HU229196B1 - Lung tissue model - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya egy tervezetten kialakított, szöveti vázszerkezet nélküli, háromdimenziós modell-tüdőszövet-tenyészet, amely minden mesterséges vázszerkezettől mentes. Egészséges és kóros tüdőszövet háromdimenziós modelljét egyaránt feltárják. A találmány szerinti termék forgalmazható például szövettenyészetek, szövettenyészeteket tartalmazó lemezek és elrendezések, vagy készletek formájában. A találmány felhasználható az orvosi és természettudományos kutatásban, vegyületek tüdőszövetre kifejtett hatásának tesztelésében, gyógyszerek, gyógyszerjelölt molekulák szkrínelésében, tesztelésében és értékelésében, és — bizonyos esetekben — tüdőbetegségek diagnosztizálásában.

Description

A. TALÁLMÁNY SZAKTERÜLETE lelett találmány tárgyát egy tervezetten kialakított („englneered), háromdimenziós tüdömodell-szöveu tenyészet képezi, amely bármilyen mesterséges vázszerkezettől mentes. Egészséges és kóros, háromdimenziós lüdöszövetmodellek. egyaránt rendelkezésre állnak. ,A találmány szerinti termék piacra vihető például szövettenyészetek, vagy a szövettettyészeteke; tartalmazó lestelek („plate”), elrendezések („atray) vagy készletek (,.klt-ek) termájában, A találmány felhasználható az orvosi és természettudományos kutatásban, vegyületek iődőszövetre kíféjtett hatásának. tesztelésében, gyógyszerek, győgyszerjelölt molekulák kiválasztásában (Yereening’), tesztelésében és értékelésében, és ··- bizonyos esetekben - tüdőbetegségek diagnosztizálásában.

A TECHNIKA ÁLLÁSA

A szövettervezés („tsssue engineering’i az orvoshiológiai kutatások egyik gyorsan fejlődő területe, melynek célja a károsodott szövetek korrekciója, pótlása vagy referálása, A közelmúltbeli katasztrofális kírumetelü Π. fázisú klinikai gyögyszerktsérletek (pl. TÖN 1412} eredményeképpen további célként Jetet meg a gyógy15 szeripari vegyületek biztonságának és hatékonyságának tesztelésére alkalmas humán szövetmodeliek kifejtesztése. A szövettervezés általában, és a mi modellünk különösen, a biológiai morfogenezist használja ki, ami az önszerveződés egy példája,

A sejt- és szövehervezést („ceil and tiwe engineering'') manapság többféle megközelítésből művelik. Egyfelől arra használják, hogy mélyebb betekintést nyerjenek a sejtbiológiába és fiziológiába.

A szöveítervezést kutatásokban két irány áll fejlesztés alatt: A szöveti vázszerkezeteit alapuló és a szöveti vázszerkezettői mentes rendszerek. Atsig a vázszerkezeten alapuló rendszerek többnyire biológiailag lebontható vázszerkezetet használnak arra, hogy mesterséges háromdimenziós szerkezetet alakítsanak ki a sejtek közötti kölcsönhatások kialakulásának elősegítésére, addig a vázszerkezet nélküli rendszerek megengedik, hogy a sejtek szabadon alakíthassák ki kölcsönhatásaikat és a saját maguk által szekretált vázartyagon megtelepedve osztőd25 janak.

Az US 2081/8855S04 Al számú irat (A humán preneoplasztikus: emlöbetegség háromdimenziós fe vitro modellje) egy háromdimenziós fe vítn? sejtkultúrarendszert ir le, amely hasznosítható a humán prerteogiasztíkus enrlöbeiegség gyógyításában alkalmazható gyógyszerjelölt molekulák tesztelésében. Az említett modellt emlöeredetü preneoplasztikus eplthelium, enöotheiium és emlöbbroblasfok ko-kalfúrájával állították elő, egy rekons30 büsált alspmembrárton, további adalékanyagokkal (növekedési faktorok, ösztrogének stb.) ellátott tápközegben. Ebben a rendszerben tehát egy alapmemhrán, előnyősén MatrigslR használatos szöveti vázszerkezetként. A leírás szerűit mintegy 3-7' napon belül elágazó, dncfalis aiveoiaris egységek érhálózata képződik a rendszerben,

A rendszer az. emlővel és nem a tüdővel kapcsolatos, és leírásban nincs «tolás tüdőtenyészet IétrehozásáΓ'3<.

Az US 2003/81119938 számú iratban {tervezetten kialakított állati szőve;) leírják, hogy mikrovaszkoláris endotbeliumot nyertek felnőtt tüdőből és azt homárt böreredetű bbroblastok két rétege közé helyeztek, amelyek háromdimenziós kollagén gélbe voltak ágyazva. így tehát egy szendvics-szerű szerkezet keletkezeit.

Noha a vaseularis endotheliails sejtek fudőcredetöek voltak, a módszerrel előállítod mesterséges szövet a hantán bőrre hasonlítod, ezért a leírt rendszer nem tekinthető tüdöszővetmodellnök.

4b Az US Nlük/b i Ufedb számú iratban «'Magzati tüdőseitek és íelhasznáíásuk; egy 313 szőveíszerü preparaU18203-15773E SG/LZs φφ ΦΦΦ* trnnot tárnak tel, melyet egér embrionális eplíheúuru, endoíhelíum és mesenehyma· aejijesböl aiütötrak eíó.. A szerzők embrionális·-egérsejtekeí használtak, a célból, hogy tüdőprotézist fejlesszenek. ki, és· hogy gyógyszerekül: vegyületeket azonosítsanak (screenmg·). Mátrixként egy hydrogéit, a MATRJGEt^TM-t használták a megfeieíö sejt-sejt kölesönhalásök .-kialakításának elősegítésére. A bírásból kitűnik, hogy a ko-kultúrában a fibroblsst-ok túlszaporndták az· spitheilumsejteket.

A WO2ŐÖ8/1Ö0555 jelű közzétételi irat (Tervezetten kialakított tödöszövet előállítása nagyteljesítményű toxlcítási szfcrístelés és gyógy vzerfei fedezés céljára) olyan (üdószevetmodellre vonatkozik, amely embrionális tüíiösejieket, biológiailag lebontható anyagból készük vázszerkezetet, és előnyösen, fibroblast növekedési faktort tartalmaz. A magzati tüdősejtek: epithelialls, eodoAeliaiis és mescnebymalis sejtek, Felsorolnak benne került számos alkalmazható biokompatibilis· anyagot is.

A WO2ÖÖ4/046322 („Repiicaúon of bioiogicai rtssus) iratban egy mesterséges háromdimenziós szövet előállítására tesznek javaslatai mikrogravitáesós környezetben.. A szövet barnán mellráksejteken alapol és rnellráhnodeilként használható. Egy forgó hioreaktor-kamrában először kötőszövet? sejteket tenyésztenek háromdimenziós szfesreió síraktdrák kialakulásáig, majd - ebben a sorrendben· - eadotfeeiiaiis és epiffeeliaiís sejteket

1S adnak a tenyészethez. Meg. kell jegyeznünk, hogy a· kitanísás elméleti, és miközben megadnak protokollokat a sejtek tenyésztésére és a tenyészetek kezelésére, tényleges kísérleti eredményeket nem tárnak tel.

Vertrees, RA, Zsvisshenberger, 3B és munkatársai (2ÖÖ8) egy jól dokumentált immortaiízált tüdő epithehalís sejtvonalat használtak hagyományos egyrétegű (monolayer (ML)) kultúrában, vaiatnint 3D költúrákbsn, forgó- falú tenyészedényekben. Ezeket a tenyészeteket összehasonlították paciensektől sebészeti úton nyert fcont20 rollszövetmintákkal a differenciálódás mértéke és markerek expressziója. tekintetében. A szerzők célja az: volt, hogy mind hagyományos egyrétegű {fnoKolayeri,. mind 3D kultúrákat fejlesszenek ki egy Ismert sejt vonalból.

A közelmúltban Kelly BéruBé és munkatársai kifejlesztették a humán tüdőepitfcelmm egy háromdimenziós, tervezetten kialakított szöveti modelljét, biztonságossági tesztek céljára. Ehhez normál humán broschialis epdheiiaiis sejteket (NHBE) használtak. Humán primer sejteket tenyésztettek mitopórusos membrános, hogy

3Ό sejtkultárát nyerjenek.. A 3D kultúrákban lévő -sejtek között szoros kapcsolatok, (..íight junction”) alakultak ki, csillós sejtek jelentek meg, más sejtek nyálkát termeitek és szekretáltak. Ezek a jellemzők nagyon ísasonKlanak a natív humán légzőszerv! epithelialls szövet jellemzőire, és feltételezhető, hogy pontosan utánozzák a szövetkárosodásra· adott választ az: emberi szervezetben.. Valójában a tenyészet vastag sejtréteget alkot, amely a nyálkahártyák felszínét .modellezi. (Hoghes Traey és mtsai.. 2ÖO7j

A tüdőmoáelfek gazdag irodalma elleném úgy tűnik, a technika állása csak szövet i vázszerkezet alapú 3D modeiiekrél számol be, egyszerű, szöveti vázszerkezet nélküli tüdőszövetmodeliek, amelyekben legalább epithelialis sejtek és Iibroblasíok találhatók, egyelőre nincsenek.

Meglepetésünkre azt tapasztaltuk, hogy egyszerű biokémiai módszerekkel gyors eljárással létrehozható egy szöveti vázszerkezet nélküli tűdőszövetmíjdeii-rendszer, mely több szempontból kedvezőbb, mint a kétdi35 menziós és a mátrixon ftérháióni alapú rendszerek. A találmány tárgyat olyan modellszövet képezi, mely felhasználásra kész különböző tesztekben. A modell alkalmas sejt-sejt kölcsönhatások vizsgálatára .különböző tüdöszövetekben, .a normál Rmfcclő és kóros folyamatok szimulálására.

Λ TALÁLMÁNY RÖVID ISMERTETÉSE

A találmány tárgyát egy tervezetten kktlakitott, háromdimenziós tüdőmodeil-szövettenyószet képezi, ró amely modeli-szövettenyeszet • ο a) mentes bármilyen mesterséges szöveti vázszerkezettől,

b) tenyésztett sejtek alkopák, vagy tenyésztett sejtes anyagot tartalmaz, amelyben a sejtek közvetlen sejt-sejt kölesötihatásban állnak a szöveti anyag egy vagy több egyéb sejttípusával..

c> legalább pulmonails epsfeelislis és mesenchymafis, előnyösen pulmonalis mcsenchymahs sejteket, előnyösen 5 fibroblast sejteket tartalmaz, és a puhnonalis epríhelialls sejtek és a mesenchymaits sejtek aránya legalább :ő, előnyösen legalább 1 :3, és legfeljebb ó: 1, előnyösen legfeljebb 3:1.

d) morfológiailag, egy vagy több sojíaggregátumoí tartalmaz, ahol az aggregátumok felszíne pulmunalis epiíheilalis sejtekben dúsait, vagy ahol a ptáraonaíis epithebalis sejtek és a meseneiivmaíis sejtek, előnyösen őhroblastök, legalább részlegesen szegregálódnak az említett aggregátumokban, és e j ahol az eplthsllaiis sejtek epíthehaSis diiferenclúlódási markereket exprcsszálnak,

a) Egy előnyös megvalósítási módban a leirt modell- szövettenyészet mentes bármilyen, a 30 szerkezet biztosítására szolgáló mesterséges vázszerkezettől. Egy megvalósítási módban a modeH-szövetteayészet mentes bármilyen mesterséges, akár biológiailag lebontható akár nem lebontható vázszerkezettől, pt pórusos, háramdírnenzíós mátrixtól, hár&íudímenzsós géSmáíríxíől. Sgy megvalósítási módban a modelí-szövettenyészet tnen15 tes bármilyen mikropörnsos támasztó membrántól.

b) Egy előnyös megvalósítási módban az említett modell-szövettenyészet extraceiíoiárís mátrixot is tartalmaz, az extracelioláris mátrix fehérjéit az adott szövetei alkotó valamelyik sejttípus szekretálja, előnyösen a ísbroblasi..

c) További előnyős megvalósítási módokban: legalább egy jelen van a következő tüdő epltheilalís sejttt20 pusokbók

-1. típusú pseumoclták (alveolar íyps 1 cclls {ATí)]

- li. típusú pnoumocitak | alveolar type fi cella iATII)}

Előnyösen, az einbtett: fi, típusú pnsnmoclíák (alveoláris epithelium sejtek ATI! jellemzőkkel) egyet vagy többet exsresszálnak a következő msrkerekbök TTFl transzkripciós faktor, felületaktív protein A (SFPA), felületaktív protein C fSFPCj, .aquxporiri 3 (AQP3

Előnyösen, az említett 1. típusú pneumociták (alveoláris epltheliam sejtek ATI jellemzőkkel) egyet vagy többet expresszálnak a következő markerekbők TTF1 transzkripciós faktor, Aquaporin 3 (AQP 3), Aquaporin 4 (AQF 4) és aqoaporln 5 (AQ? S),

Előnyös további megvalósítást módok szerint puimonalís epiíheilalis sejtek és pulmonalis üresen3 Ö ehymalis sejtek legalább egyike jelen van a modellben.

Előnyösen, a sejtek, kétéltű-, hüllő-, madár-, vagy előnyösebben emlős eredetűek.

A madársejtek előnyösen: baromfi eredetű füdösejtek.

Az emlőssejtek előnyösen növényevő átlátok sejtjei, előnyösen tenyészted növényevőkből .származnak, pl. juh, kecske, szarvasmarha, vagy rágcsáló, pl, nyúl, egér vagy patkány sejtjei:. További előnyős mlössejtek a

5 mindenevők, pl, a sertés sejtjei. A nagyon előnyös sejtek a humán sejtek.

További megvalósítási módokban a fiídő epítheliails és/vagy a mesenehytnoíis sejtek forrása a kővetkező:

- megállapodott aejtvonuink,. előnyösen kereskedelmi forrásokból

- egészséges donorok ii) · beteg donoruk.

♦ ♦ * * 4 4 4«

4 4

Egy előnyös megvalósítási mód szerint a sejtek primer sejtek,. Egy előnyös megvalósítási mád szerint a sejtek nem dedifferenciák sejtek vagy csak részben dsálfferencíált sejtek.

Egy további megvalósítási mód szerint a sejtek dedifferenciált sejtek, vagy olyan sejtek, amelyek 3D modelbszöveKenyészePé történő tenyésztésük előtt lették dedlíferenciáltatva.

Egy előnyös megvalósítási módban a tüáb epltbeiialis sejtek kis légüti epilkeií al is sejtek, előnyösen ATÍ1 jellemzőkkel.

Egy további előnyös megvalósítás! mód szerint -a találmány szerinti modell-szővettenyészet endothetíalis sejteket is tartalmaz. Egy előnyős megvalósítási mód szerint az endothelialis sejtek HMVEC vagy HUVEC-sejíek.

í) Adott esetben s találmány szerinti modeli-szövettenyészet tartalmazhat további sejttípusokba- tartozó sejteket, igy makföfógökat, hízósejteket, simalsotn sejteket,

d) Egy előnyös megvalósítási· módban sz aggregátumok átlagos átnxéröje vagy tipikus átmérője legalább 10 -um, 40 pm, Sö pm, 80 pro, löötim vagy 120 pm és az aggregátumok átlagos átmérője vagy tipikus átmérője legfeljebb 1008 ym, §00 pfn, Ő00 «m, 500 um, 408 pm vagy 300 pnt,

Nagyon előnyös, ha .az aggregátumok átlagos vagy tipikus átmérője 100-300 ym, egy előnyös megvalósítási módban kb, 280 pm.

Az aggregátumok átlagos mérete meghatározható és számítható vagy becsülhető -bármely kísérletileg, és matematikailag korrekt módszerrel. Míg az aggregátumok lényegében alakjukat tekintve szférikusok,, egyértelmű, hogy minden egyes aggregátumhoz több átmérő határozható meg a pontos gömb alaktól való eltérés miatt és az aggregátumnak a mérés során felveti helyzetétől függőé», továbbá a mérés! módszertől függően. Például a legkisebb és legnagyobb átmérőt közvetlenül megmérhetjük mikroszkópban több aggregátum, méretét megmérve és átlagolva. Célszerűen mikroszkópot használunk ehhez a feladathoz.

Egy előnyös megvalósítási -mód szerint az aggregátumok többségének, előnyösen legalább ő0%-a, 78%-a, 80%-a vagy 90%~ának .az átmérője legalább '10 pm, 40pro, 60 unt, 80 pm, íÖ8 pm vagy 128 pmés az átmé25 rője legfeljebb 1000 pm, 800 pm, 688 pm, 50Ö pm, 400 pm vagy 300 pm, nagyon előnyösen az aggregátumok fent! arányának átmérője 10O-3OÜ pm, egy -előnyős megvalósítási mód szerint mintegy 20ö pm.

Egy előnyős megvalósítási mód szerint a tenyészet minden egyes aggregátumban vagy egy készlet minden tartályában a kővetkező mennyiségben tartalmaz sejteket:

legalább 10^J, előnyösen legalább 10*. előnyösebben legalább-2x10*, 3x10*, 4x10, 5.x ΙΟ* sejk ós

3-0 legfeljebb 10\ előnyösebben legfeljebb 5x 10, 4x 10'ζ. 3χ· 10^Λ, 2x1 θ’ vagy legfeljebb 10⁵ sejt.

Egy előnyös megvalósítási módban a tüdő epiíhellum sejtek és a tiferoblastok különböző felületi feszültségüknek köszönhetőét) -szegregálódnak. Előnyösen, a tüdőepttheltum-sejrek többsége az aggregátum felületén helyezkedik el.

Előnyösen, a tűdőeredetü epithe&lis sejtek többsége az aggregátum felszínén. íűdöeplíheiiurtssejí-réíegef

5 alkot, előnyösen az említett tüdőeplíheíiumsejt-réteg legalább részben beborítja az aggregátum felszít tét.

Egy to vábbi megvalósítási -mód szerint az aggregátumok endothehalis sejteket ís tartalmaznak.

Egy előnyös. megvalósítási mód szerint az üadotiseíialis sejtek aránya -összehasonlítva az eplfbetialis és íibrobíast sejtekkel, tnagasabb az aggregátumok közepén vagy központi régiójában, mint sz aggregátumok felszínén, vagy .az. endothdialis sejtek, aránya növekszik az. aggregátumok felszínétől kiindulva az aggregátumok középpontjáig.

* «φφ ··-♦ ♦-··

Egy előnyős megvalósítási mód szerint az aggregátumoknak réteges szerkezete van. amelyben egy mag vagy központi régió legnagyobb arányban endotheílalis sejteket tartalmaz, a köztes réteg vagy régió legnagyobb arányban fíbrobiastokat tartalma·?, és az aggregátumok külső vsgy felszíni rétege legnagyobb arányban epitbellalis sejteket tartalmaz.

e> Egy előnyös megvalósítási módban a tervezetten kialakított, 313 íPdöntodellszöveí sejtjeinek felületén a következő epitbelialls differenciálódási markerek közül legalább egy vagy több expresszálódtk:

- ATH típusú differenciálódási markelek, előnyösen TTFÍ transzkripciós fáctor, cltokeratin 7 (K.RT7), felületaktív protein A fesorfecmm protein A, SFFAj, felüfetalótv protein C („suríaetant protein C”, SFFC), aquaporin 3 t AQP 3) és/vagy

- ATI típusú differenciálódási tnarkerek, előnyösen aquaporin 4 (AQF 4) és aquaporin 5 (AQP5).

Az expresszálí markerek függenek a szövet-tenyészetben használt sejíttpttetól is. Bármely marker szintje detektálható taRNS- vagy fehérjeszinten. így a marker szintié lehet mRNS-sziíü: -és/vagy fehérje-sóst. Előnyösen a találmány szerinti modell szövettenyész^ben legalább az AQP3 és a SF'FPA szintié növekszik, azaz felfelé- reguláinak egy kontroll 2G tenyészettel összsbasortlttva.

Előnyösen a találmány szerinti modell szővsttenyészetben legalább egy, a következők közül választott gyulladásos marker lefelé reguláit: H./lb, ILő és CXCLS, azaz szintjük csökkent 3D tenyésztési körüiméayek között kontroli 2D tenyészettel összehasonlítva.

Előnyösen a találmány szerinti modell szövettenyészetben sz S10ÖA4 és az N'-Rsdberin dediffereneíáeiős mnrkerek közöl legalább egynek a szintje csökken 213 tenyésztési körülmények között tartott, tisztított primer sejtekkel összehasonlítva, vagy kontroll 2D szóvetienyé szettel összehasonlítva,

Különböző további megvalósítási módok szerint a puimonalis epíthslíaíis sejlek és a polmonaiis mezeadtimális sejtek, legalább egyike jelen vau a moőelben, és az embrionális fejlődéssel analóg módon

- a pulmomlis epsíhellalis sejtek egy vagy több tibrolaszt növekedést faktort szekretátnak, amely-a következők közül választott: FGF4, FGF3, FGF9,

- a puimonalis- epitteltails sejtek a sejtfelszínen FGFR2b-re.ceptorokat expresszálnak,

- a puimonalis mezemen imái is sejtek, előnyösen flbroblastok, FG7F-et és FGFlö-el, valamint FGFRicés FGFR2c-receptorokat szokretáinak.

