HU228694B1 - Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same - Google Patents

Description

Hímfertiiitást közvetítő nukíeotid-szekvsnciák és alkalmazásuk

A hibrid növények termesztésének fejlődése- számottevő előnyöket eredményezhet a termesztett növények minőségében és menynyi. cégében. A hibridizációs eljárások lehetővé teszik, a hozamok növelését és a kívánatos tulajdonságok kombinálását, mint amilyenek a betegség- és rovarrezísztencia, a hő- és szárazságtörés, vagy a növények Összetételének megváltoztatása. Ezek az eljárások gyakran a pollent szolgáltató, hímivarú szülőnövényre vannak alapozva.

A szántóföldi növényeket olyan technikákkal termesztik, amelyek előnyt biztosítanak a növény megmerzási módjának, önmegporzó egy növény, ha az egyik virág virágpora ugyanazt a virágot vagy ugyanazon növényen egy másik virágot termékenyít meg. Idegenmegporzás akkor történik, ha egy növény virágait egy másik növényről származó virágpor termékenyíti meg.

A káposzta (Brassiea) nemzetség növényei rendesen önsterilek és csak Idegen megporzással termékenyüinek, Az önbeporzó növényekben — mint amilyen a szója vagy a gyapot — a nő- és hímivarszervek anatómiailag egymás mellett helyezkednek el, A természetes beporzás során a hímivarszerv által szolgáltatott virágpor (pollen) termékenyíti meg ugyanazon virág nöivarssérvét.

A kukorica (áea maya L.) egyedülálló helyzetet képvisel, mert mind őnbeporző, mind idegenbeporzö technikákkal termeszthető. A kukoricának ugyanazon a növényen vannak himvirágai, amelyek a címerben helyezkednek el, és vannak nővirágai, amelyek a kukoricacsőben helyezkednek el. A kukorica ön- vagy ídegenbeporC* fc / zással termekenyülhet meg. A kukorica természetes beporzása úgy történik meg, hogy a címerekből a virágport a szél viszi a csövek csúcsán kítüremkedö „haj^w-ra, arai a bibeszálak tömege.

Egy megbízható eljárás, amellyel a növények fertilítása szabályozható lenne, lehetőséget kínálna a növénynemesítés javítására. Ez különösen igaz a kukoricahiforidek nemesítésére, amelyek valamilyen himsteril rendszeren alapulnak, és ahol egy nősteril rendszer csökkenthetné a termelési költségeket.

Ά kukoricahibridek kifejlesztéséhez homozigóta, beltenyésztett vonalak kifejlesztésére, majd ezeknek a: vonalaknak a keresztezésére és a hibridek kiértékelésére van szükség. A leszármazási vonalak termesztése és az ismételt kiválogatás az a két eljárás, amivel beltenyésztett vonalakat hozhatunk létre egy populációból. A nemesitő programokban a kívánatos tulajdonságokat kombinálják két vagy több beltenyésztett vonalból vagy különböző, széles alapú forrásokból egy nemesítés! „tulajdonság-készlefc-be, amelyből új beltenyésztett vonalakat indítanak önmegtermékenyítéssel és a kívánt fenotapusok kiválogatásával. Egy hibrid kukorica-változat két ilyen beltenyésztett vonal keresztezésének eredménye, amelyek mindegyikének egy vagy több olyan kívánatos tulajdonsága van, amí a másikból hiányzik, vagy amelyek kiegészítik egymást. Az új beitenyésztett vonalak más beltenyésztett vonalakkal keresztezhetek, majd az így kapott hibridek megvizsgálhatok, hogy van-e· gazdasági jelentőségük. Az első generációs hibrid leszármazottak jele Fy. A hibridek létrehozásában csak az Fy növényeknek van jelentőségük. Az Fj hibrid életképesebb, mint a beitenyésztett szülők. Ez a hibridvígor

32/BE

X/

vagy heterósis-hatás számos módon, így például a fokozott vegetatív növekedésben. vagy a nagyobb terméshozamban is megnyílvaηυIhat.

A hibrid kukorica-vetőmag hímsteril rendszerben állítható elő, ami magában foglalja a kézi. címertelenítést („ címere zés) , A hibrid vetőmag termelése érdekében a címert, eltávolítják a beltenyésztett anyavonal fejlődő növényeiről, amelyek a szintén beltenyésztett apavonal növényeivel váltakozó sorokba vannak elvetve. Ennek következtében — feltéve, hogy az ültetvény kellően izolált a kukoricapollen más forrásaitól — az anyavonal csöveit csak az apavonal virágpora termékenyítheti meg. Az így kapott magvakból az Fy hibridnemzedék növényei keinek ki,

A növények fejlődésének környezeti variációi miatt előfordulhat, hogy egyes növényeken a címer az anyavonal címertelenítése után jelenik csak meg, vagy a címerezők nem távolítják el teljesen a címert. Bármi legyen is az ok, a következmény az, hogy az anyanövényeknek sikerül virágport termelniük és néhány közülük önbeporzéssal fog megtermékenyülni, aminek következtében a beitenyésztett anyavonal magvai keverednek a termelni kívánt hibrid vetőmagvakkal. Ezek a magok nem olyan termőképesek, mint az F'x magvak, ráadásul a beltenyésztett anyavonal magvaínak je~

1ΘΠ Léfcs	as el	adott v	etőmagban biztonsági kockázatot	jelent
hibridé	t előáll	Lítő cég	számára.
Há	s megöl	dásfcént	a beltenyésztett anyanövények	géppel
címerez	hetők.	A gépi	címerezés körülbelül annyira m	egbízhafc'
mint a	kézzel	végzett,	de gyorsabb és olcsóbb, viszont	a legtö:
címerez	ő gép t<	5bb kárt	tesz a növényekben, mint a kézi	címerézé

7€.702/BE így tehát jelenleg a eímertelenitésnek nincs teljesen kielégítő módja, és folyamatosan szükség van olyan megoldásokra, amelyekkel tovább csökkenthetők a termelési költségek és megszüntethető az anyavonal önbeporzása a hibriövetőmag termelése során.

A genetikai hímsterilitás egy megbízható rendszere előnyös lehetne, A munkaigényes olmerezés néhány genotípus esetében elkerülhető a eitoplazmás himsterii (CMS) beltenyésztett vonalak használatával. A fertilltást helyreállító gén hiányában egy CMS beltenyésztett vonal növényei a oitoplazmában. lévő faktorok miatt himsterilek. Ezt a tulajdonságot kizárólag az anyanövények örökítik a kukoricában, mivel csak az anyanövény ad óit©plazmát a megtermékényitett maghoz, A CMS növények más, nem himsterii vonalak pollenjével termékenyithetők meg. E másik beltenyésztett vonal pollenje tartalmazhatja azokat a géneket, amelyek a hibrid növényeket hímfertilissé teszik, de hiányozhatnak is belőlük. Rendszerint ugyanazon hibrid címertelenített normái kukoricával, illetve CMS vonallal Perzselt magvait keverik össze, hogy biztosítva legyen a megfelelő virágpor-mennyiség, amikor a hibrid növényeket termesztik és biztosítva, legyen a eitoplazmás diverzitás is.

A CMS vonalaknak azonban másféle hátrányaik is vannak. Az egyik egy már régen megfigyelt összefüggés a CMS egy meghatározott változata és bizonyos növénybetegségekre való érzékenység között. Ez a probléma elriasztólag hatott a CMS változatok széleskörű. alkalmazására a hibrid kukoricák előállításában és negatívan befolyásolta a CMS általában vett használatát a kukoricában.

A genetikai sterilitás egyik típusa az US 4,654,465 és

4,727,219 számé szabadalmi Iratokban van leírva. A genetikai 76.702/33 •X V •X hlmsterilitás ezen formája azonban több mutáns gén fenntartását követeli meg a genom különböző helyein,· és egy bonyolult mar kér rendszert ís igényel a gének nyomon követésére és a rendszer használatának megkönnyítésére. Az ÖS 3,861,709 és 3,710,511 számú szabadalmi iratokban is egy kroraoszóma-transzlokáciős genetikai rendszer van leírva, ami hatásos lehetne, de bonyolult.

Számos próbálkozás történt az ilyen hátrányok kiküszöbölésére, így például Fabijanskí és munkatársai több módszert fejlesztettek ki, amelyekkel növények hímsterillé tehetők (EP-0 89/3010153,8, PÜT/CA90/0ÖÖ37 és WO 90/08828 számú szabadalmi iratok), Az egyik módszer szerint egy hámszövet-specifikus promotorral kapcsolt gént juttatunk a növénybe, amely gén egy citotoxikus anyagot kódol. Egy másik módszer egy antíszensz rendszeren alapul, ahol először azonosítanak egy, a fértíirtáshoz nélkülözhetetlen gént, majd annak antíszensz párját ínszertáljak a növénybe, Mariani és munkatársai is több, citotox.ik.ns antíszensz rendszert Írtak le (EP 89/401,194 számú szabadalmi irat). Más rendszerekben „represszor géneket alkalmaznak, amelyek gátolják más, a hímfertilitás szempontjából kritikus gének működését ÍPCT/G890/00102 (WO 90/08839) számú szabadalmi irat],

E rendszer egy még további javítása az US 5, 478,369 szárma szabadalmi iratban van leírva, amit referenciaként tartunk számon, A módszer ellenőrizhető himsterilítást hoz létre azáltal, hogy elnémítja a növény egyik, a hímfertiiitáshoz. nélkülözhetetlen, eredeti génjét, majd a natív DNS-t ugyanazon génnel helyettesíti, de most már egy indukálható promoterral összekapcsolva, ami. a gén kifejeződését szabályozza- Ez a növény tehát konstitu'/'·<> _s λΰ'2/'3&

tivan steril, de fertílíssé válik, ha promoter indukálódik és a hozzá kapcsolt himfertilitási gén kifejeződik.

észrevehető^ hogy a hímsterilitásr rendszerekhez vezető munka egyik, esszenciális lépése a hímfertilítást befolyásoló gének azonosítása.

Egy ilyen gén különböző rendszerekben — köztük az. itt leírtban is — lenne használható arra, hogy a himfertiiítást szabályozza, Korábban egy hlmfertxlitás-gént azonosítottak az Arabíoopszs fchaliana-ban és felhasználták hímsteril növények létrehozására. Az egyik ilyen, a hímfertílitás befolyásoló gént Aarts és munkatársai írták le [IVa tűre 363, 715-717 (1993); DS

5,473,369 számú szabadalmi irat). Jelen találmányban a feltalálók új_: DNS-molekulákat és az általuk kódolt aminosav-szefcvenoiákat írnak le, amelyek nélkülözhetetlenek a. növények hímfertiirtása szempontjából. Ezek minden olyan rendszerben alkalmazhatók, ahol a fértiIrtás szabályozása hasznos lehet, köztük az alább leírtakban is.

így tehát találmányunk egyik célja egy nukieinsav-szekvencia biztosítása, amelynek kifejeződése nélkülözhetetlen a növények himf ertiiításához.

Találmányunk egy másik célja egy promoter és annak esszenciális szekvenciái biztosítása egy fenti nukleínsav-szekvsnciához,

Találmányunk további célja egy eljárás biztosítása, amelyben a fenti. DNS-molekulákat alkalmazzuk hzmfertílitás szabályozására növényekben.

Találmányunk további céljai az alábbi leírásból és igénypontokból ismerhetők meg.

?S. 70.2/SE

Találmányunk tárgyát olyan nukleinsav-szekvenciák és különösen DNS-molekulák, valamint, az általuk kódolt olyan amínosavszekvenciák képezik, amelyek nélkülözhetetlenek a hímfertilitáshoz. Azonosítottuk a DNS promoterát, valamint annak esszenciális szekvenciáit, A találmány tárgyát képezi továbbá az ilyen DNSmolekulák alkalmazása hímfertilitás szabályozására növényekben..

Az ábrák, rövid leírása

1. ábra. Az SBMu200 himsterilitás-gén lókusztérképe (E ~ EcoRI, X - Xbal, B - BamHX, D » Pstl és S - Sací) .

2. ábra. Egy Son.thern-.blot gél képe, amelyen egy himsterilitásra szegregéit Hu géncsaládból származó DNS EcoRI-vei emésztett és egy Mu8 próbával hihridízált fragmentumai láthatók.

3. ábra, Egy Northern-blot gél képe, ahol az SBMu200-3,1 kiónból izolált Psti-fragmentumot használtuk hibri.dizálásra,

4. ábra. Az SBMu200 szekvenciája {a cDNS szekvenciáját az 1. számú szekvenciavázlatban, a fehérje szekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlatban mutatjuk be.

5. ábra. Az SBMulöO genomiális szekvenciája (7.. számú szekvenciavázlat} ,

S. ábra. Az SBHu20ö genomiális szekvenciájának és cDNS-e szekvenciád ának összehasonlítása..

7. ábra. Egy Rorthe.rn-bl.ot gél, amelyen az SBMuiöO gén kifejeződése látható a mikrosporogenezis folyamatában.

8. ábra. Az SBHu2öO teljes hosszúságú promotera {5. számú szekvencia váz lat} .

9. ábra. Az oszlopdiagram az SBHuSOö promoter 5'-delécióval kapott szakaszainak luci.feráz-rendszerrel mért aktivitását mutatja be.

Vb.?ö2/BE » φ

10. ábra. Az SBMu2ÖO promoter egyik esszenciális területe (€.

számú szekvenciavázlat) . A koordinátákat a vélelmezett TATA-fooxtói (aláhúzva) számítjuk. A P~motl vumokat dőlt karakterek jelzik, A linker-szkenning mutációkat ..... amelyek az aktivitást körülbelül 5 %-ra vagy kisebbre csökkentik — vastagltott karakterek jelzik. A jelentős, de kevésbé kifejezett hatású mutációk helyét a dőlt-vastsgított karakterek jelzik,

11. ábra. Az oszlopdiagramon, az SBMu2ÖÖ esszenciális promoter-fragmentumának kis (9-10 bp) szakaszain végrehajtott, restrikciós helyre irányuló linker-szkenning mutációk hatásait mutatjuk be.

12. ábra. Az SSHu200 cirokcimer és az SBMu2Ö0~3,l kukorica c'DNS szekvenciáinak összehasonlítása (a. cirok DNS~t a 3., a fehérjéjét a 4. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be) .

