CZ36678U1 - Komplexní probiotický přípravek z anaerobů trávicího traktu pro drůbež - Google Patents

Description

Komplexní probiotický přípravek z anaerobů trávicího traktu pro drůbež

Oblast techniky

Předkládané technické řešení poskytuje probiotický přípravek pro zlepšení fýziologických a imunitních vlastností trávicího traktu drůbeže Gallus gallus prostřednictvím osídlení směsí probiotických baktérií.

Dosavadní stav techniky

Střevní mikroflóra podstatným způsobem ovlivňuje a charakterizuje zdravotní stav hostitele. Střevní mikroflóra každého jedince se sestává z přibližně 1000 různých bakteriálních druhů a asi desetkrát více různých bakteriálních klonů a izolátů. Střevní mikroflóra teplokrevných zvířat se sestává zejména z baktérií náležících mezi Gram pozitivní Firmicutes a Gram negativní Bacteroidetes. Minoritní baktérie kolonizující trávicí trakt pochází z kmenů Proteobacteria a Actinobacteria. U hrabavé drůbeže se jako probiotické preparáty nejčastěji používají laktobacily (patří mezi Firmicutes') a bifidobakterie (patří mezi Actinobacteria). Experimenty původců tohoto technického řešení však ukazují, že podání čistých kultur laktobacilů nebo Actinobacteria jednodenním kuřatům nevede k jejich usídlení v trávicím traktu. Identifikovat jiné baktérie schopné účinně kolonizovat trávicí trakt drůbeže mezi desítkami tisíc variant je však komplikovaný úkol a prostá znalost baktérií přítomných ve střevní mikroflóře drůbeže nebo lidí neposkytuje vůbec žádnou užitečnou informaci ohledně jejich vhodnosti pro osídlování trávicího traktu kuřat v prvních dnech života. V případě studia střevní mikroflóry kúra domácího se navíc různí autoři uchylují ke studiu střevní mikroflóry v prvních týdnech života přibližně odpovídající délce výkrmu brojlerů (cca 35 dnů). To je však značně problematický a zavádějící přístup poskytující výsledky velmi diskutabilní kvality. Důvodem pro toto tvrzení je, že kuřata se líhnou v líhních, bez kontaktu s dospělou slepicí a jejich počáteční mikroflóra pochází výlučně z prostředí. Střevní mikroflóra mladých kuřat proto není vůbec reprezentativní pro kúra domácího a mikrobiální kultivací z trávicího traktu brojlerů se v naprosté většině případů získají bakteriální kultury nevhodné pro použití jako probiotika. Evoluce naopak selektovala kuřata tak, aby se hned v prvních hodinách po vylíhnutí v hnízdě osídlila mikroflórou matky. Nerespektování této skutečnosti při selekci nových probiotických kmenů vede k mylným konceptům a závěrům. Nadto je jasné, že slepice nepředává kuřatům jednu jedinou baktérii, a v souladu s tím, experimentální podání jednotlivých bakteriálních kultur nechrání kuřata před infekcí salmonelami nebo zvýšenými úhyny v prvních dnech života.

Naopak panuje shoda, že podání komplexní mikroflóry kuřatům, např. extraktem trusu dospělých slepic, vede k jejich okamžité ochraně před infekcí salmonelami. Tato varianta ovšem naráží na legislativní opatření, protože se tímto způsobem mohou přenášet i nezjištěná infekční agens bakteriálního, virového nebo protozoámího původu. Jednotlivé baktérie tedy nezvyšují zásadním způsobem odolnost kuřat proti salmonelám, zatímco komplexní mikroflóra, která má ale omezené použití, před salmonelami chrání. Řešení ochrany trávicího traktu tedy existuje, ale není jasné, zda je nutné podat vždy všech 1000 baktérií současně s rizikem nekontrolovaného přenosu i nežádoucích baktérií, anebo zda lze ochranu redukovat na menší počet baktérií. A pokud by bylo možné redukovat počet baktérií, není jasné, které baktérie z tisíců různých vybrat do účinného preparátu.

Podstata technického řešení

Předkládané technické řešení proto předkládá probiotický přípravek, který vyhovuje výše uvedeným požadavkům. Obsahuje více než jednu baktérii, ale přesto má relativně jednoduché složení, které je technicky realizovatelné. Přitom zajistí efektivní osídlení trávicího traktu drůbeže

- 1 CZ 36678 UI od prvních dnů života, sníží přítomnost nežádoucích bakterií v trávicím traktu kuřat a ochrání kuřata před salmonelovou infekcí.

V rámci předkládaného technického řešení bylo studováno více než 500 různých baktérií, které původci technického řešení postupně izolovali z trávicího traktu kuřat a stanovili u nich kompletní sekvenci genomu. Z nich jen malá část účinně kolonizovala trávicí trakt drůbeže. Ty pocházely z kmene Bacteroidetes, Synergistetes, striktně anaerobních Proteobacteria nebo řádu Selenomonadales (kmen Firmicutes).

Po identifikaci baktérií schopných účinné kolonizace trávicího traktu kuřat v dalším kroku původci technického řešení redukovali počet bakteriálních druhů vhodných do směsi identifikací takových baktérií, které jsou specifické pro drůbež. Toho bylo dosaženo porovnáním střevní mikroflóry kúra domácího, prasete domácího a člověka. Tato analýza ukázala, že specifické bakterie pro kúra domácího pochází z čeledí Veillonellaceae, Prevotellaceae nebo Bacteroidaceae. Ze zástupců těchto taxonů byla připravena probiotická směs, která je předmětem tohoto technického řešení.

Předmětem předkládaného technického řešení je tedy probiotická směs vhodná pro podání kuřatům, která obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides gallinaceum, Metaprevotella sp., Bacteroides plebeius, Bacteroides barnesiae, Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Bacteroides mediterraneensis, Barnesiella viscericola, Bifidobacterium saeculare, Cloacibacillus porcorum, Desulfovibrio piger, Limosilactobacillus ingluviei, Limosilactobacillus reuteri, Ligilactobacillus salivarius, Marseilla massiliensis, Prevotella oris, Mediterranea massiliensis, Megamonas funiformis, Megamonas hypermegale, Megasphaera elsdenii, Olsenella uli, Parasutterella secunda, Phascolarctobacterium faecium, Succinatimonas hippei a Sutterella massiliensis.

Předmětem předkládaného technického řešení je s výhodou probiotická směs vhodná pro podání kuřatům, která obsahuje jako účinnou složku směs baktérií a to Bacteroides gallinaceum CAPM 6696, Metaprevotella sp. CAPM 7012, Bacteroides plebeius CAPM 6698, Bacteroides barnesiae CAPM 6693, Bacteroides caecicola CAPM 6694, Bacteroides caecigallinarum CAPM 6695, Bacteroides mediterraneensis CAPM 6697, Barnesiella viscericola CAPM 6699, Bifidobacterium saeculare CAPM 7000, Cloacibacillus porcorum CAPM 7001, Desulfovibrio piger CAPM 7002, Limosilactobacillus ingluviei CAPM 7004, Limosilactobacillus reuteri CAPM 7005, Ligilactobacillus salivarius CAPM 7003, Marseilla massiliensis CAPM 7006, Prevotella oris CAPM 7007, Mediterranea massiliensis CAPM 7008, Megamonas funiformis CAPM 7009, Megamonas hypermegale CAPM 7010, Megasphaera elsdenii CAPM 7011, Olsenella uli CAPM 7013, Parasutterella secunda CAPM 7014, Phascolarctobacterium faecium CAPM 7015, Succinatimonas hippei CAPM 7016 a Sutterella massiliensis CAPM 7017. Uvedené kmeny byly uloženy ve Sbírce zoopatogenních organismů (Collection of Zoopathogenic Microorganisms), Hudcova 70, 62100 Brno.

Takto je poskytnuta přesně definovaná, bezpečná, snadno kultivovatelná a aplikovatelná probiotická směs, vhodná pro masné i nosné linie drůbeže, která obsahuje baktérie striktně adaptované na kúra domácího, které ve vysoké účinnosti a dlouhodobě kolonizují trávicí trakt po jednorázové aplikaci. Všechny uvedené baktérie lze kultivovat současně, což významně zjednodušuje jejich průmyslovou přípravu. Probiotická směs je vhodná zejména pro podávání první den života drůbeže, ale lze ji podat i v pozdějších dnech.

Probiotická směs podle technického řešení má oproti všem podobným, doposud připraveným produktům, tyto technické výhody:

- Obsažené baktérie jsou adaptované na kuře a nevyskytují se ve střevní mikroflóře člověka nebo prasat.

- Jedná se komplexní směs z 25 definovaných baktérií.

-2CZ 36678 UI

- Směs obsahuje zejména striktně anaerobní baktérie adaptované na kúra domácího, ale je obohacena i o 3 druhy rodu Lactobacillus a jednu bifidobakterii.

- Všechny baktérie patří za předpokladu dodržení anaerobní kultivace mezi in vitro kultivovatelné.

- Všechny baktérie lze kultivovat v médiu bez přídavku jakýchkoli produktů živočišného původu.

- Všechny baktérie výhodného provedení byly celogenomově sekvenovány a bylo ověřeno, že ani jedna z nich nemá v genomu horizontálně přenositelné geny pro rezistence k antibiotikům.

- Baktérie ze směsi účinně osídlují trávicí trakt drůbeže po jednorázové aplikaci, a to tak odlišné genetické linie jako je masná linie Ross nebo nosná linie ISA Brown.

- Po aplikaci jednodenním kuřatům a infekci Salmonella Enteritidis probiotická směs zvyšuje odolnost kuřat před salmonelami.

- U ošetřených kuřat se v menší míře vyskytují patogenní nebo oportunně patogenní baktérie původem z prostředí, jako je Escherichia coli nebo Clostridium perfringens.

Probiotickou směs podle technického řešení lze podávat kuřatům kdykoli v průběhu života. Nejvýhodnější je však její podání kuřatům bezprostředně po vylíhnutí. Směs je proto určena zejména k aplikaci jednodenním kuřatům v líhních nebo bezprostředně po naskladnění kuřat na farmu, tedy ve věku 1 až 5 dnů, výhodněji 1 až 3 dnů.

Směs lze podávat v pitné vodě nebo krmivu. Pro dosažení homogenního pokrytí celého hejna je však nejvhodnější sprejová aplikace v líhni. Probiotická směs byla otestována jako zcela bezpečná po sprejové aplikaci. Předmětem předkládaného technického řešení je také krmivo obsahující probiotickou směs podle technického řešení. Předmětem předkládaného technického řešení je dále formulace pro sprejovou aplikaci obsahující probiotickou směs podle technického řešení a alespoň jeden kapalný nosič na bázi vody.

