HUT52701A - Process for producing vaccine of bordetella pertussis - Google Patents
Process for producing vaccine of bordetella pertussis Download PDFInfo
- Publication number
- HUT52701A HUT52701A HU893683A HU368389A HUT52701A HU T52701 A HUT52701 A HU T52701A HU 893683 A HU893683 A HU 893683A HU 368389 A HU368389 A HU 368389A HU T52701 A HUT52701 A HU T52701A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- coding sequence
- pertussis toxin
- amino acid
- subunit
- pertussis
- Prior art date
Links
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 title claims abstract description 117
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 150
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 99
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 51
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 41
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 92
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 73
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 53
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 39
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 22
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 20
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 16
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 13
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 10
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 claims description 3
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 2
- RIAKPZVSNBBNRE-BJDJZHNGSA-N Ser-Ile-Leu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RIAKPZVSNBBNRE-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims description 2
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 claims description 2
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- QFEYTTHKPSOFLV-OSUNSFLBSA-N Thr-Met-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N QFEYTTHKPSOFLV-OSUNSFLBSA-N 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- KFDPCYZHENQOBV-UHFFFAOYSA-N 2-(bromomethyl)-4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1CBr KFDPCYZHENQOBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 6
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 6
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108010000193 NAD+ Nucleosidase Proteins 0.000 description 5
- 102000002250 NAD+ Nucleosidase Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 4
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 4
- 241001406043 Bordetella pertussis Tohama I Species 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 3
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N isopropyl beta-D-galactopyranoside Chemical compound CC(C)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UOEFDXYUEPHESS-QMGXLNLGSA-N 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- -1 sulfenyl halides Chemical class 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- GPXDNWQSQHFKRB-UHFFFAOYSA-N (2,4-dinitrophenyl) thiohypochlorite Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(SCl)C([N+]([O-])=O)=C1 GPXDNWQSQHFKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTNKNFHIAFDCSJ-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) thiohypochlorite Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1SCl NTNKNFHIAFDCSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- HWROAFGWPQUPTE-OSUNSFLBSA-N Met-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N HWROAFGWPQUPTE-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241001135910 Phage M13mp18 Species 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N Thr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O APIDTRXFGYOLLH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- XLEUIPVVUKAVGL-UHFFFAOYSA-N [2-(chloromethyl)-4-nitrophenyl] acetate Chemical compound CC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1CCl XLEUIPVVUKAVGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás bordetella pertussis vakcina előállítására. Közelebbről, a találmány szamárköhögés elleni védővakcina előállítására vonatkozik, amely olyan B. pertussis toxint kódoló szekvencia által kódolt proteint tartalmaz, amely teljes vagy csonkított B. Pertussis toxin SÍ egység aminosavat kódoló szekvenciát tartalmaz, amely a 26-os helyzetben levő
67331-3072-GI-tm tiptofán maradék módosítását tartalmazza.
A szamárköhögés vagy pertussis erősen fertőző betegség, amely elsősorban a gyermekeket érinti. Légzési nehézségek mellett a szamárköhögés idegi károsodást és nagy halálozást okozhat, különösen olyan gyermekek között, akik rossz szociális körülmények között élnek, valamint olyan újszülöttek között, akik nem rendelkeznek anyai pertussis ellenes antitestekkel. A pertussis kórokozója a Bordetella pertussis nevű Gram-negativ coccobacillus. A baktérium a légzési traktusba kerül, és ott toxikus állapotot indukál,' ami a baktérium eltűnése után is megmarad.
így tehát folyamatosan szükség van B. pertussis által okozott fertőzések elleni biztonságos és hatásos vakcinára.
A találmány kiterjed olyan B. pertussis toxin kódoló szekvencia előállítására, amely a teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosavkódoló szekvenciáját tartalmazza, ahol az SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav-helyzetben levő triptofán maradék (a továbbiakban Trp-26) módosítását tartalmazza, és a Trp-26 módosítás azt eredményezi, hogy a B. pertussis toxinkódoló szekvencia által kódolt protein lényegében véve inaktivált SÍ enzimaktivitással rendelkezik, azonban megtartja azt a tulajdonságát, hogy az anti-pertussis toxin antitestek által felismerhető. A találmány kiterjed továbbá az olyan rekombináns DNS molekulák előállítására is, amelyek ezt a kódoló szekvenciát tartalmazzák.
A találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns DNS plazmid előállítására, amelyek az előbb említett szekvenciát tartalmazzák. Ezek a plazmidok az említett kódoló szekvenciát előnyösen egy alkalmas expressziós kontroll szekvenciával operatív kapcsolatban tartalmazzák. Az alkalmas expressziós kontroll szekvencia kifejezés alatt olyan szekvenciákat értünk, amelyek szükségesek a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia kifejeződéséhez egy alkalmas gazdasejtben, amelybe az említett plazmidot transzformáltuk. Ilyen expressziós kontrollt szekvenciák a technika állása szerint ismertek.
A találmány tárgya továbbá eljárás transzformált gazdasejtek előállítására, amelynek során a kívánt gazdasejtet a találmány szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformáljuk.
Az ilyen transzformált gazdasejtek alkalmas tenyészközegen képesek növekedni és a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvenciát kifejezni.
A találmány tárgya továbbá eljárás az említett protein előállítására, amelynek során a találmány szerinti eljárással transzformált gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan vakcina előállítására, amely szamárköhögés elleni védelmet stimulál, a vakcina a találmány szerinti eljárással előállított protein immunprotektiv és nem-toxikus mennyiségét tartalmazza. A vakcina a proteint tartalmazhatja önmagában vagy más antigénekkel és/vagy adjuvánsokkal együtt. Az immunprotektiv mennyiség a találmány szerinti eljárással előállított protein azon mennyiségét jelenti, amely pertussis ellen védelmet biztosító immunválaszt képes kiváltani emberben, miután az említett protein említett mennyiségét adagoltuk .
A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint Bordetella pertussis toxin aminosavkódoló szekvencia által kódolt proteint állítunk elő, amely szekvencia teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosavkódoló szekvenciát tartalmaz, ahol az SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradék (továbbiakban Trp-26) módosítását tartalmazza, és a Trp-26 módosítás azt eredményezi, hogy a B. pertussis toxin operon aminosav kódoló szekvencia által kódolt protein SÍ enzim aktivitása lényegében véve inaktiválódott, azonban a protein megtartotta azt a tulajdonságát, hogy az anti-pertussis toxin antitestek felismerik. Az eljárás során (i) Bordetella pertussis toxin aminosavkódoló szekvenciát, amelyet B. pertussis DNS-ből izoláltunk vagy szintetikus vagy rekombináns DNS technikával állítottunk elő, és amely a teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosavkódoló szekvenciát tartalmazza, az SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben triptofán maradék módosításait még nem tartalmazza, helyre irányuló mutagenezissel, triptofánmódositó kémiai reagenssel vagy fotooxidációs utón kezelünk, igy a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradék módosítását vagy törlését érjük el, egy kívánt gazdasejtet olyan plazmiddal transzformálunk, amely a kapott kódoló szekvenciát tartalmazza, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegben tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk, vagy (ii) teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmazó, natív B. pertussis DNS-ből izolálással vagy szintetikus vagy rekombináns DNS technikával előállított Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia SÍ alegysége 26-os helyzetében levő triptofánt töröljük vagy helyettesítjük egy másik aminosavval, egy, a kapott kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal egy gazdasejtet transzformálunk, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk, vagy (iii) szintetikus utón állítunk elő
- 5 ilyen kódoló szekvenciát, és a kívánt gazdasejtet egy, az ilyen kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal transzformáljuk, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk. A találmány kiterjed az ilyen eljárással előállított proteinre, szamárköhögés ellen védelmet kialakító vakcinára, amely az említett protein immunprotektiv és nem-toxikus mennyiségét tartalmazza, továbbá emberek szamárköhögés elleni kezelésére.
A találmány szerinti eljárással egy olyan B. pertussis törzset állítunk elő, amelyben a kromoszomális pertussis toxin gént inaktiváltuk, és a törzs a találmány szerinti rekombináns DNS molekulát tartalmazza. A találmány szerinti eljárással olyan teljes sejt vakcinát állítunk elő, amely szamárköhögés elleni védelmet hoz létre, és amely vakcina a találmány szerinti eljárással előállított törzs immunprotektiv és nem-toxikus mennyiségét tartalmazza. A vakcina az ilyen törzset tartalmazhatja önmagában vagy más antigénekkel és/vagy adjuvánsokkal együtt.
A találmány alapja az a felismerés, hogy a pertussis toxin kódoló szekvencia SÍ alegysége 26-os helyzetében levő aminosav maradék, amely a természetben triptofán, módosítása jelentősen csökkenti a pertussis toxin toxicitását, mig megmarad azon képessége, hogy védő immunogén választ vált ki.
A pertussis toxin a B. pertussis egy protein exotoxinja, amely jelentős szerepet játszik a szamárköhögés patogenezisében, és amelyről feltételezik, hogy a B. pertussis fő védő antigénje. / A.A. Weiss és munkatársai: Ann. Rév. Microbiol., 40:661 ( 1986_)_/. A pertussis toxin egy hexamer protein, amely 5 különböző alegységből áll, amelyeket S1-S5 jellel jelölünk, emelkedő molekulatömegüknek megfelelően /_ M. Tamura és munkatársai: Biochem.
- 6 21:5516 ( 19822/· A pertussis toxin. szerkezete egy A-B modellel jellemezhető, amelyben a B-oligomer (S2-S5 alegységek) felelős a toxin kötődéséért a célsejt membránján található receptorokhoz, és az A-protomer (SÍ alegység) tartalmazza az enzimaktivitást .
Úgy találtuk, hogy ha a találmány szerinti eljárás értelmében az SÍ alegységben található Trp-26-t módosítjuk, a kódoló szekvencia olyan proteint kódol, amely lényegében véve inaktivált SÍ alegység enzimaktivitással rendelkezik. A normál SÍ alegység enzimaktivitás hozzájárul a különböző B. pertussis vakcinák toxicitásához, amelyek pertussis toxint vagy SÍ alegység proteint tartalmaznak. Az ilyen enzimaktivitás a NAD-glikohidrolizis vagy NAD-riboziltranszfer. A találmány szerinti eljárással előállított vakcina tehát nem mutat ilyen toxicitási problémákat. Emellett az SÍ alegység enzimaktivitásának ilyen inaktiválása azért lehetővé teszi, hogy a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvenciából levezetett protein megtartsa azt a tulajdonságát, hogy az anti-pertusiss toxin antitestek felismerik.