Az összes hivatkozott közlést referenciaként tartjuk számon.

Hacsak másként nem definiáljuk, a találmányunkban előforduló összes technikai és tudományos fogalmat a szakemberek — akikre ez a találmány tartozik — által közönségesen használt értelemben alkalmazzuk, hacsak mást nem állítunk, az alkalmazott vagy figyelembe vett technikák standard módszerek, amelyeket jól ismernek a szakemberek. Az anyagok, eljárások és példák csak. bemutatásra és nem korlátozásra szolgáinak.

A genetikai himsteriiítas egy mutáció, szupresszió vagy bármilyen más, a mikrosporogenesís egy adott lépésében nélkülözhetetlen génre irányuló hatás következménye lehet; a mikrosporogenezís fogalom alatt a poilenképződés teljes folyamatát értjük. Ezeket a géneket együttesen hímfert11írási géneknek (vagy más megközeiitésből himsterilitási géneknek) nevezzük. Az egész fo76.7Ö2/3B ** * lyamaton. beiül számos olyan lépés van, amelyben a gének működése befolyásolja a fertilitást. Ezt megfelelően alátámasztani látszik a genetikai hímsterilitás gyakorisága a kukoricában. A hímsteril mutánsok áj alibijeit fedezik fel az elit beltenyésztett vonalaktól az adaptálatlan populációkig terjedő anyagokban. Napjainkig a genetikai hímsteriiitás kutatása főleg leíró jellegű maradt. Történtek erőfeszítések a kukorica sterilitási mechanizmusának feltárására, de ezek közül csak néhány volt sikeres. Ss nem is meglepő, ha figyelembe vesszük a gének számát., amelyek a himsteriIrtásért felelősnek, bizonyulhatnak. Nem valószínű, hogy egy mechanizmus lenne alkalmazható az összes mutációra.

Az US .5,478,369 számú, szabadalmi iratban szerepei egy módszer, amivel egy hlmsterilitási gén ragasztható· a kukorica 9. kromoszómájának végére. Korábban a 9. kromoszómán azonosított egyetlen hímsterilitási gén az MS2 volt, amit. sohasem klónoztak és szekvenáltak [Aibertsen és Phillips, Canad. 7'. Génét. Cytol. 23, 195-208 (1981)1. Az egyetlen fertílitás-gén, amit eddig klónoztak, az Arabidöpsis Aarts és· munkatársai (íd. közi.) által leírt génje volt.

A találmányunkban leirt SsMu20ö gén a. kukorica 1. kromoszómáján helyezkedik, el és domináns allélje nélkülözhetetlen a hímfertiIrtáshoz. A lókusztérkép az 1. ábrán látható. A gén a fent leírt vagy másféle rendszerekben használható a hímfert.ilitás befolyásolására .

A sterilitásra szegregált kukorica-család neve SBMnSöű, és azt találtuk, hogy ven egy körülbelül 5,5 kbp méretű EcoRl-fragméntúrna, ami hibrid!zálódik egy Mu8 próbával. A családból ize76·, ?C*2 /35;

» ♦ *

láltak egy genoRi-iális kiónt, ami agy Mu8 transzpozonfc tartalmas. Egy próbát készítettünk a transzpozont határoló DNS-bői_f és azt találtuk, hogy az hibridizálédik a körülbelül 5,5 kbp SooR.1·fragmentummal. Ért a próbát használtuk a cDNS-klónok izolálására egy címer c^:DNS-könyvtárból - Az SBIüa2G0 cDNS-e 1906 bp méretű, és a Mu inszertum a gén 1. exonjában van. A 9. ábrán látható a genomíális nukleotíd-szekvencía, amit még bővebben megbeszélünk. A Northern-anaiiziasel feltárt expressziés mintázatok címerspecifikus kifejeződést mutatnak, aminek csúcsa körülbelül a mikrosporogenezís kvartett stádiuma és kvartett-szétválási stádiuma között van.

A találmány szerinti nukleotid-szekvenciákat tartalmazó plazma.dókat 1998. 10. 16-··án helyeztük letétbe az American Type Culfcure Collectíon (ATCC) Patent üeposítory-jában (Manassas, Vi .) , ahol a 98931 nyilvántartási számot kapták. A letétbe helyezés a Budapesti Egyezménynek megfelelően történt. A letétet kizárólag a szakemberek kényelme érdekében létesítettük, és ne® annak elismeréseként, hogy szükséges.

Továbbá, a szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a bemutatott teljes szekvenciánál kisebb fragmentumok, változatok és mutációk is használhatók, ha megőrizték a gén hímsteríiltást szabályozó tulajdonságát. Egy átlagosan képzett szakember könnyen.

felismerheti	az Ilyen variánsoka	t vagy	fragmentumokat, ha bejut-
tatja azokat	az MS26 stabil hin	isterü	ái léi re homozigóta neve-
nyek.be, majd	megfigyeli a növény	hímező'	zeteinek fejlődését.
A talál	Hiányhoz tartoznak a	zok a	n u k 1 e o t i d- s z e k ve n c í á k is,
amelyek szel	ektiven h lórid! záló<	Inak a;	; SBMuzOO nufcleotid-szek-
75.702/SS

.♦·**·< **,,·♦ * * * X * * * » : ··.···..· venciákkal szigorú körülmények között. Az SBMu2ÖÖ szekvenciával „szelektíven hibrid!zálódó kifejezés egy olyan nukleo-tíd-szekvenciára utal, amely szigorú körülmények között kimutathatóan nagyobb (azaz a hátteret legalább kétszeresen meghaladó) mértékben hibridizáiődik egy megbatározott nukiectid-szekvenciávai, mint egy nem célzott nukleinsavval.

A ?,szigorú körülmények vagy „szigorú hibridizációs körülmények kifejezések azokra a körülményekre utalnak, amelyek, között egy próba kimutathatóan nagyobb (azaz a hátteret legalább kétszeresen meghaladó) mértékben hibridízálödik a célszekvenciájával, mint más szekvenciákkal. A szigorú körülmények a célszekvenciától függenek és a polínukieotíd szerkezetétől függően különbözőek lesznek. A híbridizálás és/vagy mosás szigorúságának szabályozásával olyan célszekvenciák azonosíthatók, amelyek 100 S-ban komplementerek a próbával (homológia-vizsgálat). Másrészt, a szigorú körülmények úgy is beállíthatók, hogy lehetővé tegyék a szekvenciák bizonyos fokú keveredését, amivel alacsonyabb fokú hasonlóságok is kimutathatók (hetsrolőgia-vizsgálat). Általában az ilyen típusú próbák bosszúsága körülbelül 1000-250 nukleotid.

A nnk.ieinsavak hibridízálásához részletes útmutatást találunk Tijssen: „Laboratory Technignes in Siochemíst.ry and Afcdecsl.ar BLology -- Aybridization tóth hucleic Acid Prcbec (Slsevier,

New York, 1993), Ausubel és munkatársai (eds.): „Current .Protocols in üolecular Sío.l.ogy' (Wiley - Interseience, hew York, 195) és Sambrook és munkatársai: „éfcleouia.r Cloníng; A iaborafozy Ms~ nual (2. kiadás, Cold Spring Hárbor Laboratory, Cold. Spring Har.feor, 19 89) ké z í könyve í ben,

7S.782/BS »*ií*

Általában azok a szekvenciák, amelyek megfelelnek a találmány szerinti nukleotid-szekvencíáknak és hibtidizálódnak a találmány szerinti nukleotid-szekvenciákkal, legalább 50 %-os, 70 %-os, vagy éppen SS %-os vagy nagyobb fokú homológ!át mutatnak a találmány szerinti szekvenciákkal. Ez azt jelenti, hogy a próba és a célszefcvencia közötti hasonlóság foka legalább körülbelül 50 %, körülbelül 70 % vagy éppen 85 %.

A specificítás tipikusan a hibridizáiás utáni mosás függvénye, ahol a kritikus tényezők az utolsó mo-sóoldat ionerőssége és hőmérséklete. A szigorú mosási körülmények között a hőmérsékletet általában körülbelül 5-2 °'C-kal alacsonyabbra állítjuk be, mint az adott szekvencia olvadáspontja íT_m) egy meghatározott ionerősség és pH esetében. A DfíS .„megolvadása (denaturálódása) egy keskeny hőmérséklet-tartományban következik be, és tulajdonképpen a kettős spirál szétválását jelenti a komplementer egyes szálakra. A folyamatot az átmenet középpontjának hőmérsékletével jellemezzük (T_m>, amit olvadási hőmérsékletnek is neveznek. Az olvadási hőmérséklet meghatározására számos képletet ismer a szakterület.

A találmány szerinti nukleotid-szekvenciák számára előnyös hibridizációs körülmények közé tartozik a 42 ’C-on, SÖO g/1 formamid, őx SSC-ben, 5 g/1 SDS és 100 pg/ml lazacsperma-DNS jelenlétében végzett hibridizáiás. Példaszerűen gyenge szigorúéágú mosási körülményeket jelent a 42 °C.-on, 2x SSC-ben, 5 g/1 SDS jelenlétében, 30 percen át, majd ezt megismételve végzett hibrídizálás. Példaszerűen mérsékelt szigorúságé körülményeket jelent az 50 ^sCon, 2x SSC-ben, 5 g/1 SDS jelenlétében, 30 percen át 7Í.702/BE végzett és megismételt mosás. Példaszerűen erős szigorúságé körülményeket jelent a 65 ’C-οπ, 2x SSC-ben, 5 g/1 S.DS jelenlétében, 30 percen át végzett és megismételt mosás. A találmány szerinti promoternak megfelelő szekvenciák a fenti körülmények bármelyike között nyerhetők. Találmányunkban az erősen szigorú körülményeket használjuk.

A szekvenciák összehasonlításra szolgáié eljárások jól ismertek a szakterületen. Géneket hasonlíthatunk össze a BLAST algoritmussal {Basic Loca.1 Alígnment Search Tool; Altsebül et al., J. AÍg.L. Bioi. 215, 403-410 (1993); lásd még www.ncbi.nlm.nih.gov], az alap-beállítási paraméterek használatával, hogy azonosítsuk azokat a B.LA.ST „GEEEMBL adatbázisában tárolt szekvenciák segítségével. A találmány szerinti szekvenciák esetében az azonosság azt jelenti, hogy egy polinukieotid-szekvercia azonosság! foka legalább 65 %-os, előnyösebben legalább 70 %-os, előnyösebben legalább 75 %-os, előnyösebben legalább 80 %-os, előnyösebben legalább 85 %-os, előnyösebben legalább 90 %-os és legelőnyösebben legalább 95 %-os.

A promoter-területeket a szakemberek könnyen azonosíthatják, Megkeressük az ATG motívumot tartalmazó, vélelmezett, start-kodont, és a start-kodontöl felfelé eső terület a vélhető promotér. A ,,promoter a DNS egy szabályozó területe, amely rendszerint tartalmaz egy TATA-boxet, ami az RNS-polimeráz-ΙΙ-t irányítva megindítja az RNS szintézisét az adott fokozó szekvencia megfelelő transzkripciós kezdőhelyén. Egy promoter tartalmazhat még járulékos felismerő szekvenciákat is, amelyek általában a TATA-boxtői felfelé {5^firányban) helyezkednek el és a transz7 5.702/BE kripcíó megindulásának sebességét szabályozzák (ezeket nevezzük felső promoter-eiemeknek} . nyilvánvaló, hogy ha azonosítottuk a találmány szerinti promoter nukleotid-szekveneiáiát, akkor a szakembereknek nem okoz nehézséget a további szabályozó elemek azonosítása az adott promoter TAfft-boxtol felfelé eső területén, így tehát a találmány szerinti promoter-területet általában tovább azonosíthatjuk a felső szabályozó elemek jelenléte alapján, amelyek a kódoló szekvencia szövetbe11 vagy időbeni kifejeződéséért felelősek, fokozok vagy hasonlók lehetnek. Hasonlóképpen azonosíthatók, izolálhatok es más promoter-magokkal felhasználhatók azok a promoter-elemek, amelyek a kifejeződést egy meghatározott, például hámszövetben teszik lehetővé.

A találmány szerinti, izolált promoter-szekvenciák módosíthatok, hogy megfelelő mértékű kifejeződést biztosítsanak idegen (heterológ) nukíeotid-szekvenciák számára. A teljes promoter-te~ rületnéi kisebb szakaszok is használhatók és megőrizhetik a por™ tok-specifikus kifejeződés vezérlésének képességét. Felismertük azonban, hogy a mRNS expresszrójának szintje szökkenhet, ha részeket távolítunk el a promoter-szekvenciából. Eszerint egy promotert módosíthatunk úgy, hogy gyenge vagy erős promoter legyen, általában a „gyenge promoter kifejezés alatt egy olyan promotert értünk, amely alacsony szinten működteti a. kódoló szekvencia expresszióját. Az „alacsony szint körülbelül 1/10.QGO-től körülbelül 1/100ÖüO-ig, vagy körülbelül 1/500.Oöö-ig terjedő transzkriptumot jelent. Ezzel szemben egy erős promoter magas szinten működteti egy kódoló szekvencia expressziéját, ami körülbelül 1/10-től körülbelül l/löö-ig, vagy körülbelül 1/1000-ig 75,TÖ2/BB «ν terjedő transzkriptumot jelent. Általában egy izolált promoterszekvenciábó.1 legalább körülbelül 30 nnkleotidot használunk egy nukleotid-szekvencia expressziójának működtetésére. Ismert, hogy a transzkripció szintjének emeléséhez £okozók, használhatók a találmány szerinti promoter-területekkel kombinálva. Λ fokozó (enh-anee.r) egy olyan nukleotld-szekvencia, amely serkenti egy promotor-terület kifejeződését. A. fokozok - mint amilyen az SVáO fokozó terület, a 35S fokozó elem és a hasonlók — jól ismertek a s zakte.rü.1 eten.

Azok a szekvenciák, amelyek hibridizálódnak a találmány szerinti szekvenciákkal, szintén találmányunk oltalmi körébe tartoznak. Azok a szekvenciák, amelyek megfelelnek a találmány szerinti promoter-s-zekveneiáknak és hibiridízáiódnak azokkal,, legalább 50 %-ban, 70 S-foan, vagy éppen 85 %~ban vagy nagyobb mértékben homológok a találmány szerinti szekvenciával.