A találmány szereid szövettenyésart egy előnyős megvalósítási módjában- az ATI! típusú differenciálódási markerek és/vagy az ATI típusú differenciálódási markerek magasabb szinten expresszáfódnak, előnyöseb30 ben legalább 19 %-kal, legalább 20 %-kal vagy legalább 30 %-kal magasabb szinten espresszálódnaR mint a referenciaként hasznait kétdimenziós szövettoítórákban.

Előnyősén, az .említett epithelsalis markerek mRNS- és proteimzmtje a szöveikuitúrábars magasabb, mint a következő refeteneiakuhúrák .közöl egyben, többen vagy az összesben:

- ugyanazokból a sejttípusokból átló kétdimenziós tenyészet,

- csak tüdöeredefe epithelíalis sejtekből álló tenyészet ·· csak primer fihrobiusíseúekböi, előnyösen humán őhroblast sejtekből álló tenyészet.

Előnyösen,, az említettek közül legalább két marker expresszíójo emelkedett.

Egy előnyös megvalósítási módban kis légúti epahehalis sejteket (>,sma!i airwsy epstheiiul celfe’) alkalmazunk,

Egy további előnyös inogvaiöd-ási mohban Λ 1Ί1 jellemzőket míüató kis légúti cpitbebalis sejtek ó.smoii asrway epiihelial cells”) közül legalább néhányat alkalmazunk. Ebben az esetben az A7H típusú dilferendálóöásj -markerek, pl, a fent felsorolt ilyen toarkerek közöl egynek vagy többnek az mRNS- és proteinskio-tje megemelkedik a szövettnodeliben.

A találmányban. ismertetett, tervezetten kialakitoh, háromdimenziós modelhüdöszövet előnyöseit egy 5 vagy több gyuHMás-serkent-δ {pro-inflammatojyy eitokin és egy vagy több BMT-marker csökkent expressziőját mutatja.

Előnyösen, egy vagy több említett gyalladás-serkentó sitokin m-RNS és/vagy protein szintje a modelfezövetbea alacsonyabb, mint a kővetkező refermcxatesyészetek közül egyben, többen vagy az összesben;

· ugyanazokból a sejttípusokból álló kétdimenziós tenyészet,

11) - a csak tüőőeredetű epkhehalis sejtekből álló tenyészet, ahol az említett iüdóeredetü epltbelialis sejtek a modell szövette nyeszeihez hasonlóan kezeltek.

Előnyösen, a gyulladás-serkentő citokinek a következő csoportból választottak:

CXCL-8 gyulladás-serkentő cisokin, ILó, ILI a, 11 Ib, TNFalpba.

Egy nagyon előnyös megvalósítási mód szerint a gyulladás-serkentő kemoking a CXCL-8 kemoatírak15 tíins.

Egy előnyös mogvalőskásí mód szerint a szövettenyészet pulmonabs epjtheííalis sejteket és pulmonaiis mezenchimái'is sejteket tartalmaz, és nem tartalmaz endothciialis sejteket, ahol

- a következő markere-k közül egynek vagy többnek 2 szintje megemelkedett kontroli, sem tenyésztett sejtekhez képest: E-cad, IL-lb és/vagy ILó,

- a következő markerek közöl egynek vagy többsek a szintje csökkent egy kontroll kétdimenziós tenyészethez képest: IL-lb, CXCLS, ILö.

Egy előnyös megvalósítást mód szeriw a. modell szövetteuyészct pulmonalis epidseíiaüs sejteket, pulmonalís mezencteaálss sejteket és enáothellafis sejteket tartalmaz, ahol kővetkező markerek közül egynek vagy többnek a szintje csökkent egy, nem tenyésztett sejteket tártál25 mazó kontrolihoz képest: E-caá, N-cad;

- az E-cad szintje megemelkedett egy kontroll kétdimenziós tenyészethez képest, a kővetkező markerek közül egynek vagy többnek a szintje csökkent egy kontroll kétdimenziós tenyészethez képest; N-cad, S1Ö0A4,

Egy előnyös megvalósítási ínódban a háromdimenziós tüdőmodell-szövettenyészet a már leírtakon kívül 39 tartalmaz a következő csoportból választott sejteket ss:

ertdölheksiis sejtek, a vaszkulatúrá· imitálása érdekében, roakrofágok hízósejtek

Későbbi stádiumban a modell kiegészíthető a kővetkező sejttípusokkal:

3$ - simalzomsejtek idegsejtek &íegrégííSü<á??óíá

A találmány tárgyát képez; továbbá a föntebb definiált, tervezetten kialakított, háromdimenziós tödömodeíi-szövettényészet, amelyben

Ifi sz eohhellídis és/ vagy Itbrob lásl se Írek a beteg, tüdőre jellemző patológiás tulajdonságokkal bírnak. íniái***Φ ΧΦ«φ tál a modeli-szövettenyészet tödőbetegségmodeli-szővettenyészet.

Előnyös megvalósítási módokban a betegség lehet gyulladás, tumor, iíferözis vagy szövetsérülés, és a megfelelő tnodell-szbvettenyészelet gyoll&dásraodelmek, tomormodelinek, tibrózismodclioek vagy regeneráció modellnek tekintjük.

A betegségmtxtéll érmietr ssltjei korlátozódhatnak, de nem korlátozódnak. paciensekből nyert sejtekre (paciensek sejtjeik betegség jegyen hordozó s^jtvena-lakra, pl. -tumersejtvo=nal»k; környezeti hatásnak, pl betegség jegyeit okozó gyalíadáskeltó anyagnak kitett sejtvonalsfcra; mutagén hatásának kitett ás betegség jegyeire szelektált sejt vonalakra; genetikailag módosított sejtekre, melyek Idegen proteineket exprosszáinak, vagy amelyekben egy gén «1 vas „hallgattatva”, úgy, hogy ettől a sejt betegség jegyeit mutatja.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint a sejteket egészséges személyekből nyerjük, és beteg állapotot indukálunk besütök. Eszerint a megvalósítási mód szedni például tumor indukáiödásának szignálja vagy potenciális gyógyszercéipontok határozhatók meg.

Egy további megvalósítási mód -szerint mmormodeli-szővetet készítőnk ímmortalizálf sejtekből, például rosszindulatúan transzformálódott vagy tumoros sejtekből vagy sejtvonaiakbói.· Miközben eszerint a megv&iősí1.5 tási mód szeriül, nincs „egészséges” kontroll jelen, ez a rendszer hasznos hatóanyagok tesztelésére, miközben egy piacebo vegyüiettel érintkeztetett minta biztosit kontrollt a kezeit mániákhoz képest.

Egy megvalósítási mód szerint a tumoros sejteket egy páciensből nyerjük és egy tervezett terápia hatékonyságát tesztelhetjük. így tékát a modell-szővettettyészet személyre szabott terápia megtervezéséhez használható.

2S .fe tdőd/őrds módszere

A találmány tárgyát képezi továbbá, módszer· is az itt definiált, tervezetten kialakított, hárotsdtmenztős ttidőmodellszövet-tenyészet előállítására, ahol a módszer a kővetkező lépéseket tartalmazza:

- legalább primer fibroblastakböl és üldőeredetá epíthehalLs sejtekből álló kevert szaszpenzlőt állítunk elő,

- a kevert szuszpenziói vagy egy aliqnoiját a szuszpenziő sejtjei pelteíálásm alkalmas tartőedönybe helyezzük,

- a sejteket pelietáljuk

- a pelletált szuszpenziót CO-_; jelenlétében mköbáljuk, elegendő ideig ahhoz, hogy a sejtek celiulárís sggregáíomokat tartalmazó háromdimenziós tüdőmodellszövetet alkossanak,

- adott esetben a modell szövetben megvizsgáljuk

a) egy vagy több, a thdöszövetre speciökos epítheliaiis differenciálódást markor expres-sziőját, és a meg30 felelő, pl. itt ismertetett reíérenotakakóráhfoz képest megemelkedett expresszíos szintet a háromdimenziós tüöőmodeli-szőveUsríyőszet 'kialakulása jeleként tekintjük, és/vagy

b) egy vagy több gyulladás-serkentő citokin. expres-sziójáí, és a megfelelő, pl, itt ismertetett referenciákulSárához képest csökkent expressziós színiét a háromdimenziós tüdömodell-szövettenyészet kialakulása jeleként tekintjük.

Előnyösed, a tartóedény nem szövettenyészet-kezelt.

Előnyösen, többszörös aifquotokat helyezünk több tartősdénybe.

Előnyösen,, a taríöedéttyek lemezben (..piaié) levő bemélyedések („welTj, pl. 96 métyedéses vagy 384 méiyeáéses lemez.

Előnyösen, a pelietáiás 200 - 600 g-vel történik, 1 -20 percig, előnyősön 2-10 percig.

ElónvOsen. a sejteket egy markermoSekulával együtt kínáljuk. pl. hiokmnpadhilis festékkel festve, ami **φ ♦ φ

tehetővé teszi az át közölt cefluláris sajátosságok, jelzését.

A tartály lehet V-fsnckő, lapos fenekű vagy U-ísnekü tartály, a felhasználás céljától függően.

Egy kevert szuszpenzló előállítása során egy vagy több sejttípust adunk egy tartályhoz 18' órán belül, előnyösen 16 órán belük H órán belül, 12 órást belül, SÖ órán. belül, 8 órán. belül, 6 órán belül, előnyösebben 4 órán 5 belől, 3 órán. belül, 2 órán. belül, különösen előnyösen 1 órást belül vagy la! órás; belül. Előnyösen minden alkalmazott sejttípust .a fent o-eghatározott időtartam alatt adagolunk.

Egy előnyős megvalósítási mód' szerint az ülepített szaszpenzíőt COj jelenlétében inkuháljuk nem tovább, mint 50' óra, 40 óra, 36 óra, 24 éra, 22 óta, 20 óra, 18 óra, lő óra, 14 óra, 12 óta vagy 5 0 óra. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az üicpüett szuszpeazáól CO₂ jelenlétében mkuháljnk nem kevesebb, mint 2 órán, 4 !:ö órán, 6 órán, S órás, 10 órán. 12 órán keresztül.

A találmány egy megvalósítási módja -szerint további típusú sejteket adunk a sejtek kevert szuszpenziójához. A találmány egy megvalósítási módja szerint a további típusú sejtek legalábbis endótheliaüs .sejtek. A. találmány egy megvalósítást módja szerint további típusú -sejteket választunk ki endoőteli-aüs sejtek, simaizom sejtek, ídegsejtek, tromhociíák, dendritikas sejtek, hízósejtek, T/S-límíbeiták, ntakroiágok közül. Grarmlocítá15 kát, dendritikus sejteket, hízósejteket, T/B4imfbeitákat: és roakrofágokat a tenyészetekhez akár inaktív, akar

Immunológiai aktív állapotban hozzáadhatunk.

Adott esetben a találmány szerinti módszer egy vagy több sejttípus dedífferenciáitatását tartalmazza a kevert szaszpenaó előállítása előtt.

Adott esetben a találmány Szerinti eljárás egy vagy több sejttípus szaporítását tartalmazza a kevert szstsz20 penzió előállítása előtt. Ez a. lépés különösen akkor szükséges, ha nagy mennyiségű minta parallel történő tesztelésére van szükség, például nagy teljesltírtényü (HT5; „Hígh Througbput Screemn-g”) szűrési eljárásokban,

Száz ötéiért ő , icreeRÍRg ) módszerei

A találmány alkalmas tüdő szövetre haló győgyszerjeíöti-vegyületek szűrővizsgálattal történő azonosítására („sereenmg”), amely módszer a következő lépéseket tartalmazza:

- a leírás szériát -definiált háromdimenziós tüdőntodeil-szőveítenyészerét áld tünk elő,

- az említett modeíl-szövettenyészefbói legalább tesztmíntát és referenciamintát veszünk,

- a. gyógysz&rjelö'lt-vegyületet érintkertetjük a részönintávsl,-a tssztminíát és a referenciamintát azonos körülmények .között tartjuk,

- detektáljak a teszünlnía bármilyen megváltozását a referenciamintához képest,

3-0 és ba bármilyen modifikációt detektálunk a tesztmíntáboz képest, azt a győgysserielöit vegyület hatásának tulajdonítják,

A módszer bizonyos változataiban csak a megváltozás irányát figyeljük meg, fiziológiai értékeket nem kalkulálunk, Bizonyos változatokban egy előre meghatározott küszöbértéket határozunk meg kalibrációs görbe segítségével, -és ehhez az értékhez hasonlítok,

Egy előnyős megvalósítási módban a modeli-szövertenyészet az egárrtágcs- íkré? szövet módéiba, és s gyógyszerjelölt-vegyület káros hatását teszteljük, ahol a megváltozást a vegyölet toxikus vagy egyéb káros hatásának Tulajdonítjuk.

Egy előnyös megvalósítási módban s modc-lKszövertenyészet tö<á3óeteg.rég-n«»áe&őwne»vüs?ez, amelyben az érintett -sejteknek kóros réíajdonságaik vannak, és fájtuk a- gyógyszorjelöU előnyös hatásai résztelei 9' Kik, ahol

- módszert feíztösfcn-k sz említett patológiás tatejőönság -tn érésére vagy becslésére az-említett sswfeílszővetre nézve, miáltal a betegség egy mértékét kapjuk meg.

- egészséges tüdöszövetböl származó tefersnetaminíáí (egészséges referenciaminta), és/vagy beteg tüdőszövetööl származó referenciamintát (beteg referenciaminta) biztosítunk

- a patológiás tulajdonságot mérjük vagy becsüljük az egészséges referenciamintában és/vagy a beteg referencia-ulníában és legalább egv teszíminíábao, tóelótt és miután azt a gyógyszetjelólí-ve-gyülettel érintkezésbe hozzuk, ahol bármely változást vagy módosítást a teszimintába-H, amely közelit! a betegség mértékét a tesztraiatáfean a betegség. mértéke leié az: egészséges referenciamintában, és/va-gy távolítja a betegség mértéket a tesztmintáfeas a betegség mértékétől a beteg refc-vndaminlábsn, az említett gyógyszere lóit molekula előnyös -'hatásának tekintünk, Más. szavakkal, jobban basim-Ht az egészséges referenciaminta állapotára, mint a beteg referenciamintáéra.

ZiilebeíegségeÁ diövríósAa

A találmány tárgyat képezi továbbá módszer twíOefegségiA -<ő«g«ostSiiW, amely módszer a következő lépéseket tartalmazza:

- pacienstől tüdő mintát veszünk,

- legalább primer fíbrobíastokat és· tüdóeredetü epiíhellalís sejteket izolálása sz említett mintából, hogy pae-fensfibroblastokat és pacienseredetö ep-itbeiítdts sejteket .nyerjünk,

- háromdimenziós íitóőmodéll-szövedenyészetet készítünk a paclem-fferób-lastokbóí és a pacienseredetű epitbelía-lis sejtekből a 111, igénypont szerinti módszernek megfelelően,

- betegségre jellemző tulajdonságot azonosítunk a tervezetten kialakított, háromdimenziós tüdőmodéll-szővettenyészefeen, összehasonlítva az egészséges primer Sbrob-lastokat és. tddőeredető -epttheliáis sejteket tartalmazó, háromdimenziós tüdömodell-szö vet: enyészettel, ahol ha betegségre jelíeioző tulajdonságot azonosítunk, azt úgy tekintjük, mint ami tüdőbetegségre íph fihrotíkus vagy tumoros betegségre) utal.

.25 A. -feni említett -megvalósítási módokban, a betegség-tulajdonság lehet például:

- morfológiai: változás

- patogéíí jelenléte

- befegség-marker expressziéin

- protein -expressz lójának hiánya, altul az említett protein expressziójának hiánya a tüdőbetegség jele,

3(1 azonban nem korlátozódik ezekre.

Egy előnyős megvalósítás mód szerint páciensből nyert primer -sejteket -alkalmazunk. Egy előnyös megva-fösi-tásí mód szerint az egy adott páciensből származó primer sejtek nem vagy csak részben dedírterenciáltak és a páciensből történt kinyerés után 5, 4, 3, 2 vagy 1 napon beiül vagy 12, lö,. 8, ó, 4, 3, 2 vagy 1 órán beiül felhasználjuk okét a sejtek kevert szuszpenziőjáaak előállításához. Egy, primer sejtekből előállítót modellsző35 vet-tenyészetbso az adott beteg állapotának jellemzőit mutató modell tanulmányozható és terápiás hatóanyagok és/vagy beadási rendek tesztelhetek.

ó'éss/uiex

A {aláhnány egy tervezetten kialakítót, báromdítnen-ziő-s tüd&modcllszövel-készietre is vonatkozik, amely tartalmaz, egy -tcsztiémezt, axüelyaek több tartóedénye van elrendezett termában foarrsy”) tartalmazza, •rt) sutelyb-íf! legalább két tófoedsfoy íartalmaz· **** «Φφ« 4Χ

Φφ X ♦ # *

- egy vagy több típusú tervezetten kialakított, bármely korábbi Igénypontban definiált, háromdimenziós. tödőmodeil-szövettenyésaet mintáit, ahol mindegyik minta az említett lemez külön tartőedényébe van helyezve.

- a tnodeil-szövettenyészet sejtjeinek tenyésztésére alkalmas tápközeget.

Előnyösen a tartályok egy része egy vagy több kontroll mintát tartalmaz, A kontroll minták lehetnek bi5 zooyos sejttípusok tiszta tenyészetei, például csak epiieiiam és ftbroblastsk tenyészetei, és/vagy kétdimenziós (2D> tenyészetek. .A betegség: modelekbeu a konöollok lehetnek egészséges sejtek tenyészetei.

Előnyösen, a tervezetten kialakított, háromdimenziós íúdömodellszdvet-készfet egy vagy több jellemzővel bír a következők közük a lemez 96-tnélyedésü lemez, azaz 96 íartóedéuykéns útnkeionáió bemélyedést tartalmaz,

- a lemez bemélyedéseinek teaeke V alakú vagy lapos fenekű, lemez, vagy V-alakú és. lapos fenekű bemélyedésekéi egyaránt tartalmazó leme. U-fénekő lemezek is -alkalmazhatók,

- az iartíjedényekbea le vő tenyészete insák .a következő számé sejtekből állnak:

legalább 102 előnyösen legalább ilf^!, legelőnyösebben legalább 2x10”, 3x1004x102 5x í 4)2 és legfeljebb 10°,.előnyösen legfeljebb 5x1 G'\ 4x10\ 3x1 Ő’, 2xiö2 vagy legfeljebb lő⁵,

-a t&rtóedányek le vasnak zárva, együtt vagy egyesként, és CO₂-ban dúsított környezetet, vagy a tüdő szövetfenyészetnék megfelelő annoszferát tartalmaznak.

fia CO, - gazdag környezet vagy atmoszféra legalább' 2%, 3%, 4% C0,4 tartalmaz legfeljebb 10%, 9%, 8%, vagy 7% C0--t tartalmaz, különösen előnyösen kb. 5% CCfi-í tartalmaz.

Egy előnyős -megvalósítási mód szerint 8 minták, magukban foglalnak. teszt snintá(ka)í és megfelelő kontroll raintáfkajt

Előnyös megvalósítási módok szerint a teszt minták V-fenskú lemezen találhatók, vagy lemezen V-fenekú mélyedésekben és· a kontroll minták lapos fenekű lemezen vagy egy lemezen, lapos fenekű mélyedések2.5 ben.

DEFINÍCIÓK

A fef?í%/;;«'Í?ge?? szöveb vdssxerfceí fiürtiffoisl tissne .scaffokT)' jelentése. a leírás szövegősszelűggősében szilárd támasztó anyag, melynek szerkezete speciálisan sejtek tapadásának elősegítésére:- és/vagy sejtek, háromdimenziós szerkezeti -elrendeződésének elősegítésére van tervezve, és erre alkalmas, szövet- vagy sejíte30 nyé szelek ben. Előnyösen, az. említett mesterséges szöveti vázszerkezet a szövet vagy sejtek tenyésztését megelőzően kerül elkészítésre, és a szövettel vagy a sebekkel az említett szövet vagy sejtek tenyésztése előtt, vagy azzal egy időbért kérői érintkezésbe. Tehát egy mesterséges szöveti vázszerkezet jellemzően egy -sejtosztódást támogató struktúra vagy anyag, amely hozzájárul a struktúrához, pl. a szövet- vagy seiitenyészet háromdimenziós súuktútájához azáltal, hogy legalább részben befolyásolja a eelluiárss Interakciókat tpl. sejt-sejt mterafeció35 kat> vagy magát s ceiinláris környezetet Következésképpen, ha a szöveti vázszerkezetet eltávolítják a szővetvagy sejttenyészetből, a szövet- vagy sejttenyészet dezitrtegráiódik vagy őezorganlzálóáik.

Szakember számára világos azonban·, hogy ha a mesterséges szöveti vázszerkezetei bíolögiaifeg lébomlö anyagból készítik és az fokozatosan lebomlik, lehetővé téve a sejt-sejt-kölosönbalásök kialakulását, ezt nem tekintjük a szöveti vázszerkezet eltávolításának és ebben az eljárásban a szövet- vagy sejttenyészet nem válhat í cuífezetfennö vagy szervezetimmé.

