamennyi vizsgált gazdaság cetrikus volt, mivel ezekben sok éven át ez a betegség komoly problémákat okozott.

Tesztvizsgálati anyag:

Az 1. példa szerinti Detach

Dózis: Gél formájú 35 ml

Élj árás:

A Detach dózis 35 ml, amelyet kívánság szerint kb. 3-4 alkalommal napi osztásban megismételtünk. A maximális dózisszám, amelyet bármely borjúnak adagoltunk, 5 volt.

Általában a hasmenés az 1 hetes és 4 hetes kor között alakult ki. Általában a borjúkat 28 napig a nevelőkarámban tartották majd ezután átkerültek a borjú legelőre, ahol már kisebb érzékenységet mutattak. Feljegyeztük a hasmenéses napokat, a kívánt antibiotikum dózisokat és elektrolit mennyiséget. Az elpusztulás időpontját is jegyeztük az elpusztulás okával együtt, amennyiben ez ismert volt. A székletből mintákat küldtünk analízisre a laboratóriumba. A bélmintákat ugyancsak továbbítottuk a laboratóriumba vizsgálatra az olyan farmokról, ahol elhalás tapasztalható.

Két farmon a borjúk tömegét is mértük a vizsgálat végén és megpróbáltuk meghatározni, hogy van-e nagy különbség a növekedés sebességében a két csoport között. Ilyen különbség értékét nem tapasztaltunk.

A hasmenéses napokat és a borjúnként alkalmazott antibiotikum adagokat páros + tesztvizsgálattal analizáltuk. A mortalitás adatait Chi-négyzetes tesztvizsgálattal analizáltuk.

A vizsgálat és az ebből eredő adatok eredményeit a 6. táblázatban adjuk meg.

t

6. táblázat

Borjúkban Detach vizsgálat eredményei

Kezelt Kontroll P

A borjúk száma	50	55
Mortalitás %	4%	25%	★ ★
Hasmenéses napok/borjú	1.45	2.33	★ ★
Detach dózis/borjú	2.24	-
Antibiotikum dózis/borjú	0.34	1.00	★
Elektrolit dózis/borjú	2.98	3.18	-
Átlagos napi testtömeg
növekedés (kg/nap)	0.93¹	0.97¹	-
Az első hasmenés kora (nap)	10.2	9.5	-

Megjegyzések: -¹- Csak két farmon mert borjúk tömege * P < 0.05 ** P < 0.01

A Detach kezelés jelentősen csökkentette a mortalitást csaknem valamennyi farmon, ezen túlmenően csökkentett antibiotikum és elektrolit kezelést is eredményezett. Az elhalási arány 25-4% mértékben csökkent (különbség P < 0.01). Az antibiotikum dózis 1 dózis/borjú értékről 0.34 dózis/borjú értékre csökkent. Az elektrolit alkalmazás kisebb mértékben csökkent és a kontroll borjú esetében 3.18 dózis, a kezelt borjú esetében 2.98 dózis volt.

A hasmenéses napok, száma, azaz amikor hasmenést tapasztaltunk, ugyancsak csökken, ez a csökkenés a kontroll borjúk esetében tapasztalt 2.33 nap/borjú értékről 1.46 nap/borjú érték volt a kezelt borjúk esetében (eltérés P < 0.01).

A legnagyobb hatás a mortalitásra tapasztalható. A mortalitás valószínűleg a Cryptosporidia által okozott, amely a domináns patogén, amit az elhalálozás utáni mintákból illetve a székletből izolálhatunk. A Cryptosporidia igen nagymértékben patogén bél parazita fiatal borjúk esetében, amely ellen eddig nem találtak hatásos kezelést. A borjúk elhullása megtörténhet a hasmenés kialakulása után 1 vagy 2 nappal. Más esetekben az állatot elektrolitok alkalmazásával több héten át életben tarthatjuk, azonban igen legyöngített állapotban. A Detach kezelés valóban nagy reményt kelt az ilyen betegség kezelésében.

Két vagy több Detach dózis (35 ml) nyilvánvalóan védelmet jelent a fiatal borjúk esetében a Cryptosporidia fertőzésével szemben és csökkenti az antibiotikum terápia szükségességét.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Készítmény, azzal jellemezve, hogy tartalmaz (i) egy granulátumot, amely a biológiailag aktív hatóanyagot valamely gyenge bázissal együtt tartalmazza és részben bevont egy, a bél-nedvekben oldható hatóanyag kibocsátást csökkentő anyaggal;

