HUT63879A

HUT63879A - Plant polypeptides having a patogenic microorganism inhibiting activity

Info

Publication number: HUT63879A
Application number: HU9200712A
Authority: HU
Inventors: Jonathan Duvick; Tracy Rood
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 1991-03-04
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1993-10-28
Also published as: NZ241813A; HU9200712D0; EP0502719A1; CA2061861A1; AU1140292A; JPH06228198A; AU5513694A

Description

A találmány anyagokkal és eljárásokkal foglalkozik növények, emberek és állatok gomba-eredetű és egyéb patogénjeinek elpusztítására és gátlására, valamint olyan anyagokkal és eljárásokkal, amelyek közvetlenül betegség elleni rezisztenciát adnak át növényeknek.

Nagy az érdeklődés olyan új mikrobicidek kifejlesztésében, amelyek nincsenek káros hatással a gazdaszervezetre, de nagy a patogének elleni hatékonyságuk. Az egyik érdeklődési terület, amelyre a mikrobicidként aktív vegyületek kutatása irányul, a természetben előforduló vegyületek területe, mivel ezeket a környezetben, az emberekben és az állatokban meglevő természetes mechanizmusok könnyen képesek detoxikálni.

Emberek és alacsonyabb rendű állatok

A baktériumok és gombák több betegség okozói emberekben és alacsonyabb rendű állatokban. Ezen betegségek tartománya kiterjed a kisebb irritációktól (pl. epidermofitózis, a lábujjak közének betegsége) egészen a súlyos vagy akár végzetes szisztémás fertőzésekig. A szisztémás fertőzések kezelésében alkalmazott, elsősorban a szisztémás gombás fertőzések kezelésében alkalmazott gyógyszeres kezelések gyakran okoznak súlyos mellékhatásokat a kezelt emberekben és állatokban. Ennek megfelelően folyamatos az igény az ember- és állatgyógyászat területén új és hatékony fertőzésellenes vegyületek kifejlesztésére.

Növények

Számos gomba és baktérium nem csupán emberekben és alacsonyabb rendű állatokban patogén, hanem súlyos kórokozója a mezőgazdasági terményeknek is. A növényi betegségek leküzdésének egyik, ma is alkalmazott eljárása szerves vagy félig szerves • « · · · · · · · • · · · · ···· ···« ·· «· ·

- 3 antimikrobiális vegyszer felvitele növényekbe. Ez az eljárás számos, a szakterületen ismert problémát vet fel. Egy nem régi eljárás a mikroorganizmusok által okozott károsodások leküzdésére az olyan biológiai szabályozó szervezetek alkalmazása, amelyek tipikusan természetes versenytársai vagy inhibitorai a kórokozó mikroorganizmusoknak. Nehéz azonban biológiai szabályozó organizmusokat alkalmazni nagy területekre, és még nehezebb olyan élő organizmusokat alkalmazni, amelyek hosszabb időn át képesek fennmaradni a kezelt területen. A legújabb időkben a rekombináns DNS technikák nyújtottak kedvező lehetőséget olyan klónozott gének beiktatására növényi sejtekbe, amelyek bizonyos fehérjéket fejeztek ki növényi sejtekben. Ilyen fehérjék lehetnek pl. olyanok, amelyeknek ismert antimikrobiális aktivitásuk van. Ez a technológia azonban további aggodalmakat vet fel a jól ismert, természetben előforduló antimikrobiális anyagok elleni rezisztencia kapcsán, különösen az erős szelekciós nyomás figyelembevételével, amely bizonyos területeken létrejöhet. így tehát folyamatosan fennáll az igény további, természetben előforduló vegyületekre, amelyeket növényi sejtek közvetlenül alakíthatnak ki egy egyedi strukturgén transzlációja segítségével.

A 204,509 számú európai szabadalmi bejelentés, amely a 725,368 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentésen alapul, eljárást ír le növényi sejt genetikai módosítására, hogy heterológ, idegen szerkezeti gének kifejezése szabályozható legyen. Az eljáráskor a növényi sejteket úgy transzformálják, hogy tartalmazzon egy pRi T-DNS promotort és egy heterológ idegen strukturgént, ahol a promotor és a strukturgén olyan helyzetben és orientációban vannak egymáshoz viszonyítva, hogy a strukturgén a növényi sejtben a promotor szabályozása alatt fejezhető ki.

-4• · · ·· ···· ··· · · · · · ·

Hasonlóképpen a 186,425 számú európai szabadalmi bejelentés, amely a 685,824 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésen alapul, olyan rekombináns DNS kifejező vektort ír le, amely tartalmaz (a) egy transzkripciós egységet, amelyet T-DNS határoló szekvenciák szegélyeznek; ez tartalmaz egy promotort, ehhez társult amino terminális területet kódoló szekvenciákat és egy terminátor szignál szekvenciát; ebben a szekvenciák egy vagy több, valamely növényi sejtben természetesen kifejeződő génből származnak, és (b) egy antibiotikum rezisztencia gént kódoló szekvenciát a promotor és a társult amino-terminális területet kódoló szekvencia, valamint a terminátor szekvencia között, és (c) egy olyan DNS fragmentumot, amely Agrobacterium-ban működőképes replikont tartalmaz.