**Φφ φφφφ φφφ ♦ «

Eszerint a változat szerint a· mesterséges szöveti vázszerkezet bátömdimenzíős mátrix» elöuyőset- háromdimenziós gél mátrix vagy porózus háromdimenziós mátrix, almi a mátrix előnyösen tsikrotereket vagy pórusokat tartalmaz, -amelyekben a sejtek elhelyezkednek. Egy változatban a mesterséges szöveti vázszerkezet maga egy olyan hordozó, amelynek a felszínén a.sejtek kitapadnak, előnyösen porózus membránhordozo. Esze5 rim. a változat szerint :a vázszerkezet struktúrája speciálisan a sejtek, kstapadúsára tervezett és tara alkalmas, például porózus vagy meggörbített vagy rovátkolt vagy hornyokkal ellátott felszín, amelyhez a sejtek hozzátapsdnak, miáltal ez elősegíti a háromdimenziós szerkezet kialakulását

Előnyösen, a mesterséges szöveti vázszerkezet

- meghatározott háromdimenziós szerkezettel rendelkezik, ö - pórusos, előnyösen nagymértékben pórusos anyag vagy mátrix pórusos membrán

- pórusos háromdimenziós· mátrix

- hlokompatibílis anyagból készült, és/vagy

- -polimerből készült.

Adott esetben a. „mesterséges szöveti vázszerkezet” poiiszacharid-alapú mátrix, például cellulóz, alapú •mátrix, például metilcellalőz-rcátrix.

Adott esetben a „mesterséges szöveti vázszerkezet” gyöngy struktúrájú,, például cltodex- gyöngy.

A ''báfffíifyi’yi mcsíezséges- szöveti v-mszertectíd/ »u:'??íu,y htáríwrúwnsh»' srövuPutp’íAzrt kifejezés alatt itt olyan háromdimenziós szövettenyészet értendő, amely háromdbnenziós szerkezetét az inherens sejt-sejt kölcsönhatásoknak köszönheti, és húrorrdirneazié» szerkezetének elérésében nem segíti mesterséges, szöveti vázszerkezet

Tehát a bármilyen mesterséges szöveh vázszerkezettől mentes háromdimenziós .szövertenyészet nem dezintegrálódik vagy dezorgaaizálódik mesterséges szöveti vázszerkezet hiányában, hanem megtarija háromdimenziós szerkezetét Még ha az említett bármilyen mesterséges szövet vázszerkezettől mentes· háromdimenziós szövettenyészetet szilárd támasztóanyagon ulakííjuk is ki és tenyésztjük is, a háromdimenziós szerkezet kialakulása nem annak köszönhető,, és azt nem segíti, hogy a sejtek ehhez a szdárd hordozóhoz kötődnek, és arról leválaszthatók a háromdimenziós szerkezet megszűnése nélkül..

A ríogrugéde/a'' kifejezés, ahogyan itt használjuk, egy szövet- vagy sejtfenyészet legalább két sejttípusának térbeli elkülönülésére vonatkozik. miáltal a térbeli -elkülönülés, azaz a szegregáció után deiinláiha30 tó vagy található a tenyészetnek egy régiója, pl. egy (részleges) térfogat vagy felszín, amelyben a két sejttípus aránya különbözik egyrészt a két sajt szegregáció előtti arányától a tenyészet ugyanazon régiójában, másrészt pedig ugyanazon spíttipasofo-ak az arányától a tenyészet -más régiójában. Előnyösen,, legalább két sejttípus felületi feszültsége közötti különbség szignifikánsan hozzájárul szegregációinkhoz;« váró.

Egy régió, -azaz egy tenyészet térfogatának vagy részleges térfogatának, vagy felszínének vagy részleges

-felszínének 7é/dá.wtóöf” egy bizonyos sejttípusban ágy értendő,, hogy bizonyos sejttípus aránya magasabb a régióban mint egy referencia régióban, azaz az említed tenyészet egy másik régiójában, Tipikusan egy tenyészet egy régiójának „feldüsulása” a sejtek szegregációjának eredménye.

A ''ipoíköíáh adaptív válasz, -amelyet káros körülmények vagy sbn-uius (pl. fertőzés vagy szövetsérük·,;;} vált ki.

< iickmek eay ssooortfa, melyeket összefoglalóan 'TrufojA/wurAvífo covr&.«eá''-ként ismerünk, mert ' 2 gyorsítják a gyulladásos folyamatot, szabályozzák is a gyulladásos folyamatokat vagy közvetlenül, vagy· azon képességüknek köszönhetően, hegy eelluláris adhéziós molekulák vagy más cií-oktnek szintéziséi serkentik bizonyos sejttípusokban A korai válaszért felelés fontosabb gyulladásserkentő citokinek az ILI -alfa, ILl-béfo, Itő és a TNF-alfo. További gyulíadásserkenré citokiíiek például a IFN-garama, CNTF, TGF-béta, IL12. ILI 7.

ILI 8, IL8 (CXC1.Ő) és egy sor egyéb k-emokln, amely gyulladási sejtekre iremoattrakiársské»; hat, továbbá különbőzé neuromoáulátor faktorok. Egy gyulladásos válasz nettó hatását a gyuliádásserkestő és & gyulladásgádó cltokinek (pl IL4, ILIö és ILI 3, ILI 6, IFN-ailá, TGF-héía, ILlra, ö-CSF, a TNF vagy ILő szolüblitsreceptoraid egyensúlya határozza meg. Az ILI-béta különböző kaszpázok általi aktiváelója egy InHammaszómának: elnevezett, nagy multiprotein komplexben tönénik.

lő A LíF, GM-CSF, ILI I és az OSM további ctfokinek, .amelyek gyulladásos folyamatokat befolyásolnak, és amelyek potenciálisan alkalmasak a találmány szerinti betegségmodelíek előállítására.

Ezzel eltefoéíbeo a 'jgyKdaréfegó/öí cfooáfoeé, pl. ILI0, úgy szabályozzák a gyulladásos folyamatokat, hogy azok gátlódnak vagy enyhülnek.

A. háromdimenziós szövetek: ''’d/fogos óMdrd”-jének a fent említett módszerekkel létrehozod húroméi15 tnenzióa szövetek több méréssel 'kapott átmérőinek számtani középértékét tekintjük.

A „rfoAízy dmforü {médián átmérő) az az átmérő, amely jelöli egy adott üledékminta elosztását két egyenlő részre súly szerint, az egyik rész tartalmazza az összes ennél az átmérőnél nagyobb átmérőjű aggregátumot, a másik rész az összes ennél kisebbet.

A. íanöedésyek egy ‘V/renzfeúye ” („array”) alatt több ugyanolyan méretű, alakó és anyagú t&rfoedény elhelyezkedését értjük. Az -elrendezés lehet például tartóedények sorozata, vagy a tartóedények kétdimenziós mátrixa.

A vírusok sejteket fertőző obiigát· fotraeelfoláris patogének, melyek gyakran magas speciftcitást mutatnak egy adott sejttípusra. A refewwöiwám vL?zsvoá?ozrré-:b;m eltávolítjuk a vírus -életciklusának .repllkúciós fázisához szükséges gértőket, és helyükre számunkra- jelentőséggel bíró géneket építünk be. A rekotnbmáns vírus vektorok transzdukálód képesek azokat a. sejteket, amelyeke; normális körülmények között megfertőznének. Hogy ilyen rekombinátts vlrusvektorokat készíthessünk, & nem esszenciális· géneket transz helyzetbe helyezzük, vagy a csomagoló sejtvonal genomjába Integrálva, vagy egy plazmádon·. Számos vírust fejfeszfotrék ki, az érdeklődés középpontjában négy típusuk sík retrovirnsok (köztük a forstivlrusok), sdenovirusok, adeno-ásszociált vírusok és az I. típusú berpes slmplex vírus.

A rőá” alatt betegségek egy osztályát értjük. A rákbetegségben sejtek egy csoportja foítfxfofofodmj ózzfthófe? végez, fovdrtóí mutat (behatol a környező -szövetekbe es -elpusztítja azokat)·, és olykor zscforgArtréí képez <a test más részeire átterjed a nyirok- és véráramon: kérésziül:). Ez a bárom mah'gnus tulajdonság különbözteti meg a rákot a jóindulatú tumoroktól·, amelyek önköriátozóak, nem. képeznek inváziót és metasztúzist, A tüdőtumorok 95 %-a bronehüseredetú karcinóma, vannak még bronehíúlis carcinoidok, és vegyes -eredetű, -etesenchy35 •iö rnahs neoplazmák.

'fofoíLA'”-ban túlzott mennyiségű irbröztss kötoaröyeí képződik egy szervben vagy szövetben a reparatfv vagy reaktív folyamat során, ellonretfecn a riiyfozus szövet képződésével, ami a szervek és szövetek normális komponense. A tüdölrbrózis súlyos krónikus: betegség, melynek, jellemzőt a tüdő rugalmasságának és vpithelialis sejtjeinek elvesztés», reelvc-k helyébe intem;írtélis myofibroblastok és extracelluláris mátrix-proteinek lépnek a tüdő imsrstitium-ban. Ezek a folyítmatn'k u tudó stn-tk túrói is átformálódásához („renmdelisg”) vezetnek.

ΛΖ ÁBRÁK RÖVID LEÍRÁSA

1, ábra - 3D kétsejres dpusü mikroienyészetsk siruktíKája. .A SAEC és NHLF-sejt'ekeí rendre CFSE vagy di? életképcsség-jelző festékekkel festettük meg, A tiszta vagy különböző aí-ányokfeas kévén sejtpopulációkat ülepítettük és 24 éra ihkubülás után aggregátumok keletkeztek, majd ezután átvittük azokat 24 méiyedés-ö sejtte5 ayésztő-istnezetere képalkotás eéíjáböl. Felső sor; tázis kónttaszt-míkrtjszkópos képek; középső ser: fluoreszcens mikroszkópos képék; alsó sor kurtfokália képek. SAEC: zöld csatomé; NHLF: vörös csatorna.

2, ábra -50 % SAEC és 50 % NHLF keverékéből állő mattígef alapú tenyészet.

3, ábra - Pelletálí, SAEC és NHLF különböző arányait tartalmazó tttiktoszőveUenyészefek. A fiziológiás fluoreszcens markereknek köszönhetően A S.AEC sejtek zöldek (vagy vlfágosszürkék fekete-fehér képeken), amíg

10' az NHLF sejtek vörösek (vagy sötétszürkék fekete-fehér képeken).

La ábra - A TTFI mRNS szintjei 3D barnán tíklő tni-kroszövetekben. A TTF1 transzkripciós iüeter az alveoláris epiíheliaíis sejtek jellemző markere. Amíg a 30 ttbroblast-íenyész.etsk nem mutatnak TTF1 expressziét, addig a TTF1 jelen van a 3D S AEC monokultúrákban, és növekedést mutat a 2D SAEC/NHLF kő-kultúrákban, jelezve a fihroblasíek előnyös hatását. A legmagasabb szintű TTF1 expressziét a 3D SAEC/NHLF szövetek.

mutatták,

4, b ábra - Az AQP-3 viztranszporier nxRNS szintje 3D humán tüdő mikroszövetben, Az AQP3 a tüdő ATH eplthcliaiis sejttípusának markere. Amíg a 3D fibroblast tenyészetek nem matatnak AQP3 expressziét, addig az AQP3 jelen van a 3D SAEC monokultúrában és emelkedést mutat a 2D SAEC7NHLE kö-kultúraban, jelezve a dbíoblas-ok előnyös hatását Az ÁQP3 legímgasabb fokó expresszíőja ebben az esetben is a 3D SAEC/NHLF ko“kultúrában figyelhető meg.

5, ábra - Génexpressztós változások a SAEC differenciálódási ntarkerskben.. A panel: AQP3-vtz transzportét relatív tnRNS szintjei 2D és 30 humán tüdő-mikroszövetekben. Az AQP3 relatív expressziós szintjei emelkedtek a kevert tenyészetekben a csak SAEC-sejíeket tartalmazó tenyészetekhez képest, miközben a 20 és 3 D tenyésztési körülmények között nem volt detektálható különbség. 8 panel: A KRT7 relatív mRNS szintje oőve25 kertelt kevert sejttenyészetekben a csak SAEC sejteket tartalmazó tenyészetekhez képest (független kísérletek szúrna: 3>. C punéi: SFTFAI és β-aktiv expressziója 2D és 30 tenyészetekben, Áz SFTPA1 expresszíóját csak SAEONHLF együttes tenyészeteiben (ko-kutóra) detektáltuk. Az SETPA1 expressziója következetese» ntagssabb volt 31) tenyészetekben,. mint 2D tenyészetekben. Három független kísérlet reprezentatív képét mutatjuk, O panel: 72 őrá, NHLE-sejtekkel történt egy üttes tenyésztés után, két- vagy három-dimenzióban, megvizsgáltuk a

3Ö génexpressziós változásokat EACS-szsl válogatott SAEC-sejtekben, Az AQP3 és a TTE-1 ditfereneiálódási markerek szintjei az újratísztimtí SAEC sejtekben jelentősen lelteié regttlálóötak a 30 együttes tenyészetekben a 20 együttes tenyészetekhez képest A bemutatott adatok két független kísérlet átlagai, (Minden kísérletünkben rundom donoroktól származó, primer, tisztított tüdősejteket alkalmaztunk.)

6, ábra - EMT-markcrek a 3Ώ tüdöszaveí-moáelben, Λ panel: S10ÖA4 relatív mRNS szintiéi 2D és 30 együf35 tcs {enyészetekben. A öbrobksstok jelenléte jelentősen csökkentette az S1Ö0A4 szintjét, SÁEC-NHLF együttes tenyészetekben összehasonlítva a csak SAEC-scjteket tartalmazó tenyészetekkel, míg a 20 vagy 3D tetsyésztést körülmények nem változtatták meg jelentésen az SIÖ0A4 expressziét. 8 punéi: az E-kadherln ü'E-esd) relatív mRNS szintjei -emelkedtek 3D tenyészetekben NHLF jelenlétében. C panel: az N-kadnenn (N-cad) relatív mRNS szintjei 20 és 30 humán ;üdö mikroszdveíekben. 8· panel: NHLF sejtekkel történt. /2 órás, 20 vagy 3D együttes tenyésztés után megvizsgáltuk s ssnevpressziós változást,kát FACS-szal válogatott SAEC sejtekben.

Áz S 1 0öA4 és· az £-etsd EMT-madcerek szintjei a válogatott epiíheti&lss tüdőseitekbe megemelkedtek 3'D kéísejtes együttes tenyészetekben 2D együttes tenyészetekkel összehasonlítva, mig az N-ead sokkal alacsonyabb szinten expresszáiódort 3D kevert tenyészetekben, A kísérleteinkben alkalmazott, tfsztstött, primer tüdőseitek rundom donoroktól származtak. A bemutatott adatok három (A-C panelek) vagy két (D panel) független kísérlet átlagai. Minden kísérletünkben az alkalmazott, tisztított, primer tödösejtek random dosorektől származtak.

7, ábra - Gyulladásos citokmek és kemokmek szekréciója barnán, primer, tüdősejt-tenyészetekben. A pattéi: CXCL-8-szekréciő- 2D és 3D NHLF-msookultúrákban alig volt detektálható a sejttenyészet-fetülüszókbaa. A 3P SAEC-tenyészetek még mindig termeltek CXCES-sg bár sokkal kisebb mértékben, mint a 2D SAEC tenyészetek. A 2D együttes tenyészetek nem változtatták meg. jelentősen a GXCL8 expressziét, jelezve, hogy a

KI Ebroblnstok jelenléte nem befolyásolja a eitokmexpressziót. A CXCI.8 expressziós szintek jelentősen csökkentek a 3D-szövetrends-zerekben, mind a tiszta SAEC-tenyószetekben, mind a SAEC-NHLF együttes tenyészetekben. A panel és 8 panel:.az IL-lb esd sz IL-6 mRNS-ek expressziós szintje) humán,, primőr tüdőse) í-teuyészetekben. A 2D tenyészetekhez: képest az IL-ib és az Ító gynl'ladásos citokmek mRNS szintjei következetesen alacsonyabbak 3í>-tmyészetekben. Tiszta fibroblast-tenydszétekben az ÍR-Ib mRNS expressziója nem volt

IS detektálható, míg az it-6 szintek sokkal alacsonyabbak voltak és az -expressziós változások szintén· kevésbé voltak jelentősek (lásd a 2. táblázatot is), D panel: Hasonlóan a kevert sejttényészetek mintáihoz, az IL-1 b és az ?t-ő gyulladásos citokinek szintjei szintén jelentősen csökkentek SAEC-sejtek tisztított 30 tenyészeteiben 2.0 tenyészetekhez képest. A bemutatott adatok három (A-C panelek) vagy két (D panel) független mérés átlagai. Minden kísérietönkben az alkalmazott, íRztitott primer tüdőseitek random donorokból származtak.

g. ábra - 30, háromsejtes típusú, SAEC-, NHLf- és HMVBC-stjíekből álló mikrotenyészetek szerke-zete. A SAEC-NHLP és a KMVEC-sejtekst rendre CESE, Díl vág ÓID életképesség-jelző festékekkel festettük meg, majd aggregátumokat alakítottunk ki, 24 őrs fekubálás után a spontán átrendeződött két- vagy háromsejtes típusú mikrotenyészeteket gondosan 24 fuélyeőésú tenyésztő tálcákra vittük át képalkotás céljából, A panel: kétsejtes típusú tenyészetek, 8 panel: hámnsejtes típusú tenyészetek. Felső sor: fázlskonímszt-mlkroszkőpos képek; középső sor:, fluoreszcens mikroszkópos képek; ateé sor: konfokális képek. SAEC: zöld csatorna; NHLF: vörös csatorna; KMV'EC: kék csatorna.

9, ábra - Géoexpresszlős változások hátomsejtes típusú tenyészetekben. A panel: az AQP3 és az ERT7 expressziós szintiéi emelkedtek, az S 1Í3ÖA4 és az N-cad expressziós szintjei csökkenték 3D tenyészetekben 2D tenyészetekkel összehasonlítva. B pattét: molekuláris markeres expressziós- szintjeinek összehasonlítása 3S

SAEC és NHLF kétsejíes típusú tenyészetekben és SAEC-NHLE-HMVEC háromsejtes típusú tenyészetekben. Áz AQfö és az E-cad mNRS szintjei emelkedtek, az S 10:).44 és az N-cad mRNS szintjei csökkentek, jelezve, hogy a szöveti differenciálódás megmaradt a három-sejtes típusú modellben. Minden kísérletünkben a tisztított, primer tíídösejtok random donoroktól származtak.

lő. ábra - A tesztre kész, „9ő-fnélyedésÖ lemez” -formájában -megvalósított tüdőszdvet-készlet előálHíásámtk folyamatábrája.

11. ábra - Adenovirálts génbe juttatás SAEC sejtekbe a kétsejíes tipcsú modellben

A panel: A SAEC sejtek zöld színnel jelennek meg a 30 szővetmodell felszínén a GFR expressziónak köszönhetően. A fibrob-íasztakat: előzetesen- vörös színű fiziológiás festékkel nregfcslertük az aggregáiödá-st megelőzően. B panel: az RT-FCR reakció- bizonyítja, hogy hatásos GFP-génöejut-tatás történ: a modellben. A GÉP detek•0 falható az adenuvimiisan iraoszöffeált medál lton vészetekben.

*·*·*♦

Λ TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA

Egy egyszerű, tervezetten kialakított, háromdimenziós tüdőntodell-szövertenyészetet alkottunk,, amely tödöszövettnodellkértt használható és felhasználásra kész különböző teszrmődszerekben.

A feltalálók a modell megalkotása· során teklnietbe vették a szövetek jellemzőinek különböző aspektusait, 5 mint példád a tudó szövegtípusainak fe jellemzőit a különböző sejttípusok kölcsönhatását a tüdő embrionális fejlődése som, a szövettervezés („tissue engmeering) technológiájában végbement műszaki előrelépéseket.

Mind -vázszerkezet alapó, mind vázszerkezet nélküli rendszereket megvizsgáltunk, amint a leírásban ismerteij&L A iudoszövet-speciLkus markersk elemzése art mutatta, hogy a háromdimenziós, vázszerkezet nélküli rendszer meglepően erős hasonlóságokat mutatott a natív tüdöszővette-l,

A technika állása szerint a Ebroblustek tóinövekedőse szokásos tapasztalat volt, amikor megkísérelték ezeket a sejteket modell szövetekben felhasználni {VS2O08ZOI12890). Eredményeink fényében feltételezhetjük, hogy ezen t-óínövekedés oka az aggregátumok kialakulásának hiánya volt. Az aggregátumokból kimarad'.: sejtek kiapadhattak az edény felületére, és szaporodni kezdtek, míg a kontakt gátlást el nem érték.

Az eddig kifejlesztett öidöszövet modellek speciális vázszerkezeti anyagokat alkalmaztak, és hosszasan tenyészetben tartották őket. [Nichoss. J..E, és Cortiella J. 2ÖÖSL Ezzel szemben az irt bemutatott modell lehetővé teszt a gyors kezelést, egyszerű kísérleti elrendezést alkalmaz, és viszonylag: rövid tenyésztési idejű. Továbbá nincs szükség speciális laboratóriumi felszerelésre. A találmány szerinti rendszer megfeleld -emberi sejtekkel történő alkalmazáshoz, beleértve humán primer sejteket és nem transzformált humán sejteket,.