A találmány szerinti eljárással tehát előállítunk egy B. pertussis toxin aminosav kódoló szekvenciát, amely teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz, ahol (a) az SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradék (a továbbiakban Trp-26) módosítását tartalmazza, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve inaktivált SÍ alegység enzimaktivitást eredményez a proteinben, amelyet a B. pertussis toxin kódoló szekvencia kódolt, de a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy
- Ί az anti-pertussis toxin antitestek felismerik. A találmány szerinti eljárással előállítunk továbbá egy rekombináns DNS molekulát, amely a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvenciát tartalmazza a találmány szerinti eljárással előállított B. pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia mellett, a találmány szerinti eljárással előállított rekombináns DNS molekula tartalmazhat további LiHS szekvenciákat, például regulátor elemeket, egy vagy több szelekciós markért és replikációs és fenntartási funkciókat.
Az B. pertussis toxin kódoló szekvencia kifejezésen a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia leírásakor a teljes B. pertussis toxin operont vagy annak bármely funkcionálisan csonkított fragmensét értjük, amely tartalmazza a teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát, ahol (a) az SÍ alegység kódoló szekvencia a Trp-26-ban módosítást tartalmaz, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve inaktivált SÍ alegység enzimaktivitást eredményez a proteinben, amelyet a B. pertussis toxin kódoló szekvencia kódolt, de a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy az antipertussis toxin antitestek felismerik. Az B. pertussis toxin kódoló szekvencia kifejezésen a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia leírásakor bármely olyan funkcionális fúziós protein kódoló szekvenciát is értünk, amely (i) a teljes B. pertussis toxin kódoló szekvenciát vagy annak bármely funkcionálisan csonkított fragmensét tartalmazza, amely utóbbi teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység kódoló szekvenciát tartalmaz, tartalmaz továbbá (ii) bármely más protein kódoló szekvenciát, ahol (a) az SÍ alegység kódoló szekvencia a Trp-26-ban módosítást tartalmaz, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve á * · · » · β ··. * · ·
- 8 inaktivált SÍ alegység enzimaktivitást eredméyez a proteinben, amelyet a B. pertussis toxin kódoló szekvencia kódolt, de a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy az anti-pertussis toxin antitestek felismerik. A funkcionális kifejezésen bármely olyan B. pertussis toxin kódoló szekvenciát értünk, amely olyan proteint kódol, amely vagy eléggé felismerhető az anti-pertussis toxin antitestek által ahhoz, hogy alkalmas legyen B. pertussis diagnosztikai vizsgálatához, és/vagy kellően védő immunválaszt vált ki pertussis ellen, amikor embernek ilyen protein immunprotektiv mennyiségét adagoljuk.
A találmány szerinti eljárással előállított B. pertussis toxin kódoló szekvencia előnyösen a B. pertussis toxin operonnak egy csonkított változata, amely csak a B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát vagy annak egy csonkított részét tartalmazza. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az előállított B. pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia tartalmazza a teljes B. pertussis operont vagy annak bármely alegysége kódoló szekvenciáját önmagában, vagy egy vagy több más alegységgel együtt. A találmány szerinti eljárás egy további előnyös megvalósítási módja szerint az előállított kódoló szekvencia egy olyan szekvencia, amely az SÍ alegység kódoló szekvencia 129-es aminosav helyzetében a glutaminsav módosítását tartalmazza.
A teljes pertussis toxin operon nukleotid kódoló szekvenciáját meghatározták, lásd például 843 727 sz. amerikai egysült államokbeli szabadalmi leírást. Ezenkívül a pertussis toxin kódoló szekvenciát tartalmazó DNS izolálható bármely hozzáférhető B. pertussis törzsből. Különböző B. pertussis törzsek hozzáférhetők például az American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, Amerikai Egyesült Államok intézetnél. Az izolálás elvégezhető például az említett 843 727 számú amerikai egysült államokbeli szabadalmi leírásban Keith és munkatársai által javasolt módszerrel vagy bármely más szokásos módszerrel.
A kódoló szekvencia SÍ alegység részének Trp-26 maradéka a találmány értelmében különféleképpen módosítható ismert módszerek alkalmazásával.
Ilyen módszer például a Trp-26 maradék módosítására triptofán (Trp) módosító kémiai reagens, például 2-hidroxi-5-nitrobenzilbromid (HNBB) alkalmazása. A találmány szerinti eljárás egy megvalósítási módja szerint a pertussis toxin és egy alegysége NAD-glikohidroláz és ADP-riboziltranszferáz aktivitásainak katalitikus környezetét, például az SÍ alegység 2-187 aminosavmaradékait tisztítottuk E. coli törzsből, amely kifejezi ennek a katalitikus környezetnek a kódoló génjét. Ezt a tisztított polipeptidet triptofánmódositó reagenssel (HNBB) kezeltük, igy a Trp-26 maradék módosítását értük el. Amikor a HNBB kezelés után nyert polipeptidet SÍ enzimaktivitásra nézve megvizsgáltuk, megállapítottuk, hogy nincs ilyen aktivitása, azaz mind a NAD-glikohidroláz mind a ADP-riboziltranszferáz aktivitás törlődött, a standard vizsgálati módszerekkel végzett mérések szerint.
A Trp-26 módosítására alkalmazható triptofán módosító kémiai reagensek továbbá például (nem korlátozó jelleggel) N-bróm-szukcinimid (Spande, T.F. és Withop, B. 1967, Meth. Enzymol., 11:522), hidrogén-peroxid,perwhangyasav szulfenil-halogenidek (Seolfone, E., Fontana, A. és Roccki, R., 1968, Biochemistry, 7_:971), 2-nitro-f enil-szulf enil-klorid , 2,4-dinitro-f enil-szulfenil-klorid és 2-acetoxi-5-nitrobenzil-klorid.
Az SÍ alegység Trp-26 maradékának módosítására fotooxidá10 ciót is alkalmazhatunk ( Spikes, J.D. és Straight, R., 1967, Ann. Rév. Phys. Chem. 18:409).
Az SÍ alegység Trp-26 maradékának módosítására egy másik módszer az ezen maradék kodonjának törlése vagy helyettesítése az SÍ alegység kódoló génjében szokásos helyre irányuló mutagenezissel. A helyre irányuló mutagenezis elvégzésének egy példáját a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia egy példaszerű konstrukcióján egy SÍ alegységen az 5. példában mutatjuk be. így például az SÍ alegységet kódoló szekvenciát M-13 vektorba szubklónoztuk úgy, hogy ennek a szekvenciának a kifejezését a rekombináns M-13 vektorral transzformált E.coli végezni tudja. Ezután a Trp-26 maradékot töröltük, vagy treoninra (Thr) cseréltük helyre irányuló mutagenezissel. Más, a bemutatotthoz hasonló vektorkonstrukciókat a területen jártas szakember egyszerűen tervezhet ilyen, a Trp-26 helyre irányuló mutagenezis alkalmazásával.
Az SÍ kódoló szekvencia 26-os helyzetében levő triptofán maradék módosításának egy másik módszere a találmány szerinti kódoló szekvencia előállítására abban áll, hogy a Trp-26 maradékot töröljük, és szokásos géntechnológiai módszerrel vagy helyettesítő módszerrel treoninnal (Thr) vagy más alkalmas aminosav maradékkal helyettesítjük. Más alkalmas aminosav maradék lehet például - nem korlátozó jelleggel - a glutamin (Gin), tirozin (Tyr) és a fenilalanin (Phe). A Trp-26 Gln-re történő cserélése a szekunder szerkezeti hajlam szempontjából konzervatívabb helyettesítés. A Trp Tyr-re történő cserélése megtartja az intermedier polaritás! jellemzőket, mig a Phe-re történő csere megtartja az aromás gyűrűt. A. módosított molekulának amennyire csak lehet hasonlítania kell a természetes molekulára, ezért
- 11 nagyon hasonló kell legyen a szekunder szerkezet, a hidrofobicitási profil és az aromás aminosavak jellemzői. így tehát bármilyen más aminosav helyettesítés lehetséges feltételezve, hogy a helyettesítés egy olyan proteint kódoló szekvenciát eredményez, amely lényegében véve inaktivált SÍ enzimaktivitással rendelkezik, és amely megtartja azt a tulajdonságát, hogy az anti-B. pertussis toxin antitestek felismerik.
A találmány szerinti ' aminosav kódoló szekvencia előállítható (a) szintetikus utón, szokásos DNS szintézis technikák alkalmazásával, vagy (b) más kémiai módosítási módszerekkel, szokásos kémiai módosító technikákat alkalmazva is.
Szokásos géntechnológiai módszereket alkalmazva a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia, a Trp-26 módosítást tartalmazó pertussis toxin operon bármely csonkított formája lehet, vagy lehet az SÍ alegység kódoló szekvencia olyan csonkított formája, amely a Trp-26 módosítást tartalmazó, SÍ alegység 2-187 aminosavát kódoló koduiiokat tartalmazza, vagy lehet egy olyan kódoló szekvencia, amely az SÍ alegység kódoló szekvencia Trp-26 módosítást tartalmazó csonkított része.
A találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia lehet továbbá egy kettős mutáns, azaz olyan kódoló szekvencia, amely mind a Trp-26 módosítást, mind egy másik aminosav módosítását tartalmazza az SÍ alegységben, feltételezve, hogy az ilyen kódoló szekvencia által kódolt protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy az anti-pertussis toxin antitestek felismerik. Ilyen további alkalmazható módosítások például - nem korlátozó jelleggel - az SÍ alegység kódoló szekvenciájának 129-es aminosav helyzetében levő glutaminsav maradék (Glu-129) módosítása;
- 12 az SÍ alegység kódoló szekvenciának a 35-ösaminosav helyzetében levő hisztidin maradék (His-35) módosítása; az SÍ alegység kódoló szekvenciájának a 9-esaminosav helyzetében levő arginin maradék (Arg-9) módosítása és az SÍ alegység kódoló szekvencia 40-es aminosav helyzetében levő szerin maradék (Ser-40) módosítása. A glutaminsav maradék módosítása ismert módszerekkel történhet, például olyanokkal, amelyeket fentebb említettünk (lásd például
13. példa és Pizza és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7521-7525 (1988).