A kisebb fragmentumok cég mindig birtokolhatják a promoter szabályozó tulajdonságait, igy a deiéciós analízis lehet az egyik módja az esszenciális területek azonosításának. A deiéciós analízis a szabályozó terület mindkét, 5'- és 3'-végén végrehajtható. Fragmentumokat helyre irányított mutagenezissel, polimeráz láncreakcióval végzett mutagenezissel és hasonlókkal nyerhetünk („tűre eted Mutagenesis: Ά Practicai App.roa.ch, IRL Press, 1991?. A 3*-deléciókkal körülhatárolható az esszenciális terület és megtalálható a 3' -vége,· amellyel ez a terület működőképes módon kapcsolható egy tetszőleges promoter-maghoz. Ha az esszenciális területet egyszer meghatóztuk, akkor egy exogén gén transzkrípcióját szabályozhatjuk az esszenciális uéíltfWt és egy promofer-mag együttesével. A prcmoter-mag bármely « * ter-xuag együttesével. A promoter-mag bármely ismert promoter-mag lehet, mint amilyen a karfiol mozaik vírus 35S vagy 19S proiaotera (US 5,352,605), az nbikvitín promoter (US 5,510,474), az IN2 promoter-mag (US 5, 364,780) vagy a görvéiyfü mozaik vírus proiaotara (Gruber et al., in: „áfethode in Plánt Molecniar Blology and Sioteohology^', pp. 89-119., CRC Press, 1993),

Az SBMu.2-00 szabályozó területét a vélelmezett TATA-boxtól felfelé elhelyezkedő, 1.005 bp hosszúságú területként azonosítottuk (8, ábra) - A fent körvonalazott módszerrel megállapítottuk azt is, hogy a promoter esszenciális területe a TATA-boxtöl felfelé elhelyezkedő -180 bp, amelyen belül különösen esszenciális a -176. bázispártól a -44.-ig terjedő szakasz.

Promoter-szekvenciák más növényekből is izolálhatok jól ismert technikákkal a találmány szerinti promoter-szekvenoiávai mutatott homológiájuk alapján. Ezekben az eljárásokban az ismert promoter-szekvencía egészét vagy egy részét használjuk próbaként, ami szelektíven hibrid!záióőík más szekvenciákkal, amelyek egy adott szervezetből származó, klónozott genom-DHS fragmentumok populációjában (azaz egy genom-könyvtárban.) vannak jelen. A nukieinsav-szekvenciák hibrid!zálásanak módszerei jól ismertek a szakterületen.

A teljes promoter-szekvencía. vagy annak egy része használható olyan próbaként, amely képes specifikusan hibrídizáiódni a megfelelő promoter-szekvenciákkal. Ahhoz, hogy különböző körülmények között is elérjük a specifikus hibrídizálódást, az ilyen próbáknak egyedi szekvenciákat kell tartalmazniuk, amelyek előnyösen legalább körülbelül 10, és legelőnyösebben legalább kő?b.7C<>/$S

ΦΦ * rülbelül 20 nukl.eot.id hosszúságúak. Az ilyen próbák felhasználhatók a megfelelő promoter-szekvenci.ák. sokszorczására egy kiválasztott szervezetből a polimeráz láncreakció (PCR) jól ismert eljárásával. Ez a technika használható járulékos promoter-szekvenciák izolálására egy kívánt szervezetből vagy annak megállapítására, hogy a promoter-szekvencía jelen van-e a szervezetben. A szélesztett DNS-könyvtárak hibridizációs szűrővizsgálatára Innis és munkatársai íeds.}: „PCR Frotocds, A Guíde to Methods and Applications' (Acad. Press, 1990} kézikönyvében találunk.

módsz e rekét.

Továbbá, a találmány szerinti promoter az SBMuzOO géntől, eltérő nukleotid-szekvenciához is kapcsolható, hogy heterológ nukleotid-szekvenciák ís kifejeződhessenek. A találmány szerinti promoter nukleotid-szekvenoíája, valamint annak, fragmentumai és változatai, expresszíős keretekbe foglalhatók a heterológ nukleotíd-szekvenciákkal együtt, hogy kifejeződhessenek az adott növényben, pontosabban a növény hámszövetében. Egy ilyen expreszszíős keret a restrikciós helyek sokaságát kínálja a nukieotidszekvencia ínszertálása számára, amely a promoter transzkripciós szabályozó hatása alá kerül. Ezek az expressziős keretek alkalmasak bármely növény genetikai módosítására a kívánt fenotí pu-sos válasz elérése érdekében. Az SBMuiOO promotert tartalmazó expresszíós vektorban idegen génként alkalmazható nukleotíd-szekvén-dákra példaként említjük a komplementer, nukieotíd-tipusű egységeket, például az antiszensz molekulákat (kalláz antíszensz RNS, barnáz antiszensz RNS, kalkon-színtetáz antiszensz RNS,

Ms4 5 antiszensz RNS), a ríbozimeket és külső vezető szekvencia76.702/SS kát, egy aptamert vagy egyszálű nukleot ido-kat- Az idegen nukleotid-szekvencía kódolhat auxinokat, rolB-t, citotoxinokafc, diftéria-toxint, SAM-metilázt, avídint, vagy egy prokariota szabályozó rendszerből származhat. így például Marian! és munkatársai ihVature 347, 737 (199ö)j kimutatták, hogy akár az Aspergú.Llus

-oryzae TI BKáza, akár a Saodllns amyJolíguefacrezís RNáza (amelyeket „barnáz^-nak neveztek) a tapsiamban kifejeződve a sejtek pusztulását és ezzel iiímsterilitást okoznak. Quaas és munkatársai [Sur. J, Biochem. 173, 617 (1988) I leírták a Ti RNáz kémiai szintézisét, míg a barnáz-gén na.fcleotid-szekveno-iáj át Hartley derítette fel |J. fíbl. Siói. 202, 913 (1988)]. Az Agrobacterium rhizogenes rolB génje egy enzimet, kódol, amely megzavarja az auxin-anyagoserét azáltal, hogy indulókat szabadit fel az índoxíl-p-glükozidokból, Kstruoh és munkatársai [SMBÖ Cl 11, 3125 (1991)1, valamint Sp-ena és munkatársai ÍTheor. Appl. G-enet, 84, 520 (1992)1 kimutatták, hogy a rolB gén portok-specifikus kifejeződése dohányban zsugorodott porzókat eredményez, amelyekben nagy mértékben lecsökken a poilezképződés, igy a rolB gén az egyik példa az olyan génekre, amelyek alkalmasak a pollentermo-

lődés szed	zályoző	sara.	Slighton és munkát áj	csal ío, Bioi. Chejn,
261, 108	(1985) }	irták	le a rolB gén nukle	ott d— s z e kv e ne t á j á t. A
diftéría-t	oxint 1	kódoló	gén DNS-moiekuláít a	z ATCC-tói lehet meg-
kapni (No .	39359	és No	ο / a z 1lásd meg az	EP-A 90902754,2 számú
szabadalmi	X. '.A u·’.»?	t) . A	BAM-metiiáz génjét	sterilitás o ko z á s á. r a
használták	az US	5, 68 9,	ö 4 9 é s PCT/U8 9 5/15 2 2 9	számú szabadalmi ira-

tokban ieirt eljárásokban. Az avídín gén alkalmazását sterilitás okozására az US 5,962,769 számú szabadalmi iratban Írták le.

75.702/BS

Találmányunkhoz tartoznak az SBMu200 gént tartalmazó vektorok is. A vektort úgy készítjük el, hogy tartalmazza az SBNu2Öö gént, egy promotert, ami a gént működtetni fogja a növényben, és egy terminátor-szakaszt.. Amint megjegyeztük, a szerkezetben a promoter lehet natív vagy lehet egy helyettesítő promoter, ami biztosítani fogja a kifejeződést a növényben. Az alkalmazott promoter lehet egy indukálható promoter, aminek következtében a szerkezetben lévő szánsz vagy antíszensz molekula kifejeződését az índuktorrai való expozíció fogja szabályozni.

A vektorban a gén szándékolt alkalmazásától függően további alkotórészek is lehetnek, amelyekre példák a szelektálható markerek, a célra irányító vagy szabályozó szekvenciák, a stabilizáló vagy vezető szekvenciák, és a többi. A növényi expressziős vektorok és riporter-gének általános leírását illetően Grube.r és munkatársai (id. mű) kézikönyvére utalunk. A megfelelő expreszsziös vektor kiválasztása a gazdaszervezettől és attól az eljárástól függ, amellyel sz expressziós vektort a gazdába kívánjuk juttatni. A szóban forgó idegen nukleotid-szekvencia 3^f-végénél az expressziós keret tartalmazhat még egy transzkripciós és transzlációs terminátor-szakaszt is, amely működőképes a növényekben. A termínátor-szakasz natív lehet a találmány szerinti proBsofcer nukleotid-szekvenciája számára, natív lehet a szóban forgó DNS számára, vagy származhat idegen forrásból. Kényelmesen haszná iható t e.rminá t or- s za kas zo kát nyerhetűn k a z Apróba c téri um taisefaciens Ti-plazrnid j áböl ? ilyenek az oktopin-szintetáz vagy a nopaiin-szintetáz terminátor-szakaszok [Guerineau et ai., Mól.

141-144 (1991); Froudfoot, Ceil 64,

Gén e t

262

Proadfoot,

671-674

Gén.

76.70-2/ BE

5, 14.1-149 <1991} ; Mogen

(1991); San rácon et	ai., (lenes	Pev. 5,
aΊ., flant Celu 2,	1261-1272	(1990) ;
151-158 (1990) ; Bal	1 a s e t; a 2 , ,	duci.
(1989) ; Joshi et al.	, Nucl, Aeids Pás.
Az expressziős	keretek járt	ílé kosán

szekvenciákat is, Az ilyen vezető szekvenciák a transzlációt fokozhatják. A transzlációs vezetők jói ismertek a szakterületen: ilyenek a pl co mavírus vezetők [például az enkefaiomlokarditísz vírus 5* ne® kódoló területe; Slrov-Stein e<

Proc, Na £2 vezető; Alii són et ai., VÜrology 154

9-20

AeaoL Scí. (7SA 8 6, 6126-6130 (19895), a potyvirus vezetők [például a TEV (dohány karcoiatos vírus) vagy az MDMV (kukorica törpe mozaik vírus) (1989)], a humán immunglobulin nehéz láncát kötő fehérje [BiP, 'Macejak et ai,, Natúré 353, 90-94 (1991)), a lucerna mozaik vírus köpenyfehérja mBdS-ének le nem fordított vezetője [AMV RNA 4, -«Jobb 1 ing et ai ., Natúr© 325, 622-62S (1987)], a dohány mozaik vírus vezetője [TMV, Gallie et ai,., dóiecnlar Bioíogy of SNA, pp. 237-256 (1.939) ] , és a kukorica klorotikus foltosság vírus vezetője · (MQ4V, Tömmel et ai,, Firology 81, 332-385 (1951);

Della-Ciopps et al., Plánt Pávaiéi. 84, 965-968 (1987)}. A keret olyan szekvenciákat, például intronokat is tartalmazhat, amelyek fokozzák a transzlációt és/vagy a mRNS stabilitását.

Azokban az esetekben, amikor kívánatos lenne, hogy az idegen nukleoziő-szekveneía kifejeződött terméke egy meghatározott sejtszervecskére., például a plasztídokrs, amilopiasztrs vagy az endoplazmatíkus retíkulumra irányuljon, illetve a sejt felszínére vagy extraceliuiárisan kiválasztódjón, az expresszié© keret ?«. 7Ö2./B3E egy tranzit-pepiid kódoló szekvenciáját is tartalmazhatja. A tranzit-peptidek jól ismertek a szakterületen; ilyen például — nem kizárólag — az acil-karrier fehérje tran2it~peptidje, a EUBXSCO kis alegysége, a növényi EFSP-színtetáz és a hasonlók, A szakemberek számos módját ismerik egy termék egy meghatározott sejtszervecskében történő kirejeztetésének. így például az árpa «-amiláz szekvenciáját gyakran használják úgy, hogy az endoplazmatikus retíkulumban fejeződön ki a terméke [Rogers, J. Siói. Chem. 260, 3731-3738 (1985)]. A tranzit-peptidek használata jói ismert (CS 5,717,034 és 5,728,925),

Az expressziős keret elkészítésekor a különböző DNS-fragmentumokat ügy kezeljük, hogy a DNS-szekvenciák megfelelő irányultságúak és a megfelelő leolvasási keretben legyenek. Ennek érdekében adaptereket vagy linketeket alkalmazunk a DNS-fragmentamok összekapcsolásához, vagy más kezelést hajtunk végre, mint amilyen a kényelmes restrikciós helyek kialakítása, a felesleges DNS eltávolítása, restrikciós helyek -eltávolítása vagy hasonlók. Ilyen célokra az in vitro mutagenezis, a primer helyreállítás, a restrikciós emésztés, az összeolvasztás és az űjrahelyettesítési (tranzíciő és transzverzió) eljárások alkalmazhatók.

Amint említettük, találmányunk biztosit egy vektort, amely képes a szóban forgó géneket kifejeztetni egy promoter szabályozó hatása alatt. A vektornak általában növényi sejtekben kell működnie. Idővel előnyösek lehetnek az. olyan vektorok, amelyek £'. ooii-ban is működőképesek (például fehérje termelése antitestek indukálásához, DNS szekvencia-analízise, ínszertumofc szerkesztése, mennyiségek előállítása nukleínsavakből), Az E. co.lí7«.782/SS bán kifejeződő vektorokat és elkészítésük módját Sambrook és munkatársai (id. uü) kézikönyvében találhatjuk meg.

A transzformációs vektor, ami a találmány szerinti promoterszekvenciát tartalmazza működőképes módon összekapcsolva egy idegen szekvenciával egy expressziős keretben, tartalmazhatja még legalább egy gén nukieotid-szekvenciá ját a gazdaszervezet kotranszformáiása céljából. Más megoldásként a járulékos szekvencia egy másik transzformációs vektorban is bejuttatható.