Egyértelmű, hegy bizonyos rendszerekben a vázszerkezei például mátrix, biológiailag lebontható. Ezeket a rendszereket azonban nem tekintjük vázszedfcezs-t-raeníes rendszereknek, még a vázszerkezet degradálódása után sem, mivel -* és amennyiben - a vázszerkezet befolyásolta vagy meghatározta a szővettenyészeí. szerkezetét vagy alakját, Emellett, fe vitro rendszerekben, mint amilyen a taláimány szerinti is, általában nem várható, hogy egy lebontható membrán feloldódik.

Továbbá, egy biológiailag lehomió vázszerkezet feloldódása hosszú Időt vesz igénybe, sokkal hosszab25 bat, mint a találmány szerinti szöveítenyészet előállítására és feibasználására szánt idő.

A találmány szerint alkalmazhatunk nem dedirferenciáíédott sejteket ís, azonban a sejtek szatíra csekély lesz. Ezért ez -a megvalósítási mód főleg azokban az esetekben hasznos, amikor kis számó fejt is elegendő a tervezett teszt végrehajtásához, például ha a teszt elég érzékeny, Egy gyors tesztben lehetséges elkezdeni a találmány szerinti modell szövettenyészet előállítását iisztlíott, differenciáit sejtekből. Ilyen sejteket frissen is előállíthatunk egy személyből. Az eljárás ezen változata különöse® alkalmas például hatóanyagok vagy vegyültek, páciens specifikus tesztelésében, vagy ha egy hatóanyag hatását kell tesztelni specifikus betegség környezetben (például egy potenciális gyártó részére).

Primer sejteket kereskedelmi forrásokból is beszerezhetünk. Például ilyenek a Lonza Verviers, S.p.r.1. Parc imfastriei d:e Petit-Recham 8-4800 Verviers, Beigiusn; Elocenter -L-td., Temesvári k-rt. 62 1-1-6726 Szeged,

Inviirogen Corporation in Life Technológus Corporatie??. 5791 Van Alku Aáy, Cartsbad, Caftfomla 920Ö8 LS.--'\ része).

Ha nagyszámú mintára van szükség, a sejteket szaporítanunk kell, mielőtt előállítjuk a modell szövettenyészet mintái?.. Ezen eljárás során dediífetenciálödás következhet be. Ez a helyzet szűrővizsgálati alkalmazások (például HTS) eseten. Páciens-speesrikus tesztelésekre .kis számé? minta is elegendő, ifi Amikor u fejtek aggregammban differenciálódunk, a szaporodás lelassul '-agy megáll és ezutáe azaggre*** *<φ

S 9 Φ ♦' Φ .** gátumok már-asm növekednek jelentősen.

Ha kisszámú minta elegendő, nem- szükséges a sejtek előzetes szaporítása. Jellemzően ez tnegtönénhet páciens minták tesztelése során néhány hatóanyag tesztelése esetén, vagy ha bizonyos jelenségeket,, például szignál folyamatokat kívánunk megfigyelni. Szűrővizsgálati eljárásokban azonban nagyszámú mintára van szükség és szaporítanánk kell a sejteket a modell -szövet-tenyészet előállítása előtt..

A .találmány egy előnyős megvalósítási módja szerint felnőtíok: dedífcenciált epitbeliabs sejtjeit alkalmazzuk. A technika állása szerint nem volt ismert, hogy felnőtt, dedifferenciálí epi-theliális sejtekben azokat Sshrobiastok jelenlétében együtt tenyésztve, képesek differenciálódás kiváltására, amely tovább fokozódik. 3£> körülmények között, különösen olyan körülmények között, amelyek alkalmasak 3D .aggregátumok kialakítására.

így tehát egy előnyős megvalósítási mód szerint a modell szövettenyészet előállítása ded-ifferenciált sejtekből indul. Az primer sejtek tenyészetben, például 2.0 szövetfenyészethen tartva bizonyos dedlfféreneiálódásí marke•refceí mutatnák. így tehát az ilyen sejtek is alkalmazhatók a találmány szerint. De-differeneiálódási roarkerek például az S1ÖÖA4, azN-adherin és a gyulladási tnarkerek. így sejtek nagyobb számát alkalmazhatjuk.

Plorí potens vagy differenciálatlan sejteket szöveti .komponensek és/vagy faktorok hozzáadása otán diffe15 renciálódásra képessé tehetjük.

Ccóhfiém oráfdószövcráeí?

Cefiidáris áedtfféeenciácw ó> re-dj/jbrencídeíó

Mind' az Őssejtek, mind a szövet'specifíkas prögenitorsejtek átmehetnek irányított, szövetspeeifikhs differenciálódási lépéseken, ennélfogva Ideális fonásai szervspeeifíkus .szövettenyészetek anyagának, Sajnos, mínd2$ két sejttípus csak korlátozott számban va» jelen a differenciáit szövetekben.

Minthogy a szövetmodelíeket rendszeresen kell előállton! a kísérleti és tesztelési igényeknek megfelelően, a differenciálódott szövetspecifikus sejtek a kiindulási anyag jobb fonásai, egyszerűen mert több van belőlük. A jelen -modellrendszer 'kihasználja, legalábbis részben, azt a jelenséget, hogy a 2D körülmények között tenyésztett differenciálódott sejtek áeáifíersneiálódhahmk, majd re-differenciálódásra késztethetők. a megfelelő tenyésztési körülmények biztosításával.

C&lhtláris üííerídciYjk

A tüdő fejlődése, csakúgy mint azepithelialis sérülések helyreállítása („rcpair”) a serkentő és gátló gének finom egyensúlya ókai koordinált folyamat. A serkentő és gátló gének együtt szabályozzák az őssejtek és a felnőtt progeniforsejtek funkcióját a tüdőben. Például, az PGF-reeeptor-thozin-kináz jeltovábbítás, amely nélktí30 lözhetetien a légzőszervek etnogeneziséhez, negatívan szabályozott az indukálható FOF-reakcíóát inhibitorai által (Zhang, Stappenbeck és mtsai. .2005)-. Továbbá, az FGF jeltovábbítás- szükséges .az új. álveolusok kialakulásához, az alveoiáris cp-ithshalis sejtek sérülés elleni védelméhez, csakúgy mint a feltételezett alveol-áris őssejtek, illetve pregenito? sejtek migrációjához és szaporodásához a tüdő helyreállítása folyamán. Ezzel ellentétben, a TOF-héta receptor szet-in-íteonm kittáz jeltovábbítás a -Sarad 2, 3, és 4-en- keresztül gátolja a tüdő roorfógenezisét, és gátolhatja a poszínatális alveoiáris- fejlődést mig. túl erős TGP-héta jeltovábbítás a 5-road 3on keresztül Imerstifsálts fibrózíst okoz,

Látjuk tehát, hogy kétirányú, jóllehet meglehetősen komplex kölcsönhatásokra van szükség a mesenchyma és az epitheíi-um között. Feltételeztük, hogy egy alapszintű tüdömodell alkotható -tisztított aiveoiáris epitheíiuor és ftbroblssíok keverékének felhasználásával.

fii Ifiért kezdetbe;» két sejtttpusi h/o;/«éhünk: primer humán llbrobfostok (NHLF) és kis jégútj epiíhtfimbs «* «»«·,”

sejtek (SAEC, ΑΠΙ jellemzőkkel). Mindkét sejttípus beszerezhető kereskedelmi forrásból (Lonza). Meglepetésre kiderült, hogy ez a két sejttípus biztosítja a szükséges faktorokat a háromdimenziós tüdőszövet-modell kialakulásához, 'Szakember száméra világos, hogy további sejttípusok, pl, az Itt felsoroltak hozzáadásával a modell továbbfejleszthető.

Λ sejfiÍpus&k szzgzzsációia kzvert renm-2erfet«· feortfegí

Mikroszkópos vizsgálataink tanúsítják, hogy 313 primer tödösejt-tenyészetekben spontán szöveti reorganizáció '{„.válogatődás’') következik be. Taiálmésyrmk megalkotásakor egy egyszerű centrifegáláses módszert alkalmaztunk a sejtek nggregáiására magzati úmuszos. szervtenyészetekhez. hasonlóan [Harc, K.J. és munkatfe’sai (1998)1. Bizonyítékot nyújtunk arra, hogy sz primer epitheliaiís tüdőseitek tibrobiastokkai történ· 3D együt10 ?es- tenyésztése előnyösebb a SAEC-sejtek számára egy differenciáltabb állapot fenntartásához, mint akár a 2D, akár a 3Γ3 í« vítm monokaUúrák. Az NHLF-sejtek bevonása a tenyésztésbe nem csupán elősegítette az eplthetíalis differenciálódást. hanem a 3'D núkroszövetek kohéziója és szerkezete is sokkal szilárdabbnak bizonyult és kompaktabb volt a csak SAEC-sejteket tartalmazó tenyészetekkel (3. ábra) vagy a SAEC-HMVEC-tenyészetekkel {8-.a ábra) összehasonlítva,

A találmány szerfed kétsejfes típusú együtt tenyésztési rendszer, amely humán kis légúti epitheiialis- sejtet („small alnvay epithebal eeiis; SAEC) és normális humán tttdöfibroblastok: (NHLF) együttesét tartalmazza,, nem követeli meg 'külsőleg, hozzáadott extraceííuláris mátrix jelenlétét a 3D szerkezetek kialakulásához és fetmísrtásáboz (3. ábra). Egylete típusú sejtet és sejtek különböző arányú keveréket tartalmazó- SAEC- és NHLF-s-ejtszuszpenziók üiepltose megmutatta, hogy a dfáő-núkroszövefek megalkotása Bbroblasíok jelenlétét követeli meg annak érdekében, hogy kompakt és stabil 3D struktúrák. keletkezzenek (3. ábra). A 3 D mlkroszövetek morfológiai vizsgálata megmutatta, hogy a két sejttípus szegrególódása kevert kttlttokban a 3D :míkföszővetek jellegzetessége, ahol a fibrobiastok alkotják a belső- központi részt, míg az epitheliaiís sejtek a külső réteget, burkolatot alkotják (3. ábra). A szegrsgálődás vagy (válogatódás) jelensége a sejttípusok különböző adhéziós jellegzetességein alapul és korábban .nem írták le primer humán tüdő-szövetre. A spontán- „sejiválugstédás” a kohéziós erők közötti különbségeken- alapul, -ami a különböző sejttípusokra jellemző:, a tüdőmikroszövet erős kohézióval jellemezhető magját vagy központi régióját az NHLF -populáció alkotja, amelyet a kevésbé kelteziv SAEC-sejíek vesznek körül A sxegregálódás folyamata primer differenciáit'humán füdöszövefekben különösen érdekes, mivel alátámasztja azt az-elgondolá-sl, hegy még a differenciát, felnőtt humán sejtek is fenntartják azon képességükét, hogy aktívan felfedezik saját mifcrekőrayezetüket. A 3D együttes tenyészetekben Jelenlévő sejtek képesek a szomszédos sejtekhez képest változtatni helyzetüket és- igy strukturálisan átszervezni a szövetet. Ez az eljárás az extíaeeliúláris mátrix átrendeződését is megköveteli A különböző SAEC/NHLF arányú modellek •vizsgálata a 3D mikroszővettenyészet-modeilekben megmutatta, hogy az 1/1 arány elegendő .ahhoz, hogy az epithehalis sejtek befedjék a belső ísbroblast magot és ezért a modell további elemzését -l/í-sejíatánynál végeztük el. A modell hasznos- lehet mindazonáltal más: epitbeisalis inescttobyirsalls sojtarányoknál is. A felles befe3 5 déshez elegendő arány bizonyos fokig változhat sejttípusok .függvényében.

Anélkül, hogy bármilyen ei-mélerhez kötődnének, úgy gondoljuk, hogy a sejtek szegregációja a jelen modellben különböző kohéziós képességeiknek köszönhető, amelyben a sejttípusok különböze feiüfetí feszültségei íontos szerepet játszanak.

Bármely sejt aktívan felderíts sajüt ralkrokSrayezeiél, képes helyet cseréini szomszédaival vagy reotgam4íí r.sbu a közefob;-> l;-;vö ·-extraneíksláfis TOás.nxot tr'ncrcte^, hogy -/ i-tőbbi felyamstbun mind (OvcIííííiífess húzó- 18»φ »φ»« **'·« φ*

Φ Φ * φ * «φφ * φ * χ χ Φ * χ φ ·

ΧΦ ΦΦ 99 ΦΦΦ erők, mind a mtóx-melailoprtsteinázok (MMP-k) ejtztmat-ikns aktivitása szerepet játszanak, ismert kísérleti tény, hogy bizonyos összetételű keveri sejthalutnzofc aggregátumokba szegregálődhatnak. Ez a jelenség azadhezlv energiák kötöttségén alapszik.

A filggőcsepp-tenyészefek szegregálödölt sejfsggregáüitnaiban a iegköbézívebb sejtpopuláció tbgteija el 5 a kőzpooti helyzetet körülvéve a kevésbé koséziv populációval. A sejtek felületi feszültsége a szöveti kofeézivitás ügyfele mértéke. így tehát a felületi feszültség, amely kísérletileg mérhető mennyiség, képes· az elrendeződés· hierarchiájának predíkeiöjára. Ezért történtek korai próbálkozások, hogy előre jelezzék a ’sortlsg’ hierarchiát ój sejtúpus .hozzáadása esetére (Nesgu 2fiöö).

Azonban a barnán tüdő egyes· sejttípusaira jellemző felületi feszültség faktorok nem ismertek. Az irodaíö lom hallgat arról, hogy ez a szöveti „válogatás” a. töggöcsepp tenyészeten kívül más tenyészetekben is végbemegy-e. Elsőként igazoltuk klséricbicg, hogy tneglepo módon az epithehalfs és a fibroblast sejtek szegregációja alveofáris· epltheíium és fibroblast sejtek peitetált kevert tenyészetében is végbemegy.

Váratlanul -azt tapasztaltuk, begy még nagyon kicsi, azonban strukturált aggregátumok is szöveti jellegzetességeket mutatnak, és így megfelelőek kölcsönhatások tanulmányozására, és vegyületek vagy környezeti hatások tesztelésére,

A kis ííggresátumokuak számos előnye van, például nincs szükség speciális reakcióedényekre, méretük és a különböző sejttípusok aránya reprodukálható és ezákal s kölcsönhatások könnyebben koctroliálhfeóak. Kis aggregátumokban gyakorlatilag sem várható a szövet aggregántmok belső részeinek nekrotizálódása. Továbbá meglepően egyenletes méreteloszlás érhető ei, ami különösen alkalmassá teszi őket párhuzamos tesztelésre·.

így előnyösen a találmány szerint fent kelt tartani az aggregátonok kis méretét, feltéve, hogy megjelennek a szöveti jellegzetességek· és Így köte»önbaíásokat lehet vizsgálni..

Ha az aggregátumok tói kiesik, a leírás szórtat feltárt, helyes morfológia esetleg nem alakul ki, és az aggregátumok esetlég nem mutatnak szövetszerő jellegzetességeket. Ha az aggregátumok túl nagyok, méretük na25 gyón eltérhet az átlagtól. Továbbá az aggregátumok belsejében nekrotizáfódás következhet be a .hosszabb tenyésztési idő és az aggregátumok perfüziój&nak alacsonyabb szintje miatt.

Speciális hozzáadott anyagok hiányában, például h& csupán sejrtenyésztő tápközeget kapnak, az aggregátumok növekedését a sejtek közötti kontakt gátlás kontrollálja.

.A méret függ azonban a sejtek számától .az aggregátumban·. Szakember számára világos, hogy az aggre30 gátőrnek mérete és bennük s sejtek száma- adóit határok között változhat, feltéve, hogy a fent ismertetett követelmények teljesülnek.

Azt tapasztaltuk, hogy endothelialis sejtek hozzáadása nem változtatta meg jelentősen az aggregátumok méretét..

.fofon fo/d/njdnyén« /efoassndító# /v&ro&fert va/tek

A fibroblast a kötőszövet! sejtek családjának: iegsokoldabíbb tagja, a legelterjedtebb sejttípus. A librohlastok a szövetek integritásának fontos strukturális elemei. Majdnem minden humán szövetben és szervben, Így a tüdőben is, részt vesznek a 'repsir és regenerációs folyamatokban. Elsődleges lünkeiöjuk az extraeeilulsris mátrix CEC.M) .szekréciója. Az ECM proteinjei szöveti vázszerkezetet alkotnak a. normál helyreállt lílási«. repairj események, pl. ez epiibetialis sejtek migrációjának eiősegftésére.

- 19♦ * «*:** ** « ♦ * * * ♦ ·#»' * * * « «χ ♦ « « *

ΦΦ «» ***

Λ ffbroblaatok, vagy elkülönül? szubpopaláciöíh s:zövet-speei.fikusan funkcionálnak min? ima«H;regulátorok, cbexnokinekst és Cítokineket szekrctáluak, amelyek Immunválasz kiváltására képesek a gyulladási- és iru.m.unsej'tek vonzásán keresztül. A különböző ssnatómiai helyekről származó ftbróblastok sgy sor közös fénofiposjegyet mutatnak. A übroblastok, azonban, különböző anatómiai helyeken különböző fenotípusokat mutatnak. A tüdööpröhiasíekrs Is jellemző a fsbreblast növekedési faktorok és receptoraik jellegzetes expresszíója [De Moerloozs, Spencer-Deoe és mtsai, (2080)j.

Az; tapasztalmk, hogy -rá lehet bízni a fibrohiastok fiziológiájára, hogy mesterségesen tervezete szöveti vázszerkezettől mentes szöveti rendszeri alkossanak, amely bizonyos aspektusokból hasonlít a disztális tüdőszövethez, tehát a mesterséges vázszerkezeten alapuló modell nem a háromdimenziós túdőtenyésxeíek létreho10 zásának egyetlen módja. Anélkül, hogy 'bármilyen elmélethez kötődni kívánnánk, feltételezzük, hogy az eredmenyekhez jelentősen hozzájárul az a tény, hogy a íifcrobi&stok a tüdőben ECM-öt szekretálnak.

í'piíádíoíA sebéé <'•’nínímoeyíáél

A pnemuociták (tüdő- vagy alveoláris epitfreliabs sejtek vagy AEO-k) olyan epkheiiaíis sejtek, amelyek a normális alveoláris alapmembránon fekszenek, azaz a perifériális gázcsere területén a tüdő disztális íégutaiban.

IS .A pneamocilák vagy ÁEC-k két csoportra.oszthatók: l. tipnsú és H, típusú pneernocitákra.

A két alveoláris epitheiiabs sejttípusra jellemző markezek. könnyén nyomon követhetők és motútörozhutók a kísérletek folyamán, RT-PCR és inmnmhlszsekétnla alkalmazásával.

/. /tb.vsá píté'Kwoeíáí.k

Az 1. típusú pncursockák 11. típusú alveoláris pneumocilák, 1. síposa aiveoiaris .sejtek fröv, ATI sejtek), 28 más néven kis alveoláris sejtek,, ellap&lt alveoláris sejtek, meraöránszerü pneumocíták, vagy I. típusú alveoláris cpiíheii&íis sejtek], komplex elágazó sejtek sok cstopiazmikus lemezzel, amelyek a gázcsere felüfeieként szolgáinak a tüdő ai veolostúbars. Ezek a sejtek rnemboi ikusan aktívak, és különböző anyagokra specifikus receptorokat hordoznak felületükön, köztük sstraoeílaiárls mátrix ÍECM) proteinek, növekedést faktorok és eitokinek receptorait. Az aiveoius felületének kb. 95 %-át E típusú pneutaoclták borítják.

/7. r.yvtz’é p7?e,w»ío<.-ííd.é·

A II. típusú pneumoelták {alveoláris 2. típusú pueumoctták, 2. típusú alveoláris sejtek; tóv, Α.ΤΪ1 sejtek, T2P) kuboldáiis ephholialis sejtek, más néven 2. tipnsú alveoláris epithelialis; sejtek (róv, ABC. vagy ΕΡΊΙ sejtek), 2. típusú granolárss pnenouíriták, 2, típusú sejtek, 2. típusú alveolociíák, septalls sejtek, nagy alveoláris sejtek, vagy grnsuiáris pneurnociták. Ezek a sejtek éretlen epitbeliahs pregemfor sejtekből keletkeznek. Úgy gondoljuk, hogy az alveoláris 2. típusú pneamociták az alveoláris ephheliutn pregenitor sejtjei·., Áz önmegújkáson kívül képesek eilaptn? (sqnamons) 1. típusú pneumocítákká diffarendálödsi. A II. típusú sejtek kuboldálls sejtek, amelyek az alveoláris felszínnek mindössze 4 %-át borítják, számszerűen viszont az alveohfris epi thelialis sejtek 60 %-áí, az összes íúdösejí 10-15 %-át adják (Crupo és mtssi. I9§2).., ///, ífettóá o/vesddíás -φί/Λνόο/ό;

Λ 3. típusú alveoláris epithelialis sejtek abban különbőznek a lapos 1. típust· és a kuboidúlis 2. típusú sejtektől, hogy csúcsaikon nrikrífeolyhoka? hordoznak, és nincsenek bennük larneliáris típusú szekréciós grsruhumok. Ezeket a sejteket más néven alveoláris Meséitekként említik, £Wo/&e//o& .rriteé

Az endothdialis sejtek fegkslap alakú sejtek, amelyek a véredéoyek üregének felületet borítják egyetlen étlapok eplthebíüis Amham = sejtrétegként, auglsbíasiokbőí és heutaftgjohinstokőöl származnak, * »

Λ makroiáge'k csontvelő eredetű mooocitákből keletkező sejtek (csontvelő; eredetű firaferefögok), amelyek különböző szövetekben telepedjek le (.„homfeg”). A m&kroíagok differenciálódása a csontvelőben elhelyezkedő uni- és bipettmcjális progcnlior sejtekből különféle eítokmek által kontrollált folyamai. További diffe5 reneiálődás megy végbe & szövetekben, és sz ott kialakuló mákrosag populációkat: rezidens makrofágoknak nevezzük.

