HUT63883A

HUT63883A - Physiologically active kanglemycin c, process for producing and using same

Info

Publication number: HUT63883A
Application number: HU9200677A
Authority: HU
Inventors: Wang Nanjin; Yang Xianshu
Original assignee: Nippon Kayaku Kk
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 1993-10-28
Also published as: CA2061642A1; CS59492A3; JPH0570470A; CN1037526C; HU9200677D0; CN1064504A; KR920018226A; IL101103A0; EP0501399A1; AU1119892A; US5275817A

Description

A találmány a fiziológiailag aktív kanglemicin C-re, valamint az annak előállítására szolgáló eljárásra és gyógyászati alkalmazására vonatkozik. Közelebbről, a találmány kanglemicin C-re vonatkozik, amely új immunszuppresszánsként autoimmun hemolitikus anémia és, nefritisz kezelésére, valamint kötőszöveti és zsigeri transzplantátumok kilökődésének meggátlására alkalmazható, továbbá a fenti anyag előállítására alkalmas eljárásra, és a fenti anyag gyógyászati alkalmazására.

A legújabban kifejlesztett, nagy szelektivitást mutató, immunszuppresszánsok bizonyos immunsejtek egy alcsoportjának specifikus szabályozására fejtik ki hatásukat. A fenti immunszuppresszánsok egyik képviselője, a ciklosporin A szelektíven gátolja a segítő T-sejt kiónok proliferációját és így jelentős eredménnyel alkalmazható a szerv-transzplantációk területén. Fenti tulajdonsága következtében a ciklosporin A-t [(Agents and Actions, 6., 468-475 (1976)] széles körben alkalmazzák a klinikai gyakorlatban. Azonban a ciklosporin A-nak különféle mellékhatásai vannak, például akut (vagy krónikus) vese-intoxikáció, enyhe remegés, idegi károsodások, ínygyulladás, hajhullás, stb.

Az újabban felfedezett FK-506 jelű anyag [(Journal of Antibiotics, 40, 1249 (1987)] egy makrolid antibiotikum (C44H69NO22)» amely kísérleti szinten kedvező eredményeket adott. Azonban bonyolult előállítása miatt valószínű, hogy a fenti anyag klinikai alkalmazása korlátozott lesz.

A fenti hátrányok ismeretében olyan új ideális immunszuppresszánst kerestünk, amely a hagyományos immunszuppresz« ·« ···« · ·· • · · · · · · • · · · ···· β • · ·· ······ · ··· ·· ·« · · ·

-3szánsok különféle hátrányaival nem rendelkezik.

Célunk továbbá iparilag előnyösen alkalmazható eljárás kidolgozása volt egy ilyen immunszuppresszáns előállítására.

Célunk továbbá olyan mikroorganizmus izolálása volt, amely alkalmas egy új immunszuppresszáns termelésére.

Célunk volt ezen kívül egy új immunszuppresszánst előállítani gyógyászati alkalmazásra.

Széleskörű kutatásokat végeztünk abból a célból, hogy olyan új immunszuppresszánst találjunk, amely az ismert immunszuppresszánsok hátrányaival nem rendelkezik. Kutatásaink eredményeként sikerült egy, a Nocardia később Amycolatopsisnak nevezett (International Journal of Systematic Bacteriology, 1986. jan., 29-37) genusba tartozó törzs fermentációs tápközegéből egy új immunszuppresszáns anyagot izolálnunk, amely rendkívül kis móltömegű, ezt az anyagot kanglemicin Cnek neveztük. Azt találtuk, hogy ez az új immunszuppresszáns, amely jobb tulajdonságokkal rendelkezik, a jövő nemzedék immunszuppresszánsává válhat. Találmányunk ezen a felismerésen alapul.