A transzformációs vektorban riporteriének lehetnek jelen; az alkalmas riportergénekre számos példa van a szakirodalomban [Jefferson et alt, ín: „Plánt .Mbleouiar Síology éfeneal, pp. 133·., Gelvirt et ál., (eds.), Kluwer Academic Publishers, 1991;

DeWet et al., Hol. deli, Siói. 7, 725-737 (1987 5; Gof.f et al.,

PMBO 7. 9, 2517-2522 (1990); Kain et. al. , BioTeehnigyes 19,

850-655 (1995) és Chin et al., -Current Siói. Q_f 325-330 (1996)].

A transzformáit sejtek 'vagy szövetek szelektálására alkalmas markergének is lehetnek a transzformációs vektorban. Az ilyen gének közé tartoznak az antibiotikum- és herbicid-rezisztenciát kölcsönző gének. A szelektálható- markergénekre nem. korlátozó példaként említjük az alábbiakat: kioramfeniko.l-reziszten.cia [Herrera-Estrella et al., SMBÖ ,J. 987-992 (1983)), metotrexátrezisztencia [He.rrera~Est.rel l.a et al., Natúré 303, 209-213 (1983); Meijer et al., Alant M?l. Siói. 16, 807-820 (1991)), higromicln-rezisztencia [Waidron et al., Plánt hfol. Bíol. 5, 103-103 (1985); Zhijian et al., Plánt Sci. 108, 219-227 (1995)), sz'treptomíoin-rezisztencia [Jones et al., Mól. Gén. Génét. 210, 86-91 (1987)1, szpektinomicin-rezisztencia [Bretagne-Sanard et

7S. 0.2/SS al., Tra&sgenic Pes. 5, 131-137 (1996)], bleomicin-rezisztencia (Hille et al., .Plánt Afol. Bioi. y, 171-176 (1990) ], szulfonamidrezisztencia (Guerineau et ai., Plánt Mól. Bioi. 15, 127-136 <1990)1, bromoxinii-rezisztencia [Stalker et al., Science 24.2, 419-423 (1983)}, glifozát-rezisztencla (Shaw et ah, Science

233, 478-481 (1986) j és foszfinotricin-rezisztencia [.DeBlock et ai., PMSÖ J. ő, 2513-2518 (1987)}.

A transzformáció és/vagy t.ranszfekciö módja nem kritikus a találmányunk szempontjából. Mindkét módszerhez számos eljárás áll rendelkezésünkre. Amint újabb eljárások válnak elérhetővé a növények és más gazdasejtek transzformálására, azonnal közvetlenül alkalmazhatók. Ennek megfelelően a módszerek széles választékát fejlesztették ki egy DNS-szekvenciának egy gazdasej tbe juttatására, hogy elérjék a szekvencia transzkripcióját vagy transzkripcióját és transzlációját, ami a szervezet fenotipusának megváltozásához vezet. így tehát bármely eljárás alkalmazható, ha hatásos transzformációt érhetünk el általa.

Azok az eljárások, amelyekkel expressziós vektorok juttathatók növényi szövetekbe, széles választékban állnak rendelkezésre, és a megcélzott növénynek megfelelően választhatók meg. A növények széles körének transzformálására alkalmas eljárások a

szakirodalomban vannak 1	eírva [Miki. et al	., „Procedu.
roducing	toréign DNS	lato Plánta, í:	n; „déthod
Molecular	Bi o techn o-l-ogy	(már idézve) ; Kl<	sin et al. ,
logy 10,	268 (1992) és	Weising et al. ,	Anno. Pev.

Xil

Bio/Techno421-477 (1988)]. így például a DNS-szerkezetek olyan technikákkal juttathatjuk be a növényi sejt genomjába, mint a mikrobelö7«.'7ü2/SK

Φ» * vés-e s szállítás [Klein et al,, Ma tűre 327, 70.....73 (1987)1, az eiektroporácíó [Fromm et al,, Proc. Nstl, Acad. .Ser. dSA 82, 58.24 (1.985)], a poiietilénglíkolos (PEG) ki-csapás (Paszkowskx et al., EM&G J. 3, 2717-2722 (1984)1, a közvetlen génbevitel (WO

85/01856 és EP 0 275 069), az ín vitro protoplaszt-transzformácíó {US 4,684,644) és a növényi protoplasztok vagy embriogén kaliusz míkroinjekciőzása [Crossway, Mól. Gén, Génét, 202, 179185 (1385)1. Sgy másik lehetőség a növényi szövet közös tenyésztése az ág'.robacta.ri_:!rs twefaeí ens-szel, ahol a DNS-szerkezetet. egy kettős vektor-rendszerben helyezzük el [US 5,591,616; Ishída et al., .Natúré Blotechnoiogy 14, 745-750 (1996)], Ekkor az A.

twae-faciens virulencia-funkcíői irányítják a szerkezet ínszercíőját a növényi sejt DNS-ébe, miután a baktérium megfertőzte a sejtet [Hor-s-ch et all, Science 233, 496-498 (1984); Fraley et sí., Proc. Náfl, Acad. Ser, USA 80, 4803 (1983)].

Az olajrepce transzformálásának standard módszereit Möloney és munkatársai írták le [Plánt Cell Seports 8, 238-242' (1989)]. Gabona transzformálását. Fromm és munkatársai [Sio/leoiinoiogy 8, 833 (1990)] és Gordon-Kamm és munkatársai (id. közi.) írták le,

As Agrobaoferíum els< egyszikűt, így a kuk<

az U-S 5,550, 318 szám

>rban kéts	zikűeken s	í lkaimat)
_cát is transzformál	tak vei
szabadalmi iratot).	A rizs
i (Plánt	J. 6, 271	-282 (1
Siotechn,	10, 239	(1992)]
áoad. Sca,	USA 88,	6389 (1
? a rizs	fcranszform	álására
ra.nszf ormi	íIható. A	cirok t

76,702

Casas és munkatársai (id. közi.), illetve Wan és munkatársai íPlánt Physiol. 104, 37 (1994)] írfák le. A szója transzformálásáról számos közlemény szól,· köztük az OS 5,015, 580 számú szabadalmi irat.

Az alábbi példák az útm.utatást és illusztrálást szolgálják, de nem korlátozzák találmányunk oltalmi körét.

A SBMU20O azonosítása és koszegregálása

Egy mufator (Mu) populációból olyan növénycsaládokat válogatunk ki, amelyek növényei zömmel hímsterilek, egynek sem voltak porzói, vagy csak néhányon jelentek meg abnormális porzók, de egyben sem volt pollen. A hlmsterilítás okául feltételezzük, hogy egy Mu elem. integrálódott véletlenszerű módon egy génbe, ami a mikrosporogenezis bizonyos lépéseiért felelős, és .megzavarta annak depresszióját. Egy szegregé lódó· Fy család — amelyben a himsteril mutációt SBHu200~ként jelöljük — növényeit felneveljük és a hímfertílitás vagy sterilitás szerint osztályozzuk. Osztályonként körülbelül 20 növényről levélmintákat veszünk és izoláljuk belőlük a DNS-t,

A Mu és a sterilitás kapcsolatának igazolására Southern-analízist végzünk, ami a szakemberek által jói ismert technika. Ez a mindennapos eljárás magában foglalja a növényi DNS izolálását, restrikciós endonukleásokkal való feldarabolását, a DNS-darabok molekulatömeg szerinti frakcionálásit agarözgéien, mad átvitelüket nejlonmembránokra, hogy rögzítsük a szétválogatott DNS-t, Ezután ezeket a membránokat egy radioaktív jelöléssel ellátott .702/SS ♦ *· {32pp-dCTB~t tartalmazó) próba-fragmentummal hibridizál juk és SDS-oldattai mossuk ^Southern, J. Aöl, Bioi. .9 8, 503-517 1975)]. Egy szegregáXődö Fg SBMu2Q0 család növényeit felneveljük és hímfertilitás vagy sterilitás szerint osztályozzuk. Osztályonként körülbelül 20 növényről levélmintákat veszünk, amelyekből izoláljuk a DKS-t. Az 5 fertilís és 12 steril növényből származó DbS-t (körülbelül 7 pg) EcoRI-vei emésztjük, majd a fragmentumokat 0,75 %-os agarózgélen szétválasztjuk. Az emésztett DNS-t nejionmambránra visszük át, a membránt a Mu transzpozon agy belső fragmentumával hibridizáljuk, A membrán autórádiógramján (2. ábra) egy 5,5 kbp méretű EcoRI fragmentum kőszegregálódása látható a steril fenetípussal. Ez az EcoRI sáv szegregálóöott a fertilis növényben, ami arra utal, hogy az alléi heteroziaőta vad típusú.

Könyvtár készítése ás szűrővizsgálata

A cD^S-könyvtárak készítésének módja közismert a szakemberek körében és Sambrook és munkatársai már idézett kézikönyvében van leírva, A könyvtárakat az alábbi módon készítettük el.

Egy sterilia növényből származó DNS-t EcoRI-vei emésztünk és egy preparatív gélen megfuttatunk. Az 5,0 és 6,0 kbp közötti méretű DNS-sávokat kivágjuk a gélből, a DKS-t elefctroeiűciővai kinyerjük és etanoiial kicsapjuk. Ezt a DNS~t a Lambda Kap vektorba (Stratagene) ligáljuk a gyártó utasítása szerint. A ligáit DNS~t fágokba „csomagéijuk a Gígapack Goid (Stratagene) készlet alkalmazásával. Körülbelül 500.000 tarfoitképző egységet (BFU) ssélesztünk, majd emelünk fel nitro-cellulőz membránokra.. A membránokat az Mu8 próbával hibridizáljuk. A szűrővizsgálat harmadik körében egy tiszta kiónt kapunk. Az inszertumot plazmádként kivágjuk a fágból és SBMu20ö-3.1-nek neveztük el. A kiónból izolálunk egy PstI határoló fragmentumot és ellenőrző próbaként alkalmazzuk az eredeti EcoRI fragmentum koszgregáciős vizsgálatához. Az 5,5 kbp EcoRI fragmentum homozigóta az összes sterilig növényben, ami megerősíti, hogy a megfelelő Mu fragmentumot izoláltuk. A fér til is növények közül három bizonyult he te.ro zí góbénak az 5,5 kbp é.s egy 4,3 kbp EcoRI sávokra. A fertilís növények közül kettő volt homozigóta a 4,3 kbp Ecorl-sávra, ami feltételezhetően a vad típusé alléi..

Expressziem analízis ás a cDNS izolálása

A portok fejlődésére jellemző gének kifejeződését Northern-analízissel mutatjuk kí a mdkrosporogenezís különböző fázisaiban.. A Northern-analízis is jól ismert eljárás a szakemberek körében; hasonlít a Southern-analizishez azzal az eltéréssel, hogy nem DRS-t, hanem mWS-t Izolálunk és viszünk fel a gélre. Ezután

az Rí	1S-t hib	rídizáljuk a	jelölt	próbáv
ΆΓ -f- 7 tV<2 u .-i- .	Acad. Sói. ÜSA 78,	6562-6(	>66 (19í
ben.	Génét.	0 -i α q ? ις... 9 *} 4	(1989	) } . Az
Pst 1	f raguién	t úrnőt használ	unk pr	öbának
bán,	amit m;	ágból, éretle	n csőt	ő 1, cs
szára	ja zó RNS-	•sel végzünk.	Csak egyetlen
-RNS-	ben, kö	rülbelül a a	íi kr os-po r ogene:

~ » « »- * « * Φ * * » * * , ♦ * * ζ * (3. ábra). A transzkriptám körülbelül. 2,3 kbp hosszúságú. Ugyanezt a próbát használjuk egy másik cDNS-könyvtár szűrő-vizsgálatához, amely a meiotikustól a késői egymagvűig terjedő stádiumé portokokból származó- mRNS~ ról készült. E könyvtárból ~ amit S3Mu20Q~S.1-nek neveztünk — egy kiónt izoláltunk..

Az 38Mu2öö-3.I genom-klónt és az SBMu200-8.1 cDNS-klónt a Lofstrand Labs Ltd. s-zekvenálta Sanger és munkatársai módszerével [Proc. Ate ti, Acad. Ser. dSA 74, 5463-5467 (1977)]. A szekvenciákat a 4. és 5. ábrákon, összevetésüket a 6. ábrán mutatjuk be. A cDNS/genom összevetés 5 intron jelenlétét fedte fel a genom- kiónban. Az Mu8 inszertu® az 1. exonban van. A kodon-prefereúcia és a véletlenszerűségtől való eltérés vizsgálata minden

zíciójában egybeeső	eredményt	adott a cDNS	nagy ny	ilt
keretével, ami val	ószínűieg	a fehérje-kő·	dőlő ny	üt
keret. Egy vélelme.	iett Met	start kodon van a gén	om-
pozíciójában. A cG-f	ÍS: .homológiája a genom-	kiónnal	az
sotidnál kezdődik.	Sv £? *7 £5 V ·$-* iJv< övtA-U t-í	az SSMulOO—8.	I nem	egy

teljes hosszúságú klón, mert 5 bázis hiányzik belőle a vélelmezett Met startkodon felett. Egy adatbázisban végzett kutatás jelentés homológiát mutatott ki. az élesztők, növények és emlősök P45Ö enzimei között. A 9150 enzimeket kiterjedten vizsgálták és három jellegzetes fehérje-doménjüket tárták fel. Az SBMu20ö-8.1 prediktált fehérjéje és a domének konszenzus aminosav-s-zekvenciúja összehasonlításával kimutattuk, hogy 1) a dioxi-gén-kötő do7S.702/3K » * · 4.

♦ * ¢, * ♦·<*♦ <·* mén azonossága 92 %-os; 2') a tridekapeptid {szteroidkötö} dómén azonossága 85 %-os; és 3) a -C-termináiis (hemkötő) dómén azonossága 100 %-os. Ezen túl expressziés vizsgálatot végeztünk a mikrosporcgenezis egyes stádiumaiban az SBMu200-8.1 cDNS-próbát használva. Jeleket a meiőzís 11/kvartett stádiumtól a késői egymagvű stádiumig kaptunk; a .legnagyobb jelek a korai és késői egymagvű stádiumokban jelentek meg (7. ábra).