Při testování bylo zjištěno, že po orálním podání jednodenním kuřatům tvoří baktérie z probiotické směsi více než 80 % z celkové střevní mikroflóry u sedmidenních kuřat. Ve střevní mikroflóře kontrolních kuřat, kterým nebyla probiotická směs podávána, se baktérie probiotické směsi nenacházely. Baktérie z probiotické směsi ze střevní mikroflóry vytlačily baktérie, které mohou způsobovat záněty a nežádoucí fyziologické stavy, jako je E. coli nebo Clostridium perfringens. Probiotická směs podle technického řešení při testování nevykazovala žádné negativní vlastnosti, a naopak chránila kuřata před experimentální infekcí Salmonella Enteritidis, a to jak při orální čelenži tak i po čelenží s využitím modelu „seeder bird“. U osídlených kuřat navíc klesal podíl E. coli na 1 až 2 % z celkové mikroflóry, signifikantně méně než u kontrolních neosídlených kuřat, u kterých se podíl E. coli na celkové mikroflóře pohyboval v desítkách procent. Předkládaná probiotická směs je proto velmi vhodná pro použití jako probiotický preparát pro kuřata, který účinně zlepšuje zdravotní stav a fýziologické vlastnosti kuřat bez nežádoucích vedlejších účinků a omezuje tak potřebu použití antibiotik.

Přípravek je s výhodou formulován pro orální nebo sprejové podání, a obsahuje tedy kapalný nosič na bázi vody. Kapalným nosičem může být voda, fýziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie. Růstové médium pro pomnožení a fermentaci neobsahuje žádné ingredience živočišného původů a sestává se pouze z peptonu ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu.

CZ 36678 UI

Probiotický přípravek s výhodou obsahuje alespoň 10⁷ CFU, s výhodou 10⁷až 10⁹ CFU, na mililitr tekutého produktu každé z obsažených baktérií. Předmětem předkládaného technického řešení je tedy probiotický přípravek obsahující baktérie pro použití jako probiotický preparát pro léčebné či preventivní zlepšení imunity a/nebo fyziologických vlastností střevního traktu drůbeže Gallus gallus. Zlepšení imunity a/nebo fýziologických vlastností s výhodou zahrnuje prevenci infekcí trávicího traktu drůbeže patogeny, zejména patogeny E. coli, anebo Salmonella, anebo Clostridium perfringens.

Přípravek je možno podávat jednorázově v jedné jednotkové dávce nebo opakovaně v několika jednotkových dávkách rozložených v čase. S výhodou se však poprvé podává sprej ováním v dolíhni den před naskladněním kuřat na farmy, nebo sprej ováním kuřat při třídění před transportem na farmu. Třetí dávkuje možné distribuovat kuřatům po naskladnění na farmu orálně, a to jak pitnou vodou, tak jako příměs do krmivá.

Objasnění výkresů

Obrázek 1. Grafý znázorňují počty salmonel ve slepém střevě kuřat 4 a 14 dní po infekci (DPI). Kuřata byla v den vylíhnutí osídlena probiotickou směsí a po týdnu byla polovina kuřat v probiotické i kontrolní skupině orálně infikována S. Enteritidis. S. Enteritidis byla kvantifikována kultivačně jak u kuřat, která byla přímo orálně infikována (seeder), tak i u kuřat v kontaktu, tedy kuřat, u kterých došlo k infekci salmonelami přirozenou cestou, kontaktem s infikovanými kuřaty (kontakt). Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty salmonel byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.

Obrázek 2. Grafý znázorňují počty salmonel ve slepém střevě kuřat 4, 11 a 18 dní po infekci (DPI). Kuřata byla v den vylíhnutí osídlena probiotickou směsí a hned po 24 hodinách byla orálně infikována 5. Enteritidis. S. Enteritidis byla kvantifikována kultivačně jak u kuřat ve slepém střevě, tak i v játrech. Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty salmonel byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.

Obrázek 3. Schopnost probiotické směsi zvyšovat odolnost sedmidenních kuřat před spontánním osídlením E. coli a Clostridium perfringens z prostředí. Hvězdičkou jsou označeny signifikantní rozdíly (t-test, p<0,05), kdy nižší počty E. coli byly vždy zaznamenány u kuřat ošetřených probiotickou směsí.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1: Identifikace a izolace vhodných bakteriálních druhů specifických pro mikroflóru kuřat

Při návrhu nových probiotik je klíčové selektovat z bakteriálních druhů adaptovaných na daného hostitele a vyhnout se sdíleným druhům, jejichž původ je nejasný. Při návrhu nových probiotik jsme porovnali bakteriální druhy vyskytující se u člověka, prasete a kúra domácího, a zaměřili se jen druhy, které jsou přísně hostitelsky adaptované na kuře. Baktérie adaptované pro kuře jsme vybírali z čeledí Veillonellaceae, Prevotellaceae a Bacteroidaceae. Na druhy z těchto čeledí jsme zaměřili následnou kultivaci, která byla prováděna z obsahů slepých střev dospělých slepic naředěných ve sterilním ředicím roztoku (0,1 g síran hořečnatý heptahydrát, 0,2 g monobazický fosforečnan draselný, 0,2 g chlorid draselný, 1,15 g dibazický fosforečnan sodný, 3,0 g chlorid sodný, 1,0 g thioglykolát sodný, 0,5 g L-cystein, 1000 ml destilovaná voda, pH 7,5 při 25 °C). Jednotlivá ředění byla vyseta na Wilkins-Chalgren (WCHA) agar a inkubace probíhala v anaerobní atmosféře sestávající z 10% CO2, 5% H2 a 85% N2 při 37 °C po dobu 72 hodin. Z narostlých kolonií byl alikvot resuspendován v 1,0 ml BHI bujónu s 10% glycerolem a zamražen při -70 °C pro další použití. Z jiného alikvotu byla izolována DNA, která byla využita pro stanovení kompletní sekvence bakteriální DNA a následnou druhovou identifikaci. Se znalostí celogenomové sekvence

-4CZ 36678 UI byly identifikovány geny specifické pro každou z uvedených baktérií a na ně byly zacíleny Sybr Green real time PCR pro detekci a kvantifikaci v libovolném typu vzorků, zejména však trusu ošetřených kuřat s využitím následujících specifických primerů:

Cílová baktérie

Bacteroidss gailisiaceuiii CAPM6696

Metapm’ctella sp. CAPM7012 Bacteroides plebetsia CAPM6698

Bacteroides baraesiae

CAPM6693

Bacteroides caesícola

CAPMW4

Bacteroides caecigallšiararsi

CÁPM6695

Bacteroides Hiedtterrarieerssis

CAPM6697

Bamesiella visceňcola

CAPM6599

Sifidobacieřiuta saecdai t

CAPWODO

Clcacibaciltas porcsnim

CÁPM7801

Dessiífovibrio piger CAPM7OO2 LšsEosflactobacšSus mgluviei CAPM7OO4

LifEosilaetoba-ciite resteri

CAPM7005

LígtíactcsbacilhK salivarius

CÁPM7803

Nl&rseííla rwasidtierKts

CAPM7S06

Prevotella cris CAPM7007 Mediterrarsea suassiíisisís CAPMTOOS

Mpgarajmas funífcíUlís

CAPM7OO9

Megaawoas hvpersitegale

CAPM7S10

Megasphaera eřsáenu

CA?M70H

OlseaeUa uli CAPM7G13

Pafssutterella secuoda

CAPM7014

Phascolarctobscterium faecítim

CAPM7S15

SuccinatiHioaas hippei

CAPM7016

CAPM7017

Forward primer

TACCGAGTTGTTGCAGGACT (SEQIDNO. 1) GCGAAAOGAAAGACCCGAAG (SEQIDNO. 3) GGAGGTTCCTGTGGÁACTGA (SEQIDNO. 5)

ÁCGTACCTTGGCTCACTTCG (SEQIDNO. 7)

TATACCATGČACGATGAACC (SEQIDNO. 9)

GATGCGGTCCGTGTAAAGTT (SEQIDNO. 11)

CGGTTGA4GGATGTGCCTG (SEQIDNO. 13) ČTCCTCATCTGGGGCAAGAA (SEQIDNO. 15)

GAGGACGGAŤACGACACCAC (SEQIDNO. 17) CTCATAGGAGTCCGCATGGT (SEQIDNO. 19)

TCCTTTGCGTCTACATGCTG (SEQIDNO. 21)

ÁGTCCTCCACGAACATACCG (SEQID NO. 23)

GAAGCAAAGČCAGCTCAAAC (SEQIDNO. 25)

TCGATGACGŤTTTCGGTGTA (SEQIDNO. 27) TTATCGTGGTGCCTACGGTG (SEQIDNO. 29)

GACACCATAGACGCCCAACT (SEQIDNO. 31) GGGCATTICCCCGTATTTAT (SEQID NO. 33)

ATTACAGGAÁCAGGTGTAGG (SEQIDNO. 35)

ATTCGCCTTCÁCGACAATTC (SEQIDNO. 37)

ACGTCAACGAAGCCGAATAC (SEQIDNO. 39) ČAGATCTCCCAGGTCCTCAT (SEQIDNO. 41) GGAAGCGAIŤTCGACTACGA (SEQ ID NO. 43)

ATGGTTGACTGGTGGCTTFC

Reverse primer CGAACGGCACTGCATTGATA (SEQ ID NO. 2)

ACCAAGGCGGAAGCAACGA (SEQIDNO. 4)

AACGAAGTGGTGGAATGCTC (SEQIDNO. Ě)

ŤGGTATGCATCACCTCGTCG (SEQ ID NO. 8)

AAATACCTTCTTCCCTCACG (SEQIDNO. 10)

GTCGGCAGTGAGGAATTTGT (SEQIDNO. 12)

GGTCGAACAČAAAAGCCGGAC (SEQIDNO. 14)

ÁAACTCGTAGGGCTTGTCGA (SEQIDNO. 15)

ČAGGTGGTCČAGCAGTCTCA (SEQIDNO. 18)

TCTGTAGTACGCGCATTTCG (SEQ ID NO. 20)

GATTGAAGGTGGCGTAGAGC (SEQ ID NO. 32)

TGATTAGTGGCACCGTCAAA (SEQ ID NO. 24)

TCCCCGGATTGTCAAAGTAG (SEQIDNO. 26)

AAAAGCCGTGTTCGACAATC (SEQ ID NO. 28)

CAAGCTEGCTCGACGATGTG (SEQIDNO. 30)

CCATCCTACAAGTGCCCGTT (SEQIDNO. 32)

GTATACTCGCCCAGGTTCCA (SEQ ID NO. 34)

ČAGCCAAAAÁCTAAACTTGC (SEQIDNO. 36)

TTACGATATCGGCGAGAACC (SEQIDNO. 38)

CGACGACCATGAACTGAATG (SEQ ID NO. 40)

GTCGAGCTCGTTCTGCTTCT (SEQIDNO. 42)

GGAAATAGACTGAGTGCCGTT (SEQIDNO. 44)

ÁGCTTTGTTGTCGGCAAGTT (SEQ IDNO. 45)