A találmány tehát első megközelítésben az alábbi fizikai-kémiai tulajdonságokkal jellemezhető, fiziológiailag aktív kanglemicin C-re és annak sóira vonatkozik:

(1) móltömeg (EI-MS): m/z 326 (M⁺) (2) összegképlet: CigH^gOs (3) olvadáspont: 170 °C (bomlással) (4) optikai forgatóképesség: [α]²⁵ο⁼ + 150° (c = 0,57, metanol) (5) UV abszorpciós spektrum (metanol):

• · · · λ _max nm (lóg e) 232 (4,61), 356 (3,93) (6) IR abszorpciós spektrum (KBr) (cm^-1):

3400, 1690, 1650, 1640 (7) ¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-dg):

204,02 (s) , 160,58 (s) , 70,92 (s) , 20,47 (t) , 195,0 (S), 159,50 (s), 136,66 (d), 134,58 (s), 43,62 (d),

23,75 (q), 123,95 (d), 46,52 (t), 31,47 (t), 44,89 (d) , 117,69 (s), 122,68 (d) , 118,21 (d), 196,90 (s),

54,93 (d), (8) ^XH-NMR (400 MHz, DMSO-dg):

5,78 (1H, széles s), 1,98 (3H, s), 2,79 (1H, d,

J=18,	,54), 2,35 (1H, d, J=18₍	>54) ,	1,47	(2H, m),	1,98
(1H,	m) , 1,79 (1H, m), 1,98	(1H,	t) ,	7,30 (1H,	d),
7,75	(1H, t), 7,55 (1H, d),	2,91	(1H,	d), 3,37	(1H,

d) .

Másik megközelítésben a találmány a fiziológiailag aktiv kanglemicin C és sói előállítására alkalmas eljárásra vonatkozik, amelynek jellemzője, hogy a Nocardia genusba tartozó kanglemicin C termelésére képes mikroorganizmust tenyésztjük, majd a tenyészléből kinyerjük a fiziológiailag aktív hatékony kanglemicin C-t.

Harmadik megközelítésben a találmány a kanglemicin C-t termelő, Nocardia genusba tartozó mikroorganizmusra is vonatkozik.

Negyedik megközelítésben a találmány immunszuppresszív hatású gyógyászati készítményekre vonatkozik, amelyek hatóanyagként a fiziológiailag aktív kanglemicin C-t, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák.

4·4· · ···· «··· · • · · · ······ · • · · ·« ·· · · ·

-5Αζ ábrákat az alábbiakban ismertetjük.

1. ábra: kanglemicin C UV abszorpciós spektruma

2. ábra: kanglemicin C IR abszorpciós spektruma (KBr-ben fel- véve)

3. ábra: kanglemicin C ¹³C-NMR spektruma (100 MHz, DMSO-dg)

4. ábra: kanglemicin C ^-H-NMR-spektruma (4 00 MHz, DMSO-

-d₆)

A találmány szerinti kanglemicin C moltömege - amint az a fent ismertetett fizikai-kémiai tulajdonságokból kitűnik 326, ami rendkívül kis értéket jelent az ismert immunszuppresszánsok moltömegéhez viszonyítva.

Optikai forgatóképessége [ck]²⁵d= + 150° (c = 0,57, metanolban). A kanglemicin C metanolban 232 és 356 nm-nél mutat abszorpciós maximumot UV abszorpciós spektrumában; IR abszorpciós spektrumában 3400, 1690, 1650, 1640, 750 cm^-1-nél mutat abszorpciót. A vegyület összegképlete elemanalízis adatok szerint C19HX8O5. A vegyület poláros, szerves oldószerekben oldódik, de vízben és nem-poláros szerves oldószerekben oldhatatlan. A tisztított kanglemicin C sárgás, kristályos anyag.

A találmány értelmében a fiziológiailag aktív kanglemicin C-t a Nocardia genus-hoz tartozó kanglemicin C termelésére képes mikroorganizmusok tenyésztésével állítjuk elő, majd a tenyészléből a kanglemicin C-t kinyerjük.

A kanglemicin C termelésére képes mikroorganizmusokra példaként említjük a Nocardia mediterránéi var. kanglensis 1747-64 törzset, amely a Nocardia genusba tartozik és a Kínai Népköztársaság területén izoláltuk. A fenti törzs bak-64 4 44 4··

4 *4

4 4 44 • 444444· teriológiai és fiziológiai tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük .

1. Morfológiai tulajdonságok

A törzset 28 °C-on, 2 héten keresztüli inkubálás után vizsgáltuk. A hifák egyszerűek, határvonaluk kacskaringós vagy hurokalakú. A szubsztrát-micélium töredezését figyeltük meg. Sem sporangium, sem örv nem képződik. A spórák felülete síma vagy durva, néha szúrós. A spórák hengeralakúak, méretük 0,6-0,8 x 0,8-1,3 um. Mintegy 10 lánc képez egy spórát.