5, példa:

A promoter és esszenciális területeinek azonosítása

Egy vélelmezett TATA-fooxot azonosítottunk primer extenziós analízissel, Ausubel és munkatársai leírása szerint (íd. mű} .

A portok-gének szabályozó területei, például a promoterok, genom-alklónokban azonosíthatók funkcíó-analízissel, amit rendszerint a riportergén expressziéjának a portok-szövetekben való megfigyelhetősége illetve a portoktól eltérő szövetekben megfigyelhető hiánya vagy csökkent megjelenése erősít meg. Annak lehetőségét, hogy a szabályozó területek a transzláció kezdő helyétől „felfelé, azaz 5'-irányban helyezkednek el, úgy vizsgáljuk, hogy egy, a területet magában foglaló DNS·-fragmentumot expressz iós vektorokba alkiónoznnk átmeneti expressziős kísérletek céljára. Várható, hogy a kisebb szubgenom~fragmentumok fogják tartalmazni azokat a szakaszokat, amelyek elengedhetetlenek a himszövet-preferálő kifejeződéshez. így például a CaMVláS és 35S promoterok esszenciális területeit nagyobb genom-darabokból származó, viszonylag kis fragmentumokban azonosították (OS

E. 3 £ £ A C \ _{z s}> Ο·ά ? v u s? ; >

76.?í>2/BS:

f ragment umo kba n ., ·> ’*·· , . « » . »♦ > » í . ··*’ ί » -* τν* # *

A megfelelő expresszfős· vektor — amellyel a funkcionális kifejeződés vizsgálható — és az eljárás, — amellyel a vektor a gazdaszervezetbe juttatható — kiválasztása a gazdaszervezettől függ; az ilyen vektorok és eljárások jól ismertek a szakterületen. A vektorban, lévő területek magukban foglalják azokat a szakaszokat, amelyek szabályozzák a transzkripció megindulását és folyamatát az e-ukar.iótákban. Ezekhez a területekhez működőképes módon kapcsolódik egy riportergén, például az UídA, amely β—glukuronidázt (GUS) vagy iuciferázt kódol. A növényi expressziős vektorok és riportergének leírását -Grufoer és munkatársai (id. mű) kézikönyvében találhatjuk meg. A GUS expresszíós vektorok és génkeretek megvásárolhatók a Genentech-tól (Palo Alto, Ca.}, mig a luciferáz expresszíós vektorokat a Prómega Corp. (Madison, Ui.) árusítja. A Ti plazmidokat és más Agrobacterű um-vektorokat

Ishida és munkatársai (id. közi.) írták le, illetve az US 5,591,616 .számú szabadalmi, iratban, szerepelnek.

Az expresszíós vektorok, amelyek a feltételezett szabályozó területekét tartalmazzák a géhom-fragmentumokban, bejuttathatok, ép szövetekbe, például kifejlődött portokokba, illetve embriókba vagy kalluszokba. A DNS bejuttatása történhet mikroszemcsés bombázással, injektálással, eiektroporácíőval vagy Agrab&cterlw®közvetltésü génátviteliéi (Gruber et ai., id. mű; Ishida et al., id, közi,; US 5,591,616). A növényi szövetek tenyésztésének általános módszereit is a fentiekben találjuk meg.

.Az átmeneti kifejeződés vizsgálatához kifejlődött, izolált portokokat helyezünk címer-tenyésztő tápközegre [Pareddy és Petelinó, Crop Sci. c. 29, 1564-1566 (1989)], amit 0,5 % Phytagel7S.702/3K

lel (Szama, St. Looís) vagy más szilárdító adalékkal szilárdítunk meg. Az expressziős vektor DN'S-ét 5 órán belül juttatjuk be mikroszesicsés bombázással (1,2 pm átmérőjű szemcsék, 6880-7568 kPa nyomás) . A IMS bejuttatása után a portokokat 26 °C-on in kubaijuk ugyanazon a tápközegen, 17 órán át, majd teljesszövet~ho~ mogenizátumot készítünk belőlük, aminek megmérjük a GüS- vagy uc i £e r á z - a kt í vi/fc á s á t.

Az SSMuzöö valószínűsíthető transzlációs startkodon j ától félteié 1088 bp DNS van jelen az SBMu2ÖG— 3 «1 genom-klónbanEgy kialakított hool restrikciós hely segítségével az utóbbit a luciferázt és β-glukuronidázt kódoló riportergénekhez kapcsoljuk megvizsgálandó, hogy van-e ennek a DbS-fragmentómnak promoteraktivitása a növényi szövetben. Az aktivitást kimutattak a portokokban, de nem a szíklevelekfoen, gyökerekben és kalluszokban, ami portok-preferáló vagy -specifikus promoter-aktivitást jelez.

Egy valószínű TATA-boxot figyeltünk meg körülbelül 83-77' bázispárral felfelé a transzlációs startkodontól. így tehát az SBMu2C?0-3„ 1 genom-klón körülbelül 1005 bázispárt foglal magában, a lehetséges TATA-boxtől felfelé. A tipikus növényi génekben a transzkripció kezdőheíye 26-36 bázispárral a TATA-box alatt van, ami az SBMu2GÖ mKNS-hez egy körülbelül 48-58 bp hosszúságú, nem lefordítható, S'-vezető szakaszt ad. A teljes, 1088 bp hosszúságú SBMuZÖÖ szubgenom-fragmentum — amely magában foglalja a nem lefordítható vezető szakaszt, a transzkripció kezdőhelyét, a TATA-fooxot és a TATA-boxtől felfelé eső szekvenciákat — elégségesnek bizonyult a promoter-aktlvitáshoz (8. ábra, 5. számú szekvenciavázlat), Az ábrán a vélelmezett TATA-boxot (TATATCA) aláhű7S.7C2/SS * » »'♦’ /*>

, „ Ζ * » t, '«k sással jelöljük. így tehát találmányunkhoz tartozik egy, az 5. számú szekvenciáváziatban megadott (vagy azzal azonos) szekvenciajö UhS-moiekuIa, aminek hámszövet-preferáló szabályozó funkciója van.

A szabályozó terület mindkét, 5^f~ és 3'-végén delécíós analízist végzünk: a fragmentumokat helyre irányított vagy PCR-mutagenezissel és hasonlókkal nyerjük. A hámszövet-preferáló szabályozó terület 3'-vége meghatározható a TATA-box közelségéből vagy szükség esetén 3-kivágásokkal. Ezután, az esszenciális terület működőképes módon egy tetszőleges promoter-maghcz kapcsolható, Ha az esszenciális területet egyszer azonosítottuk, akkor egy idegen gén kifejeződését már vezérelhet juk az SBMu200 himszövet-preferáló területével és egy promoter-maggal. A promotermag bármely ismert promoter-mag lehet, mint amilyen a karfiol mozaik vírus 35S vagy 19S promotera (US 5,352,605}, az ubikvitin promoter-mag (US 5,510,474), az IN-2 promoter-mag vagy a görvélyfa mozaik vírus promotera (Gruber et al., id, mű). A promoter előnyösen egy hímszövet-preferálő gén promoter-mag ja vagy a CaMV35S promoter-mag. Előnyösebbe:: a promoter egy hímszövet-pref erálő gén promotera, még előnyösebben az SBMuzOO promoter-mag.

A további — például iinker-szkenning-gel, egy jól ismert módszerrel végzett ..... mutációs analízissel kisebb szakaszok azonosíthatók, amelyek a portok-preferslő kifejeződéshez szükséges szekvenciákat tartalmazzák. Ezek a mutációk a működést módosíthatják, például a kifejeződés szintjét, időzitettségéc vagy a szövetet, ahol történik. A mutációk azonban némák is lehetnek, amelyeknek nincs megfigyelhető hatása.

A fenti eljárásokat használjuk az SBMuiöO promoter esszenci7Ö-.7Ö2/BS ális területeinek azonosítására, Miután a promotert a iuciferáz markér génhez kapcsoltuk, deléciós analízist végzünk a p romot érnék a TATA-boxtól felfelé eső szakaszán (9. ábra). Az oszlopdiagram ^-tengelyén a TATA-boxtől közvetlenül felfelé elhelyezkedő, megtartott bázispárok száma látható az 3·'-végnél kezdett, sorozatos levágások után. Az y~tengelyen a normalízáit luciferáz-aktivitas van megadva a teljes hosszúságú promoter aktivitásának százalékában.

Az ábrából nyilvánvaló, hogy a TATA-boxtől felfelé eső, körülbelül 176 bp hosszúságú szakasz — ha a promoter-maghoz kapcsoltuk — és az 5^f nem lefordítható vezető szakasz elégséges volt az átmeneti kifejeződéshez a portokban. Ezzel szemben a lucíferáz-aktivítás minimális volt, ha a kivágást az 5' -végtől a 91. házaspárig hajtottuk végre. Ezt a 176 bázispárt a TATA-box fölött a nem lefordítható szakasszal együtt tekinthetjük a minimális promoternak, ami a lö. ábrán látható (a TATA-boxofc aláhúzás jelöli). A teljes hosszúságú promoterból kivágva a TATA-boxtől számított -176. és -92, bázispárok közötti szakaszt, az aktivitás a vad típusú promoter aktivitásának körülbelül 1 %-ára csökken. Ha a -39, - -8» szakaszt vágjuk ki, az aktivitás nem csökken nagy mértékben. így tehát a -176. — -44. bázispárok közötti szakasz egy esszenciális területet tartalmaz és egy felfelé eső fokozó elemet képez, ami portok-specifIkus kifejeződést biztosit a promoternak és ezért „portok-box^-nak neveztük el.

A portok-boxon belül, 9-10 bp-os lépésekben, linker-szkenníng analízist végzünk. A szubsztitúciók helyét a 10. ábrán, a mutánsok kifejeződését a vad típusú szekvenciához képest a 11, ?e.7Ö2/&S ábrán mutatjuk be. A portokban zajló átmeneti kifejeződésre gyakorolt, legdrasztikusabb hatást az LS12 és LSI 3 mutánsok esetében figyeltük meg (a TATA-fooxtől felfelé eső 52. és 71. bázispárok közötti szakasz). Nagyobb hatást figyeltünk meg az LS06, LSQ7, LSÖ8 és LS10 mutánsok esetében (82. és 131. .bázispárok között} ». így tehát a portokban végbemenő- átmeneti kifejeződés vad típusú intenzitásához a portok-boxon. belüli -52. — -131, területre, különösen a -52. — -71. szakaszra van szükség.

A cirok (címer RT-J?CR> és a kukorica sonlitása

Amint írtuk, az SBMu200 egy hímfertilitás-gén, amelynek mutatása him-sterí ütést eredményez. A cirokban azonosítottuk az SSMu.280 egy homológját. A cirok-SBMu2ÖO cDNS-t izoláltuk a kukorica SBMu2'ŐÖ gén primer jelnek alkalmazásával egy polimeráz láncreakcióban, ahol a cirokéímer cDNS-et használtuk terápiát ként. Az így kapott oDNS-fragmentumot a fent leírt módon szekvenáltuk, majd összehasonlítottuk a kukorica SBMu200· cDNS-ével. A nukleotid-szekvanciák 90 %-os azonosságot mutatnak (10, ábra),

A fentiekből nyilvánvaló, hogy az SBMu2C-0 gén nélkülözhetetlen a növények hímfertilitásához.

Látható tehát, hogy találmányunk végül minden célját elérte.

•?S,7ö2/BE :Iatok kői <1.10> Pioneer Hí-Bred International, Inc.

<12:0 Himfertilitást közvetítő nukieotiá-szekvenciák és alkalmazásuk <210> 1 <2ll> 1906 <212> DNS

<213> <•7 x-z -	2ea mays (kukor Koooio saskveno ί. j. . . ib3o) , xoaz	Ica) .X 176?)
<210>	2
<211 >	588
<212>	BRT (protein)
<213>	2 e a ma y s (k.u ko r	Ica)
<2.10 >	3
<2il>	ο
< z i2	DNS
<213>	oorgnam s.p. len	rok)
<22I>	módosított házi
<222>	(1)..(494)
<223>	n lehet a, t,	c, g.
<210>	Λ íi
< z' 1 i >	158
<2i2>	BRT (protein)
<213>	Sorghum so< (ci	rok)

óiS <22 !> MOD_RS.S (egy aminosav-maradék poszt transzlációs· .módosulása) <222> (1),.(158) <223> Xaa lehet bármely, másik vagy ismeretien aminosav-maradék

0. 702 / <211:> 1092

Ρ.·.ό> Zea maya pruKorrca;

12> DNS <213> Ze.a mavs (kukorica):

-7s6,?02/Bg/MZ ♦ φφ ΦΦΦΧ φ ΦΦ»·* ** » φ > φ * « » « X *«* Φ * * * * ♦ X φ ί Φ χφ* Φ> φφλ φ* χ »>»:

ftöiToUíA

SEQUENCE LISTISG:

<11 Ö> Plöaser Hi-Bred TnternaLIghaT, Inc,

<120>	NUCLEÖTIDE SEQUENGES M METHOD OF US ING SAME	EDI ATT	NG MALE FÉRT ILITV AND
<130>	1148-PGT
< 14ö> <141>	09/678,153 2000-09-26
< 160 >	7
< 170>	PatentIn Ver. 2.1
<210> <211> <212>	1 1906 DNA

<213> Zea mays <220>

<221> COS <222> {:1..1638, 1642:..1767:) <400> 1 gaa ttc ggc acg agg gaa get cac ctc acg ccg gcg acg cca teg cca 48

Glu Phe Gly Thr Arg Glu Alá His Len Thr Pro Alá Thr Pro Ser Pro

5 10 15 tte t'te cca. cta gea agg cet cac aag tac atc gcg ctc ett ctg gtt 96

Phe: Phe Pro Leu Alá Gly Pro His Lys Tyr Ile Alá Leu Leu Leu Val

25 30 gtc ctc tea tgg atc ctg gtc cag agg tgg age ctg agg aag cag aaa 144

Val lett Ser Trp Ile lett Val Gin Arg Trp Ser Leu Arg Lys Gin. Lys:

40 45 ggc ccg aga tea tgg cca gtc atc ggc gea acg gtg aag cag ctg agg 192

Gly Pro Arg Ser Trp Pro Val Ile Gly Alá Thr Val Glu Gin Leu Arg

55 60 aac tac cac egg atg cac gac tgg ett gtc ggg tac ctg tea egg cac 240

Asn Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val Gly Tyr Leu Ser Arg His ' 78 ' ' 75 88 agg aca gtg acc gtc gac atg ccg ttc act tcc. tac acc tac atc get 288

Arg Thr: Vai Thr Val Asp Met Pro: Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Alá

98 95:

gac ccg gtg aat gtc gag cat gtc ctc aag act aac ttc acc aat tac 336

Asp Pro Val Asn Val Gin His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr

100 105 110 ccc aag gga atc gtg tac aga tcc tac atg gac gtg ctc ctc ggt gac. 384

Pro Lys Gly Ile Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Léu Gly Asp

115 120 125 ggc atc ttc aac gcc gac ggc gag ctg tgg agg aag cag agg aag acg 432

Gly Ile Phe Asn Alá Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gin Ara Lys Thr

0^: 135 * ' 140 gcg agt ttc gag ttc gcc tcc aag aac ctg agg gat ttc aac gcc att 480

Alá Ser Phe Glu Phe Alá Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Sér Alá Ile

1:45 150 155 < 168

gtg Val

tte Phe

aga Arg

gag Glu

tac Tyr; 165

tcc Ser

ctg leu

aag lys

ctg leu

heg Ser 170

ggt· Gly

© t ?! He

ctg leu

agc Ser

cag Gin 175

gea Alá

528

tcc

aag

gea'

ggc

aaa

gtt

gtg

gac

atg

cag

Cj:íia..

ett

tac

atg

agg

atg

576

Sec

lys

Alá

Gly 180

lys

Val

Val

Asp

Met 165

Gin

Glu

leu

Tyr

Met 190

Arg

Met

acg

ctg

gac

tcc

atc

tgc

aag

gtt;

ggg·

ttc

ggg

gtc

gag

atc

ggc

acg

624

Thr

let;

Asp 195

Ser

lle

Cys

Ivs

Val 200;

Gly

Phe;

Gly

Val

Glu 2:05

lle;

Gly

Thr

ctg

lég:

cea

gat

ctc

eee

gag

aac

agc

tíC

gcg

cag

gcg

ttc

gat

gce

672

leu

Ser 210

Pro

Asp

leu

Pro

Glu 215

Asn

Ser

Phe

Alá

Gin 220

Alá

Phe

Asp

Alá

gcc

aac

atc

atc

atc

acg

ctg

egg

ttc

atc

gac

ccg

ctg

tgg

ege

atc

720

Alá 225

Asn

lle

lle

11©

Thr 230

leu

Arg

Phe

lle

Asp 235

Pro

Leu

Trp

Arg

lle 2;4;í}

aag

agg

ttc

ttc

cac

gtc

ggg

tea

gag

gcc

ctc

cta

gcg

cag

agc

atc

768

Lys

Arg

Phe

lle.

HlS- 245:

Val

Gly

Ser

Glu

Kla 250

leu

leu

Alá

Gin

Ser 255

lle

aag

ctc

gtg

gac

gag

ttc

acc

tac

agc

gtg

atc

ege

egg

agg

aag

gcc

816

Lys

Leu

Val

Asp 260

Glu

Ph©

Thr

lyr

Ser 265

Val

lle

Arg

Arg

Arg 270

Lys

Alá

gag

atc

gtc

gag

gtc

egg

gce

agc

ggc

aaa

cag

gag

aag

atg

aag

cac

864

Gly

lle

Val 275

Glu

Val

Arg

Alá

Ser 280

Gly

lys:

Gin

GlU

lys 285

Met

lys:

HÍS

gac

ate

ctg

tea

egg

tte

atc

gag

ctg

ggc

gag

gcc

ggc

gac

gac

ggc

912;

Asp

11© 2áO:

leu

Ser

Arg

Phe;

11© 215

Glu-

leu

Gly

Glu

Alá 300

Gly

Asp

Asp

Gly

ggc

ggc

ttc

ggg

gac

gat

aag

5.CJC

©te

egg

gac

gtg

gtg

ctc

aac

ttc

960

Gly 305

Gly

Phe>

Gly

Asp

Asp 310

lys

Ser

leu.

Arg

Asp 315

Val

Val

leu

Asn

Phe 32 0:

gtg

ate

gcc

ggg

egg

gac

acg

acg

gcg

acg

acg

ctg

teg

tgg

ttc

acg

1008

Val

lle

Alá

Gly

Arg 325

Asp

Ilit

Thr

Ála

Thr 330

Thr

leü

Ser

Trp

Phe 335

Thr

cac

atg

gcc

atg

tcc

cac

ccg

gac

gtg

gcc

gag

aag

ctg

ege

ege

gag

1056

HiS

Met

Alá.

Met 340

Ser

His

Pro

Asp

Val 345

Alá

Glu-

lys

leu

Arg 350;

Arg

Glu

ctg

tgc

gcg

tte

gag

gcg

gag

ege

gcg

ege

gag

gag

ggc

gtc

acg

ctc

110;4

leu

Cys

Alá 355

Phe

Glu

Alá

Glu

Arg 36ö

Alá

Arg

Glu

Glu

Gly 365

Val

Thr

leu

gtg

cte:

tgc

ggc

ggc

get

gac

gcc

gac

gac

aag

gcg

tte

gcc

gcc

ege

1152

Val

leu 370

cys

Giy

Gly

Alá

Asp 375

Alá

Asp

Asp

Lys

Alá 380

Phe

Alá

Alá

Arg

gtg

gcg

cag

tte

gcg

ggc

ctc

ctc

acc

tac

gac

agc

ctc

ggc

aag

Ctg

1:200

Vaí 385

Alá

Gin

Phe

Alá

Gly 390

leu

leu

Thr

lyr

Asp 395

Ser

leu

Gly

lys

Leu 4«

gtc

tae.

ctc

cae

ggc

tgc

gtc

acc

gag

acg

ctc

cgc:

ctg:

tac

ec©

gcc

1246

Val

Tyr:

leu

His

Alá 405

Cys

Val

Thr

Glu

Thr 410·

leu

Arg

Leu

lyr

Pro 415

Alá

gtc Val.

cet Pro

cag Gin

gac Asp 42Θ

ecc Pro

aag Lys

ggg Gly

atc lle

ctg gag gac

gac Asp

gtg Val

ctg Leu 430

ccg Pro

gac Asp

1296

Leu 425

Glu

Asp

ggg

acg

aag

gtg

agg

gcc

gge

ggg

atg

gtg

acg

tac

gtg

ccc

tac

tcg

1344

Gly

Thr

Lys

Val

Arg

Alá

Gly

Gly

Met

Val

Thr

Tyr

Val

Pro

Tyr

Ser

435

440

445

atg

ggg

cgg

atg

gag

tac

aac

tgg

gge

ccc

gac

gcg

gcg

agc

tte

cgg

1392

Met

Gly

Arg

Met

Glu

Tyr

Asn

Trp

Giy

Pro

Asp

Alá

Alá

Ser

Phe

Arg

450

455

460

üCCf

gag

cgg

tgg

atc

aac

gag

gat

gge

gcg

tte

ege

aac

gcg

tcg

ccg

1440

Pro

Gin

Arg

Trp

lle

Asn

Glu

Asp

Gly

Alá

Phe

Arg

Asn

A'lá

Ser

Pro

465

47Ό

475

488

tte

aag

tte

acg

gcg

tte

cag

gcg

ggg

ccg

agg

atc

tgc

ctg

gge

aag

1488

Eke

Lys

Phe

Thr

Alá

Phe

Gin

Alá-

Gly

.Pro

Arg

lle

Cys

Lee

Gly

Lys

485

490

495

gac

tcg

gcg

tac

ctg

cag

atg

aag

atg

gcg

ctg

gcc

atc

ctc

ctc

ogc

153 6

Asp

Ser

Alá

Tyr

Leu

Gin

Met

Lys

Met

Alá

Leu

Alá

lle

Leni

Phe

Arg

500

.585

510

tte

tac

agc

tte

cgg

ctg

ctg

gag

ggg

cac

ccg

gtg

cag

tac

ege

atg

1584

Eke

Tyr

Ser

Phe

Arg

Leu

Leu

Glu

Gly

Hig

Pro

Val

Gin

Tyr

Arg

Met

51.5

520

525

atg

agg'

atc

ctc

tcc

atg

gcg

cac

gge

ctc

aag

gtc

ege

gtc

cet

agg

1632

Met

The

lle

Leu

Ser

Met

Alá

His

Gly

Leu

Lys

Val

Arg

Val

Ser

Arg

530

535

540

gcc

gtc

tga

tgt

cat

gge

gat

ttg

gat

atg

gat

atc

gtc

ccg

ett

aat

1680

Alá

Val

Cys

His

Gly

Asp

Len

Asp

Met

Asp

Lle

Val

Pro

L:eu

Asn

545

550

555

cca

cga

caa

ata

acg

ctc

gtg

tta

caa

att

tgc

atg

cat

gca

tgt

aag

1728

Pro

Arg

Gin

'Lle

Thr

Leu

Val

Len

Gin

I le

Gys

Met

His

Alá

Gys

Lys:

560

565

570

578

gga

aag

cga

tgg

gtt

t ca

ttg

gtg

ggt

tgg

ett

aag

cet

taaaaactcc

1777

Giy

Lys

Arg

Trp

Val

Ser

Leu'

Val

Alá

Tip

Leü

Lys

Pro

580

585

gtcgggtctt gcgaaceacc acatcactag tgttttgtae tctactcctc agtggaagtg 1837 tagtgacagc atacaagttc atcatatata ttatcctctt tcttaaaaaa aaaaaaaaaa 1897 aaaetegag 1906 <210> 2 <211> 588 <212> PRT <213< Zea maya <400> 2

Glu . 1

Phe

Giy

Thr

Arg 5

Gin. Alá

His·

Leu

Thr 18'

Pro

Alá

Thr

Pro Ser Pro 15

Phe

Phe

Pro

Leu

Alá

Gly Pro

His

Lys

Tyr

lle

/A. 3. η

Len

Leu Leu Val

20

25

30'

Val

Len

Ser

Trp

lle

Leu Val

Gin

Arg

Trp

Ser

Len

Arg

Lys Gin Lys

40 45_:

Gly

Pro 5:0:

Arg

Ser

Trp::

ΡΉ

Val SS

He

Gly

Alá:

Thr

Val: 60

Glu

Gin

leu

Arg

Asn 65

Tyr

fi is

Arg

'Met

His 70

Asp

Trp

leu

Val

Gly: < 75:

Tyr

leu

Ser

Arg

His AQ

Arg

Thr

Val

Thr

Val 85

Asp

Mét

Pro

Phe

Thr 90

Ser

Tyr

Thr

Tyr

He 95

Aia

Asp

Pro:

Val

Asn 10©

Val

Glu.

His

Val

leu 105

Lys

Thr

Asn

Phe

Thr 110

Asn

Tyr

Pro

Lys:

Gly 115

Ile

Val

Tyr

Arg

Ser 120

Tyr

Met

Asp

Val.

Leu 125

Leu

Gly

Asp

Gly

tle: 130

Phe

Asn

Alá

Asp:

Giy 135

Glu

leu

Trp

Arg

Lys 140

Gin

Arg

Lys

Thr

Aia 14:5

Ser

Phe

Giu

Phe

Alá 15Θ

Ser

Lys

Asn

Leu

Arg 155

A.sp

Phe

Ser

Alá

Ue 100:

Val

Phe

Arg

Giu:

Tyr 105:

Ser

leu

iys

Leu

Ser 170

Giy

Ile

leu

Ser

Gin 17:5

Alá

Ser

ly:s<

Alá

Gly ISO:

Lys·

Val

Val

AS'p:

Klet 18:5

Gin

Giu

Len

Tyr

Met 190

Arg

Met:

Thr

Leu

Asp :1:9:5:

Ser

Ha

Cys

Lys

Val 200

Gly

Phe:

Gly

Val

Glu 205

He

Gly

Thr

Leu

Ser 210'

Pro

Asp

leu

Pro:

Giu 215

Asn

Ser

Phe

Alá

Gin: 22:0

Aia

Phe

Asp

Alá

Alá 225

Asn

Iie

Iie:

He

Thr 228

leu.

Arg

Phe

Il:e

Asp 235

Pro:

leu

Trp

Arg

ίίθ 240

lys

Arg

Phe

Phe

His· 245

Val

Gly

Ser

Glü

Alá 250

Leu

Lén:

Alá

Gin

Ser 2:55:

He

Lys:

leu

Val

Asp 2:60:

Giu

Phe

Thr

Tyr

Ser 265

Val

He

Arg·.

Arg

Arg 270

Lys

AH:

GM

He

Val 2 75

Giu

Val

Arg

•Aia

Ser 280

Gly

lys

Gin

Glu

Ly s 2:0:5

Méh

lys

His

Asp

Ile 290

Leu

Ser

Arg

Phe

Ile 295

Glu

leu

Gly

GlU:

Aia 300:

Giy

Asp

Asp

Gly

Gly 3:05

Gly

Phe:

Gly

Asp

Asp 310:

Lys

Ser

leu

Arg

Asp 315

Val

Val

len

Asn

Phe: 320

Val

Ile

Alá

Gly

Arg 32:5

Asp

Thr

Thr

Alá

Thr 330

Thr

Leu

Ser

Trp

Phe 33:5:

Thr

His

Met

Alá

Met 3:4:0:

Ser

HLs

Pro

Asp

Val 345

Aia

Gin

Lys:

Leu

Arg 350

Arg

Glu

Leu

Cys

Alá :3:5:5:

Phö:

Glu

Alá:

GiÜ:

Arg 3:60:

Alá

Arg

Glu

Gin

Gly 365

Val

Thr

len

Val

len 370

Cys

Gly

Gly

Alá

Asp: 375

Aia.