J/fedse/reá

A hízósejtek muídpótens CD34(fe> prekurzor sejtekből keletkeznek a csontvelőben (Nakahsta és Tóm 2002; Austeu és Beyce, 2001). Az -éretlen· hízósejtek a szövetekbe történő migrációjuk után veszik fel tipikus

-granuláris morfológiájukat. Ezek a sejtek Fe-epszilon-Rl-et is expresszálnak, és elvesztik CD.34 és Fc-gststna R.2 expressziójukat A tfödő és az latest inalis mucosa hízósejtjeinek többsége vagy csak triptázt (designált MCT), vagy csak kiraázt termel, A hízósejték központi szerepet játszanak az azonnali allergiás reakciókban, azáltal, hogy potens medíáíorokat bocsátanak ki.

őVmoízome/feá

A simaizomsej-tek magasan specializálódott multifunkcionális kontrshíilis sejtek (rnyaciták, vasctdans rnyochák). melyek vagy tranziensen szabályozzák az .öreges szervek öregének méretét (reverzibilis kontrakció), vagy krónikusan felferosis és izom hipertrőfía). A simaizom sejtek fontos szerepet játszanak a vascuicgenszisfees, formát adnak, a véredényeknek, és fenntartják a éwtdszeri tónust

Endothelialis sejtek hozzáadása dedíffereneiált sejteket tartalmazó, stabil aggregátumokat eredményezett.

A differenciálódás mértéke- -nem csökkent ha emáofoelialis sejteket is .beépítettünk a modell szöveteyészetbe', ezt az. expresszáfödö markerek alapján figyeltük meg. Úgy tűnik, hogy ezek az aggregátumok fenntartják a réteges szerkezetet, ahol az endotbeiíaiís· sejtek belül helyezkednek el.

a találmány megvalósítási módjai

5 jfdrpmdrmerxnidr rdséffi&fee

Jelen találmány szerinti módszerek szerint legalább tfödő epítbelialis sejtek és mesenchymalis sejtek, -előnyösen 11 brobkisfok, kerülnek felhasználásra, A sejteket külön tenyésztjük, hogy életképes tenyészeteket nyerjünk, azután összekeverjük a megfelelő arányban és együtt tenyésztjük őket COj jelenlétében a megfelelő körülmények. között, ahogy az érthetővé válik az itt közölt módszereken alapulva·.. .A sejtek, megfelelő arányának beállításával és a megfelelő körülmények kiválasztásával elkerülhető, hogy egyik: .sejttípus· túlnője a másikat

Egy előnyős megvalósítási mód -szerbit s sejteket emberi személyből, primer sejtekként uyerjűk, és deditferettciálfetjok vagy .azonnal felhasználjuk. A dedifforenciálődást -elvégsz-hetjük például ismert módszerekkel (passzázsok, egyéb sejttípusok eltávolítása, növekedési fekíorok hozzáadása). Ha a sejtek képesek kosíluetseiára, dediífermcíáltakúak. tekintjük .őket,

A ko-kultúráh&á tenyésztett. sejtek peiletálása fontos lépes, kialakítja a sejt-sejt kontaktusokat és beállítja a megfelelő sejt-sejt távolságot. A sejtek ps-lietálásárrak legkézenfekvőbb módja a centtiíugáiás. A pelletálás megfelelő -módját szakember képes kiválasztani a feirásbaa nyújtott klttműá;; alapján.

A jelen modellben elvileg bármely felsorolt sejt felhasználható- a natív tQdöszővethez közelálló tödószövet-modéil előállításához. Mindegyik alkalmazott sejttípus képes kell. hogy legyen szaporodni a háremdmsenzi40 ős modeiiszövct előáll kásához. használt, itt kórt körülmények között, és ifepes kell íegyett ass/iaa.nzova a w>deil • 21 · méta sejttiposaivak Ezeket a faktorokat tesztelő! kell -előzetes- kísérletekben. A- további sejttípust célszerűen viszonylag kis arányban keli kezdetben a tenyészethez adni, aztán arányát nővehn lehet, amíg elérjük az in vive állapotra jellemző arányt.

A előnyös megvalósítási módokban további sejttípusok, például endotheltalis sejtek és a -simaizoms-sjtek 5 adhaiök a modellhez.

őeregség/míricZfeá

A fent leid modellre alapozva, és különböző génbevitelt módszereket, és célgéneket alkalmazva, a fent leírt rendszer könnyen adaptálható- a tüdőbetegségek folyamán végbemenő genetikai változások tanulmányozásara,. amely áj gyógyszeres .beavatkozási pontok azonosítására és áj terápiák kio^tesztóséhez vezethet.

i ö Ha-a betegségben gyulladás szerepet játszik, az érintett sejtek, előnyösen az epkheliaits sejtek gyuHadásverkentö cítokimte expresszálnak (a normáik- szint felett), és a modell gyaliadésmodellHa a betegség tumor, a sejtek transzformált, azaz malignassn transzformált vagy halhatatlan -sejtek, és -a modell tamormodelí.

Ha a betegség ribrózfeí foglal magában, a modell fsbrózísmodeil.

Ha a betegségben szöveti sérülés szerepet játsszák, a modell: regeneráció-modelt.

A betegségmodellekét alk&bnazbatjak hatóanyag-tesztelésre.

AtófeíTS-Móíte m, e·'·' .séfed.

Egy meg valósítási mód szerint a pnímonalis sejteket páciensekből nyertük és a találmány szerinti módszerrel. tenyésztjük. Ebben s .megvalósítási módban: előnyösen sem vagy csak részben tesszük lehetővé a dedlffereacíálódást, Ezután gyors preparativ eljárásban 3D modell szövetteayészetet-alakítunk ki és a páciens kezelésére javasok hatóanyagokat teszteljük vagy egy javasolt terápiás rezsimet tesztelhetünk. Ezen .megvalósítási mód előnye többek között az, hogy egyforma összetételű és mérető, tiszta, párhuzamos mmtatenyészeteket tudunk e-lőállüani·. A minták továbbá- mentesek bármely patogéntől és szükség szerint tisztíthatóak.

kjpfezsi'gv.s sejtekbőf

Egy előnyös megvalósítási mód- szerint a betegség modelleket egészséges sejtekből kiindulva állítjuk elő, és a sejtekben a betegség jellemzőn {tüneteit} kiváltó faktorokat- később adjak hozzá.

Például tumor modellt állítunk éló egészséges sejtekből és a rossziadufeid transzfotmációt kiváltó faktorokat adunk hozzájuk és/v-agy olyan géneket, amik rosszindulatú transzformációt okoznak, ha a sejtekben expresszálödoak. Megfigyelték, hogy a Wní-Íehérjék szintje, például a Wnt5 szintje emelkedett puhnoaaíis tumorszővetben. Vgy látjuk tehát, hogy tosnormodeílek állíthatók elő tumorogén faktorok, például EOF (epjíhelteös növekedési faktor). IGF ri-nzufm-szeró növekedési faktor), insfofo, Wnt faktorok, például WntŐ vagy ezek alkotta koktél hozzáadásával a sejtkevorék-hez, vagy a találmány szerinti tenyészethez.

Szer» -eljárás egy változatába® tumoros sejteket adunk a tápközeghez, amelyben a találmány szerinti, modell tenyészet felen van, de azokat egy felig áteresztő membránnal őíkülörsifjük. Ezáltal a tumoros- sejt termelte

3$- faktorok tumoros (rosszíndoiafó) átmenetet eredményeznek a találmány szerinti tenyészet .sejtekben, r«fofo/»?<?r---yto/vo/?;kűkóö/ áfociteh

Tüdötumor-modeUekeí készíthetünk tödőnunor-sejtvonaiakból. Ilyen sejtvonalak minden nehézség nélkül hozzáférhetők az .„Ameriean Type Calture Cóileetíon’' gyűjteményből (ATCC: Eockviiie, MD, USA}, ha tumor-sej-tvonalakra keresünk rá, iö Tanácsos kísérteteket végezni ahhoz, hov.v ateafalá-juk a megfelelő körülményeket a sejtek tenyésztésére és optimalizáljuk a sejttípusok arányát a sejtíteverékben:.

Ci-id/adásos ÍSOífeö'ík

Gyulladásos modellekhez moacoüákat és/vagy makrofágokat adhatunk a találmány szerinti modell tenyészethez, előnyösen az előállítási eljárás alatt.

Az ilyen modellben LPS-scl vsgy WmSA-vai végzett előkezelés javasolható.

Aktivált makrofágok citokin termelése, továbbá egyéb faktorok, mint. a WatS· termelése, hatással van a sjzövettenyészetre és tehetővé teszi egy gyulladásos modell megalkotását.

Ha gyulladásos modellrendszert vizsgálunk, a puimonalis aggregátumoktól megfelelő kamrábso membránnal elkülönített seutroíil sejteket aikahnazhatunk. Ebben az esetben a xwfroftl sejtek migrációját és M.MF1Ö -termelését is merhetjük,

Egy alternatív megvalósítást o?ód szerint puteumaiis betegség snődeh-sejtvonalakat tenyésztitek a találmány szerint. Ebben a megvalósítási módban drogokat tesztelhetünk adott betegséggel szembeni hatásuk szempontjából,

A. betegség modellekben fokozottan expresszálőáó gén alkalmazása kerülendő,. és inkább indukálható 15 promótert célszerű használni.

Gyu/íOiábos ínoíteöoá natív pulm-ertalis' se/l t^greígáíatwöábó/

Gyulladásos körülmények ímitáiására natív három-dimenziós palmonalls sejt aggregámmoksí kezelhetünk. különböző, gyulladásost reakciókat kiválté anyagokkal.

Ilyen anyagok például a következők: kémiai anyagok, amelyek akut gyulladást okoznak, például 20 vazoaktlv aminok, eikozanodiok, stb.

Gyulladást kiváltó poiipeptidek, például növekedési faktorok, hidrolltíkus enzimek.

Reaktív oxigén specleszek, gyulladást .kiváltó citokinek, például IPN-v -és más etíokmek, bakteriális sejtfal-kivonatok.

A gyulladásos körülményeket. citoktnexpresszsó detektálásával, például biokémiai: vizsgálatokkal, immunológiát. vizsgálatokkal, például EtlSA-val, PCR-alapú .módszerrel, például valós idejű PCR-rel, vagy expressziós artalízissaí, például géuchip alkalmazásával tesztelhetjük,

Primer scyteá geuedáöd Módosítása

Mind.az eplthellaíís, mind & mesenclmmlís sejtek, genetikailag módosíthatók rekombináns vínisvektorok (rAdenovirálts és rLcuti virális vektorok) segítségévek Ezek a génbevitelt módszerek nem befolyásolják a. sejtek aggregálódási: képességét. A gyulladás, tumor, bbrosis vagy .regeneráció jellemző génjei konstitutívat vagy ladukáibaiónrs tülexpresszalhaíóak vagy eihallgattathatóak, és tt szövetmortológia, cellu'láris válaszreakciók ss gém és pretteinexpresszló-változások háromdimenziós mikrokőrnyezetbeo tanolmányozhatóak.

Például, egy vagy több, toorképzódést elősegítő gén vihető be egy füdősejtvonalbá, pl, alveoláris I.

vagy' 11, típusú sejtvonalha, előnyösen II. típusú sejtvonafba, vagy egy flbroblast-sejivonalba. Ilyen gén lehet pl. oakogén, pl. a roy gén vagy egy tumorra jellemző mintázatban expresszálédó gén vagy gének, p.i. COX-2 gén. Megtörténhet, hogy egyedül a ras gén expressziója- nem· elegendő a sejtek, előnyösen halhatatlan sejtek ttanszÍGtmálődásához, de a sejtosztódás valőszínSleg nőni fog [Wáng, XQ, ti, 1-1 et al <2009)1, amely betegség jelleget kölcsönözhet a modellnek.

lö ,i ;V'Ví?i.-í' sc/mycccgmm/msóv?? <·/ Yíte;c;fe> ósomoí Axrctete/éffcx .«ródíMÍföso giVícbáíu/^y ?;?<;te>?;/<>;/

- 23 φφ ΦΦΦ* ΦΦΧ* és ízuGetédiín ;rra::á«i{ sfefvouofeáofeöúrípzásiívírt

Ebben a megvalósítási módban minden sejttípust fertőzetle-nöi hagyunk, ezért a génexpresszlok' éppolyan normáiisak. mint bármely adott háromdimenziós túdőszövet-moáellbe-n. Az aggregátumok ceiluláris kompozíciója azonban tartalmaz S-1Ö· % szuöfetálisan aradiak sejtet, akár Ebroblast (WI-3S) akár alveoláris epiíheliatis sejtvonalat (A549), esetlég mindkettőt, amelyek genetikailag módosították, és különféle faktorokat (Wnt-okat, csonúoorfogenetiktrt-proteínt (BMP), gyulladási -és gyutíaáásserkentő -chökineket, növekedési faktorokat, stb), szekretálnak, amelyek módosítják az aggregátumok mikrokömyezetét. Szubletális «radiáció csökkentheti a sejtek szaporodását, és megakadályozhatja, hogy az egyik sejttípus túlszaporodja a másikat.

7er#ídÁeA

I ö A találmány tárgyát képezik 313 modell-szövettenyészefek többszörös mintáit tartalmazó készletek is.

Előnyösen, a. taríóedeayek lemezben levő bemélyedések, pl 9$ bemélyedést vagy 384 beméiyedésü lémez,

A 3 D modell szö vet lehet egészséges- szövet: vagy betegség modellje (betegségmodell-készlet).

A lemez tartósdények vsgy bemélyedések célszerű. elrendezéséből' áll, ahol a sok tartóedény terveződen kialakított, háromdimenziós- íődö-modellszöveíek egy vagy több típusát tartalmazza a megfelelő tápközegben

A tartóedény lehet árpás fenekű, U-fenekö, vagy előnyösen V-fenekÜ, olyan lemezen, amely lehetővé feszi több minis párhuzamos tesztelését.

Előnyösen, s tartóedéayék nem szővettenyészet-kezehek,. miáltal elkerülhető» hogy a sejtek a tartóedény tálára tapadjanak.

Egy előnyös megvalósítási módban az egyes tartóedény egyetlen aggregátumot 'tartalmaz. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az egye tartőedényekben levő tényészetmiutak a találmány rövid ismertetésénél meghatározón számú sejtekből: áitok.

Előnyösen a tart-őedésyek le vannak zárva,. együtt vagy egyenként, és CGj-ben dúsított környezetet, vagy a tüdő szó-vehenyészetaek. megfelelő atmoszférát tartalmaznak» a találmány rövid iswrtetéséséi megbatározot25 lak szerint.

Tipikusan a betegségmodellek ugyanilyen körülményeket igényelnek.

Előnyősén a sejtek biokompaöbiiís -festékkel megfestett sejtek, amely alkalmas a 'következő ceiluláris jellemzők nyomon követésére.: a sejtek állapota pl, sejtfázis, sejtek életképessége, apoptőzk vagy a sejtek moribund állapota; sejttípus; sejtek lokalizációja; maligtms transzformáció; gyulladás.

A.'<;«0‘;:i!iok

A készletek tiszta cpiiheliam- és fibroblast-tenyészeteket tartalmaznak kontrollként. Egy lemezen előnyösen legalább 3-3 kontroll 'bemélyedés van (epítóliun és tlbroblasí).

Előnyösen, további .kontrollként egy 2D tüdőszövetet is használunk a 313 állapotra jellemző tulajdonságok felmérésére.

-35 Kérésre, tehát, egy 2D kontroll lemez (előnyösen egy lapos fenekű, adhézív szövettenyésztő lemez) mellékelhető a 3D szövethez. Másképpen, a lemez tartalmazhat 2D tüdöszővef tartalmú bemélyedéseket kontrollként. előnyösen lapos fenekű bemélyedésekben..

Tehát a találmány egy megvalósításában kétféle bemélyedéseket tartalmazó lemezek használatosak: Vfcnekü bemélyedéseket a 313, és lapos vagy ii-feuekííűket a 20 szövetek számára.

-M l-ÉLDAX .Ld^hfezzÁnyagokér móíbzerek

Primer SAEC, NHLF'és pulmon-atís HMVSC-sejteket a Lonza cégtől szereztük be. Minden sejttípust különböző nemű és kom, több randóm donor tüdejéből izoláltak. Rendre SAGM, FGM vagy EGM-2 tápkőzegef alkalmaztunk a SAEC, NHtE vagy pulmoindis MMV-EG sejtek kezded expandáhatására, a gyártó- ajánlása sze~ rlnt. Minden sejttípust 5% Cöj-t tartalmazó atmoszférában mkabáitank 3?°'C-on.. A 28 és 38 tenyésztéshez tiszta vagy kevert -sejtpopulációkat tenyésztettünk SAGM (Smali Akway Growth Médium, Lonza) és teljes DMEM-tápközeg 5-Ő-SG%-os keverékében. A HMVEC sejteket tartalmazó- két és háremsejtes HMVEC sejtekhez szükséges megfelelő növekedési fakfor^kiegészifÖ-ket adtunk a SAGM és ÖMEM-tápfcözegek 50-58%-es keverékéhez. Az összetett sejttenyésztő tápküzegefcet a gyártó utasításai szerint készítettük el. A 2.8 és 3-8 teli) nyésztéshez a sejteket a jelzett arányokban összekevertük és iapos-íenekő haí-lyulöi lemezekre vagy 96-lyuksk V-fenekü lemezekre (Sarstedt) vittük lek előbbit az előbbire, utóbbit az utóbbira, A V-tenekú lemezeket azonnal leoentritágáltuk, miután a sejteket felvittük, ÖOO g-vel 10 percig. szobahőmérsékleten.

A SAEC-sejtefeet és az NHLF-sejtefcet a következő- fluoreszcens festékekkel festettük meg:

Dií (Honig, M. G. és R. 1. H-ume (1989)) és C.FSE [Wang, X. Q., X. M. Ottan, és munkatársai ¢2005)),

1.5 hogy követni tudjuk a sejtek mozgását a tenyészetben. Matrigel-lei készük és anélkül készült sejteket vittünk fel pipettával V-fenekű, 9ő-mélyedéses szővetteayészettó nem kezelt lemezekre, éá mkubáltuk. azokat 1 órán keresztül CCC inkubátorban 3? °C-on. .Az Inkuhálást követően a sejteket 2809 rpm fordulatszámon 5 percig ülepítettük szobahőmérsékleten, majd a kapott sejöfodékef agy éjszakán át inkubáltuk (5% Cö_2> 37 ⁿC),

Az A549 sejtvomfat 1972-ben· vezették be (8. .1. <3tárd és mtsai, (19733); egy 58 éves férfi tumoros tüdő20 szövetéből származott. Az A549 sejtek adenokajclnőma eredetű humán bazális epíthelialis sejtek. Az A549 sejtek laphámsejtek (soua-m-oos: epitbehalis sejtek). A 2x18'* sejt/ cm2 koncentrációban, a megfelelő táipeldafbanindítóit sejttenyészet 5 nap alatt. 100% kontinens lesz.

Az A549 -sejtek beszerezhetők az American Type Cniture Colleetion-tői (ATCC; Roekvilfe, M8) mint CCL-I.-85 sejtek,-és 10% magzati botjüszénmunal (FCS, Feíai Calf Semm) kiegészített Ham’s F-S2 tápöldafbast (GIBCO BRL, Grand Isiítnd, NY) tenyészthetők a forgalmazó instrukciói szerint.

A Wl-38 sejtvon&lat 19ő2-beo fejlesztették ki egy terápiás célból abortáít kb. 3 -hónapos foetas södőszövetéből. A tődószövetbol tripszines emésztéssel nyert sejtek szolgáltaik a primer tenyészetként. A sejtek, morfológiája Hbroblastszerü. A karietipus 46, XX; normál dipíoid nőnemű. A tenyészetet 50 populáció-duplázódásmaximális'-élettartamig tenyésztették. A felépülés utáni -timiáin-jelöiésiindex 8ó% volt, A-GóPD-'izoenzím típus .30 B. A Wl-38 tenyészet o 9. passzázs utás lefagyasztott sejtek expanziója.

Λ W.t-38 sejtek beszerezhetők:

iWbAíteXí&AKOdi^ American Type Cultare Cóílection (ATCC; Roekvilfe, MOjmint CCL-75. és a forgalmazó instrukciói betartásával szaporítjuk azokat.