A 8807087 számú PCT bejelentésben, amely a 168109 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentésen alapul, r&kombináns vírus kifejező rendszert írnak le, amely egy polihedrin promotort és egy heterológ peptidet vagy fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett pepiidnek vagy fehérjének antimikrobiális hatása van.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A találmány szerint két, növényekből származó polipeptidről, a Bandeiraea II. lektinről és a kimopapainról, megállapítottuk, hogy hatékony antimikrobiális aktivitásuk van több, közönségesen előforduló patogén ellen. A találmány tehát szélesebben értelmezve olyan kompozíciókkal foglalkozik, amelyek tartalmazzák ezeket a polipeptideket, foglalkozik továbbá ezen polipeptideket és az azokat tartalmazó kompozíciókat emberi, állati és növényi patogének ellen alkalmazó eljárásokkal. Mivel jelenleg már megvalósíthatónak és kívánatosnak tekinthető a növények

-5• « ··· · ··· • · · ·· ···· • · · · ·· · · · genetikai manipulálása, hogy olyan fehérjéket fejezzenek ki, amelyek - többek között - rezisztenciát biztosítanak betegségek és más kórokozók ellen, a találmány nagy mértékben vonatkozik eljárásra betegség elleni rezisztenciával bíró növények megalkotására is, amelyek a fent nevezett fehérjéket vagy polipeptideket képesek kifejezni, vonatkozik továbbá az eljárással megalkotott sejtekre és növényekre.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmányt.

Meghatároztuk, hogy bizonyos, a növényekben természetesen kis mennyiségben előforduló fehérjék, mint a Bandeiraea simplicifolia II. lektin (Bandeiraea II) és a kimopapain látexből nyerhető tiol proteáz, a kimopapain, antimikrobiális aktivitással bírnak sok, gyakran előforduló patogén ellen. A Bandeiraea II. a legaktívabb a kukorica és cirok virágzatát és szárát támadó Fusarium moniliforme patogén gomba ellen, a dohánylevél-patogén Alternaria ellen, valamint az Aspergillus flavus ellen. A kimopapain a legaktívabb a Fusarium gramináarum, Alternaria longipes és a Fusarium moniliforme ellen.

így tehát a találmány eljárást nyújt fogékony patogének elpusztítására és gátlására, ideértve elsősorban a Fusarium gramingarum, Alternaria longipes és Fusarium moniliforme patogéneket; az eljárás abban áll, hogy a nevezett organizmusok környezetébe Bandeiraea II., kimopapain, vagy ezek kombinációja antimikrobiális mennyiségét vezetjük be.

A találmány kompozíciókat is nyújt emberekben, alacsonyabb rendű állatokban és növényekben a nevezett organizmusok által okozott betegségek kezelésére; ezek a kompozíciók a fentebb nevezett polipeptidek egyikét vagy mindkettőt tartalmazzák valamely nem toxikus hordozóval kombinálva.

-6···· · · · · ·

Növények.

A találmányban alkalmazott polipeptideket, vagyis a Bandeiraea ΙΙ-t és a kimopapaint, hatásosan alkalmazhatjuk adott mikroorganizmusokkal fertőzött növényekhez, bármilyen alkalmas módon, ezek közé értve a permeteket, bevonatokat, porokat vagy más kiszereléseket, amelyek az antimikrobiális szakterületen általánosan alkalmazottak. A Bandeiraea ΙΙ-t vagy a kimopapaint beépíthetjük szisztematikusan a kezelt növények szöveteibe, hogy a növény megtámadása folyamán a patogének ki legyenek téve a Bandeiraea II vagy a kimapain antimikrobiális mennyiségének. Ennek elérésére az egyik eljárás a Bandeiraea II vagy a kimopapain beépítése valamely nem-fitotoxikus hordozóba, amely szisztematikus bevitelre van adaptálva a szóban forgó növénybe. Az eljárást általánosan alkalmazzák a fungicid anyagoknál, mint a Captan-nál, és ez belül van azon az ismeretanyagon, amelyet a növényi fungicid kiszerelés területén jártas szakembernek birtokolnia kell. Mivel azonban izolálhatok azok a gének, amelyek a Bandeiraea II-1 és a kimopapaint kódolják, valamint klónozhatok, megfelelő kifejező kazettába beiktathatok és a megfelelő növényfajta sejtjeibe bevezethetők, az eljárás egyik különösen előnyös kiviteli módja magában foglalja a Bandeiraea II-t vagy a kimopapaint kódoló DNS szekvencia beiktatását a növény genomjába megfelelő leolvasó keretbe egy transzkripciós beindítóval és egy, a növényben aktív promotorral együtt. A DNS szekvencia transzkripciója és transzlációja a szabályozó szekvenciák ellenőrzése alatt a Bandeiraea II vagy kimopapain fehérje szekvencia kifejeződését idézi elő olyan szinten, amely antimikrobiális mennyiségű Bandeiraea II vagy kimopapain mennyiséget biztosít a növény olyan szöveteiben, amelyeket a patogének általában megfertőznek.

♦ ··· • · · · « * · • · ··· · ··· « ········· ··· · ·« · ♦ ·

-ΊΑ növény előnyösen olyan növény, amely fogékony az alábbi mikroorganizmusok fertőzésére és károsító hatására: Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum, és Sclerotinia trifoliorum. Ezek között a növények között találjuk a kukoricát (Zea mays) és a cirokot (Sorghum bicolor). Ezek megnevezése azonban nem jelenti azt, hogy az eljárás csak ezekre korlátozódik, csak azt jelenti, hogy ez a két faj az egyébként nagyon nehezen transzformálható és regenerálható növények közé tartozik; ezek a patogének megfertőzhetnek más haszonnövényeket is. így ez az eljárás könnyen alkalmazható hagyományos technikák segítségével számos más növény-fajtára is, ha azokat a fentebb felsorolt növénypatogénekre fogékonyaknak találjuk. Az alkalmas növényfajták közül felsoroljuk - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi nemzetségekbe tartozó növényfajtákat: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geránium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicum, Nicotiana, Solanum, Petúnia, Digitális, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Triticum és Datura.