(ii) egy savasságot biztosító adalékanyagot,amelynek pH értéke oldatban körül-belül 1.5-6 érték közötti; és (iii) egy gélképző szert.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott biológiailag aktív hatóanyag egy fehérje, amely enzim, növekedési faktor vagy hormon.
3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott protein valamely enzim, amely lehet bromelin, papain, ficin, kimotripszin, tripszin, ribonukleáz, karboxi-peptidáz A vagy B, subtilisin.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott biológiailag aktív anyag nem protein típusú biológiailag aktív anyag.
5. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a nem protein típusú biológiailag aktív anyag valamely vitamin, kofaktor, fémion vagy antibiotikum.
6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a gélképző hatóanyag a vízzel vagy más oldószerrel történő elegyítés során gélt képez.
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a granulátumok felületének 10-90 bevont a hatóanyagkibocsátást csökkentő anyaggal.
8. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a savasságot biztosító anyag szemcsés formájú.
9. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy egy olyan savas gélt képez, amely mikrogranulátumot tartalmaz és ez a gélképzés vizes oldat adagolása során képződik.
10. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy továbbá egy vagy több antibiotikumot tartalmaz.
11. Készítmény, azzal jellemezve, hogy savas gél formájú, pH értéke körülbelül 1.5-6 közötti és mikrogranulátumot tartalmaz, amely magában foglalja a biológiailag aktív hatóanyagot valamely gyenge bázissal kombinációban, és amely részben bevont egy, a bél-nedvekben oldható hatóanyagkibocsátást késleltető anyaggal.
12. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív hatóanyag valamely protein, amely lehet egy enzim, egy növekedési faktor vagy hormon.
13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott protein valamely enzim, amely lehet például bromelin, papain, ficin, kimotripszin, tripszin, ribonukleáz, karboxi-peptidáz A vagy B vagy subtilisin.
14. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív hatóanyag nem protein típusú biológiailag aktív anyag.
15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a nem proteinszerű biológiailag aktív hatóanyag valamely vitamin, kofaktor, fémion vagy antibiotikum.

··· ·. ..· ·..·
16. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a granulátum felülete körülbelül 10-90 mértékben bevont a hatóanyagkibocsátást késleltető anyaggal.
17. A 11. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy továbbá egy vagy több antibiotikumot tartalmaz.
18. Eljárás biológiailag aktív anyagoknak állatok felső vékonybél traktusában történő felszívódására, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti készítményt megfelelő oldattal reagáltatjuk és így gélt képezünk, majd ezután az így képződött gélt az állatoknak orális úton adgoljuk.
19. Eljárás biolgóiailag aktív anyagoknak állatok számára felső vékonybél traktusban történő felszívódására, azzal jellemezve, hogy az állatoknak a 10-14. igénypontok bármelyike szerinti készítményt orálisan adagoljuk.
20. Eljárás bél patogének és/vagy betegségek, amelyek bél patogén fetőzéssel kapcsolatosak, állatokban történő kezelésére, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti készítményt, ahol a készítményben található biológiailag aktív anyag valamely proteáz megfelelő oldattal reagáltatjuk és gélt képzünk, majd ezt követően az így képzett gélt az állatnak orálisan adagoljuk.
21. Eljárás bél patogének és/vagy betegségek amely betegségek bél patogén fertőzéssel kapcsolatosak állatokban történő kezelésére, azzal jellemezve, hogy az állatnak a 11. igénypont szerinti készítmény terápiásán hatásos mennyiségét adagoljuk, ahol a készítményben a biológiailag aktív hatóanyag valamely proteáz.
22. A 20. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy proteázként bromelint alkalmazunk.
23. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt bél patogén egy baktérium, vírus vagy parazita.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt bél patogén egy enterotoxikus Escherichia coli, Shigella, Yersinia, Pleisiomonas, Vibrios, Aeromonas, Campylobacter, rotavírus, Cryptosporidia vagy Coccidosis.
25. A 20. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény továbbá egy vagy több antibiotikumot tartalmaz.
26. A 20. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ezzel egyidőben vagy lényegében egyidőben egy vagy több antibiotikumot adagolunk.
27. A 20. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt állat egy egygyomrú állat vagy egy nem kifejlett kérődző.
28. A 20. vagy 21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt állat humán egyed, disznó, borjú, ló, hal vagy rákféle.
29. Eljárás állatokban hasmenés kezelésére, azzal jellemezve, hogy az állatoknak egy savas gélt adagolunk, amelynek pH értéke körülbelül 1.5-6 közötti és amely gél mikrogranulátumokat tartalmaz, amely mikrogranulátumok azzal jellemezhetők, hogy egy fehérjebontó enzimet tartalmaznak valamely gyenge bázissal együttesen és részben bevontak hatóanyagkibocsátást késleltető anyaggal, amely anyag a bél nedvekben oldható.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjebontó enzim bromelin.

ΛΛΛΛ
31. Α 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gél ezen túlmenően egy vagy több antibiotikumot tartalmaz.
32. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gél adagolásával egyidőben vagy lényegében egyidoben egy vagy több antibiotikumot adagolunk.
33. Eljárás állatokban az immunrendszer nem specifikus stimulálására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti készítményt, amelyben a biológiailag aktív hatóanyag valamely proteáz, egy megfelelő gélképző oldattal reagáltatjuk, majd ezután az így képzett gélt az állatoknak orális úton adagoljuk.
34. Eljárás állatokban az immunrendszer nem specifikus stimulálására, azzal jellemezve, hogy az állatoknak a 10. igénypont szerinti készítményt adagoljuk, ahol a készítményben a biológiailag aktív anyag valamely proteáz.
35. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy proteázként bromelint alkalmazunk.
36. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelt állat humán egyed, disznó, borjú, ló, hal vagy rákféle.
37. Eljárás az 1. igénypont szerinti készítmény felhasználására, ahol a készítményben a biológiailag aktív hatóanyag valamely proteáz gyógyszerkészítmény előállítására, amely gyógyszerkészítményt bél patogének és/vagy hasmenés kezelésére alkalmazhatunk állatokban.
38. A 37. igénypont szerinti felhasználási eljárás, azzal jellemezve, hogy proteázként bromelint alkalmazunk.