A -Cl,'13 vagy CL30 sejteket (Wardiow és snísai. (2ö02)j Dulbeeco álfái módosított Eagíé/Fi.2 tápohlaf.35 bán tenyésztjük, amelyet.50% FCS-selés 25 oákrogZ ml gentatnfeinnel egészítünk ki.

Előnyősén a humán sejteket. 3?''C-oo, COj-tártaimú, párás atmoszférában tartjuk fenn,

F7«ómzee«s -őr ffdicrosAőp/a

A 2D és 38 tenyésztés előtt a SABC-, NHLF- és HMVE'C-sejteket rendre a következő fluoreszcens, fiziológiás festékekkel festettük: C.FSE, Dlí és BID {mindegyiket a Moiecular Probes cégtől szereztük be), A s-ejte48 h-ί kétszer ÍúoAok PAS-bco ez 0,5 yg/ud .kotK-ctüráeiój-ύ CFSE-vei, Dil-vel vagy DiD-vG inkubáltuk 37 C-vu percig, A festékek feleslegét a sejtek DMEM-H9% FCS-sel történő mosásával eltávolitoísA. A 2D és 3D tenyészeteket a Suomxeensen jelölt sejtek alkalmazásával állítottuk elő, mint fent jeleztük. Egy éjszakát; át tartó Inkubálás után a 3D sejttenyészeteket gondosan eltávolítottuk a V-feuekü lemezekről és átvittük fedöiemez alapú .{„coverslip-bottom”) tálcákra (MaíTck). A tüdöszővet mikroíe'nyészeteket fluoreszcens mikroszkópiával (Olympus i'X-Sl mikroszkóp) vagy konfokáiis mikroszkópiával (Olympns FVtööO konfokábs képalkotó rendszer) vizsgáltuk,

Ó’gíívá/ugipíjí

A S'ÁEC- és NHLF-sejteket CFS-E és Öli festékkel festettük a gyártó utasításai szériát (Molecuiar probes), A sejteket összekevertük, és 72 órán át tenyésztettük 2D és 3D rendszerekben, A festett sejteket enyhe

ÍÖ tripszines· kezeléssel dísszociáita-tuk, majd ezt kővetően PBS-HSDTA-val .kezeltük. A disszociált- sejteket- 8D FACSVantage sejiválogate eszközzel válogattak az mRNS preparálás érdekében lixis puffért tartalmazó csövekbe (Miítenyi Bloteeh).

eöíV<5-.$riztóz& és kvantitatív RT-PCR

A 2D- és 30 sejttenyészeíekbői össze RNS-í preparáltunk NaeleoSpln RNAil reageuskésxlet alkalmazá15 savai (Mackery-Nagot) az oszlopos végzett ONáz-emésztéssel.. A válogatott SAEC-minfákbói mRNS-t preparálUtnk pMACS mRNS- izoláló rendszerrel (Mttesyi öiotech). A cDN-S-t az RNS mintákból MMuLV reverz ttansztóptáz reagenskészlet alkalmazásával állítottuk elő (Thermo Seientifíe). A valós idejű kvantitatív PCR-vtzsgáiafokat ÁSsolate QPCR SYBR Geen Low RÖX „mester mix” (ASGeae) egy Applied Biosystems 7SÖÖ PCR- berendezés alkalmazásával végeztük,

A láncwdítókat az i. táblázatban soroltak tél.

.ReáwwÁfewy acfenovfrális vektorok

A számunkra, fontos teljes géneket vagy csak GFR-t tartalntazó szekvenciákat „«lőre ·(§’); 5’- -3' és „vissza <3’): 5’- -3’ iauelnditó szekvenciákkal ampltSkáltuk és 'ingázó {„Sbuítle”) vektorba klónoztuk, majd homológ rekombinációval az sdenovlfas-wklotba juttattuk be. Az adeoovírnsí li-nearizált plazmid DNS 29325· -csomagoló sej-tvooalba· (American Type Culásre Coitection, Rockvllle, MD, USA) történő írunszfektálásával áll köbük elő, Lipofectamme 2öö0 (Invítrogen) felhasználásával. A kaprát piakkokat ampl lfikálbA, sz adenovirust tisztítottuk és koncentráltuk adenovlrns tisztító készlet (BD Biosciences) alkalmazásával.

Epittieiia/ii· se/íek/érrdzése oránmvírssW

GFP-t vagy a számunkra fontos gént és GFP fúzióját tartalmazó adenovlrust adtunk supát sejtekhez 20 vagy 30 kórliimények 'között, 1x106 sejtet reszuszpendáitsusk 250 p.I sejtet és 5Ö pl vírust tartalmazó tápfcőzegben 90 percig 37 Χ?.-οο.

i Mis	A gés festesse	píiiírtsi SÍB	,,Β«”ρΠ8»ίίίί0«ίίΙ	,W|anM	Ttwék- tesz
AOR	itotiiospfayí^apírífij	NBjXí	siCCCCi’WATTTCCA	;K;se	dd
AQR	HöíS(SspaíSi)»aj»rínA	NMJÖWSö	GCGAGGAGAGCTCCTAGGAT	AC;GGTGCCÁG3?GAATC	Iii)
: AQH	lfo®Síp«Wnn5	HUH»	CÜTTGGGGTGGTCAfGA	agggggggctag(:gagaaaag	61
tai		Wí»í	ÍACCGGSilaAKTTÍiAAA	TíGACSGCGAGAGGTAGAC	93
li, lf:	ΙΙϊϊηκ) s^>if is öiteifaíkis i, i«a	NMJ08576	aramra	TGGCGAGCTGGGGGACITCIG	62
íl(í	Ηοπκ) φ® tohh 6	NMB«	AGGGCTCTTCGGí^AáTGTA	GSAGGSTGCGSGTSAiSAGAA	62
öiü	(iesss^esfestiií?	NMJOé		rCACTTTCCAGíiCTGTCTCAC’rGTCT	ö
íN-B	tosapffiscsdtesű	W«O2	AGCTGCTGACGGGATACACG	GGGCATGASGGAGAGCGl'C’'	lö
SíXiAA	&sw sápi® SB ofóm hb&g proiáAA	NMJBil	GGGAGAAGGCCGTG	CGCl'CTRGCCGGAGTACTK	ö
OA!	fel» sapiens ffi&tsfit ρίΛίπ Ai	NMB54Í1	CGGCaGGCTGCAGGATö'	ATtca«GKKm	m ::
SFfffi	Ηβη» sápi® iSí&M proies 8	NMJ9W3	SCACrTSAASSAüGGlGTGíT	ístgcccacaccacctg	128 i
SRK	Hm>sapíe««AeM|in®C	Ml	AsAGKGACAbCTGCGÍRATGGs	CCGGGCCCAGCaAGACGÍA	Ö
ro-i .............................	(NKX2J),	MIIG	GsTGK'GATGAGTCCAAAGCA	GCCCAGIGOGTAGCGTKC	fö

·♦» » ♦ X ♦ » >

» χ ί « ν X » ♦ i* ♦ > X » X ♦ X

JO3.J3773CSG1&

t * »♦ » » « >

ί »««« «φφφ * β φ

Φ Φ Χ· ♦

Φ Φ φφ Φ * χCXCó-5 vfafgdútt

A 2D és 30 sejtteuyészto télíilősze CXCL-8 ÍIL-.S) tartalmát Qumtikine CXCL-S/1L-8. EEÍSA resgenskészleüel (R&D Systems) mértük. A szendvics ELl'SA vizsgálatot- a gyártó utasításai .szériát hajtottuk végre. Röviden, azonos mértékben hígított sejttenyészet-felüiftszó· mintákat és· CXCL-S-siandardokat osztottunk el CXCL-8 ellem monoklonális antitesttel előre burkolt lemezekre. 2 óra 'inkubálás után szobahőmérsékleten a lemezt négyszer mostuk a mellékeli mosópnfferreL A HRPO-konjugáit poltkfonáUs, CXCL-8 elleni antitestet 1 órára adtuk hozzá a rendszerhez, Egy végső mosási lépés után TMB szubszírat oldatot adtunk a mélyedésekhez. Az optikai sűrűséget egy iE'MS .Reader MF készülékkel (Thermo Labsysteíss) határoztuk meg 458 és 570 nm hullámhosszon, az adatokat pedig Ascent szoftverrel elemeztük, ,· ab.ttí.k weunylség/ értél«/éve

A kvantitatív, valós idejű RT-FÜR. adatokat delta Ct (dCt) és relatív nwnnyiség-ő („Relatíve Quarüüv'’, RQ) módszerekkel elemeztük, 7508 System SOS szoftvernél, az Applied Biosystems javaslatait követve. Minden mintát két párhuzamossal vizsgáltunk. Röviden, a Ct értékeket minden mintára meghatároztuk automata küszöbszintet alkalmazva a 7580 .System SOS szoftverrel. A delta Ct (dCt) értékeket a kővetkező képlettel hatá15 roztuk meg:

áCt (cél gén) ~ Ct (eélgén)—Ct (háztartási géni.

Az RQ értékként ábrázolt génexpresssóős változásokat a következő képlettel számítottuk ki::

RQ ~ l'^íi(iO, ahol a ddCi értékeket a következő képlettel számítottuk::

ddCt ~ dCt (mióta) — dCt (referencia minta).

A sejttenyésztö felölöszók CXCL-S-ísrtaknát az optikai denzitásnak standard görbéhez való hasonlításával batározuik meg. A standard görbét hét különböző CXCL-8-köuoetttrácidbó-l számítottuk a 31,2-2008 pg/tni tartományban. Két-két párhuzamos reimás alkalmaztunk és a további adatelemzéshez az átlagértékeket használtuk.

APmAA^Hdremdirnsnz^^ .25 á'Kggöésigyi mc-ded

Hogy szimuláljuk a humán tüdő szerkezetéi, 181) .808 sejt 3Π aggregátumából indultunk ki, amely durván egyenlő arányban random összekevert fihroblast (NBLF) és kis légúti eplthelialis sejteket (SAEC)· tartalmazott. Egy nap fftggőcseppben· történő inkubáció alatt a sejtek laza. szöveti szerkezetet alakítottak ki, Az 1. ábrán 58 % SAEC és .50 % NH1..F keverékéből álló föggöcsepp-íeeyészel iáibaiő.

A képződmény azonban nem volt stabil, és nem lehetett a keletkezeit tni'kroszövetet átvinni másik tenyészedénybe helyrehozhatatlan károsodás nélkül

PvUeíáp maíngett t&rtaimasó ínoíAE/

Hogy följött a kevert iödőmikreszővefek stabilitása, SAEC és 'NHtP 1:1 arányú keverékét pelletáítttk és {«atrigei jeienlélébefi tenyésztettük. Sok 3D född és egyéb szövettnodelihez használnak matrigelt, hogy hárout35 dimenziós szerkezetet hozzanak létre, ahol kálOabözó sejttípusok osztódhatnak, és kölcsönhatásba léphetnek egymással A SAEC- és a NHLF-sejteket fluoreszcens fiziológiás festékkel (Dil Honig és Kume 1989), és CFSE- vei (Wang, Dttan és rnísai. 2085) festettük meg. hogy a .sejtmozgások követhetőek legyenek a tenyészetben. A sejteket és· a matrlgeft V-fenekű, 96 mélyedésö, szö-vettenyészettel nem kezelt lemezekbe pipettájuk, és CCL inkubátorban mkubáftafc 37 C-on, egy órán keresztül. Az inkubációt követően a -sejteket pelleláituk 2088

El rpns-cn, 5 percig, .szoböhömerseklcsea, aztán a keletkező sejtpeileret egy éjszakán keresztül inkubálfuk (57¾

10263-13773E SG/L.Xs

Μ*

X χ *

CG_:.. 37 '€).

A 2, ábrán 50 % SAEC és 50 % Nl-IEF keverékéből siló tnatrige-l alapú tenyészet látható. Nyilvánvaló, hogy a matrígei jelenléte ellenére a S-AFC és azNHtF képtelen volt stabil 30 struktúrákat kialakításit. Továbbá úgy sünt, hogy kis gomb alakú, jórészt epithelíalis .sejtekből álló szöveti struktúrák váltak le a szövet/maíxigel tömegről.

A 30 tenyésztési körülmények szimulálásának kővetkező iépés-eként, egyenlő mennyiségű epltbelialis sejt (SAEC) és fibroblast (NHLF)- raadom keverékét pelletáituk matrígei nélkül, kát lépésben. A sejteket Vfenekö, 96 nfelyedésü, nem szö-vettenyészet-kezelt lemezekbe plpettaztuk, és ínkubáltuk egy CG> inkubátorba» 37 ^<:Oon egy órán keresztül. Az Inkuhálást kővetően a sejteket pelletáituk 2öött rptn-en, 5 percig, szobahőmérsékleten, aztán a keletkező sejtpdletet egy éjszakán- keresztül ínkubáltuk (5% CO>, 37 ’C). A kevert tenyésztés előtt a -sejteket Dh (1 tng/tnl íőrzsoidat DMSO-ban) és CFSE (1 -ng/ml tőrzsoídat DMSO-ban) fiziológiás festékekkel festettük meg, PBS-ben 1:1 ööö-szeres hígítást alkalmazva. E tenyésztési körülmények között a sejtek stabil aggregátumokat képeztek, ebei a legashezívabh fi-broblastöfcat (vörös vagy sötétszürke) körülvették a kevésbé asdhezlv eplthelialis sejtek (zöld vagy világosszürke) (3. ábra). Az aggregátumok átmérője kb. 2.Ő0 jira.

Egy további kísérletben, a SAEC és az NHLF sejtek arányát .szisztematikusan változtattuk, és a következő SAECíNFtLE arányokat tartalmazó tenyészeteket készítettünk: 0/100%, 25/75%, 50/50%, 75/25^%. egyéb tekintetben úgy, ahogy lent Ismertettük. A 3. ábrán a pelletálL különböző SAEC és NHLF arányokat tartalmazó mikreszóvet-teayészetek láthatók. Ahogy az ábra bizonyítja, a legkifejezettébb 30 struktúrájú aggregátumok, felületi epitbelía-lls- .sejtburokkal, akkor keletkeztek, hs egyenlő mennyiségben alkalmaztunk -epftbeiialis és fibroblast sejteket, ekkor sz aggs^gátumoknak elfogadható- bevonatuk van epithelia-lís sejtekből, habár ez a preparátum valamivel kisebb és kevésbé meggyőző morfológiájú a 25/75%-nsi;: míg: sokkal egyenletesebb epitbebabs bevonat alakul ki, ha a SAEC van túlsúlyban, 75/25%-náL Tiszta tenyészetek vagy nem formálnak 30 aggregátumokat (ephheliafis sejtek), vagy az aggregátumok sokkal kisebbek (flbrobiastok).

s^tLYfe^d^ggÍJx^g^kétsgi|^píu^Llöe^2Syek«^l^!.iel|e®^ öijTeri'fíeía/öiW/ z-eurím'á

A modell molekuláris jellemzése epiíheBalis differenciálódási matketeken alapul, valós idejű FCRanalízist alkalmazva. Az aggregátumokból mRNS-t izoláltunk, és cDNS-ί generáltunk, TTFK, (áa ábras, AQ3(4b ábra) és AQS-speeiSkus printereket használva, az eredmények -a beta-akflnboz mini belső kontrolihoz viszonyítva kerültek kifejezésre.

A 4. ábrán a TTF1 raRNS szintjelt tüntettük fél 3D humán tüdő mikroszö-vetekben. A TTF1 transzkripciós factor az alveolaris eptthefiiaíís sejtek jellemző markere. Amíg a 3D Öbrofclastíenyészetek nem mutatnak TTF1 expressziót, addig s TTF1 jelen- van a 3ö SAEC monokultúrákon, ás növekedést mutat a 20 S AEC/NHLF ko-kultúrákban, jelezve a fibroblastök előnyös hatását A legmagasabb szintű TTF1 expressziét a 30 SAEC/NHLF szövetek mutatták,

A 4b. ábra az AQP-3 -vlztcauszport'er mRNS szintjét mutatja 30 humán tüdő-mikroszövetben.. Az AQP3 a tüdő ÁTH epíthehahs sejttípusának markere. Amíg a 30 fibroblasttenyé-szet-ek. nem mutatnak emelkedett AQF3 expressziót, addig az A-QP3 jelen van a 30 SAEC monokultúrában és emelkedést mutat a 20 SAEONHLF kokul túrában, jelezve a fíbröblastok jótékony hatását. Áz AQF.3 legmagasabb fokú expresszi-ója·-azonban ebben az esetben ís a 30 SAEC/NH'Í..F kc-kuttőrábat: figyelhető meg.

* 29 »««« **** * ♦ * ♦ ♦ ♦ ♦

-.«.♦,- ♦♦ ***

Tehát a fenti markerek jelzik az ATll-típus irányába történő differenciálódás indukálható növekedését, amelyet az is megerősít, hogy az AYi-típusra jellemző mark erek expresszifen uern nőtt.

Az .általunk a kísérletekben álkalmazott, tisztított differenciált sejttípusokat kereskedelmi forrásokból szereztük be. Bár ezek a sejttípusok differenciáit szövetekből származtak, miután tisztítottuk és 2.D tenyésztési körülmények között iartodok őket, a sejtek majdnem azonnal a dédifferenciálődás jeleit mutatták, amit az S1.0ÖA4 (S. ábra és 2. táblázat) .megemelkedett szintié jelez. Amikor a SA.EC sejteket együtt tenyésztettük NHtF-fei, az S1ÖÖA4 és az. N- kadherin-sziutek jelentősen csökkentek., míg az E-kadberin szintje emelkedett. Az ógyoeve-zett ,.kadherl»-kapesoió” (Zeisberg M aad E.-G, Mellsőn (2ö09)j kifejezettebb veit a három-dimenziós. mint a két-dimenziós tenyésztési körülmények közöd (ó, ábra), jelezve, hogy el-tekmtve az NMLFjelenlélO tótöl a bárom-dimeaziös szerkezet szintén szükséges ahhoz, hogy csökkentse a .SAEC-sejtek dediffereneiáíddását.

Ezek a változások az epitheliaiis nrezenckíáhs átmenet (BMTj jellegzetességei is. Ez az átmenet jellemző az epitbelsaiis dediftérenciáiődási folyamatokra..

.7 gyfetótóöseráenhí otóÁtóífe rrprevsrifeíí

Tüdöinfekció vagy alveoláris epiíhefiafís sérülés (az: összefüggő epítheliaiis sejtréteg megszakadása) kiváltja az -alveoláris epithdiam gynUadá-sserkentő cdokifeeinek expressziólát, amely vonzza a gyulladási sejtekéi, köztük a «eutrofdokat. Hogy teszteljük a CXCL-S gyuiiadtóserkeníö eltokin expresszióját, a CXCE-& protein szintjeit mértünk a 2.D mono- és ko-kuitfoák és a 3B szöveti kokuhúra.sejtjeinek felülászőjáből, ahogy ezt a 3. ábráé mutatja.. Kereskedelmi forgalomban kapható ELISA tesztkészlet alkalmazásával (R aad D Taboratories) megállapítottak, hogy a CXCL-8 szintek szipjflkássan csökkennek a 3B szővetreadszerekhen. a hagyományos, 2D szövettenyészetekhez képest, arat magában foglalja, hogy a CXCL-8 expressziól. az epitheisalts sejtréteg megszakadása váltja ki.

A 7.a ábra diagramja mutatja a CXCk-8-sxpressziet humán, tó vtó-o, 3.D tüdőmodéllhen. A 3E> fíbrohlast-mtmoknltürák nem szekreiálnak CXCL-8-at, viszont a 3D S.AEC termeli ezt a eltekint (habár kisebb mér25 rékfeen, mint a 2£> CAEC tenyészetek - adatok nincsenek feltüntetve). A 2D ko-kuhárákban nem változott meg lényegesen a CXCL-8 expresszié, jelezve,, hogy a Ebrobíastok jelenléte nem befolyásolja .a ettokmexpressziót. A CXCL-.8 expresszifeánsk szintje lényegesen, csökkent azokban a 3'D szövetrendszerekben, melyekben az epithehum-bbfoftlast arány 75/25 %. Ezekben a ko-kulforsfcbaa az: spstheliaiís sejtek teljesen beborították a lihrobl&stokból álló gömböt, azt igazolva ezzel, hogy a CXCL-8-expresszíöt ki lehet váltani az alveoláris epi3ö ihdiahs sejtréteg megszakításává:, A CXCL-8 expresszió csökkenése valamivel kevésbé volt kifejezett az 50/59% és a 25/75 % aránynál.

Az l.L-lb«ta és az. IL-δ gyulladásos citokinek mRNS-szmrjeit színtér! megvizsgáltuk kvantitatív valós idejű RT-PCR elemzéssel. A megfelelő 2D tenyészetekkel összehasonlítva a 3I> tenyészetekben mind aziL-lb, mind az ÍL-6 mRNS színijei jelentőse» lecsökkenve reguiálódtak (7B és 7C ábra), .amikor s SAFG-NHLF mR'NS keverékből végeztük a FCR-t. Amikor a SAEC sejteket kiválogattuk a 21> és 3D S.AEC-NHLF együttes tenyészetekből, még szembo-szököbb volt az 11.-1 b és az 1L-6 csökkent express2ióju a 3D körülmények között Í?D ábra).