Az előnyös növények, amelyek a talámány szerinti eljárással transzformálhatok, a gabonanövények és egyéb haszonnövények, ezek közé értve a kukoricát, rozsot, árpát, búzát, cirokot, zabot, kölest, rizst, tritikálét, napraforgót, lucernát, repcét és szóját.

A DNS szekvencia, amely kifejeződésekor antimikrobiális aktivitást ad át, egy olyan strukturgén, amely Bandeiraea ΙΙ-t vagy kimopapaint kódol, amint a későbbiekben ♦ «

I

-8leírjuk. Általában mivel a találmány tárgya rezisztencia átvitele valamely mikroorganizmus ellen, amelyre a növény érzékeny, a Bandeiraea II vagy a kimopapain nem veleszületett alkotórészei a növénynek.

Azokat a DNS szekvenciákat, amelyek a találmány gyakorlati kivitelezésében a Bandeiraea ΙΙ-t vagy a kimopapaint kódolják, hagyományos technikákkal kaphatjuk meg; a géneket a natív genomból megfelelő' restrikciós enzimek alkalmazásával vághatjuk ki, és ezeket beilleszthetjük teljes egészében egy kiválasztott növényi kifejező kazettába. Egy másik megoldás szerint elvégezzük a tisztított Bandeiraea II vagy kimopapain polipeptid szekvencia-elemzését, és ezután előállíthatjuk azokat a szintetikus DNS szekvenciákat, amelyek a megfelelő aminosavszekvenciát kódolják, és ezeket a szintetikus DNS szekvenciákat beiktathatjuk valamely megfelelő növényi kifejező kazettába.

Számos növényi kifejező kazetta és vektor ismert a szakterületen. A kifejező kazetta kifejezés szabályozó (kontroll) szekvenciák komplett készletét jelenti, amelyben benne foglaltatnak az iniciációs-, promotor-, és terminációs szekvenciák, amelyek növényi sejtekben működőképesek, amikor megfelelő leolvasó keretben körülveszik a strukturgént. A kifejező kazetták gyakran és előnyösen tartalmaznak egy sor restrikciós helyet, amelyek alkalmasak valamely kívánt strukturgén hasításához és beiktatásához. Fontos, hogy a klónozott gén a start kodont a strukturgénhez viszonyítva korrekt leolvasókeretben tartalmazza. Ezen kívül a növényi kifejező kazetta előnyösen az egyik végén magában foglal egy erős konstruktív promotor szekvenciát - amely azt segíti elő, hogy a gén nagy gyakorisággal íródjék át - és a másik végén magában foglal egy poli-A felismerő szekvenciát a hírvivő RNS megfelelő feldolgozásához és átviteléhez. Az olyan előnyös (üres) kifejező kazettára, « · · amelybe a találmány szerinti cDNS szekvencia beiktatható, jó példa a pPHI 419 plazmid, amelyet Beach és munkatársai fejlesztettek ki a Pioneer Hi-Bred International Inc.-nél (Johnston, Iowa). Nagyon előnyös növényi kifejező kazettákat alakíthatunk ki, amelyekbe egy vagy több szelektálható marker gén, pl. kanamicin rezisztencia gén vagy herbicid tolerancia gén található.

A vektor kifejezés itt olyan DNS szekvenciát jelent, amely képes replikálódni és képes valamely idegen gént kifejezni egy gazdasejtben. Tipikusan a vektor rendelkezik egy vagy több endonukleáz felismerő hellyel, ahol előre megjósolható módon hasítható a megfelelő enzim alkalmazásával. Az ilyen vektorok előnyösen úgy vannak megalkotva, hogy foglaljanak magukban további olyan strukturgén-szekvenciákat, amelyek antibiotikum- vagy herbicid rezisztenciát adnak át, és így markerként szolgálnak a transzformált sejtek azonosítására és elkülönítésére. Az előnyös markerek/szelekciós szerek között találjuk a kanamicint, klórszulfuront, foszfinotricint, higromicint és metatrexátot. Egy sejt, amelyben egy vektorban levő idegen genetikai anyag működőképesen kifejeződik, a vektor által transzformálva van, és ezt a sejtet transzformáns-nak nevezzük.

Különösen előnyös vektorok a plazmidok, amelyek olyan köralakú, kettős szálú DNS molekulát jelentenek, amelyek nem részei a sejt kromoszómáinak.

Amint fentebb említettük, a szóban forgó gént kódoló mind genomikus, mind cDNS-t alkalmazhatjuk a találmányban. A szóban forgó vektort megalkothatjuk részben cDNS kiónból, részben genomikus kiónból is. Amikor a szóban forgó gént izoláltuk, olyan genetikai konstrukciókat készítünk, amelyek tartalmazzák a szükséges szabályozó szekvenciákat, hogy lehetővé tegyék a gén hatékony

-10· *·· · ··« • · ·· ·«·· kifejezését a gazdasejtben. A találmány szerint a genetikai konstrukció tartalmaz (a) egy első genetikai szekvenciát, amely a szóban forgó fehérjét vagy jellemvonást kódolja, és (b) egy vagy több szabályozó szekvenciát működőképesen összekapcsolva a szóban forgó strukturgén valamelyik oldalához működőképesen hozzákötve. A szabályozó szekvenciákat tipikusan a promotorok és terminátorok közül választjuk ki. A szabályozó szekvenciák lehetnek autológ vagy heterológ forrásokból valók.