TACCGGCGTTGTTGTCTTC A (SEQIDNO. 47)

AATGAAACGGGCGGCAAC (SEQ ID NO. 49) (SEQIDNO. 46)

ClOCGGTGCAAAACGATTGA (SEQIDNO. 48)

CGAAAATCACSCGACTGCGGAT (SEQIDNO. 50)

-5CZ 36678 UI

Cílové sekvence primerů byly následující (oblasti, na které přiléhají primery, jsou vyznačeny velkými písmeny a tučně):

Bacteroides gallinaceum CAPM 6696 membránový protein, předpokládaný pro AGFAE dráhu (membrane protein, inferred for ABFAE pathway) aigccttcticgaaaaacgaagatggtacgaccaagctggcttttgccaacttgcgtattaaggacaagacatttttggtgttcgaaggcaaag agggtgtttctaccgaacgtatggcagaggtgtgtgatgccttíattgattegttgeaggctaaggatgccttgtccgatteattacaccgggtg atagaggaggtgttttaccgtttgcctgaagaactcttgccggatgccattgattacctgagtggacattttcctgcttatategatacaagetttta tgcctgcatcgacacgatgctgaccgaaaagcattttcgccggcagatggagatgaaecggaaggatttgctcagcccgataggcacgttat ateccgaacttatecagatggatccgctaggtatgcgtatgcttctgaaggagcaa.ttettgcíggcatcagctggagagaaaaaaggaggtt ataaaatccttgacgggcatatittcgtaagtgactctacggtgtgtgtggcatttattacgc£ct\gciattcggcaactaatacaggicaa.ggtt ctgctttgtttacgatgttgaatgaacagatagctcaaittgcccagacggctcctgacatcaaaatagcttatcacggtacgcctgccagtggc ttt.tataattcgaaacaaatcaagtcggacttggctggcaccctttccggttcgttgcttttcgtattggcttttatttttgtttgctatcgcaattggga tacacttcctttgttggtcttgcccgtcctgttcggaacgttattcggacrtgctttgatgtattteaicaagggacaatatcattgttggcattgg atogg3gc.ggttattttgggtgtggcatlcagttatgtgrtacacatcatcacccattataagtatgttggiaatcccgaacaggtcttgcgigacg aagtcaagccggtgtgtctgggttgtcttacaaccattgg.cicgtttatggga.gtagtatttattcgTACCGAGTTGTTGCAGG ACTtcggactttttgccact.ttcgccattctg£gcactacggcattcagcttgatctatttgccgcagt.tcttaagtccgaagcgaaataagt.tg aaccggcgtgccttigccttaaitgaccgTATCAATGCAGTGCCGTTCGacagaagcaaacctttattgattgttaitctg gtggt3acc.gtggcttgtatcggactttacctggccggaggcacacgctrtgatgctgatatgc-ataacctgggataiaaggcagatattacca cttattcggaagsattgttj^gaagcaag»cgtatecgggcg&^^ gagcgttttgccggaatggcccggaaactggattegctÉcagcaggcaggactggÉgařiaggctatacacgtaccgaccggatattcgttcc tttacgtgigcaacaagaacgtatagatgcctggaaagcatattggaacgaagaccgtctgaaacgggtgcacgagttgattacccgtacgg cacctcaggttggctigcgtcccg&agcttttgacttgtttttcgaatatgctactgccgattatcaíceggatgcct^ ccctgcaggatatcagtctacattaatggagcaatcgtaÉastggcgaatacctgt.gÉtttacgtcggtgagatgcgccaatgatacggtgcgt agcaagacgagcgattatcatcgiatttgcgatgetaitgcaacacagcctcacatgttggtgttggatacctatiattatactacggatactttga tgcaattgaacgatg.acttcagtgtattgcaatgggtttctatgctttttgtcttgctggtcttgtttttcagctteagggggaatatccggteitacgtt actgggatttatgccgattgt.attcagttggcttettgtattgggastgatggtgttgttcgatatgagttttaatett3teaacatcattatctctacttt tatttttggtatcggagtggattatagcatetttgtcatgagtggactgataggagaagaacgcgacacgcgattgctgggataccataaaacc gctettttctteagtgcggttataftagtggtaactgta^ctcaatgttgtttgeggtacatecggcaatcťgfó

c.ggattgctggcggctgttatřawtctiatgtgctacagcccgctgtgttcagaatgattcagaagaagaaatga (SEQ ID NO. 51) to Metaprevotella sp. CAPM 7012 glukuronyl hydroláza (Glucuronyl hydrolase) atgaígaaacĚgagtaatgtattgtttggcatggggetggctgctttgtcggcatgtgccggaggaaaaactgcatcgteggctggaacagtc gatgtggat.aagga.gcttgcatattgcgatgcgcaggtgtgccgcgcgttggacagtctgcactgcggtgataccattgactatacgatgga gccgag.aaa.catttatecgggggagagcaagtggaactgccgcaa.ggcgactaaggaagaatgg3cggccggattetggcccggegtg ctgtggtatgactatgaagcgaccggaaatgattccatccgcagggaagcggagagatttaccggatcgctgaagtttcttgctÉctgctccg gcatacgaccacgatctgggattecttgtattttgcagttacgggaacgggtaicgtetgactcagaatccggaatacaaggaggtgaitcttg ccgttgccgattcgctggccgccctgttcaatccgaaagtgggaacaatcctgtcatggcctcgcaatgtggaagtttatggagggcacaata ccatcatggataatatgctgaatetggaaatgcttttctgggcggcacgcaacggaggggacaagaagctttatgacatagccgtctcccac· gccgataagacc&tggagaatcagtíccgtccggactatacttectatcatgtggccgtatacgatacgetgagcggaaaatgcatcaggca gtgtacacatcagggatacgctgacagcacaatgtgggcgcgaggccaagcctgggccatttatggatataccatggtgtatcGCGAA A.CGAAAGA€GCGAAGtatctggacttcgcgaagaaggttacggatgtttatttggaacgcctgcccgaagattatgtgcctttc tgggattttagtgctcccggcattecggacgcccccaaagatgcttctgctgcctgtgTCGTTGCTTCCGCCTTGGTtga gcttgccggctattgtgagggcgagctgcggcagaattatategatgcggctgaaaggatgctgaaaagcctgagcteggacagctaccag tcgcgcgacagaaatgtagctitcctcatgc-attctacggggcattggcctgc€aagtcggaaataga.tgcttcaatcatttatgcagactattat tatatcgaggcttEgctgaggctgaaagcttaccgccagtcacactga (SEQ ID NO. 52}

-6CZ 36678 UI

Bacteroides plebeius CAPM 6698 hypotetický protein atgcgaatttctthcaactgaatgcggcatctcctttgcaaataaaggatttitttcgcaagctGGAGGTTCCTGTGGAACT GAccgtacagggtacttaccgtggggaaactcattattattttcatcgrccgGAGCATTCCACCACTTCGTTtgtcatttc cgacgataigcatggcaaaatagigatagecatggacggactgtcttcatacgatgactstaaattetitccttaceigsitgatacgitgggctt gcatctcaacgggcatagtccgaaactgatgtcgcgggaggatgggaagacttecagcgtatatgeaa^ctgggtgcgcaatggataga a.gactgtateg.gagaggag.ata.gcctcgctgaaggtgatattgtccgtcattccecgctgftacctggagcfc gtitctctggagcagttgaaacgatatggggtgaatottcattectecaccteacgcatttatggttacatacaatacctgcttcggaaaggetgg ctgttagaagcgactaagg.aagagtttetggccgaecggatggcctatgcgatggatgtggaggttgatgtgccacagcatgtgtetatcg acgggteaagtcatggcagaccgacggcacggaaacctgggaaagtttttogcgggaagacgtag^ agtatcgtgaaggaacgcccgtagacggggtagtattgaatgacattggtaccttgtatcaggaaggggtaggggtatt.ccccga.cggctat caggcagagttctggtttaaagasgctgtccgtcagggggatttgacatacgcttcggccaacttgggigatttgtatcggaaaggatgcggt a.cattgcccgtgtcgcttccgcaagcctttgaggcttatcgtcattcgtccgacccttatgctttctatcgcatcgggcaggggtacgaggaag gatg.gacgggagtacctgatttac.a.cctggcc3ígttctggtataagaaggcagcteaggctgggcatcatctggctctcaaacggctřgcíc gcgagtga (SEQ ID NO. 53)

Bacteroides barnesiae CAPM 6693 hypotetický protein atggaaagaatgaacaatcgtgtagcgtt.ggtaa.ccggcggagcttcgggcatcggtcgggctaccgtagagcgtetggtacgcg.aaggc gcaaaagtggccgtcgcggattataacctggaggcagccgagaagctggccgtagcattgaacgccgatggcgagaaagtattgcctttgt a.ctatg3tgcggca.gatttggatagcggtcaggccgctgtggL4CGTACCTTGGCTCA.CTTCGgtaccategatgtact ggtgaacaatgtcggtatcggcgaiatgaagcgggatg.tigatgiagtctgtctggatttggattattiCGACGAGGTGATGCA TACCAacctgaagagtatgctggccatttegcgtaccgctttgccggtgatggccgaaaagaagcaaggagccattgtcaatgtatettc catcggttag (SEQ ID NO. .54)

Bacteroides caecicola CAPM 6694 dvoukomponentní regulátor odpovědi (two-component response regulator) atgaacaacgggattgaggcatatcgggttttggrtatcgacgatcatcctatcgtgtgtgaagggttgagaggactgatagcgcaaaaagag aataccttatgtgtgggcgtateggataagaaatcgctggaagcatcgtttgccgggcggttcgatttgtatattacagatttggagtttccggat gtogatatgggaaaattggttattcggttgcgaaatcatgcEccccggtgcagcatccttgttTATACCATGCACGATGAA CCgtgggtggcggctaagttgteggattgggataiigatggagccgtttecaaaaatEcggatataaacgaacttcatctřgccatte ttgCG'TG AGGG AAGAAGGTATTTcgac a.c ggcaitggctccgtgtcggtcgttgagcccttttgctgttcctgatttctc a cggcgcgaa&aagaggtgUggatÉgccagcacggggaatgaatacagccgagatagcagattctettttcataagtecc.aatacggtgaa aacacatcgcaggcacttgatggagaaatttgatgccaagaaegtggctca.gttgattgctaaatgg'aaacgctggtcgctctga (SEQ ID NO. 5 5 )