A találmány szerinti eljárással előállított kódoló székvencia előállítható továbbá egy fúziós proteint kódoló szekvencia formájában, amely a B. pertussis toxin aminosav kódoló szekvenciát egy egy vagy több más kódoló szekvenciához fuzionáltantartalmazza, ilyen más kódoló szekvencia lehet például - nem korlátozó jelleggel - pertussis toxinből származó kódoló szekvencia és/vagy nem-pertussis toxinból származó kódoló szekvencia. Az ilyen fúziós protein állhat például az SÍ alegység kódoló szekvencia egészéből vagy részéből, amely a Trp-26 módosítást az S2 alegység kódoló szekvencia és/vagy S3 alegység kódoló szekvencia és/vagy az S4 alegység kódoló szekvencia és/vagy az S5 alegység kódoló szekvencia egészéhez vagy egy részéhez fuzionált formában tartalmazza. A fúziós protein állhat továbbá az SÍ alegység kódoló szekvencia egészéből vagy egy részéből, amely a Trp-26 módosítást tartalmazza, más, a B. pertussisból származó antigénhez vagy egyéb antigénhez fuzionált formában, igy például - nem korlátozó jelleggel - Diphteria antigénekhez és/vagy Tetanus antigénekhez és/vagy Haemophilus influenzáé antigénekhez fuzionált formában.
Egy, a találmány szerinti eljárással előállított fúziós protein kódoló szekvencia, amelyet a példákban ismertetünk,
- 13 például a következő szekvenciát tartalmazza:
ATG ACC
ATG ATT ACG
AAT TCG AGC
TCG GTA
CCC
GGG
GAT (Met) Thr
Met Ile Thr
Asn Ser Ser
Ser Val
Pro
Gly
Asp béta-galaktozidáz polilinker
SÍ
| CCT | CCC | GCC | ACC | GTA ... | ... GTA | GCG | TCG | ATC | CTC TAG |
| Pro | Pro | Alá | Thr | Val ... | ... Val | Alá | Ser | Ile | Leu Stop |
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 184 | 185 | 186 | 187 | polilinker |
SÍ
A találmány szerinti eljárással előállítható más fúziós proteint kódoló szekvenciát a területen jártas szakember egyszerűen tervezhet és állíthat elő.
A fenti, Trp-26 helyen módosított, csonkított SÍ fragmens más vad-tipusu pertussis toxin operon szekvenciájával lehet kapcsolva, igy például az S2-S5 alegységek bármelyikét kódoló szekvenciával eggyel vagy ezek közül többel. Ezenkívül komplett B. pertussis toxin kódoló szekvencia is előállítható, amely tartalmazza (a) a fenti Trp-26 helyen módosított, csonkított SÍ fragmenst, amely helyettesíti a természetesen előforduló SÍ cisztront, vagy (b) a teljes SÍ alegység cisztront, amely csak a Trp-26 módosítást tartalmazza vagy valamely más fragmenst, amely a Trp-26 módosítást más komponensekkel együtt tartalmazza .
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan gazdasejt előállítására, amelyet a találmány szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformálunk. Az ilyen gazdasejt alkalmas tenyészközegen képes növekedni, és a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvenciát kifejezni. Az ilyen gazdasejtet tehát a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy a gazdasejtet a találmány ·«» «· ·· • · ♦ · * · ♦ ·»· • · · ·· ··
- 14 szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformáljuk. A transzformálást szokásos transzformálási technikák alkalmazásával végezzük. A legalkalmasabb gazdasejtek az E. coli fajba és a Bordetella nemzetségbe tartozó gazdasejtek. Gazdasejtként alkalmazhatók továbbá például - nem korlátozó jelleggel - emlőssejtek, rovarsejtek, más baktériumsejtek és élesztősejtek. A találmány tehát nem korlátozódik bizonyos gazdasejtekre.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan protein előállítására, amelyet a találmány szerinti eljárással előállított kódoló szekvencia kódol. Az eljárás abban áll, hogy a találmány szerinti eljárással transzformált gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a proteint izoláljuk. Az alkalmas tenyészközeg kifejezésen olyan közeget értünk, amely lehetővé teszi, hogy a transzformált gazdasejt növekedjék, és a találmány szerinti kódoló szekvenciát kinyerhető mennyiségben kifejezze. Nyilvánvaló, hogy az alkalmas tenyészközeg az alkalmazott gazdasejttől függ. Az előállított protein izolálását a gazdasejt tenyészetének lizátumából vagy közvetlenül a gazdasejt tenyészközegéből végezhetjük, szokásos protein izolálási módszereket alkalmazva.
A fentiek alapján a találmány egy előnyös megvalósítási módja eljárás olyan protein előállítására, amelyet Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia kódol, amely a teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciáját tartalmazza, ahol (a) az SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradék (a továbbiakban: Trp-26) módosítását tartalmazza, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve inaktivált SÍ enzimaktivitást eredményez a proteinben, amelyet a B. pertussis toxin operon aminosav kódoló szekvencia kódolt, de a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy az anti-pertussis
··· * · toxin antitestek felismerik. Az eljárás abban áll, hogy (i)
Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvenciát, amelyet natív B. pertussis DNS -bői izolálással vagy szintetikus vagy rekombináns DNS technikával állítunk elő, és amely teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz, feltételezve, hogy az SÍ alegység kódoló szekvencia még nem tartlamaz módosítást a 26-os aminosavhelyzetben levő triptofán maradéknál, helyre irányuló mutagenezissel, triptofán módosító kémiai reagenssel vagy fotooxidációs utón kezelünk, igy a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradékot módosítjuk vagy töröljük, egy kivánt gazdasejtet egy olyan plazmiddal transzformálunk, amely az igy kapott kódoló szekvenciát tartalmazza, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk, vagy (ii) natív B. pertussis DNS-ből izolálással vagy szintetikus vagy rekombináns DNS technikával előállított, teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmazó Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia SÍ alegysége 26-os helyzetében levő triptofán maradékot töröljük vagy helyettesítjük egy másik aminosavval, egy kivánt gazdasejtet egy olyan plazmiddal transzformálunk, amely a kapott kódoló szekvenciát tartalmazza, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk, vagy (iii) ilyen kódoló szekvenciát állítunk elő szintetikus módszerrel, a kivánt gazdasejtet olyan plazmiddal transzformáljuk, amely tartalmazza a kapott kódoló szekvenciát, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk. A találmány kiterjed továbbá olyan vakcina előállítására, • · • « • ·* •·♦♦ *· • * ♦» a vakcina az • · ♦ • » · ·*· «·
- 16 amely szamárköhögés elleni védelmet biztosit, előállított protein immunprotektiv és nem-toxikus mennyiségét tartalmazza.
A találmány tehát kiterjed olyan vakcina előállítására, amely pertussis ellen immunitást indukál. Az ilyen vakcina a találmány szerinti protein immunprotektiv és nem-toxikus mennyiségét tartalmazza függetlenül attól, hogy a proteint milyen módon állítottuk elő. A vakcina előnyösen 5-25 ^ug proteint tartalmaz.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcina tartalmazhat más ismert antigéneket is, olyanokat, amelyek ismert módon előnyösen adagolhatok pertussis toxinnal kapcsolatban. Az ilyen komponensek szakember számára ismertek. Előnyös komponens például a tetanusz toxoid és/vagy diftéria toxoid, valamint rostos hemaglutinin(FHA) és/vagy bármely más B. pertussis védőantigén.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcina embereknek adagolva pertussis elleni immunizálásra alkalmas. Az adagolás módját úgy választjuk meg, hogy az alkalmas legyen immunprotektiv mennyiségű proteint juttatni a kezelt szervezetbe. A vakcinát előnyösen parenterálisan, intramuszkuláris vagy mély szubkután utón adagoljuk. Az adagolás azonban történhet másféle módon is, igy például orálisan vagy más parenterális utón, például intradermálisan, intranazálisan vagy intravénásán.
A vakcinát olyan gyógyszerkészítmény formájában állítjuk elő, amely a találmány szerinti eljárással előállított protein immunprotektiv, nem-toxikus mennyiségét tartalmazza nem-toxikus és steril farmakológiailag elfogadható vivőanyag mellett. Parenterális adagolásra szánt vakcina esetén a találmány szerinti
·* ·· ··· ♦ ·
- 17 eljárással előállított proteint adott esetben valamely szokásos adjuvánssal keverve vagy arra abszorbeálva készítjük el. Az adjuváns olyan anyag, amely nem-specifikus irritációt biztosit az immunválasz kiváltására vagy elősegítésére. Ilyen adjuvánsok például többek között az aluminium-hidroxid, aluminium-foszfát, muramil-dipeptid és a szaponinok, mint például Quil A. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát előállíthatjuk úgy is, hogy a találmány szerinti eljárással előállított proteint mikrokapszulákba, például liposzómákba kapszullázzuk. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát előállíthatjuk továbbá úgy is, hogy a találmány szerinti eljárással előállított proteint egy immunstimuláló makromolekulával vagy tetanusz toxoiddal együtt adagoljuk. Készíthetünk továbbá orális adagolásra szánt vizes szuszpenziót vagy oldatot, amely a találmány szerinti eljárással előállított proteint tartalmazza előnyösen fiziológiás pH-ra pufferolva.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát előnyösen gyógyszerkészítményként egységdózis formájában készítjük el. Az alkalmas terápiásán hatásos dózist a területen jártas szakember egyszerűen megállapíthatja. A találmány szerinti eljárással előállított vakcinában levő protein hatásos mennyisége általában megegyezik a szokásos B. pertussis sejtmentes vagy komponens vakcinákban jelenlevő antigén hatásos mennyiségével, azaz 5-25 protein. Ezt a dózist adott esetben különböző mennyiségű rostos hemaglutininnal (FHA) (kb 10-25 yug) és/vagy aglutinogénnel vagy más antigénekkel együtt alkalmazzuk.Az egyes kezelendő sze mélyeknek adagolt dózis azonban különböző faktoroktól függ, igy például a kortól, általános egészségi állapottól, nemtől és a kezelt személy diétájától, az adagolás idejétől, az adagolás mód-
·· • · ··· ·♦ ·· ·
jától, más párhuzamosan adagolt hatóanyagok szinergikus hatásától és a kívánt védőhatás szintjétől. Az adagolás kívánt esetben alkalmas időközönként megismételhető. Előnyösen 3 dózist adagolunk, 3-12 hónapos intervallumokkal és később adott esetben egy emlékeztető dózissal.
A találmány tárgya továbbá eljárás egy B. pertussis törzs előállítására, amelyben a kromoszomális pertussis toxin gén inaktiválva van, amely törzs a találmány szerinti eljárással előállított rekombináns DNS molekulát tartalmazza. A találmány szerinti eljárás egy másik megvalósítási módja szerint olyan teljes sejt vakcinát állítunk elő szamárköhögés elleni védelem biztosítására, amely a találmány szerinti eljárással előállított törzs immunprotektiv és nem-toxikus mennyiségét tartalmazza. Az ilyen vakcina a törzset tartalmazhatja önmagában vagy más antigénekkel és/vagy adjuvánsokkal együtt.