Azok között a promotorok között, amelyeket alkalmazhatunk a genetikai szekvenciában, találjuk a nos, öcs, és CaMV promotorokat.

Az alkalmazható hatékony növényi promotorok egyike valamely túltermelő növényi promotor lehet. Azok között a túltermelő növényi promotorok között, amelyet a találmányban alkalmazhatunk, találjuk a szója-eredetű ribulóz-1,5 bifoszfát karboxiláz kis alegységének (ss) promotorját [Berry-Love és munkatársai: J. Molecular and App. Gén. 1, 483-498 (1982)], és a klorofil a-b kötő fehérje promotorját. Erről a két promotorról ismert, hogy fénnyel indukálható eukarióta növényi sejtekben [ lásd pl.: Cashmore A Genetic Engineering of Plants, An Agricultural Perspective, Pelham kiadó, New York (1983), 29-31 oldal; Coruzzi G. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258, 1399 (1983); és Dunsmuir P. és munkatársai: J. Molecular and App. Gén. 2, 285 (1983)].

A kifejező kazettát, amely a Bandeiraea II vagy a kimopapain strukturgénjét tartalmazza működőképesen összekapcsolva a kívánt szabályozó szekvenciákkal, megfelelő klónozó vektorba ligálhatjuk. Olyan plazmid vagy vírus (bakteriofág) vektorokat alkalmazunk, amelyek a gazdasejttel összeférhető fajból származó replikációs és szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. A klónozó vektor tipikusan

-11« «4 · · · * 9 > · • *···· · » s • · » ♦ ♦ ···· hordoz valamely replikációs origót, továbbá olyan speciális géneket, amelyek képesek fenő típusos szelekciós markereket szolgáltatni a transzformált gazdasejtekben. Tipikusan olyan géneket alkalmazunk, amelyek antibiotikumra vagy valamely kiválasztott herbicidre adnak át rezisztenciát. Miután a genetikai anyagot bevezettük a célsejtekbe, a sikeresen transzformált sejteket és/vagy sejttelepeket ezen markerek alapján végzett szelektálással izolálhatjuk.

Tipikusan egy köztes gazdasejtet kell alkalmaznunk a jelen találmány gyakorlati kivitelezésében, hogy megnöveljük a klónozó vektor kópia számát. Megnövekedett kópiaszámmal a szóban forgó gént tartalmazó vektort jelentősebb mennyiségben izolálhatjuk a kívánt növényi sejtekbe való bevezetéshez. A gazdasejtek között, amelyeket a jelen találmány gyakorlatában alkalmazhatunk, találjuk a prokariótákat, beleértve az olyan bakteriális gazdaszervezeteket, mint az E. coli, S. typhimurium és Serratia marcescens. Alkalmazhatunk azonban a találmány szerinti eljárásban eukarióta gazdaszervezeteket, pl. élesztőket vagy micéliumos gombákat is. Mivel ezek a gazdaszervezetek is mikroorganizmusok, lényeges biztosítani azt, hogy a vektorban növényi promotorokat alkalmazzunk, amelyek nem segítik elő a Bandeiraea lektin avagy a kimopapain kifejeződését baktériumokban.

Az izolált klónozó vektort azután bevezetjük a növényi sejtbe valamely alkalmas technika alkalmazásával, beleértve az elektroporációt (protoplasztokba), a retrovírusokat, a bombázást és a mikroinjektálást egyszikű vagy kétszikű növényekből való sejtekbe sejt-vagy szövettenyészetben, hogy olyan transzformált növénysejteket kapjunk, amelyek idegen DNS-ként a növényi kifejező kazetta DNS szekvenciájának legalább egy kópiáját tartalmazzák. Az egyszikű faj előnyösen kukorica, cirok, búza vagy rizs, míg a kétszikű fajta előnyösen szója, lucerna, dohány vagy paradicsom.

«

-12Ismert technikákat alkalmazva a protoplasztokat regenerálhatjuk, és a sejt-vágy szövettenyészeteket úgy regenerálhatjuk, hogy teljes, termő növényeket képezzenek, amelyek hordozzák és kifejezik a Bandeiraea II lektin vagy a kimopapain génjét. Következésképpen a találmány - nagy mértékben előnyös kiviteli alakja egy transzformált kukorica növény, amelynek sejtjei idegen DNS-ként valamely jelen talámány szerinti kifejező kazetta DNS szekvenciájának legalább egy kópiáját tartalmazza.

