HUT62486A

HUT62486A - Process for producing pharmaceutical compositions comprising antigene-antibody complexes

Info

Publication number: HUT62486A
Application number: HU9202214A
Authority: HU
Inventors: Jean-Marie Saint-Remy; Philippe Lebrun; Serge Lebeque; Pierre Lucien Masson; Marc Jacquemin
Original assignee: Int Inst Cellular Molecul Path
Priority date: 1990-01-03
Filing date: 1990-12-31
Publication date: 1993-05-28
Also published as: CA2015515C; US7122380B1; IE904693A1; DE69007799T2; DK0508993T3; EP0508993A1; HU9202214D0; ES2054484T3; JPH03227942A; EP0508993B1; PL288597A1; DE69007799D1; NO922621D0; ATE103495T1; WO1991009619A1; AU644400B2; NO922621L; CA2015515A1; PT96409A; AU6962691A

Description

A találmány antigén-antitest komplexet tartalmazó gyógyászati készítményekre, valamint ezeknek autoimmun betegségek kezelésében történő alkalmazására, és átültetések kilökődésének kezelésére és megelőzésére vonatkozik. Mindkét szindróma a test immunrendszerének immunológiai reakcióiból ered.

Az immunrendszer normális körülmények között különbséget tesz a testsaját és behatoló Idegen anyag között, és megfelelő mechanizmust biztosít a káros idegen anyagok elpusztítására vagy eltávolítására. Autoimmun betegség esetén azonban az immunrendszer nem tesz különbséget a saját és idegen determinánsok között, és ezáltal immunreakció lép fel a testsaját sejtek ellen, így azokat károsítva és pusztítva.

A humán autoimmun betegségeket két csoportba osztják: szervspecifikus és nem-szervspecifikus betegségekre. Myasthenia gravis az autoimmun betegségek első csoportjának egyik jellemző képviselője, míg a második kategóriába például a szisztemikus lupus erythematosus tartozik. A myasthenia gravis egy neuromuszkuláris betegség, mely súlyos izomgyengeséget eredményez. Normális körülmények között egy idegimpulzus acetilkolin felszabadítását eredményezi egy ideg mozgató véglemezke vesiculából. Az így felszabadított acetilkolin végigdiffundál a neuromuszkuláris csatlakozásokon, és a kapcsoló izomrostok acetilkolin receptoraival kombinálódik. Ez a jelenség a membrán ionok vándorlását hozza létre, mely egy depolarizációs hullámmal, és ezzel indukált elektromos jellel jár, és így izomöszszehúzódás jön létre. A myasthenia gravisban szenvedő betegeknél úgy vélik, hogy a receptorokhoz tartozó IgG antitestek

gátolják az acetilkolinnak a receptorokhoz történő kötődését, ezáltal gyengítve a neuromuszkuláris átvitelt.

A fenti betegségben szenvedő betegek különbözőképpen reagálnak az antikolinészteráz gyógyszerekre, thymuseltávolításra, immunszupresszív szerekre és plasmapheresisre. Acetilkolinészteráz gyógyszereket gyakran alkamaznak a myasthenia enyhe eseteinek gyógyítására, főleg az extraokuláris izmokkal kapcsolatban, azonban a kezelések gyengeségi tüneteket és más nem-kívánatos mellékhatásokat okozhatnak. A thymuseltávolítás, radikális volta ellenére is, előnyös sok, prog resszív és viszonylag súlyos betegségben szenvedő fiatal betegnél, általános, és viszonylag rövid idő alatt kifejlődött tünetekkel jelentkező myastheniában szenvedő betegeknél, és néhány thymomás idős férfibeteg esetén. A glükokortikoszteroidok hasznosak lehetnek súlyos betegségek esetén, és gyakran előnyösek általános myastheniában szenvedő betegek esetén. A glükokortikoszteroidokkal végzett kezelés tipikusan egy kezdeti átmeneti állapotromlást, majd fokozatos javulást eredményez. A krónikus glükokortikoidos kezelés azonban függetlenül a betegségtől, izomgyengeséget és a felborult izomprotein- és szénhidrát-metabolizmus miatt izomsorvadást eredményezhet.

Ezenkívül csökken a fertőzésekkel szembeni ellenállás, mivel az immunszupresszív hatások generalizálódnak. A plasmapheresis esetén, bár csökkenti az antítest-titert, és gyakran klinikai javulást eredményez, az eredmények csak átmenetiek, ezért csak végszükség esetén alkalmazzák súlyos betegeknél, akik a más terápiás módszerekkel szemben rezisztensek. A thymus-eltávolí tás kivételével, a fenti hagyományos módszerek egyike sem támadja a myasthenát annak okozati összefüggésében, hanem csak a betegség szimptómáit befolyásolja.

A szisztemikus lupus erythematosus (a továbbiakban: SLE) a teljes szervezetre kiterjedő betegség, jellemzője a különféle, az immunpatológiásan átvitt szöveti sérülésekért felelős autoantitestek jelenléte. Az SLE-ben szenvedő betegekben jelenlévő patogén antitest a natív kettősszálú DNS és extrahálható nukleáris antigének (a továbbiakban: ENA) ellen irányul.