-7 CZ 36678 UI

Bacteroides caecigallinarum CAPM 6695 hypotetický protein atgaaaacacatatctacatttatatttctatattatttatggtaatgttttcegcctgcggaaagaaaactgacagggaatatctttctgaagtgctt gagaatatgaacsaggtaaattcs.gtaaaataccattgtgtacttaaatcttgggagcc.gggagacaatgaa£ct.gtataega^ gaaatatacgagcatgiaaatectgaagataccgceataggttatteatatttaattgcatcagacaaggaattcaagcatcctotatcagtatat gatggaactgtteaatcatatattgaagaaaaggagaaagaaatagtaatagatgacttcacacgaaaaaggcctttaccattcagattaatca aacaagaagctttitatcacatgaaagcaataatagattatgegctgaacacaaacgacngcattatcctcacactgiiaggacgagggaaaa gattttcttatggaactgacgataaaiatgcccaatcaggtagagttittcggtaaggcacaata.tatgccggaaaa.cccttacacatacgaccc tacatetatttacaaagtatggatttctaaagaaaatgatatgccataccgctatcgcagggaaatgcaacataatataaatgaaganatctgtic cgactttgtattcaacccctcgggaatgggaaaaataatagcagaagattactatccggaaggctatgaacggtatataagaggacagaaaa aagagaagcdgccgttgacatgacaggtaagactgctccggaatggactctgacEgstattsacgaccggaaaaictcscttaaagacatEa aatcga3aa.ttgtccttcta.cagctcacagga3.ta.gGATGCGGTCCGTGTAA4GTTtctatccctttectgaac3.ggctta gagagaaatacgacaataatgagcftgaaatciitagctgttgaga.catggataaagagaiiaatcategagcgagaactatatcaggaagaat gatataaaatACAAATTCCTCACTGCCGACaaggaaa.gtatagaaaaa.cttattaatgactatcaggccggaagcagtg ttccteaattttatctgataggtaaagacagaaagatattgaagaaattccaaggatacgccgaaaaga.taagjgacaaagagatagaggacg agattaagaaaaatctataa (SEQ ID NO. 56)

Bacteroides mediterraneensis CAPM 6697 glykosid hydroláza, rodina 28 (glycoside hydrolase, family 28) atgaaaaaacaaaecttgtttcttgttttgtgtggcctgitctcgtggacgaatacggctacggcaattgaaiataatgEgctccggcacggagt ggtgggcgatggaaaaacactgaafacggatagccigcaagcggctatcgataaEttgcatgtetcaggasgcggtcagttgiatttoccgg ccggacggtatckaccggtagtttgcagttgaaatcgaatgtgatgcttiacctggsgaaggaggcggtgctgttgggasgcacgagtccg tatgatta.tccgggttteagcacggagaaggagctgaaggtgaa.cgatgaccattttgaccaggcactgatttatgcggaaggagctgaaaa tattggtatcatgggagaaggatetategatggiicaaggccgagaactggccttgacgattgatagtetgcatcatacgggagagttggtgg ataagcattataacacataccgcaagcgíccgaatacgcgtccgaaacttcřrácattcgtggatgtcgtggggtggagattcgcaatgccca tctccgaagcagtgccgcgtggggattgtcgttctctttsígcactgaccttacttEggacagtctgcatgtcgaaaaccgggcttattggaaca acgacgggattgacatcagcgattgtaagaaggtgcgtatttcgaactgttacatcaattcagctgatgacggcatttgcttgaagtcgcacaa ccggggggcttggaatgacgatgtctctatttecaactgtcacatcatcagcagtgccagcgccatcaagtttggcacggaatcactcggcg gattoaagaatgtga3gattgaccgtatctgggta3aggatacttaccgdcggccattgccattgagtcggteg.atggagcggagattg3.gc atgtacaggtatccaatgtgcatgcggtgaacacgggcaatgcgatttttattcgtctgggacatcgctcgggagaccagccggggtacttgc gtcatgtgtctattaagaatgtatatgtggaagtgccttttggccgtecggaccttaartatgacttgcggggaccttcggtgacgttettccataa tccgĚtccccagtícca.tttcaggcataccagggc3.tgacattgaagatgigacgĚtggagaacatcgagattgtgtatccgggccgtgctac gcggggaatggc ttacstgteggtgagcC GGTTGAAGGATGTGCCTGaaaatgaaaagggatatcc ggagtttaceat gtttgaggaactgccttca.tggggattttatgtgcgccatgt.g.aaagggattcagatgcgteacatcaagctgcgtttgcaggaagatgatttcc GT CCG GCTTTT GT GTT CG ACCgggtaagtg.atattcgtetgacg.gggattgacttgce ggagaa ca agcaggcaag gcaggtggtcttgcggaaatgcacgttgcaggaagtggataccaccgcaaagaaccíigttgcaggaggtagattga (SEQ ID NO. 57)

-8CZ 36678 UI

Barnesiella viscericola CAPM 6699 putativní hydroláza, rodina alfa/beta ohybu (hydrolase, alpha/beta fold family, putative) gtgacgctgcaatacaacgtcgaa ggcgaaggcctgcccgtgatactgatgcacg gctgggggtgcaa cc acaccaccgtg gcctcgat cgaacggctgttgacgccteacttcaaggtctataacctcgacttcccgggattcggcggcagcagcacgccgccggccgtgtggggcgt agaggagtatacttgcctggtcgaggcttttgcccgggccgaaggcatcgagcgtcccatccrc.atcggccactcgttcggcggccgggtg tcgataetctttgcctcgcgcaacgccacccgcaaggtgattctggtcgatgccgccggcglgaaaccccgccgtecgclcaaatactacgt gaaggtet3ttcgĚtc.aaactgtggaaacggctgctccccctcgtcgtgggccgcaaa.cgggccgacgaaaccaícgaggcctaícgccg cařiateggggtcggccgactaeaa.cgccctcaccggeaecatgcgcascattctggtcaaggtggtgaaegaaga£ctcaa.ggeggtgat gccccgcatccagtgccccgtgCTCCTCATCTGGGGCAAGAAcgacaccgccacccccctgcgcgacgcccgcac catggagcgcctcaítcccgacgccgggctegtggccttegaegatgccggccattacagctíccTCGACAAGCCCTACG AGTTTaatgccgtagtacaaaacrttttacagcccgatataaaacaaaaatcatga (SEQ ID NO. 58)

Bifidobacterium saeculare CAPM 7000 FIG00424012: hypotetický protein gtgatccgícacctggtggcgacgtacgagtecactgaggÉgcgccataiccggtgcgacgggtactacgactatcaggtcgcccggccc atcacctgcaacatccagggccgtaggcgcattctgtggceceaga.ccacg.tÉctatgacatcacgatcagccccgagctgcacgtgttggc gcagatagcgccggaacccaactaccggtggctggaatactgcagggaaagcctgcatgtggccga.ggagttcga.ggtggaccgcatoa tcacgctgggcsccatgttcgccgactgcccgcacaccaggccgttgccggtggacgtctcggacagcacctgccagtgcagcatggac caggaatacaacgggcccgtcggcatccccaccatectggatgccatggcctgcGAGGACGGATACGACACCACgt cgatgtgggtgte gatcc cgcaatatctgggc tgtgacgaatgcgccccggccacgcTGAGACTGCTGGACC ACCTG tccatggcgctgggggtcgccctggacggcggca.cgttggtcgggaa.ggccgaacggtggcgaggcaaggcctcagcactgatgcggt gcaatgatgacctgaacgcctecgtgaaggagctggaacgcgcctacgacggtgaateccccgcgcgggacatgccgccgtteaacgct ccgcaggccgagcagctggtgaaggaggccgaggagttcctcaaggattgcggcggcgcttccacggcatga (SEQ ID NO.

Cloacibacillus porcorum CAPM 7001 protein neznámé funkce DUF521 atgtatttgacagacgaagagaaacggatcctagaeggagccgaagggaccggacgacagaa.ggcgatggagctgctctacgcgttggg gctgaccdcaaegccgagaagcteatcccgatcaagegcgcccacgiggcgctcagcggccaggaaggcgacacgíactggtgcgaa ctgcttgtcgacggcggcgcgaaatgcgtcgtacctccgacaacaaacccgtactgggacacggagtacctcacgaaatatttcgacgtga cgagagaagagc-tcgagctcgcggagcgc.accggcgacge-ctaccgcaggata.ggagccaagctcacatetcactgcgc-ccccgggct ttgcicgaacgtgccgttc.ÉtcaaagagcacgtcgccactctgaatcsagcgcgaccccgtacgteaacÍcegcgatag accgtgaaic.gtcggta3gcgcsotcgccgcggcagteatcggcaaaacgcccíatt3cggcetgcaccftgaa.gaaaaccgcagggga gaettccttatc gacgtggac gccgac e t cagggactgctac gactggggga.tgctcggc.cactgcgtc.ggcagaat agcgggctc gegc aac.cc.ggtcdccgcttcagaaacc.agccgaaaccggggcaggaagacttcctetacfcgg.a.gccgaagccgcgacgagcggctccgt cgccatgtaccacatggtaggcgtgacgccggaagcgccgacgcttgaggccgccttcggaggcaaaaaagtacetgaatcagaatacgt catcaccaacaaggaactcaaagccgaagaggacatgctcacgcccgcgaccggcaaaateaacctcgtcatgctgggct.gcccgcatt.a cacttacaaccagcttctcgaggtcgagcgtctctttgcOgggcggcacgtatcgtacgataccgcgttctgga^ ccgtggagctegcxgagaagtegcatetgcgccagcgccttgagCTCATAGGAGTCCGCATGGTtggcgacacctg catagacgaaccgigctggaaatcgttcgagggcgcgctcggagtgaccgactcgcCGAAATGCGCGTACTAC'AGA gagcgccgcggacagccctttgcaatccgccggctgtcggaatgcgtagaagcggctatcsaagggaggctcgacĚaa (SEQ ID NO. 60)

-9CZ 36678 UI

Desulfovibrio piger CAPM 7002 protein cytoplasmatické membrány (cytoplasmic membrane protein) atgctcaagatcgtcacgaccaTCCTTTGCGTCTACATGCTGgtccgctgcgtgctgrccctgcgcrgcaaacggccg ctcaagatgcÉgclggccctgctggtgctgctggtgggctteegcctgcacattttttccctGCTCTACGCCACCTTCAAT Cccgagctgcc.gcgctgggtaciggteagcacgggcgtgccgcatgtgctettettcctgctgg.ccctgctctcgctgctccgggacg.gc.g tetgcctcatctggtggctggegcgccgcctgcgtccgggccttccggccctgcccggcagcaaccggcagiitggccgccctgctgctgg tggccctggtgatgaccgtcatggccgtgcccgcggccctgcgcatecccgatgtccgcacgcaggagategtcctgcccggcctgcctc ccgctctggacggcctgcgcgtggcccagcteacggacctgcacatcagccgcaacttccccgccgagtggacccgggccgtggtggac aggaccaatgccctcaggccggacatcatcctgctcacgggagaccttatggacggcagccccgccctgcggcgcgaggacttcgcgcc catggccgacctgcgggcgccgcigggegtcttcgcctgcccgggcaaccatgaatattactccgaccigcctgcctggcggcccgtcctg cgcgetcacggcatcac^tgctggagaacgaggccgiggtgctgccggtgcggggcagcctoctgaccgtggccggtgtcaccgacaa tgtggccggtegcttcggcctgcccggccc-cgatccgcacagagccctggaggggacgccgcgaccgcgcatcctcatggcccacaag ccggagctcttecatgasacggccccggagatcgacctgcagctttccggccataccc.acggcgggctggccctgctgctggatcagggc gtggccctgttcaacggcggtitcgtgcgcggctggtatgcccgggac.gacgcccgcctgtatgtgggteccggcagcggcctgtggggc ggttttcccctgcgcctgggcgtgccttccgagatcctgctgctggtcctgcgcgcgccgcggtga (SEQ ID NO. 61)