Á.EFLfiA.r...Hi%2mfefetexd^ <fe5zc;ey<áikei

Annak érdekében, hogy a tödöszevet tenyészet tnodeHűnk komplexitását tovább fokozzuk,, primer, hu10 utón. tüdöeredetü mikrovaszkuifois endotheiislis sejteket {HM vhC) adtunk a SALA és NHLF sejtekhez, és 2D

ΦΑΧ» ** « * » ♦ « » Λ * és 3D szövet; raikrotenyússsteket állítottusk eső hasonlóan a SAEC és N'HLF együttes tenyészeteihez.

A mikroszövetek fiaoreszcens és. konfbkális mikroszkopiával végzett morfológiát vizsgálata kimutatta, hogy a HMVEC sikeresen együtt tenyészthető mind a SAEC, faiad as NHEF sej-tekkei 3D körülmények között (8.a ábra.?. Érdekes módos SAEC- vagy NHLf-sejtekkel való együttes tenyésztés során a HMVEC sejtek ttlkoiS ták a belső kompakt magját a mikroienyészeteknek. Araikor mindhárom sejttípus (1:1:1 arányban) jelen volt, és együtt tenyésztettük őket 30 körülmények között, összetapadtak és .figyeieróreméhóan kompakt és stabil 30 struktúrái alkottak (S.d ábra).

A. háromsejtes, tenyészetek molekuláris jellemzése kisautatta, hogy az .AQP3 és a klRT? expressziőja (1gyeiemreméhő mértekben fokozódott 30 tenyészetekben a 2D tenyésztési körülmények között mért szintekkel összehasonlítva (9.a ábra és 2. táblázat). Az S1Ö0.A4 és az N-cad EMT-tnarkerek szintje emelkedett, amikor a sejteke; 20 tenyészetekben tartottak, de stabilizálódott 3.0 tenyészetekben. Az E-cad enyhe csökkenése 3D tenyészetekben kisebb mértékű volt, mint a 20 tenyésztési körülmények közöd detektált csökkenés (9. a ábra és 2. táblázat). Mivel a kvantitatív RT-PCR-i a három- sejt típus kevert ENS-ébősi végeztük, azonban a háromsejttípust tartalmazó 3D-tenyészetek további elemzése szükséges, azonban, hogy meghatározzuk a három sejttíl S pus optimális arányát, and segítené a szövet-építést tisztítod szöveíelemekből.

A 2. táblázat mutatja a géuexpressraás· változásokat humán primer tüdősejf tenyészetekben. A számok

RQ-éríékek, amelyeket az RQ~2^i:iU képiedéi számoltunk, ahol a ddCt értékeket pedig a következő képlettel számítottuk ki:

ddCt ~ dCt (minta) —dCí (referencia «unta),

2-Ö A válogatott SAEC** kivételével, ahol az adatokat dQ értékekként mutatjuk be, szokat a kővetkezőképpen számoltuk:

dCt ~ dCí (eél gén? — Ct (háztartási gén),

A begyűjtött sejteknek a különböző tenyészetek létrehozása előtt begyűjtött részöt használtuk minden esetben referenciamintaként. A delta Ct (tíCí) értékekei a következőképpen számítottuk ki::

dCt (eél gén) ~ Ct (cél gén) — Ct (háztartási gén).

A. íSS rsboszomális RNS-t használtuk háztartási génként, kivéve a válogatott SAEC** minták esetében, ahol akt Int használtunk háztartási génként.

Gén	ZdbeBBA	JfciiwWA
zsASAEC	SAEC-SF	SA£C«· HMVEC .:.:::.. . .................	csskNffif	Valósi 1 MF	etóSAK	SAEC-RíilF	SAEC-NHLE· íftSVEC	tssRilLF	Váló»»!! SAK”
AQP3	«2977	6,271692751	O«	wte	5,78456172			2$O?$	8571433
AQP4	ffi	RS.	RA,	tó.	RC.	RC,	RC.	b	Rí).	RC.
AQP5	RC.	tó.	RÁ.	RC.	RC.	RC, :	RC.	Rí).	RC.	RC.
T-ad	10»	177220	055096 ’	RÖ	7,9%	§,648138229	327681578	8,269617725	tó	Ί/Ο
iUb	5.72M4	25,98549927	tó	tó	w	8,867615932	2,616755678	RA,	RÖ	5,7892
ÍU	5,189()296:19	2OWÍ2	RA.	«07285548	7,425867	0,114035	132372529	B	ö,«B44	»,67545
m?	7,462934582	2,481«	tó	: 4,46075	□42tói2;	3,684848469	5,765852951	tó.	9,4287
M	0,52;\:0§42	1,111361289	*5,374683892	6,132931947	6,17953	0,95583254	6,895882573	1,2448(859		11,4899
«4	2,535912577	6,521634903	1,8608»	«380664	8,52985	2,03353«	0,415219465	1,956573185	6,157182738	9,853597
sFTI’A!	rd.*	Álíw*	RÖ.·	tó,·	RA.	RÖ*	Magas*	tó.»	tó.»	Rá.
SFTPB	tó	tó.	B	RÖ	RA.	tó	RC. t	Ra	tó.	.Rá.
sffpc	Hí,	RC.	Rí).	SÍ	RA.	tó.	; N.C.	o.	RÖ	NA
ί'ΠΉ ;	1,62354522	0,895626227 í	RÁ.	tó	15.351 i 6,926426355	1,359291358	tó	o.	8,034067

Miied: R A. az sa ras teáftfcft c «pasát száki sa btt mg, Ri), Ha Éíátfck spáfe KR iaaéÖ! ate ftji kvasliaív Kid N.B.* Nn aSstea spdfe O. ís®ífeí apáiyss KM K. A speifte αροζίκ színia κ «ΑΑ Mtok j pStiaMBíSy&áto a ®s klíjii baifeív KS. siifiisa. Atewiy*: Vissza árny aptísaios sziasfe ttiátak SiagMsyes KR-ri Magas*: Vszayte n$s ispresáis szisist feklfei, fepijm PCI-»!.

» ♦ X » « S « < ♦ * > ♦ ΐ χ «ί

S 8

101377311500 i »« ♦ * ♦ X « « X » *« *«♦* φ*·** «« φ « * - * *

X . * * *ί..

5'e/Z&\v ffia/JezMA és a ágiéi sfed ssefo'im&fii&ar-aá&aÍ foipatí .eredmények Avszegzéye·

A leírásban hízonyltckot szolgáltatunk m, hogy az primer pulmonalis epithelíaiis sejtek együtt tenyésztése ti brob inatokkal előnyösebb a SAEC sejtek számára. ahhoz, hogy differenciáltabb állapotot tartsanak fent, m int -akár 2 D, akár 30 í« vátro monokultúrákban. Áz NHLF sejtek alkalmazása nem csupán az epithelíaiis difié5 renciálődást segítette elő, hanem a 3D míkroszövetek kohéziója és szerkezete sokkal szilárdabb es kompaktabb volt a csak SÁEC sejteket tartalmazó tenyészeteknél (3. ábra) és a S.AEC-HM.VEC-teayészetektté1 (8.a ábra) is. Λ TTFI transzkripciós faktor az alveoláris epíthelialls sejtek általános, jellemző n-iarkexe az embrionális fejlődés során és a születés után ΑΤΠ-sejtekfcen. A eitokeratmok a citoszkefeton köztes filamentumamak komponensei és expressziős mintázatuk fontos a sejtek leszármazási vonalának, („célt lineage”) azonosítása szempontjából.

fi. Kísérleteinkben a TTFI és a citokeratin- “ (KXT7) tüdő epíthebalis markerek megemelkedett expressziós szintet mutattak 30-együttes tenyészetekben.

A H típusis pneumoeiták elősegítik & víz transzepithelialis mozgását az aquaporin fehézjecsalád (AQP) tagjai segítségével Egy ΑΤΠ-marker, az Aquaporin 3 megemelkedett szintet mutat íibrobiasiok jelenlétében (5, ábra). A ieiSletakíiv fehérjék szekréciója az ATíí típusú tüdő epithebabs sejtek egyedi jellegzetessége [Dobbs,

L.G. (1989), Aleom, 3.L., et al, (1997)]:. Kísérleteinkben a SAEC-sejtek monokultúrákban nem expresszáltak felületaktív fehérjéket, míg a felületaktív As fetsérje mRNS-e következetesen expresszalödott 30 tenyészetekben és kisebb mértékben 20-együttes-tenyészetekben (5.c ábra). A felítfeíakriv B és C-féhérjéket azonban nem tudtuk -következetesen kimutatni 30 együttes tenyészeteinkben fáz adatokat nem ábrázó líukj, Megvizsgáltuk az: ATI markerek expresszióját Is, mind kétsejíes, mind háromsejtes tenyészetekben, ilyen matkerek az Aquaporin

4 és az Aquaporin 5. Ezen molekulák expressz.lóját sem tudtuk. azonban: következetesei· kimutatni, feltehetően azért, mert az itt alkalmazott sejtek (SAEC) Inkább ATI! típusúak. Továbbá jelentős időtartam szükséges -az ATI differenciálódáshoz (nem bemutatott adagok). Némileg hosszabb tenyésztési idő alatt, ha ATI típusú jellegzetességet hordozó sejteket alkalmazunk, az ATI markerek megjelennének, így tehát az SFFC kivételével az AQF3, KRT7, TTFI és SFPA differenciálódási markerek felfelé regu25 Sálódtek tlbroblastok jelenlétében. Az AQP3 és SFPA markerek szintje tovább emelkedett három-dimenziós tenyésztési körülmények között, a KRT7 és a. 'ΠΊΡΪ markereké azonban nem.

Az SI00A4 jól Ismert molekuláris tnattee sz eplthelí&lis mesenchymal-is átmenetnek és expressziós szintje gyakran magas met&s-ztatíkus karcinőmákhan. [S-herbet, G.V et. al. 2őö9j, valamint tüdöűbrózisban [Guarino, M. et al., 20Ö9L

Az SÍÖÖA4 és- az N-feadherm emelkedő szintet eredményező regulólódása és az 8-kadherin ezzel párhuzamos csökkentő regaiálődása [Zelsberg, M. and E.G. Néi'lson, (29ö9). S&lke, M,, et al,, (291)9)}. szántén az epi^:th-elialis mesencbymalis átmenet (EMT)-jellegzetessége^ -ami az epstélláls .deditlerenciálódásl folyamatra·.jellemző és a sejtadhézió· elvesztésével E-kadherm expresszié repressziójával, válamiat fokozott sejt-mobilitással jár .

Áz. SIÖ&M és az. N-kadherin deditfereridálódási marksrek megjelentek fisztitötf primer sejtekben. 2Π te35 nyésztési körülmények között. A fenti dedüfereoe-iálódási markerek expressziója csökkeni fibroblastok jelenlétében és tovább csökkent 30 körülmények közön,

Λ gyulladásos markerek, így az 1 í.,ib, az ILő és a CXCL-8 csökkenését lehetett meg Egyelni 30 tersyészetekfoen 2l> tenyészetekkel ö-sszehasonlítva, Ezek a markerek jelentős mértékben, lefelé reguiál-ódíak 30 tenyésztési körülmények között; a ribroblastok paszta jelenléte. például 2D tenyészetekben, nem volt elegendő szintjük

4fi cs-Okkent-és-ébez:

1ÍT2ÓT13773F SGTZs *

Az SLTPAi-sxpresszíóf kétsejíes tenyészetekben megfigyeltük, de báromsejtes tenyészetekben nem (5.c ábra, valamit nem bemutatott adatok).

^ÉLDM^^sjjgntsá^lSk í'sdóbmo?’ vitAvíteíWíAAó; ké,«>Mí aWíkxoHor tsWe&k

Mesterséges báromdimenzlós tüdő szSvettenvészetet készítettünk, ahogyan az a 3. Példában w leírva, a következő módosításokkal..

Epithehalis sejtek (SAEC) helyed 11, típusú alveoiáris epithelialts sejteket (A549) és 5-20% CL 13 vagy CL38 sejtet (W-ardíw és mtsai. Molecular Phanmeolegy, 62, 326-333 20Ő2) alkalmaztunk. A CL? 3 és a CL3Ő sejtek NNK |4-{m«thytóteosammtyH-(3-pyndaíM-butanöne'j kezelt Ari egérből származnak, és tüdőid adettokarctBóma modellként használhatók ÍBdlnsky és tntsai. (1992j. A CL 13 és :a CL30 sejtekben a Kí-ros gén mutációt hordoz.

Egy sor kísérletet végeztünk, hogy meghatározzak a CLL3- vagy CL3(Mejtek és az A549-sejtek megfelelő arányát.. Azt az arányt használtok a 3D tüdőotodell-szövet készítéséhez, .amelynél. spontán tumor keletkezett. Ex a.3D tüdömodellszövet. tüdőfuíuor-betegaégmodeílként használható,

A fent említett módszer egy ahemativálskéíst paciensek tunsorsejtjeit használjuk.

,3 primer ssyíigggj-egsíaíínA s2ckre&Eí?áeri?r-ö,ssze?ó?clé?<ek mőífeyítáíö .getí^iköi/űg ináckísíttx? és szwbte/á&satí írrariiáh ve/íVOíWoá ri:íátJS2«íííásöv<;/

Minden sejttípust fertöze-lenöl hagyunk, ezért a génexpressziők éppolyan normálisak, mint bármely adott háromdimenziós tüdőszövetmodelihen, Az aggregátumok eelidáris összetétele azonban tartahnaz: 5-10 %

2Θ szubletáiisan hzaöiáh -sejtet, vagy fibroblast (WI-3S) vagy alveoiáris epithelialss sejívonslaí (AS49), vagy mindkettői, amelyek genetikailag tnedosíióttak, és különféle faktorokat (Wnf-okat, boné motphogénétte proteint i 8MP), gyulladási -és gyohattásserkentő citektnekef, növekedési faktorokat, stb), amelyek nhidosifiák az aggregátumok Kükrokörnyezefét.

AáííA tó'í!fíírií»KV,s;í;:«' riíhtou/?-n.ggzegí,h«,wk

A gyulladásos köráknények utánzása céljából natív háromdimenziós tüdősejtaggregátumökat kezeltünk bakteriális sejtfeikívoaal; különböző koncentrációival. A cítokinexpressziól eltokinspecífifcus ELISA-val határoztuk meg a szövetsenysszef tápfolyadékából. A génexpress2iő változásait az ephhehails Sferoblastsejtokben valós idejű hCR-rea&ciökkaí mennyiségileg határoztuk meg.

zr.fÉLDAj^ArHlhlíAizöyetkégglei

Ebben, a példában egy tesztelésre kész 312 tödőszövet-készlétet készítünk, mely a következő talajdomagofckai bír:

1. A tesztrekész íüdőszöve; üő-méiyedésü lemezekben van kiszerelve.

2. Kis (Sö ööö sejtiroélyedés) íUdömodeil szövetminták vannak a mélyedésekben, kísérletre vagy tesztre készen.

3, Mindegyik szövet humán primer alveoiáris epithelíuro és fibroblast keverékéből ált (rendre 25, 5(1, illetve ?5% ephheikon),

4. A lemez 3-3 mélyedésben kontrollt tartalmaz .(csak: epitbeiiuro, illetve csak fibrobtesth

5. A lemezeket transzparens, tökéletesen adhézlv műanyag fóliával {pl. Saranrap) záriak le.

A. szövetek minősége bárom napig garantált, beleértve a kézbesítést, •1-0 Maga a lemez óő V -muckü bemélyedést tartalmazó, uom-adhéziv szövettenyésztó lemez.

φφ*« ***« *«

Φ Φ » * X φφφ ·ν Φ * :> χ Φ » χ > * *Φ Φ* «Φ ***

A modeilszövetet a 3. pőidábsa leírtak alapján készítjük. Mindegyik szövetet 200 μ.Ι szövedenyésztö tápoldatba helyezzük, amely tüdőszövethez optimális, 5% C€9-t tartalmaz, lezárjuk és kézbesítjük szobahőmérsékleten vagy jégen.

Minőségellenőrzés:: Egy szövetet kiveszünk mindegyik bemélyedésből, teszteljük az életképességei,. A. 5 differenciálódást markereket valós idejű PCR-rel: teszteljük.

Kérésre, egy 2D kontroli lemez (előnyösen egy Isposfenekü, adhézív szövettenyésztő lemez) 'mellékelhető a 3D szövethez.

IPARI ALKALMAZNA TÖSAG

A fentiekben egy ATH-tipasú szöveti vázszerkezettől mentes Htdömodeít alapvető- paramétereit és 10· tenyészkdrülményeit állítottunk be. Az Így előállított Α'ΓΠ-típnsú szöveti vázszerkezettől mentes tödömodeii alkalmas a spontán önszerveződés és a. eeíiulárís kölcsönhatások tesztelésére. A modell lehetővé feszi komplex szövetrendszex-ek könnyű kezelhetőségét és genetikai manipulálhatóságát mind elméleti, mind alkalmazott és gyógyszeripari resztekben. Á modell: könnye» kite-rjeszdtető további sejttípusokkal, pl. endothelialh sejtekkel a vaszkn-larlzáemboz, vagy akár simalzomsejtekkel, afeoi további kétirányú szöveti ős eellnláris kölcsönhatások lesznek maufmányoz&atóak.

A vázszerkezet-mentes 3D tenyésztés lehetővé teszi: egyszerű vagy bonyolultabb szöveti- rendszerek problémamentes- genetika manipulálását elméleti vagy alkalmazott. kutatásban és gyógy szer· észlelések során. Ez a tüdőszövet modell különösen alkalmas sejtek spontán, ön-szerveződésének és sejtek közötti kölcsönhatások tanulmányozásának. Mind az orvosbtológiai kutatásoknak, mind a gyógyszerekkel foglalkozó cégeknek szüksé20 ge van üt vara modellekre, hogy fekozzák a hstóanysgieiöh molekulák toxfeitásának és hatásosságának hatékony prsdík eiöjáí a prekiimkai fázisban [Kramer, J.A. et al. 2007j. Az úknman kibocsátott útmufetók- szintén hangsúlyt fektetnek-az. állati modellek. helyettesítésére és sürgetik üj prekltnlkai. tesztelés; módszerek kifejlesztését [ínnovatlve Medic-ine Research mitistive Stratégát Research Agenda. 21X18, European Technology Platform]:.

A fenti modell és különböző génbejuítatási módszerek, valamint változatos célgének alkalmazásával há25 romdimenztós humán tüdő- mikroszővetmodell rendszerünk könnyen alkalmazható genetikai változások tanulmányozásához, iüdöbetegségekbsn, ami üj gyógyszer célpontok azonosításához vezethet, valamint új: terápiák kifejlesztését teszi lehetővé. Ez:ch betegség modellek tehernek gyulladásos. modellek, tumor modellek, tüdő Obrózts modellek vagy regenerálódást modellek is.

Egészséges és kóros íüdőszővet háromdimenziós modellje egyaránt rendelkezésre áll. A iaiálmársy sze30 ríntí termék forgalmazható példán! szövettenyászetek,. szővettenyészeteket tartalmazó lemezek és elrendezések, vagy készletek formájában.

HIVATKOZÁSOK

Álcára, J.L,, «1 al., Prsmary Cell -Caífure of Humán íype ll Pneutnonocytes·; Mamtenance of a Diííerentiafed

Phenotype and 'Fransfeetíon wítfe Recombinant Adenovlrases.. Am. 3. Respsr, Cell Mól. Slot.. 1907. :7(6): p. j 672-682,!

; öeiínsky -et al, Roie of the slv-eolar type fi cell in the deveiopment and pxogression of pufraonaty temors indueed by á-t'-ínethylmtrasamin.oVMd-pyridylH-hutaoonc in. the A/'J mouse, Caneer Rés: 1992 52 3164-3173

I Beiimcí, S . f. firfedlcy. et ál, í 1997), Ffhrabíast growth factor lö (FOFfÖ) and brancbing moxpbogenssis· ín ; tbc embrycsníc motíse UtngA DevelophtvM 124(234 4867-4876.

Λ

Λ,

Brúnó, M.D., R. .í. Bofeioski, et ai. (1995). Ltmg eeli-speeifle expression oftbe murine surfaet&at protein A iSP-A) gene is médiaién by tateracítons betweert the SP-A promoter and tbyroid transeription factor-i.M J. Bioi.Chem. 270: 653 i -6.536.

Cardoso, W. V. (20111). Moiecuiar reguládon of lángdeveíopment. Annu Rév fihysíel. 63; 471-494.

Coivin, .1. $.. A. C. Whtie, ei al. (2001). Láng. hypopíasía -and nsosataí deatít ih Fgf9-null srtlce ídentify tins gene as.an essential regulator oflung meseuchysse, Dpveloptnent 12801): 2095-2:06.

Coivin, J, S., 8. Feidman, et ah (1999). Genonbe orgartízatioo and emferyontc expression of the tanúsé fibroblast growtb fáctor 9 gene. Dev Dyn. 216(1); 72-88.

De Moerlooze, L,, :B. Spencsr-Gene. et ai. (2009). “An unportant role fór the Hlb · isoform of fibroblast groxvtít fiíCtor receptor 2 (FGFR2) ín mesenchymai-epstí?eiiai siguailíng during mouse organogeoesis. öevelopment 127(3):.483-492.

Dobbs, E.G., Pulmowy Swfactaot. Áaaual Review of Medicine, 1989. 99(1): p. 431-446..:.

<3tárd D„ J. et al. In vítro eultivation of humán tumors: establishineni of ceO liftes derived írom a sértés of soiíd iurrtors. .1. Mail. Cattcer lost. (Bethesdaj (1973) 51; 1417-1423,

Guarino, M., A. Tosonr, ;md M. Nebulóm, Direct contribution of epithefiimt te ergatt· fibrosís; epitbeíiaimesenehytaál transítíon. Humán Patítoiogy, 2609. 41)(19): p. 1365-1376.

S-fare, KJ., EJ, .leoklnson, and G. Andersen, la vítroraode-ls of T ceti deveiopmeut. Semiuars in. Imraunoíogy, 1999. 1 lil);p, 3-12.

Hars, KJ., EJ.. ieniiason, and G. Andersen, itt vitrotnodels of T cell dewtopment. Setmnars in Immunobgy, ; 5999. 11(1); p. 3-12.

Honig, M. G. and R. Ϊ. Home fi989). ”Bíl and diÖ; versatile fluoreseent dyes fór neurohái íabeiling and patbway traeíng.” Trends Neurosei. 12(9): 333-335.

Honig, M. G. and R. 1. Hunte (1989), Trends Neuroscl. 12(9): 333-335.

Hughes Tracy et aí., a poster presented al National Center fór Replapetnent, Retiaetsent and Reduetion of arsiroais In Research, Shosvessing the 3Rs Fortca-lltS: House, 28 February 2907

fedő. A., 3. C. Clark, et al. (1995). Gene structute and expression of humán íhyroiá transeripbon tactet-1 in resp-katory eplibellai cells. 1. Biol.Chssn. 270:8108-8514.

Srmovazlve Medícíbe Research initi&dve Shateglc Research Agenda. 2008, Eufepéan Technology Platform.

Köítigshoff M., et at, Funetional Wnt Sigrtaling Is loereased in idiopathic Pulmooary Fibrosís. PLoS ONE, 2008.3(5); p. e2142.

Kratner, J.A., IE. Sagartz,. sód D.L. Morris, The íjpniícation of discovery toxkology and puthology towards the design.ofsafer pharmacetöicaí lead cundidates. Naf Rév Drug Discov, 2007, 6(8): p. (536-649,

Kreda. S·. M„ M. C. Gynn, et al. (2001). Expression and iocaiízatios of eplthelial aqnaporins in the aduit humán lurtg. Atn. A Respir. Cell. Mól. Bioi. 24. 224-234,

Eazzaro, D., M. Prico, et al. (5995). The íranseripíiort facior, TTF-1, ts expressed al the ottset ofthyrold and Inog morpbogenesis and in restrietsd regtons of the. foetal bratn.” Geveíoptnent 113; 1093-1 (94.

Min. H„ D. M, Dani le»ko, ei ai. (:998), ’Tgf-lö is rsíítdred fór bofh lintb and inog deveiopmem and exhibiís •sitifcing fimetíona! shnílarhy ·< Drosophila branehkss.” Genes Dev. 12120): 3156-3161

Napolitano, ΑΡ, Chai, Ρ et ai. (2007) 'Oyoa«;les of ifse sed-assembly of eontptex eebniar aggregate:; on nscroxsolded aonadbesive hydrogels. Tissue Fng. 13-(S>: 2087-94.

'Neagü'’Á? (2ÖÖ6))''”CÖMPlJTÁBONAt MODBtMGOF’TISSÜF7SFlr-ÁSSi^LY?“M^m^fá tettess B 20; 1207-1231.

Oröiíz, D. M. aad N. ltok (2001). FibroWast growíh. factors.” Genome Bioi, 2(3): 3005.

Seike, M„ et al, BpiXsíial to Mesencfeyrnai Tr&nsition of L«sg Cascer Cells. Journal of Níppon Medícal | Scoot 2009. 76(4): p. 181 -1S1. |

Sefóne, K«, H. Óbuda, et al. (1999). FgfiO ís assenOni forlinsb and láng formádon.” Nat Génét. 21(1): 138- j

141.

Sbannon, I. M. and 8. A. Hy&tt (2004). Epífeelíst-Mesenchyatai Interaetions in őse Devdöpssg liung.” Annus! Reviewof Pbysiology 66: 625-845.

Sfeerbet, G.V., Metastasis promoter S100A4 is a potentially valaabls motecatsr target fór cascer therapy. Csneer Lettem, 2009.280(1); p, 15-3Ö.

Yerírecs. RA, Zwtehesberger, JB et ál. (20Ö8) “Celinlar difíereníiatksn ín diree-dhnensimad lung cell culteres.” Canoer Bioi Ther. Mar; 7(3): 404-12.

Wsng, X. Q., Η. Li, et al, (2009) “öneogenic K-Ras Regnlates Prolíferatfon aad Coli Jascdoss in Láng Rpíthelásl Ceits througá índnenon of Cycísoxygeöase-2· and Ácdvation of MetaJlopröíeísase-9” Molecular Biology of the Coll 20,791-S00.

Waag, X. Q., X. M, Dusn, eí al. (2005), ''Carboxyímcrescein Diaeetate Suecitónááyl Ester Fluorescent Dye fór Cell Labelíng.” Acta Bioehimica Biophysica Sánca 37(6): 379-385.

Wssg, X. Q., X. M. Duan, et at (2(11)5). Ácta Bíocitsímca Biophysica Siniea 37(6): 379-385,)

Wardlaw et al., Transoriptionnl reguládon of basa! cyelooxygenase-2 expression,,. Molecular Fharmaeology, (2002) 62, 326-333

Ysng, M. C„ Ϋ. Gao, et ai, (2Ö06). ”Tfee TTF-1/TÁF26 eomplox diffetwtíafiy moduíaües .surfadastt preteis-B (SP-B) and ~C (SP-C) promoters is iusg cells,” Biocbem Biopfays Rés Cöíunsun. 344(.2): 484-490.

Zeisberg, M. and E.G. Netten, Biomarfcers fer epitlielial-mesenefeymal iransíferss. The Journal of ülínical ísvesdgadon, 2009.119(6): p, 1429-1437, íihaug, X., T. S. Stappeubecfe, ei ah (2005). Rscíprocal epnfeeliai-ntese&ehyrnal FGF sígnallng ís required tor ceeai devetopment* Devsiopsnení. 133: 173-180.

* φ

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK.

   1, Tervemten kislakitott, háíómdsm^rióstMŐHtödeH’SasövWeayészet, amely modeil-szövettíntyészet

   a) mentes mesterséges szöveti vázszerkezettől ahol a mesterséges szöveti vázszerkezet porózus, háromdimen5 ziós mátrix, háromdimenziós gélmátrix vagy porózus membránstap,

   b) tenyésztett sejtek alkotják,

   e) legalább epitheliaiis töáösejteket és rnesenekyusaiis sejteket, előnyösen fibroblastokat tartalmaz, d) morfológiailag egy vagy több sejtaggregstusi, ahol az aggregátoraik) felszíne epitheliaiis tüdőseitekben dfisult, és,

   10 e) amelyekben az epitheliaiis sejtek epithellamra jellemző dilfereneiálódási rnarkereket expresszáinatk.
2. 2, Az 1. igénypont szerinti, tervezetten. kialakított, háromditnenziős töáősHodeil-szövetteayészet, amelyben

   - az egy vagy több aggregátum mérete vagy átlagos mérete legalább 8ö pts és legfeljebb böö pnt, előnyösen az aggregátumok, mérete vagy átlagos mérete 100-300 pm éa'vagy, l5 - az egy vagy több aggregáttun a kővetkező menny bégbe® tartalmaz sejteket:

   legalább 2*10* sejt, előnyösen legttlább 2*1Ö⁴ sejt, és legfeljebb 5*lö^s sejt, előnyösen legfeljebb 2*IÖ^S sejt. vagy legfeljebb IO⁵ sejt
3. 3. Az l, vagy 2. igénypont szerinti, tervezetten kialakított, ísámanámsenziés tőrförnodell-sfeivettenyészeí,

   - amely mcGeli-szövettenyészeí mentes bármely mesterséges szöveti vázszerkezettől és/vagy

   20 · amely modell-szövet/enyészeí extrsoelhdáris .mátrixot Is tartalmaz, amelynek extracellaláris mátrixproteinjeit a szövettenyészei legalább egy sejttípusa, előnyösen a ribroblast, szekretáija, és/vagy

   - epiíheiialis sejtek túdőspithelislts sejtbevonatot képeznek legalább az aggregátum felszínének egy részén, előnyösen a tüdőepitbelialis sejtek beborítják, legalább részben, az aggregátum felszínéi,
4. 4. Az I, - 3. igénypontok bármelyike szerinti, tervezetten kialakított, háromdimenziós ttidőmodeli25 szövettenyészet, almi

   - tt modeíbsxőveííeoyészet a személyből nyert, tenyésztett primer sejteket tartalmaz, és/vagy

   - a mödeii-szővetíenyészeí a tenyésztés elölt dedifferenciáltatott és a tenyésztés során re-differertciáltatott sej teket tartalmaz, és/vagy

   - a tttodell-szSvettenyészst megállapodott sejívonalak sejtjeit tartalmazza.

   30 5. .Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti, tervezetten kialakított, háromdimenziós íadőszövettenyészet, amely endotheliabs sejteket is tartalmaz.

   á, Ax 1-5. igénypontok bármelyike szerinti, tervezetten kialakított, háromdimenziós tüdőszövettenyészes, amelyben az epitheliaiis tíldösejtek beletartoznak az alábbi sejttípusok legalább egyikébe;

   - ! típusú pneumooíták (ΑΉ)

   35 - H. típusú pneumoeiták (ÁTH),

   7. Az 1-6, igénypontok bármelyike szerinti, tervezetten kialskímtt, ttáromdimertzíős tttdőmoáellszóvetfenyészet, amelyben.

   - a következő markerek szirtije fokozott nem tenyésztett sejteket, előnyösen tlszttott, primer sejteket tartalmazó korttroiíbox képest: TTT 1, AQF3, SFFPÁ, SFTPC, KRT7,

   40 - a következő markerek szintje csökkent nem tenyésztett sejteket tartalmazó kontrolihoz képest: CXCLS β «φ χφφ β*

   ΧΦ * φ * φ φ Φ * β * φφφ X Φφ

   Φ. ♦ X« φ <φ Φ * * **Φ Φ «X ΦΦΦΦ «κ iLib,SI00A4,

   - a kővetkező .markerek szőttje fokozott kétdimenziós kontroBteayészetfcc® képest; AQP3, SFfPA,

   - a következő matkerek. szintje csökkent kétdimenziós kontrollfenyészethez képest CXCL8, IL,lb, ILő,

   S 10ÖA4, N-ead.berin.
5. 5 8- Az 1-7, igénypontok bármelyike szériát definiált, tervezetten kialakított, háromdimenziós dldőssodeÖszövetteiiyészet, amelybe® az. epithellalís és/vagy Sbrobíaatsejtek a beteg tüdőre jellemző patológiás tulajdonsággal bírnak, igy a modelíszővot-tenyászet tódSbelegsé^aodell-sabvettenyészet, előnyösen

   - amelyben s betegség gyulladást foglal magában és &z érintett sejtek gyulladásserkentő ebökineket

   10 expresszálaak a normális szint felett, és a modell gyulladásmodeH,

   - amelyben a betegség tumor, és a sejtek traosztowták, pl, maligmisan transzformált vagy halhatatlan sejtek, és a moáel tnmormodeil,

   - amelyben a betegség fthrázíst foglal .magában, és a modell fibrózismoáell,

   - amelyben a betegség szöveti sésülésí foglal magában, és a modell regeuerációmodell.

   15 9. Eljárás tervezetten kialakított, háromdimenziós tődőiuodell-szövettenyészet előállítására, amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza:

   - legalább epithellalís tüdösejteket és mesendsymalis sejteket, előnyösen íibroblast sejteket, előnyösebben primer fibroblast sejteket tartalmazó kevert szuszpenzió előállítása,

   - a sejtek pelletálása

   20 - a pelletáh szuszpenzió mkubálása COj jelenlétében, egy vagy főbb cellaláris aggregátumot tartalmazó, báromdnúenziós tödómodellszövet kialakulásához elegendő ideig,

   - adott esetben a modellszövet vizsgálata

   a) egy vagy több, a tödőszővetre specifikus ephhelialis differenciálódási naartser expressziójára, és égy tekintjük, hogy egy retérenciakijiiúrábőz viszonyítok megemelkedett expressziós .színt a háromdimenziós íiidő25 modeli-szővettenyészet kialakulását jelzi, és/vagy

   b) egy vagy több gyalladás-serkemő eitokin expressziójára, és ágy tekintjük, hogy egy megfelelő, pl. font meghatározott reforenciakulhrrához viszonyított csökkent, expresszié a háromdimenziós tadomodellszővettenyészet formálódását jelzi ej egy vagy több aggregátum mérete és morfológiája.

   30 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, ahol a sej&ggregátamok átlagos átmérője legalább 80 pm, és legfeljebb 600 pm, előnyösen íÖO-300 pm és/vagy az egy vagy több aggregátum a következő mennyiségben- tartalmaz sejteket:: legalább'2xW\ előnyösen legalább 4x10’ sejt, és .3.5 legfeljebb 3xl'0^?,előnyösen legfeljebb 2xt0⁵ vagy legfeljebb I0^? δφ.

   II. A 9. vagy 10, Igénypont szerinti eljárás, ahol az ülepfte-U szuszpenzső CO₂ jelenlétében intóbá-h nem több, mint két hétig, előnyösen nem több, mint 12, 10, 8,7, ő vagy 5 napig, és nem kevesebb, mim 10 h. előnyösen nem kevesebb, mim 12 vagy 14 b időtartamig, és/vagy ahol 40 kevert szoszpetóő előállítása -serán egy vagy több sejttípust, adunk egy tartályhoz 18 órán belül, előnyöy ? «»'*:*·♦φ* φ

   Λ »

   Ifr * « φφ tt- -φ « Φ* φ« ♦·♦. « φ φ φ

   Φ « « « Ν φ φ * *φφ« « φ

   -*·»·» * φφ se® 1.2 őrá» -belül, előnyösebbe» 4 órán belől, különösen előnyöse» 1 órán belül vagy- egyidejűleg, nagyon előnyösen minden alkalmazott sejttípust a fest meghatározott. időtartam alatt adagolunk,

   Π. A5-11 igénypontok bármelyik® szerinti eljárás,

   - ahöl a tartóedény V-fenekű, nem-sstóvettmyészet-kezelt tartóedény, és/vagy

   5 - ahol a pelleíálás 2ÖÖ - 600 g-vel történik, 1 -20 percig, előnyösen 2-10 percig, és/vagy

   - ahol a sejtek blökempadbilis- festékkel vannak megfestve, amely alkahnas a következő eeiluíéris jellemzők nyomon .követésére: a sejtek állapota,, pl, sejtfázis, sejtek életképessége, apoptosis vagy a. sejtek morihsmd állapota; sejttípus; sejtek lokalizációja; mahgnas íranszfonsiáció; gyulladás.

   13. A. 9-.12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol

   10 - a legalább pulmonali» ephhelialís és· puimonalis mesenchymalis sejtek kevert szuszpenziőja személyből nyert, tenyésztett primer sej teket tartalmaz, és/vagy

   - a legalább puhnanaiís epithohaíis és pulmonaim meseachymsi-ís sejtek kevert szuszpeazsója- a tenyésztés előtt dedifferenciáliatott és a tenyésztés során re*d-iff«encláítatott sejteket tartalmaz, és/vagy

   - a legalább puhnonsíis -ephhelialis és putaoaaiis mesenchyxnalis sejtek kevert sznstpenziója 15 megállapodott sejtvoaalak sejtjeit tartalmazza.

   14. A 9-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a tenyésztett. sejtek, előnyösen pnlmoaaKs eplthelialis és puimonalis mesenehymahs sejtek beteg tüdő patológiás jellegzetességét mutatják, így a modelí-szóvetíenyészet palmonalxs· betegségísodell-szövettenyé20 35. Az 1-8:. igénypontok bármelyike szerinti, tervezetten kialakított, háromdimenziós tüdőxaodellssőwgttenyószet,. amely a 9-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állítható elő, lé, Eljárás tűdőszővette ható vegyületek szfaíneiésére, amely eljárás a kővetkező lépéseket tartalmazza:

   - az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti, tervezetten kialákiíott, háromdíutersziós tlídömoddl-szővottenyészet biztosítása,

   25 - legalább egy tesztmmta és egy refereneianiínta vétele a modell-szövettesyésssetből,

   - a vegyület hozzáadása a tesztmintához, miközben a teszttniatát és referenciamintái ugyanolyan körülmények között tartjuk,

   - detektáljuk a tesztmárta bármilyen megváltozását vagy módosulását a referenciamintához képest, ahol ha a íesztnhntában bármilyen megváltozást vagy módosulást detektálnak, azt a vegyület .hatásának 30 tulajdonítják:.

   17. A lő, igénypont szerinti eljárás, amelyben a modell szóvettenyészet egészséges tüdőszővet.modellje, és egy vegyület káros hatását teszteljük, ahol a megváltozást vagy módosulást a vegyidet toxikus vagy egyéb káros hatásának tulajdonítjuk, és/vagy amelyben a -moádi-szővettenyészet tt^őbetegségmodell-szővetteayészet, amelyben az érintett sejteknek 35 kóros mbíjdcsusága van, és rajtok egy vegyület előnyös hatását teszteljük, ahol

   - vizsgálati módszert biztosinak az említett patológiás tulajdonság -mérésére vagy becslésére a medellszővettenyészotrs nézve, miáltal a betegség egy mértékéhez juinok.

   • egészséges tüdöszövetböl referenciamintát biztosiunk (egészséges referefidamíata) és/vagy beteg tödőszővethől referenciamintái bizt-ostek (beteg refémteíammta),

   40 - «. patológiás ttűajdoaságot sfeijük vagy becsüljük az egészséges referenciamintába» és/vagy a beteg

   ΦΦ*

   Φ* -¹ » Φ » * 4

   ΦΦ X χφ

   Φφ «Φ

   ΦΦ « * φ * χ »** φ «χ
6. 9 Φ Φ * φφ «ίφφ φφ referesciíimintában, és legalább egy tesidíniniáhss mielőtt és mmtáa a gyógyszerje-lőlt vegyületet erlatkezésbe hozzuk vele, ahol bármely megváltozás a fesztoríntábas, amely eltolja a betegség mértékét a tessömmfába» a betegség egészséges referenciamintára jellemző mértéke irányában, és/vagy eltávolítja azt a betegség beteg referenciamintára.

   5 jellemző, ménékétől a győgyszetjelölt molekula előnyős hatásának tekintjük.

   1_;8. Tervezetten kialakított, aáromdimenzíás tadömodellszövet-készlet,. ameiy tartalmaz egy tesztlemezt, amelynek elrendezett módon iartóeáéayei varnak, ahol legalább kér tartóedény tartalmaz;

   - miniákat egy vagy több típusú, az K igénypontok bármelyike szerinti,. tervezette® kialakított, háromdimenziós tódómodell-szövettenyószctból ahol mindegyik minta a lemez· külön tartóeóányébe van·
7. 10 helyezve,

   - a modell szövefteayészet sejtjeinek tenyésztésére alkalmas tápkőzeg.

   19. A 18. igénypont szerinti, tervezetten kialakított, háromdimenziós tütföraodeíiszövef-készáeí, ameiy egy vagy több jellemzővel bh a kővetkezők közül:

   - a lemez 96-mélyedésú lemez,
8. 15 - a lemez bemélyedéseinek feneke- V alakú.

   - az egyes tartóeáényefeben levő tenyészet-minták a következő számó sejtekből állnak; legalább 10', előnyösen legalább Iö'\ előnyösebben legalább.2xlö*> 3xlö⁴,4xiÖ'', 5xl0⁴, és legfeljebb Kk, előnyösen legfeljebb 10, előnyösebben legfeljebb 5xlÖ⁵,4xlö'\ 3xT0\ 2xlő⁵.vagy legfeljebb ;Ö⁵,
9. 20 - -a fartóedéuyek le vasinak zárva, együtt vagy egyenként, és COj-feaa dúsított környezetet, vagy a tüdő szövetíenyészeínsk megfelelő atmoszférát tartalsmzaak,

   - a .ΟΟϊ - gazdag környezet vágy atmoszféra legalább 2%, 3%, 4% CXA-t tartalmaz legfeljebb 10%, 9%, 8%, vagy 7% Cö_rt tartalmaz»
10. 25 a. nagyon előnyösen kb. 5% COj.

    20, Az 1-7. igénypontok bármelyike szerint meghatározott, háromdimenziós tüdömodell-szövettenyészet

    - vegyüieteknék a puhnonalís szövetre való hatásuk parallel tesztelésére, pl. toxieitásí tesztelésre, vegyüfeíjelőltek keresésére, stb.

    - vegyületek betegspecífíkas tesztelésére terápiás hatásuk szempontjából, feltéve, Irngy a moáel.l30 sző vettenyészet páciens primer primer puhnonaOs sej tjéből nyert,

    - puimonalís szövetben sejtes interakciók vizsgálatára,

    - pulmonaii» betegséges sorás fellépő genetikai változások vizsgálatára.