A találmány végülis eljárásokat nyújt a Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Diplodia maydis, Colletototrichum graminicola, Verticillium alboatrum, Phytophthora megaspermae f.sp. glycinea, Macrophonina phaseolina, Diaporthe phaseolorum caulivora, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia trifoliorum és Aspergillus flavus mikroorganizmusok által okozott betegségek elleni rezisztencia átadására valamely érzékeny taxon növényeibe; az eljárás az alábbi lépésekből áll:

a. / a taxonból legalább egy növényből származó sejteket vagy növényeket tenyésztünk;

b. / a sejtekbe vagy szövettenyészetbe bevezetjük a Bandeiraea II vagy a kimopapain strukturgénjét tartalmazó valamely kifejező kazetta legalább egy kópiáját, ahol a kazettában a strukturgén működőképesen össze van kapcsolva növényi szabályozó szekvenciákkal, amelyek a Bandeiraea II vagy a kimotripszin strukturgén kifejezó'dését idézik elő a sejtekben, és

c. / betegségre rezisztens teljes növényeket regenerálunk a sejtekből vagy szövettenyészetből. Amikor a teljes növényeket megkaptuk, ezek szexuálisan vagy • · klonálisan reprodukálhatók olyan módon, hogy a kifejező kazetta által szolgáltatott szekvenciának legalább egy kópiája legyen jelen a reprodukciós utódok sejtjeiben.

Egy másik eljárás szerint, amikor egy egyedi transzformált növényt megkapunk az előbbi rekombináns DNS eljárással, hagyományos növénynemesítési eljárásokat alkalmazhatunk a Bandeiraea II vagy kimopapain strukturgén és a társult szabályozó szekvenciák átvitelére keresztezéssel és visszakeresztezéssel. Az ilyen köztes eljárások az alábbi lépéseket tartalmazzák:

a. / a betegség-rezisztens növényt keresztezzük valamely a betegségre fogékony taxonból származó növénnyel;

b. / a reproduktív anyagot a keresztezés udódaiból kinyerjük; és

c. / a reproduktív anyagból a betegség-rezisztens növényeket növesztjük. Amikor kívánatos vagy szükséges, az érzékeny taxon mezőgazdasági jellenzőit lényegében megőrizhetjük az eljárást kiterjesztésével olyan módon, hogy foglalja magában az alábbi ismételhető lépéseket:

a. / a betegség-rezisztens utódokat visszakeresztezzük valamely, a betegségre fogékony taxonból származó növénnyel; és

b. / szelektálunk antimikrobiális aktivitás (vagy ezzel társult marker gén) kifejezésére a visszakeresztezés utódai között, amíg a fogékony taxon jellemzőinek kívánt százaléka jelen lesz az utódok között az antimikrobiális aktivitást átadó génnel együtt.

-14A taxon kifejezés itt a nemzetség vagy alacsonyabb egység botanikai osztályát jelenti. így ez magában foglalja a nemzetséget, fajt, fajtát, változatot, variánst, vagy más kisebb taxonómiai csoportot, amelynek esetleg nincs is következetes nomenklatúrája.

Azok, akik a szakterületen járatosak, tudják, hogy az itt nyújtott növényi vektorok beépíthetők Agrobacterium tumefaciensbe, amelyet azután alkalmazhatunk a vektor átvitelére fogékony növényi sejtekbe, elsősorban kétszikű fajták sejtjeibe. így a találmány eljárást nyújt antimikrobiális aktivitás és betegség-rezisztencia átvitelére Agrobacterium tumefaciensre fogékony kétszikű növényekbe, amely eljárásban a kifejező kazettát olyan módon vezetjük be a sejtekbe, hogy a sejteket Agrobacterium tumefacienssel fertőzzük meg, amelynek valamely plazmidját úgy módosítottuk, hogy foglaljon magában valamely jelen találmány szerinti növényi kifejező kazettát.

Ember- és állatgyógyászati alkalmazás

A találmány eljárásokat nyújt a fogékony organizmusok által emberekben vagy alacsonyabb rendű állatokban okozott fertőzések kezelésére és megelőzésére az ilyen kezelés szükségessége esetén; az eljárás abból áll, hogy a kezelés szükségessége esetén az emberbe vagy az alacsonyabb rendű állatba valamely találmány szerinti polipeptid terápiásán hatékony mennyiségét vezetjük be, vagy a polipeptidek egyikét vagy mindkét polipeptidet tartalmazó kompozíció hatékony mennyiségét vezetjük be. A találmány szerinti polipeptideket bevezethetjük parentálisan, inhaláló permet formájában, végbélen át vagy helyileg olyan dózisegység kiszerelésben, amely - ha szükséges vagy kívánatos - tartalmaz hagyományos

-15nem toxikus, gyógyászatilag elfogadható hordozókat, adjuvánsokat vagy töltő anyagokat. A parenterális kifejezés, ahogyan itt használjuk, magában foglalja a szubkután, intravénás, intramuszkuláris, intraartikuláris és intratracheális injekciókat, valamint az infúziós technikákat. Akárcsak más polipeptidek esetében, a találmány szerinti polipeptidekről sem állíthatók, hogy orálisan aktívak lennének.

A gazdaszervezetbe egyedi vagy megosztott dózisokban bevezetett találmány szerinti vegyületek teljes napi mennyisége 1 és 2000 mg/ testtömeg kg, inkább azonban 50 és 500 mg/testtömeg kg közti tartományban lehet. A dózisegység kompozíciók tartalmazhatják ezeket a mennyiségeket tört részletekben vagy többszörözött mennyiségekben, ahogyan ez alkalmas a napi dózis elkészítéséhez. Meg kell érteni azonban, hogy bármely adott betegnél a speciális dózis-szint sokféle tényezőtől függ, ideértve az alkalmazott vegyületek mibenlétét, a kort, a testtömeget, az általános egészségi állapotot, a nemet az étrendet, a beadás időpontját, a beadás módját, a kiválasztás sebességét, a más gyógyszerekkel való kölcsönhatást, és a terápiát szükségessé tevő adott betegség súlyosságát.

A találmány tehát egységdózis formájú gyógyászati kompozíciókat is nyújt, amelyek egy találmány szerinti vegyület hatékony mennyiségét tartalmazzák valamely hagyományos gyógyászati hordozóval kombinálva. Ahogyan itt használjuk, a gyógyászati hordozó kifejezés egy szilárd vagy folyékony töltőanyagot, hígítót vagy bezáró anyagot jelent. Azokra az anyagokra, amelyek gyógyászati hordozóként szolgálnak, példák lehetnek a cukrok, mint a laktóz, glükóz és a szacharóz; a keményítők, mint a kukorica keményítő és burgonya keményítő; cellulóz és származékai, mint a nátrium-karboxi-metil-cellulóz, etil-cellulóz és cellulóz-acetát

-16a porított tragant mézga; a maláta; a zselatin; a talkum; a kötőanyagok mint a kakaóvaj és a végbélkúp-viaszok; az olajok, mint a földimogyoróolaj, gyapotmagolaj, pórsáfrány-olaj, szézám-olaj, olívaolaj, kukoricaolaj és a szójaolaj; a poliolok, mint a propilénglikol, glicerin, szorbit, mannit és a polietilénglikol; az észterek, mint az etil-oleát és az etil-laurát, az agar; a pufferoló szerek, mint a magnézium-hidroxid és az aluminium-hidroxid; az alginsav;a pirogénmentes víz; az izotóniás konyhasóoldat; a Ringer-féle oldat; az etil-alkohol; és a foszfáttal pufferolt oldatok, valamint más nem toxikus, a hatóanyaggal összeférhető anyag, amelyet a gyógyászati kiszerelésekben alkalmaznak. A kiszerelést végző kívánságának megfelelően a kompozíciókban lehetnek jelen nedvesítőszerek, emulgeáló szerek és kenőanyagok, mint nátriumlauril-szulfát és magnézium-sztearát, valamint színező anyagok, felszabadító szerek, burkolóanyagok, illatosító anyagok és tartósító szerek is. Az aktív alkotórész, amelyet kombinálhatunk a hordozóanyaggal egy egyedi dózisforma kialakítása érdekében, mennyisége változhat a kezelendő szervezettől és az adott beadási módtól függően.

A gyógyászatilag hatásos mennyiség kifejezés itt valamelyik polipeptidnek vagy kombinációjuknak olyan mennyiségét jelenti, amely antimikrobiális aktivitást nyújt úgy, hogy csökkentse vagy megelőzze a fogékony organizmusok által előidézett fertőzést a kezelendő emberekben avagy alacsonyabb rendű állatokban az ésszerű előny/kockázat arány mellett, amely minden gyógyászati kezelés velejárója.

Ipari alkalmazhatóság

Az alábbi leírás példaszerűen is ad meg találmány szerinti kompozíciókat, és megadja előállításukat és alkalmazási lehetőségeiket. Azon szakemberek számára azonban, • ·

-17akik a szakterületen átlagosan jártasak, világos, hogy számos más, ezekkel egyenértékű eljárást is alkalmazhatunk a nélkül, hogy kilépnénk a találmány oltalmi köréből.

PÉLDA

Mikroorganizmusok fogékonysága Bandeiraea ΙΙ-re és kimopapainra.

A növénypatogén gombákkal kapcsolatos spóra-csírázási és hifa-növekedési vizsgálatokban a 3 mikromólos koncentrációban alkalmazott Bandeiraea II lektinről úgy találjuk, hogy bizonyos kísérletekben gátló aktivitása van Alternaria longipes, Fusarium moniliforme és Aspergillus flavus ellen. Ugyanezen koncentráció mellett bizonyos mértékben más gombák, mint a Fusarium graminearum, Sclerotinia sclerotiorum és Sclerotinia trifoliorum csak gyengén gátlódnak. A kimopapainról úgy találjuk, hogy 3 mikromólos koncentrációban erős gátló aktivitása van Fusarium graminearum ellen és mérsékelt gátló aktivitása van Alternaria longipes, Aspergillus flavus és Fusarium moniliforme ellen.

Mintegy 200-250 konidiumot vagy mintegy 20-30 micélium-töredéket inkubálunk 90 mikroliter tenyésztő tápközegben, mikrotitráló lemez üregeiben. A tenyésztő tápközeg olyan növesztő tápközeg (pH 5,5), amely tartalmaz 0,25 % élesztőkivonatot, 0,1 % kazein-hidrolizátumot, 1 % glükózt, 0,25 % kalciumnitrátot, 0,05 % kálium-foszfátot, 0,0625 % magnézium-szulfátot, 0,038 % nátrium-kloridot és 2,5 mmól/1 nátrium-foszfátot. A vizsgálandó koncentrációjú Bandeiraea II lektint vagy a kimopapaint 10 mikroliter vízben vagy pufferban az üregekhez adjuk, és a lemezeket 1-3 napon át inkubáljuk 28° C hőmérsékleten. Az inkubálási időszak végén az üregeket megvizsgáljuk és a miceliális növekedést a

-18kontroll üregekhez viszonyítva pontozzuk az alábbiak szerint.