A találmány szerinti eljárásban kiinduló törzsként bármely
B. pertussis törzset alkalmazhatunk, amely a kromoszomális pertussis gént tartalmazza. Számos ilyen B. pertussis törzs hozzáférhető különböző törzsgyüjteményekben, igy például American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok intézetnél. A törzs előállítását szokásos módszerekkel végezhetjük. így például eljárhatunk úgy, hogy a kromoszomális pertussis toxin gént szokásos módszerekkel inaktiváljuk, igy például törléssel, vagy beiktatásos mutációval, és a találmány szerinti eljárással előállított rekombináns DNS molekulát szokásos módszerekkel transzforrnáljuk ebbe a törzsbe. Előnyösen olyan B. pertussis törzset alkalmazunk, amelyben a kromoszomális toxin gént inkább töröljük, mint inaktiváljuk, pont- vagy beiktatásos mutációval. A gén pont- vagy beiktatásos mutációval végzett inaktiválása nem küszö·· · · ! ·*·.
··· ·· ·· · · . . :::··· ··· ·· ·· böli ki azokat a DNS szekvenciákat, amelyek in vivő rekombinálódhatnak olyan DNS-sel , amely a mutált pertussis toxint kódolja autonóm módon replikálódó plazmidban. Törléssel mutált pertussis toxin gén esetén nem következhet be ilyen rekombináció. A kapott 8· pertussist ezután a találmány szerinti eljárással előállított rekombináns DNS molekulával transzformáljuk, és igy a találmány szerinti törzset kapjuk. Előnyös, ha az ilyen rekombináns DNS molekulát a találmány szerinti eljárással előállított plazmid tartalmazza. Az ilyen rekombináns DNS molekula a gazdasejt kromoszómájába integrálható, vagy ha plazmid formájában van, akkor episzomálisan fenntartható. Miután a rekombináns DNS molekulát beiktattuk, a kapott B. pertussis törzs alkalmazható arra, hogy a találmány szerinti mutált pertussis toxin proteint termeljük. Más módszer szerint miután a rekombináns molekulát beiktattuk, a törzs alkalmazható arra, hogy pertussis elleni teljes sejt vakcinát állítsunk elő. Az ilyen teljes sejt vakcina előállítását szokásos módszerekkel végezzük.
Az igy kapott vakcinával embereket pertussis ellen immunizálhatunk. A vakcinát olyan módon adagoljuk, amely biztosítja, hogy a kezelt személynek a törzs immunprotektiv mennyiségét adagoljuk. A vakcinát előnyösen parenterálisan, intramuszkuláris vagy mély szubkután utón adagoljuk. Az adagolás történhet más módon is, például orálisan vagy más parenterális utón, például intradermálisan, intranazálisan vagy intravénásán.
Az ilyen vakcina alkalmas immunprotektiv és nem-toxikus dózisát szakember egyszerűen megállapítja, azaz a találmány szerinti eljárással előállított vakcinában a törzs alkalmas immunprotektiv és nem-toxikus mennyisége a szokásos B. pertussis teljes sejt vakcinákban jelenlevő hatásos mennyiségnek megfelelő.
Ezt a dózist adott esetben különböző mennyiségű rostos hemaglutininnal (körülbelül 10-25 /ug) és/vagy aglutinogénekkel vagy más antigénekkel együtt alkalmazzuk. Az egyes betegeknek adagolt dózis mennyisége különböző faktoroktól függ, igy példáula kortól, általános egészségi állapottól, nemtől és a kezelt személy diétájától, az adagolás idejétől, az adagolás módjától, a párhuzamosan adagolt más hatóanyagok szinergikus hatásától, és az elérni kívánt védelem szintjétől. Kívánt esetben az adagolást alkalmas időközönként megismételhetjük. Előnyösen 3 dózist adagolunk, az egyes dózisok között 3-12 hónap itervallummal, és később egy adott esetben adagolt emlékeztetővel.
A találmány szerinti eljárást, azaz a kódoló szekvencia, a vektor, a transzformált sejt és a protein előállítását, annak antigén aktivitását és a vakcina előállítását a következő példákkal szemléltetjük}nem korlátozó jelleggel.
A DNS manipulációkhoz alkalmazott enzimeket a Boehringer, Mannheim, NSZK és Amersham, Nagy-Britannia cégektől szereztük be, és a gyártó előírásai szerint alkalmaztuk.
A példákban a következő rövidítéseket alkalmaztuk:
IT tápközeg: 8 g/1 tripton, 5 g/1 nátriumklorid, 5 g/1 élesztőkivonat.
Tris-hidroklorid: 1 mol/literes törzsoldat: 121,1 g/1 Trizma bázis + sósav a kívánt pH érték eléréséig (például 7,5),
LB tápközeg (pH = 7,5): 10 g/1 tripton, 5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 nátriumklorid.
1. példa
SÍ alegységgel kapcsolatos proteint kódoló pRIT20001 expressziós vektor készítése pPTX42 plazmidot (Locht, C. és munkatársai, Nucleic
Acids Rés., 14 : 3251 (1986)) Sau3a-val fragmensekre hasítottunk. A fragmenseket Maniatis és munkatársai módszere szerint poliakrilamidgél elektroforézissel (PAGE) szétválasztottuk (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Egy 560 bázispár hosszúságú fragmenst tisztítottunk, és replikativ formájú, előzetesen BamHI-rel emésztett M13mpl8-ba iktattuk be. Az M13mpl8-t Messing, J. Methods Enzymol. 101, 20-78, 1983 helyen ismertetik, és a Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland helyről szereztük be. Az Amersham, International PLC, Amersham, Nagy-Britannia helyről beszerzett E. coli TG1 sejteket transzformáltuk a rekombináns -fágok replikativ’ formájával Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszere szerint. Transzformálás után egy éjszakán át inkubáltunk, és a fágokat Sanger és munkatársai módszerével (Proc. Natl. Acad.
Sci., Amerikai Egyesült Államok, 74, 5463-5467 , (1977)) DNS szekvencia meghatározással arra nézve vizsgáltuk, hogy tartalmazzák-e a beiktatott 560 bázispáros fragmenst.
Egy? 3560 bp inzertet tartalmazó fágot tisztítottunk, és pRIT 20001 jellel jelöltünk. Megállapítottunk, hogy pRIT2000 1 által kódolt SÍ alegységgel kapcsolatos protein azonos az rSld-val, azzal az SÍ alegységgel kapcsolatos proteinnel, amelyet a Locht és munkatársai által ismertetett pTXSll kódol (Infect. Immun., 55:2546 (1987)). A pRIT 20001 cl^ő hat aminoterminális aminosav a béta-galaktozidáz első hat aminosava ezeket öt olyan aminosav követi, amelyeket azM13mpl8 klónozó vektorban található polilinker szék22 vencia kódol, ezek után található a pertussis toxin SÍ alegysége
2-187 maradékát kódoló szekvencia. Végül a polilinker egy Leu
| maradékot | kódol, és | egy Stop kodon | van | jelen. Ez | az SÍ alegység- | |||||||
| gél | kapcsolatos | protein | következő | szekvenciáját | adja : | |||||||
| ATG | ACC | ATG | ATT | ACG | AAT | TCG | AGC | TCG | GTA | CCC | GGG | GAT |
| (Met) | Thr | Met | He | Thr | Asn | Ser | Ser | Ser | Val | Pro | Gly | Asp |
| béta-galaktozidáz | polilinker | 2 | ||||||||||
| SÍ | ||||||||||||
| CCT | CCC | GCC | ACC | GTA | .GTA | GCG | TCG | ATC | CTC | TAG | ||
| Pro | Pro | Alá | Thr | Val | .Val | Alá | Ser | Ile | Leu | Stop | ||
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 184 | 185 | 186 | 187 | polilinker |
SÍ
2. példa
SÍ alegységgel kapcsolatos protein szintézise E.coliban pRIT20001 alkalmazásával
1,5 ml egy éjszakás E. coli TG1 ,sejt tenyészetet 100 ml
YT tápközegbe oltottunk, és ezt az 1. példában leirt módon előállított 10 /Ul pRIT20001-gyel vagy M13mpl8 fág alappal fertőztük. A fertőzött sejteket állandó rázás mellett 37 °C-on addig növesztettük, mig az optikai sűrűség (0D) el nem érte a 0,3 értéket. Ezután a sejtekhez izopropil-béta-D-galaktopiranozidot (IPTG) adtunk 1 mmol/1 végső koncentrációig, és a növesztést
4-5 óra hosszat tovább folytattuk. Ezután a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, 3 ml lizáló pufferben (25 mmol/1 Tris-hidroklorid, pH = 7,5, 25 mmol/1 nátriumklorid) szuszpendáltuk, és egy francia sajtolókamrán kétszer keresztül nyomva rancsoltuk. A lizátumot 12000 x 9-vel 40 percig centrifugálva frakcionál-
A felüluszó frakciót SÍ alegységgel kapcsolatos protein jelenlétére nézve Western biot analízisnek vetettük alá ( Towbin és munkatársai, Proe. Natl. Acad-Sci., Amerikai Egyesült Államok, 7 6: 4350-4354, ( 1979)), és B2F8 anti-Sl-monoklonális antitesttel detektáltuk (Marchitto, K.S. és munkatársai, Infect. Immun. 55:1309 (1987 )), amelyet Laboratory of Pathobiology, NIAID, Rocky Mountain Laboratories, Hamilton, Montana intézettől szereztünk be. Az olyan sejtek felüluszó frakciója, amelyeket M13mpl8 segítségével fertőztünk, nem tartalmazott olyan proteint, amelyet a B2F8 monoklonális antitest specifikusan felismer. Azon sejtek felüluszó frakciója azonban, amelyeket pRIT20001 plazmiddal fertőztünk, egy körülbelül 22000 daltonos proteint tartalmazott, amely a Western biot analízisnek B2F8 monoklonális antitesttel reagált. Ez a protein a Western biot analízisben ugyanolyan módon viselkedett a B2F8 monoklonális antitesttel, mint az SÍ alegységgel kapcsolatos protein, az rSld, amelyet a pTXSll kódol (lásd Locht
C. és munkatársai, idézett helyen).
3. példa pRIT20001-gyel fertőzött E. coliban szintetizált SÍ alegységgé, kapcsolatos protein enzimaktivitása
A 2. példa szerinti módon előállított felüluszó frakciókat SÍ alegységgel kapcsolatos protein specifikus enzimaktivitására nézve vizsgáltuk. Az aktivitás szintjét összevetettük a r$ld aktivitásával, amelyet pTXSll-t tartalmazó E. coli sejtekből részleges tisztítással nyertünk. A Locht és munkatársai által Infect. Immun. (1987) idézett helyen ismertetett nikotinamiddinukleoitid (NAD)-glikohidroláz vizsgálatban mértük a nikotinamid felszabadulását NAD-ból ilyen részlegesen tisztított rSld katalízisekor. 1 ^ug részlegesen tisztított rSld 3 óra alatt 30 °C-on 1200 pmol nikotinamid felszabadulását katalizálta a Locht és munkatársai által idézett helyen ismertetett körülmények között. Az M13mpl8-cal fertőzött TG1 sejtek felüluszó frakciója nem tartalmazott szignifikáns NAD-glikohidroláz aktivitást, és a mért nikotinamid felszabaditási értékek nem különböztek a háttér-szinttől. 25 /Ul, pRIT20001-gyel fertőzött E. coli T(r'1 sejtek felüluszó frakciója azonban 3 óra hosszat ugyanolyan körülmények között inkubálva 300 pmol nikotinamid felszabadulását katalizálták NAD-ból. A pRIT20001-gyel fertőzött E.coli sejtek felüluszójában az enzimaktivitás csökkenése egy inhibitornak a következménye, amely a nyers E.coli sejt extraktumban van jelen. (Locht nem publikált megfigyelése).