Limosilactobacillus ingluviei CAPM 7004 FIG00752414: hypotetický protein atgcgtgaagaagttttaaaagtcctacataa.cgaatcatcaaeggcgggggtgccaatttccttttggcggca£Éttgctgacaatgaatítat cgatgctgctgaccaaLxagcggtgatcgaaaccaacttgcaagggcatcgcgactaittggccgcggitgacgtggatctggtcaaaacg atgttggatggctactttccttaccca.ttcaacaacgttactgatecgcgtgaccttagtcagttgaaacggattcaaccgctagcaecaactgat ccctggadcaaggtcaagttgaactggciaaacagcagcgggcccttgca.ggtgacaa.gccattatttgtg.acggtcltttcgcctctgatctt acttaaatgggcgttaattaagcartatgaggaagccttaacgttggccgaccagcggtttaccgatctttacgaacaagacgcgaccattgta aagcatgtittggcagtgattgccacagatcagatcaaagtggt.gcaAGTCCTCCACGAACATACCGatattgstggga tttactacagtacccaatcaattcaggatccgcgggttgataaccttgaattttteaacagcgtcatgaagcccgttgatataaaaatlcagaagg ccatcaatgaagtetttgagaccagtattetecacatctgcgggTrTGACGGTGCGACTAATCAtttggagtEgtttgtgg a£tatccgttaccggtaateaactgggccaccaagactgatggcíataccttgggggaaggtaagcaactgtttggggaccgggĚggtgtÉg ggeggctKgacaacagccggaaaggaatcctctattcgggcaataaagaagagatteaacgttatgttcaagagcttttattggaagcggga a£gaaaggcgtaaitttaggggcggattgcacgghcctegcgacaitccttatgacca.cctgaaatgggcgattgaagctgcgca.taattttt ag (SEQ ID NO. 62)

Limosilactobacillus reuteri CAPM 7005 celulóza 1,4-beta-cellobiosidáza (cellulose 1,4-beta-cellobiosidase) atgcgagtaatgaatttaatgatagtattagcagttattgcgattattattttagctgctcaatatttttctcagtlacggaagaaccgc.aacggtaat aatttcgtgagtgggggtcgtgtettitdaactggacgctggtcgctgtcttagtaatttgtgttgggggaataatttttggtagcattcattcacat cgccaaGAAGCAAAGCCAGCTCAAACtga.taagaccgagaatgttgaata.tactgctte£gacagtgatgatttgggta aggtttcgatorgtttgatcggaaagttacfttaaaigat&atggagaagcaaaagttaagtitaaggtttckxacaaa.CTACTTTGA CAATCCGGGGAcataagagcaaa.gagatagttaaga£atttaaagcaagtaagggcgaatcatiggitaaccatacttatacattt gatgtagctggtacctatgatattattgctgaacgtggtgatcaaaaggtaaccaagcagtřaaaggttaaggaaaatgataatgcccaagaa agttcatcaagtagtaghcagtaagttcíagctcftctteagttgcttcctcagtaagtagcacagtttectcgtctteaagctegactgcítccac cgcgcaaagfaatagtgaaagttcaagcagcacgacagcagcttcatcgaataacggaggaacttcaagaagctacaatacttctcgtccac gataiagtggcaatggcggtggaaataggacctctggtagc-agtacctcgactgctcctgcgcaagaaccaagtaclcctgcctatagtcaa gaaaacaatggctatgttagegatggcccacaataa (SEQ ID NO, 63)

- 10 CZ 36678 UI

Ligilactobacillus salivarius CAPM 7003 transkripční regulátor (transcriptional regulator) atgaaaaíúgttgtgacagatcctgaaaaggteiwccg&ateck'aaaa.cagcgacggaaatttteggccagcaaggcttcatcaagagcaa aaccgatcagattgccaaccaagcacaagtatctaagggcttgctcttccattattitggcaataaacaagcgctgtatcttgacgctttcaaata. tgcctatcaícgaatttatgatcacatg.gac^:cccaaa8agtggcagaatgcccctggcttggctgccatgatgaccactgcagttaagtatgag ttgaaactacaattcaa3ttcccagctgaai3ccgcttg.atgatg.caagcctatgctgatttac€gcattttcccgaae£gtt.gcgacaacaagt gcagcaagaaa.caaetgcc£itatcegcigaaaccgatcgcatttttcgcgagaaaattgaacagcigcctcgtcgtgagggcctgtea.gTC GATGACG‘TTTT€'GGTGTAgtttctgccttaategcccaacaaacggcggtca.cc3cca.ga.ct.cattgccagtggccatbat egcaagtttgaagatctgcagiccgtggttgagacgatggcacgccagftattGATTGTCGAAGACGGCTTTTtaccag atgaaagttga (SEQ ID NO. 64)

Marseilla massiliensis CAPM 7006 prekurzor protein IG-H3 indukovaného transformujícím růstovým faktorem beta (Transforming growth factor-beta induced protein IG-H3 precursor) atgg.agaattctatgaagcggctaaaatacatatttgtcggtgtcgtatgcgcactgaccgggatggctaccgtaagttgctctgacgaacctg atgargagaatttctatscatttacaggtgagatgatgagegactatttcaggaacaggccggaatacagcgactttgcttacattgtcga gctggcatgaccgatttgctgtcggcatacggccactai3catgctt.ccttccttcaaacaaggtgg.ttgaaaactattt.gaa.caagaagggttt gaatagtgtaaaggatcttacccgggaacagtgtgacaccatcgcacgcacgcatcttgtcaataa.catgtatgcgactettgacatgaa.cga cggtacgcágaatactgceaacatgaaca3gaggtacatacagattactcatac.tgtegacaagaacgacaactc^:tgtcgtecaactcaacc gtatgtcaaacatcattttcgacctgaaagacgattetgtagaaaacggaataatccacccgatagstgtcttgcttgagaattccaacagttca .atatetgatgttttgaaggcaaatgacaggatacgcatettttacgaaggtcttgttgecaccggcctgcgtgacacactcattaagacgaaag acgagtcgiatga.eggttcgaaatatgg8acatattcatacacgtctgatttctggcgcgagatagctgtegctcctgaggagaaaaagiatg gttttectgtttttgtcgagcctgatgacttgtatgagaaaaagttcaaggaatacggcatttccacatccaacggcatggtaagggctctttatg .accttgcatgeatga.tttatgaccctgtttttgccgacgacgctgattacaaggcagcctatggctttgacaagatcacagacaggaataatcct ctcaatatgtttatggcctaccacatactcacgcgcgacgtgatagggtggaacaagc.ttactccgaiagaggttcactccggcaiagtggat ggtgccataggcattaagatagacaagatgaatccttgcgactg.gtatgaaacattgatgcctegca.ccatgatga3gctggagca.ggccac ggtgcgcgaataEatggggaattctgagcgtgggcaaagata.cateaaccgtcgtgtagatgacaagtttt£ca.ttgatggoagt3a3ateca gccoacggtcgaggccgactetctgcaggatgcacccaatgggcggtatttctatattgacgatatcattgcctteaataaggacacteagga gaaggtgctgaacgacagga.taaggatggacttttcca.ctatcttccccgaa.gtgatgacaatgaac3tgcgtcttaacggtgacccg3c.aa aggatgatgaaagttetaaa.gccgaccagacatttaagaacgg.aaagaattattggttcccaaagggctatcttgacaa.tgtgacc.atggaag gtaacggagtgcttgtat.accgtcgcccte.acÉggaactÉcÉggtcgtacgaaggtgatgaatÉcaatctgtttgg.cgactatgacttta.cattcc gattgcctccggtgccatacgaaggtgagtatcagattcgcctgggattctgtgcccttgatacccgtggcgttgcacaaatctacttcgatggt aagccccagggcatacctgtagacatgcgtaagcgcttgtctgacgagacaatactcggcgaccagttcggcacaaagaagtgggcagac atgacagatgaggagaaggctgaagaccagaagatgcttaaaaacctcggttaTTATCGTGG'TGCCTACGGTGgcta ccatteaag,cggttccacaateaacg.aatttgtagacaacccgcgtacatacaggcttgtgctttgcactgtgcacatcaacccgaagaaaga ccattatatccgcgtacgttgCACATCGTCGAGCAAGC'TTGgtaacaataa.cgagtttatgatgg.actacttggagattgt tcccaaaagtgtttatgggatatcgtcgagtggtgcaaiggagacagatctgtaa (SEQ ID NO. 65)

- 11 CZ 36678 UI

Prevotella oris CAPM 7007 protein TPR domény (TPR domain protein) atggacaacaagggcBtaaaacaaataaacgaratattcaggMactegacaaccgcgBBCtggga^^ ettarégaeaectetecwaeatgatgtatgacgaggaacttgagantatcgagggtgatíacaatetaatgcttgactaca^ cascgacccgcaccgcgccgacatarataataatetgacagacaggctatacageHtgecrgcgacatgiteattacataccgtacacagca cgttgagttcttcaitgaggcgttaaggaantccatgaacaacaagttctecaaegriaaccgteaaagccgaaetggaaggaticgtsgccg aiaccgctatgctgagecrtgaagccgaagcgacacgcacggaaaagagcaaggagctgtaecgtaageataacgatttcatgcagtcact gttctgcaatetcatagtgtcacacc-aatggtc-cgtgcatgactctgaatttttcaagacactgttgatgtcacccBccgtcGACACCAT AGACGCCCAACTgctggtaa.gcgcgctgacgctggcgaegatgaacaacatggacgtaaataaaítcgaaatatiagtacatci ataccttaattcaacagatgaaaaagtgcgccAACGGGCACTTGTAGGATGGgtaitegcactetcctcacgcacaag gctattgccgaaaatgaaaaatategtggcaaaagcadcgaagacgairagcgtg^^ tactgcatgaacgcegaacaggacaccgacaceatcaggcgtgacataatgccggaactgatgaagaacaacaaectcaaaataacscgc ttcggaattacggaaaaggatgaagacecgatggccgacgttttcgaccccggagcctcggaacgcgcaatggagaaaatggaagaaag tttceagaagatgatgaacatgcagaaagccggctetgBcatatactttggaggettetcgcaaatgaaaegctttcegtttttctataaegtagc aacggcrottttfgcgacagtgacaaatactratttacgttigccgtcgcgtctgtaataagcagactgccggacaatatgaaggaaatgcta Bacacgcccgaagcattaggaertgccgtaagccatgaaga<waaraaaaaecggcatataia^^ ggttettcaggágttcccgcaacgtggacaactcgteaacccatttggcggcgaaaacttcactttcattaecgacaac^ cggttlacatgagttggttec ggacmtgrtattteatgataaagc a ca ggaaegaaaasgccttgaaaaatattatggc aaaa tttgccgatg gcggcaattcaaaaatgcgcctcataaBcggtctatacgaactgasctttgcaaagcggccacaaaaggctgtteaaaiattcsaggaactg astgcggaaaagccagacaacaagcgcgtgctattgcteetcgcacgaicatacttcga^^ acgaaacgMncatgacaacgagcaiwuuiacaawccgtagcettgaacatgtgcgtcgcactgta^^ ccataaacatgctttaccgtctegacatcgBatgecetgacteaatgccggtaaagcgtgtgcttgegtgggctcttatggggctgggcaaata igEBcaggcggaaasmgaatacaatt^attaacggctgacaacgacgtagaaa^^ gaaaggaaacacgcctgaagcaataaaccgartcaagaatHcatggcaaaccgtaaratccattcaccaaaaagggaacatgaaaiatect acgaattcgecaatgacaaagatttcttgtasgaaeatggaattaacgataccgatatccacctiatggcggatatcattgacggcgecacaga ataa (SEQ ID NO. 66)