Az SLE hagyományos kezelése a betegség súlyosságától, és a megtámadott szerv típusától függően változik. Az aszpirin vagy más, nem-szteroid gyulladásgátló szerek a betegség enyhe formái esetén meggátolhatják a tünetek kifejlődését, azonban károsan befolyásolhatják a máj- és vesefunkciókat. A kortikoszteroidok meggátolhatják fontos szervek állapotának akut súlyosbodását, azonban ez magas, 40-100 mg/nap kezdeti glükokortikoid-dózist (prednizolon) igényel, mely azonban még magasabb is lehet, megismételt kezelés esetén. Rekalcitráns szimptómák, előrehaladott vese- és agyi tünetek eredményes gyógyítása általában folyamatos szteroidokkal és immunszupresszív szerekkel történő kezelést kíván meg. Még súlyosabb esetekben citotoxikus szerek is adagolhatok a szteroidokkal együtt, ezek a gyógyszerek azonban köztudomásúlag súlyos mellékhatásokkal rendelkeznek.

A myasthenia gravistól és SLE-től eltérő más autoimmun betegségek hagyományos kezelése hasonló módon történhet szteroid-terápiával, immunszupresszív szerekkel és gyulladásgátló • · · · szerekkel. Mint a myasthenia gravis és SLE esetén, ezek a betegségek, a thymus-eltávolitás kivételével, ugyancsak azzal a hátránnyal járnak, hogy nem a betegség okát, hanem csak tüneteit célozzák. Mivel tüneti kezelések, mindig okoznak melléks hatást is. Ideális esetben a kezelésnek csak az abnormális autoimmun válaszra kellene irányulnia, ugyanakkor érintetlenül kellene hagynia a más antigénekre adott válasz lehetőségét.

A két személy közötti szövetátültetés legfőbb immunológiai problémája a kilökődés. A transzplantátum kilökődésének sebességét alapvetően két faktor befolyásolja jelentősen: az előszenzitizálás foka, és a donor és recipiens közötti eltérés nagyságrendje. Az azonnali hiperakut kilökődések oka a transzplatátummal szemben a recipiens keringési rendszerében fellépő előzetes antitestképződés. Az ilyen antitestek a transzfúziós átültetés előtti ABO-inkompatibilitás, vagy terhesség miatt keletkezhettek. Erősen szenzitizált betegek esetén az anti-HLAantitestek plazmacseréval, vagy legújabban Staphyllococcus protein A-val történő testen kívüli immunadszorpcióval eltávolíthatok . Azonban az immunszupresszív gyógyszerekkel történő kezelés ellenére is, az új antitest-szintézis komoly probléma marad. Az akut kilökődések az átültetés után öt napon túl kezdődnek, majd gyors lefolyásúak. A krónikus kilökődés a beültetett szerv funkciójának fokozatos romlását eredményezi.

Néhány átültetési reakció, főleg az azonnali hiperakut reakciók és krónikus reakciók irreverzíbilisek, és a kezelésre nem reagálnak. Ezért elsődleges szempont az ilyen reakciók megelőzése. A transzplantátum-kílökődések megelőzésére különböző • · · · *

* · ♦ · · · · « 4 ···<· · • · · • · • · · • · · · · ·

- 6 hagyományos módszerek ismeretesek. Az antigén-egyeztetés nélkülözhetetlen a hiperakut reakciók elkerülésére, kivéve talán a csontvelőátültetéseket. Az előszenzitizálás vizsgálata ugyancsak igen fontos, és úgy végzik, hogy a donorban a komplementer dependens limfocitotoxikus antitestek jelenlétét vizsgálják. Ezek az antitestek a celluláris citotoxicitást, és a donor transzplantációs antigénjével szemben reaktív killer T-sejtek reaktivitását közvetítik.

Azonban az átültetés előtti antigén-egyezési és előszenzitizálás mérés csak csökkenti, de nem küszöböli ki a kilökődés veszélyét.

Az immunszupressziós módszerek gyakran hatékonyan tovább csökkentik a kilökődés veszélyét, és adott esetben meg is akadályozhatják a már fellépett kilökődésí folyamatot. Ilyen jellemző immunszupressziós módszer például veseátültetések esetén a kortikoszteroidok, például metil-prednizolon és prednizolon adagolása, vagy azatioprinos kezelés, az átültetést követő hosszabb időn keresztül. Ugyancsak szükség lehet a donortól vett vérrel végzett transzfúzióra, különösen veseátültetés esetén. Ugyancsak veseátültetés esetén a beteg nyirokrendszerének besugárzását is alkalmazzák, az Immunszupressziós folyamatok elősegítésére, amennyiben a beteg már kilökött korábbi vesetranszplantátumot, és fennál a veszélye a további transzplantátumok kilökődésének is.

Mindemellett az élő szövetek eredményes átültetése komoly probléma marad. A kilökődések jelentős százaléka nem akadályozható meg, és nem befolyásolható hagyományos módszerek··«· · · · 4««·· • -4 « · · Μ · · · » - 7 kel. Az intenzív immunszupressziós kezelés az immunrendszer hasznos működését is visszaszorítja, és a betegséggel nem összefüggő fertőzések veszélyét jelentősen növeli.