A részben tisztított rSld és a pRI120001-gyel fertőzött E.coli sejtek felüluszó frakciója, valamint a M13mpl8-cal fertőzött 1G1 sejtek azon tulajdonságát is vizsgáltuk, hogy képesek-c katalizálni a 41000 daltonos Gi szignál transzdukáló GTP-Kötőproteinsí specifikus aóenozin -difoszfát (ADP)-ribolizelését CHO sejtmembránokban. Ezt a vizsgálatot szintén Locht és munkatársai ismertetik az Infect. Immun. (1987) idézett helyén. A 41000 daltonos Gi protein specifikus jelzését úgy detektáltuk, hogy részlegesen tisztított rSld-t és pertussis toxint radioaktivan jelzett FÁD és kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtmembránok jelenlétében Locht és munkatársai által javasolt körülmények között inkubáltunk, és a reakcióterméket nátrium-dodecil-szulfát-PAGE (SDS-PAGE) segítségével és autoradiográfiával analizáltuk. A Gi protein jelzése nem volt megfigyelhető, ha az rSld-t vagy a pertussis toxint lizáló pufferrel (25 mmol/1 Iris-hidroklorid (pH = 7,5), 25 mmol/1 nátriumklorid) vagy az M13mpl8-cal fertő• ·
I
HNBB-vel kezelt SÍ alegységgel kapcsolatos protein és HNBBvel nem-kezeit SÍ alegységgel kapcsolatos protein) arra nézve vizsgáltuk, hogy a NAD-glikohidrolizist és a ADP-ribosiltranszfért mennyire képesek katalizálni a Gi-re CHO sejt membránokban a Locht és munkatársai által Infect. Immun. (1987) idézett helyén ismertetett vizsgálati körülmények között. A nemkezelt SÍ alegységgel kapcsolatos protein, valamint a HNBB-vel nem-kezeit SÍ alegységgel kapcsolatos protein a koncentrációtól függő NAD-glikohidroláz aktivitást fejezett ki. Csak csekély NAD-glikohidroláz aktivitás volt megfigyelhető a HNBB-vel kezelt SÍ alegységgel kapcsolatos protein esetén, és az aktivitás körülbelül
Vra csökkent, amikor a HNBB-vel kezelt SÍ alegységgel kapcso latos protein kisebb koncetrációját, azaz 1 yug, vizsgáltuk. Amikor
0,5 /ug és 1,0 yug nem-kezeit, HNBB-vel kezelt és HNBB-vel nem kezelt SÍ alegységgel kapcsolatos proteint Gi-re vonatkozó
ADP-riboziláz aktivitásra nézve vizsgáltunk CO sejtmembránban, csak a nem-kezeit SÍ alegységgel kapcsolatos protein és a
HNBB-vel nem-kezeit SÍ alegységgel kapcsolatos protein mutatott
Gi-re specifikus ADP-ribozilező aktivitást mindkét koncentráció esetén. A HNBB-vel kezelt SÍ alegységgel kapcsolatos protein esetén nem volt kimutatható egyik koncentráció esetén sem Gi:ADP--riboziltranszferáz aktivitás.
5. példa
A találmány szerinti kódoló szekvencia előállítása helyre irányuló mutagenezissel
Az 1. példa szerint előállított pRIT20001 fág egyszálu DNS-ét tisztítottuk, és oligonukleotiddal végzett helyre irányuló mutagenezisnek vetettük alá Oligonucleotide-Directed in vitro Mutagenesis System-ben (AmershamInternational PLC, Amersham, Nagc-Britannia kódszám RPN 2322) a forgalmazó által javasolt körülmények között. A pRIT20001-ben található rSld gén 26. aminosav helyzetében levő triptofán maradékot kódoló TGG kodon specifikus törlésére használt oligonukleotid szekvenciája 5' CGTTGTTTCCCGCCGTGAAT 3' volt. A pRIT20001-ben található SÍ gén 26. aminosav helyzetében levő triptofán maradékot kódoló TGG kodon specifikus kicserélésére
MZ használt oligonukleotid szekvenciája 5' CGTTGTTCCGGTCGCCGTGAAT 3' volt.
A kapott hatásokat mutagén poligonukleotidokkal történő differenciális hibridizációval vizsgáltuk át Wallace módszere szerint (Suggs, Developmental Biology Using Purified Genes,
Ed. D. Brown N.Y., Academic Press). A mutációkat DNS szekventálással határoztuk meg Sanger és munkatársai (1977) idézett helyen ismertetett módszerével. Egy, a Trp-26 törlést tartalmazó mutánst pRIT20002 jellel láttunk el, klónoztuk és arra a képességére nézve vizsgáltuk, hogy ki tudja-e fejezni a Trp-26 helyzetben módosított SÍ gént, amint ezt a 6. példában ismertetjük.
Egy másik mutánst, amely a Trp-26 helyzetben Thr helyettesítést tartalmazott, pRIT20008 jellel láttunk el, klónoztuk és arra a képessségére nézve vizsgáltuk, hogy ki tudja-e fejezni . a Trp-26 helyzetben módosított SÍ gént, amint ezt a 6. példában ismertetjük.
6. példa
Trp-26 helyzetben módosított rSld gén kifejezése E.coliban és a termék enzimaktivitásának vizsgálata
E.coli TG1 sejteket pRIT20002, ill. pRIT20008 plazmiddal fertőztünk, amelyeket az 5. példa szerinti módon állítottunk elő, és a TGG Trp-26 kodon törlést, ill. a treoninnd< megfelelő ACC kodonra történt helyettesítést tartalmazó Trp-26 helyen • ·
- 28módositott SÍ alegységgel kapcsolatos gének kifejeződését a
2. példában ismertetett módon IPTG-vel indukáltuk. A sejteket összegyűjtöttük, és lizáltuk, a sejtlizátumot centrifugálással frakcionáltuk, és a felüluszó frakciót a mutált rSld jelenlétére nézve vizsgáltuk Western biot analízissel, és B2F8 anti-Sl monoklón antitesttel történő reakcióval, a 2. példában ismertetett módon.
Az eredményeket összehasonlítottuk a 2. példában kapott eredményekkel. A pRIT20001, pRIT20002 és a pRIT20008 fággal fertőzött sejtek felüluszó frakciója olyan proteint tartalmazott, amely a Western biot analízisben a B2F8 monoklón antitesttel reagált, mig az M13mP18 fággal fertőzött sejtek felüluszó frakciója nem tartalmazott ilyen proteint. Ezenkívül a pRIT20001, pRIT20002 és a pRIT20008 felüluszójában található B2S8-cal reagáló protein ugyanolyan látszólagos molekulatömeget mutatott, mint a 3. példában ismertetett, részben tisztított rSld. A Western biot analízisben végzett vizuális megfigyelés alapján a pRIT20001, pRIT20002 és pRIT20008 durván ugyanolyan mennyiségű SÍ alegységgel kapcsolatos proteint fejezett ki.
A pRIT20001, pRIT200Q2 és pRIT20008 felüluszó frakcióit NAD-glikohidroláz és ADP-riboziltranszfferáz aktivitásukra nézve összehasonlítottuk a 3. példában ismertetett vizsgálórendszerrel. Mig 25 /U1 pRIT20001 felüluszó 300 pikomol nikotinamid felszabadulását katalizálta 3 óra alatt, a pRIT20002 és pRIT20008 felüluszó frakciója hasonló NAD-glikohidroláz aktivitás-szintet mutatott, mint a M13mpl8-cal fertőzött sejtek felüluszó frakciója, azaz lényegében véve nem volt megfigyelheő NAD-glikohidroláz aktivitás. Hasonlóképpen, mig a pRIT20001 felüluszó frakciója katalizálta a Gi protein AOP-r ibolizelését, ilyen aktivitás nem volt megfiyelhető a pRIT20002, ill. pRIT20008 felüluszó frak29 dójában. Tehát a pRIT20002 és pRIT20008 által kódolt SÍ alegység protein lényegében véve inaktivált SÍ alegység protein enzimaktivitást mutatott.
7. példa
A pRIT20002 és pRIT20008 által kódolt SÍ alegységgel kapcsolatos protein antigén szerkezete
A 6. példa szerinti módon előállított pRIT20002 és pRIT20008 felüluszó frakciókat arra nézve vizsgáltuk, hogy reagálnak-e a monoklón, valamint poliklón anti-pertussis toxin antiszérummal Western biot analízisben, llgy találtuk, hogy pertussis toxin elleni poliklonális antitestek ( E. Simoen, SmithKline-R.I.T . s.a., Rixensart, Belgium SK-RIT), valamint különböző antipertussis toxin antitestek ( M. Francotte (SK-RIT) és J.G. Kenimer (Laboratory of Cellular Physiology, Food and Drug Administration , Bethesda, MD) specifikusan reagáltak a pRIT20002 és pRIT20008 eredetű SÍ alegységgel kapcsolatos proteinekkel nyers E.coli sejtek felüluszójában. Némelyik reagáló monoklonális antitest jó toxinsemlegesitő és védő aktivitást mutatott egér kísérleti rendszerben. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy legalább néhány védő epitop megmaradt a pRIT20002 és pRIT20008 eredetű proteinekben, és a protein alkalmazható szamárköhögés elleni vakcinákban.