2. Szaporodás különféle tápközegeken

A törzset a különböző tápközegeken 28 °C-on, 2 héten keresztül tenyésztettük. A megfigyeléseket az 1. táblázatban összegezzük.

1. Táblázat

Tápközeg Növekedés Légmicélium Szubsztrát- Oldható pigment

-micélum

szacha	jó	közepes,	halvány-	barnás
róz-nitrát		fehér-hal-	sárga-hal-
agar		ványsárga	vány na-
		narancs-	rancs-

színű színű • * az 1. táblázat folytatása • · · « «· · · «««* · · · · · • · ·« «···«· · «·· ·♦ ·· · ··

Tápközeg	Növekedés	Légmicélium	Szubsztrát micélum	Oldható pigment
Glükóz-	közepes	közepes,	halvány-	sárgás
-aszpara-		fehér-hal-	sárga-hal-
gin agar		ványsárga	vány na-
		narancs-	rancssár-
		színű	ga
Glicerin-	jó	közepes,	halvány-	barna
-aszpara-		fehér-hal-	sárga-hal-
gin agar		ványsárga	vány na-
		narancs-	rancssárga
		sárga
Keményítő-	közepes	közepes,	halvány-	barnás
-szervetlen		fehér	sárga-
sók agar			-halvány
			sárgásbarna
Tirozin	közepes	közepes,	halvány-	barnás
agar		fehér	sárga-hal-
			ványsárgás

barna

-8az 1. táblázat folytatása « ·4 »·»« ·· * ·· · · * · · • ··« 9 · · ·· • 9 ·· ···>««9

9·· 99 ·· «·«

Tápközeg	Növekedés	Légmicélium	Szubsztrát micélum	Oldható pigmen'
Tápagar	közepes	közepes,	halvány-	nincs
		fehér-hal-	sárga-hal-
		ványsárgás	vány na-
		narancs-	rancssár-
		sárga	ga
Élesztő-	közepes	közepes,	halvány-	sárgás
-maláta		fehér	barna
agar
Zabliszt	közepes	közepes,	halvány	sárgás
agar		halvány	narancs-
		narancs-	színű
		sárga-
		-halvány
		sárgás-
		barna
Pepton-	közepes	-	halvány-	nincs
-élesztő-			sárga

-vas agar ···· · • · * · ···« · · · » · ···· · · ··· ·· ·· · «·

3. Fiziológiai tulajdonságok

Optimális szaporodási hőmérséklet: 27-37 °C

Nitrát redukálás: negatív

Zselatin elfolyósítása (glükóz-pepton-zselatin közeg, 20 °Con): negatív

Keményítő hidrolízise (keményítő-szervetlen sók agaron): negatív

Fölözött tej koagulálása: pozitív

Fölözött tej peptonizálása: pozitív

Melanoid pigment képződése: negatív

4. Szénforrás hasznosítása (Pridham-Gottlieb agar közeg)

L-arabinoz + D-xilóz + D-glükóz + D-fruktóz + szacharóz + inozit + L-ramnóz + raffinóz

D-mannit +

5. Sejtfalban lévő diamino-pimelinsav: mezo-diamino-pimelinsav

A fenti törzs sejtfala tehát mezo-diamino-pimelinsavat tartalmaz. Az International Streptomyces Project (rövidítése: ISP) módszere szerint a spórát képező hifák rektiflexibles vagy rektikuliaperti fejezetbe tartoznak; a spórák felülete sírna vagy durva; az érett hifa színe a fehér különféle árnya-10latait; mutatja a törzs nem képez melanoid pigmenteket vagy egyéb pigmentet a tápközegben; a szubsztrát-micélium színe halványbarna vagy halványsárga; osztódás megfigyelhető; a törzs szénforrásként, például L-arabinóz, D-glükóz, D-fruktóz, szacharóz, inozit, L-ramnóz, D-xilóz és D-mannit felhasználásával szaporodik, de raffinózt nem hasznosít.

A fenti tulajdonságok ismeretében átvizsgáltunk egy bakteriológiai kézikönyvet [Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás (1974)]; az eredmények alapján arra következtettünk, hogy a törzs a Nocardia genus-ba tartozik. Ezért a törzset Nocardia mediterránéi var. kanglensis 1747-64nek neveztük (továbbiakban: 1747-64 törzsnek nevezzük). A törzset a Committee of Preservation and Control of Chinese Microorganism-nál helyeztük letétbe a Kínai Népköztársaságban 1991. február 20-án, letéti száma: CGMCC 0163. A törzset a Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Sciense & Technology of Japan-nál is letétbe helyeztük 1992. január 28-án a Budapesti Egyezménynek megfelelően, letéti száma: FERM BP-3718.