Mediterranea massiliensis CAPM 7008

FIG00939702: hypotetický protein atgaaa.caaaaagcggttatt3t3ggtgg3ggatmggcggactgtttaccggtgcttttcttagtaaggaaggcgtggaagtgai'agtcctc gaaaaaaacaatgtcattggaggaggttfgcagtgttttaagcgtaacgggacatgtttcgaaaegggiatgcatatactgggtggctttcatc eEggtggcagtctgaatcgíaíttgtaccíatetgggtatcttggacaagetígsaatacggcatacggatgcggacgecatggaigccattttg tatggagaggfltggttcctgctatacttr.gcctaceggraaggatgcatttacgegttaccttea.gcagcagtttoctgcegacteagagggtat aaagcgctataiggatgcgatgtatgccttgtcrtatgaggtcgatgccttttatttgcgcagtag^a^itgggtttattttcacacagcgatgatt tcttcatgecggcc gatgagttcattgcacas.tatgf ttecgatc gtagattgcgcgaccrgttggcatatatgag we gatgtaigga^tBttg ctggteatBctcccgcttatgttcatgcgitgataaatgtattgtatataaacggttcsagccagttEgtagaiggaagccagcagctggeegBte ggttggcagaggttetcgaatcttgcggcggacatgtgattgccggtgatgcggtagagtctgtaasagtggtcgaccgggrtgwgaatcc. gtcatgaccaagagcaMaagcMtMgttggcgactggtBCBtcagcgatgtccafcctgctiicactttttgcgttgaegggegatgGGG CATTTCCCCGTATTTATgtgaatcggataaaagagnticccaacagctatteggcitttagigttiacataaagttcaagccg gagtiwtatccftatgtcaaceatccetgitatttccaggagaactaegaaacegttTGGAACCTGGGCGAGTATACegsi aga.cagttttccwaagggtttatgtt.tateactectectacccgcaatcagggcecgtgggcgaacegcatgaltBííMattgtgtcatgcct.tt cga.tgecgtt.cgtoagtgggaaeataegaccateggtcaccggggaaatgattatgtggagtggaaagaacgttt.ga.eaaa.caaggtgattg ctaaaaiggacatgcigaaaecgggattcagggatgccatigatgittectttgcttcctctccactgaecattcgcgattattatggagtaaagg aaggcagtttgtacggtcawggtgt.gattgEaaaaacatgctteagtcccagai.geceattgcgaceaaagHegcaacettttgettacaggt cagaatgtgaatctccaEggcatttgtggggttcctEtgac3gcga!Eg3B3cg.gctgaggcgattgttggecgtggagEaat3ttggataeg3 taaaiaatcBtaastaa (SEQ ID NO. 67)

Megamonas funiformis CAPM 7009

FIG01055114: hypotetický protein ttgaatactaaaaaaagtaaatfgagccagmtgtaaaaaaaEatatttatatttrtatEggrtctatBstcacagcggtagggtmgaaatatttttaa ttcctaataamtaattgatggtggtgtagiaggtatitctattatgctcagtgcataacaggacttccttttggtgcctttttgattttgataBBtttac cttttttata.ttiaggatataaacat.8taggtfiaagcttt.tgciatagcgacta.cttttgcigtaatatcfittgteattttggtctagcgtatttttacctgt attgcctgtaactaa.tgattatt.ttttagcagcagtttttggtggtattATTACAGGAACAGGTGTAGGtattataaÍtcgcaat ggtggttcttiggatggaa.ca.gaaatigtggcaafttigacggataagaaaacagtttttwtgttggcgaaatcgteatgtttataaaictatttatt ttaagtagtGCAAGTTTAGTITTTGGCTGggataaagctatgtattcattagEagcttattttgtcatcgctaaaatgattgBt gtagtttt3aaaggtti3gaggaaacctattcigiaatgaiagHacttcai»3catacagatatttt.aB3tcgrttgatgftggaaa^ tgtaaecgtaciteatggagaaggrggtiatacgaaagaaaaacgaaaaattttatattgtgtagiaactag'attagagat8gataaattaa.aaa ataíggttttagatatagatgaaggtgcatttgtaacrattaaicctgttagtgaíattgtaggtggaagatigagagtaaagaaaaakattaa (SEQ ID NO. 68)

- 12 CZ 36678 UI

Megamonas hypermegale CAPM 7010 sodíkový/glycinový symportér GlyP (Sodium/glycine symporter GlyP) atggajcttttatactctaattcaaacaattgacacgttcatctggggaccaccttigattatcctgctggttggcacggggattitcctcacctgcc gtctgcatttaaftcaagtattcaagetgccgctggctatgaagctgattttaacggccaaaaacaaaggctcgggtgafatcagcagctttaag gcactgtgccttgccatgtcggccactatcggtacgggtaatatcgtcggcgtcgctacggctaicgctgteggcggtcccggtgccat^ ggatgtgggtafcggcatttftcggtatggcgacaaaatacgccgaaggattactcgccatcaaattccgttccaaagacgaaatcggacaag ttgccggcggacctatgtattatatcgagctcggtcteggtaaaaaattcegtccgcttgctattaatttgccgtattcactattctcgta^^ cggtatcggtacatttgctcaggtaaatgctatcgttgacagtatgcaaatttccttcggtgtgcctatttacataaccgatattgttcttacactttta gtaggtatcatcatcttcggcgggctgaaaagcatcgcccecgccgctacggcaatcgttccgttcatggctgtgctgtatttcgttacctgctt cagtaticmttetccatateacggaaatcccggctgccatcatgctgattatcgacagcgctticaacggicatgcsgccc^^ caggctccaciatgatgatggctatgcagaacggtatcgcccgcggcgtattctgcaacgaateaggictcggctrtgcaccgattgccgct gctgccgctaaaacg.aactggccggcggaacaaggtcttatctecatgaccggtacttttatcgac.acattattcatctgcactatga£gggta caacactcatccigactggtgaatgggcgggaactcatgccggcgccgctatgacgaatgccgctticEigctacgactacggtacaatcgg c^tattatcctgacagtttcactcatíttATT CGCCTT CACGACAATT Ctcggctggaactattacggcgaac gtgcctg ccagtatctgttcggcattaaaggcatcgtaccgtaccgcatcateticactattctcgttgcttecggtgcttatcttgaacttcagtecatctgG GTTCTCGCCGATATCGTAAacggccteatggccatcOcgaaccttategctcttcteggtdgtecggcgtaategtagc cgaaacgaaaaagÉattĚcgaccateícaaaaacaaícagctttaa (SEQ ID NO. 69)

Megasphaera elsdenii CAPM 7011 glukarátový transportér (Glucarate transporter) atgggaaíttgcaatggaaagacaacaaaccgccgcggcagctacaccggcaaggacgaatttecgctggaaaaícgcctttcttatcrtttta. atcagcrttgtagcttacatggaccgcgtcaatitatccgtagcgacacctgteatcaigcaagaattcggitttacaaaaattgatatgggcttca. ttcagacgtgtttcttcgcaggctacgcactcatgcaggdcccggcggcaigctcgccgaaaagcigggcctgcgccgcaccggcgccct ggccattctctggtggtctatcttcacggctetgBcagcctttgccaaaggcaaggtcagcttcgccgccgtccgcctgctcttcggcBtggg cgaaggcccggicitcccggctttgggagcagcgaccttcagctggttcaatacccgtgaaaagggcaaggccagctcgtccatcctcatg ggcacctictteggccccgtcgtcggcccggccattaeggtcgcccteatggccgccatggg.ctggcatgccgtaticatcafcttcggcetc gteggcaicgtcctggcctgggtatggcacaaatacgeccacgataacccggcteacagcccctACGTCAAC’GAAGCCG AATACgctcatatcaccgaaggccgcgccgctgccagtgaaaagaaaagcgtcgccccgrggagcaaattcctccgctcgteccagt tcigggcegtcggCATTCAGTTCxYTGGTCGTCGactacateaígiacgtcttcciggccíggctgcccctgíacetgac ggaagÉgcacaacctgtccctgaaagctatgggcgtcígggcttctttcccgtggaícgccctcatggccatggtcttcgtcgccggctatattt ctgataaaatggccaacggcaaaaacagcgaacggcagtacaccatgcgtaccttcacggctatggccggcgtcgccgtcacctctatcg gcctgiacgtcgccgcacatacgccgagtgccgaaatgaacatcttciggatgaccgtctccctcggcgcaitaggcttctccatgagcgcc a.gcfgggccacggttatetccctgggcggcaaata£aecggctccgtatcgggctggatgaacctctggggcaacateggcggcgtccte geccccatcgtcacggcctacttcgtcaccaactacggctggaacgacg.ccttcaicgccacgtccctcttcggcatcgtagccategtcgc ctggatcttcgtcaaaecgggcaaggccctgacgccgaacgaataa (SEQ ID NO. 70)

Olsenella uli CAPM 7013 protein iniciace buněčného dělení DivIVA (Cell division initiation protein DivIVA) atggcaataacaccagcagacatcgagcagcagaccttctctccctccaagcacggctatgacaccgaggaggtegacgccttccrggag cagctctccgccgaggtggacgcgatgctccagaa.gaEcgcggacctcaagggccgcctga£etcca.ccgagcagcagctctccgccgc ccaggcgcagattgccagcctcgaggagcgcggctcctecacegccceggececegtcgccccggcgccggctcccgccacegactec atca.ccgcgtccgagcgtCAGATCTCCCAGG'TCCTCATcgtggcg£agcagtccgccgacaagctcctcgccgagg cgcgagactccgccgagcgcatccgcaatgacgccgacgcc-aaggcccgc^ggtcatccgtcaggcgctcgccgAGAAGCA GAACGAGCTCGACgagatcgaccgtctgaaggccteccgcgaggacttccgcgccgagtacaagaagctcctgcagcactt catggacgatgccgaggccatgttcccggcgcaggictcctteteoagcgcccceaccggctcegccggcaccaccca.ca.ccgacgtcc cgaccgecgctcccacgcccgtggctcccgccccggcgc.cggcegtcaacgícg<:cgactttggiga.cctegactag (SEQ ID NO. 71)

- 13 CZ 36678 UI

Parasutterella secunda CAPM 7014 fosfopantetein adenylyltransferáza (Phosphopantetheine adenylyltransferase) (EC 2.7.7.3) atgacasítgccatttatgcaggtacgtitgatccctttacccítggaca.cgaagatgtgcttgatcgtgcccgtcaaaícttcgatgaagtcattg tggcagtcgctgctgatactggaagHaataccttcttttcttttgaagaaagagtcgacttagcccgccgatctttagcgggtatcgaaggcgte aga,gicgttggaittgaaggcttgttgagtgaatttgteaaagcaaccggtgcttcagtccttatccgcggtgt.tegaaacGGAAGCGA TTTCGACTACGAgacgcgcatggcctgtgtcaatcatgcattaaacagtaatgttcaaacaatatttttcccgcctattAACGG CACTCAGTCTATTTCCggctcattagtcagagaaatteatcgtctgggcggcgatgtttccgcitttgteagccccattgittcg caageactggaagccaagcgtttaggagccaatcaatga (SEQ ID NO. 72)

Phascolarctobacterium faecium CAPM 7015

ABC transportér, protein vážící substrát (klastr 1, maltózy/g3p/polyamin/železo) (ABC transporter, substrate-binding protein (cluster 1, maltose/g3p/polyamine/iron)) atgaaaaaagcaaaatggctctgtact.gctgcggcagtictggcattatcggctgcagttgca.ggctgcggcggcag<;gataagcaggaag ccggcactaaagcaggcgg3ccgaaaggcgaggtaatggtatatacctccatttatcctgatattettga.iaatgtttgcaaaccggcaatga gcaaagttttccctgacatgaaagttgactggticcagggcggtaccgasaaagttatgaccaaaatggcaggcgaaateaagctsaaaaa ateggtgccgatgttttaatggttgccgaaccticttactaixtgteccttaaaaaagacaaccttcttttggattatgittecccgaacctgaagg acgttattaccgataaggacgaaaaaggcgcatggtcttccgttcgtatcagcaacatgattatcgcttataactccgacaagctttctccggaa gaa.gclccgaaatectggaaagatttgactgacc.cgaaatggaaaggcaaaattgcaatgcetaacccgatgctttccggtactgcaittgttg cagttggcgcacttgccgataaatacggctgggaatatttcgaccagctgaaagctea.cggcatgcgtgttgaagaaggcaactccgcaatt caaaacaaacttttaaccggcgaatatgcagcagcaatgattctgg.aagaaaacatcctgaaactggctgctaccaaaaacgagcc^:tttg.a3 agttgtataicctgaagacggcgiagttaitattecticaccgattgctaitttcaatactaccaaaaacccggatggtgctaaagccATGGT TGACTGGTGGCTTTCcaaagaaggccagcaggctgttgttgaii ggctgga tgcactecgtacgcggcgatgtacagcctc ctaaaggcgctcc-ggaactgaaatocttetctgacaaagctgtaaaagttgattggcagaAACTTGCCGACAACAAAGC Tgaaattaaggaagagttecgcgtaagggtfatggaataa (SEQ ID NO. 73)

Succinatimonas hippei CAPM 7016 protein sekrece vnitřní membrány typu III (Type III secretion inner membrane protein) (YscT,HrcT,SpaR,EscT,EpaRl,homologní ke komponentám flagelámího exportu) atgaatgcadgcttgaittatttagiacagatgccttttetcttcacttateagcaEttettttaggttctattcgiateggcgtctttattgccaty^ ctttttteggaecteaggtttcagttgecgttaaaaigccgataaccgttgctttgtatattecgctgcacccgtttatgcteaetatcattgagccttt gtctttttctgccgttggagatttetttggctttattatcattgtgttaaaagaaattettataggaatiattttígcctggctatgttcgttgattttttacgt cgcgttgtctgctggcgtgattatcgataaccagcgcggtgcctcaatggcacaaagtgccgatattttatcaggggcggaatcgtctcctttg ggctcagnttatttcttgcgaiggteactttgtttttegcgtccggagcgtttttagcgtttttaaatattítttaíacgactÉttatagcatggcctccc actgaaítetTACCGGCGTTGTTGTCTTCAaataccgcaattttttcagcgcaaagtctteatíggatgatggaacaaaca gtgctggtgtgigctccttttaútřggtagctttgttatgcgatategctttaggtcttaTCAATCGTTTTGCACCGCAGctta atgtctttattttgtcaatgccgattaaaagc^gtttgtgcctttttaattattttttatttgtegccgtttttggat^ catgcaggaaagttttagcgttcttaaícagatttteggcagatag (SEQ ID NO. 74)

- 14 CZ 36678 UI

Sutterella massiliensis CAPM 7017 flavinová podjednotka flavocytochromu c (Flavocytochrome c flavin subunit) atgaagcaaaagaacttttctgcctatgcagcagaactcgcc.agacgacgcatactgcgttcgggcgcttgggcgggactcgggcicgctg cgggcggtctttegagggeatacgctteagcggatgcggaagatgccgactttctgeagagcgaaggcacgggacatcc-tgttcgcgttga cgccgagc agcgcgaggactgggacgtcgttgtgatcggttcgggagcggcggggctegccgccgcgcttgaagc gc gccgcgcggg ggcgcgcgicgtcattctcgaaaagatgggcagcatcggcggcaatteggtgatttccgaaggactggtgggcgtgccgggtacgcccat gcaggctgcgctcggcattcacgaitegcctgaactctttgcggcggaccttttggctgcgggctacgteaaccatecgggcaaggtgcgg gtgctcgctcaaaaggcgcttgaaacgttegagíggacgcgcgacgaattgggcgttcgctggtggga.ggaí:c£cctcgagtatgagctc ggccagagcgtgcgacgaacggccgttatccgcgaagccaagggcggcggcctcgtttatccgcÉgtacgaacgcgcacgggcgctcg gcgtegtgatccggctgcgtacgaaggcgcteeacctecttgaggctgagegactcggígagcggcgcgttgcggccgtactegccgaag acgcctcgagcggcacgagaatcgtttttcacgccagg.cgcggtgtcgtgctcgcttecgggggcttttcgagcgae.aíagaa.ctgcggca aatgcagaactggcgcttgtccgcgcgtgtcggtaccgcgacgcagccgggctccacgggcgaaatgctgcgcgaagcagcccgcatc ggcgcgtggctgctgcatctcgaatacatccactgcattccggacgcgagtcccgatgaaaagggctggggcacaacctgg.a3aitcagc cgctadgtgcggcca.cgcaggg£atctgggoggtgcgccagacgggacaacgcttcgicAATGAAACGGGCGGCAA CgtcgacaagacaaacgcgatcttcgattigcttaacgccggactggagcccgtagccatttcggatgcgcgtgccgtacggcATCC GCAGTCGGTGATTTTCGgcacga.gc.gacgttgaggcgetcgttgcgcgcgggttcgtgagccgctaiccgac.gctcga agcgcttgccgaaggacgccgcattccgcttgcggcacttcaagcaaccgttgcgcgctacaacgacgccttgcgaagcgggcgcgagc gcgacgagatgggccggcgcatetcgcccattgccgaacccatggaagaggggccctggttcgcgagtccgatgcttgccaaggtcctca tgtgcagcggcggcatcgcggcggacgactgtgcgcgggtgctctccgtcgtggacgatcggccgattccggggctetatgcggcgggc gaagttacgggcggcctgcacgggattgcsttcstgggcteggcgggccttttggatscgctcgttiteggacgcattgccggacaaiatgc ggcgaagtetctttag (SEQ ID NO. 75)

Příklad 2: Příprava probíotické směsí

Jednotlivé čisté kultury výše uvedených izolátů se skladují v BHI médiu s 10% glycerolem při -70 °C. Při pomnožení se jednotlivé kultury vysely na WCHA agar a kultivovaly se 48 hodin při 37 °C v anaerobní atmosféře. Poté se jednotlivé kultury samostatně resuspendovaly v 5 ml BHI média s 10% glycerolem do ODeoonm = 1, což odpovídá 1 x 10⁹ CFU/ml. Následně se pětimililitrové objemy všech 25 baktérií smíchaly a rozplnily do jednomililitrových master inokulí. V případě přípravy probíotické směsi se 1 ml master inokula použilo k zaočkování 3 litrů kultivační půdy ainkubovalo se anaerobně v médiu bez živočišných proteinů (Pepton ze sójových bobů (enzymatický digestát), kyselý hydrolyzát sójového proteinu, kvasnicový extrakt) při 37 °C po dobu 48 hodin. Výsledná koncentrace baktérií ve směsném fermentátu dosahuje hodnot 1 x 10⁹ CFU/ml a složení jednotlivých baktérií se stanovilo sekvenováním části genu pro 16S rRNA (Tab. 1). Po fermentaci byl bakteriální nárůst poletován centrifugací při 5000 x g po dobu 20 min, a získaný pelet byl v anaerobním boxu resuspendován v 30 ml BHI média s 10 % glycerolu. Tento objem obsahoval dostatečné množství probiotických baktérií pro ošetření 30 000 kuřat.

-15 CZ 36678 UI

Tabulka 1. Procentuální zastoupení baktérií probiotické směsi po společné fermentaci. Pro průmyslovou fermentaci je důležité, aby baktérie ve směsi měly podobnou růstovou rychlost. Kombinace vybraných baktérií tuto podmínku splnila. Baktérie byly ve směsi zamrazeny jako master inokula při -70 °C. Jednotlivá master inokula byla použita pro zaočkování živného média 5 a po 48 hodinové fermentaci byly stanoveny poměry jednotlivých baktérií pomocí kvantitativní real time PCR. Vybrané baktérie rostou podobnou rychlostí a lze je s výhodou kultivovat současně. Experiment byl zopakován 2x nezávisle.