8. példa
Az SÍ alegység cisztronban Trp-26 törlést tartalmazó teljes pertussis toxin operon rekonstrukciója
A teljes pertussis toxin operont tartalmazó 4,7 kbp DNS fragmenst (T.Cabezon, SK-RIT) pUC7 plazmidba iktattuk, amelyet előzőleg EcoRI-vel emésztettünk. A beiktatást Maniatis és munkatársa i idézett helyen leirt módszere szerint végeztük.
• · ♦ ··· • · · β • · · · · · ·
A pUC7 plazmidot 3. Vieira és J. Messing, Gene 19:259-268 1982/ helyen ismertették.
A kapott rekombináns plazmidot E.coli TG1 kompetens sejtekbe vezettük be Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszerével. A transzformált sejteket Maniatis és munkatársai által ismertetett módszerrel klónoztuk, és a kiónokat plazmidjaik restrikciós emésztésével analizáltuk, Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszerével. Az egyik plazmidot, amelyet pRIT13070 számmal láttunk el, és amely a teljes pertussis toxin operont tartalmazta, tisztítottuk, majd Acc I-val emésztettük Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszerével. A kapott két fragmenst poliakrilamid gél elektroforézissel (PAGE) elválasztottuk, és a nagyobbikat tisztítottuk, és a következő ligálási lépésben felhasználtuk.
A pRIT20002 replikativ formáját tisztítottuk és szintén emésztetüttk Accl-vel. A kapott fragmenseket PAGE utján elválasztottuk, és a Trp-26 törlést tartalmazó 300 bp DNS fragmenst tisztítottuk. A pRIT20002-ből származó 300 bp AccI fragmenst ezután ligáltuk a pRIT13070 nagyobbik AccI fragmensével Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszere szerint, és a kapott rekombináns plazmidot E.coli TG1 kompetens sejtekbe vezettük be Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszere szerint. Klónozás után a teljes pertussis toxin operont tartalmazó pRIT13071 plazmidot Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszere szerint izoláltuk. A pRIT13071 az SÍ cisztronban tartalmazza a Trp-26 kodon törlését, azonban egyébként azonos a pRIT13070vel.
A pRIT13070 által tartalmazott Trp-26 helyen módosított
- 31 pertussis toxin operont most már alkalmazhatjuk arra, hogy módosítást vezessünk be a B. pertussis genomjába úgy, hogy a jelenlevő vad tipusu operont a módosított operonnal cseréljük ki rekombinációval. Másképpen a módosított operon plazmidba foglalható, amely ezután Bordetella sejtbe vagy bármely más alkalmas gazdasejtbe transzformálható a Trp-26 helyén módosított operon által kódolt protein kifejezése érdekében.
Az ilyen módosított Bordetella törzs azután alkalmazható a találmány szerinti kódoló szekvenciához és/vagy más védő antigénekhez például FHA és/vagy agglutinogénekhez együtt. Ezek az antigének azután szamárköhögés elleni vakcinákban alkalmazhatók alkalmas adjuváns szerrel, például alumínium adjuváló szerrel együtt.
9. példa
Parenterális vakcina
5-25 yug, a 6. példa szerinti módon előállított pRIT20002 vagy pRIT20008 által kódolt proteint alumínium adjuvánssal, például aluminium-hidroxiddal keverünk, és parenterális adagolásra alkalmas vakcinává alakítjuk.
10. példa
Mutált pertussis toxin gének kifejeződése Bordetella pertussisban
A 8. példa szerinti módon előállított pRIT13071 plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel emésztettük, és az SÍ cisztronban található Trp-26 kodon törlését tartalmazó teljes pertussis toxin operont 4,7 (kbp) DNS fragmens formájában izoláltuk Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszere szerint. Ezt a 4,7 kbp DNS fragmenst azután a kis • · ·· • ·♦· • · ·· ·· kópiaszámu pLAFRII plazmid egyetlen EcoRI helyére iktattuk be, igy a pRIT13268 jelű plazmidot kaptuk. A pLAFRII plazmidot Friedman és munkatársai ismertetik a Gene 18:289-296 (1982) és
Dr. 3.J. Mekalanos, Harvard Medical School, Cambridge , Massachusetts,
USA intézettől szereztük be. A rekombináns plazmidot
E.coli SM10 törzsbe transzformáltuk, amelyet Dr. S.Stibitztől szereztünk be (U.S. Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland USA). A pLAFRII tetraciklin rezisztenciát tartalmaz, ezért az SM10 transzformálásokat LB tápközegen szelektáltuk, amely 12,5 yug/ml tetraciklint tartalmazott (Maniatis és munkatársai).
A tetraciklin rezisztenst transzformálásokat tovább analizáltuk DNS szekventálással (Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1977)) a mutált pertussis toxin gén jelenlétére. A tetraciklin rezisztens SM10 kiónokat, amelyek a módosított pertussis toxin gént tartalmazták, azután Bordetella pertussis SK39 törzzsel konjugáltuk. A SK39 törzset Knapp és Mekalanos ismerteti J. Bacteriol., 170, 5059-5066 (1988) helyen. Az SK39 törzs a pertussis toxin operon SÍ cisztronjában kromoszómában tartalmaz egy Tn5 inzertet, a toxin gén ezen megszakítása miatt ez a törzs nem szintetizálja a pertussis toxint. A tetraciklin rezisztens B. pertussis SK39 konjugátokat BC agáron azonosítottuk tottuk (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), amely 250 ml def-ibrinált birka tartalmazott literenként, továbbá yug/ml tetraciklint. A tetraciklin rezisztens kiónokat azután Stainer-Scholte-féle módosított tápközegen növesztettük (Kloos és munkatársai C.R. Manclark és J.C. Hill. , International Symposium on Pertussis, U.S. Department of Health, Education, and Welfare, Washington, D.C. 70-80. oldal (1979)). Növesztés után a sejteket centrifugálással elválasztottuka tápközegtől, majd • ·· *í i J • · · · · · a ··· ·· ··· ·· · .
- yj ~ mind a sejteket, mind a tenyészközeget Western biot analízisben vizsgáltuk (Locht és munkatársai, Infect. Immun. (1987) id.h.) a pertussis toxin jelenlétére akár sejttel kapcsolatos formában, akár szabadon a tenyészközegen. Az eredmények azt mutatják, hogy a rekombináns plazmidot tartalmazó B. pertussis SK39 törzs szintetizálja a pertussis toxint, és a toxin a tenyészközeg felüluszójába kerül, bár jelentős mennyiségű pertussis toxin található sejttel kapcsolatos formában is. A rekombináns plazmidot nem tartalmazó B. pertussis SK39 törzs nem tartalmaz detektálható mennyiségű pertussis toxint sem a tápközegben sem a baktériumsejtekkel kapcsolatos formában. A rekombináns plazmidot tartalmazó B. pertussis SK39 törzs alkalmazható teljesejt vakcinaként, amelyet szokásos módszerekkel készíthetünk el.
A 8. és 9. példa szerinti módon, azonban pRIT20002 helyett pRIT20008-t használva a pRIT13269 plazmidot állítottuk elő. A pRIT13269 plazmid a teljes pertussis toxin kódoló szekvenciát tartalmazza, azonban a treonin helyettesíti a triptofán mutációt az SÍ kódoló szekvencia 26-os aminosav helyzetében.
11. példa
A mutált pertussis toxin biológiai aktivitása
A tisztittott pertussis toxin (List Biologicals, Campbell, California, USA), valamint a toxint szintetizáló B. pertussis Tohama I törzs (Piet Roelants, SK-Biologicals) tenyészet felüluszója morfológiai változásokat okoz a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtekben, amint ezt Hewlett és munkatársai, Infect. Immun. 40:1198-1203 (1983) helyén ismertetik. Másrészt a módosított pertussis génnel rendelkező rekombináns plazmidot tartalmazó B. pertussis SK39 törzs tenyészetének felüluszója nem indukál észlelhető morfológiai változásokat a CHO sejtekben, • ♦ • ·· ·· • · · · · · * · · · · · « · · · • · · · » ·
- 34 ami azt jelzi, hogy a Trp-26 kodon törlése a pertussis toxin gén SÍ alegység cisztronjából drasztikusan csökkenti a pertussis toxin biológiai aktivitását. Amikor a mutált toxin aktivitását mennyiségi alapon vizsgáltuk, kitűnt, hogy a mutáns legalább 500-szor kevésbé toxikus ebben a CHO sejt viszgálatban.