A találmány értelmében a kanglemicin C-t úgy állítjuk elő, hogy a Nocardia genus-ba tartozó kanglemicint termelő mikroorganizmust tenyésztjük és a fiziológiailag aktív kanglemicin C-t a tenyészléből kinyerjük.

A kanglemicin C-t termelő baktériumok tenyésztésére bármely olyan tápközeg megfelel, amely megfelelő, a kanglemicin C-t termelő baktériumok által asszimilálható tápanyagforrásokat tartalmaz. Szénforrásként például glicerint, glükózt, maltózt, szacharózt, dextrint, keményítőt, olajokat és zsí

-11rokat, stb. alkalmazhatunk. A nitrogénforrás szerves anyapéldául szójaliszt, gyapotmagliszt, húsextraktum, pepton, száraz élesztő, élesztőkivonat, kukoricalekvár, stb. vagy szervetlen anyag, például ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, nátrium-nitrát, kalcium-karbonát, ammónium-klorid, stb. lehet.

Kívánt esetben a tápközeget szervetlen sókkal, például nátrium-kloriddal, kálium-kloriddal, nehézfémsókkal, stb. és aminosavakkal, vitaminokkal is kiegészíthetjük.

A fermentáció során a habzás megakadályozására megfelelő habzásgátló anyagokat, például szilikonolajat, szójaolajat, stb. is alkalmazhatunk a szokásos módon.

A tenyésztésre a legelőnyösebb módszer a mély levegőztetéses, forgatott tenyészet, amely az antibiotikumok előállítására van adaptálva.

A tenyésztési hőmérséklet nem kritikus, amennyiben az adott hőmérsékleten a baktérium képes a kanglemicin C termelésére, például 25 és 37 °C között változtatható anélkül, hogy lényegesen csökkentené a kanglemicin C-t termelő baktérium szaporodását. A különösen előnyös hőmérséklet 27 és 32 °C közötti tartományba esik.

A tenyésztést általában addig folytatjuk, amíg a tápközegben a kanglemicin C megfelelő mértékben felhalmozódik. A tenyésztési idő a tápközeg összetételétől és az inkubálási hőmérséklettől függ. Általában a tenyésztést 20-60 órán keresztül folytatva kapunk kívánt mennyiségű kanglemicin C-t.

Közelebbről a mikroorganizmus tenyésztését az 1. példában ismertetett módon végezhetjük. Ezek szerint a 1747-64 törzset ferde tenyésztő tápközegen tartjuk fenn, amely ke• · · · ···· · · · · · • · ·· ······ · •·· ·· ·· · · ·

-12ményítőt, nátrium-kloridot, kálium-nitrátot, agart, stb. tartalmaz. Ezután a ferde tenyészetről összegyűjtjük a micéliumokat, és oltótenyészet tápközegbe oltjuk. Az oltótenyészet tápközege glükózt, élesztőkivonatot, szójalisztet, kálium-hidrogén-foszfátot, ammónium-szulfátot, stb. tartalmaz. Az oltótenyészetet 25-32 °C-on, 24-55 órán keresztül inkubáljuk. Az így kapott fermentációs oltótenyészetet a fermentációs tápközegbe visszük át, és 25-32 °C-on, 68-96 órán keresztül folytatjuk a tenyésztést. A fermentációs tápközeg glükózt, élesztőkivonatot, szójalisztet, peptont, kálcium-karbonátot, stb. tartalmaz. A fenti módon kapott fermentléből ezután a kanglemicin C-t kinyerjük.

A fent kapott fermentléből a kanglemicin C-t megfelelő módszerekkel izoláljuk.

így például a fermentlevet szűrjük, és a micéliumot ismert módon, például centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszóból a kanglemicin C-t megfelelő oldószerekkel végzett oldószeres extrakcióval, adszorpciós vagy ioncserélő képességen alapuló kromatográfiával, a fenti módszerek külön-külön, vagy kombinált alkalmazásával izolálhatjuk, tisztíthatjuk és dúsíthatjuk.