— Nincs gátlás — Gyenge gátlás — Mérsékelt gátlás — Csaknem teljes gátlás — Teljes gátlás

Az egyik ilyen tanulmány eredményét az 1. és 2. táblázatban adjuk meg.

cc t— OT

1. TABLAZAT

*->

<υ

I I I I

<Λ <υ

-4—» <ü E Ό <Λ

C '<υ öű ο Ε ο Λ referencia: Histochemical Journal

IS, 589-596 (1986)

OC I— ω o o

Ο θ'

in of in of of »n of

1. TÁBLÁZAT (folytatás) cc o u.

O _i <

in <N of őf >n of

	3	<D -4-*	'-4—( 'Ctf	N 'CT
	<->		ÖJO	<D
’ct cu	CT 6	C3 >*	o C3	O
CT	öű	CS	tí	c.
D.		CX	ti	1 ,
O	ζ/)	03	O	o
B	ce	CX	£	•
2	1	1		1

I

Ό .s cS

Ό +-» N

c/3

Ό

B

N O

N

SSC = Sclerotinia sclerotiorum

STR = Sclerotinia trifoliorum

2. TÁBLÁZAT

Sclerotinia trifoliorum

• · ···· ··· • · ······ ··· · · · ·· ·

-22További tanulmányokban azt találjuk, hogy a kimopapain hatására legérzékenyebb gomba a Fusarium graminareum, amely már jelentős gátlást mutat 1,0 mikromólos koncentrációnál. A legellenállóbbak a Sclerotinia trifoliorum és a Sclerotinia sclerotiorum, amelyek csak 9 mikromólos koncentrációnál mutatnak gátlást. A Bandeiraea ΙΙ-t csak Fusarium moniliforme ellen találjuk hatásosnak.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a Bandeiraia II vagy a kimopapain gátló hatásúak patogének széles tartománya ellen, bár a gátlási profiljaik jelentősen változnak patogénről patogénre.

Az összes eddig megadott százalék tömegszázalékot jelent, hacsak másképpen nem jelezzük. A mikroorganizmus kifejezés, ahogyan itt jelezzük, baktériumokat és gombákat foglal magában. A baktérium és a bakteriális fertőzés kifejezések a szakterületen szokásos jelentésűek. A gomba kifejezés a magasabbrendű protistákat jelenti, ideértve a Phycomycetes, Ascomycetes és Basidiomycetes rendek tagjait, valamint minden más protistát, amelyet általában élesztő-nek vagy penészgombá-nak nevezünk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. / Ejár ás Bandeiraea II lektin vagy kimopapain polipeptidre fogékony mikroorganizmusok elpusztítására vagy gátlására azzal jellemezve, hogy a Bandeireaea II lektint vagy a kimopapaint vagy ezek keverékét antimikrobiális mennyiségben bevezetjük a nevezett mikroorganizmusok környezetébe.
2. / Az 1. igénypont szerinti eljárás Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum és Sclerotinia trifoliorum patogén gombák elpusztítására vagy gátlására azzal jellemezve, hogy a Bandeiraea II lektint vagy a kimopapaint vagy ezek keverékét antimikrobiális mennyiségben bevezetjük a nevezett patogén gombák környezetébe.
3. / A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a nevezett pep- tideket környezetként az élő növény szöveteibe vezetjük be.
4. / Az 1. igénypont szerinti eljárás növények védelmére Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum és Sclerotinia trifoliorum patogén gombák által okozott fertőzés ellen azzal jellemezve, hogy a növény genomjába a Bandeiraea II lektint, kimopapaint, vagy mindkettőt kódoló idegen DNS szekvenciákat vezetünk be a növényben aktív transzkripciós beindító és promotor szekvenciákra vonatkoztatva megfelelő leolvasó keretben, hogy végbemenjen a polipeptid vagy polipeptidek kifejeződése antimikrobiális szinten olyan növények szöveteiben, amelyek normális körülmények között a patogénekkel megfertőződnének.
5. / Az 4. igénypont szerinti eljárás egyszikűek, elsősorban búza, rizs és cirok védelmére azzal jellemezve, hogy a megfelelő növény genomjába vezetjük be a nevezett idegen DNS szekvenciát.
6. / Az 5. igénypont szerinti eljárás szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza:

a. / a növényből származó sejteket vagy szöveteket tenyésztjük:

b. / a sejtekbe vagy a szövettenyészetbe a Bandeiraea II lektűrt, a . kimopapaint, vagy mindkettőt kódoló szekvenciát tartalmazó kifejező kazetta legalább egy kópiáját bevezetjük; és

c. védett teljes növényeket regenerálunk a sejtekből vagy a szövettenyészetből.
7. / Az 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy magában foglalja a teljes növény szexuális vagy klonális reprodukálásának további lépését is olyan módon, hogy a kifejező kazetta által szolgáltatott szekvencia legalább egy kópiája jelen legyen a reprodukciós utód sejtjeiben.
8. / Az 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kifejező kazettát a sejtekbe elektroporációval vezetjük be.
9. / Az 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kifejező kazettát a sejtekbe mikrorészecskés bombázással vezetjük be.
10. / Az 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kifejező kazettát a sejtekbe mikroinjekcióval vezetjük be.
11. / Az 6. igénypont szerinti eljárás mikroorganizmusok elleni rezisztencia nyújtására Agrobacterium tumefaciensre fogékony kétszikű növényekben azzal jellemezve, hogy a kifejező kazettát a sejtekbe a sejteknek olyan Agrobacterium tumefacienssel végzett fertőzésével visszük be, amelynek egyik plazmidja a kifejező kazetta befogadásával módosítva van.

♦ · · • »··«· a · * • · ··«·*·« ··· · t« ·· ·
12. / Eljárás Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus, Alternaria longipes, Sclerotinia sclerotiorum és Sclerotinia trifoliorum patogén gombák által okozott betegségek elleni rezisztencia átadására valamely, az ilyen betegségekre fogékony taxon növényeibe azzal jellemezve, hogy

a. / kiválasztunk egy termő, betegség-rezisztens növényt a 7. igénypont szerint előállított növények közül a szexuálisan összeférhető növényekből;

b. / a betegség-rezisztens növényt szexuálisan keresztezzük a betegségre fogékony taxonból való valamely növénnyel;

c. / a keresztezés utódaiból szaporítóanyagot nyerünk ki; és

d. / a szaporítóanyagból védett növényeket növesztünk ki.
13. / A 12. igénypont szerinti eljárás betegség rezisztencia és antimikrobiális aldvitás átadására olyan taxonban, amely lényegében homozigóta növényekből áll, azzal jellemezve, hogy az alábbi, további, többször megismételhető lépéseket is elvégezzük:

a. / a betegség-rezisztens utódokat visszakeresztezzük a taxon lényegében homozigóta, betegségre fogékony növényeivel; és

b. / a betegség rezisztencia és az antimikrobiális aktivitás kifejezésére is szelektálunk a fogékony taxon további kívánt jellemzőin kívül a visszakeresztezés utódai közül, egészen addig, amíg a fogékony taxon jellemzőinek kívánt százaléka nem lesz jelen az utódokban a betegség-rezisztenciával és az antimikrobiális aktivitással együtt.

«· · « ···♦ ·<

«· · · ♦ · * « « ··· · · · <

« « *·««··« ·· ι «« ·« ·
14. / DNS klón valamely növény genomjából azzal jellemezve, hogy lényegében csak a Bandeiraea II lektint vagy a kimopapaint kódolja.
15. / Kifejező kazetta azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 14. igénypont szerinti DNS kiónt működőképesen összekapcsolva növényi szabályozó szekvenciákkal, ahol a kazetta a DNS klón kifejeződését idézi elő olyan növényi sejtekben, amelyek a természetben a kiónt nem tartalmazzák.
16. / Kifejező kazetta azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 14. igénypont szerinti DNS kiónt működőképesen összekapcsolva bakteriális szabályozó szekvenciákkal, ahol a kazetta a DNS klón kifejeződését idézi elő bakteriális sejtekben.
17./ Baktériumsejt azzal jellemezve, hogy idegen plazmidként tartalmazza valamely 16. igénypont szerinti kifejező kazetta legalább egy kópiáját.
18./ Transzformált növénysejt azzal jellemezve, hogy idegen DNS-ként tartalmazza valamely 15. igénypont szerinti kifejező kazetta DNS szekvenciájának legalább egy kópiáját.
19./ A 18. igénypont szerinti valamely egyszikű faj sejtje.

transzformált sejt azzal jellemezve, hogy ez
20./ A 19. igénypont szerinti kukorica, cirok, búza, vagy rizs sejtje.

transzformált sejt azzal jellemezve, hogy ez
21./ A 18. igénypont szerinti valamely kétszikű faj sejtje.

transzformált sejt azzal jellemezve, hogy ez transzformált
22./ A 21. igénypont szerinti szója, lucerna, repce, napraforgó, dohány, vagy paradicsom sejtje.

sejt azzal jellemezve, hogy ez
23. / Kukorica sejt- vagy szövettenyészet azzal jellemezve, hogy 20. igénypont szerinti sejteket tartalmaz.
24. / Transzformált kukoricanövény azzal jellemezve, hogy sejtjei idegen

DNS-ként tartalmazzák a 14. igénypont szerinti kifejező kazetta DNS szekvenciájának legalább egy kópiáját.
25. / Gyógyászati kompozíció dózisegység-formában azzal jellemezve, hogy tartalmazza a Bandeiraea II. lektin, vagy a kimopapain, vagy ezek keveréke gyógyászatilag hatásos mennyiségét nem toxikus hordozóban.
26. / A 25. igénypont szerinti kompozíció azzal jellemezve, hogy a nevezett hordozó emberekbe vagy alacsonyabbrendű állatokba való szisztematikus beadáshoz adaptált hordozó.
27. / Eljárás fogékony mikroorganizmusok által okozott fertőzés kezelésére vagy megelőzésére emberekben vagy alacsonyabb rendű állatokban az ilyen kezelés szükségessége esetén, azzal jellemezve, hogy az embernek vagy állatnak a Bamdeiraea II lektin polipeptid, vagy a kimopapain polipeptid, vagy ezek keverékének biztonságos és hatékony mennyiségét adjuk be.
28. / A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy keveréket helyileg adjuk be.
29. / A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy keveréket parentálisan adjuk be.
30. / A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy keveréket intramuszkulárisan adjuk be.

• 4 • ·«« *« ·· · • · 4 · · • ·*· · · · « * * · · · ·· · • ·« ·* ·
31. / A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy keveréket szubkután adjuk be.
32. / Kompozíció fogékony organizmusok által előidézett növényi betgségek kezelésére azzal jellemezve, hogy tartalmazza a Bandeiraea II lektin polipeptidet, vagy a kimopapain polipeptidet, vagy ezek keverékét nem fitotoxikus hordozóba!®.