12. példa
B. pertussis törzs létrehozása, amelyben a pertussis toxin operon törölve van
A 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradékánál módosítást tartalmazó, teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciájának kifejezésére előnyösebb olyan B. pertussis befogadó törzset alkalmazni, amelyben a kromoszomális toxin gén törölve van, mint olyant, amelyben inaktiválva van, vagy amely pont- vagy beiktatásos mutációkat tartalmaz. A pont*vagy beiktatásos mutációval végzett géninaktiválás nem iktatja ki azokat a DNS szekvenciákat, amelyek in vivő rekombinálódhatnak a mutált pertussis toxint kódoló DNS-sel egy autonóm replikálódó plazmidban. Másrészt egy pertussis gén törléses mutánsában ilyen rekombináció nem fordulhat elő. Ezért a B. pertussis Tohama I törzs pertussis toxin kódoló szekvenciáját a következő módon töröltük. Először a B. pertussis Tohama I törzset BG tápközegen, amely 400 yug/ml streptomicint tartalmazott, szélesztettük. Ezután a streptomicin rezisztens törzseket 50 /ug/ml nalidixin savat tartalmazó BG tápközegben szélesztettük. A streptomi ci nr e egy nalidixinre rezisztens B. pertussis Tohama I törzseket használtuk a konjugációs kísérletekben. A Black and és Falkow, Infect. Immun, 55:2465-2470 (1987) helyen ismertetett pT0X9 plazmid a pertussis toxin gént egy körülbelül • · kbp Β. pertussis ONS fragmensét tartalmazza. A pT0X9-t KpnI és BglII restrikciós enzimekkel, majd Bal31 exonukleázzal emésztettük. Ligálás után a törölt pertussis toxin gént egy körülbelül 7 kbp hosszúságú Cla/Cla DNS fragmensen izoláltuk a Bal31-vel kezelt pT0X9-ből. A kezeléseket a Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszerei szerint végeztük. A 7 kbp DNS fragmenst pSORTPl plazmid (Stibitz és munkatársai, Gene 50: 133-140 (1986)) HindlII helyére iktattuk be. A rekombináns plazmidot E.coli SM10 törzsbe transzformáltuk, és DNS szekvencia meghatározással azonosítottuk a törléses mutációt. A kívánt törléssel rendelkező rekombináns plazmidot tartalmazó E.coli SM10 törzset ezután streptomicin és nalidixinsav rezisztens B. pertussis -Tohama I törzssel konjugáltuk. A kromoszómába beiktatott formában rekombináns plazmidot tartalmazó konjugátumokat géntamicin rezisztencia és streptomicin érzékenység alapján azonosítottuk BG agarlemezeken. A pSORTPl plazmid gentamicin rezisztencia gént és egy streptomicinre dominánsan érzékeny gént tartalmaz és autonóm módon nem képes replikálódni B. pertussisban. Ezért a gentamicin rezisztens, streptomicin érzékeny B. pertussis törzs csak akkor képes működni, ha a rekombináns plazmid analóg rekombinációval iktatódik be a kromoszómába. Az ilyen homológ rekombináció magában foglalhatja a toxingénhez közvetlenül kapcsolódó területeket a kromoszómában és a rekombináns plazmidot. A gentamicin rezisztens kiónokat azután 400 /ug/ml streptomicint tartalmazó
BG lemezeken szélesztettük, és igy a streptomicin rezisztens B pertussis visszaütő kiónokat szelektáltuk. Néhány ilyen visszaütő k Jón megjelent a kromoszóma és a beiktatott plazmid között végbement 2. homológ rekombináció következtében. A kapott
streptomicin rezisztens törzseket a gentamicin rezisztencia elvesztésére nézve vizsgáltuk. Ezeket a kiónokat ezután Southern biot hibridizációval vizsgáltuk, Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszere szerint a pertussis toxin gén kromoszómából való elvesztésére nézve. A kapott B. pertussis törzset (a továbbiakban BRPA> használtuk arra, hogy olyan plazmidokat vezessünk be, amelyek a mutált pertussis toxin géneket tartalmazzák, igy például a 10. példában ismertetett pLAFRII eredetű plazmidokat, mint például a pRIT13268. Miután a plazmidokat bevezettük, a kapott B. pertussis BPRA (pRIT13268) törzset használtuk mutált pertussis toxin termelésére. Más módon a plazmidok bevezetése után a kapott B. pertussis törzs alkalmazható teljes sejt vakcinákban. Az ilyen teljes sejt vakcinákat ismert módszerekkel állíthatjuk elő.
13. példa
Egyszeres vagy kétszeres mutációt tartalmazó pertussis toxin gének kifejezése Bordetella pertussisban A 12. példa szerinti módon előállított BPRA törzset, az olyan Bordetella pertussis törzset, amelybena pertussis toxin strukturális gén törölve van, alkalmaztuk olyan plazmidok befogadó törzseként, amelyek a pLAFRII plazmidból származnak. A pLAFRII plazmidot a 10. példában ismertettük. A pLAFRII eredetű plazmidok a pertussis toxin gént vagy egyszeres vagy kétszeres mutációval tartalmazták. Az egyszeres mutáció vagy Trp-26 törlésében vagy helyettesítésében, vagy a Glu-129 (azaz a pertussis toxin kódoló szekvencia SÍ alegysége 129-es aminosav helyzetében levő glutaminsav törlésében vagy helyettesítésében mutatkozott. Megjegyzendő, hogy a Glu-129-ről szintén kimutat♦ ··
- 17 ták, hogy pertussis toxin enzimaktivitásában szerepet játszik (lásd Pizza és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA:85, 7521-7525 (1988)). A kétszeresen mutált pLAFRII eredetű plazmidok Trp-26 törlést és/vagy Glu-129 törlést (pRIT1327O plazmid) vagy a Glu-129 aspartin savra (Asp) történt helyettesítést tartalmazzák (pRIT13271 plazmid). A genetikai manipulációkat klasszikus szubklónozó módszerekkel végeztük a Maniatis és munkatársai idézett helyen ismertetett módszerei szerint. A helyre irányuló mutagenezist Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system (Amersham International plc., Amersham United Kingdom, kódszám RPN2322) alkalmazásával végeztük, ahogyan ezt az 5. példában a Trp-26 mutáció esetére leírtuk. Mutagenezis után minden mutáns DNS-szekvenciáját meghatároztuk Sanger és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) idézett hely) módszer szerint. A különböző mutációkkal rendelkező pertussis toxin géneket tartalmazó, pLAFRII eredetű plazmidokat E. coli SM10 törzsbe transzformáltuk, majd a befogadó B. pertussis törzsbe konjugáltuk a 10. példa szerinti módszerrel, azzal az eltéréssel, hogy ebben az esetben a B. pertussis befogadó törzs a BPRA volt, az a törzs, amelyben a kromoszomális pertussis toxin struktur gént a 12. példa szerinti módon töröltük. A B. pertussis konjugátumokat Western biot analízissel vizsgáltuk a 10. példa szerinti módon, a pertussis toxin jelenlétére.
A mutált toxint azután összevetettük a tisztított pertussis toxinnal (List Biological Laboratories, Campbell, California) vad tipusu pertussis toxinra nézve a B. pertussis Tohama I felüluszó frakciójában, és abban a B. pertussis felüluszó frakciójában, amelyben a kromoszomális toxin gént töröltük. A vizsgálatokat a ···· • ·· · • ···· ♦ ·« • ···· kifejtett biológiai hogy 3 ng tisztított citotoxikus csomóso- 38 a 11. példa szerinti módon a CHO sejtekre aktivitás alapján végeztük. Megfigyeltük, pertussis toxin a CHO sejtek szignifikáns dását okozta, ez a morfológiai változás szintén megfigyelhető volt, amikor a B. pertussis Tohama I tenyészetének felüluszóját vizsgáltuk. Ezzel szemben a mutáns toxinokat tartalmazó felüluszó tenyészetek csak háttér CHO sejt citotoxicitást indukáltak. Kvantitatív vizsgálatokban a mutáns toxinok legalább 500-szorosan kevésbé voltak toxikusak, mint a vad tipusu pertussis toxin.
Claims (13)
- Szabadalmi igénypontok1. Bordetella pertussis toxin kódoló szekvencia, amely teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz, feltételezve, hogy (a) az SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradék módosítását tartalmazza, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve inaktivált SÍ enzimaktivitást eredményez a proteinnél, amelyet a B. pertussis toxin kódoló szekvencia kódol, de a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy anti-pertussis toxin antitestek által felismerhető.
- 2. Az 1. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy teljes Bordetella pertussis toxin operon aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz.
- 3. Az 1. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy csonkitottt Bordetella pertussis toxin operont tartalmaz.
- 4. Az 1. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy csak SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz.
- 5. Az 1. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy az SÍ alegység aminosav kódoló szekvencia csak egy csonkított részét tartalmazza.
- 6. Az 5. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy az SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciának csak a 2-187. aminosavát tartalmazza.
- 7. Az 1. igénypont szerinti 8. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy további legalább egy más kó• · doló szekvenciát tartalmaz.
- 8. A 7. igénypont szerinti 8. pertussis toxin kódoló szek- vencia, amelyre jellemző a következő kódoló szekvencia:
ATG ACC ATG ATT ACG ATT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT (Met) Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Gly Asp béta-galaktozidáz polilinker 2 SÍ CCT CCC GCC ACC G]A .... .. GTA GCG TCG ATC CTC TAG Pro Pro Alá Thr Val .... .. Val Alá Ser Ile Leu Stop 3 4 5 6 7 184 185 186 187 polilinker SÍ - 9. Az 1. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy az SÍ alegység kódoló szekvenciában további aminosav maradék módosítását tartalmazza, feltételezve, hogy a B. pertussis toxin kódoló szekvencia által kódolt protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy anti-pertussis toxin antitestek által felismerhető.
- 10. A 9. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekven- cia, azzal jellemezve, hogy a további módosítást az SÍ alegység kódoló szekvencia 129-es aminosav helyzetében levő glutaminsav maradékával (Glu-129); az SÍ alegység kódoló szekvencia 35-ös aminosav helyzeténél levő hisztidin maradékánál (His-35); az SÍ alegység kódoló szekvencia 9-es aminosav helyzeténél levő arginin maradékánál (Arg-9) vagy az SÍ alegység kódoló szekvencia 40-es aminosav helyzeténél levő szerin maradékánál (Ser-40) tartalmazza.
- 11. A 10. igénypont szerinti B. pertussis toxin kódoló szekvencia, azzal jellemezve, hogy a további módosítást a 129-es aminosav helyzetű glutaminsav maradéknál
- 12. Rekombináns DNS molekula, amely bármelyike szerinti Bordetella pertussis ciát tartalmazza.
- 13. Rekombináns DNS plazmid, azzal tartalmazza.az 1-11. igénypontok toxin kódoló szekvenjellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazza operatív kapcsolatban alkalmas expressziós kontrollszekvenciával.