A fentiekben leírtakat részletesen taglalják az alábbi irodalmak: Kohler és munkatársai: The Autolmmune Diseases, Fink és munkatársai: Immunological Aspects of Neurological and Neuromuscular Diseases, és Kirkpatrick és munkatársai: Transplantation Immunology, Journal of the American Medical Association, Vol. 248,(20), 2646-57, 2710-15 és 2727-33, 1982 november 26;

Roitt és munkatársai, Immunology, copyright 1985: Gover Medical Publishing Ltd., London; Lindstrom és munkatársai: Myasthenia Gravis, Advances in Immunology, 1988 Vol 42, 233-284; Immuné Recognition of Antigén and Its Relevance to Autoimmune Disease: Recent Advances at the Molecular Level, Eur.J. of Clin.Investigation, 1989, Vol. 19, 107-116; és Organ Specificity Autoimmunity: A 1986 Overview, Immunological Reviews, 1986, 94: 136169.

Ennek megfelelően, a találmány tárgya olyan gyógyászati készítmények és eljárások kidolgozása, melyek hatékonyak az autoimmun betegségek terápiájában, és gátolják az ezekkel kapcsolatos tüneteket.

Ugyancsak a találmány tárgya olyan gyógyászati készítmény és módszer, mely megváltoztatja az autoimmun betegségek lefolyását anélkül, hogy káros mellékhatásokat okozna.

A találmány további tárgya autoimmun betegségek sebészeti beavatkozás nélküli kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény és eljárás.

Ugyancsak a találmány tárgya olyan gyógyászati készítmény és módszer, mely a betegség szimptomatológiájának állandó, viszonylag gyors, és állandó javulását eredményezi.

A találmány további tárgya gyógyászati készítmény és módszer transzplantátumok kilökődési reakcióinak meggátlására.

Ugyancsak a találmány tárgya olyan gyógyászati készítmény és módszer, mely csökkenti transzplantátum-kilökődés esetén az antitest-szintet, anélkül, hogy a teljes immunrendszer működését elnyomná.

A találmány további kiviteli alakjait az alábbiakban részletesen is ismertetjük.

A találmány fentiekben részletezett tárgya tehát olyan gyógyászati készítmény, mely antigének és azokra specifikus, tisztított antitestek immunkomplexeit, és fiziológiailag elfogadható hordozóanyagokat vagy higítóanyagokat tartalmaznak. Antigénként olyan antigének jönnek számításba, melyek autoimmun betegségekkel és transzplantátum-kilökődéssel kapcsolódó immunológiai reakciókat okoznak. Az antigének és antitestek olyan arányban vannak jelen, hogy lényegében az antigénnek valamennyi kötődési helyét blokkolja az antitest, ezáltal az antigén a betegnek adagolva lényegében nem okoz immunológiai reakciót. A készítményeket autoimmun reakciók kezelésére, és transzplantátum-kilökődések megelőzésére vagy kezelésére adagoljuk.

A találmány számos előnnyel rendelkezik az eddigi, autoimmun reakciók kezelésére alkalmazott módszerekhez képest. Mindenekelőtt általánosan alkalmazható valamennyi autoimmun betegség esetén, igy számos betegség általános és hatékony ke zelésére alkalmas. A korábban jórészt hagyományos módszerekkel, de nem teljes mértékben gyógyított autoimmun betegségek jóval biztosabban, eredményesebben és kényelmesebben gyógyíthatók a találmány szerint. Ugyancsak gyógyíthatók azok a súlyosabb au toimmun betegségekben szenvedő betegek is, melyekre a hagyomá nyos, korábbi módszerek hatástalannak bizonyultak.

Másodszor, a találmány szerinti eljárás és készítmény egyszerűen és könnyen alkalmazható. A készítmény hatóanyaga a betegséggel kapcsolatos immunválaszt létrehozó antigén, és ezen antigén ellen irányuló antitest immunkomplexe. Számos antigént azonosítottak már különböző autoimmun betegségek esetén, és ezek sok esetben kereskedelmi forgalomban vannak. Az ilyen esetben a találmány szerinti immunkomplexek egyszerűen úgy állíthatók elő, hogy izoláljuk és tisztítjuk az antigénekkel szembeni antitesteket, és az antigént és antitestet a megfelelő arányban összekeverjük. Más, olyan autoimmun betegségekkel kapcsolódó antigének esetén, melyeket ugyan azonosítottak, azonban nincsenek forgalomban, az immunkomplex előállítása során először az irodalomban ismert eljárásokkal az antigént izolálni és tisztítani, szintetizálni szükséges, vagy géntechnológiai módszerekkel kell előállítani. Ismét más autoimmun betegségek esetén, ahol még a patogén antigént sem azonosították, a találmány szerinti megoldás lényeges eleme az okozó antigén meghatározása.

Harmadszor, a találmány szerinti készítmények igen nagy előnye, hogy alig, vagy egyáltalán nem toxikusak. A találmány szerinti imunnkomplex egy előnyös alakja olyan antigénből és antitestből áll, mely már jelen van a szervezetben. A készítmény többi alkotórészei biológiailag kompatibilisek, és úgy választhatók meg, hogy bármely ellenreakció kizárható le gyen, amely a kezelt személynél esetleg specifikusan felléphetne. Mivel a találmány szerinti készítmények igen egyszerűek és jól kezelhetők, a találmány szerint azok biztonságosan és hatékonyan kombinálhatók a technika állásából ismert más terápiás eljárásokkal is, amennyiben arra szükség volna.