Baktérie	Inokulum 1	Inokulum 2
Bacteroides bamesiae CAPM6693	0,39	0,75
Bacteroides caecicola CAPM6694	7,02	5,86
Bacteroides caecigallinarum CAPM6695	1,80	18,28
Bacteroides gallinaceum CAPM6696	0,007	1,46
Metaprevotella sp. CAPM7012	1,63	6,21
Bacteroides mediterraneensis CAPM6697	2,68	3,85
Bacteroides plebeius CAPM6698	7,89	3,16
Bamesiella viscericola CAPM6699	0,18	5,36
Bifidobacterium saeculare CAPM7000	0,22	0,78
Cloacibacillus porcorum CAPM7001	0,10	7,49
Desulfovibrio piger CAPM7002	2,78	5,59
Limosilactobacillus ingluviei CAPM7004	7,59	1,90
Limosilactobacillus reuteri CAPM7005	6,83	1,29
Ligilactobacillus salivarius CAPM7003	21,54	0,57
Marseilla massiliensis CAPM7006	0,14	1,96
Prevotella oris CAPM7007	0,31	1,34
Mediterranea massiliensis CAPM7008	<0,005	1,63
Megamonas fůniformis CAPM7009	<0,005	2,81
Megamonas hypermegale CAPM7010	2,68	2,92
Megasphaera elsdenii CAPM7011	8,71	0,91
Olsenellauli CAPM7013	<0,005	0,83
Parasutterella secunda CAPM7014	0,01	0,48
Phascolarctobacterium faecium CAPM7015	0,007	4,88
Succinatimonas hippei CAPM7016	1,49	3,91
Sutterella massiliensis CAPM7017	24,67	2,56

Příklad 3: Schopnost baktérií z probiotické směsi osídlovat slepé střevo drůbeže po jednorázové orální aplikaci

Kuřata byla první den života orálně inokulována 0,1 ml probiotické směsi a týden po osídlení se 15 stanovilo zastoupení probiotických kultur ve slepém střevě kuřat sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PLoS One 2014;9:ell5142). (Tab. 2). Experiment byl proveden 2x s využitím inokula 1 a 2 z tabulky 1.

-16 CZ 36678 UI

Tabulka 2. Procentuální zastoupení baktérií probiotické směsi ve slepém střevě sedmičlenních kuřat po osídlení jednodenních kuřat. Probiotická směs úspěšně osídlovala kuřata v obou nezávislých experimentech a tvořila více než 80 % z celkové mikroflóry slepého střeva kuřat.

Baktérie____________________________________Experiment 1 Experiment 2

Bacteroides bamesiae CAPM6693	0,09	0
Bacteroides caecicola CAPM6694	29,82	11,09
Bacteroides caecigallinarum CAPM6695	13,56	14,53
Bacteroides gallinaceum CAPM6696	0	4,10
Metaprevotella sp. CAPM7012	4,75	0
Bacteroides mediterraneensis CAPM6697	9,52	1,88
Bacteroides plebeius CAPM6698	9,37	0
Bamesiella viscericola CAPM6699	4,68	14,18
Bifidobacterium saeculare CAPM7000	1,31	0,78
Cloacibacillus porcorum CAPM7001	0	0
Desulfovibrio piger CAPM7002	0,20	0,87
Limosilactobacillus ingluviei CAPM7004	0,05	0,09
Limosilactobacillus reuteri CAPM7005	0,10	0,03
Ligilactobacillus salivarius CAPM7003	0,22	0,36
Marseilla massiliensis CAPM7006	0,16	1,71
Prevotella oris CAPM7007	3,26	0
Mediterranea massiliensis CAPM7008	0	0
Megamonas fúniformis CAPM7009	0	0,06
Megamonas hypermegale CAPM7010	7,20	19,89
Megasphaera elsdenii CAPM7011	1,72	4,99
Olsenellauli CAPM7013	0	0,01
Parasutterella secunda CAPM7014	0,02	5,79
Phascolarctobacterium faecium CAPM7015	1,67	0,53
Succinatimonas hippei CAPM7016	1,56	4,23
Sutterella massiliensis CAPM7017	4,578	0
Suma celkem	93,93	85,21

Příklad 4: Schopnost probiotické směsi 7 dní po podání zvyšovat odolnost kuřat před experimentální infekcí Salmonella Enteritidis

Probiotická směs byla orálně podána 20 jednodenním kuřatům linie ISA Brown. Dalších 20 kuřat v kontrolní skupině nebylo probiotickou směsí ošetřeno. O týden později, tedy ve věku 8 dní, bylo 10 kontrolních kuřat neosídlených probiotickou směsí a 10 kuřat osídlených probiotickou směsí orálně inokulováno divokým kmenem Salmonella Enteritidis (10⁷ CFU v 0,1 ml). V kontrolní i probiotické skupině tedy zůstalo 10 kuřat, která nebyla infikována Salmonella Enteritidis a u kterých infekce probíhala přirozenou cestou díky kontaktu s infikovanými „seeder“ kuřaty. Kuřata byla utrácena 4 a 14 dní po čelenži, vždy 5 inokulovaných „seeder“ kuřat a 5 kontaktních kuřat. Počty salmonel byly stanoveny kultivačně po desítkovém ředění obsahu slepých střev ve sterilním fyziologickém roztoku a výsevu na XLD agar. Osídlení kuřat probiotickou směsí snižovalo počty salmonel ve slepém střevě 4 dny po infekci ve skupině kuřat infikovaných kontaktem (Obr. 1).

- 17 CZ 36678 UI

Příklad 5: Schopnost probiotické směsí zvyšovat odolnost kuřat před experimentální infekcí Salmonella Enteritidis 24 hodin po podání

Probiotická směs byla orálně podána 18 jednodenním kuřatům linie ISA Brown. Dalších 18 kuřat v kontrolní skupině nebylo probiotickou směsí ošetřeno. Hned 24 hodin později byla všechna kuřata v probiotické i kontrolní skupině orálně inokulována divokým kmenem Salmonella Enteritidis (10⁷ CFU v 0,1 ml). Kuřata byla utrácena 4, 14 a 18 dní po inokulaci salmonelou, vždy 6 kuřat z každé skupiny. Počty salmonel byly stanoveny kultivačně po desítkovém ředění obsahu slepých střev a homogenátu jater ve sterilním fýziologickém roztoku a výsevu na XLD agar. Osídlení kuřat probiotickou směsí snižovalo počty salmonel ve slepém střevě a játrech 4 dny po infekci (Obr. 2).

Příklad 6: Snížení zastoupení E. coli a Clostridium perfringens v mikroflóře slepého střeva

Jednodenní kuřata linie ISA Brown byla první den života orálně inokulována 0,1 ml probiotické směsi. Kuřata byla utracena ve věku 8 dní a bylo stanoveno složení bakteriální mikroflóry ve slepém střevě sekvenováním V3 a V4 variabilní oblasti genu pro 16S rRNA (Vídenská et al., Succession and replacement of bacterial populations in the caecum of egg laying hens over their whole life. PLoS One 2014;9:ell5142). S využitím znalosti sekvence genů pro 16S rRNA jsme byli schopni stanovit zastoupení E. coli a Clostridium perfringens ve vyšetřených vzorcích. Zatímco u kontrolních kuřat ve věku 8 dní tvořila E. coli 27 a 30 % z celkové mikroflóry, u kuřat osídlených probiotickou směsí tvořila E. coli pouze 1 až 2 % z celkové mikroflóry (Obr. 3). Clostridium perfringens se ve slepém střevě probiotických kuřat vůbec nevyskytovalo, zatímco u kontrolních tvořilo v průměru 0,1 % z celkové mikroflóry. Aplikace probiotické směsi tedy snižovala procentuální zastoupení E. coli a Clostridium perfringens ve střevní mikroflóře ošetřených kuřat.

Závěry

Probiotická směs účinně osídluje slepé střevo kuřat od prvního dne života a po jednorázové administraci. Probiotická směs nemá žádné negativní účinky, po jejím podání nebyly zaznamenány žádné úhyny. Probiotická směs naopak chrání kuřata před infekcí baktérií Salmonella Enteritidis a snižuje počty E. coli nebo Clostridiumperfringens ve střevní mikroflóře. Proto se dá s výhodou použít jako probiotický preparát u kuřat.

Claims (7)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   1. Probiotický přípravek pro drůbež, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides gallinaceum, Metaprevotella sp., Bacteroides plebeius, Bacteroides barnesiae, Bacteroides caecicola, Bacteroides caecigallinarum, Bacteroides mediterraneensis, Barnesiella viscericola, Bifidobacterium saeculare, Cloacibacillus porcorum, Desulfovibrio piger, Limosilactobacillus ingluviei, Limosilactobacillus reuteri, Ligilactobacillus salivarius, Marseilla massiliensis, Prevotella oris , Mediterranea massiliensis, Megamonas funiformis, Megamonas hypermegale, Megasphaera elsdenii, Olsenella uli, Parasutterella secunda, Phascolarctobacterium faecium, Succinatimonas hippei a Suite re lla massiliensis.
2. 2. Probiotický přípravek pro drůbež podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku směs bakterií Bacteroides gallinaceum CAPM 6696, Metaprevotella sp. CAPM 7012, Bacteroides plebeius CAPM 6698, Bacteroides barnesiae CAPM 6693, Bacteroides caecicola CAPM6694, Bacteroides caecigallinarum CAPM6695, Bacteroides mediterraneensis CAPM6697, Barnesiella viscericola CAPM 6699, Bifidobacterium saeculare CAPM 7000, Cloacibacillus porcorum CAPM 7001, Desulfovibrio piger CAPM 7002, Limosilactobacillus ingluviei CAPM 7004, Limosilactobacillus reuteri CAPM 7005, Ligilactobacillus salivarius CAPM 7003, Marseilla massiliensis CAPM 7006, Prevotella oris CAPM 7007, Mediterranea massiliensis CAPM 7008, Megamonas funiformis CAPM 7009, Megamonas hypermegale CAPM 7010, Megasphaera elsdenii CAPM 7011, Olsenella uli CAPM 7013, Parasutterella secunda CAPM 7014, Phascolarctobacterium faecium CAPM 7015, Succinatimonas hippei CAPM 7016 a Sutterella massiliensis CAPM 7017.
3. 3. Probiotický přípravek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále obsahuje kapalný nosič na bázi vody, s výhodou vybraný ze skupiny voda, fyziologický roztok nebo růstové médium pro baktérie sestávající z peptonu ze sójových bobů, kyselého hydrolyzátu sójových proteinů a kvasnicového extraktu a produktů fermentace baktérií probiotické směsi.
4. 4. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 10⁷ CFU, s výhodou 10⁷až 10⁹ CFU, každé baktérie v jednom mililitru přípravku.
5. 5. Krmivo pro drůbež, vyznačující se tím, že obsahuje probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
6. 6. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 či krmivo podle nároku 5 pro použití pro léčebné či preventivní zlepšení fýziologických vlastností střevního traktu drůbeže.
7. 7. Probiotický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 či krmivo podle nároku 5 pro použití pro prevenci infekcí trávicího traktu drůbeže patogeny vybranými ze skupiny E. coli, Salmonella a Clostridium perfringens.