Asp

.Asp:

Lys:

Aia: 380

Phe

Aia

Alá

Arg

Val

Aia

Gin

Phe::

Alá:

Gly

Leu

Leu

Thr

Tyr

Asp

Ser

Leu

Gly

Lys

Leu

385:

300

3:05:

400

Val

Tyr

ÁeU:

His

Ála

Cys

Val

Thr

Glu

Thr

Len

Arg

Leu

Tyr

PrO:

Alá

405

410

415:

Val

Pro

Glh

Asp

Pro

Lys

Gly

He

Leu

Glu

Ásp

Ásp

Val

Leu

PtÖ:

Asp

420

425

430

Gly

Thr

Lys

val

Arg

Alá

Sly

Gly

Met

Vai

Thr

Tyr

Val

Pro

Tyr

Ser

435

44:0

445

Méh

Gly

Arg

Met

Giu

Tyr

Asn

Trp

Sly

Pro

Ásp

Ála

Ála

Ser

Pha-

Arg

45Θ

455

40Θ

Pro:

Gla

Arg

Trp

Ile

Asn

Gin

Asp

siy

:Á:la

Phe

Arg

Asn

Alá

ser

Pro

4 65

470

475

480

Phe:

Ey:S::

Bhg:

Thr

Alá

Phe

Gin

Ai-a

Gly

Pro

Arg

Hfi:

Cys

Leu

Gly

Lys:

485

490

405

Asp-

Ser

Ála

Tyr

Len

Gin

Met

Lys

Met

Alá

Leu

Alá

He

Leu

Phe

Atg·

5:00

505:

510

Phe

Tyr

Ser

Phe

Arg

Leu

Leu

Glu

Gly1

His

Pro

Val

Gin

Tyr

Arg

Met

515:

520

525

Met

Thr

Us

Leu

Ser

Met

Ál a

His

Gly

Tea

L-y-s-

val

Arg

Val

Ser

Arg

53Ö

535

540:

Ál a

Val

Cys

His

Gly

Asp

Leu

Asp

Met

Asp

He

Val

Pro

Leu

Asn

Pro:

545

550

555

560

Árg

Gin

He

Thr

Leu

Vai

:Lea

Gin

He

Cys

Met:

Mis

A : U

Gys:

Lys

Gly:

565

570

5:V5:

Lys

Arg

Trp

Val

Ser

Leu.

Val

.Alá

Trp

Leu

Lys

Pro

580

585

<21®> 3 <211> 494 <212> DNA <213> Sorghum sp.

<22 0>

<221> modified_base <222> (1)..(4-94) <223> η bases may be a, t, c, g, other or unknown <40O> 3

ggaattegge	ttatgccgtt	cacttcctac	a-cetacatcg	ctgacccggt	gaatgtcgag	60
catgtechea	agáctá-aeht·	eaco aa ttac	cccaaggggg	acgtgtacag	ahcetaeatg	12:0
gatgtgctcc	tcggtgacgg	eatattcaac	gctgacggcg	agctgtggag	gaagcagagg	180
aagacggcga	gtttcgagtt	cgcctccaag	aacctgaggg	atttcagtgc	caatgttttc	240
agagagtact	ccctgáagct	gtcgggcata	ctgagtcagg	catccaaggc	aggcaáagtt	300:
gttgacatgc·	aggaacttta	catgaggatg	acaetggact	cgatctgcaa	ngttgggttc	30(0-
gggctcua.ua	tcggcacgct	gtcnccggat	ctccccgagá	acagcttcnc	ccaagogfcte	420:
gatgccgcta	acatcatcgt	Eacnctgegg	ttcatccacc	cnctgtggcg	catccagaag	480:
ttctfecccn	gtea:					494

<210> <2H> <212> <213>

4 158 PRT Sorghüt

ti :S:p

£ <220>

<221:> MGD_:RE:S <222> (1)..(153)

<223> Xaa	ittsy	be anv,	other or unfenown amino	add
<4Q0> 4-
Met: Pro Éhe	Thr	Ser Tyr	Thr Tyr ile· Alá Asp Erő	Val Asn Val Glu
1		5	IÖ	15:
His Vai Lsu	Lys	Thr Ágh	Éhe Thr Asn- Tvr Pro Lys·	Gly Asp Val Tyr
	2:0		25	30
Arg Ser Tyr	Kel	Asp Val	Leu Leu Gly Asp Giy Ile	Phe Asn Alá Asp
35			45	45
Gly Glu Leu	Trp	Arg Lys	Gin Arg Lys Thr Aia Sér	Phe Glu Phe Alá
50			55 69
Ser Lys Asn	Leu	Arg Asp	Éhe Ser Aia Asn Vai Phe	Arg Glu Tyr Ser
63		70	75	80:
Leu L:ys: Len	Ser	Gly Ile	Leu Ser Gin Aia. Ser Lys	Aia Gly Lys Val
		85	95	95
Val Asj> Miét	Gin	Glu Len	Tyr Met Arg Met Thr· Leu	Asp Ser ile Cys
	100		105:	110
Xaa Val Gly	Phe	Gly Val	Xaa Tie Giy Thr: Leu: Ser	Pro Asp Leu Pro
115			120	125
Glu Asn Ser	Phe	Xaa Gin	Aia Phe Asp: Aia Aia Asn	Ile: He Val Thr
130			135 140:
Leu Arg Ebe	Ile	His: Ere	Leu Trp' Arg Ile Gin: Lys	Phe: Phe
145·		159	155:

<21ö> 5 <211> 1092 <2:1:2> DMA <213> Zea mays <4Q:O> 5) gaattccaag cgaggccctt gtagcagaga gtgttgctga tgcagtcggc ggaaatgagt 60 gegtgctgág agcaácgctg aggggttcca gggatggcaa tggctatggc aatcggctag 120 aggtggagga caaggtggtg aggattggga gggcaaccta tggcaagttg gtgaagaggc 180 acgcaatgag agatctattc agacttacac tggatgccgc caacaaattc aacctttaga 240 ttttgatact gtcactccta cfcttatfcccfc tggt.tgggca acttccaata ggcteatgtt 300 aatcaatgat tagtgattat teagcaaata ttcttgtttg tttgacattt ataatatgtg 360 gggtgagacg gattaaatat catccatgag agctttatct tcatgctctc ttgattttgg 420 fctteagafcea t:fcc:ttt:ca:gfc gfetcacaaga afetttcteag t.ttggtcsat gtaatttttg: 48:0 aagtgaqgtt ccttaaattt cattatgett cctttettt-t ctagactagc aactgcatga 540 cttttcacfct tgggttcaca aattgactca caagaaaaca aattcacttt tgggttcaca 600 aattcctctt eaggatgtac ttttcacttg aactgtcatg tataggaaca aggaatggct 660 cagtttttaa ggaacaatgt acagatttca tttcagaact ctttctggtt ggttgagttt 720 cagacttttt gtaccaagct gatggatcac aatacttgtt tccaaagtct gataacagaa 780 actggcaact cctaattgat aataaaaaga ataaaataca gtatcagata tctcattttc 840 ttggttggca gatcacaaaa aggaacacaa aggcfcaagcc cectacttgt tcgggagtta 900 ggtcagggac accatatgaa tgaaagaaat cttaatttgg ggtcacaeca agattgtcte 960 tctcgaggtt ggggggtccc taaggttggt agtagcaata cccaatatat cacctaacaa 1020 acccaatcca tgctacatac afeacatagca tcc.atcactt gtagactgga cccttcatca 1080 agagcaceat gg 1092 <210> 6 <211> 267 <2i_> DNA <213> Zea rnays <4SS;> 6 ceccatctca ttttcttggt tggcagatea caaaaaggaa cacaaaggct aagcctccta 60^: ettgttcggg agttaggtca gggacaeeat atgaafegaaa gáaatcttaa tttggggtca 120 caccaagatt gtctctctcg aggttggggg gtccctaagg ttggtagtág caatacccaa 180 tata.tca.cct aacaaaccca atccatgcta catacataca tagcatccat cacttgtaga 240 efeggáccctt' eatcaágagc· accatgg 2&l <21Ö> 7 <211> 3897 <212> DNA <213> Zea .maya <40 ö> 7 gaatt.ccaag cgaggccctt gtagcagaga gtgttgctga tgcagtcggc ggaaatgagt 60 gcgtgctgag agcaacgctg aggggttcca gggatggcaa tggetatggc aatcggctag 120 aggtggagga caaggtggtg aggattggga gggcaaccta tggcaagttg gtgaagaggc 180^: acgcaatgag agatc-tattc agacttacac tggatgecgc caacaaattc aacetttaga 240

c.tttgatact gtcactccta ctttattcct tggttgggca acttccaata ggctcatgtt 30Ό aatcaatgat tagtgattat tcagcaaata ttcttgtttg tttgacattt ataatatgtg 360 gggtgagacg gattaaatat catccatgag agctttatct tcatgctcte ttgattttgg 420

t.ttcagatca tcctttcagt gttcacaaga attttctcag tttggtccat gtaatttttg 480 aagtgaggtt cettaaattt cattatgctt cctttctttt ctagactagc aactgcatga 540 cttttc-actt· tgggttcaca aattgactea c.aagaa.aaoa aattcacttt tgggttcaca_: 600 aatfccctott caggatgtac fctttcacttg aactgtcatg tataggaaca aggaatggct 660 cagtttttaa'ggaacaatgt acagatfetca tetteagaaét cfettctggtt ggttgagttfc 720 cagacttttt gtaccaagct gatggatcac aatacttgtt tccaaagtct gataacagaa 780 actggcaact cetaattgat aataaaaaga ataaaataca gtatcagata tcfccattttc 840 ttggttggca gatcacaaaa aggaacacaa aggctaagcc tcctacttgt tcgggagtta 900 ggtcagggac accatatgaa tgaaagaaat etbaafcfctgg ggtcacacca agattgtctc 960 tctcgaggtt ggggggtccc feaaggttggt agfeagcaata cccaatatat cacetaacaa 1020 acccaatcca tgctacatac atacatagca tccatcactt gtagactgga .cccttcatea. 1080 agagcaccat ggaggaaget cacatcacgc cggcgacgcc atcgccattc ttcccactag 1140 cagggeetca caagtacatc gcgctcctcc tggttgtcct ctcatggatc ctggfcccaga 1200 ggtggagcct gaggaagcag aaaggcccga gatcatggcc agtcatcggt gcaacggtgg 1260 agcágctgag gaactaccac cggatgcacg acfcggcttgt cgg.gt.acctg tcacggcaca 1320 ggacagtgac cgtcgacatg ccgttcactt cctaeaccta catcgetgac ccggtgaatg 1380 tcgagoatgt cctcaagact aacttcacca attaccccaa ggtaaatgae ctgaactcac 144ű^: tgatgttcag tcttcggaaa teagagcfega aagctgaate gaatgtgcct gaacaccgtg 1500 tagggaatcg tgtacagate ctacatggác gtgctcctcg gtgacggeat cttcaacgcc 1560 gaeggegage tgtggaggaa gcagaggaag acggcgagtt tegagttege ctccaagaac 1620 ctgagggatt tcagcgccat tgtgttcaga gagtactccc tgaagctgtc gggtatactg 1680:

agccaggcat ccaaggcagg caaagttgtg gacatgcagg tgagateact gctccctt.gc 1740 cattgccaac atgagcattt caacctgaga caegagagct acOttgccga ttcaggaact 1800 fetaca.tgagg afegaegetgg actccacctg caaggttggg ttcggggfccg agatcggcac 1860 gctgtcgccg gatctccccg agaacagctt cgcgcaggcg ttcgatgccg ccaacatcat 1920 cgtcacgetg eggtteateg acccgctgtg gcgcatcaag aggttcttcc aegtegggte 1980 agaggccctc ctagcgcaga gcafceaagct cgtggacgag tteaeetaca gcgtgatccg 2040 ceggaggaag gccgagatcg tcgaggcccg ggccagcggc aaacaggaga aggtacgtgc 2100:

acsatgac.tgt teegattett eagttcafccg tettggeegg gatggacctg atcctgattg 2160 attatatatc cgtgtgactt gtgaggacaa attaaaatgg gcagatgaag cacgacatcc 2220 tgtcacggtt catcgageta ggcgaggccg: gcgacgacgg eggeggette ggggacgaca 2280:

agagcct'ccg ggacgtggtg ctcaacttcg tg.afccgccgg gegggaeacg aeggegaega 2340 cgctgtcgtg gttcacgcac atggccatgt cccacecgga egtggecgag aagetgcgcc 2400 gegagctgtg egegttegag gcggagcgcg egegegagga gggcgtcgcg ctcgtgccct 2460 geggeggege tgacgccgac gacaaggcgt tcgocgcccg cgtggcgcag ttcgcgggcc 2520^: tcctcaccta cgaeagcetc ggeaagctgg tctacctcca cgcctgcgtc aeegagaege 2580 tccgcctgta ccecgccgtc cctcaggfcga gcgcgcccga cacgcgacct ecggteeaga 2640 gcacagcatg cagtgagtgg acctgaatge aatgcacatg cacttgcgeg cgcgcaggac 2700 cccaagggga tcctggagga cgacgtgctg ccggacggga cgaaggtgag qgccggcggg 2760^: atggtgácgt acgtgeccta ctcgátgggg cggatggagt aeaactgggg ccccgacgcg 2820 gcgagcttcc ggccggagcg gtggatcaac ga gga tgg cg cgttccgeaa cgcg-tcgccg 2880 ttcáagttca cggegttcca: ggcggqgccg aggatctgcc tgggcaagga ctcggcgtac 2240 ctgcágatgá ágatggcgct ggccatcctc ttgcgcttct acagcttccg gctgctggag 3000 gggcacccgg tgcagtaccg cgtgatgacc atcctctcca tggcgcacgg cctcaaggtc 3060 cgcgtctcta gggccgtctg atgtca-tggc gatttgggat atcát-Cccgc ttaatcctta 3120 aaaatttgca tgcatgcatg taagggaaag cgatgggttt cattggtggc ttggcttaag 3180 cettaaaaac tccgtcgggt ettgegaacc accacatcac tagtgttttg tactctac.tc 3240 etcágtggaa gtgtagtgac agcatacaag ttcateatat atatfcatcet etttettege 3300 eggatgette ccgggacctt ttggagacca ttactgacag gegtgtgaaa aaaaggcttc 3360 ttctgcggcg aagttttggg tteagagtet tggcgtct.tt gcagcagaaa aaaggtttgg 3420 aaggatctga accctgaacc gaaaatggct teggaaatat gctcgcatcg gggcggggcc 3480 gtcactcggg atgacgacaa gcccacaagc agtgagagcg áagegatett tggagtttgg 3540 ágáeactctc ggaeceetcg gegetecgcg ageteatett cgcctcetet gtcgtgtccg 3600 tggcggcaee gcgcccgccc gcctcgtgtt cgaccaaatc ccgegccccg accggttegt 3660 gtacaacaec ctcatecgcg gegecgcgcg cagtgacacg cccegggaeg ccgtatacat 3720 ctataaatea tggtattgta etttatttte aaacggcctt aacácááceá tatttttatg 3780 gtaaacacgt tcaaaattga eacaaattta aaacaggcac aaaeegtagc taaacataag 3840 ágáátgagag aeaacccaaa ggttagagat gaaataagct gagtaaaega egaatte 3897