Negyedszer, a találmány kiküszöböli hagyományos vezelési módszerek számos más hátrányát, mind eredményesség, mind gazdaságosság szempontjából. A találmány alapvetően okozati szinten hatékony, és sok esetben teljesen megszünteti a betegség lefolyását. A találmány szerinti sikeres kezelés jóval alacsonyabb dózisokat igényel viszonylag rövid kezelési idő alatt, és a teljes gyógyulás és a kezelés megszakításának kilátásai sok esetben igen igen jók. Ugyanakkor a találmány szerinti eljárás nem igényel radikális módszereket, mint például szerveltávolítást vagy plazmacserét, és nem nyomja el a szervezet saját immunvédekezését a betegséggel nem kapcsolatos antigénekkel szemben. A találmány további előnyei a fentiekből nyilvánvalóak szakemberek számára.

Hasonlóképpen, a találmány számos előnyt nyújt a hagyományos módszerekkel szemben a transzplantátumok kilökődésének megelőzése és kezelése terén is. A találmány általánosan alkalmazható minden típusú, transzplantátummal szembeni immunológiai reakció esetén. A találmány szerinti készítmény ilyen esetben ugyanúgy állítható elő, mint az autoimmun betegségek kezelésére alkalmasak, a lényeges különbség az antigén és a megfelelő antitest kiválasztásában van. A találmány hatékonyan előzi meg és kezeli a transzplantátum-kilökődést, ugyanakkor nem okoz szöveti károsodást és más hátrányos elváltozásokat, melyek a hagyományos módszerek esetén fellépnek.

A találmány szerinti készítmény és módszer sikeres működésének hatásmechanizmusa nem ismeretes, valószínű azonban, hogy az eredményesség az antigén-antitest immunkomplex jelenlétével magyarázható, mely minden esetben jelen van a leírt antigén-antitest elegyekben. Úgy véljük, hogy az immunkomplex stimulálja az anti-idiotipusos antitestek termelését a patogén antigénnel szemben specifikus antigének termelésének rovására. Ugyanakkor, az anti-idiotipusos antitestek elnyomják az antitestek képződését a sejt és valószínűleg a humorális szinten. Ez a feltevés azonban csak a találmány könnyebb megértését szolgálja, és semmiképpen nem értelmezhető szűkítő értelemben a találmány oltalmi köre szempontjából.

A találmány szerinti készítménnyel minden olyan autoimmun betegség kezelhető, melyben a cél-antigének mind a nemszervspecifikus, mind a szerv-specifikus betegségek patogenézisében szerepet játszanak. Szervspecifikus betegségek például a következők: myasthenia gravis, Addison-kór, thyroiditis, inzulin-függő és inzulintól független diabetes, Grave-kór, krónikus atrófiás gastrítis, uveitis, sclerosis multiplex, autoimmun hemolitikus anaemia, idiopathiás thrombocytopenia purpura, Goodpasture-szindróma, férfi terméketlenség bizonyos esetei, vitiligo és pemphígus. Nem szerv-specifikus betegségek például az alábbiak: szisztemikus lupus erythenatosus, scleroderma, Sjörgen-kór, rheumatoid arthritis és különböző kötőszöveti betegségek .

A találmány szerinti immunkomplexhez választott antigén patogén immunológiás reakciót vált ki, mely összhangban van a kezelendő immunbetegség vagy transzplantátum-kilökődés etlológiájával. Bármely specifikus rendellenesség kezelésére a készítmény tartalmaz egy, a betegséget okozó antigént, tartalmazhat azonban több antigént is, valamint az azok elleni anitest-családot, ha a patogenézisben több antigén vesz részt. Az antigén acetilkolin (AChR) myasthenia, mellékvese sejt citoplazma Addison kór, tiroglobulin (Tg) és/vagy thyroid mikroszóma antigén (TMA) autoimmun thyroiditis, inzulin receptor inzulinrezisztens diabetes esetén, sziget-sejtek és/vagy inzulin inzulin-függő diabetes, thyroid stimuláló hormon receptor (THH-R) Grave-kór, gyomorsejt mikroszóma atrófiás gastritis, retina S-antigén uveitis, mielin sclerosis multiplex, vörösvértestek autoimmun hemolitikus anaemia, vérlemezkék idiopathiás thrombocytopenia purpura, IV típusú kollagén Goodpastureszindróma, sperma férfi terméketlenség, melanociták vitilígo, és bőrkomponensek pemphigus esetén. Az antigén kettős szálú DNS és/vagy ENS molekulák lupus erythematosus, SS-A/Ro és SSB/La Sjörgen-szindróma, RNP a vegyes kötőszöveti betegség, Scl 70 és centromerek scleroderma, és az IgG Fc-régiója rheumatoid arthritis esetén. A transzplatátum-kilökődés esetén az antigének a donor antigének, például ABO és MHC 1 és 2 típusú antigé13

A fenti antigének közül számos kereskedelmi forgalomban hozzáférhető. Ezek a következők: humán thyroglobulin (Dako Corporation, Santa Barbara, California 93103, Accurate Chemical and Scientific Corp._z Westbury, New York 11590), humán IV típusú kollagén (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama 35226); humán inzulin (Peptides International, Louisville, Kentucky 40223); és mielin bázikus protein (Chemicon International, Inc., El Segundo, California 90245). Mivel az antitest csak specifikus antigénjével reagál, lényegében csaknem minden antigén-készítmény alkalmas, még a nyers extraktumok is, feltéve, hogy nem tartalmaznak toxikus anyagokat. Előnyös azonban a tiszta, vagy viszonylag tiszta antigénkészítmények alkalmazása, mivel Ilyen esetben könnyebb a jelenlévő antigén mennyiségének meghatározása és szabályozása, mely igen fontos a dózisok meghatározásánál.

Számos, a találmány szempontjából számbajövő betegség esetén csak viszonylag szennyezett antigén könnyen hozzáférhető. Általában az ilyen antigén különböző módszerekkel tiszítható a találmány szerinti alkalmazáshoz. Bizonyos esetekben a humán anyagból történő tisztítás járható út, az antigén természetétől függően. így például a boncolásból vagy szövetmintából származó anyagot (acetilkolin receptor vagy retina S-antigén) nehéz lenne alkalmazni, míg a vérből származó anyagok alkalmasak és a gyakorlatban jól megfelelnek (például vérlemezkéből származó proteinek).

Egy másik antigén-forrás, mely esetben a humán anyagból történő tisztítás gyakorlati nehézségei leküzdhetők, a nem humán anyag, például az elektromos angolnából származó AChR esetén. A humán és nem-humán eredetű antigén közötti immunológiai különbség nem jelentős olyan esetekben, amikor az állati antigének nagy hasonlóságot mutatnak a humán megfelelőikkel. Ennek különösen azért van gyakorlati jelentősége, mivel a találmány szerinti antigén komplex formában van jelen, és ez csökkenti a nem-humán antigén immunogenicitását.

A fentieken kívül léteznek más, megfelelően tisztított antigén források. Mivel az autoimmun betegségekben szereplő antigének természetének meghatározási módszerei egyre pontosabbak, lehetővé válik az antigéneknek genetic engineering módszerekkel és hasonlókkal történő előállítása. Ahol az antigénről megfelelő ismeretanyag áll rendelkezésre, legalábbis a makromolekula egyrészéről, például bizonyos epitópok kémiai úton is szintetizálhatok. Másik antigén-forrás lehet egy antigén belső tükörképének alkalmazása, mivel ismert, hogy az anti-idiotipusos antitestek az eredeti antigén bizonyos epitopjait utánozni képesek. Ezt a jelenséget kísérletileg alkalmazták vakcinák előállításánál, ahol az antigén önmaga jelent fertőzésveszélyt.

A géntechnológiai és szintetikus antigén-előállításra számos példa ismert. A TSH-R klónozását például a Molecular Thyrotropin Receptor, 8th Int.Congress of Endocrinology, 1988, Kyoto, Japan, 175.old., No. 04-22-052 c. referátum ismerteti. Más módszereket alkalmaznak olyan antigének esetében, melyek csak néhány antigéndeterminánst tartalmaznak, melyek kis számú, általában 3-6 aminosavból épülnek fel. Ezeket az antigéndeterminánsokat in vitro szintetizálják, és általában különböző szubsztitúciós fokú proteinhodrozóhoz kapcsolják. Más módszer szerint az antigén-determinánsokat tisztítják és szekvenálják, és meghatározzák a megfelelő DNS-szekvenciát. Ezt a DNS-t valamely mikroorganizmus genomjába juttatják, melyet azután in vivő az antigén termelésére használnak. A megfelelő, további géntechnológiai módszereket ismertető irodalmak például a következők :

(1) T.Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, 1982 Cold Spring Harbor Laboratory, (2) B.Wallace és munkatársai, Solid Phase Biochemistry, 631. old, 1983 J.Wiley & Sons, New York (szerkesztő: W.H.Souten), és (3) K.Murray, Philosophical Transactions of the Royal Society of London - Part B, Vol. 290, 369-386 (1980).

Ismét egy másik módszer szerint az antigént glutáraldehiddel, etilénglikol-származékokkal, vagy hasonlókkal kémiailag módosítják.

Feltevések szerint léteznek okozó antigének is, ezeket azonban bizonyos más autoimmun betegségekre még nem azonosították. Ilyen esetben a találmány magában foglalja az antigén azonosítása miatt végzett preparációs lépést is. Mivel a találmány teljesen általánosan azonosítható, magába foglalja a még ismeretlen patogén antigének feltárását és alkalmazását is.

Ha az antigént kiválasztottuk, a megfelelő antitest három különböző forrásból nyerhető: a) immunizált állatokból; b) egyéni véradóktól, vagy több donortól nyert egyesített plazmából; és c) magától a betegtől. Előnyös a betegtől vett antitestek alkalmazása, mert a betegben normális körülmények között nagyobb számú alkalmas specifikus antitest található, mint a véradókban. Másrészt az összegyűjtött plazmából származó antitestek kereskedelmi szempontból értékesebbek, mert lehetővé teszik előre kiszerelt antigén-antitest komplexek készítését anélkül, hogy a beteget terhelni kellene. Az állati eredetű antitestek általában a legkevésbé alkalmasak, mert nem-kívánatos mellékreakciókat okozhatnak.

Az antitest poliklonális vagy monoklonális, és egy kiviteli alaknál mint Ig-frakció, vagy egy tisztább forma, például F(ab')₂ van jelen. A poliklonális antitestek alkalmazása csökkenti a nem-rejtett antigéndeterminánsokkal szembeni antigén-reakciók veszélyét. A monoklonális antitestek előállítására egy módszert ismertet az Immunochemical Techniques - Part 1 - Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies, Methods in Enzymology 121. oldala: (szerkesztő J.J.Langone és munkatársai, kiadó: Academic Press, Inc., 1986).

Az antitest előnyösen tisztított alakú. A tisztítás előnye, hogy eltávolítja a terápiás szempontból nem odatartozó anyagokat. Az antigén és antitest szérumban történő komplexálódása többek között komplemetum aktiválódáshoz vezethet. Az antigén-antitest komplex felületén jelentkező komplementum interferálhat a komplex várt in vivő viselkedésével.

Az antitestet célszerűen önmagukban ismert eljárásokkal tisztítjuk. Ilyen módszer a szilárd fázishoz kötve inszolubilizált megfelelő antigénhez történő kötés. Ezután az antitestet olyan körülmények között eluáljuk, ahol az antigén-antitest komplex disszociál, például extrém pH-értéken, vagy kaotróp szerek alkalmazásával. A későbbi példák ezeket a módszereket ismertetik.

A találmány szerinti készítményeket úgy állítjuk elő, hogy az antigént vagy antigéneket a megfelelő antitesttel vagy antitestekkel keverjük, a választott adagolási formának megfelelő alakra. Az antigén és antitest aránya nagy mértékben függ az antigén méretétől, mivel az antigénen elhelyezkedő antigéndeterminánsok száma arányos az antigén molekulatömegével. Ugyanakkor elegendő antitestet kell alkalmazni az antigén lényegében összes hozzáférhető kötőhelyének blokkolására, úgy, hogy az antigén lényegében ne fejthessen ki antigén hatást adagolás után. Az adagolandó antigén minimális mennyisége általában mólegyenértéknyi, azonban az antitest előnyösen mólfeleslegben van. Kívánt esetben az alkalmazandó antitest minimális menynyiségét rutinkísérlettel lehet megállapítani minden antigén esetén. Az alkalmazott antitest mennyiségének felső határa nincsen, biztonság szempontjából azonban akár 500-szorosig terjedő mólfelesleget alkalmazunk. Alkalmazható ugyan ennél nagyobb antitest-felesleg is, ez azonban már az értékes anyag pazarlása lenne csupán. Ezért az alkalmas antigén-antitest mólarány 1:1 - 1:500, előnyösen 1:3 és 1:500 közötti érték.

Az antigén és antitest keverékének előállítására egy egyszerű módszer az immunkicsapás, mely kiküszöböli az antigén és antitest tisztításának szükségességét. Ennek egy kiviteli alakjánál a csapadékot úgy képezzük, hogy a beteg plazmájából vagy szérumából származó immunglobulin nyers csapadékát inkubáljuk az antigénnel, majd centrifugáljuk. A csapadékképződés elősegíthető polimerek, például polietilénglikol és dextrán, vagy biológiai reagensek, például a rheumatoid faktor vagy a komplementum Clq faktorának hozzáadásával. Ezek a módszerek ismertek, és azokat a későbbi példákban szemléltetjük.

A találmány szerinti készítmények az antigénen és antitesten kívül további komponenseket is tartalmaznak. Injekciós készítmények esetén a megfelelő további komponens például a humán albumin, mely meggátolja az antitest denaturálódását, antiszeptikumok, például fenol, és adjuvánsok, például a peptidoglükánok és tirozin kristályok.

A készítményekben alkalmazott megfelelő folyékony hordozóanyag injekciók esetén például a desztillált víz, vagy előnyösebben a megfelelő sóoldatok vagy pufferőit sóoldatok. Előnyösen a készítmény 9 g/1 nátriumklorid-tartalmú sóoldatot, vagy pH = 7,4 értékű pufferőit sóoldatot tartalmaz. A megfelelő folyékony hordozók csak legfeljebb kissé írritációs hatásúak, például semleges pH-júak, és fiziológiás ionerősségűek. Szakemberek számára nem jelenthet nehézséget a készítményekben alkalmazható más gyógyászatilag elfogadható hordozó- és higítóanyagok megválasztása.

A találmány szerinti készítményeket az adagolás fajtájának megfelelően a legkülönbözőbb formában állíthatjuk elő. Általános a steril injekció alak, a nyújtott hatóanyagleadású implantátum, az orr, hörgő, könny és/vagy emésztőrendszeri nyálkahártyára lokális alkalmazással felvihető formák, mely esetben az aeroszol és szpré formák az általánosak, a szem- és orrcseppek, vagy a védett enterikus kapszulák és ha sonlók. Szakember számára természetesen nyilvánvaló, hogy más adagolási formák is kialakíthatók.

Ha a készítményeket folyékony alakban állítjuk elő, azok célszerűen oldatok vagy szuszpenziók. A folyadékokat ampullákben tároljuk, vagy liofilizáljuk; ez esetben közvetlenül alkalmazás előtt oldjuk vissza a szilárd anyagot. A találmány szerinti készítmények meglehetősen stabilak, és steril ampullákban 4°C-on meghatározott ideig, vagy -20°C-on 12-24 hónapig tárolhatók. Liofilizált termékek esetén a tárolhatóság még hosszabb.

A találmány szerinti injekcióoldatokat intradermálisan, szubkután, intramuszkulárisan, vagy nagy elővigyázat esetén intravénásán adagolhatjuk. Az intradermális injekció előnyös, mert igen tiszta bőrreakciót okozhat, ha nincs jelen elegendő antitest az antigén semlegesítésére. Az injekciók gyakorisága széles határok között változhat, például egy nap és egy év közötti időtartamon belül, a betegség súlyosságától és a kezelés előrehaladottságától függően.

A készítmények erősségét előnyösen az antigén-koncentrációval és az antigén-antitest aránnyal fejezzük ki. Az antigén alkalmas dózishatára 1 ng és 100 mikrogramm között van, míg az antigén-antitest arányt úgy kell megválasztani, hogy antitest lefedje az antigén antigenecitását. A kezdeti antigéndózis előnyösen viszonylag alacsony, mely egy elővigyázatossági szempont esetleges nemvárt ellenreakciók esetére, majd egymásutáni adagolások során növekszik a hatékony szintre. A kezelés hatékonysága az autoimmun betegségek kezelése esetén követhető az autoantigénekkel szembeni antitest-szint követésével, és a beteg klinikai állapotának ellenőrzésével. Átültetések esetén a kezelés hatékonysága az anti-ABO és HLA titerek folyamatok követésével, és a transzplantátum-kilökődés tüneti ellenőrzésével mérhető. Elképzelhető, hogy az antigén-antitest komplex határdózisát el kell érni, mielőtt bármilyen klinikai javulás lenne észlelhető.

Szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a találmány megvalósítása során olyan módszerbeli változtatásokra lehet szükség, melyeket az eddigiekben nem írtunk le, azonban az igénypontok által megfogalmazott oltalmi körbe tartoznak. A találmány részletes ismertetésére szolgálnak az alábbi példák is.

1.példa

A készítmények előállítása és alkalmazásuk myasthenia gravis kezelésére

A humán szövetből nyerhető receptorok igen kis mennyisége miatt a neuromuszkuláris AChR tisztítását angolnák (Torpedó marmorata) elektromos szervéből végezzük. Frissen kioperált elektromos szervet (200 g) felaprítunk és 200 ml lOmM foszfátpufferben (mely lOmM EDTA-t, 0,1 mM fenilmetilszulfonil-fluoridot és 0,01 % nátriumazidot tartalmaz, pH=7,4, A puffer) homogenizálunk. A homogenizátumot 1 órán át 20.000 x g értéken centrifugáljuk, és a pelletet 200 ml 1 tf/tf% Triton Χ-100-at tartalmazó A pufferrel 4°C hőmérsékleten 16 órán át extraháljuk. Az extraktumot 100.000 x g értéken 1 órán át centrifugáljuk, majd, a felülúszót összegyűjtjük. 100 ml extraktumot 50 ml affinitás-gyantára viszünk fel; a gyantát 25 mg a-cobratoxin Sepharose CL-4B gyantán cianogén-bromiddal végzett immobilizálásával állítottuk elő.

A gyantát 2 órán át 20°C hőmérsékleten tartjuk, majd 0,1 % Triton Χ-100-at tartalmazó A pufferrel (B puffer) és 1 mM nátriumkloriddal, majd csak B pufferrel mossuk. Ezután B pufferrel oldott 20 ml IM Carbachol (Sigma, St.Louis, USA) oldattal eluáljuk 5 órán át, 20°C hőmérsékleten.

Centrifugálás után a felülúszót egy éjszakán át 4°C hőmérsékleten dializáljuk 2 1 B pufferrel szemben, mely azonban nem tartalmaz EDTA-t (C puffer), majd előzőleg C pufferrel egyensúlyba hozott 2 ml-es DEAE-cellulóz (Whatman DE52, Maidstone, Kent) oszlopra visszük fel. Az oszlopot 1 1 C pufferrel mossuk, és a receptort 0,5 M nátriumklorid-tartalmú C pufferrel eluáljuk. 1 ml-es frakciókat szedünk. A módszert részletesen ismerteti Barkas, T. és munkatársai: Eur.J.Immunoi. 1982, Vol. 12, 757-761 cikke.

A fenti eljárás a specifikus antí-AChR antitestek izolálására alkalmazható; ugyanakkor a rekombináns antigének alkalmasabbak az injektálható immunkomplexek előállításáa: lásd Barkas és munkatársai cikkét: Science, 1988 Vol.235, 77-80.

Myasthenia gravisban szenvedő beteg 100 ml szérumát kiülepítjük 100 ml 36 g/1 koncentrációjú Na₂SO₄ oldat hozzáadásával, foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) szuszpendáljuk, és ugyanezen pufferrel szemben hosszú időn át dializáljuk. Az ősz• * · «

- 22 szes immunglobulint tartalmazó oldatot ezután TSK 55 gélszűrő oszlopon (Merek AG, Darmstadt, NSZK) engedjük át, az IgG és IgM elválasztására. Az IgG-t tartalmazó frakciókat egyesítjük, ultraszűréssel kb. 20 ml-re töményítjük, és PBS-sel szemben dializáljuk. Az IgG-frakciót ezután az angolna neuromuszkuláris receptorral borított Sepharose oszlopon engedjük át, és az adszorbeált antitestet 50 mM citromsavoldattal (pH 2,6) végzett elúcióval mossuk le. Az eluátum pH-ját hirtelen 7,4-re állítjuk vissza, és 2-5 ml-re töményítjük, PBS-sel szemben dializáljuk, majd felhasználásig -20°C hőmérsékleten tartjuk. Az antigént 1:10 arányban keverjük az egyetlen betegtől nyert specifikus antitesttel. Az antigén és antitest keverékét intradermálisan inokuláljuk.

A fentiekben leírtakból szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány egyes elemei variálhatók, így az antigén dózisa, az antigén-antitest arány, a hordozó vagy higítószer, az adalékanyagok, preparálási módszerek, az adagolás módja és sűrűsége, attól függően, hogy milyen betegséget kezelünk, illetve milyen szerv kilökődését kell meggátolni. Mindezek a variációk a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Gyógyászati készítmény humán immunológiai betegségek kezelésénél történő alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy egy antigén és egy arra specifikus, tisztított antitest immunkomplexéből, ahol az az antigén valamely, autoimmun betegségeknél és transzplantátum-kilökődésnél patogén immunológiai reakciót okozó antigén, és az antigén és antitest olyan arányban van jelen, hogy az antitest az antigénnek lényegében összes kötőhelyét blokkolja;

és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagból vagy higitóanyagból áll.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény autoimmun betegségek kezelésére, azzal jellemezve, hogy az autoimmun betegségben patogén immunológiai reakciót okozó antigént tartalmaz .
3. A 2. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a) fiatalkori diabetes, b) myasthenia gravis, c) sclerosis multiplex, d) Goodpasture-szindróma, e) thyroiditis, f) genuin coeliakia, g) vasculitis, h) szisztemikus lupus erythematosus, vagy i) uveitis ellen hatékony, és antigénje a) Langerhansszigetek sejtjei, inzulin és/vagy inzulin receptor, b) acetilkolin receptor, c) bázikus mielin protein, d) kollagén-4, e) tiroglobulin, f) gliadin, g) PMN citoplazma és/vagy alkálikus foszfatáz, h) kettősszálú DNS és/vagy ENA vagy i) retina S-antigén.
4. A 2. Igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a) Biermer anaemia, b) hyperthyroiditis, c) rheumatoid arthritis vagy d) thyroiditis ellen hatékony, és antigénje a) gyomorfal sejtek, b) mitokondriumok, c) kollagén-2 vagy d) LATS.
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény transzplantátu mok kilökődési folyamatainak megelőzésére vagy kezelésére, az zal jellemezve, hogy olyan antigént tartalmaz, mely transzplantátum kilökődési folyamatot indukál.
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy ABO és MHC 1. vagy 2. antigént tartalmaz.
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy humán eredetű antitestet tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy több donortól összegyűjtött plazmából származó antitestet tartalmaz.

«««« · ·♦·· 1 « · · ♦ * . Λ « 4 * *

44» ♦ ♦··· · ·· ···· · ♦ *
9. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemez- ve, hogy előállítására humán plazmából elválasztjuk az antitestet, azt tisztítjuk, és a tisztított antitestet keverjük az antigénnel .
10. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy az antitest az antigénhez viszonyítva mólfeleslegben van jelen.
11. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemez- ve, hogy az antigént és az antitestet körülbelül 1:1 és körülbelül 1:500 között mólarányban tartalmazza.
12. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy az antigént és az antitestet legalább 1:3 mólarányban tartalmazza.
13. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemez- ve, hogy az antigén a készítményben körülbelül 1 nanogramm és körülbelül 100 mikrogramm közötti dózisban van jelen.
14. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemez- ve, hogy hordozóanyaga valamely higítószer, pH-értéke körülbelül semleges.

:

• · ··♦·
15. A 14. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy hordozóanyaga folyékony, és steril injekció alakra formált.
16. A 15. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy a folyékony hordozóanyag sóoldat.
17. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy hosszantartó hatóanyagleadású implantátum, szpré, ae roszól, csepp vagy orális dózis formájú.
18. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy liofilizált formájú.
19. Az 1. igénypont szerinti készítmény azzal jellemezve, hogy két vagy több antigént és a hozzájuk tartozó két vagy több antitest-családot tartalmaz.
20. Gyógyászati készítmény humán myasthenia gravis kezelésénél történő alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy acetilkolin receptor és egy arra specifikus, tisztított antitest immunkomplexéből, ahol az acetilkolin receptor és antitest olyan arányban van jelen, hogy az antitest az acetilkolin receptornak lényegében összes kötőhelyét blokkolja;

és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagból vagy higitóanyagból áll.

···· ····

·. ···: :

• .· :

>·· *
21. Gyógyászati készítmény humán szisztemikus lupus erythematosus kezelésénél történő alkalmazásra, azzal jellemezve, hogy

DNS és egy arra specifikus, tisztított antitest immun komplexéből, ahol a DNS és az antitest olyan arányban van jelen, hogy az antitest a DNS-nek lényegében összes kötőhelyét blokkolja;

és gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagból vagy hígitóanyagból áll.
22. Eljárás betegek immunológiai zavarainak megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy olyan humán adagolásra alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő, mely egy antigén és egy arra specifikus, tisztított antitest immunkomplexét, ahol az antigén autoimmun betegségek és transzplantátum kilökődések során patogén immunreakciót okoz, és melyben az antigén és antitest olyan arányban van jelen, hogy az antitest az antigénnek lényegében valamennyi kötőhelyét blokkolja, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy higítószert tartalmaz, és a készítményt a betegnek adagoljuk.
23. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy autoimmun betegség kezelésére alkalmazzuk.

.....

.· Í.S.

• ·
24. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy transzplantátum kilökődések megelőzésére vagy kezelésére alkalmazzuk.
25. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antitestet a kezelendő betegtől izoláljuk.
26. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antitestet több donortól származó, egyesített plazmából nyerjük.
27. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a készítményt injektáljuk.
28. A 22. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a készítményt aeroszolként, belső kapszulaként, vagy viszkózus folyékony csepp formában adagoljuk.