A találmány szerinti eljárással előállított kanglemicin C erősen gátolja az immunsejteket, különösen a lépsejtek átalakulását. A találmány szerint előállíthatok tehát immunszuppresszáns gyógyászati hatású készítmények is, amelyek hatóanyagként kanglemicin C-t, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák. A találmány szerinti immunszuppresszáns gyógyászati készítményeket melegvérű állatoknak, • · ···· ···· · • · ·· ······ · • · · ·· · · · ··

-13így embernek is adhatjuk a kanglemicin C hatásos dózisát tartalmazó mennyiségben. A találmány szerinti immunszuppresszáns készítményt parenterálisan injektálhatjuk; de a készítményeket orálisan, vagy az injektálástól eltérő más parenterális módon is adagolhatjuk. A kanglemicin C dózisa a kezelendő személytől és a kezelési módtól függően változik, általában 0,1 mg - 100 mg/kg/nap, előnyösen 0,5-50 mg/kg/nap lehet.

A gyógyászati készítmények formája nem kritikus. A kanglemicin C-t különféle cseppfolyós vagy szilárd készítményekké alakíthatjuk a gyógyszerkészítésben szokásosan használt adalékanyagokkal, például hordozóanyagokkal, segédanyagokkal, stb.; a készítmények az össztömegre vonatkoztatva 0,01-50 tömeg% kanglemicin C hatóanyagot tartalmazhatnak. Az így előállított készítményeket orálisan vagy parenterálisan alkalmazhatjuk.

Amint az a fentiekből látható, a kanglemicin C egy új, fiziológiailag aktív anyag, amelyet a Nocardia genus-ba tartozó 1747-64 törzs fermetlevéből állíthatunk elő. A kanglemicin C erősen gátolja az immunsejtek, különösen a lépsejtek konverzióját, és erősen gátolja a tumorsejtek proliferációját is. Ezenkívül a kanglemicin C-t bizonyos szempontból előnyösen lehet előállítani, az ismert immunszuppresszánsokhoz viszonyítva rendkívül kis moltömege miatt.

Fentiek következtében a kanglemicin C várhatólag a jövő nemzedék immunszuppresszáns anyagát jelentheti, nem rendelkezik az ismert immunszuppresszánsok különféle hátrányai val.

• · · ·

-14A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.

1. példa

Kanglemicin C előállítása

A 1747-64 törzset tenyésztjük és fermentáljuk. A kapott fermentlevelet szerves oldószerrel extraháljuk. A kanglemicin C-t az extraktumból oszlopkromatográfiás eljárással izoláljuk és tisztítjuk. A részleteket az alábbiakban ismertetjük.

(1) Ferde tenyészet tápközege: kálium-nitrát 0,1%, nátrium-klorid 0,5%, kálium-hidrogén-foszfát 0,05%, vas-szulfát 0,01%, keményítő 2%, agar 1,7%, hideg, felforralt víz, pH 7,0; inkubálás 28 °C-on, 5-7 nap;

(2) Oltótenyészet tápközege: glükóz 2,5%, élesztőpor 0,5%, kálium-klorid 0,25%, szójaliszt 0,5%, dikálium-hidrogén-foszfát 0,02%, ammónium-szulfát 0,5%, magnézium-szulfát 0,02%, kalcium-karbonát 0,5%, csapvíz 100 ml (pH-t nem állítjuk be);

(3) Fermentációs tápközeg összetétele: glükóz 3%, élesztőkivonat por 1%, szójaliszt 0,5%, pepton 0,2%, kalcium-karbonát 0,1%, csapvíz 100 ml (pH-t nem állítjuk be).

Az összes fent ismertetett tápközeget 121 °C-on, 30 percen át sterilezzük autoklávban. A ferde tenyészetből egy kacsnyi 1747-64 törzset 250 ml-es, 50 ml oltótápközeget tartalmazó lombikba oltunk, és 28 °C-on, 48 órán keresztül forgó-rázó gépen (180-200 fordulat/perc) tenyésztjük. A kapott oltótenyészetet ezután 500 ml-es, 50 ml fermentációs tápközeget tartalmazó lombikba oltjuk át 10 térfogat%-nak megfelelő mennyiségben. A tenyésztést 28 °C-on, 72 órán keresztül végez

-15zük forgó-rázó gépen (180-200 fordulat/perc).

Az ilymódon kapott fermentlevet szűrjük, és a szűrlet pH-ját szervetlen savval 4-re állítjuk. A szűrletet butil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot koncentráljuk, majd szilikagélen kromatografáljuk. Az eluálást kloroform és metanol 30 : 1 térfogatarányú elegyével végezzük. A fiziológiailag aktív frakciókat összegyűjtjük és koncentráljuk. A koncentrátum Sephadex™ LH-2 0 oszlopon tovább tisztítjuk, az eluálást etanollal végezzük. A fiziológiailag aktív anyagot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és koncentráljuk. Az anyagot etanolból átkristályosítva tisztított kanglemicin C-t kapunk, sárga, tűs kristályok formájában, amelyek 170 °C-on bomlanak. Az anyag moltömege 326 és optikai forgatóképessége:

[α]²⁵ο = +150° (c = 0,57, metanol); UV abszorpciót metanolban 232 nm-en és 256 nm-en mutat (1. ábra); IR abszorpciós spektrumában 3400 cm^-1-nél, 1690 cm^-1-nél, 1650 cm^-1-nél, 1640 cm^-1-nél, 750 cm^-1-nél kapunk abszorpciós sávokat (2. ábra). A vegyület szerves, poláros oldószerben oldódik, de vízben és nem-poláros szerves oldószerben oldhatatlan.

2. példa

Kanglemicin C izolálása és tisztítása

1 1. példa szerint előállított fermentléhez 20 1 butil-acetátot adunk. Az elegy pH-ját 3 n sósavval 4,0 értékre állítjuk és extraháljuk. A szerves fázist vákuumban szárazra pároljuk. 3,12 g maradékot kapunk, amelyet 30 ml metanolban oldunk és 30 g szilikagélt (gyártja: Chingtao Kaiyo Kako Factory) adunk az oldathoz. Az elegyet vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot 800 ml, kloroformban duzzasztott szi4*44 4 • t 44 44444· 4 ··· 44 ·« 4 ··

-16likagéllel töltött oszlopra visszük. Az oszlopot kloroform és metanol 30 : 1 térfogatarányú elegyével eluáljuk. A kívánt frakciókat összegyűjtjük, és bepároljuk. 25,3 mg barnás port kapunk. A port etanolban oldjuk. Az oldatot 300 ml etanolban duzzasztott Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals Inc.) töltetű oszlopon kromatografáljuk, az eluálást etanollal végezzük. A kívánt frakciókat összegyűjtjük, és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot kevés etanolból átkristályosítva 9,5 mg kanglemicin C-t kapunk, sárgás tűs kristályok formájában.

Olvadáspont: 170 °C (bomlás közben) Tömegspektrum (El) m/z: 326 (M⁺) Elemanalízis eredmények a ¢19^305 összegképlet alapján: számított: C = 69,93%, H = 5,55%;

talált: C = 69,58%, H = 5,60%.

¹³C-NMR spektrum (100 MHz, DMS0-d₆) (3. ábra):

204,02 (s), 160,58 (s), 70,92 (s), 20,47 (t), 195,0 (s), 159,50 (s), 136,66 (d), 134,58 (s), 43,62 (d), 23,75 (q) , 123,95 (d), 46,52 (t), 31,47 (t), 44,89 (d), 117,69 (s), 122,68 (d), 118,21 (d), 196,90 (s),

54,93 (d)

ÍH-NMR spektrum (400 MHz, DMSO-d₆):

5,78 (1H, széles s), 1,98 (3H, s), 2,79 (1H, d),

J=18	,54), 2,35 (1H	, d, J=18,54),	1,47 (2H, m),	1,98
(1H,	m), 1,79 (1H,	m), 1,98 (1H,	t), 7,30 (1H,	d),
7,75	(1H, t), 7,55	(1H, d), 2,91	(1H, d), 3,37	(1H,

d) .

-174 · • « ♦ • 4 • 4 ·« 4« ·

Nagynyomású folyadékkromatográfia:

oszlop: Senshu Pák ODS-2151-A 60 x 150 mm hőmérséklet: 35 °C detektálás: UV (232 nm) mozgó fázis: acetonitril - 0,1 mol/liter koncentrációjú foszfát puffer (pH 6,0) 4 : 6 térfogatarányú elegye retenciós idő: 7,41 perc (kanglemicin C)

Kanglemicin C immunszuppresszív aktivitása és tumorsejtek növekedését gátló aktivitása, valamint toxicitása

A kanglemicin C 0,5 Mg/ml dózisban 96,9%-os gátlást fejt ki az egér lép-limfociták konverziójára. Az egér lépsejtek tenyészetében a kanglemicin C nem mutatt toxicitást 40 μg/ml dózisban, ami azt jelenti, hogy spermatogén sejtekre 1 mg/ml koncentrációban nem toxikus.

A kanglemicin C-t egérnek intravénásán 2 mg/kg dózisban adagolva nem tapasztaltunk pusztulást. Ez azt bizonyítja, hogy a kanglemicin C toxicitása igen kicsi.

A kanglemicin C 0,1 μg/ml vagy annál kisebb koncentrációban gátolja a K562 leukémiasejtek proliferációját, és 0,1 μg/ml koncentrációban gátolja a HeLa S₃ sejtek proliferációját.

3. példa

Tabletta előállítása tömegrész kanglemicin C, 120 tömegrész kristályos laktóz, 147 tömegrész kristályos cellulóz és 3 tömegrész magnézium-sztearát elegyét v-formájú tablettázó gépen 300 mg-os

tablettákká alakítjuk.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Fiziológiailag aktív kanglemicin

C, (1) moltömege (El): m/z 326 (M⁺) (2) összegképlete: CjgHigOs (3) olvadáspontja: 170 °C (bomlás közben) (4) optikai forgatóképessége: [α]²⁵ ₀ ⁼ +150 metanol) (5) (6) (7) (8) • ·99 «« · • · · ·

9 · · ·· • a·*·»·· ·· · ·« amelynek ° (c = 0,57,

UV abszorpciós spektruma (metanol):

^nmmax (109 €) 232 (4,61), 356 (3,93)

IR abszorpciós spektruma (KB) (cm^-1):

3400, 1690, 1650, 1640 ¹³c-NMR spektruma (100 MHz,

DMSO-dg)

1H-

204,0 2 (s), 160,58 (s), 70,92 (s) , 20,47 (t), 1 95,0 (s) , 159,50 (s), 136,66 (d), 134, 58 (s), 43,62 (d) , 23,75 (q), ¹ 23,95 (d), 46,52 (t), 31,47 (t), 44 ,89 (d) , 117,69 (s), 122,68 (d), 118, 21 (d), 196,90 (S) 54,93 (d) NMR sp ektruma (400 MHz, DMSO-dg): 5,78 (1H, sz éles s), 1,98 (3H, s) , 2,79 (1H, d) / J=18, 54), 2, 35 (1H, d, J=18,54), 1,47 (2 H, m) , 1,98 (1H, m) , 1,7 9 (1H, m), 1,98 (1H, t), 7,3 0 (1H, d), 7,75 (1H, t) , 7,55 (1H, d), 2,91 (1H, d) , 3,37 (1H,

d) , és gyógyászatilag elfogadható sói.

2. Eljárás fiziológiailag aktív kanglemicin

C és sói előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Nocardia genus-ba tartozó, kanglemicint termelő mikro- • · · «*·· ·99 ·· « · 4 ·· • ·· 4 9 · · ·· • · * · · ···· · · ··· »· ·· ·99

-20organizmust tenyésztünk, és a kanglemicin C-t a tenyészléből kinyerjük.
3. Gyógyászati készítmények, amelyek hatóanyagként fiziológiailag aktív kanglemicin C-t, vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák.
4. A 3. igénypont szerinti gyógyászati készítmények, amelyek immunszuppresszív hatásúak.
5. A Nocardia genus-ba tartozó fiziológiailag aktív kanglemicin C-t termelő törzs.
6. Az 5. igénypont szerinti kanglemicin C-t termelő törzs, amely Nocardia mediterránéi var. kanglensis 1747-64 (FERM BP-3718) .
7. Eljárás az immunrendszer szuppresszálására, azzal jellemezve, hogy a kezelendő emlősnek fiziológiailag aktív kanglemcin C-t vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját adagoljuk gyógyászatilag hatásos mennyiségben.
8. A fiziológiailag aktív kanglemicin C, vagy gyógyászatilag elfogadható sójának alkalmazása gyógyászatilag hatásos anyagként.
9. A fiziológiailag aktív kanglemicin C, vagy gyógyászatilag elfogadható sója alkalmazása immunszuppresszív hatású gyógyászati készítmények előállítására.