14. A 13. igénypont szerinti rekombiná ns DNS plazmid, amely nek jele PRIT20002. 15. A 13. igénypont szerinti rekombiná ns DNS plazmid, amely nek jele PRIT20008. 16. A 13. igénypont szerinti rekombináns DNS plazmid, amely nek jele PRIT3070. 17. A 13. igénypont szerinti rekombiná ns DNS plazmid, amely nek jele pRIT13268. 18. A 13. igénypont szerinti rekombiná ns DNS plazmid, amely nek jele pRIT13269. 19. A 13. igénypont szerinti rekombiná ns DNS plazmid, amely nek jele PRIT13270. 20. A 13. igénypont szerinti rekombináns DNS plazmid, amely nek jele PRIT13271. 21. Gazdasejt, amely a 13. igénypont szerinti plazmiddal van transzformálva. 22. A 21. igénypont szerinti gazdasejt, amelynek jele BPRA. 23. Protein, amelyet az 1-11 . igénypontok bármelyike sze- rinti kódoló szekvencia kódolhat.24. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti szekvencia által kódolt pro• · · ·· ·· ·· · · · ··· • · · · · · • · ··· ·« · · tein immunprotektiv és nem toxikus mennyiségét a vakcinagyártásban szokásos módszerekkel vakcinává alakítjuk.25. Eljárás transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a kívánt gazdasejtet az 1. igénypont szerinti kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS plazmiddal transzformáljuk.26. Eljárás protein előállítására, amelyet olyan Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia kódol, amely teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz, feltételezve, hogy (a) a SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradéknál módosítást tartalmaz, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve inaktivált SÍ enzimaktivitást eredményez a protein esetén, amelyet a B. pertussis toxin operon aminosav kódoló szekvencia kódol, azonban a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy anti-pertussis toxin antitestek által felismerhető, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti rekombin áis DNS kódoló szekvenciát tartalmazó rekombin áns DNS plazmiddal transzformált gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztünk, és a termelt proteint izoláljuk.27. Eljárás protein előállítására, amelyet Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia kódol, amely teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmaz, feltételezve, hogy (a) a SÍ alegység kódoló szekvencia a 26-os aminosav helyzetben található tripto fán maradék módosítását tartalmazza, és (b) a Trp-26 módosítás lényegében véve inaktivált SÍ enzimaktivitást eredményez a B. pertussis toxin operon aminosav kódoló szekvencia által kódolt proteinnél, • ·· · ·* ·· ·· · · ·· · ·· · • ·· ·· ··«· • · · « · · · • * · ·· ·· · ·· ·· de a protein megtartja azt a tulajdonságát, hogy anti-pertussis toxin antitestek által felismerhető, azzal jellemezve, hogy (i) natív B. pertussis DNS-ből izolált vagy szintetikus vagy rekombináns DNS-technikával előállított Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvenciát, amely a teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciáját tartalmazza, feltételezve, hogy az SÍ alegység kódoló szekvencia még nem tartalmaz módosítást a 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradéknál, helyre irányuló mutagenezissel, triptofán módosító kémiai reagenssel vagy fotooxidációs utón kezelünk, a kapott, 26-os aminosav helyzetben levő triptofán maradék módosítását vagy törlését tartalmazó kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal gazdasejtet transzformálunk a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegben tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk, vagy (ii) natív B. pertussis DNS-ből izolálással vagy szintetikus vagy rekombináns DNS-technikával előállított, teljes vagy csonkított B. pertussis toxin SÍ alegység aminosav kódoló szekvenciát tartalmazó Bordetella pertussis toxin aminosav kódoló szekvencia SÍ alegysége 26-os aminosav helyzetében levő triptofán maradékot töröljük, vagy helyettesítjük egy másik aminosavval, a kapott kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal egy kívánt gazdasejtet transzformálunk, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk, vagy (iii) ilyen kódoló szekvenciát állítunk elő szintetikus módszerekkel, a kapott kódoló szekvenciát tartalmazó plazmiddal kívánt gazdasejtet transzformálunk, a kapott gazdasejtet alkalmas tenyészközegen tenyésztjük, és a termelt proteint izoláljuk.28. Bordetella pertussis törzs, amely inaktivált kromoszomális pertussis toxin gént, továbbá az 1. igénypont szerinti kódoló szekvenciát tartalmazza.29. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hegy a 28. igénypont szerinti törzs immunprotektiv és nemtoxikus mennyiségét a vakcinakészitésben szokásos módon vakcinává alakítjuk.30. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 27. igénypont szerinti eljárással előállított protein immunprotektiv és nemtoxikus mennyiségét a vakcinakészitésben szokásos módon vakcinává alakítjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22299188A | 1988-07-22 | 1988-07-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT52701A true HUT52701A (en) | 1990-08-28 |
Family
ID=22834543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU893683A HUT52701A (en) | 1988-07-22 | 1989-07-20 | Process for producing vaccine of bordetella pertussis |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0352250B1 (hu) |
| JP (1) | JP2798986B2 (hu) |
| KR (1) | KR900001852A (hu) |
| AP (1) | AP8900132A0 (hu) |
| AT (1) | ATE142697T1 (hu) |
| AU (1) | AU3827089A (hu) |
| DE (1) | DE68927144T2 (hu) |
| DK (1) | DK355789A (hu) |
| FI (1) | FI893512A (hu) |
| HK (1) | HK1004568A1 (hu) |
| HU (1) | HUT52701A (hu) |
| IL (1) | IL90994A0 (hu) |
| NO (1) | NO892997L (hu) |
| NZ (1) | NZ229954A (hu) |
| OA (1) | OA10038A (hu) |
| PT (1) | PT91248A (hu) |
| ZA (1) | ZA895573B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0296765B1 (en) * | 1987-06-24 | 1994-06-08 | Teijin Limited | Bordetella pertussis variants |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| EP0396964B1 (en) * | 1989-04-28 | 1995-09-06 | SCLAVO S.p.A. | Pertussis toxin mutants, bordetella strains capable of producing such mutants and their use in the development of antipertussis vaccines |
| US5786189A (en) * | 1989-11-29 | 1998-07-28 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine |
| ATE143692T1 (de) * | 1989-11-29 | 1996-10-15 | Smithkline Beecham Biolog | Neuer impfstoff |
| IT1248735B (it) * | 1990-06-21 | 1995-01-26 | Sclavo Spa | Vaccini acellulari contro la pertosse |
| DE69434000T3 (de) * | 1993-10-05 | 2008-11-06 | UCB Pharma Ltd., Slough | Impfstoffzusammensetzungen |
| US20030072774A1 (en) * | 1994-06-10 | 2003-04-17 | Diane M. Gajewczyk | Proteinaceous adjuvants |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340373C (en) * | 1986-01-28 | 1999-02-02 | Rino Rappuoli | Cloning and sequencing of the dna fragment which codes for the five subunits of the pertussis toxin, a hybrid plasmid containing the dna fragment and micro-organisms transformed by the hybrid plasmid and capable of expressing all or some of the subunits of the pertussis toxin |
| US4762710A (en) * | 1986-06-16 | 1988-08-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Novel method of preparing toxoid by oxidation and metal ions |
| IT1223334B (it) * | 1987-11-02 | 1990-09-19 | Sclavo Spa | Polipeptidi immunologicamente attivi con una tossicita' alterata utili per la preparazione di un vaccino antipertosse |
| GB8727489D0 (en) * | 1987-11-24 | 1987-12-23 | Connaught Lab | Detoxification of pertussis toxin |
| EP0396964B1 (en) * | 1989-04-28 | 1995-09-06 | SCLAVO S.p.A. | Pertussis toxin mutants, bordetella strains capable of producing such mutants and their use in the development of antipertussis vaccines |
-
1989
- 1989-07-14 AP APAP/P/1989/000132A patent/AP8900132A0/en unknown
- 1989-07-17 NZ NZ229954A patent/NZ229954A/xx unknown
- 1989-07-17 IL IL90994A patent/IL90994A0/xx unknown
- 1989-07-17 OA OA59614A patent/OA10038A/en unknown
- 1989-07-18 DK DK355789A patent/DK355789A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-07-19 JP JP1187238A patent/JP2798986B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-19 AU AU38270/89A patent/AU3827089A/en not_active Abandoned
- 1989-07-19 KR KR1019890010219A patent/KR900001852A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-07-20 AT AT89870113T patent/ATE142697T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-07-20 HU HU893683A patent/HUT52701A/hu unknown
- 1989-07-20 DE DE68927144T patent/DE68927144T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-20 FI FI893512A patent/FI893512A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-07-20 EP EP89870113A patent/EP0352250B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-21 NO NO89892997A patent/NO892997L/no unknown
- 1989-07-21 PT PT91248A patent/PT91248A/pt unknown
- 1989-07-21 ZA ZA895573A patent/ZA895573B/xx unknown
-
1998
- 1998-04-28 HK HK98103613A patent/HK1004568A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA895573B (en) | 1990-07-25 |
| PT91248A (pt) | 1990-02-08 |
| AU3827089A (en) | 1990-01-25 |
| DK355789A (da) | 1990-01-23 |
| HK1004568A1 (en) | 1998-11-27 |
| AP8900132A0 (en) | 1991-01-14 |
| DE68927144D1 (de) | 1996-10-17 |
| EP0352250A2 (en) | 1990-01-24 |
| NZ229954A (en) | 1992-09-25 |
| NO892997L (no) | 1990-01-23 |
| IL90994A0 (en) | 1990-02-09 |
| JPH0284183A (ja) | 1990-03-26 |
| JP2798986B2 (ja) | 1998-09-17 |
| NO892997D0 (no) | 1989-07-21 |
| FI893512A0 (fi) | 1989-07-20 |
| EP0352250A3 (en) | 1990-11-14 |
| DE68927144T2 (de) | 1997-03-20 |
| DK355789D0 (da) | 1989-07-18 |
| KR900001852A (ko) | 1990-02-27 |
| ATE142697T1 (de) | 1996-09-15 |
| EP0352250B1 (en) | 1996-09-11 |
| FI893512A (fi) | 1990-01-23 |
| OA10038A (en) | 1996-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6040427A (en) | Vaccine | |
| CA1341591C (en) | Detoxification of pertussis toxin | |
| Vodkin et al. | A heat shock operon in Coxiella burnetti produces a major antigen homologous to a protein in both mycobacteria and Escherichia coli | |
| Burnette et al. | Direct expression of Bordetelia pertussis toxin subunits to high levels in Escherichia coli | |
| CA1338705C (en) | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes | |
| CA2138970A1 (en) | Membrane-associated immunogens of mycobacteria | |
| US5358868A (en) | Genetic detoxification of pertussis toxin | |
| US5244657A (en) | Genetic detoxification of pertussis toxin | |
| US5332583A (en) | Vaccine containing genetically-detoxified pertussis holotoxin | |
| CN100435845C (zh) | 抗猪胸膜肺炎的减毒活疫苗 | |
| Hausman et al. | Analysis of proteins encoded by the ptx and ptl genes of Bordetella bronchiseptica and Bordetella parapertussis | |
| EP0352250B1 (en) | Bordetella pertussis vaccine | |
| US6403306B1 (en) | Serogroup-specific nucleotide sequences in the molecular typing of bacterial isolates and the preparation of vaccines thereto | |
| US6309648B1 (en) | Protective epitopes of adenyl cyclase-haemolysin (AC-Hly), their application to the treatment or to the prevention of bordetella infections | |
| JPH10510984A (ja) | 無細胞性抗ボルデテラワクチン | |
| US7211263B2 (en) | Use of adenylate cyclase or bacteria producing it as vaccines against Bordetella | |
| EP0502016B1 (en) | Novel vaccine | |
| EP1180119B1 (en) | Recombinant haemophilus influenzae adhesin proteins | |
| AU739191B2 (en) | Vaccines containing attenuated bacteria | |
| JPH1075774A (ja) | パスツレラ科の弱毒化ｒｔｘ産生細菌 | |
| Mukhopadhyay et al. | Phenotypic expression of a mannose-sensitive hemagglutinin by a Vibrio cholerae O1 E1Tor strain and evaluation of its role in intestinal adherence and colonization | |
| US7785609B1 (en) | Recombinant Haemophilus influenzae adhesin proteins | |
| GB2400558A (en) | Passive immunisation against Bacillus anthracis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |