HUT59830A

HUT59830A - Bacterium-composition for pofilacting bacterial enterosepsis of birds

Info

Publication number: HUT59830A
Application number: HU904822A
Authority: HU
Inventors: Matti Antero Aho; Lasse Olavi Nuotio; Esko Viljo Nurmi
Original assignee: Orion Yhtymae Oy
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-27
Publication date: 1992-07-28
Also published as: IE902378L; AU5836690A; EP0479820A1; EP0479820B1; ATE110960T1; PT94564A; WO1991000099A1; GR900100462A; GB2233343B; GB2233343A; DE69012329D1; ZA904099B; GB8915027D0; AU638032B2; CA2058990A1; JPH05500656A; IE902378A1; US5252329A; HU904822D0; KR920702626A

Description

Baktériumkészítmény szárnyasok baktériumos bélfertőzésének megelőzésére

ORION-YHTYMA OY, TURKU, FINNORSZÁG

Feltalál ók:

NUOTIO Lasse Olavi, IMATRA,

AHO Matti Antero, HELSINKI,

NURMI Esko Viljo, HELSINKI,

FINNORSZÁG

A bejelentés napja: 1990 . 06. 27.

Elsőbbsége: 1989. 06. 30. /8915027.0/

NAGY-BRITANNIA

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/FI9O/OO171.

A nemzetközi közzététel száma: WO 91/00099.

- 2 A találmány szárnyasok baktériumos bélfertőzésének a megelőzésére alkalmas baktériumkészítményre vonatkozik.

Közelebbről megjelölve, a találmány tárgya olyan baktériumkészítmény, amely a bél kolonizációjának a megelőzésére szolgál humán-baktériumok, különösen Campylobacter spp. segítségével.

A szárnyas a legjelentősebb humán campylobacter- és szalmonella-fertőzősforrás. A Campylobacter jejuni és a Campylobacter coli szerepe, mint a humán gyomor- és bélrendszeri betegségek közös okozója, le van írva a szakirodalomban. King, R.O. szerző ismertetése a The laboratory recognition of Vibrio fetus and a closely related Vibrio isolated from cases of humán vibrosis, Annals of the New York Academy of Sciences, 98: 700-711, 1962, csirkéket említ elsődleges humán fertőzésforrásként. Skirrow, M.B. a Campylobacter ént érit is: a ’new’ disease , Brit. Med. J. 2:9-11 /1977/ irodalomban bemutat egy kapcsolatot, amely bizonyos esetekben humán betegség és olyan csirkékkel való érintkezés között áll fenn, amelyek a mikroorganizmus hordozói a baromfitenyészetekben, a hentesüzletekben és a háztartások konyháiban. Ez a kapcsolat később különböző járványtani tanulmányokban kerül megtárgyalásra, így például Harris, N.V., Weiss, N.S. és Nolan C.M. szerzők által a The role of poultry and meats in the etiology of Campylobacter jejuni coli enteritis, Am. J. of Public Health 76:407-411 /1986/ irodalomban. Vannak különböző közlemények járványok kitöréséről is, amelyek szerint a járvány szempontjából létező vagy vélt campylobacteriosis vivőanyaga valamely nyers, sült vagy kevésbé sült csirke volt. A Newslettes 20. számában a WHO által 1989. áprilisában leírtak szerint

- 3 a campylobacter-f ertőzések száma felülmúlta a szalmonella-fertőzések számát a legutolsó években különböző iparilag fejlett országokban.

Egy a National Veterinary Institute-nak Finnországban végzett tanulmányában megerősítették azt, hogy egy valószínű ok a rántami való csirkéknek a szalmonella kolonizációjára /növekedés és kötődés/ a belekben a normál bélbaktériumflóra késleltetett fejlődése volt. Ez a késleltetés a növekvő rántani való csirkék modern tömegtenyésztésének az eredménye. Az ilyen állatok ennélfogva csak kis mértékben védettek a külső baktériumok ellen, amelyek bejutnak a testbe. E. Nurmi és M. Rantala szerzők a Natúré 241:210-211, 1973 irodalomban bemutatják, hogy a normál kifejlett béltartalom az újonan kikelt napos csibéknek olyan védelmet biztosít, amely megnöveli a szalmonella-kolonizációv’al szembeni ellenállásukat. Ennek az úttörő munkának az alapján kialakították a versengésen alapuló kirekesztés /a továbbiakban CE = competitive exclusion/ elméletét. Baktériumkészítményeket, amelyek különösen a szalmonella-fertőzések szárnyasokban való megelőzésére szolgálnak, például az EP 6695. számú, az EP 33 584. számú és az EP 154 478. számú európai szabadalmi leírásokban ismertetnek. A siker a szalmonelle-fertőzésnek versenyen alapulú kirekesztéssel történő megelőzésére rántani való csirkéknél felbátorított néhány munkacsoportot szerte a világon arra, hogy ugyanezt a módszert felhasználják a Campylobacter spp. kórmegelőzésére. Soerjadi-Lien, Snoeyenbos és Weinack szerzők az Avian Diseases 26:520-524 /1982/ és 28:139-146 /1983/ irodalmi helyeken beszámolnak arról, hogy amennyiben optimálisan

- 4 védő mi krofl ófl órával kolonizált patogénmentes /SPF = spéciiic pathogen free/ hulladékokból származó 10 %-os ürtüékszuszpenzi ót adtak fiatal csirkéknek, a C»dejuni-vel szembeni ellenállásuk megnőtt. Ez a kutatócsoport hirt adott arról, hogy valamely beadott mikroflóra CE-hatása csökkent a Campylobacter spp. adagok növelésével. Más - a Campylobacter spp-re vonatkozó - beszámolók szerint nem találtak ilyen hatást ürülékből származó, sem pedig vakbélváladékból eredő termelt CE-fi órák használata esetén /Stem, Bailey and Blankenship, Avian Diseases 32: 330-334. 1988/ vagy friss kifejlett vakbélflórából származó tenyésztett CE-flórák alkalmazásánál /Shanker, Lee & Sörrel, Epidemiology and Infection 100:27-34, 1988/.

A találmány kidolgozásával olyan baktériumkészítményt alakítottunk ki, amelynek a használatával megelőzhető patogén baktériumok kolonizációja a szárnyasokban és amelyre az jellemző, hogy a készítmény valamely kifejlett madárból, a mikroökol ógiai fekélyfészekből, amelyet patogén baktériumok foglalnak el, származó baktériumokat tartalmaz.

A találmány szerinti készítmény olyan baktériumflórát foglal magában, amely különösen a kifejlett madarak normál vakbélflórájából és főként a kifejlett madarak vakbelének a nyálkarétegéből származnak, amely felhasználható humán patogén baktériumok, elsősorban a Campylobacter spp. kolonizációjának a gátlására, fiatal madarakban. Az itt közzétett eredmények a C. jejuni biotyp 1 kolonizációjának a csökkentését foglalják magukban rántani való csirkék esetében. A találmány szerinti baktériumkészítmény hatásos más Campylobacter-fajták és esetleg más patogén baktériumok ellen is.

• ·

- 5 A találmány során alkalmazott flórát ugyanabból a mikroökológiai fekélyfészekből választjuk ki,amelyet a campylobacteriumok igyekeznek elfoglalni a rántani való csirkék vakbelében. Nagyon hatásos flórákat kapunk akkor, ha valamely kifejlett madárból származó vakbélfal nyálkarétegéből vett baktériumflórát tenyésztünk akár anaerob, akár mikroaerofil körülmények között, előnyösen állati nyálkában. Előnyös olyan baktériumok kiválasztása, amelyek nagy mozgékonyságúak a nyálkában.

A vizsgálatnál használt flórákat mind valamely öregebb tojó tyúk vakbeléből termeltük ki.

FLÓRÁK TERMELÉSE

Vakbél-homogenátum /A flóra/

Az egész vakbelet homogenizáltuk és 0,1 %-os peptonos vízzel hígítottuk laboratóriumi méretű kísérleteknél és ivóvízzel szabadban végzett /farxn/ kísérleteknél. A flóra sem Salmonella spp-t, sem Campylibacter spp-t nem tartalmazott.

A vizsgálati módszerek a következők voltak:

Salmonella: 1 %-os pufferolt peptonos víz /37 C°/20 óra/,

Rappaport-Vassiliadis táptalaj /41,5 C⁰/ 20 óra és tetrationát táptalaj /37 C°/20 óra/, Onöz és brillantzö’ld agarok /37 C°/20 óra/. Brucella táptalaj kiegészítve piruváttal, metabiszulf ittál és ferrovássál /FBP/

Campylobacter:

- 6 /41,5 C°/20 óra mikroaerof il légkörben/,

CCD agar /41,5 C°/44 óra mikroaerofil légkörben/.

Tenyésztett vakbél-homogenátum /B flóra/ ml vakbél-homo genátumot használtunk 100 ml Brucella-táptalaj /BBL/ beoltásához, amelyet 1 g Porcin Gastric Mucin-nal /sertésgyomor nyalkával, SIGMA/ felerősítettünk. Nyálkát szuszpendáltunk kis adagokban forró vízben és semlegesítettük a szuszpenziót mielőtt hozzáadtuk a közeg maradékához. Ezután Cefoperazone-t /Cefobis, Pfizer/ adtunk fertőzésmentesen autoklávozás után hozzá 32 mg/liter végső koncentráció eléréséig. Az inkubálást óra hosszat 41,5 C°-on végeztük mikroaerofil körülmények között.

Tisztított tenyésztett vakbél nyálkaréteg /0 flóra/

A nem-mozgó B baktériumflóra jelentős részét kiválasztottuk %-os félszilárd nyálka-agar segítségével, amelynek az összetétele a következő volt:

Félszilárd 10 %-os állati nyálka agar:

állati nyál ka	10,00	g
Brucell a-t ápt al a j	0,50	g
k₂hpo₄	0,25	g
agar	1,10	g
víz	100,00	ml

• · · · • · ·

- 7 Az állati nyálkát feloldottuk forró vízben az autoklávozás előtt. A pH-t 7,2-re állítottuk be 0,1 normál NaOH-oldattal.

A B flórát egy vezetékben egy 12 cm-es petri-csészébe vittük, amely 33 ml félszilárd állati nyálka agart tartalmazott.

Mikroaerofil inkübálás után /41,5 C°/48 óra 5 % oxigén, 15 % CO^ és 80 % nitrogén/ kis mennyiségű 2 és 4 cm közötti agart vittünk a vezetékből egy 10 %-os állati nyálka táptalajhoz. E táptalaj összetétele ugyanaz volt, mint a 10 %-os állati nyálka agaré azzal az eltéréssel, hogy nem tartalmazott sem cefoperazone-t, sem agart. A folyamatot mindaddig ismételtük, ameddig nem-mozgékony baktériumok voltak észlelhetők a táptalajban.

A baktériumok elkülönítése

A C flórát Brucella agaron és mikroaerofil légkörben tenyésztettük 41,5 C°-on 48 óra és 96 óra közötti időtartamig. Mozgékony spirál alakú mikroorganizmusokat különítettünk el.

B flórát vittünk egy vezetéken át egy 12 cm átmérőjű petricsészébe, amely 33 ml 10 %-os félszilárd állati nyálka agart tartalmazott. Anaerob inkübálás után /41,5 C°/48 óra/ kis menynyiségü agart 2 cm-től 4 cm-ig vittünk a vezetékből 10 %-os II jelű állati nyálka agárhoz, amelyet szintén anaerob légkörben inkubáltunk. Ezt a folyamatot addig ismételtük, ameddig nemmozgékony baktériumok voltak kimutathatók a táptalajban. Három ismétlés után csupán egy fajta Y jelű baktériumok maradtak a • · ·

- 8 táptalajban.

A FLÓRÁK ALKALMAZÁSA

Laboratóriumi vizsgálatok

A laboratóriumi vizsgálatok során 60 - 72 újonan kikelt csirkét 12 csoportra osztottunk. A CE-fl órákat 2x4 csoport madarainak a begyébe adtuk be. A fennmaradó négy csoportot használtuk kontrollként, és ezek nem kaptak CE-fl órákat. A következő napon 1000 - 3000 CFU C.jejuni biotip I Penner 15-öt vagy Penner 3/43/59-et adtunk be ugyanolyan módon mindegyik csoportnak a négy kontroli-csoport kivételével. A madarak felét egy hét múlva, a fennmaradó részt két hét múlva leöltük. A campylobakteriumok vizsgálatát a madarak vakbeléből végeztük el.

Szabadban végzett vizsgálatok

A szabadban végzett vizsgálatoknál 1600 - 1700 csirkét 16 csoportra osztottunk, amelyekből nyolc csoport vizsgálati csoportként szolgált, négy csoportot Campylobacter pozitív kontroll-csoportként, négy csoportot pedig összehasonlító csoportként használtunk. CE-flórákat kevertünk a nyolc csoport első ivóvízébe. Ezután 4,16 - 5,80 log-^θ CFU C. jejuni biotyp Penner 15öt adtunk be a következő napon három spermás madárnak mindegyik ketrecben, kivéve a négy összehasonlító csoportot. Minden héten a növekedési időszak végéig három-öt madarat leöltünk mindegyik ketrecből és a vakbeleiket megvizsgáltuk annak megállapítása vé• · ·

- 9 gett, hogy mennyi Campylobacter spp. van jelen.

Brucella táptalajt használtunk, amely FBP-t /0,5 - 0,5 g/liter ferroszulfát, nátrium-biszulfit és nátrium-piruvát/ és cefoperazone-t /32 mg/liter/, valamint aktivszén-cef aloperazone-dezoxichloáte-ot/CCD/ tartalmazott, a Campylobacter spp. minőségi és mennyiségi vizsgálatánál. A táptalajokat 20 óra hosszat és az agarokat 44 óra hosszat 41,5 C°-on inkubáltuk mikroaerofil légkörben.

Eredmények

A kolonizációs tényező a CFU szám log^Q-ért ékeinek a számítani középértéke az egyes madarak vakbéltartalmának egy gramjára számítva mindegyik vizsgálati és kontroli-csoportban.

Egy campylobacter-negativ madár /mind minőségi, mind menynyiségi vizsgálatnál/ hagyományosan rendszerint 0,1 log^-értékkel rendelkezik a számítások szerint.

1. kísérlet

Laboratóriumi vizsgálatok

Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a B flóra mikroaerofil inkubálása a Campylobacter spp. hatásosabb versengésen alapuló kirekesztését szolgáltatja, mint a B flóra anaerob inkubálása.

1. táblázat

A C. jejuni biotyp I hőstabil szerotip /savótipus/ 15 kiváltó · · · ·

- 10 - adagja: 895 CFU/csirke
	Kolonizációs	tényező
	1. hét	2. hét
1-es kontroll	5,13	7,74
2-es kontroll	5,96	8,35

B flóra mikroaerofil tenyészete

1-es csoport	< 2,00	<2,00
2-es csoport	<2,00	<2,00
3-as csoport	<2,00	<2,00
4-es csoport	2,34	<2,00
B flóra anaerob	tenyészete
1-es csoport	<2,00	3,24
2-es csoport	4,91	<2,00
3-as csoport	3,89	<2,00
4-es csoport	5,70	7,04

2. kísérlet

A B flórát mozgékonyság és légkör szerint valamely mikrofil C flórában és anaerob Y baktérium-flórában, tisztítottuk, ahogy fent leírtuk. Az anaerob Y baktériumok nem vátottak ki CE-hatást. Ezeknek a flóráknak az 1:1 arányú kombinációja viszszafordította a CE-hatást, ahogy a 3. és 4. csoportok mutatják a 2. táblázatban.

• *♦· ····

- 11 L aborat őri umi vi zs gál at ok

2. táblázat

A C. jejuni biotyp I hőstabil szerotip /savótipus/ 15 kiváltó adagja 245 CFU/csirke

Kolonizációs tényező

1. hét 2. hét

1- es kontroll 7,787,58

2- es kontroll 8,338,74

Y flóra egyedül

1- es csoport 1,906,70

2- es csoport 6,558,06

Y flóra + C flóra /1:1/

3- as csoport

4- es csoport

1,80 <2,00

3,22 <2,00

Szabadban végzett vizsgálatok x 100 darab rántani való csirkét normálisan hagytunk fejlődni hat héten át. Nyolc csoportot használtunk a versengésen alapuló kirekesztéses vizsgálathoz. Négy csoport negativ kontrollként szolgált és nem szerepel az ábrákon. Két csoport·· · • · · « • · ·« ««· * • · ♦ « < < · • · » · · · ·«· 4« · ·<· · ··· ··

- 12 nak két fajta specifukus vakbélflórát adtunk az első ivóvizükbe. A flórák hígítása 1/30 volt. Mindegyik madár megközelítően 0,25 ml kezelő folyadékot kapott.

Négy vizsgálati csoportnak állati nyálkát tartalmazó anaerob mozgékony baktériumokét /Y flóra/ adtunk. A fennmaradó négy csoport kombinált flórát kapott, amely 1:1 arányban tartalmazott Y flórát és C flórát, amely egy állati nyálkát tartalmazó mikroaerofil flóra volt, ahogy fent megadtuk.

darab rántani való csirkét megfertőztünk Campylobacter jejuni biotyp 1, Penner serotype 15-tel egynapos korban. Az adag log^Q A,16 CFU volt. E spermás madarak közül hármat tettünk mindegyik csoporthoz.

Mindegyik csoportból három madárnál mennyiségileg megviszgáltuk a vakbéltartalmat egyhetes időközökben a CCD-agaron lévő campylabacteriumok mennyiségének a meghatározása végett. A kolonizációs tényezőt a CFU szám log-^-értékeinek a számtani átlagaként számítottuk az egyes madarak vakbéltartalmának egy gramjára számítva mindegyik csoportnál. A negatív kontroll mennyiségileg negatív maradt Campylobacter spp-re nézve a levágásig.

A kapott eredményeket az 1. ábra szemlélteti. Látható, hogy az állati nyálkát tartalmazó anaerob mozgékony baktériumok /Y flóra/ nem védték a vakbelet a Campylobacter spp. kolonizációtól, bár a Campylobacter spp. száma a vakbélben kis mértékben csökkent /< 1 log_1Q-egységgel/. Az Y flóra és a C flóra 1:1 arányú kombinációja 2 héttel késleltette a Campylobacter spp. kolonizációját. Három hetes fertőzés után a Campylobacter spp. száma 4 logi q-egységszinttel kisebb maradt, mint a kontroli-csoportok • ··*« • · «« 4« · « • · · ··< « • 4 · « · · ·«· «·· ·«· 4 ·· ··

- 13 esetén.

3. kísérlet

A vakbél hígított homo gén át urnának /A flóra/ a CE-hatásait összehasonlítottuk olyan nem-specifikált vakbél-flóra CE-hatásával, amely anaerob légkörben fejlődött. A vizsgált madarak és csoportok száma, valamint a beadott CE-flóra mennyisége megegyezett az előző kísérleteknél alkalmazottakkal. Négy vizsgálati csoport A flórát kapott és négy csoport olyan nem-specifikált vakbél-f 1 órát kapott, amely anaerob légkörben fejlődött. Ez a flóra 427/C néven ismert. Tizennyolc rántani való csirkét Campylobacter jejuni biotypel, Penner serotype 15-td£ fertőztünk meg 18 napos korukban. Az adag nagysága log_1Q 5,80 CFU volt. Három ilyen spermás madarat adtunk mindegyik csoporthoz.

A 2. ábra azt mutatja, hogy az A flóra /a hígított vakbél homogenátum/ kedvezőbb CE-hatást mutatott.

Az A flóra szemmel láthatóan kolonizálta a csirkék vakbeleit és akadályozta a C. jejuni kolonizációját két csoportnál, továbbá csökkentette a kolonizációs sebességet /4 log^-egységgel/ a másik két csoportnál. A 427/C flóra 1-2 héttel késleltette a fertőzés kezdetét, de alkalmasint két hét után a Campylobacter száma a csirkék vakbelében valószínűleg ugyanazon a szinten maradt, mint a kontroli-csoportok vakbelében /amelyeket a Campylobacter spp. teljesen kolonizált/.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Baktériumkészítmény bélbaktériumok által okozott fertőzések megelőzésére szárnyasoknál, azzal jellemzve, hogy a készítmény olyan baktériumokat foglal magában, amelyek valamely kifejlett madártól, a mikroökológiai fekélyfészekből származnak, amelynek az elfoglalására a patogén baktériumok rendszerint törekszenek.
2. Az 1. igénypont szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy az a Campylobacter spp. által okozott fertőzés megelőzésére használhat ó.
3. A 2. igénypont szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a baktériumok valamely kifejlett madár vakbeléből származnak.
4. A 3» igénypont szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a baktériumok valamely kifejlett madár vakbelének a nyálkarétegéből származnak.
5. A megelőző igénypontok bármelyike szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a baktériumok valamely kifejlett madár homogenizált vakbeléből származnak.

.s ;......:

4 ··· · • · · ·
6. A megelőző igénypontok bármelyike szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény olyan baktériumokat foglal magában, amelyek előállítása mikroaerofil vagy anaerob körülmények között történt.
7. A megelőző igénypontok bármelyike szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény olyan baktériumokat foglal magában, amelyeknek a tenyésztése állati nyálka-táptalajon történt.
8. Az 1 - 7. igénypontok bármelyike szerinti baktériumkészítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény spirál alakú mozgékony baktériumokat foglal magában.