Claims (8)

1. Szabadatmi igénypontok ♦ * » » * * *

   A ««

   X * « ♦ * » *

   1. Növény, amelyben a hímfertilitást egy olyan. eis<T*

   X ♦ X X « » * * nukleotid-szekvencia kifejeződésének szabályozása, befolyásolja,. ;

   » « .amely az illető növényben hímfertilitást közvetít, és amely: :

   « ♦ ♦ ♦ β (a) egy, a 2. vagy 4. számú szekvenciával megadott aminosav*·;»,» -szekvenciát kódoló nakleotίά-szekvencia, vagy egy olyan szekvencia, amely a 2, vagy 4. számú szekvenciával megadott aminosav-szekvenciát kódoló nnkleotid-szekvenciávai erősen szigorú körülmények között hibridizál; vagy (bi egy, az I., 3. vagy 7. számú szekvenciával megadott nukieotid-szekvencía, vagy egy olyan szekvencia, amely az 1., 3. vagy 7. számú szekvenciával megadott nukleotid-szekvenciával erősen szigorú körülmények között hibridizál, vagy egy olyan szekvencia, amely az I., 3. vagy 7. számú szekvenciával legalább 70% szekvencia-azonosságot matat, ahol erősen szigorú körülmények 2XSSC-ben, 0,5 (töm../tf.) % SDS jelenlétében, 65^&C-on 30 percen át végzett és megismételt mosást jalanténak,
2. 2. Az 1, igénypont szerinti növény, amelyben az illető első szekvencia kifejeződése himsteriliást eredményezve el van nyomva.
3. 3. A 2. igénypont szerinti növény, amelyben az első nukleotid”szekvencia kifejeződése:

   (aj az. első nakleotid-szekvencla mutációjával; vagy (rd egy, az első nokieoti.d~szekvenc.ia kifejeződését elnyomó második nukleotid-szekvencia beiktatásával van elnyomva.
4. 4- A 3. igénypont szerinti növény, amelyben az illető második nukleotid-szekvencia az első nukleotid-szekvenciához ké— 'vrzmz/SK/muuvm Gr?

   pest antiszensz irányban orientált, ezáltal elnyomja annak kifei-;.:.

   * ,♦ jezödését.

   * «« « *

   S. Az. 1, igénypont szerinti nővény, amelyben egy 1. igény-*·ζ* « 6 « * ♦ X pontban meghatározott gént tartalmazó natív gén el van nemítva^ \ » ♦ Λ Λ egy 1. igénypontban meghatározott további szekvencia pedig egyb.

   * * ♦ indukálható promóterhoz van kapcsolva úgy, hogy a növény konstig. : tutivan hímsteril, és a fertilífeás a promoter redukálásával idézhető elő.

   €. Mag, amely egy, a következőket magában foglaló eljárással kapható·:

   •a) egy szelektált himfertilis szüiönövénytöl származó első mag és egy
5. 5. igénypont szerinti hímsteril anyai szülőnövénybö'l szelektált második mag keresztbeporzást elősegítő szomszédságban való elvetése;

   (b) a magok érett növényekké való felnevelése olyan körülmények között, amelyek nem indukálják az 5, igénypont szerinti további szekvencia kifejeződését;

   te) a hímsteril anyai növény keresztbeporzása a himfertilis növényből származó pollennel; és (d) a magok betakarítása a hímsteril anyai növényekből.

   '7. Himfertilis növény, amely az 5. igénypont szerinti hímsteril növénynek egy, a hámszövetnek az 1, igénypontban meghatározott szabályozott szekvencia által való tönkretételét megakadályozó terméket produkáló gént tartalmazó növénnyel való kereszt -megtermékenyítésével, az Illető hímsteril kapott mag leszáfásával és az illető magból himfertilis növény felnevelésével kapható.

   8. Hímsteril növény, amely egy S. igénypont szerinti himsteril növénynek egy 5. igénypont szerinti olyan második nö~

   A 0 0 00 Φ *

   XV · * Φ Φ Α 0 0 Φ Φ· * χ«« φ

   vénnyel való keresztezésével kapható, aminek során a második nöb.;,.

   * X vény az indukáld anyag hatásának van kitéve, vagyis hímfértiiisv»:

   ** V ♦ 0 és olyan magot terem, amely olyan harmadik növénnyé nő fel*,·*·*

   X * » * 0 Φ amely hímsteril.

   0 « 0 X

   9. Mag, amely a 8. igénypont szerinti harmadik növénynek.'.

   X 0 Φ egy negyedik, himfertilis növénnyel való keresztezésével és 5s.J himfertilis növénytől való magoknak a betakarításával kapható.

   ID. Mag, amely egy 8. igénypont szerinti, harmadik, hímsteril növénynek egy negyedik, a kívánt gén jellegzetességet szabályzó gént tartalmazó himfertilis növénnyel való keverésével kapható.

   lí< Eljárás egy 5. igénypont szerinti, kívülről szabályozható hirn.ster.il it ássál rendelkező növény szaporítására, azzal jellemezve, hogy:

   ía) az '5. igénypont szerinti növény magvait elvetve hímsteril növényeket nevelünk;

   (fel kiváltjuk a fejlődő növények himfertilis formába, való átalakulását olyan körülmények között, amelyek indukálják a promótert, hogy az 5. igénypont szerinti további szekvencia az 1, igénypontban meghatározottak szerint kifejeződjön;

   (c) az izolációban fejlődő növényeket megtermelés céljából szabadon beporozzuk; és tó) betakarítjuk a magvakat,

   12. Izolált hímszövet-preferáló szabályozó régió, amely: ta) az 5. számú szekvenoiaváziattal megadott nukleotid-szekvenciát;

   íö) egy, az 5. számú szekvenciával legalább 70% szekvencia-azonossággal rendelkező nukieotíd-szekvenoiát;

   u. ne ma/mu zen Gr?

   ♦ » «» « φ « (ej az
6. 6. számú szefcvenciaváziattal megadott nukleo-tid-szekí..:.

   * Φ véneiá; VJ « ♦«

   X s (dj sz 5. vagy S< számú nakieotid-szekveneia. sgy fragffientu**f

   Φ κ Φ « X « mát tartalmazó hámszövet specifikus szabályozó elemed; *..

   » · «Φ vaay » * < * « Φ x χ Φ (ej egy, a €« számú szekvenciával erősen szigorú körülményeik. :

   között hibridizáiő nnkleotid-szekveneiát — ahol erősen szigorú körülmények 2X SSC-ben, 0,5 (töm./fcf.^:)% SDS jelenlétében, 65^öC~on 30 percen át végzett és megismételt mosást jelentenek — tartalmaz.

   13, A 12. igénypont szerinti szabályozó régié, amely körülbelül 130 összefüggő bázispártéi álló nukleotid-szekyenciákat tartalmaz a 7. számú szekvencia TATA-boxától számított körülbelül -38. és magasabb helyzettől npstream, ahol a TATA-boxot a 7, számú szekvencia 100.5-tói 1012.-ig terjedő nukleotidjai alkotják.

   11. A 12.· igénypont szerinti szabályozó régió, amely; (aj a 7, számú szekvencia TATA borától npstream -44. hely- zettói -180 . helyzetig terjedő szekvenciát; (b) a 7. számú szekvencia TATA boxától npstream -92. hely- zettói -176 , helyzetig terjedő szekvenciát; tej a 7. számú szekvencia TATA boxától upstre-am -4 4. heiy- zettói -89. helyzetig terjedő szekvenciát; tdj a 7. számú szekvencia TATA boxától npstream -52, he.ly- zettói -131 . helyzetig terjedő szekvenciát; Get a 7. számú szekvencia TATA boxától npstream -52. hely- zettói -71, heiycetig terjedő szekvenciát; (zt a 7. számú szekvencia TATA boxától npstream -82. hely- rétiét -131 . helyzetig terjedő szekvenciát;

   70, 703/ 3Z/m>rip27 2 ··g

   Kit vagy egy, az ía) - {f) szekvenciák bármelyikével erősen szig-orjí.j.

   * « körülmények között hibridízáló nukleotid-szekvenciát tartaimaz\p:

   ΚΛ «.

   ♦ <· ahol erősen szigorú körülmények 2X SSC-ben, 0,5 (töm./fcf, ) % Sö'S*·*

   M ♦ β * * ♦ jelenlétében, 65 01---00 30 percért át végzett és megismételt mosási ‘ *

   * jelentenek. , »· '* * ♦

   S-4 ♦

   15. Expresszíós vektor, amely egy, a 12. igénypont (c), (db : vagy (e) része szerinti hiraszovetspeciíikus szabályozó elemmel működőképesen kapcsolt promótert tartalmaz.

   16. A 15. igénypont szerinti expresszíós vektor, amely még egy, a promőterhöz működőképesen kapcsolt exogén gént tartalmaz.

   17. A 16, igénypont szerinti expresszíós vektor, amelyben a promőter a CAMV35-S, S'GBG, MS45 vagy 5126 promőter.

   18. A 17, igénypont szerinti expresszíós vektor, amelyben az exogén gén terméke tönkreteszi a hímszövet működését.

   19. Növényi sejt, amely a 15.· igénypont szerinti vektort tartalmazza.

   20. Eljárás himfértiirtás közvetítésére egy növényben, azzal jellemezve, hogy a növénybe transzformációval bejuttatjuk a 16, igénypont szerinti expresszíós vektort, ahol a 16. igénypontban meghatározott exogén gén befolyásolja a növény himfertilátását, és a promóterral kapcsolatban levő szabályozó elem szabályozza az exogén gén kifejeződését.

   21. A 2-0, igénypont szerinti eljárás, amelyben az exogén gén tönkreteszi a növény hámszövetének működését azt okozva, hogy a növény hímsterillé válik,

   22. · A 21. igénypont szerinti eljárás, amelyben a promóterral kapcsolatban levő szabályozó elem indukálható.

   23. A 22. igénypont szerinti eljárás, amelyben a növény konstítutívan himsterrl, amikor a promőter és a szabályozó elem

   76.7 37 /KB V -U pí >_ÖK B nincsenek, indukálva, viszont himfertílis, araikor a promoter és g,:.

   * <· X szabályozó elem indukálva vannak, %♦»;

   '♦·♦ V x £

   24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez vér·* φ » Φ

   Φ * V hogy magában foglalja továbbá még a himsteril növény kereszt-meg~ \

   Λ X #.<· termékenyítését egy második növénnyel, amely második növény e^y.·, «« X olyan exogén oént tartalmas, amelynek terméke megakadályozza ;a. I hámszövetnek a 16. igénypontban meghatározott exogén gén által való tönkretételét ezzel hímfertilis növényt eredményezve.

   2:5. A 20-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárással kapható növény.

   26. Mag, amely egy, a következőket magában foglaló eljárással kapható:

   (a) egy olyan első szülőnövény létrehozása, amely egy 1:2., 13, vagy 14, igénypont szerinti szabályozó régiót tartalmaz egy, a növény himfertilitását befolyásoló olyan exogén génnel működőképesen kapcsolva ágy, hogy a növény hím-steril, és egy második szülőnövény létrehozása, amely hímfertilis; és (b; az első szüiönövény és a második szülőnövény kereszt-megtermékenyitése mag termelésére.

   27. himsteril növény, amely egy 25. igénypont szerinti első, himsteril növénynek egy 25. igénypont szerinti második növénnyel való keresztezésével kapható, ahol a második növény ki. van téve az indukáló anyag hatásának, azaz hímfertilis, igy olyan magot terem, mely olyan harmadik növénnyé nő fal, amely hímsteril ,

   28. Mag, amely a 27. igénypont szerinti harmadik növénynek egy negyedik, hímfertilis növénnyel való keresztezésével és a himsteril növényből való magnak a betakarításával kapható.
7. 7a . 752Οϊ/ΪΑ&υΐί OO ««XX

   29. Mag, amely egy 27. igénypont szerinti, harmadik^.í„ ♦

   .hímsteril növénybői. származó magnak egy negyedik, a kívánt gtíy«| *>«
8. 9 * jellegzetességet szabályzó gént tartalmazó himtertiiis növénnyé!·»* * 9 ♦ * .

   való keresztezésével kapható.

   30, Az i~10.

   vény vagy vetőmag.

   vagy 25---29, igénypontok bármelyike szerint amely kukorica növény vagy vetőmag.

   nü· *«x

   9 x 9 β «.

   * X*

   31. Izolált nukleotid-szekvencia, amely növényekben hímfartintást közvetít, és a következőket tartalmazza:

   <ai agy, a 2. vagy 4, számú szekvencia által megadott aminosso-szekvemciát kódoló nukleotid-szekvencia;

   ;b! egy, a .1., 3. vagy 7. számú szekvenciával megadott nukleotid-szekvencia, vagy egy ezekkel legalább 55% szekvencia-azonosságot mutató szekvencia.

   32. A 31. igénypont (b) része szerinti szekvencia, amelyben a szekvencia-azonosság legalább 90% vagy 95%,

   33. Expressziós vektor, amely egy 31. vagy 32. igénypont szerinti DNS szekvenciát tartalmaz,

   34. Növényi sejt, amely a 33.. igénypont szerinti vektort tartalmazza>

   35. Nukleotid-szekvencia, ahogy az ATCC 98935. számon letétben szerepel.