HU225785B1 - Modulation of plant response to abscisic acid - Google Patents

Description

A találmány tárgyát növények genetikai módosítására szolgáló eljárások, különösen a növények abszcizinsavra adott válaszának befolyásolására (modulálására) alkalmas eljárások képezik.

Az abszcizinsav (ABA) egy növényi hormon, amely esszenciális szabályozó szerepet játszik egy sor élettani folyamatban. E hormonnak szerepe van a csíra (embrió) fejlődésében, a magvak nyugalmi állapotában (dormancia), a lélegzésben és a környezeti hatásokhoz való adaptációban. Az ABA szabályozza a növények fejlődésének számos, mezőgazdaságilag fontos eseményét, így a magvak tartalék fehérjéinek és szénhidrátjainak szintézisét vagy a légzőnyílások (sztómák) záródását. Az ABA-érzékeny promoterek vizsgálata egy sor különböző, potenciális c/'sz-reaktív szabályozóelemet tárt fel.

Az ABA bioszintézisét érintő mutációk számos növényfajban ismertek; lásd például Leung és Giraudat [Annu. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Bioi. 49, 199-222 (1998)] összefoglalóját és az abban idézett közleményeket. Az Arabldopsisban több, genetikailag különböző, ABA-érzéketlen lokuszt azonosítottak. Ezeket a mutánsokat azon tulajdonságuk alapján szelektálták, hogy magvaik az ABA gátlókoncentrációinak jelenlétében is képesek a csírázásra. A mutációk a magfejlődés más folyamatait, így a tartalék fehérjék és lipidek felhalmozódását, illetve a klorofill lebontását és a kiszáradástűrést is érintik.

Napjainkig számos mutánst és gént jellemeztek a növényekben. Öt, mutáción keresztül azonosított ABAreaktív lokuszt klónoztak, amelyek három fehérjeosztályba tartoznak. Az egyikbe a kukorica két ortológ transzkripciós regulátora (Viviaparous1=Vp1) és az Arabldopsis ABA-érzéketlen-3 (ABI3) regulátora, a másikba a foszfatáz 2C fehérjecsalád két, erősen homológ tagja, míg a harmadikba az Arabidopsis farneziltranszferáza tartozik [lásd például McCarty ef al., Cell 66, 895-905 (1991); Giraudat et al., Plánt Cell 4, 1251-1261 (1992); Leung ef al., Science 264, 1448-1452 (1994); és Cuither ef al., Science 273, 1239-1241 (1996)].

A magfejlődés érési fázisában a csíra nyugalmi állapotba kerül az életben maradó szövetekben, és a száraz mag tűrőképessé válik a kiszáradással szemben. A kukoricában és más pázsitfűfélékben ez a mag táplálószövete (endospermium) aleuronrétegének sejtjeit is érinti. A kukorica „elevenszülő” mutánsában az érési program van gátolva, ezért a mutáns embrió csíranövénnyé fejlődik még az anyanövényen. A kilenc leírt elevenszülő lokusz mindegyike a karotinoidok és az abszcizinsav bioszintézisének bevezető lépéseit befolyásolja. A vp1 embriók csökkent ABA-érzékenységet mutatnak szövettenyészetben, ami arra utal, hogy az eredeti Vp1 egy olyan tényezőt kódol, amely az ABA érzékelésében játszik szerepet.

Molekuláris szinten az embrió érése a gének széles körének aktiválódásával jár, és az ekkor kifejeződő gének közül sokat az ABA-hormon szabályoz. Ennek ellenére az ABA hatásának molekuláris mechanizmusa nagyrészt ismeretlen.

A fejlődés ABA-közvetítésű szabályozása a növények alapvető válaszreakciója a kedvezőtlen környezeti hatásokra. Mivel keveset tudunk az ABA-közvetítésű fejlődésszabályozás molekuláris mechanizmusáról, szükség van olyan eljárásokra, amelyekkel befolyásolni lehet a növények válaszát az ABA-ra, és különösen olyanokra, amelyekkel a terméshozamot lehet fokozni.

A találmány tárgyát növények, különösen magtermő növények terméshozamát fokozó készítmények és eljárások képezik. Az eljárások magukban foglalják az ABA érzékelésének és jelátvitelének befolyásolását a fejlődő magvakban. Ezek az eljárások alkalmasak arra, hogy megvédjük a növényeket a stressz káros és/vagy pusztító hatásaitól és a hátrányos környezeti körülményektől. A készítmények genetikai szerkezeteket tartalmaznak, amelyekről tudjuk, hogy növények vagy növényi sejtek ABA-érzékenységét befolyásolják. Különösen fontosak az ABA-asszociált szekvenciák. Az ABAasszociált szekvenciák közé tartoznak az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó gének, azok mutánsai, fragmentumai és változatai, valamint az előbbiek antiszensz nukleotidszekvenciái. A DNSszekvenciákat olyan szerkezetekben használhatjuk, amelyek időfüggő, a fejlődési fázistól függő vagy szövetspecifikus kifejeződést biztosítanak.

A készítmények stresszhatás - különösen abiotikus stressz - alatt álló növények terméshozamának fokozására szolgáló eljárásokban használhatók. Ezen a módon megszüntethető az ABA káros hatása a virágzat és a magbél fejlődésére.

Találmányunk továbbá transzformált növényeket, növényi sejteket, szöveteket és magvakat is biztosít.

A találmány szerint rendelkezésre bocsátunk egy eljárást növényben magfejlődés, magbélfejlődés vagy magérés során abszcizinsavra (ABA) adott válasz befolyásolására, amely eljárás abból áll, hogy az illető növénybe egy korai magbél (kernel)/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezetet juttatunk be, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest.

A találmány rendelkezésre bocsát továbbá:

- egy eljárást fejlődő növényi magot, érésben levő növényi magot vagy fejlődő magbelet érő stressz káros hatásainak megelőzésére, amely eljárás egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezetnek az illető növénybe való bejuttatásából áll, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest;

- olyan növényt, amelybe egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezet van stabilan bejuttatva, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest;

HU 225 785

- olyan növényi sejtet, amelynek genomjába egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezet van bejuttatva, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest;

- egy eljárást fejlődő növényi magot, érésben levő növényi magot vagy fejlődő magbelet érő stressz káros hatásainak megelőzésére, amely eljárás abból áll, hogy egy késői magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó DNSszerkezetet juttatunk be egy olyan növénybe, ahol a növénynek az említett szekvenciát érintő funkcióvesztéses mutációja van, és az említett késői magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest;

- olyan növényt, amelybe egy késői magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezet van stabilan bejuttatva, amelyben az említett késői magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest;

- olyan növényi sejtet, amelynek genomjába egy késői magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezet van bejuttatva, amelyben az említett késői magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest;

- a találmány szerinti növény transzformált magját; és

- a találmány szerinti növény transzformált utódját.

Eljárásokat biztosítunk növények abszcizinsavval szembeni korai válaszának befolyásolására, különösen terméshozam biztosítására azáltal, hogy megszüntetjük az ABA ártalmas hatását a magvak fejlődésére. Pontosabban, találmányunk olyan készítményeket és eljárásokat biztosít, amelyek megszakítják az ABA jelátvitelét vagy működését. A készítmények és eljárások alkalmasak az ABA hatásának egy szövetben, fejlődési fázistól függő módon történő megszakítására, hogy ezzel elszigeteljük a női szaporítószöveteket a stressztől és a káros környezeti hatásoktól.

Találmányunkban a „növények válasza” kifejezés alatt a szaporítószövet fejlődését, a mag fejlődését, a táplálószövet fejlődését és a mag érését értjük. Az ABA-nak szerepe van a növények életciklusának számos más élettani és fejlődési folyamatában is, mint amilyen a magvak nyugalmi állapota, az abiotikus környezeti stresszhatásokhoz (például hideg, szárazság, magas sótartalom és a többi) való alkalmazkodás, a tápanyagtartalékok felhalmozása, a kiszáradástűrés elérése, a légzőnyílások záródása és a többi. A korai szakaszokban az ABA szabályozza a magvak érését és tartja fenn a csíra nyugalmi állapotát. Később, az egyedfejlődés kezdetén, az ABA közvetítésével jelenik meg számos adaptív válaszreakció a környezeti hatásokra, mint amilyenek a kiszáradás, a hideg, a sóstressz és más stresszhatások, ugyanakkor az ABA negatív növekedésszabályozóként is működik. Általánosságban, az ABA kétirányú növekedésszabályozó hatást fejt ki: egyrészt befolyásolja a sejtek növekedését (valószínűleg a turgor szabályozásával), másrészt leállítja a sejtek osztódását a negatív növekedésszabályozó szerepének megfelelően.

Találmányunk magában foglalja a növények ABA-ra adott korai válaszreakciójának szabályozását vagy befolyásolását. A „befolyásolás alatt az ABA-ra adott növényi válaszreakció fokozását (felszabályozását) vagy csökkentését (leszabályozását) értjük. Találmányunk szempontjából a befolyásolás általában leszabályozást jelent, ami az ABA szintézisének megszakításán vagy az ABA érzékelésének vagy jelátvitelének megszakításán keresztül valósulhat meg. Belátható, hogy az ABA működésének teljes megszakítása a növényben nem célszerű, mert az ABA-nak több szerepe van a fejlődés folyamán. Találmányunk szempontjából általában az a célszerű, ha csak azon a helyen szüntetjük meg az ABA hatását, ahol ténylegesen nincs rá szükség, azaz a gabonanövények kalászaiban. Ezen a módon - az ABA érzékelését vagy jelátvitelét megszakítva - hatásos stratégiát biztosíthatunk a gabonafélék női szaporítószövetének elszigetelésére a stresszhatásoktól.

A megtermékenyülés után bekövetkező környezeti stresszhatások meggátolják a raktározókapacitás felépülésének korai eseményeit, és ezzel csökkenthetik a terméshozamot. A gabonák esetében például az endospermium a raktározott tartalék tápanyagok fő forrása az érett magvakban. A raktározókapacitás a mag fejlődésének korai szakaszában épül fel. Felismerve az ABA szerepét a növények stresszre adott korai válaszában, találmányunkkal arra törekszünk, hogy kiiktassuk az ABA káros hatásait a magvak fejlődésére, és ezzel javítsuk a magvak és magkészítmények, különösen a gabonák és más magvak minőségét és mennyiségét [Mambelli és Setter, Physioí Ptantarum 104, 266-272 (1998); Tuberosa eí a/., Theor. Appl. Génét. 744-755 (1998)].

Amint jeleztük, találmányunk magában foglalja olyan szekvenciák bejuttatását a célnövénybe, amely befolyásolja az ABA érzékelését és jelátvitelét. Az „ABA érzékelését és jelátvitelét befolyásoló szekvenciák” vagy az „ABA érzékelésében és jelátvitelében érintett szekvenciák” kifejezések alatt olyan mutánsokat és géneket értünk, amelyek megszakítják az ABA szintézisét vagy érzékelését és jelátvitelét. Az ABA szintézisét, érzékelését vagy jelátvitelét megszakító mutánsokat, géneket és szekvenciákat találmányunkban „ABA-asszociált szekvenciákénak is nevezzük. Az ilyen szekvenciák közé tartoznak - nem korlátozó módon - az ABA-érzéketlen vagy hiperszenzitív mutánsok, vagy a mutáns vagy vad típusú géneknek megfelelő antiszensz szekvenciák. A szakterületen ismert ABA-mutánsok közé tartozik az ab/1-5 és era1-3 [Cutler et a/., Science 273, 1239-1241 (1996)], a gca1/8 [Benning et aí, Workshop Abscisic Acid Signal

HU 225 785

Transduction in Arabidopsis, Madrid, p. 34. (1996)], az axr2 [Wilson ef a/., Mól. Gén. Génét. 222, 377-383 (1990)], a y'arl [Staswick ef a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6837-6840 (1992)], a jin4 [Berger ef a/., Plánt Physiol. 111, 525-531 (1996)], a bri1 [Clouse ef a/., Plánt Physiol. 111, 671-678 (1996)], a sax (Arabidopsis thaliana), a vpl [McCarty ef al., Cell 66, 895-905 (1991); Robichaud ef al., J. Plánt Physiol. 126, 235-242 (1986)], a reál (Zea mays) [Sturaro ef al., J. Exp. Bot. 47, 755-762 (1996)], a cool (Hordeum vulgare) [Raskin ef al., Planta 173, 73-78 (1988)], az aóa1 (Nicotiana plumbaginifolia) [Bitoun ef al., Mól. Gén. Génét. 220, 234-239 (1990); Leydecker ef al., Plánt Physiol. 107, 1427-1431 (1995)] és a hasonlók. Ezek és más ABA-asszociált mutánsok találmányunk gyakorlatában alkalmazhatók.

Egy szekvenciát akkor tekintünk „megfelelő-nek egy gén vagy szekvencia számára, ha képes olyan fokú hibridizálódásra a génnel vagy szekvenciával, amely a transzkripció megakadályozásához szükséges. Felismertük, hogy a találmányunkban alkalmazott ABA-asszociált szekvenciától függően vagy a kódoló-, vagy az antiszensz szekvencia lehet előnyös. A kódolószekvencia azonban a megcélzott gén expressziöjának koszuppresszálására is használható. így például az egyik stratégia magában foglalja mutáns gének, például az abi1 vagy abi2 kifejeztetését egy korai magbél/embrió promoterrel, ami domináns módon megszünteti az ABA hatását e szövetek korai stádiumában. Egy ilyen megoldás nem fogja megszüntetni az ABAnak a mag éréséhez szükséges funkcióit. Más megoldásként gének, például a Vp1 vad típusú alléljei leszabályozhatok koszuppresszióval vagy antiszensz stratégiával, hogy felfüggesszük az ABA hatását. Ez utóbbi példában egy korai magbél/embrió promotert használhatunk ama, hogy a Vp1 egy kódolószekvenciájának (koszuppresszióhoz) vagy egy antiszensz szekvenciájának expresszióját működtessük vele. Egy harmadik példában úgy transzformálhatunk egy növényt egy késői magbélpromoterrel, hogy az a vad típusú Vp1 szekvenciát működtesse, majd ezt a transzformált növényt egy vp1 mutáns növénnyel keresztezzük. Ebben a példában a vp1 mutáns azon tulajdonsága, hogy az ABA nem képes indukálni, szigeteli el a korai magbelet a káros hatásoktól. Ugyanakkor a DNS-szerkezet biztosítja a magbél képességét a normális érésre, (gy tehát @BAJUSZ = amit az alábbiakban részletesen is leírunk - számos célpontjelölt gén áll rendelkezésünkre olyan promoterekkel való összekapcsoláshoz, amelyek korlátozott kifejeződési lehetőségei biztosítják a fokozott termésbiztonságot az abiotikus stresszhatásokkal szemben.

A kukorica viviparous-1 (Vp1, „elevenszülő) génjére szükség van az érési program lefutásához a mag fejlődésében. A VP1 egy új transzkripciós faktor, amelynek valószínűleg része van egy magspecifikus hormonválasz potenciálásában. A Vp1 nukleinsavszekvenciáját az 1. számú, aminosavszekvenciáját a 2. számú szekvenciavázlatként mutatjuk be. A kukorica elevenszülő mutánsaiban az érési program van gátolva. Ennek következtében a mutáns embrió idő előtt, még az anyanövényen csíranövénnyé fejlődik. Számos elevenszülő mutánst írtak le. A funkciót veszített vp1 mutánsok további jellegzetessége például az ABAérzéketlen fenotípus (azaz a külső ABA csírázásgátló hatása iránti csökkent érzékenység szövettenyészetben) és/vagy az Em promoter csökkent aktiválhatósága. A szakemberek könnyen azonosíthatják a Vp1 funkcióvesztéses mutációit, amelyek alkalmasak a találmány szerinti felhasználásra, (gy például Hill és munkatársai azt találták, hogy a Vp1 N-terminális savas területe és az erősen konzervatív BR1 dómén esszenciális szerepet játszanak a Vp1 működésében [J. Bioi. Chem. 7, 3366 (1966)]. További vp1 mutánsok is ismertek [Neill ef al., Planta 169, 87-96 (1986); McCarty ef al., Cell 66, 895-905 (1991); Robichaud ef al., Dev. Génét. 1, 325-330 (1980); Robichaud és Sussex, Plánt Physiol. 130, 181-188 (1987); Robichaud ef al., J. Plánt Physiol. 126, 235-242 (1986); McCarty ef al., Physiol. Plantarum 81, 267-272 (1990); Eyster ef al., Genetics 16, 457-590 (1931)].

Ugyancsak rendelkezésre álnak az Arabidopsis ABA-érzéketlen mutánsai is. Az ilyen mutánsok magfejlődésében pleiotrop hibák vannak, mint amilyen az ABA csírázásgátló hatása iránti csökkent érzékenység a megváltozott magspecifikus génkifejeződés következtében [Finkelstein ef al., Plánt Cell 10, 1043-1045 (1998); Leung et al., Science 264, 1448-1452 (1994); Leung, Plánt Cell 9, 759-771 (1997); Giraudat ef al., Plánt Cell 4, 1251-1261 (1992); Myer ef al., Science 264, 1452-1455 (1994); Koornneef ef al., Plánt Physiol. 90, 463-469 (1989); Nambara ef al., Plánt J. 2, 435-441 (1992); Finkelstein és Somerville, Plánt Physiol. 94, 1172-1179 (1990); Leung és Giraudat, Annu. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Bioi. 49, (1998); Robinson és Hill, Plánt, Cell and Environment 22, 117-123 (1999); Rodriguez et al., FEBS Letters 421, 185-190 (1998)]; valamint a fentiekben hivatkozott közlemények, amelyek mindegyikét referenciaként tartjuk számon. A vad típusú ABI1, ABI2, ABI3 és ABI4 gének nukleinsavszekvenciáját és aminosavszekvenciáját a 3-10. számú szekvenciavázlatokként adjuk meg. A másféle ABA-asszociált mutánsok közé tartozik az Arabidopsis thaliana bili génje, aminek szekvenciája az AF 017056 génbanki nyilvántartó szám alatt, illetve Li és munkatársai [Cell 90, 929-938 (1997)] közleményében található meg; mindkettőt referenciaként tartjuk számon.

Az érdeklődésre számot tartó abi mutánsok egyike az abil, amely egy domináns mutáció az ABI1 gén szerkezeti részében. A mutáció egy nukleotid átalakulása guaninből adeninné, aminek következtében egy GGC triplett GAC-vé változik, és emiatt a 3. szekvenciavázlat 180-as helyzetében a vad típus glicinje helyére aszparaginsav kerül [Meyer ef al., Science 264, 1452-1455 (1994)]. Az ab/2 szintén a találmányunk szempontjából fontos, domináns mutánsok közé tartozik; ez esetben is egy GGC-»GAC átalakulás történik a 6. szekvenciavázlat 168-as helyzetében, ahová glicin helyett aszparaginsav kerül [Rodriguez ef al., FEBS

HU 225 785

Letters 421, 185-190 (1998)]. A szakemberek könnyen találhatnak további mutációkat (dominánst és recesszívet egyaránt) más ABA-asszociált szekvenciákban is, amelyek alkalmasak lehetnek a találmány szerinti felhasználásra.

A fent felsorolt mutánsokat „ABA-asszociált mutánsok”-nak nevezzük. E fogalom alatt olyan géneket és szekvenciákat értünk, amelyek megszakítják az ABA jelátvitelét és/vagy érzékelését egy növényben. A fenti szekvenciák felhasználásával más növényekből, köztük gabonákból, izolálhatunk hasonló szekvenciákat. Egyes esetekben jó hatású lehet egy olyan ABA-asszociált szekvencia alkalmazása, amely megfelel egy, a szóban forgó célnövényből származó szekvenciának. így például kukoricában való használatra előnyös az ABAasszociált szekvencia kukoricahomológja, vagy egy, a kukoricahomológnak megfelelő szekvencia.

Találmányunk az ABA-asszociált szekvenciákat használja a növények ABA-val szembeni válaszreakciójának szabályozására. A termésveszteség megelőzésére általában előnyös az ABA jelátvitelének vagy érzékelésének gátlása. Az ABA-asszociált szekvenciák, kódoló- és antiszensz szekvenciák alkalmazásával szabályozható az ABA expressziója és érzékelése egy növényben. Amint alább részletesebben leírjuk, az ilyen szekvenciák rekombináns módszerekkel, valamint hagyományos nemesítési eljárásokkal juttathatók be az érdeklődésre számot tartó növényekbe.

A találmány szerinti nukleotidszekvenciák felhasználhatók megfelelő szekvenciák izolálására más szervezetekből, különösen más növényekből, még különösebben gabonákból. E célra olyan eljárások alkalmasak, mint a polimeráz-láncreakció (PCR), a hibridizálás vagy bármely hasonló módszer, amely alkalmas az ilyen szekvenciák azonosítására a találmány szerinti ABA-asszociált szekvenciákkal mutatott homológiájuk alapján. A szekvenciák a teljes ABA-asszociált szekvenciával vagy annak fragmentumaival való homológiájuk alapján izolálhatok.

Ha PCR-t alkalmazunk, olígonukleotidprimerek tervezhetők a megfelelő DNS-szekvenciák sokszorozásához a cDNS-ből vagy genom-DNS-ből, amit bármely, az érdeklődésre számot tartó növényből vonunk ki. A PCR-primerek tervezésének és a PCR-rel végzett klónozásnak a módszerei általában ismertek a szakterületen, és olyan kézikönyvekben vannak leírva, mint a „Molecular Cloning; A Laboratory Manual” [Sambrook et al. (eds.), 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989], „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” [Innis et al., (eds.), Academic Press, New York, 1990], „PCR Strategies” [Innis és Gelfand (eds.), Academic Press, New York, 1995] vagy „PCR Methods Manual” [Innis és Gelfand (eds.), Academic Press, New York, 1990]. A PCR ismert eljárásaihoz tartoznak a párosított, csoportosított, egyedi specifikus, degenerált, génspecifikus, vektorspecifikus vagy részben kevert printereket alkalmazó eljárások; a felsorolás nem kizáró jellegű.

A hibridizációs technikákban egy ismert nukleotidszekvencia egészét vagy részét használjuk próbaként, hogy szelektíven hibridizálódjon más, megfelelő nukleotidszekvenciákkal, amelyek egy adott szervezetből klónozott genom-DNS-fragmentumok vagy cDNS-fragmentumok populációjában (azaz genom- vagy cDNSkönyvtárakban) vannak jelen. A hibridizációs próbák lehetnek genom-DNS-, cDNS-, RNS- vagy más oligonukleotidfragmentumok, és egy kimutatható csoporttal, például ³²P-izotóppal vagy mással lehetnek megjelölve. így például a próbák úgy készíthetők el, hogy jelölt oligonukleotídokat szintetizálunk a találmány szerinti ABA-asszociált szekvenciák alapján. A hibridizációs próbák elkészítésének módja, valamint a genom- és cDNS-könyvtárak elkészítése Sambrook és munkatársai már idézett kézikönyvében van leírva.

így például a találmány szerinti ABA-asszociált szekvencia egészét, illetve egy vagy több részét használhatjuk próbaként arra, hogy specifikusan hibridizálódjanak a megfelelő szekvenciákkal és mRNS-ekkel. Ahhoz, hogy specifikus hibridizálódást érjünk el különböző körülmények között, az ilyen próbáknak olyan szekvenciákat kell tartalmazniuk, amelyek egyediek a szóban forgó szekvenciák között, és a próba hosszának legalább körülbelül 10 és legelőnyösebben legalább körülbelül 20 nukleotidnak kell lennie. Az ilyen próbák arra használhatók, hogy a megfelelő szekvenciákat sokszorozzuk velük egy adott növényből, PCRrel. Ez a technika arra is alkalmas, hogy további kódolószekvenciákat izoláljunk vele egy kívánt növényből, vagy hogy megállapítsuk vele egy kódolószekvencia jelenlétét egy növényben. A hibridizációs technikák közé tartozik a szélesztett DNS-könyvtárak szűrővizsgálata is (akár tarfoltok, akár telepek; lásd például Sambrook és munkatársai, id. mű).

Az ilyen szekvenciák hibridizálása szigorú feltételek között hajtható végre. A „szigorú feltételek” vagy „szigorú hibridizációs feltételek” kifejezések olyan körülményeket jelentenek, amelyek között egy „próba” kimutathatóan nagyobb (a hátteret legalább kétszeresen meghaladó) mértékben hibridizálódik a célszekvenciájával, mint más szekvenciákkal. A szigorú feltételek szekvenciafüggőek, és függenek a körülményektől is. A hibridizálás és/vagy a mosás szigorúságának változtatásával felismerhetők azok a célszekvenciák is, amelyek 100%-ban komplementerek a próbával (homológiavizsgálat). Másrészt a szigorúság feltételei úgy is beállíthatók, hogy a kisebb hasonlósági fokú szekvenciák összekeveredve kimutathatók legyenek (heterológiapróba). A próba általában rövidebb, mint 1000 nukleotid, előnyösen nem éri el az 500 nukleotid hosszúságot.

A szigorú feltételek tipikusan olyanok, hogy a sókoncentráció kisebb, mint körülbelül 1,5 mol/l nátriumion, tipikusan körülbelül 0,01-1,0 mol/l nátriumion (vagy másféle só) 7,0-8,3 pH között, és a hőmérséklet legalább körülbelül 30 °C a rövid próbák (azaz a 10-50 nukleotid hosszúságúak), és legalább körülbelül 60 °C a hosszabb próbák (azaz az 50 nukleotidnál hosszabbak) számára. A hibridizálás időtartama általában rövidebb, mint körülbelül 24 óra, rendszerint körülbelül 4-12 óra. A szigorú feltételek létrehozhatók destabilizálóreagensek, például formamid hozzáadásával

HU 225 785 is. Példaszerűen alacsony szigorúságé feltételeket biztosít egy pufferoldat 30-35% formamiddal, 1 mol/l nátrium-kloriddal és 1% SDS-sel (nátrium-dodecil-szulfát) 37 °C-on, és a mosás 1*-2*SSC-vel 50-55 °C-on (20*SSC=3,0 mol/l nátrium-klorid+0,3 mol/l trinátriumcitrát). Közepes szigorúságé feltételt biztosít a hibridizáció 40-45% formamid, 1 mol/l nátrium-klorid és 1% SDS jelenlétében, 37 °C-on, és a mosás 0,5*-1 *SSCvel 55-60 °C-on. Erősen szigorú feltételek az 50% formamid, 1 mol/l nátrium-klorid és 1% SDS 37 °C-on, és a mosás 0,1^xSSC-vel 60-65 °C-on.

A specificitás tipikusan a hibridizálódás utáni mosásnál derül ki; a kritikus tényezők a mosóoldat ionerőssége és hőmérséklete. A DNS/DNS hibridek esetében a T_m jól megközelíthető Meinkoth és Wahl egyenletével [Anal. Biochem. 138, 267-284 (1984)], ami szerint

T_m=81,5 °C+16,6(logM)+0,41(%GC)-0,61(% formamid)-500/L ahol M az egyértékű kationok molaritása, %GC a guanozin és citozin nukleotidok aránya a DNS-ben, % formamid a formamid aránya a hibridizálóoldatban, és L a hibrid hossza bázispárokban mérve. A T_m az a hőmérséklet (adott ionerősségen és pH-η), amelyen egy komplementer célszekvencia 50%-a hibridizálódik a tökéletesen hozzáillő próbával. A kevertség minden 1%-os fokozódásával a T_m körülbelül 1 °C-kal csökken; így tehát a T_m, a hibridizálás és/vagy a mosás körülményei úgy állíthatók be, hogy a kívánt azonosságú szekvenciák hibridizálódjanak. így például ha >90%-os azonosságú szekvenciákat keresünk, akkor a T_m 10 °C-kal csökkenthető. A szigorú feltételeket általában úgy választjuk meg, hogy a hőmérséklet körülbelül 5 °C-kal alacsonyabb legyen az adott szekvencia és komplementere olvadási hőmérsékleténél az adott ionerősség és pH mellett. Az igen szigorú feltételek esetén a hibridizálást és/vagy a mosást a T_m-nél 1, 2, 3 vagy 4 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük; a kismértékben szigorú feltételek esetén a hibridizálást és/vagy a mosást a T_m-nél 6, 7, 8, 9 vagy 10 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük; a kismértékben szigorú feltételek esetén a hibridizálást és/vagy a mosást a T_m-nél 11,12, 13, 14, 15 vagy 20 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten végezhetjük. A fenti egyenletet használva a szakemberek meghatározhatják a hibridizálás és mosás körülményeit. Ha a kevertség kívánt foka miatt a T_m alacsonyabb lenne, mint 45 °C (vizes oldatban) vagy mint 32 °C (formamidos oldatban), akkor előnyös az SSC koncentrációját úgy megemelni, hogy magasabb hőmérsékletet használhassunk. A nukleinsavak hibridizálásához kimerítő útmutatást találunk Tijssen „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes” című kézikönyvében, valamint Ausubel és munkatársai, illetve Sambrook és munkatársai már idézett műveiben.

így tehát a találmány tárgyához tartoznak azok az izolált, „megfelelő ABA-asszociált szekvenciák”, amelyek módosítják a növény ABA-ra adott válaszát, és szigorú körülmények között hibridizálódnak a találmány szerinti ABA-asszociált szekvenciákkal vagy azok fragmentumaival. Az ilyen szekvenciák legalább körülbelül 70-75, körülbelül 80-85, vagy éppen 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 vagy 99%-os, vagy magasabb arányú homológiát mutatnak a találmány szerinti szekvenciákkal. Ez azt jelenti, hogy a szekvenciaazonosság foka legalább körülbelül 70-75, körülbelül 80-85, vagy éppen 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 vagy 99%-os, vagy magasabb az adott szekvenciák között.

A találmány szerinti ABA-asszociált szekvenciák szövet- vagy fejlődésspecifikus promoterekkel használhatók arra, hogy szövet- vagy fejlődésspecifikus módon szakítsuk meg az ABA funkcióit. Az e szempontból különösen fontos promoterek közé tartoznak a magspecifikus promoterek, különösen a korai és késői magbél/embrió promoterek.

A magbél megporzás utáni fejlődése körülbelül három fő szakaszra osztható. A lagfázis a megporzástól (0. nap) körülbelül 10-12 napon át tart. Ezalatt a magbél tömege nem növekszik jelentősen, de annál fontosabb események zajlanak benne, amelyek meghatározzák a magbél életképességét (például a sejtek száma). A lineáris feltöltődés fázisában (a 10-12.-től a körülbelül 40. napig) a magbél elnyeri csaknem teljes végső tömegét, és különböző raktározott termékek (például keményítő, fehérjék, olaj) halmozódnak fel benne. Végül az érési fázis a körülbelül 40. naptól a betakarításig tart. Ebben a fázisban a magbél nyugalmi állapotba jut, és megkezdődik a kiszáradása, amivel a magbél felkészül a dormancia hosszú időszakára a csírázás előtt. Találmányunkban a „korai magbél/embrió promoterek” alatt a fejlődés első fázisában aktív promotereket értjük, míg a „késői magbél/embrió promoterek alatt azokat, amelyek a fejlődés körülbelül 12. napjától az érési folyamat végéig aktívak. A promoter megválasztása a felhasznált ABA-asszociált szekvenciától fog függeni.

A korai magbél/embrió promoterek közé tartozik például a cim1, egy pollen- és teljes magbélspecifikus promoter, amely 5 beporzás utáni napon (DAP) aktív (lásd például a WO 00/11177 számú szabadalmi iratot, amit referenciaként tartunk számon). További korai magbél/embrió promoterek az end1 magspecifikus promoter, amely a 7-10. DAP-okon, valamint az end2, amely a teljes magbélben a 9-14. DAP-okon, az endospermiumban és a perikarpiumban pedig a 10. DAP-on aktív (lásd például a WO 00/12733 számú szabadalmi iratot, amit referenciaként tartunk számon). További, a találmány szerinti eljárásokban felhasználható korai magbél/embrió promoterek közé tartozik még az Ipt2 magspecifikus promoter (13. számú szekvenciavázlat), amely a 6-24. DAP-ok között aktív (US 5,525,716 számú szabadalmi irat, amit referenciaként tekintünk).

Az ilyen, korai magbél/embrió promoterek az ABA érzékelésének vagy jelátvitelének génjeivel vagy mutánsaival használhatók. Mutáns gének, mint amilyen az aó/1 vagy az abi2, működőképes módon egy korai magbél/embrió promoterhez kapcsolva dominánsan

HU 225 785 megszakítják az ABA hatását a szövetekben azelőtt, hogy később szükségessé válik a mag éréséhez. Más megoldásként a korai magbél/embrió promoter működőképes módon összekapcsolható egy ABA-asszociált szekvencia vad típusú (koszuppresszió) vagy antíszensz nukleotidszekvenciájával. A korai magbél/embrió promoter az ABA hatásának magérés előtti megszakítására alkalmazható.

A késői magbél/embrió promoterek közé tartoznak például az oleozingének promoterei [Plánt et al., Plánt Mól. Bioi. 25, 193-205 (1994); Keddie ef al., Plánt Mól. Bioi. 24, 327-340 (1994); Keddie ef a/., Plánt Mól. Bioi. 19, 443-453 (1992); Hong ef al., Plánt Mól. Bioi. 34, 549-555 (1997)]. A 11. szekvenciavázlat a Glycine max oleozinpromoter szekvenciáját (génbanki nyilvántartási száma U71381), a 12. szekvenciavázlat a Brassica junceáét (AF134411) mutatja be, míg az Arabidopsis thalianáét az US 5,977,436 számú szabadalmi iratban találjuk meg. A fenti idézetek mindegyikét referenciaként tartjuk számon. További késői magbél/embrió promoterek közé tartozik az smilps, egy embrióspecifikus promoter, amely a 13-14. DAP-okon, valamint a cz19B1, egy teljes magbélspecifikus promoter, amely a 13-40. DAP-okon aktív (WO 00/40710 számú szabadalmi irat, amit referenciaként tartunk számon).

A késői magbél/embrió promoterek, például az oleozingéneké, felhasználhatók a vad típusú Vp1 allélek expressziójának működtetésére, majd az ilyen növények keresztezhetők egy vp1 mutációt hordozó növénnyel. Ebben a példában a vp1 mutáns allélnek azon tulajdonsága, hogy nem képes kölcsönhatásba lépni az ABA-val, el fogja szigetelni a fiatal magbelet a káros hatásoktól. A Vp1 gén terméke a magbél fejlődésének igen korai szakaszában van jelen. Az ABA jelenlétében a VP1 hatásossá válik. A módosított gén, amit a transzgén szülő szolgáltat, fogja biztosítani a normális beérés lehetőségét a magbél számára. Találmányunkban az „endogén ABA-asszociált szekvencia kifejezésen bármely olyan, ABA-asszociált szekvenciát értünk, amelyet nem egy transzformációs eseménnyel juttatunk a növénybe.

Az ilyen ABA-asszociált gének arra használhatók, hogy szabályozzuk a stressz hatását a növényekre. A kiszáradástűrés elérése során a tápanyagtartalékok felhalmozódása együtt jár specifikus mRNS-együttesek expressziójával. Azokat a transzkriptumokat, amelyek a raktározott fehérjéket vagy a „late-embryogenesis-abundant” (LEA) fehérjéket kódolják, és vélhetően részük van a kiszáradástűrés létrejöttében, idő előtt indukálja az exogén ABA az embriótenyészetekben. így tehát az ABA-gének késői expressziója összekapcsolható transzgén raktárfehérjékkel, hogy növeljük a magvak tápanyagtartalékát.

Az ABA érzékelését vagy jelátvitelét befolyásoló szekvenciák „bejuttatása” egy célnövénybe magában foglal bármely módot, amivel a szóban forgó szekvencia beépíthető a célnövénybe. Erre hagyományos nemesítés! módszerek, genetikai transzformációs módszerek vagy bármilyen elérhető módszer alkalmas lehet. A találmány szerinti eljárások nem függenek egy adott, a nukleotidszerkezetek növényekbe juttatására szolgáló módszertől; a feltétel csak az, hogy a nukleotidszerkezet sikeresen eljusson a növény legalább egy sejtjének belsejébe. A „stabil transzformáció” fogalom alatt azt értjük, hogy a növénybe juttatott nukleotidszerkezet beépül a növény genomjába, és képes az utódokba átöröklődni.

Gének vad típusú alléljei, például a Vp1, a korai promoterekkel leszabályozhatok akár a koszuppressziós, akár az antiszensz stratégia alkalmazásával. Ismeretes, hogy ezekkel a szekvenciákkal olyan antiszensz szerkezetek készíthetők, amelyek az ABAasszociált szekvenciák mRNS-einek legalább egy részével komplementerek. Az antiszensz nukleotidok úgy vannak megszerkesztve, hogy hibridizálódjanak a megfelelő mRNS-ekkel. Az antiszensz szekvenciák mindaddig módosíthatók, amíg hibridizálódnak a megfelelő mRNS-sel és interferálnak expressziójával. Az antiszensz szerkezetek akkor használhatók, ha 70%-os, előnyösen 80%-os, előnyösebben 85%-os szekvenciahasonlóságot mutatnak a célszekvenciával. Továbbá az antiszensz nukleotidok részei is használhatók a megcélzott gén kifejeződésének megszakítására. Általában legalább 50, 100, 200 vagy több nukleotidból álló szekvenciákat használhatunk.

Jól ismertek a szakterületen azok a módszerek, ahol szensz orientációjú nukleotidszekvenciákat használnak gének expressziójának elnyomására növényekben. Ezek az eljárások általában magukban foglalják a növények transzformálását egy olyan DNS-szerkezettel, amely egy promotert tartalmaz működőképes módon egy nukleotidszekvencia legalább egy részéhez kapcsolva, amely szekvencia megfelel az endogén gén transzkriptumának (azaz egy ABA-asszociált szekvencia). Egy ilyen nukleotidszekvencia és az endogén gén transzkriptumának szekvenciája közötti azonosság foka előnyösen nagyobb, mint körülbelül 65%, előnyösebben nagyobb, mint körülbelül 85%, és legelőnyösebben nagyobb, mint körülbelül 95% (US 5,283,184 és 5,034,323 számú szabadalmi iratok, amelyeket referenciaként tartunk számon).

Felismertük, hogy találmányunkban az ABA-asszociált gének fragmentumai és/vagy változatai is alkalmazhatók. így tehát találmányunkhoz tartoznak az ABA-asszociált nukleotidszekvenciák fragmentumai és változatai, valamint az általuk kódolt fehérjék. A „fragmentum” fogalom alatt egy nukleotidszekvencia egy részét vagy egy aminosavszekvencia egy részét értjük. Egy nukleotidszekvencia fragmentumai fehérjefragmentumokat kódolhatnak, amelyek megőrizhetik a természetes fehérje biológiai aktivitását, és ezáltal befolyásolhatják az ABA-val szembeni válaszreakciókat. Másrészt egy nukleotidszekvencia azon fragmentumai, amelyek hibridizációs próbáknak alkalmasak, általában nem kódolnak biológiailag aktív fehérjefragmentumokat. Ennek megfelelően egy nukleotidszekvencia fragmentumainak hossza legalább körülbelül 20 nukleotidtól körülbelül 50 vagy körülbelül 100 nukleotidig, vagy a találmány szerinti nukleotidszekvencia teljes hosszáig terjedhet.

HU 225 785

A „változatok” fogalom alatt lényegében hasonló szekvenciákat értünk. A nukleotidszekvenciák esetében a természetben előforduló változatok jól ismert molekulárbiológiai technikákkal, például polimerázláncreakcióval (PCR) vagy hibridizációs technikákkal azonosíthatók. A nukleotidszekvenciák változatai magukban foglalják a szintetikus eredetű nukleotidszekvenciákat is, amelyeket például helyre irányított mutagenezissel állítanak elő. Általában egy adott nukleotidszekvencia találmány szerinti változatai legalább körülbelül 40, 50, 60, 65 vagy 70%-os, előnyösen legalább körülbelül 75, 80 vagy 85%-os, előnyösebben legalább körülbelül 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 vagy 97%-os, és legelőnyösebben legalább körülbelül 98 vagy 99%-os szekvenciaazonosságot mutatnak az adott nukleotidszekvenciával, ha azt a később leírandó szekvenciaegyeztető programokkal, alapbeállítási paraméterek használatával határozzuk meg.

A szekvenciák egyeztetése az összehasonlítás céljából jól ismert a szakterületen. A százalékban kifejezett azonosság bármely két szekvencia között egy matematikai algoritmus alkalmazásával határozható meg. Az ilyen algoritmusokra nem korlátozó példaként említjük Myers és Miller algoritmusát [CABIOS 4, 11-17 (1988)], Smith és munkatársai lokális homológiát kereső algoritmusát [Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)], Needleman és Wunsch homológiaegyeztető algoritmusát [J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)], Pearson és Lipman hasonlóságkereső módszerét [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448 (1988)] vagy Kariin és Altschul algoritmusát [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264 (1990)], amit később szerzői módosítottak [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877 (1993)].

Az említett matematikai algoritmusok számítógépes alkalmazásai használhatók szekvenciák összehasonlítására a szekvenciaazonosság meghatározása céljából. Az ilyen alkalmazások közé tartozik például a CLUSTAL a PC/Gene programban (Intelligenetics, Mountain View, Ca.), az ALIGN program (2.0 verzió) vagy a GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA és TFASTA programok a Wisconsin Genetics Software Package 8. verziójában (GCG, Madison, Wi.). Az egyeztetés a programok alapbeállítási paramétereivel végezhető. A CLUSTAL programot többen is jól leírták [Higgins et a/., Gene 73, 237-244 (1988); CABIOS 5, 151-153 (1989); Corpet ef al., Nucl. Acids Rés. 16, 10 881-90 (1988); Huang ef al., Computer Appl. Biosci. 8, 155-165 (1992) és Pearson ef al., Methods in Mól. Bioi. 24, 307-331 (1994)]. Az ALIGN program Myers és Miller algoritmusán alapul. Aminosavszekvenciák összehasonlításakor az ALIGN a PAM120 súlymaradvány-táblázatot használja; a résért 4, a rés hosszáért 12 büntetőpontot ad. A BLAST programcsaládot Altschul ef al. dolgozták ki [J. Mól. Bioi. 215, 403 (1990)] Kariin és Altschul algoritmusa alapján. A nukleotidok keresését a BLASTN végzi (találat=100, szóhossz=12), hogy megtalálja egy találmány szerinti fehérjét kódoló nukleinsavszekvencia homológjait; a BLASTX olyan aminosavszekvenciákat keres, amelyek egy találmány szerinti fehérje vagy polipeptid homológjai (találat=50, szóhossz=3). Hézagos illesztés céljára a Gapped BLAST (a BLAST 2.0 verzióban) használható, míg a molekulák közötti távoli rokonság felfedésére a PSI-BLAST alkalmas [Altschul ef al., Nucl. Acids Rés. 25, 3389-3402 (1997)]. Ha a BLAST-ot, Gapped BLAST-ot vagy PSI-BLAST-ot használjuk, akkor a paraméterek alapbeállításait alkalmazhatjuk (például a BLATN-t a nukleotidszekvenciákhoz, a BLASTX-et a fehérjékhez). A BLAST szoftver nyilvánosan hozzáférhető a National Center fór Biotechnology Information honlapján át (http://www.ncbi.hlm.nih.gov). Az egyeztetés kézzel is elvégezhető.

Hacsak másként nem adjuk meg, az itt közölt szekvenciaazonosság- és/vagy -hasonlóság-értékeket a GAP programmal (10. verzió) számítottuk ki a következő paraméterek használatával: a százalékos azonosság kiszámításához a réssúly=50, a hosszsúly=3; a százalékos hasonlóság kiszámításához a réssúly=12, a hosszsúly=4. Használhatunk ezzel egyenértékű programokat is. „Egyenértékű” bármely olyan szekvencia-összehasonlító program, amely bármely két szekvencia között ugyanolyan nukleotid- vagy aminosavegyezéseket talál, és ugyanolyan fokú szekvenciaazonosságot határoz meg, mint az előnyös program.

A GAP Needleman és Wunsch (id. közi.) algoritmusát használja az egyezések megtalálására két teljes szekvencia között úgy, hogy maximálja az egyezések és minimalizálja a hézagok számát. A GAP figyelembe vesz minden lehetséges egyezést és hézagot, majd olyan illesztést készít, ahol legnagyobb az egyező bázisok és legkisebb a hézagok száma. Lehetővé teszi a hézagkészítés és hézagkiterjesztés büntetőpontozását az egyező bázisok egységében. A GAP-nek „profitot” kell elérnie minden egyes bevezetett hézag hézagkészítési büntetőpontjaiból. Ha a hézagkiterjesztés büntetőpontját zérónál nagyobbra választjuk meg, akkor a GAP-nek úgy kell profitot elérnie minden bevezetett hézag után, hogy annak büntetőpontjait megszorozza a hézagkiterjesztés büntetőpontjával. A hézagkészítés és hézagkiterjesztés büntetőpontjainak alapértékei fehérjeszekveciákhoz rendre 8 és 2 a Wisconsin Genetics Software Package 10. verziójában. Ugyanezek az értékek nukleinsavszekvenciákhoz 50 és 3. A hézagkészítés és hézagkiterjesztés büntetőpontjainak értékeit a 0 és 200 közötti egész számok közül választhatjuk ki; így például ezek egymástól függetlenül 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,15, 20, 25, 30, 35,40,45, 50, 55, 60, 65 vagy nagyobb számok lehetnek.

A GAP egyik tagja az illesztőprogramok családjának, de az összes többinél jobb minőségű. A GAP négy számmal mutatja be az illesztés jóságát: ezek a „Minőség, az „Arány”, az „Azonosság” és a „Hasonlóság”. A Minőség egy mérőszám a szekvencia egyezésének mértékére. Az Arány egyenlő a Minőség osztva a rövidebb szegmentum bázisainak számával. Az Azonosság a ténylegesen megegyező szimbólumok százalékos aránya, a Hasonlóság pedig a hasonló szimbólumoké. A hasonlóság akkor kap értéket, ha az értékadó mátrix értéke egy szimbólumpárra nagyobb vagy egyenlő 0,50-dal, a hasonlósági küszöbbel. A Wiscon8

HU 225 785 sin Genetics Software Package 10. verziója a BLOSUM62 értékadó mátrixot használja (Henikoff és Henikoff, id. közi.).

A fehérjék esetében a „változat egy olyan fehérje, amely egy natív fehérjéből származik egy vagy több aminosav elhagyásával (úgynevezett csonkítás) vagy hozzáadásával a natív fehérje N- vagy C-terminális végeinél; egy vagy több aminosav kivágásával vagy beépítésével a natív fehérje egy vagy több pontján; vagy egy vagy több aminosav kicserélésével (szubsztitúciójával) a natív fehérje egy vagy több pontján. Az ilyen változatok keletkezésének oka például a genetikai polimorfizmus vagy az emberi beavatkozás lehet.

A találmány szerinti fehérjék különböző utakon változtathatók meg, így aminosavak cseréjével, kihagyásával vagy inszertálásával, vagy csonkítással. Az ilyen módosítások módszerei általában ismertek a szakterületen. A mutagenezis módszerei és a nukleotidszekvencia megváltoztatásai jól ismertek a szakterületen [lásd például Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985); Kunkel ef a/., Meth. Enzymol. 154, 367-382 (1987); Walker és Gaastra (eds.): „Techniques In Molecular Biology”; MacMillan Publishing Co., New York, 1983; és a fentiekben idézett munkákat]. Az olyan aminosavcserékhez, amelyek nem befolyásolják a szóban forgó fehérje biológiai aktivitását, Dayhoff és munkatársai modelljében találunk útmutatást („Atlas of Protein Sequence and Structure”, Natl. Biomed. Rés. Found., Washington, D. C., 1978), amit itt referenciaként tartunk számon. Előnyösek a konzervatív szubsztitúciók, amikor egy aminosavat egy hasonló tulajdonságúval cserélünk ki.

[gy tehát a találmány szerinti gének és nukleotidszekvenciák magukban foglalják mind a természetes szekvenciákat, mind azok mutáns változatait. Hasonlóképpen, a találmány szerinti fehérjék is magukban foglalják mind a természetes fehérjéket, mind azok változatait és módosított formáit. Az ilyen változatok megőrzik a kívánt aktivitást. Magától értetődik, hogy a változatot kódoló DNS-ben végrehajtott mutáció nem helyezkedhet el a leolvasási kereten kívül, és előnyösen nem hoz létre olyan komplementer területeket, amelyek másodlagos mRNS-szerkezetek keletkezéséhez vezetnének (EP-A 75,444).

A találmány szerinti fehérjeszekvenciákban végrehajtott kihagyásoktól, beépítésektől és cseréktől nem várjuk el, hogy gyökeresen megváltoztassák a fehérje jellemzőit. Ha azonban bonyolult előre látni a csere, kihagyás vagy hozzáadás pontos hatását, akkor a szakemberek elfogadják, hogy a hatást rutin-szűrővizsgálattal kell megállapítani.

A nukleotidszekvenciák és fehérjék változataihoz tartoznak azok a nukleotidszekvenciák és fehérjék is, amelyek egy mutagén és rekombinánsokat eredményező eljárás, a DNS megkeverése útján keletkeznek. Egy ilyen eljárással egy vagy több különböző, ABA-asszociált kódolószekvencia módosítható úgy, hogy egy új, de a kívánt tulajdonságokat megőrző ABA-asszociált fehérjét hozzunk létre. Ezen a módon rekombináns polinukleotidok könyvtárai hozhatók létre hasonló szekvenciájú polinukleotidok egy populációjából, amely könyvtárak egymáshoz lényegesen hasonlító, illetve in vltro és in vivő egymással homológ módon rekombinálódó szekvenciákat tartalmaznak. A DNS megkeverésének stratégiái jól ismertek a szakterületen [Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10 747-10 751 (1994); Stemmer, Natúré 370, 389-391 (1994); Crameri ef a/., Natúré Biotech. 15, 436-438 (1997); Moore ef a/., J. Mól. Bioi. 272, 336-347 (1997); Zhang ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4504-4509 (1997); Cameri ef al., Natúré 391, 288-291 (1998); és az US 5,605,793 és 5,837,458 számú szabadalmi iratok].

A találmány szerinti ABA-asszociált szekvenciák expressziós keretekbe foglalva juttathatók be az érintett növényekbe. A keret 5’ és 3’ regulátorszekvenciákat tartalmazhat működőképes módon egy találmány szerinti ABA-asszociált szekvenciához kapcsolva. A „működőképes módon” kifejezés egy funkcionális kapcsolatot jelent egy promoter és egy második szekvencia között, ahol a promoterszekvencia indítja meg és közvetíti a második szekvenciának megfelelő DNSszekvencia transzkripcióját. Általában a „működőképes módon összekapcsolva” azt jelenti, hogy a nukleinsavszekvenciák folytatólagosan és ugyanabban a keretben vannak egyesítve. A keret adott esetben tartalmazhat még legalább egy további gént a szervezet kotranszformációja céljából. Más megoldásként a további gének több expressziós keretben is bejuttathatok.

Az ilyen expressziós keretek restrikciós helyek sokaságát tartalmazhatják a szóban forgó szekvencia beillesztése céljából a regulátorterületek transzkripciót szabályozó hatása alá. Az expressziós keretek adott esetben szelektálható markergéneket is tartalmazhatnak.

Az expressziós keret a transzkripció 5’->3' irányában tartalmaz egy transzkripciós és transzlációs kezdőterületet, egy találmány szerinti DNS-szekvenciát és egy transzkripciós és transzlációs terminátorterületet, amelyek működőképesek egy növényben. A transzkripciós kezdőterület, a promoter lehet natív, analóg, idegen vagy heterológ a gazdanövény számára. Emellett a promoter lehet egy természetes vagy egy szintetikus szekvencia. Az „idegen” jelző azt jelenti, hogy a transzkripciós kezdőterület eredetileg nem található meg abban a növényben, amelybe bejuttatjuk. Egy „kiméra gén egy kódolószekvenciát tartalmaz működőképes módon összekapcsolva egy olyan transzkripciós kezdőterülettel, amely heterológ a kódológénhez képest. Bár előnyös lehet a szekvenciákat heterológ promoterekkel kifejeztetni, használhatunk natív promoterszekvenciákat is. Ennek megfelelően megváltozik a növény vagy sejt fenotípusa.

A terminátorterület származhat a transzkripciós kezdőhellyel vagy az ahhoz kapcsolt DNS-szekvenciával azonos vagy eltérő forrásból. Kényelmesen használható terminátorterületek nyerhetők az A. tumefaciens Ti-plazmidjából; ilyenek az oktopin-szintetáz- és a nopalin-szintetáz-gének terminátorterületei [Guerineau ef al., Mól. Gén. Génét. 262, 141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64, 671-674 (1991); Sanfacon ef al.,

HU 225 785

Genes. Dev. 5, 141-149 (1991); Mogen ef al., Plánt Cell 2, 1261-1272 (1990); Munroe ef al., Gene 91, 151-158 (1990); Ballas ef al., Nucl. Acids Rés. 17, 7891-7903 (1989); Joshi ef al., Nucl. Acids Rés. 15, 9627-9639 (1987)].

Ahol az a megfelelő, a gén(ek) optimalizálható(k) a növényben való fokozott kifejeződés érdekében. így tehát a gének a növények által előnyben részesített kodonok felhasználásával szintetizálhatok. A növényekben előnyös gének szintézisének módszerei rendelkezésünkre állnak [US 5,380,831 és 5,463,391 számú szabadalmi iratok, valamint Murray et al., Nucl. Acids Rés. 17, 477-498 (1989); a hivatkozott közleményeket referenciaként tartjuk számon].

Ismertek másféle szekvenciamódosítások is, amelyekkel egy gén expressziója fokozható egy gazdasejtben. Ezek közé tartozik a gén kifejeződését megnehezítő, jól ismert szekvenciák eltávolítása: ilyenek a hamis poliadenilációs szekvenciák, az exon-intron tapadási helyek, a transzpozonszerű ismétlések és hasonlók. A szekvencia G/C aránya is beállítható az adott gazdasejtnek megfelelő átlagértékre, ami a sejt ismert génjeiből számítható ki. Ha lehetséges, a szekvenciát úgy módosítjuk, hogy elkerüljük a másodlagos „hajtű mRNS-szerkezetek keletkezését.

Az expressziós keret adott esetben tartalmazhat 5' vezetőszekvenciákat is a szerkezetében. Az ilyen vezetőszekvenciák fokozhatják a transzlációt. Az ismert transzlációvezetők közé tartoznak a következők: picornavírus-vezetők, például az EMCV-vezető [enkefalomiokarditisz 5’ nem kódoló terület; Elroy-Stein ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6126-6130 (1989)], potyvírus-vezetők, például a TEV- (dohány karcolatos vírus) vagy az MDMV- (kukorica törpe mozaik vírus) vezető [Allison ef al., Virology 154, 9-20 (1986)], a humán immunglobulin nehézlánc-kötő fehérje [BiP; Macejak ef al., Natúré 353, 90-94 (1991)], a lucernamozaik-vírus köpenyfehérje mRNS-ének nem lefordított vezetője [AMV RNA4; Jobbling ef al., Natúré 325, 622-625 (1987)], a dohánymozaik-vírus vezetője [TMV; Gallie et al., in „Molecular Biology of RNA”, pp. 237,256; Cech (ed.), Liss, New York, 1989] és a kukorica klorotikus foltosság vírus vezetője [MCMV; Lömmel ef al., Virology 81, 382-385 (1991)]. A fentiekről lásd még Della-Cioppa és munkatársai közleményét [Plánt Physiol. 84, 965-968 (1987)]. A transzláció fokozására más, ismert módszerek, például intronok alkalmazása és hasonlók is használhatók.

Az expressziós keret elkészítése során a különböző DNS-fragmentumok manipulálhatók például úgy, hogy a szekvenciák a megfelelő irányultságúak és a megfelelő leolvasási keretben legyenek. A manipulációk közé tartozik adapterek vagy linkerek alkalmazása a DNS-fragmentumok egyesítéséhez, vagy más műveletek, például kényelmesen használható restrikciós helyek biztosítása, felesleges DNS-szakaszok és restrikciós helyek eltávolítása és a többi. Erre a célra in vitro mutagenezis, primerjavítás, restrikció, összeolvasztás és reszubsztitúciók, például áthelyezések és átfordítások alkalmazhatók.

A transzformáció, valamint a nukleotidszekvenciák növényekbe juttatásának módja a megcélzott növény vagy növényi sejt típusától (például egy- vagy kétszikű) függhet. A nukleotidszekvenciák növényi sejtekbe juttatására, majd azt követően a növény genomjába való beépítésére alkalmas módszerek közé tartozik a mikroinjektálás [Crossway ef al., Biotechniques 4, 320-334 (1986)], az elektroporáció [Riggs ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5602-5606 (1986)], az Agrobacteriummal közvetített transzformáció (US 5,563,055 és 5,981,840), a közvetlen géntranszfer [Paszkowszki ef al., EMBO J. 3, 2717-2722 (1984)] és a ballisztikus részecskegyorsítás [US 4,945,050; Tömés ef al., in „Plánt Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods; Gamborg és Phillips (eds.), Springer Verlag, Berlin, 1995; McCabe etal., Biotechnology 6, 923-926 (1988)]. A témával kapcsolatban lásd még Weissinger és munkatársai [Annu. Rév. Génét. 22, 421-477 (1988)], Sanford és munkatársai [Particulate Science and Technology 5, 27-37 (1987), hagyma], Christou és munkatársai [Plánt Physiol. 87, 671-674 (1988), szója], McCabe és munkatársai [Bio/Technology 6, 923-926 (1988), szója], Finer és McMullen [In Vitro Cell Dev. Bioi. 27P, 175-182 (1991), szója], Singh és munkatársai [Theor. Appl. Génét. 96, 319-324 (1998), szója], Datta és munkatársai [Biotechnology 8, 736-740 (1990), rizs], Klein és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4305-4309 (1988), kukorica], Klein és munkatársai [Biotechnology 6, 559-563 (1988), kukorica], Klein és munkatársai [Plánt Physiol. 91, 440-444 (1988), kukorica], Fromm és munkatársai [Biotechnology 8, 833-839 (1990), kukorica], Hooykaas-VanSIogteren és munkatársai [Natúré 311, 763-764 (1984)], Bytebier és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5345-5349 (1987), liliomfélék], De Wet és munkatársai [in „The Experimental Manipulation ofövule Tissues, pp. 197-209 (pollen), Chapman ef al. (eds.), Longman, New York, 1985], Kaeppler és munkatársai [Plánt Cell Reports 9, 415-418 (1990) és Theor. Appl. Génét. 84, 560-566 (1992), habveréssel segített transzformáció], D’Halluin és munkatársai [Plánt Cell 4, 1495-1505 (1992), elektroporáció], Li és munkatársai [Plánt Cell Reports 12, 250-255 (1993), rizs], Christou és Ford [Annals of Botany 75, 407-413 (1995), rizs] és Osjoda és munkatársai [Natúré Biotechnology 14, 745-750 (1996), kukorica Agrobacterium tumefaciensen át] közleményeit, valamint az US 5,240,855, 5,322,783, 5,324,646 és 5,736,369 számú szabadalmi iratokat, amelyeket referenciaként tartunk számon.

A transzformált sejtekből növények nevelhetők fel szokványosnak tekinthető módszerekkel [lásd például McCormick et al., Plánt Cell Reports 5, 81-84 (1996)]. A felnevelt növények ezután megtermékenyíthetők ugyanabból vagy más transzformált klónból származó virágporral, és az így kapott hibridekben azonosítható a kívánt fenotípusos tulajdonság konstitutív kifejeződése. Két vagy több nemzedéket lehet felnevelni, hogy meggyőződhessünk a kívánt fenotípusos tulajdonság konstitutív kifejeződésének állandósulásáról és örökle10

HU 225 785 tessé válásáról, azaz a magvakkal való átvihetőségéről egyik nemzedékből a másikba.

A találmány szerinti eljárások bármely növényfaj, mind egyszikűek, mind kétszikűek transzformálására alkalmasak, mint amilyenek a kukorica (Zea mays), a káposztafajok (Brassica napus, B. rapa. B juncea), különösen azok a Srass/ca-fajok, amelyek magvai olajforrásként használhatók, a lucerna (Medicago sativa), a rizs (Oryza sativa), a rozs (Secale cereale), a cirok (Sorghum bicolor, S. vulgare), a gyöngyköles (Pennisetum glaucum), a köles (Panicum miliaceum), az olasz muhar (Setaria italica), az ujjas muhar (Eleusine coracana), a napraforgó (Helianthus annuus), az olajözön (Carthamus tinctorius), a búza (Triticum aestivum), a szója (Glycine max), a dohány (Nicotiana tabacum), a burgonya (Solanum tuberosum), a földimogyoró (Arachis hypogaea), a gyapot (Gossypium barbadense, G. hirsutum), az édesburgonya (Ipomoea batatas), a tápióka (Manihot esculenta), a kávé (Coffea spp.), a kókusz (Cocos nucifera), az ananász (Ananas comosus), a citrusok (Citrus spp.), a kakaó (Theobroma cacao), a tea (Camellia sinensis), a banán (Musa spp.), az avokádó (Persea americana), a füge (Ficus caríca), a guava (Psidium guajava), a mangó (Mangifera indica), az olajfa (Olea europaea), a papaja (Caríca papaya), a kesu (Anacardium occidentale), a Macadamia integrifolia, a mandula (Prunus amygdalus), a cukorrépa (Béta vulgáris), a cukornád (Saccharum spp.), a zab, az árpa, zöldségnövények, dísznövények és tűlevelűek; a felsorolás nem kizáró jellegű.

A zöldségnövények közé tartozik a paradicsom (Lycopersicon esculentum), a saláta (Lactuca sativa), a zöldbab (Phaseolus vulgáris), a limabab (Phaseolus limensis), a borsó (Pisum sativum) és a Cucumis nemzetség fajai (C. sativus, C. cantalupensis, C. meló). A dísznövények közé tartozik az azálea (Rhododendron spp.), a hortenzia (Hydrangea macrophylla), a mályvarózsa (Hybiscus rosanensis), a rózsa (Rosa spp.), a tulipán (Tulipa spp.), a nárcisz (Narcissus spp.), a petúnia (Petúnia hybrida), a szegfű (Dianthus caryiphyllus), a mikulásvirág (Euphorbia pulcherrima) és a krizantém. A találmányunk gyakorlatában alkalmazható tűlevelűek közé tartozik a Pinus tadea, P. elliotii, P. ponderosa, P. contorta és P. radiata, a Pseudotsuga menziesii, a Tsuga canadensis, a Picea glauca, a Sequoia sempervirens, az Abies amabilis és az A. balsamea, a Thuja plicata és a Chamaecyparis nootkatensis. A találmány szerinti növények előnyösen haszonnövények (például rizs, kukorica, lucerna, napraforgó, Srass/ca-fajok, szója, gyapot, olajözön, földimogyoró, cirok, köles, búza, dohány és a többi), előnyösebben kukorica-, rizs- és cirokfajták.

Különösen fontosak a gabonafélék, az olajos magvúak és a hüvelyesek. A gabonamagvak közül fontos a kukorica, búza, árpa, rizs, cirok, rozs és a többi. Az olajos magvúak közé tartozik a gyapot, szója, olajözön, napraforgó, repce, kukorica, lucerna, olajpálma, kókusz és a többi. A hüvelyesek közé tartoznak a babok és borsók. A babok közé tartozik a guarbab, szentjánoskenyér, görögszéna, szója, a veteménybabok, tehénborsó, mungóbab, limabab, lóbab, a lencsék, csicseriborsó és a többi.

Az alábbi példák csak a bemutatást szolgálják, és nem korlátozzák találmányunk oltalmi körét.

1. példa

Kukorica transzformálása részecskebombázással és a transzgén növények felnevelése Üvegházban nevelt kukoricanövényekről nyert, éretlen embriókat bombázunk egy plazmiddal, amely az ABI3 szekvenciát, egy működőképes módon hozzákapcsolt korai mag/embrió promotert és egy szelektálható markergént [PAT; Wohlleben et al., Gene 70, 25-37 (1988)] tartalmaz, ami a bialafosz herbiciddel szembeni rezisztenciát kódolja. Más megoldásként a szelektálható markergént külön plazmidban juttatjuk be. A transzformáció módját és a tápközegek receptjeit az alábbiakban közöljük.

A célszövet előkészítése

A kukoricacsöveket lefosztjuk, és felületüket 30%-os Clorox fehérítőt és 0,5% Micro detergenst tartalmazó oldattal fertőtlenítjük 20 percen át, majd steril vízzel kétszer leöblítjük. Az éretlen embriókat kimetsszük, és az embriótengellyel lefelé (a scutellummal felfelé) 560Y táptalajba ágyazzuk (25 embriót lemezenként) 4 órára, majd elrendezzük azokat a bombázás 2,5 cm-es célfelületére.

A DNS előkészítése

Elkészítünk egy plazmidvektort, amely ABI3 szekvenciát tartalmaz működőképes módon összekapcsolva egy korai mag/embrió promoterrel. Ezt a plazmidDNS-t és a PAT szelektálható markert tartalmazó plazmid-DNS-t 1,1 pm átlagos átmérőjű volfrámszemcsékre csapatjuk ki egy kalcium-kloridos eljárással, amihez a következő anyagokat használjuk:

100 pl előkészített volfrámszemcse vízben, μΙ (1 pg) DNS Tris-EDTA pufferben (összesen pg DNS),

100 pl 2,5 M kalcium-klorid-oldat és 10 pl 0,1 M spermidinoldat.

Az egyes reagenseket egymás után adjuk a volfrámszemcsék szuszpenziójához folytonos keverés közben. A végső elegyet ultrahanggal röviden kezeljük, majd keverés közben inkubáljuk 10 percen át. A kicsapódási idő után a csöveket lecentrifugáljuk, a folyadékot leöntjük, az üledéket 500 pl 100%-os etanollal mossuk és 30 másodpercig centrifugáljuk. A folyadékot újra eltávolítjuk, majd a kész volfrámszemcse-üledékhez 105 pl 100%-os etanolt adunk. A bombázáshoz a volfrám/DNS szemcséket ultrahanggal röviden kezeljük, 10 μΙ-t helyezünk minden makrohordozó közepére, és 2 percen át száradni hagyjuk a bombázás előtt.

Kezelés a szemcsékkel

A mintalemezeket a 4-es szinten bombáztuk HE34—1 vagy HE34-2 részecskeágyúval. Minden minta egy lövést kapott 4472 kPa nyomással; csövenként 10 aliquot szemcse/DNS szuszpenziót használunk fel.

További kezelések

A bombázás után az embriókat az 560Y tápközegben tartjuk 2 napon át, majd átrakjuk az 560R tápkö11

HU 225 785 zegbe, amely 3 mg/l bialafoszt tartalmaz. Itt körülbelül 10 héten át neveljük, miközben kéthetente felfrissítjük a tápközeget. Ezután a szelekcióra rezisztens kalluszokat átrakjuk a 288J tápközegbe, ahol megindul a növény regenerálódása. A szomatikus embriók érése (2-4 hét) után a jól fejlődő szomatikus embriókat csíráztató tápközegbe tesszük át, és megvilágított tenyésztőszobában helyezzük el. Körülbelül 7-10 nappal később a fejlődő növénykéket a 272V hormonmentes táptalajra visszük át kémcsövekbe, 7-10 napra, amíg a növénykék jól beállnak. Ezután átültetjük azokat 6,5 cm-es cserepekbe, talajba, 1 hétig neveljük tenyésztőkamrában, további 1-2 hétig üvegházban, majd újra átültetjük 6 l-es dézsákba és teljesen felneveljük. A növényeket megfigyeljük és értékeljük.

Tápközegek

560Y (bombázó tápközeg): 4,0 g/l N6 alapsókeverék (Sigma, C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-féle vitaminkeverék (1000x Sigma-1511), 0,5 mg/l tiamin-hidroklorid, 120,0 g/l szacharóz, 1,0 mg/l 2,4-D és 2,88 g/l L-prolin; desztillált vízzel feltöltjük a kívánt térfogatra, a pH-t 5,8-re állítjuk kálium-hidroxiddal; hozzáadunk 2,0 g/l Gelrite-et, sterilizáljuk, majd lehűlés után 8,5 mg/l ezüst-nitrátot adunk hozzá.

560R (szelektáló tápközeg): 4,0 g/l N6 alapsókeverék, 1,0 ml Eriksson-féle vitaminkeverék, 0,5 mg/l tiamin-hidroklorid, 30,0 g/l szacharóz és 2,0 mg/l 2,4-D; desztillált vízzel feltöltjük a kívánt térfogatra, a pH-t 5,8-re állítjuk kálium-hidroxiddal; hozzáadunk 3,0 g/l Gelrite-et, sterilizáljuk, majd lehűlés után 0,85 mg/l ezüst-nitrátot és 3,0 mg/l bialafoszt adunk hozzá.

288J (regeneráló tápközeg): 4,3 g/l MS sókeverék (Gibco 11117-074), 5,0 ml/l MS vitamintörzsoldat [0,100 g/l nikotinsav, 0,02 g/l tiamin-hidroklorid, 0,10 g/l piridoxin-hidroklorid és 0,40 g/l glicin desztillált vízben; Murashige és Skoog, Physiol. Plánt. 15, 473 (1962)], 100 mg/l mioinozitol, 0,5 mg/l zeatin, 60 g/l szacharóz és 1,0 ml/l 0,1 mM abszcizinsav; desztillált vízzel feltöltjük a kívánt térfogatra, a pH-t 5,6-re állítjuk, hozzáadunk 3,0 g/l Gelrite-et, sterilizáljuk, majd 60 °C-ra való lehűlés után 1,0 mg/l indol-ecetsavat és 3,0 mg/l bialafoszt adunk hozzá.

272V (hormonmentes tápközeg): 4,3 g/l MS sókeverék, 5,0 ml MS vitamintörzsoldat, 0,1 g/l mioinozitol és 40,0 g/l szacharóz; desztillált vízzel feltöltjük a kívánt térfogatra, a pH-t 5,6-re állítjuk, hozzáadunk 6 g/l Bacto-agart, sterilizáljuk és 60 °C-ra lehűtjük.

2. példa

Agrobacterium-közvef/fésű transzformálás

A kukorica Agroöacfer/um-közvetítésű transzformálásához egy ABI3 szekvenciával és a működőképes módon hozzá kapcsolt korai mag/embrió promoterrel előnyösen Zhao eljárását alkalmazzuk (US 5,981840 és WO 98/32326 számú szabadalmi iratok, amelyeket referenciaként tartunk számon). Röviden, éretlen embriókat izolálunk a kukoricáról, majd azokat egy Agroőacfenum-szuszpenzióval érintkeztetjük, ahol a baktérium képes az ABI3 szekvenciát és a működőképes módon hozzá kapcsolt korai mag/embrió promotert átvinni legalább egy éretlen embrió legalább egy sejtjébe (1. lépés: a fertőzés). Ebben a lépésben az éretlen embriót előnyösen bemerítjük egy Agrobacterium-szuszpenzióba a fertőzés megindításához. Ezután az embriókat az Agrobacteríummal együtt tenyésztjük (2. lépés: a közös tenyésztés). Az éretlen embriókat a fertőzési lépés után előnyösen egy szilárd táptalajon tenyésztjük. A közös tenyésztés után adott esetben egy „pihentető lépést is beiktathatunk, amikor az embriókat legalább egy olyan antibiotikum jelenlétében inkubáljuk, amely tudottan gátolja az Agrobacterium szaporodását, de nem alkalmazunk olyan szert, amely szelektálná a transzformált növényeket (3. lépés: a pihentetés). A következő lépésben az inokulált embriókat egy szelektálószert tartalmazó táptalajon tenyésztjük, ahonnan megkapjuk a növekedő, transzformáit kalluszokat (4. lépés: a szelekció). A kalluszokat növényekké regeneráltatjuk (5. lépés: a regeneráció), azaz a szelektív táptalajon növekedő kalluszokat előnyösen szilárd táptalajon tenyésztve növényekké neveljük fel.

3. példa

Szójacsíra transzformálása

A szójacsírákat egy olyan plazmiddal, ágyúzással transzformáljuk, amely az ABI3 nukleotidszekvenciát tartalmazza egy működőképes módon hozzá kapcsolt korai magbél/embrió promoterrel együtt. A szomatikus embriók indukálásához 3-5 mm hosszúságú szikleveleket metszünk ki az A2872 szójafajta sterilezett felszínű, éretlen magvaiból, majd megvilágításban vagy sötétben, 26 °C-on neveljük azokat egy megfelelő, agaros táptalajon, 6-10 héten át. A másodlagos szomatikus embriókat ezután kivágjuk és egy megfelelő tápfolyadékba tesszük. A szomatikus embriókat ismételten szelektálva kiválasztjuk azokat, amelyek korai, globuláris állapotú embrióként szaporodnak, majd ezekből szuszpenziótenyészetet készítünk az alábbiak szerint.

A szója embriogén szuszpenziótenyészetet 35 ml tápfolyadékban, forgó rázógépen (150 f/perc), 26 °C hőmérsékleten, fluoreszcensz fényben, 16/8 órás fény/sötét ciklus mellett tartjuk fenn. A tenyészeteket kéthetente felújítjuk, amikor körülbelül 35 mg szövetet viszünk át 35 ml friss tápfolyadékba.

A szója embriogén szuszpenziótenyészetet a részecskebelövéses módszerrel transzformáljuk [Klein et al., Natúré 327, 70-73 (1987); US 4,945,050], A transzformáláshoz egy DuPont Biolistic PDS1000/HE (héliumtöltésű) készüléket használunk.

A szelektálható jelzőgén, ami a szója transzformálását segíti, egy transzgén készítmény, ami a karfiolmozaik-vírus [CMV; Odell et al., Natúré 313, 810-812 (1985)] 35S promoteréből, az E. coli higromicin-foszfotranszferáz-génjéből [a pJR225 plazmidból véve; Gritz et al., Gene 25, 179-188 (1983)] és az Agrobacteríum tumefaciens Ti-plazmidja T-DNS-ében lévő nopalinszintetáz-gén 3’-területéből van összeépítve. Az ABI3 nukleotidszekvenciát és a hozzá működőképes módon kapcsolt korai magbél/embrió promotert tartalmazó expresszíós keretet restrikciós fragmentumként

HU 225 785 izolálhatjuk, ami azután beépíthető a jelzőgént hordozó vektor egy egyedi restrikciós helyére.

Az 1 pm szemcseméretű aranyszemcse-szuszpenzió (60 mg/ml) 50 μΙ-éhez sorban 5 μΙ DNS-oldatot (1 μθ/μΙ), 20 μΙ spermidinoldatot (0,1 M) és 50 μΙ kalcium-klorid-oldatot (2,5 M) adunk. Ezután a készítményt 3 percen át rázzuk, majd egy mikrocentrifugában 10 s-ig ülepítjük, és a felülúszót eltávolítjuk. A DNS-sel bevont szemcséket 400 μΙ 70%-os etanollal mossuk, és 40 μΙ vízmentes etanolban felszuszpendáljuk. A DNS/szemcse szuszpenziót háromszor 1 s-ig ultrahanggal kezeljük, majd 5 μΙ-es adagokat teszünk minden makrohordozókorongra.

A kéthetes szuszpenziótenyészetből körülbelül 300-400 mg-ot teszünk egy üres, 60*15 mm-es Petricsészébe, és a felesleges tápfolyadékot pipettával eltávolítjuk. Minden transzformációs kísérletben körülbelül 5-10 szövetmintát ágyúzunk. A membránt átszakító nyomást 7568 kPa-ra állítjuk be, a kamrában 94,92 kPa vákuumot létesítünk. A szövetmintát körülbelül 8,9 cm-re tesszük a visszatartó rácstól, majd három lövést adunk le rá. Az ágyúzás után a szövetet két részre osztjuk, és friss tápfolyadékban tenyésztjük tovább a fent leírt módon.

A transzformálás utáni 5-7. napon a tápfolyadékot frissre cseréljük, majd a 11-12. napon újra friss, de 50 mg/ml higromicint tartalmazó tápfolyadékra. Ezt a szelektáló tápfolyadékot hetente cseréljük. A transzformálás után 7-8 héttel zöld, transzformált szövet figyelhető meg, amint kinő a transzformálatlan, nekrotikus embriogén sejthalmazokból. A zöld szövetet izoláljuk, és egyedi palackokba oltva, új kiónokként tenyésztjük tovább a transzformált embriogén szuszpenziótenyészeteket. Minden új vonalat független transzformációs eseményként kezelünk. Ezután a szuszpenziókat fióktenyészetekre osztjuk, és vagy éretlen embriók halmazaként tenyésztjük tovább, vagy teljes növényeket regenerálunk belőlük az egyes embriók megérlelése és csíráztatása útján.

4. példa

Napraforgó-merisztéma transzformálása

A napraforgó-merisztémát egy olyan expressziós kerettel transzformáljuk, amely az ABI3 szekvenciát tartalmazza működőképes módon összekapcsolva egy korai magbél/embrió promoterrel [lásd az EP 486233 számú szabadalmi iratot, illetve Malone-Schoneberg ef a/., Plánt Sci. 103, 199-207 (1994) közleményét]. Érett napraforgómagvakat (Helianthus annuus L.) kalászcséplővel lehántolunk, majd a magbelek felszínét 20%-os, 50 ml-enként 2 csepp Tween 20-at tartalmazó Chlorox fehérítőszerrel fertőtlenítjük 30 percen át. Az így kezelt magbeleket steril desztillált vízzel kétszer leöblítjük.

Embriótengely-preparátumot készítünk Schrammeijer és munkatársai módosított eljárásával [Plánt Cell Rep. 9, 55-60 (1990)]. A magvakat a fertőtlenítés után 60 percre desztillált vízbe áztatjuk. Ezután az egyes magok szikleveleit kitörjük az embriótengely síkjában, levágjuk a gyökércsúcsot, majd az embriót hosszában kettévágjuk a két elsődleges levél között. A két féldarabot ezután vágott felszínükkel felfelé GBA táptalajra fektetjük, ami Murashige-Skoog-nyomelemoldatot [Murashige ef a/., Physiol. Plánt. 15, 473-479 (1962)], Shepard-féle vitaminadalékot (Shepard, in „Emergent Techniques fór the Genetic Improvement of Crops”; Univ. Minnesota Press, St. Paul. Mi., 1980), 40 mg/l adenin-szulfátot, 30 g/l szacharózt, 0,5 mg/l 6-benzil-amino-purint (BAP), 0,25 mg/l indol-3-ecetsavat (IAA), 0,1 mg/l gibberellinsavat (GA₃) és 8 g/l Phytagart tartalmaz; pH-ja 5,6.

Az explantátumokat mikroszemcsés ágyúzással kezeljük az Agrobacterium-os kezelés előtt [Bidney et al., Plánt Mól. Bioi. 18, 301-313 (1992)]. Ehhez 30-40 embriótengelyt helyezünk el körben, a 60*20 mm-es lemez közepén. Körülbelül 4,7 mg, 1,8 μπι átmérőjű volfrámszemcsét elszuszpendálunk 25 ml steril TE-pufferben (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH=8,0), majd a szuszpenzióból lövésenként 1,5 ml-eket használunk fel. Minden lemezre kétszer lövünk egy 150 mm-es Nytex hálón át, ami 2 cm-rel van a minta felett kifeszítve. Az ágyúzáshoz egy PDS 1000 szemcsegyorsító készüléket használunk.

„Hatástalanított Agrobacterium tumefaciens törzset (EHA105) használunk minden transzformációs kísérletben. Egy kettős plazmidvektort - amely az ABI3 gént és a működőképes módon hozzákapcsolt korai magbél/embríó promotert tartalmazó expressziós keretet hordozza - juttatunk az EHA105 Agrobacterium törzsbe Holster és munkatársai fagyasztás-olvasztás módszerével [Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 (1978)]. Ez a plazmid tartalmaz még egy szelektálható jelzőgént is (kanamicinrezisztencia, nptll). A növények transzformálásához a baktériumot egy éjszakán át tenyésztjük (28 °C, 100 f/perc állandó rázás) YEP tápfolyadékban [10 g/l élesztőkivonat, 10 g/l pepton (Bacto) és 5 g/l nátrium-klorid, pH=7,0], a megfelelő antibiotikumokkal kiegészítve, amelyek a baktériumtörzs és a kettős plazmid fenntartásához szükségesek. A szuszpenziót akkor használjuk, amikor 600 nm-nél mért optikai sűrűsége körülbelül 0,4-0,8 lesz. Ekkor a sejteket kiülepítjük, majd felszuszpendáljuk OD₆₀₀=0,5 sűrűségre egy inokuláló tápfolyadékban, ami 12,2 mM MES-t (pH=5,7), 1 g/l ammónium-kloridot és 0,3 g/l magnézium-szulfátot tartalmaz.

A frissen ágyúzott explantátumokat az Agrobacteríum-szuszpenzióba tesszük, elkeverjük, majd 30 percre állni hagyjuk. Ezután áttesszük azokat a GBA táptalajra, vágott felszínükkel lefelé, és 26 °C-on, 18 órás megvilágítás mellett inkubáljuk. Három nap múlva az explantátumokat áttesszük a 374B táptalajra (GBA táptalaj növekedésszabályozók nélkül és 1%-ra csökkentett szacharóztartalommal), ami 250 mg/l cefotaximmal és 50 mg/l kanamicin-szulfáttal van kiegészítve. Ezen tenyésztjük az explantátumokat 2-5 héten át szelektálás céljából, majd áttesszük friss, kanamlclnt nem tartalmazó 374B táptalajra, 1-2 hétre, a továbbfejlődés céljából. A differenciálódó, antibiotikumrezisztens, de kivágásra alkalmas hajtást nem hozó explantátumokat újra GBA táptalajra (250 mg/l cefotaxim) tesszük egy

HU 225 785 második, 3 napos hormonkezelésre. A zöld, kanamicinrezisztens hajtásokról vett levélmintákat ELISA-val megvizsgáljuk az NPTII jelenlétére, valamint az átvitt gén expressziójára azzal, hogy ellenőrizzük a növény válaszát az ABA-ra.

Az NPTII-pozitív hajtásokat a Pioneer® 6440 hibrid napraforgó-csíranövények gyökérnyakába oltjuk. A csíranövényeket in vitro neveljük: sterilezett felszínű magvakat csíráztatunk 48-0 táptalajon (félerősségű MS-sóoldat, 0,5% szacharóz, 0,3% Gelrite, pH=5,6), az explantátumtenyészet körülményei között. A csíranövények felső részét levágjuk, a hajtást függőleges irányban, 1 cm hosszan bevágjuk, és a transzformált hajtást a vágásba illesztjük. Az egész területet Parafilmbe tekerjük, hogy a hajtást biztosítsuk. Az oltott növényeket 1 hetes in vitro nevelés után talajba ültetjük át, előbb magas páratartalom mellett neveljük, majd lassan akklimatizáljuk az üvegházi körülményekhez. Az üvegházban felnevelt T_o növények (szülői generáció) transzformált szektorait például NPTII ELISA-val azonosítjuk levélkivonatokból, az NPTII-pozitív T_o növényekről szedett transzgén magvakat pedig úgy ellenőrizzük, hogy megvizsgáljuk a növény ABA-ra adott válaszának módosulását.

5. példa

Kukorica transzformálása

Transzgén kukoricanövényeket hozunk létre az 1. példában leírt módon, egy olyan DNS-szerkezetet használva, amely egy vad típusú Vp1 szekvenciát (1. számú szekvenciavázlat) tartalmaz működőképes módon egy oleozinpromoterhez kapcsolva. A plazmid része még a PAT szelektálható jelzőgén is [Wohlleben et a/., Gene 70, 25-37 (1998)]. Amint az 1. példában leírtuk, izoláljuk azokat a növényeket, amelyekbe az oleozin:Vp1 DNS-szerkezet stabilan beépült.

Eyster és munkatársai módszerével izoláljuk azokat a növényeket, amelyekben a vp1 funkcióvesztéssel járó mutációja jelent meg [Genetics 16, 574-590 (1931); referenciaként tartjuk számon]. Az ilyen növényeket a csökkent ABA-érzékenység jellemzi. A stabilan beépült oleozin:Vp1 DNS-szerkezetet hordozó, transzgén kukoricanövényeket ezután funkcióvesztett vp1-mutáns növényekkel keresztezzük. Az így kapott utódokat visszakeresztezve olyan növényt kapunk, amelynek genotípusa vp1/vp1; oleozin:Vp1/oleozin:Vp1. Ebben a növényben nem érvényesül az ABA káros hatása a korai embrióra, de működni fog benne a Vp1 a késői magbél/embrió fejlődés során, és lehetővé teszi a magbél normális beérését.

A leírásban idézett összes közlemény és szabadalmi irat azt a szakmai szintet jelzi a szakemberek számára, amelyen találmányunk is elhelyezkedik. Az összes idézett közleményt és szabadalmi iratot referenciaként tartjuk számon ugyanolyan mértékben, mintha az egyes közleményeknél és szabadalmi iratoknál kifejezetten feltüntettük volna ezt a tényt.

Bár találmányunkat részletesen leírtuk a bemutatás céljával, és példákkal illusztráltuk a világosabb érthetőség kedvéért, nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatások és módosítások végezhetők azon az igénypontok oltalmi körén belül.

(SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE) SEQUENCE LISTING <110> Helentjaris, Tim <120> Modulation of Abscisic Acid <130> 35718/205302 <150> US 60/166,080 <151> 1999-11-17 <160> 13 <170> FastSEQ fór Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2456 <212> DNA <213> Zea mays <220>

<221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> vpl cDNA (Genbank Accession No. M60214) <221> CDS <222> (73)...(2148)

HU 225 785 <400> 1 ctacacccga gaggcggcgg cggcagacac agacaccgtc tctctcctcc ctttgtcgtc gtgcctctct gc atg gaa gcc tcc tcc ggc tcg tcg cca ccg cac tcc caa

Met Glu Alá Ser Ser Gly Ser Ser Pro Pro His Ser Gin 15 10

111

gag Glu

aac Asn 15

ccg Pro

ccg Pro

gag Glu

cac His

ggt Gly 20

ggc Gly

gac Asp

atg Met

gga Gly

ggg Gly 25

gcc Alá

ccc Pro

gcg Alá

gag Glu

gag

atc

gga

ggg

gag

gcg

gcg

gat

gac

ttc

atg

ttc

get

gaa

gac

acg

Glu

Ile

Gly

Gly

Glu

Alá

Alá

Asp

Asp

Phe

Met

Phe

Alá

Glu

Asp

Thr

30

35

40

45

ttc

ccc

tcc

ctc

ccg

gac

ttc

cet

tgc

ctt

tcg

tcg

ccg

tcc

agc

tcc

Phe

Pro

Ser

Leu

Pro

Asp

Phe

Pro

Cys

Leu

Ser

Ser

Pro

Ser

Ser

Ser

50

55

60

acc

ttc

tcg

tcc

aac

tcc

tcg

tea

aac

tcc

tcc

agc

gcc

tac

acc

aac

Thr

Phe

Ser

Ser

Asn

Ser

Ser

Ser

Asn

Ser

Ser

Ser

Alá

Tyr

Thr

Asn

65

70

75

acg

gca

gga

aga

gcc

ggc

ggc

gag

ccc

tcc

gag

cet

get

tcg

gcc

gga

Thr

Alá

Gly

Arg

Alá

Gly

Gly

Glu

Pro

Ser

Glu

Pro

Alá

Ser

Alá

Gly

80

85

90

gaa

ggg

ttt

gat

gcg

ctc

gat

gac

atc

gac

cag

ctc

ctc

gac

ttc

gcg

Glu

Gly

Phe

Asp

Alá

Leu

Asp

Asp

Ile

Asp

Gin

Leu

Leu

Asp

Phe

Alá

95

100

105

tcg

ctt

tcc

atg

ccg

tgg

gac

tcc

gag

ccg

ttc

ccg

ggg

gtt

agc

atg

Ser

Leu

Ser

Met

Pro

Trp

Asp

Ser

Glu

Pro

Phe

Pro

Gly

Val

Ser

Met

110

115

120

125

atg

cta

gag

aac

gcc

atg

tcg

gcg

ccg

ccg

cag

ccg

gtg

ggc

gac

ggc

Met

Leu

Glu

Asn

Alá

Met

Ser

Alá

Pro

Pro

Gin

Pro

Val

Gly

Asp

Gly

130

135

140

atg

agt

gaa

gag

aaa

gcc

gtg

ccg

gaa

ggg

acc

acg

ggg

gga

gag

gag

Met

Ser

Glu

Glu

Lys

Alá

Val

Pro

Glu

Gly

Thr

Thr

Gly

Gly

Glu

Glu

145

150

155

gcc

tgc

atg

gat

gcg

tcg

gag

ggg

gag

gag

ctg

ccg

egg

ttc

ttc

atg

Alá

Cys

Met

Asp

Alá

Ser

Glu

Gly

Glu

Glu

Leu

Pro

Arg

Phe

Phe

Met

160

165

170

gag

tgg

ctc

acg

agc

aac

ege

gaa

aac

atc

tcg

gcc

gag

gat

ctc

ege

Glu

Trp

Leu

Thr

Ser

Asn

Arg

Glu

Asn

Ile

Ser

Alá

Glu

Asp

Leu

Arg

175

180

185

ggg

atc

ege

ctc

ege

ege

tcc

acc

atc

gag

gcc

gcc

gcc

gcc

egg

ctc

Gly

Ile

Arg

Leu

Arg

Arg

Ser

Thr

Ile

Glu

Alá

Alá

Alá

Alá

Arg

Leu

190

195

200

205

ggc

ggc

ggg

ege

cag

ggc

acc

atg

cag

ctg

ctc

aag

ctc

atc

ctc

acc

Gly

Gly

Gly

Arg

Gin

Gly

Thr

Met

Gin

Leu

Leu

Lys

Leu

Ile

Leu

Thr

210

215

220

159

207

255

303

351

399

447

495

543

591

639

687

735

HU 225 785

tgg Trp

gtg Val

cag Gin

aac Asn 225

cac His

cac His

ctc Leu

cag Gin

agg Arg 230

aag Lys

ege Arg

ccg Pro

ege Arg

gac Asp 235

gtg Val

atg Met

783

gag

gag

gag

gcg

ggc

ctg

cac

gtc

cag

ctc

ccc

agc

ccg

gtc

gcc

aac

831

Glu

Glu

Glu

Alá

Gly

Leu

His

Val

Gin

Leu

Pro

Ser

Pro

Val

Alá

Asn

240

245

250

cca

cca

gga

tac

gag

ttc

ccc

gcc

ggc

gga

cag

gac

atg

gcc

gcg

ggc

879

Pro

Pro

Gly

Tyr

Glu

Phe

Pro

Alá

Gly

Gly

Gin

Asp

Met

Alá

Alá

Gly

255

260

265

ggc

ggc

aca

tct

tgg

atg

ccc

cac

cag

cag

gca

ttc

acg

ccg

cet

get

927

Gly

Gly

Thr

Ser

Trp

Met

Pro

His

Gin

Gin

Alá

Phe

Thr

Pro

Pro

Alá

270

275

280

285

gcg

tac

ggc

ggc

gac

gcg

gtg

tac

ccg

agc

gcg

gca

ggc

caa

cag

tac

975

Alá

Tyr

Gly

Gly

Asp

Alá

Val

Tyr

Pro

Ser

Alá

Alá

Gly

Gin

Gin

Tyr

290

295

300

tct

ttc

cac

cag

ggc

ccc

agc

acg

agc

agc

gtg

gtc

gtg

aac

agc

caa

1023

Ser

Phe

His

Gin

Gly

Pro

Ser

Thr

Ser

Ser

Val

Val

Val

Asn

Ser

Gin

305

310

315

ccg

ttc

tcc

ccg

ccg

cet

gtg

ggc

gac

atg

cac

ggc

gcg

aac

atg

gcc

1071

Pro

Phe

Ser

Pro

Pro

Pro

Val

Gly

Asp

Met

His

Gly

Alá

Asn

Met

Alá

320

325

330

tgg

ccg

cag

cag

tac

gtg

ccg

ttc

cca

ccg

cet

ggg

get

tcc

acg

ggc

1119

Trp

Pro

Gin

Gin

Tyr

Val

Pro

Phe

Pro

Pro

Pro

Gly

Alá

Ser

Thr

Gly

335

340

345

tct

tac

cet

atg

ccg

cag

ccg

ttc

tcc

ccc

gga

ttc

ggc

ggg

cag

tac

1167

Ser

Tyr

Pro

Met

Pro

Gin

Pro

Phe

Ser

Pro

Gly

Phe

Gly

Gly

Gin

Tyr

350

355

360

365

gcc

ggc

gcc

ggc

get

ggc

cac

ctc

tea

gtg

gcc

ccc

cag

ege

atg

gca

1215

Alá

Gly

Alá

Gly

Alá

Gly

His

Leu

Ser

Val

Alá

Pro

Gin

Arg

Met

Alá

370

375

380

ggc

gtg

gag

gcc

teg

gcg

acc

aag

gag

gcc

ege

aag

aag

ege

atg

gcg

1263

Gly

Val

Glu

Alá

Ser

Alá

Thr

Lys

Glu

Alá

Arg

Lys

Lys

Arg

Met

Alá

385

390

395

aga

cag

cgg

ege

ctg

tcc

tgc

ctg

cag

cag

cag

ege

agc

cag

cag

ctg

1311

Arg

Gin

Arg

Arg

Leu

Ser

Cys

Leu

Gin

Gin

Gin

Arg

Ser

Gin

Gin

Leu

400

405

410

agc

ctg

ggc

cag

atc

cag

acc

tcc

gtc

cac

ctg

cag

gag

ccg

tcc

cet

1359

Ser

Leu

Gly

Gin

Ile

Gin

Thr

Ser

Val

His

Leu

Gin

Glu

Pro

Ser

Pro

415

420

425

cgg

tcc

acg

cac

tcc

ggc

ccg

gtc

acg

ccg

tea

gca

ggc

ggc

tgg

gga

1407

Arg

Ser

Thr

His

Ser

Gly

Pro

Val

Thr

Pro

Ser

Alá

Gly

Gly

Trp

Gly

430

435

440

445

ttc

tgg

teg

ccg

agc

agc

cag

cag

cag

gtc

cag

aac

ccg

ctc

tcc

aag

1455

Phe

Trp

Ser

Pro

Ser

Ser

Gin

Gin

Gin

Val

Gin

Asn

Pro

Leu

Ser

Lys

450

455

460

HU 225 785

tcc Ser

aat Asn

tcc Ser

tea Ser 465

agg gcg Arg Alá

ccg Pro

cet Pro

tcc Ser 470

teg Ser

ctg Leu

gaa Glu

gcg Alá

gcg Alá 475

gcg Alá

gcg Alá

1503

get

cca

cag

aca

aag

ccc

gcg

cet

get

ggt

get

egg

cag

gac

gac

att

1551

Alá

Pro

Gin

Thr

Lys

Pro

Alá

Pro

Alá

Gly

Alá

Arg

Gin

Asp

Asp

Ile

480

485

490

cac

cac

ege

ctc

gca

gcg

get

tea

gat

aag

egg

cag

ggc

gcc

aag

gcg

1599

His

His

Arg

Leu

Alá

Alá

Alá

Ser

Asp

Lys

Arg

Gin

Gly

Alá

Lys

Alá

495

500

505

gac

aag

aac

ctg

egg

ttc

ctg

ctg

cag

aag

gtg

ctg

aag

cag

agc

gac

1647

Asp

Lys

Asn

Leu

Arg

Phe

Leu

Leu

Gin

Lys

Val

Leu

Lys

Gin

Ser

Asp

510

515

520

525

gtc

ggg

agc

ctc

ggc

ege

atc

gtg

ctc

ccc

aaa

aag

gaa

gcg

gag

gtt

1695

Val

Gly

Ser

Leu

Gly

Arg

Ile

Val

Leu

Pro

Lys

Lys

Glu

Alá

Glu

Val

530

535

540

cac

ctg

ccg

gag

ctg

aag

acg

agg

gat

ggc

atc

tcc

atc

ccc

atg

gag

1743

His

Leu

Pro

Glu

Leu

Lys

Thr

Arg

Asp

Gly

Ile

Ser

Ile

Pro

Met

Glu

545

550

555

gac

atc

gga

acg

teg

ege

gtg

tgg

aac

atg

egg

tac

agg

ttt

tgg

ccc

1791

Asp

Ile

Gly

Thr

Ser

Arg

Val

Trp

Asn

Met

Arg

Tyr

Arg

Phe

Trp

Pro

560

565

570

aac

aac

aag

agc

aga

atg

tat

ctg

ctg

gaa

aac

aca

ggg

gaa

ttt

gtt

1839

Asn

Asn

Lys

Ser

Arg

Met

Tyr

Leu

Leu

Glu

Asn

Thr

Gly

Glu

Phe

Val

575

580

585

cgt

tcc

aac

gag

ett

cag

gag

ggg

gat

ttc

ata

gtg

atc

tac

tec

gat

1887

Arg

Ser

Asn

Glu

Leu

Gin

Glu

Gly

Asp

Phe

Ile

Val

Ile

Tyr

Ser

Asp

590

595

600

605

gtc

aag

teg

ggc

aaa

tat

ctg

ata

egg

ggc

gtg

aag

gta

agg

ccc

ccg

1935

Val

Lys

Ser

Gly

Lys

Tyr

Leu

Ile

Arg

Gly

Val

Lys

Val

Arg

Pro

Pro

610

615

620

ccg

gcg

caa

gag

caa

ggc

agt

ggt

tcc

agc

ggg

gga

ggc

aag

cac

agg

1983

Pro

Alá

Gin

Glu

Gin

Gly

Ser

Gly

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Lys

His

Arg

625

630

635

ccc

ctc

tgt

cca

gca

ggt

cca

gag

aga

gcc

gca

gcc

gcc

ggt

get

cet

2031

Pro

Leu

Cys

Pro

Alá

Gly

Pro

Glu

Arg

Alá

Alá

Alá

Alá

Gly

Alá

Pro

640

645

650

gaa

gac

gcc

gtc

gtc

gac

ggg

gtc

agc

ggc

gcc

tgc

aag

ggg

agg

tet

2079

Glu

Asp

Alá

Val

Val

Asp

Gly

Val

Ser

Gly

Alá

Cys

Lys

Gly

Arg

Ser

655

660

665

ccg

gaa

ggc

gtg

egg

egg

gtt

egg

cag

cag

gga

gcc

ggc

gcc

atg

agc

2127

Pro

Glu

Gly

Val

Arg

Arg

Val

Arg

Gin

Gin

Gly

Alá

Gly

Alá

Met

Ser

670

675

680

685

cag atg gcg gtg agc atc tga aagagcagca ggctccgcca tatattgatc 2178

Gin Met Alá Val Ser Ile *

690

HU 225 785 gatcgaccaa tcgatcgtta gttctccaag ttactattag ctagctatag cccgaaacag ctgaactgat gatgacgatg gtaacctccg tcgtgtgtgt gctaagcatg tagcgtgcta ggagatgata tattaaatat aatcgagtag tagagcctac ccgctgtgtg acgctaaatt tgtgtgcatt tggtttggtt tgtgagttgg gcccgtgcgt ggctgtgtca tgtcgtggtt aattagctat actagtcctg tctgtacatg catggaca <210> 2 <211> 691 <212> PRT <213> Zea mays <400> 2

Met Glu Alá Ser Ser Gly Ser Ser Pro Pro His Ser Gin Glu Asn Pro 15 10 15

Pro Glu His Gly Gly Asp Met Gly Gly Alá Pro Alá Glu Glu Ile Gly 20 25 30

Gly Glu Alá Alá Asp Asp Phe Met Phe Alá Glu Asp Thr Phe Pro Ser 35 40 45

Leu Pro Asp Phe Pro Cys Leu Ser Ser Pro Ser Ser Ser Thr Phe Ser 50 55 60

Ser Asn Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Alá Tyr Thr Asn Thr Alá Gly

70 75 80

Arg Alá Gly Gly Glu Pro Ser Glu Pro Alá Ser Alá Gly Glu Gly Phe

90 95

Asp Alá Leu Asp Asp Ile Asp Gin Leu Leu Asp Phe Alá Ser Leu Ser 100 105 110

Met Pro Trp Asp Ser Glu Pro Phe Pro Gly Val Ser Met Met Leu Glu 115 120 125

Asn Alá Met Ser Alá Pro Pro Gin Pro Val Gly Asp Gly Met Ser Glu 130 135 140

Glu Lys Alá Val Pro Glu Gly Thr Thr Gly Gly Glu Glu Alá Cys Met

145 150 155 160

Asp Alá Ser Glu Gly Glu Glu Leu Pro Arg Phe Phe Met Glu Trp Leu

165 170 175

Thr Ser Asn Arg Glu Asn Ile Ser Alá Glu Asp Leu Arg Gly Ile Arg 180 185 190

Leu Arg Arg Ser Thr Ile Glu Alá Alá Alá Alá Arg Leu Gly Gly Gly 195 200 205

Arg Gin Gly Thr Met Gin Leu Leu Lys Leu Ile Leu Thr Trp Val Gin 210 215 220

Asn His His Leu Gin Arg Lys Arg Pro Arg Asp Val Met Glu Glu Glu

225 230 235 240

Alá Gly Leu His Val Gin Leu Pro Ser Pro Val Alá Asn Pro Pro Gly

245 250 255

2238

2298

2358

2418

2456

HU 225 785

Tyr

Glu

Phe

Pro 260

Alá

Gly Gly

Gin Asp 265

Met Alá Alá

Gly

Gly 270

Gly

Thr

Ser

Trp

Met

Pro

His

Gin

Gin

Alá

Phe

Thr

Pro

Pro

Alá

Alá

Tyr

Gly

275

280

285

Gly

Asp

Alá

Val

Tyr

Pro

Ser

Alá

Alá

Gly

Gin

Gin

Tyr

Ser

Phe

His

290

295

300

Gin

Gly

Pro

Ser

Thr

Ser

Ser

Val

Val

Val

Asn

Ser

Gin

Pro

Phe

Ser

305

310

315

320

Pro

Pro

Pro

Val

Gly

Asp

Met

His

Gly

Alá

Asn

Met

Alá

Trp

Pro

Gin

325

330

335

Gin

Tyr

Val

Pro

Phe

Pro

Pro

Pro

Gly

Alá

Ser

Thr

Gly

Ser

Tyr

Pro

340

345

350

Met

Pro

Gin

Pro

Phe

Ser

Pro

Gly

Phe

Gly

Gly

Gin

Tyr

Alá

Gly

Alá

355

360

365

Gly

Alá

Gly

His

Leu

Ser

Val

Alá

Pro

Gin

Arg

Met

Alá

Gly

Val

Glu

370

375

380

Alá

Ser

Alá

Thr

Lys

Glu

Alá

Arg

Lys

Lys

Arg

Met

Alá

Arg

Gin

Arg

385

390

395

400

Arg

Leu

Ser

Cys

Leu

Gin

Gin

Gin

Arg

Ser

Gin

Gin

Leu

Ser

Leu

Gly

405

410

415

Gin

Ile

Gin

Thr

Ser

Val

His

Leu

Gin

Glu

Pro

Ser

Pro

Arg

Ser

Thr

420

425

430

His

Ser

Gly

Pro

Val

Thr

Pro

Ser

Alá

Gly

Gly

Trp

Gly

Phe

Trp

Ser

435

440

445

Pro

Ser

Ser

Gin

Gin

Gin

Val

Gin

Asn

Pro

Leu

Ser

Lys

Ser

Asn

Ser

450

455

460

Ser

Arg

Alá

Pro

Pro

Ser

Ser

Leu

Glu

Alá

Alá

Alá

Alá

Alá

Pro

Gin

465

470

475

480

Thr

Lys

Pro

Alá

Pro

Alá

Gly

Alá

Arg

Gin

Asp

Asp

Ile

His

His

Arg

485

490

495

Leu

Alá

Alá

Alá

Ser

Asp

Lys

Arg

Gin

Gly

Alá

Lys

Alá

Asp

Lys

Asn

500

505

510

Leu

Arg

Phe

Leu

Leu

Gin

Lys

Val

Leu

Lys

Gin

Ser

Asp

Val

Gly

Ser

515

520

525

Leu

Gly

Arg

Ile

Val

Leu

Pro

Lys

Lys

Glu

Alá

Glu

Val

His

Leu

Pro

530

535

540

Glu

Leu

Lys

Thr

Arg

Asp

Gly

Ile

Ser

Ile

Pro

Met

Glu

Asp

Ile

Gly

545

550

555

560

Thr

Ser

Arg

Val

Trp

Asn

Met

Arg

Tyr

Arg

Phe

Trp

Pro

Asn

Asn

Lys

565 570 575

HU 225 785

Ser Arg Met Tyr 580

Leu

Leu

Glu Asn Thr Gly Glu 585

Phe

Val

Arg 590

Ser

Asn

Glu

Leu

Gin

Glu

Gly

Asp

Phe

Ile

Val

Ile

Tyr

Ser

Asp

Val

Lys

Ser

595

600

605

Gly

Lys

Tyr

Leu

Ile

Arg

Gly

Val

Lys

Val

Arg

Pro

Pro

Pro

Alá

Gin

610

615

620

Glu

Gin

Gly

Ser

Gly

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Lys

His

Arg

Pro

Leu

Cys

625

630

635

640

Pro

Alá

Gly

Pro

Glu

Arg

Alá

Alá

Alá

Alá

Gly

Alá

Pro

Glu

Asp

Alá

645

650

655

Val

Val

Asp

Gly

Val

Ser

Gly

Alá

Cys

Lys

Gly

Arg

Ser

Pro

Glu

Gly

660

665

670

Val

Arg

Arg

Val

Arg

Gin

Gin

Gly

Alá

Gly

Alá

Met

Ser

Gin

Met

Alá

675

680

685

Val

Ser

Ile

690 <210> 3 <211> 1981 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> ABI1 cDNA (Genbank Accession No. X77116) <221> CDS <222> (432)...(1736) <400> 3 catttcctcc ttctttctct cttctatctg tgaacaaggc acattagaac tcttcttttc 60 aactttttta ggtgtatata gatgaatcta gaaatagttt tatagttgga aattaattga 120 agagagagag atattactac accaatcttt tcaagaggtc ctaacgaatt acccacaatc 180 caggaaaccc ttattgaaat tcaattcatt tctttctttc tgtgtttgtg attttcccgg 240 gaaatatttt tgggtatatg tctctctgtt tttgctttcc tttttcatag gagtcatgtg 300 tttcttcttg tcttcctagc ttcttctaat aaagtccttc tcttgtgaaa atctctcgaa 360 ttttcatttt tgttccattg gagctatctt atagatcaca accagagaaa aagatcaaat 420 ctttaccgtt a atg gag gaa gta tct ccg gcg atc gca ggt cet ttc agg 470

Met Glu Glu Val Ser Pro Alá Ile Alá Gly Pro Phe Arg

10

cca Pro

ttc Phe 15

tcc Ser

gaa Glu

acc Thr

cag Gin

atg Met 20

gat Asp

ttc Phe

acc Thr

ggg Gly

atc Ile 25

aga Arg

ttg Leu

ggt Gly

aaa Lys

518

ggt

tac

tgc

aat

aac

caa

tac

tea

aat

caa

gat

tcc

gag

aac

gga

gat

566

Gly

Tyr

Cys

Asn

Asn

Gin

Tyr

Ser

Asn

Gin

Asp

Ser

Glu

Asn

Gly

Asp

30

35

40

45

HU 225 785

cta Leu

atg gtt

tcg Ser

tta Leu 50

ccg Pro

gag Glu

act Thr

tea Ser

tea Ser 55

tgc Cys

tet Ser

gtt Val

tet Ser

ggg Gly 60

tea Ser

614

Met

Val

cat

ggt

tet

gaa

tet

agg

aaa

gtt

ttg

att

tet

egg

atc

aat

tet

cet

662

His

Gly

Ser

Glu

Ser

Arg

Lys

Val

Leu

Ile

Ser

Arg

Ile

Asn

Ser

Pro

65

70

75

aat

tta

aac

atg

aag

gaa

tea

gca

get

get

gat

ata

gtc

gtc

gtt

gat

710

Asn

Leu

Asn

Met

Lys

Glu

Ser

Alá

Alá

Alá

Asp

Ile

Val

Val

Val

Asp

80

85

90

atc

tcc

gcc

gga

gat

gag

atc

aac

ggc

tea

gat

att

act

agc

gag

aag

758

Ile

Ser

Alá

Gly

Asp

Glu

Ile

Asn

Gly

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Glu

Lys

95

100

105

aag

atg

atc

agc

aga

aca

gag

agt

agg

agt

ttg

ttt

gaa

ttc

aag

agt

806

Lys

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Leu

Phe

Glu

Phe

Lys

Ser

110

115

120

125

gtg

cet

ttg

tat

ggt

ttt

act

tcg

att

tgt

gga

aga

aga

cet

gag

atg

854

Val

Pro

Leu

Tyr

Gly

Phe

Thr

Ser

Ile

Cys

Gly

Arg

Arg

Pro

Glu

Met

130

135

140

gaa

gat

get

gtt

tcg

act

ata

cca

aga

ttc

ett

caa

tet

tcc

tet

ggt

902

Glu

Asp

Alá

Val

Ser

Thr

Ile

Pro

Arg

Phe

Leu

Gin

Ser

Ser

Ser

Gly

145

150

155

tcg

atg

tta

gat

ggt

egg

ttt

gat

cet

caa

tcc

gcc

get

cat

ttc

ttc

950

Ser

Met

Leu

Asp

Gly

Arg

Phe

Asp

Pro

Gin

Ser

Alá

Alá

His

Phe

Phe

160

165

170

ggt

gtt

tac

gac

ggc

cat

ggc

ggt

tet

cag

gta

gcg

aac

tat

tgt

aga

998

Gly

Val

Tyr

Asp

Gly

His

Gly

Gly

Ser

Gin

Val

Alá

Asn

Tyr

Cys

Arg

175

180

185

gag

agg

atg

cat

ttg

get

ttg

gcg

gag

gag

ata

get

aag

gag

aaa

ccg

1046

Glu

Arg

Met

His

Leu

Alá

Leu

Alá

Glu

Glu

Ile

Alá

Lys

Glu

Lys

Pro

190

195

200

205

atg

ctc

tgc

gat

ggt

gat

acg

tgg

ctg

gag

aag

tgg

aag

aaa

get

ett

1094

Met

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Thr

Trp

Leu

Glu

Lys

Trp

Lys

Lys

Alá

Leu

210

215

220

ttc

aac

tcg

ttc

ctg

aga

gtt

gac

tcg

gag

att

gag

tea

gtt

gcg

ccg

1142

Phe

Asn

Ser

Phe

Leu

Arg

Val

Asp

Ser

Glu

Ile

Glu

Ser

Val

Alá

Pro

225

230

235

gag

acg

gtt

ggg

tea

acg

tcg

gtg

gtt

gcc

gtt

gtt

ttc

ccg

tet

cac

1190

Glu

Thr

Val

Gly

Ser

Thr

Ser

Val

Val

Alá

Val

Val

Phe

Pro

Ser

His

240

245

250

atc

ttc

gtc

get

aac

tgc

ggt

gac

tet

aga

gcc

gtt

ett

tgc

ege

ggc

1238

Ile

Phe

Val

Alá

Asn

Cys

Gly

Asp

Ser

Arg

Alá

Val

Leu

Cys

Arg

Gly

255

260

265

aaa

act

gca

ett

cca

tta

tcc

gtt

gac

cat

aaa

ccg

gat

aga

gaa

gat

1286

Lys

Thr

Alá

Leu

Pro

Leu

Ser

Val

Asp

His

Lys

Pro

Asp

Arg

Glu

Asp

270

275

280

285

HU 225 785

gaa Glu

get Alá

gcg Alá

agg Arg

att Ile 290

gaa gcc Glu Alá

gca Alá

gga Gly

ggg Gly 295

aaa Lys

gtg Val

att Ile

cag Gin

tgg Trp 300

aat Asn

1334

gga

get

cgt

gtt

ttc

ggt

gtt

ctc

gcc

atg

teg

aga

tcc

att

ggc

gat

1382

Gly

Alá

Arg

Val

Phe

Gly

Val

Leu

Alá

Met

Ser

Arg

Ser

Ile

Gly

Asp

305

310

315

aga

tac

ttg

aaa

cca

tcc

atc

att

cet

gat

ccg

gaa

gtg

acg

get

gtg

1430

Arg

Tyr

Leu

Lys

Pro

Ser

Ile

Ile

Pro

Asp

Pro

Glu

Val

Thr

Alá

Val

320

325

330

aag

aga

gta

aaa

gaa

gat

gat

tgt

ctg

att

ttg

gcg

agt

gac

ggg

gtt

1478

Lys

Arg

Val

Lys

Glu

Asp

Asp

Cys

Leu

Ile

Leu

Alá

Ser

Asp

Gly

Val

335

340

345

tgg

gat

gta

atg

acg

gat

gaa

gaa

gcg

tgt

gag

atg

gca

agg

aag

egg

1526

Trp

Asp

Val

Met

Thr

Asp

Glu

Glu

Alá

Cys

Glu

Met

Alá

Arg

Lys

Arg

350

355

360

365

att

ctc

ttg

tgg

cac

aag

aaa

aac

gcg

gtg

get

ggg

gat

gca

teg

ttg

1574

Ile

Leu

Leu

Trp

His

Lys

Lys

Asn

Alá

Val

Alá

Gly

Asp

Alá

Ser

Leu

370

375

380

ctc

gcg

gat

gag

egg

aga

aag

gaa

ggg

aaa

gat

cet

gcg

gcg

atg

tcc

1622

Leu

Alá

Asp

Glu

Arg

Arg

Lys

Glu

Gly

Lys

Asp

Pro

Alá

Alá

Met

Ser

385

390

395

gcg

get

gag

tat

ttg

tea

aag

ctg

gcg

ata

cag

aga

gga

agc

aaa

gac

1670

Alá

Alá

Glu

Tyr

Leu

Ser

Lys

Leu

Alá

Ile

Gin

Arg

Gly

Ser

Lys

Asp

400

405

410

aac

ata

agt

gtg

gtg

gtg

gtt

gat

ttg

aag

cet

egg

agg

aaa

ctc

aag

1718

Asn

Ile

Ser

Val

Val

Val

Val

Asp

Leu

Lys

Pro

Arg

Arg

Lys

Leu

Lys

415

420

425

1766 agc aaa Ser Lys 430 ccc ttg aac Pro Leu Asn tga ggcagagagg gtcctttttc ttaattttta ★ aaatgaatat ttaactaaca cttgactaca acaacataca gggtctctcc agttataacc ttctaaaaag ttaagatgta aagaaaaagt atatggagat ccccttgtat gtattattgt atttactatt aatgaagctt ttttcttccc ttaaa attaatttgt gcttattttt aatgtgttaa gctcttttgt gggctaattg taatatggtt

1826

1886

1946

1981 <210> 4 <211> 434 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

Alá

Ile

Alá Gly Pro 10

Phe

Arg

Pro

Phe 15

Ser

Met 1

Glu

Glu

Val

Ser 5

Pro

Glu

Thr

Gin

Met 20

Asp

Phe

Thr

Gly

Ile Arg Leu 25

Gly

Lys

Gly 30

Tyr

Cys

Asn

Asn

Gin 35

Tyr

Ser

Asn

Gin

Asp 40

Ser Glu Asn

Gly

Asp 45

Leu

Met

Val

HU 225 785

Ser Leu Pro Glu Thr 50

Glu Ser Arg Lys Val 65

Met Lys Glu Ser Alá 85

Gly Asp Glu Ile Asn 100

Ser Arg Thr Glu Ser 115

Tyr Gly Phe Thr Ser 130

Val Ser Thr Ile Pro 145

Asp Gly Arg Phe Asp 165

Asp Gly His Gly Gly 180

His Leu Alá Leu Alá 195

Asp Gly Asp Thr Trp 210

Phe Leu Arg Val Asp 225

Gly Ser Thr Ser Val 245

Alá Asn Cys Gly Asp 260

Leu Pro Leu Ser Val 275

Arg Ile Glu Alá Alá 290

Val Phe Gly Val Leu 305

Lys Pro Ser Ile Ile 325

Lys Glu Asp Asp Cys 340

Met Thr Asp Glu Glu 355

Ser Ser Cys Ser Val Ser 55

Leu Ile Ser Arg Ile Asn 70 75

Alá Alá Asp Ile Val Val 90

Gly Ser Asp Ile Thr Ser 105

Arg Ser Leu Phe Glu Phe 120

Ile Cys Gly Arg Arg Pro 135

Arg Phe Leu Gin Ser Ser 150 155

Pro Gin Ser Alá Alá His 170

Ser Gin Val Alá Asn Tyr 185

Glu Glu Ile Alá Lys Glu 200

Leu Glu Lys Trp Lys Lys 215

Ser Glu Ile Glu Ser Val 230 235

Val Alá Val Val Phe Pro 250

Ser Arg Alá Val Leu Cys 265

Asp His Lys Pro Asp Arg 280

Gly Gly Lys Val Ile Gin 295

Alá Met Ser Arg Ser Ile 310 315

Pro Asp Pro Glu Val Thr 330

Leu Ile Leu Alá Ser Asp 345

Alá Cys Glu Met Alá Arg 360

Gly Ser His Gly Ser 60

Ser Pro Asn Leu Asn 80

Val Asp Ile Ser Alá 95

Glu Lys Lys Met Ile 110

Lys Ser Val Pro Leu 125

Glu Met Glu Asp Alá 140

Ser Gly Ser Met Leu 160

Phe Phe Gly Val Tyr 175

Cys Arg Glu Arg Met 190

Lys Pro Met Leu Cys 205

Alá Leu Phe Asn Ser 220

Alá Pro Glu Thr Val 240

Ser His Ile Phe Val 255

Arg Gly Lys Thr Alá 270

Glu Asp Glu Alá Alá 285

Trp Asn Gly Alá Arg 300

Gly Asp Arg Tyr Leu 320

Alá Val Lys Arg Val 335

Gly Val Trp Asp Val 350

Lys Arg Ile Leu Leu 365

HU 225 785

Trp

His 370

Lys

Lys

Asn Alá

Val Alá 375

Gly

Asp

Alá

Ser 380

Leu

Leu

Alá

Asp

Glu

Arg

Arg

Lys

Glu

Gly

Lys

Asp

Pro

Alá

Alá

Met

Ser

Alá

Alá

Glu

385

390

395

400

Tyr

Leu

Ser

Lys

Leu

Alá

Ile

Gin

Arg

Gly

Ser

Lys

Asp

Asn

Ile

Ser

405

410

415

Val

Val

Val

Val

Asp

Leu

Lys

Pro

Arg

Arg

Lys

Leu

Lys

Ser

Lys

Pro

420 425 430

Leu Asn <210> 5 <211> 1470 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> ABI2 cDNA (Genbank Accession No. Y08965) <221> CDS <222> (51)...(1322) <400> 5 tttttgttaa agttcaagaa agttcttttt tctttttttt tcctccttta atg gac 56

Met Asp

gaa Glu

gtt Val

tct Ser 5

cet Pro

gca Alá

gtc Val

get Alá

gtt Val 10

cca Pro

ttc Phe

aga Arg

cca Pro

ttc Phe 15

act Thr

gac Asp

cet Pro

104

cac

gcc

gga

ett

aga

ggc

tat

tgc

aac

ggt

gaa

tct

agg

gtt

act

tta

152

His

Alá

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Cys

Asn

Gly

Glu

Ser

Arg

Val

Thr

Leu

20

25

30

ccg

gaa

agt

tct

tgt

tct

ggc

gac

gga

get

atg

aaa

gat

tct

tcc

ttt

200

Pro

Glu

Ser

Ser

Cys

Ser

Gly

Asp

Gly

Alá

Met

Lys

Asp

Ser

Ser

Phe

35

40

45

50

gag

atc

aat

aca

aga

caa

gat

tea

ttg

aca

tea

tea

tea

tct

get

atg

248

Glu

Ile

Asn

Thr

Arg

Gin

Asp

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

Ser

Ser

Alá

Met

55

60

65

gca

ggt

gtg

gat

atc

tcc

gcc

gga

gat

gaa

atc

aac

ggt

tea

gat

gag

296

Alá

Gly

Val

Asp

Ile

Ser

Alá

Gly

Asp

Glu

Ile

Asn

Gly

Ser

Asp

Glu

70

75

80

ttt

gat

ccg

aga

teg

atg

aat

cag

agt

gag

aag

aaa

gta

ett

agt

aga

344

Phe

Asp

Pro

Arg

Ser

Met

Asn

Gin

Ser

Glu

Lys

Lys

Val

Leu

Set

Arg

85

90

95

aca

gag

agt

aga

agt

ctg

ttt

gag

ttc

aag

tgt

gtt

cet

tta

tat

gga

392

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Leu

Phe

Glu

Phe

Lys

Cys

Val

Pro

Leu

Tyr

Gly

100

105

110

HU 225 785

gtg Val 115

act Thr

tcg Ser

att Ile

tgt Cys

ggt Gly 120

aga Arg

cga Arg

cca Pro

gag Glu

atg Met 125

gaa Glu

gat Asp

tct Ser

gtc Val

tea Ser 130

440

acg

att

cet

aga

ttc

ctt

caa

gtt

tct

tct

agt

tcg

ttg

ctt

gat

ggt

488

Thr

Ile

Pro

Arg

Phe

Leu

Gin

Val

Ser

Ser

Ser

Ser

Leu

Leu

Asp

Gly

135

140

145

cga

gtc

act

aat

gga

ttt

aat

cet

cac

ttg

agt

get

cat

ttc

ttt

ggt

536

Arg

Val

Thr

Asn

Gly

Phe

Asn

Pro

His

Leu

Ser

Alá

His

Phe

Phe

Gly

150

155

160

gtt

tac

gat

ggc

cat

ggc

ggt

tct

cag

gta

gcg

aat

tat

tgt

cgt

gag

584

Val

Tyr

Asp

Gly

His

Gly

Gly

Ser

Gin

Val

Alá

Asn

Tyr

Cys

Arg

Glu

165

170

175

agg

atg

cat

ctg

get

ttg

acg

gag

gag

ata

gtg

aag

gag

aaa

ccg

gag

632

Arg

Met

His

Leu

Alá

Leu

Thr

Glu

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Lys

Pro

Glu

180

185

190

ttt

tgt

gac

ggt

gac

acg

tgg

caa

gag

aag

tgg

aag

aag

get

ttg

ttc

680

Phe

Cys

Asp

Gly

Asp

Thr

Trp

Gin

Glu

Lys

Trp

Lys

Lys

Alá

Leu

Phe

195

200

205

210

aac

tct

ttt

atg

aga

gtt

gac

tcg

gag

att

gaa

act

gtg

get

cat

get

728

Asn

Ser

Phe

Met

Arg

Val

Asp

Ser

Glu

Ile

Glu

Thr

Val

Alá

His

Alá

215

220

225

ccg

gaa

act

gtt

ggg

tct

acc

tcg

gtg

gtt

gcg

gtt

gtc

ttt

ccg

act

776

Pro

Glu

Thr

Val

Gly

Ser

Thr

Ser

Val

Val

Alá

Val

Val

Phe

Pro

Thr

230

235

240

cac

atc

ttt

gtc

gcg

aat

tgc

ggc

gac

tct

agg

gcg

gtt

ttg

tgt

ege

824

His

Ile

Phe

Val

Alá

Asn

Cys

Gly

Asp

Ser

Arg

Alá

Val

Leu

Cys

Arg

245

250

255

ggc

aaa

acg

cca

ctc

gcg

ttg

tcg

gtt

gat

cac

aaa

ccg

gat

agg

gat

872

Gly

Lys

Thr

Pro

Leu

Alá

Leu

Ser

Val

Asp

His

Lys

Pro

Asp

Arg

Asp

260

265

270

gat

gaa

gcg

gcg

agg

ata

gaa

get

gcc

ggt

ggg

aaa

gta

atc

cgg

tgg

920

Asp

Glu

Alá

Alá

Arg

Ile

Glu

Alá

Alá

Gly

Gly

Lys

Val

Ile

Arg

Trp

275

280

285

290

aac

ggg

get

cgt

gta

ttt

ggt

gtt

ctc

gca

atg

tea

aga

tcc

att

ggc

968

Asn

Gly

Alá

Arg

Val

Phe

Gly

Val

Leu

Alá

Met

Ser

Arg

Ser

Ile

Gly

295

300

305

gat

aga

tac

ctt

aaa

ccg

tea

gta

att

ccg

gat

cca

gaa

gtg

act

tea

1016

Asp

Arg

Tyr

Leu

Lys

Pro

Ser

Val

Ile

Pro

Asp

Pro

Glu

Val

Thr

Ser

310

315

320

gtg

cgg

cga

gta

aaa

gaa

gat

gat

tgt

ctc

atc

tta

gca

agt

gat

ggt

1064

Val

Arg

Arg

Val

Lys

Glu

Asp

Asp

Cys

Leu

Ile

Leu

Alá

Ser

Asp

Gly

325

330

335

ctt

tgg

gat

gta

atg

aca

aac

gaa

gaa

gtg

tgc

gat

ttg

get

cgg

aaa

1112

Leu

Trp

Asp

Val

Met

Thr

Asn

Glu

Glu

Val

Cys

Asp

Leu

Alá

Arg

Lys

340

345

350

HU 225 785

cgg att tta cta	tgg cat Trp His 360	aag aag aac gcg atg gcc gga gag get	ttg Leu 370	1160
Arg 355	Ile Leu	Leu	Lys	Lys	Asn Alá	Met 365	Alá Gly	Glu Alá
ctt	ccg gcg	gag	aaa aga	gga	gaa	gga aaa	gat	cet gca	gca atg	tcc	1208
Leu	Pro Alá	Glu	Lys Arg 375	Gly	Glu	Gly Lys 380	Asp	Pro Alá	Alá Met 385	Ser
gcg	gca gag	tat	ttg tcg	aag	atg	get ttg	caa	aaa gga	agc aaa	gac	1256
Alá	Alá Glu	Tyr 390	Leu Ser	Lys	Met	Alá Leu 395	Gin	Lys Gly	Ser Lys 400	Asp
aat	ata agt	gtg	gta gtg	gtt	gat	ttg aag	gga	ata agg	aaa ttc	aag	1304
Asn	Ile Ser 405	Val	Val Val	Val	Asp 410	Leu Lys	Gly	Ile Arg 415	Lys Phe	Lys
agc Ser	aaa tcc Lys Ser 420	ttg Leu	aat tga Asn *	aaaagaaggt ttggaagaaa agtgaaaaaa		1352
aaagttttga '	tggtgggtaa aaattctctt tagtgaaaaa	agaaagataa aacaacaggt	1412
aataattaca	ttgtaatatt aatttcctgc ttaaatttgt	tatttaettt ctcaaaaa	1470

<210> 6 <211> 423 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6

Met 1

Asp Glu Val

Ser 5

Pro

Alá

Val Alá Val 10

Pro

Phe

Arg

Pro

Phe 15

Thr

Asp

Pro

His

Alá

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Cys

Asn

Gly

Glu

Ser

Arg

Val

20

25

30

Thr

Leu

Pro

Glu

Ser

Ser

Cys

Ser

Gly

Asp

Gly

Alá

Met

Lys

Asp

Ser

35

40

45

Ser

Phe

Glu

Ile

Asn

Thr

Arg

Gin

Asp

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

Ser

Ser

50

55

60

Alá

Met

Alá

Gly

Val

Asp

Ile

Ser

Alá

Gly

Asp

Glu

Ile

Asn

Gly

Ser

65

70

75

80

Asp

Glu

Phe

Asp

Pro

Arg

Ser

Met

Asn

Gin

Ser

Glu

Lys

Lys

Val

Leu

85

90

95

Ser

Arg

Thr

Glu

Ser

Arg

Ser

Leu

Phe

Glu

Phe

Lys

Cys

Val

Pro

Leu

100

105

110

Tyr

Gly

Val

Thr

Ser

Ile

Cys

Gly

Arg

Arg

Pro

Glu

Met

Glu

Asp

Ser

115

120

125

Val

Ser

Thr

Ile

Pro

Arg

Phe

Leu

Gin

Val

Ser

Ser

Ser

Ser

Leu

Leu

130

135

140

Asp

Gly

Arg

Val

Thr

Asn

Gly

Phe

Asn

Pro

His

Leu

Ser

Alá

His

Phe

145

150

155

160

HU 225 785

Phe Gly Val Tyr Asp Gly His Gly Gly Ser Gin Val Alá Asn Tyr Cys 165 170 175

Arg Glu Arg Met His Leu Alá Leu Thr Glu Glu Ile Val Lys Glu Lys 180 185 190

Pro Glu Phe Cys Asp Gly Asp Thr Trp Gin Glu Lys Trp Lys Lys Alá 195 200 205

Leu Phe Asn Ser Phe Met Arg Val Asp Ser Glu Ile Glu Thr Val Alá 210 215 220

His Alá Pro Glu Thr Val Gly Ser Thr Ser Val Val Alá Val Val Phe

225 230 235 240

Pro Thr His Ile Phe Val Alá Asn Cys Gly Asp Ser Arg Alá Val Leu

245 250 255

Cys Arg Gly Lys Thr Pro Leu Alá Leu Ser Val Asp His Lys Pro Asp 260 265 270

Arg Asp Asp Glu Alá Alá Arg Ile Glu Alá Alá Gly Gly Lys Val Ile 275 280 285

Arg Trp Asn Gly Alá Arg Val Phe Gly Val Leu Alá Met Ser Arg Ser 290 295 300

Ile Gly Asp Arg Tyr Leu Lys Pro Ser Val Ile Pro Asp Pro Glu Val

305 310 315 320

Thr Ser Val Arg Arg Val Lys Glu Asp Asp Cys Leu Ile Leu Alá Ser

325 330 335

Asp Gly Leu Trp Asp Val Met Thr Asn Glu Glu Val Cys Asp Leu Alá 340 345 350

Arg Lys Arg Ile Leu Leu Trp His Lys Lys Asn Alá Met Alá Gly Glu 355 360 365

Alá Leu Leu Pro Alá Glu Lys Arg Gly Glu Gly Lys Asp Pro Alá Alá 370 375 380

Met Ser Alá Alá Glu Tyr Leu Ser Lys Met Alá Leu Gin Lys Gly Ser

385 390 395 400

Lys Asp Asn Ile Ser Val Val Val Val Asp Leu Lys Gly Ile Arg Lys

405 410 415

Phe Lys Ser Lys Ser Leu Asn 420 <210> 7 <211> 2868 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> ABI3 cDNA (Genbank Accession No, X68141)

HU 225 785 <221> CDS <222> (406)...(2568) <400> 7 ctttgtgaac aaaacacatc tcgtatactt cagatctaga ctcgaaaatt ttagacctct 60 ttacaattgg tctttgttca tctgaagttg gagaaaatag ttagcttagg tcggatcttt 120 tcatatgctt tggatcctcc ttcgtctctt ttgtataatt ttaaccttat caagagttct 180 ttttgaatct caaaagatta tatagtagta tagaaggttt atatgtatat gtatagccag 240 atagtttatg ttgtttaaag attcgatgat agccaagttg ggttaacttt ctttttcctt 300 gcctccttac tcacatacaa accctatctg tccgtacaaa atactaaaaa ccctaacttt 360 tctctctcca ccaatctagt ttattgtttc atttccactt caacg atg aaa agc ttg 417

Met Lys Ser Leu 1

cat His 5

gtg Val

gcg gcc Alá Alá

aac Asn

gcc Alá 10

gga Gly

gat Asp

ctg Leu

get Alá

gag Glu 15

gat Asp

tgt Cys

gga Gly

ata Ile

ctc Leu 20

465

ggt

gga

gac

get

gat

gat

act

gtt

ttg

atg

gat

gga

att

gat

gaa

gtt

513

Gly

Gly

Asp

Alá

Asp

Asp

Thr

Val

Leu

Met

Asp

Gly

Ile

Asp

Glu

Val

25

30

35

ggt

aga

gag

atc

tgg

tta

gat

gac

cat

gga

gga

gat

aat

aat

cat

gtt

561

Gly

Arg

Glu

Ile

Trp

Leu

Asp

Asp

His

Gly

Gly

Asp

Asn

Asn

His

Val

40

45

50

cat

ggt

cat

caa

gat

gat

gat

ttg

att

gtt

cat

cat

gac

cet

tea

atc

609

His

Gly

His

Gin

Asp

Asp

Asp

Leu

Ile

Val

His

His

Asp

Pro

Ser

Ile

55

60

65

ttc

tat

gga

gat

ctc

cca

acg

ett

cet

gat

ttc

cca

tgc

atg

teg

tet

657

Phe

Tyr

Gly

Asp

Leu

Pro

Thr

Leu

Pro

Asp

Phe

Pro

Cys

Met

Ser

Ser

70

75

80

tea

tea

teg

tet

tea

aca

tet

cca

get

cet

gtc

aac

gca

atc

gtc

tcc

705

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro

Alá

Pro

Val

Asn

Alá

Ile

Val

Ser

85

90

95

100

tea

gcc

tet

tet

tet

teg

gca

get

tet

tcc

tcc

act

tcc

tea

get

get

753

Ser

Alá

Ser

Ser

Ser

Ser

Alá

Alá

Ser

Ser

Ser

Thr

Ser

Ser

Alá

Alá

105

110

115

tet

tgg

get

ata

ttg

aga

tea

gat

gga

gaa

gat

ccg

act

cca

aac

caa

801

Ser

Trp

Alá

Ile

Leu

Arg

Ser

Asp

Gly

Glu

Asp

Pro

Thr

Pro

Asn

Gin

120

125

130

aac

caa

tac

gca

tea

gga

aac

tgt

gac

gac

tet

tet

ggt

gca

ttg

caa

849

Asn

Gin

Tyr

Alá

Ser

Gly

Asn

Cys

Asp

Asp

Ser

Ser

Gly

Alá

Leu

Gin

135

140

145

tcc

aca

get

tcc

atg

gag

att

cca

tta

gac

agc

agt

caa

ggt

ttt

ggt

897

Ser

Thr

Alá

Ser

Met

Glu

Ile

Pro

Leu

Asp

Ser

Ser

Gin

Gly

Phe

Gly

150

155

160

tgc

ggc

gaa

ggc

ggt

ggt

gat

tgc

att

gat

atg

atg

gag

act

ttc

ggg

945

Cys

Gly

Glu

Gly

Gly

Gly

Asp

Cys

Ile

Asp

Met

Met

Glu

Thr

Phe

Gly

165

170

175

180

HU 225 785

tac Tyr

atg Met

gat Asp

cta Leu

ctt Leu 185

gat Asp

agc Ser

aac Asn

gag Glu

ttc Phe 190

ttt Phe

gac Asp

acc Thr

tea Ser

get Alá 195

ata Ile

993

ttt

agc

caa

gac

gac

gac

acg

caa

aac

cet

aac

ttg

atg

gac

caa

acc

1041

Phe

Ser

Gin

Asp

Asp

Asp

Thr

Gin

Asn

Pro

Asn

Leu

Met

Asp

Gin

Thr

200

205

210

ctt

gag

aga

caa

gaa

gac

cag

gtc

gtt

gtt

ccg

atg

atg

gag

aat

aac

1089

Leu

Glu

Arg

Gin

Glu

Asp

Gin

Val

Val

Val

Pro

Met

Met

Glu

Asn

Asn

215

220

225

agt

ggt

gga

gac

atg

caa

atg

atg

aat

tet

tcc

ttg

gaa

cag

gac

gat

1137

Ser

Gly

Gly

Asp

Met

Gin

Met

Met

Asn

Ser

Ser

Leu

Glu

Gin

Asp

Asp

230

235

240

gat

ctc

get

get

gtg

ttt

ttg

gag

tgg

cta

aag

aac

aac

aag

gag

act

1185

Asp

Leu

Alá

Alá

Val

Phe

Leu

Glu

Trp

Leu

Lys

Asn

Asn

Lys

Glu

Thr

245

250

255

260

gtg

teg

get

gag

gat

ttg

agg

aaa

gta

aag

ata

aag

aaa

get

acg

att

1233

Val

Ser

Alá

Glu

Asp

Leu

Arg

Lys

Val

Lys

Ile

Lys

Lys

Alá

Thr

Ile

265

270

275

gaa

tea

gcg

gca

aga

aga

cta

ggc

ggt

ggt

aaa

gaa

gcg

atg

aag

cag

1281

Glu

Ser

Alá

Alá

Arg

Arg

Leu

Gly

Gly

Gly

Lys

Glu

Alá

Met

Lys

Gin

280

285

290

ctt

tta

aag

ctg

att

ctt

gaa

tgg

gtc

caa

act

aat

cac

tta

caa

aga

1329

Leu

Leu

Lys

Leu

Ile

Leu

Glu

Trp

Val

Gin

Thr

Asn

His

Leu

Gin

Arg

295

300

305

aga

ege

acc

acc

acc

acc

acc

acc

aac

ctc

tet

tat

caa

caa

tea

ttc

1377

Arg

Arg

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Asn

Leu

Ser

Tyr

Gin

Gin

Ser

Phe

310

315

320

caa

caa

gat

cca

ttt

caa

aac

cet

aac

cet

aat

aac

aac

aac

cta

atc

1425

Gin

Gin

Asp

Pro

Phe

Gin

Asn

Pro

Asn

Pro

Asn

Asn

Asn

Asn

Leu

Ile

325

330

335

340

cca

ccg

tcc

gac

caa

acc

tgt

ttc

tea

cet

tea

aca

tgg

gtt

cet

cca

1473

Pro

Pro

Ser

Asp

Gin

Thr

Cys

Phe

Ser

Pro

Ser

Thr

Trp

Val

Pro

Pro

345

350

355

cca

cca

caa

caa

caa

get

ttt

gtc

teg

gac

ccg

ggt

ttt

gga

tac

atg

1521

Pro

Pro

Gin

Gin

Gin

Alá

Phe

Val

Ser

Asp

Pro

Gly

Phe

Gly

Tyr

Met

360

365

370

cet

get

cca

aac

tat

ccg

cca

cag

cca

gag

ttc

ctt

cet

tta

ctt

gaa

1569

Pro

Alá

Pro

Asn

Tyr

Pro

Pro

Gin

Pro

Glu

Phe

Leu

Pro

Leu

Leu

Glu

375

380

385

tet

cca

ccg

tea

tgg

cca

cca

cca

cca

cag

tet

ggt

ccc

atg

cca

cat

1617

Ser

Pro

Pro

Ser

Trp

Pro

Pro

Pro

Pro

Gin

Ser

Gly

Pro

Met

Pro

His

390

395

400

caa

caa

ttc

ccc

atg

ccg

cca

acc

teg

cag

tat

aat

caa

ttt

gga

gat

1665

Gin

Gin

Phe

Pro

Met

Pro

Pro

Thr

Ser

Gin

Tyr

Asn

Gin

Phe

Gly

Asp

405

410

415

420

HU 225 785

cca Pro

aca Thr

ggt Gly

ttc Phe

aat Asn 425

gga Gly

tac Tyr

aac Asn

atg Met

aat Asn 430

ccg Pro

tac Tyr

caa Gin

tat Tyr

cet Pro 435

tat Tyr

1713

gtt

cet

gca

gga

caa

atg

aga

gat

cag

aga

tta

ctc

cgt

ttg

tgt

tcc

1761

Val

Pro

Alá

Gly

Gin

Met

Arg

Asp

Gin

Arg

Leu

Leu

Arg

Leu

Cys

Ser

440

445

450

tea

gca

act

aaa

gag

gca

aga

aag

aaa

egg

atg

gcg

aga

cag

agg

agg

1809

Ser

Alá

Thr

Lys

Glu

Alá

Arg

Lys

Lys

Arg

Met

Alá

Arg

Gin

Arg

Arg

455

460

465

ttc

ttg

tet

cat

cac

cac

aga

cat

aac

aac

aac

aac

aac

aac

aac

aac

1857

Phe

Leu

Ser

His

His

His

Arg

His

Asn

Asn

Asn

Asn

Asn

Asn

Asn

Asn

470

475

480

aat

aat

cag

cag

aac

caa

acc

caa

atc

gga

gaa

acc

tgt

gcc

gcg

gtg

1905

Asn

Asn

Gin

Gin

Asn

Gin

Thr

Gin

Ile

Gly

Glu

Thr

Cys

Alá

Alá

Val

485

490

495

500

get

cca

caa

ett

aac

ccc

gtg

gcc

aca

acc

gcc

acg

gga

ggg

acc

tgg

1953

Alá

Pro

Gin

Leu

Asn

Pro

Val

Alá

Thr

Thr

Alá

Thr

Gly

Gly

Thr

Trp

505

510

515

atg

tat

tgg

cet

aat

gtc

ccg

gca

gtg

ccg

cet

caa

tta

ccg

cca

gtg

2001

Met

Tyr

Trp

Pro

Asn

Val

Pro

Alá

Val

Pro

Pro

Gin

Leu

Pro

Pro

Val

520

525

530

atg

gag

act

cag

tta

cet

acc

atg

gac

cga

get

ggc

tea

get

tet

get

2049

Met

Glu

Thr

Gin

Leu

Pro

Thr

Met

Asp

Arg

Alá

Gly

Ser

Alá

Ser

Alá

535

540

545

atg

cca

cgt

cag

cag

gtg

gta

cca

gat

ege

egg

cag

gga

tgg

aaa

cca

2097

Met

Pro

Arg

Gin

Gin

Val

Val

Pro

Asp

Arg

Arg

Gin

Gly

Trp

Lys

Pro

550

555

560

gaa

aag

aat

ttg

egg

ttt

ctc

ttg

cag

aaa

gtc

ttg

aag

caa

agc

gac

2145

Glu

Lys

Asn

Leu

Arg

Phe

Leu

Leu

Gin

Lys

Val

Leu

Lys

Gin

Ser

Asp

565

570

575

580

gtg

ggt

aac

ctc

gga

agg

atc

gtt

ttg

cca

aaa

aaa

gaa

get

gag

aca

2193

Val

Gly

Asn

Leu

Gly

Arg

Ile

Val

Leu

Pro

Lys

Lys

Glu

Alá

Glu

Thr

585

590

595

cac

ttg

ccg

gag

cta

gag

gca

aga

gac

ggc

atc

tet

ctg

gcc

atg

gaa

2241

His

Leu

Pro

Glu

Leu

Glu

Alá

Arg

Asp

Gly

Ile

Ser

Leu

Alá

Met

Glu

600

605

610

gac

atc

gga

acc

tet

cgt

gtt

tgg

aac

atg

ege

tac

agg

ttt

tgg

cet

2289

Asp

Ile

Gly

Thr

Ser

Arg

Val

Trp

Asn

Met

Arg

Tyr

Arg

Phe

Trp

Pro

615

620

625

aac

aac

aaa

agc

agg

atg

tat

ctc

ctc

gag

aac

acc

ggc

gat

ttt

gtg

2337

Asn

Asn

Lys

Ser

Arg

Met

Tyr

Leu

Leu

Glu

Asn

Thr

Gly

Asp

Phe

Val

630

635

640

aaa

acc

aat

ggg

ctc

caa

gaa

ggt

gat

ttc

ata

gtc

ata

tac

tcc

gac

2385

Lys

Thr

Asn

Gly

Leu

Gin

Glu

Gly

Asp

Phe

Ile

Val

Ile

Tyr

Ser

Asp

645

650

655

660

HU 225 785

gtc Val

aaa Lys

tgt Cys

ggc Gly

aaa Lys 665

tat Tyr

ttg Leu

ata Ile

cga Arg

ggg Gly 670

gtt Val

aaa Lys

gta Val

aga Arg

caa Gin 675

ccg Pro

2433

agc

gga

caa

aag

ccg

gag

gcc

cca

ccg

tcg

tea

gca

get

acg

aag

aga

2481

Ser

Gly

Gin

Lys

Pro

Glu

Alá

Pro

Pro

Ser

Ser

Alá

Alá

Thr

Lys

Arg

680

685

690

caa

aac

aag

tcg

caa

agg

aac

ata

aac

aat

aac

tet

ccg

tcg

gcg

aat

2529

Gin

Asn

Lys

Ser

Gin

Arg

Asn

Ile

Asn

Asn

Asn

Ser

Pro

Ser

Alá

Asn

695

700

705

gtg

gtg

gtc

get

tea

cca

act

tet

caa

act

gtt

aaa

tga

aaaacagaga

2578

Val

Val

Val

Alá

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Thr

Val

Lys

★

710

715

720

caaaaagaaa caatataaat attattatgt accaaataag aaagagggca aaaggaaaaa 2638 atggcagcgt acccgagtgt gccacttctc gtgcatgcat gggatcttga agacaaatgg 2698 agggtcatga ttaaagctgt ttggtcaggg tccgggtttt tactccattt tttgcctttt 2758 cttgtcgagt cggttctttt ataactcttt actcttttta ccttcaggat attgtagaga 2818 tgattaattc tggaaatggt gtttgtgtta taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2868 <210> 8 <211> 720 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 8

Met Lys Ser Leu His Val Alá Alá Asn Alá Gly Asp Leu Alá Glu Asp 15 10 15

Cys Gly Ile Leu Gly Gly Asp Alá Asp Asp Thr Val Leu Met Asp Gly 20 25 30

Ile Asp Glu Val Gly Arg Glu Ile Trp Leu Asp Asp His Gly Gly Asp 35 40 45

Asn Asn His Val His Gly His Gin Asp Asp Asp Leu Ile Val His His 50 55 60

Asp Pro Ser Ile Phe Tyr Gly Asp Leu Pro Thr Leu Pro Asp Phe Pro

70 75 80

Cys Met Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Pro Alá Pro Val Asn

90 95

Alá Ile Val Ser Ser Alá Ser Ser Ser Ser Alá Alá Ser Ser Ser Thr 100 105 110

Ser Ser Alá Alá Ser Trp Alá Ile Leu Arg Ser Asp Gly Glu Asp Pro 115 120 125

Thr Pro Asn Gin Asn Gin Tyr Alá Ser Gly Asn Cys Asp Asp Ser Ser 130 135 140

Gly Alá Leu Gin Ser Thr Alá Ser Met Glu Ile Pro Leu Asp Ser Ser

145 150 155 160

Gin Gly Phe Gly Cys Gly Glu Gly Gly Gly Asp Cys Ile Asp Met Met

165 170 175

HU 225 785

Glu

Thr

Phe

Gly

Tyr

Met

Asp

Leu

Leu

Asp

Ser

Asn

Glu

Phe

Phe

Asp

180

185

190

Thr

Ser

Alá

Ile

Phe

Ser

Gin

Asp

Asp

Asp

Thr

Gin

Asn

Pro

Asn

Leu

195

200

205

Met

Asp

Gin

Thr

Leu

Glu

Arg

Gin

Glu

Asp

Gin

Val

Val

Val

Pro

Met

210

215

220

Met

Glu

Asn

Asn

Ser

Gly

Gly

Asp

Met

Gin

Met

Met

Asn

Ser

Ser

Leu

225

230

235

240

Glu

Gin

Asp

Asp

Asp

Leu

Alá

Alá

Val

Phe

Leu

Glu

Trp

Leu

Lys

Asn

245

250

255

Asn

Lys

Glu

Thr

Val

Ser

Alá

Glu

Asp

Leu

Arg

Lys

Val

Lys

Ile

Lys

260

265

270

Lys

Alá

Thr

Ile

Glu

Ser

Alá

Alá

Arg

Arg

Leu

Gly

Gly

Gly

Lys

Glu

275

280

285

Alá

Met

Lys

Gin

Leu

Leu

Lys

Leu

Ile

Leu

Glu

Trp

Val

Gin

Thr

Asn

290

295

300

His

Leu

Gin

Arg

Arg

Arg

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Asn

Leu

Ser

Tyr

305

310

315

320

Gin

Gin

Ser

Phe

Gin

Gin

Asp

Pro

Phe

Gin

Asn

Pro

Asn

Pro

Asn

Asn

325

330

335

Asn

Asn

Leu

Ile

Pro

Pro

Ser

Asp

Gin

Thr

Cys

Phe

Ser

Pro

Ser

Thr

340

345

350

Trp

Val

Pro

Pro

Pro

Pro

Gin

Gin

Gin

Alá

Phe

Val

Ser

Asp

Pro

Gly

355

360

365

Phe

Gly

Tyr

Met

Pro

Alá

Pro

Asn

Tyr

Pro

Pro

Gin

Pro

Glu

Phe

Leu

370

375

380

Pro

Leu

Leu

Glu

Ser

Pro

Pro

Ser

Trp

Pro

Pro

Pro

Pro

Gin

Ser

Gly

385

390

395

400

Pro

Met

Pro

His

Gin

Gin

Phe

Pro

Met

Pro

Pro

Thr

Ser

Gin

Tyr

Asn

405

410

415

Gin

Phe

Gly

Asp

Pro

Thr

Gly

Phe

Asn

Gly

Tyr

Asn

Met

Asn

Pro

Tyr

420

425

430

Gin

Tyr

Pro

Tyr

Val

Pro

Alá

Gly

Gin

Met

Arg

Asp

Gin

Arg

Leu

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Cys

Ser

Ser

Alá

Thr

Lys

Glu

Alá

Arg

Lys

Lys

Arg

Met

Alá

450

455

460

Arg

Gin

Arg

Arg

Phe

Leu

Ser

His

His

His

Arg

His

Asn

Asn

Asn

Asn

465

470

475

480

Asn

Asn

Asn

Asn

Asn

Asn

Gin

Gin

Asn

Gin

Thr

Gin

Ile

Gly

Glu

Thr

485

490

495

HU 225 785

Cys Alá Alá Val Alá Pro Gin Leu Asn Pro Val Alá Thr Thr Alá Thr 500 505 510

Gly Gly Thr Trp Met Tyr Trp Pro Asn Val Pro Alá Val Pro Pro Gin 515 520 525

Leu Pro Pro Val Met Glu Thr Gin Leu Pro Thr Met Asp Arg Alá Gly 530 535 540

Ser Alá Ser Alá Met Pro Arg Gin Gin Val Val Pro Asp Arg Arg Gin

545 550 555 560

Gly Trp Lys Pro Glu Lys Asn Leu Arg Phe Leu Leu Gin Lys Val Leu

565 570 575

Lys Gin Ser Asp Val Gly Asn Leu Gly Arg Ile Val Leu Pro Lys Lys 580 585 590

Glu Alá Glu Thr His Leu Pro Glu Leu Glu Alá Arg Asp Gly Ile Ser 595 600 605

Leu Alá Met Glu Asp Ile Gly Thr Ser Arg Val Trp Asn Met Arg Tyr 610 615 620

Arg Phe Trp Pro Asn Asn Lys Ser Arg Met Tyr Leu Leu Glu Asn Thr

625 630 635 640

Gly Asp Phe Val Lys Thr Asn Gly Leu Gin Glu Gly Asp Phe Ile Val

645 650 655

Ile Tyr Ser Asp Val Lys Cys Gly Lys Tyr Leu Ile Arg Gly Val Lys 660 665 670

Val Arg Gin Pro Ser Gly Gin Lys Pro Glu Alá Pro Pro Ser Ser Alá 675 680 685

Alá Thr Lys Arg Gin Asn Lys Ser Gin Arg Asn Ile Asn Asn Asn Ser 690 695 700

Pro Ser Alá Asn Val Val Val Alá Ser Pro Thr Ser Gin Thr Val Lys 705 710 715 720 <210> 9 <211> 1500 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> misc_feature <222> (0)...(0) <223> ABI4 cDNA (Genbank Accession No. AF040959) (221) CDS (222) (151)...(1137) <400> 9 aatcgaccat tcacaacgat gacattcaaa cactcttcag tttcccttcc ttcttgattc gtcctctcca ctatttttct caatttcttt aatctctctc tttctctctc tacttcctct

120

HU 225 785 tcctcttctt cttcttcttc ttcttcatct atg gac cet tta get tcc caa cat Met Asp Pro Leu Alá Ser Gin His

5

174

caa Gin

cac His 10

aac Asn

cat His

ctg Leu

gaa Glu

gat Asp 15

aat Asn

aac Asn

caa Gin

acc Thr

cta Leu 20

acc Thr

cat His

aat Asn

aat Asn

cet

caa

tcc

gat

tcc

acc

acc

gac

tea

tea

act

tcc

tcc

get

caa

ege

Pro

Gin

Ser

Asp

Ser

Thr

Thr

Asp

Ser

Ser

Thr

Ser

Ser

Alá

Gin

Arg

25

30

35

40

aaa

ege

aaa

ggc

aaa

ggt

ggt

ccg

gac

aac

tcc

aag

ttc

cgt

tac

cgt

Lys

Arg

Lys

Gly

Lys

Gly

Gly

Pro

Asp

Asn

Ser

Lys

Phe

Arg

Tyr

Arg

45

50

55

ggc

gtt

cga

caa

aga

agc

tgg

ggc

aaa

tgg

gtc

gcc

gag

atc

cga

gag

Gly

Val

Arg

Gin

Arg

Ser

Trp

Gly

Lys

Trp

Val

Alá

Glu

Ile

Arg

Glu

60

65

70

cca

cgt

aag

ege

act

ege

aag

tgg

ett

ggt

act

ttc

gca

acc

gcc

gaa

Pro

Arg

Lys

Arg

Thr

Arg

Lys

Trp

Leu

Gly

Thr

Phe

Alá

Thr

Alá

Glu

75

80

85

gac

gcc

gca

cgt

gcc

tac

gac

egg

get

gcc

gtt

tac

cta

tac

ggg

tea

Asp

Alá

Alá

Arg

Alá

Tyr

Asp

Arg

Alá

Alá

Val

Tyr

Leu

Tyr

Gly

Ser

90

95

100

cgt

get

cag

ctc

aac

tta

acc

cet

teg

tct

cet

tcc

tcc

gtc

tct

tcc

Arg

Alá

Gin

Leu

Asn

Leu

Thr

Pro

Ser

Ser

Pro

Ser

Ser

Val

Ser

Ser

105

110

115

120

tct

tcc

tcc

tcc

gtc

tcc

gcc

get

tct

tct

cet

tcc

acc

tcc

tct

tcc

Ser

Ser

Ser

Ser

Val

Ser

Alá

Alá

Ser

Ser

Pro

Ser

Thr

Ser

Ser

Ser

125

130

135

tcc

act

caa

acc

cta

aga

cet

ctc

ctc

cet

ege

ccc

gcc

gcc

gcc

acc

Ser

Thr

Gin

Thr

Leu

Arg

Pro

Leu

Leu

Pro

Arg

Pro

Alá

Alá

Alá

Thr

140

145

150

gta

gga

gga

gga

gcc

aac

ttt

ggt

ccg

tac

ggt

atc

cet

ttt

aac

aac

Val

Gly

Gly

Gly

Alá

Asn

Phe

Gly

Pro

Tyr

Gly

Ile

Pro

Phe

Asn

Asn

155

160

165

aac

atc

ttc

ett

aat

ggt

ggg

acc

tct

atg

tta

tgc

cet

agt

tat

ggt

Asn

Ile

Phe

Leu

Asn

Gly

Gly

Thr

Ser

Met

Leu

Cys

Pro

Ser

Tyr

Gly

170

175

180

ttt

ttc

cet

caa

caa

caa

caa

caa

caa

aat

cag

atg

gtc

cag

atg

gga

Phe

Phe

Pro

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

Asn

Gin

Met

Val

Gin

Met

Gly

185

190

195

200

caa

ttc

caa

cac

caa

cag

tat

cag

aat

ett

cat

tct

aat

act

aac

aat

Gin

Phe

Gin

His

Gin

Gin

Tyr

Gin

Asn

Leu

His

Ser

Asn

Thr

Asn

Asn

205

210

215

aac

aag

att

tct

gac

atc

gag

ctc

act

gat

gtt

ccg

gta

act

aat

teg

Asn

Lys

Ile

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Thr

Asp

Val

Pro

Val

Thr

Asn

Ser

220

225

230

222

270

318

366

414

462

510

558

606

654

702

750

798

846

HU 225 785 act tcg ttt cat cat gag gtg gcg tta ggg cag gaa caa gga gga agt 894

Thr Ser Phe His His Glu Val Alá Leu Gly Gin Glu Gin Gly Gly Ser

235 240 245 ggg tgt aat aat aat agt tcg atg gag gat ttg aac tct cta get ggt 942

Gly Cys Asn Asn Asn Ser Ser Met Glu Asp Leu Asn Ser Leu Alá Gly

250 255 260 tcg gtg ggt tcg agt cta tea ata act cat cca ccg ccg ttg gtt gat 990

Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Ile Thr His Pro Pro Pro Leu Val Asp

265 270 275 280 ccg gta tgt tct atg ggt ctg gat ccg ggt tat atg gtt gga gat gga 1038

Pro Val Cys Ser Met Gly Leu Asp Pro Gly Tyr Met Val Gly Asp Gly

285 290 295 tct tcg acc att tgg cet ttt gga gga gaa gaa gaa tat agt cat aat 1086

Ser Ser Thr Ile Trp Pro Phe Gly Gly Glu Glu Glu Tyr Ser His Asn

300 305 310 tgg ggg agt att tgg gat ttt att gat ccc atc ttg ggg gaa ttc tat 1134

Trp Gly Ser Ile Trp Asp Phe Ile Asp Pro Ile Leu Gly Glu Phe Tyr

315 320 325 taa tttgtttttg tggaagatca tattatatac gatgagcatc cctaaggtcg 1187 ★

gtcaagagca ttggagattc attgttgaga ggaatcaaag agattgeatt ctatgaggag 1247 ctctgcatgc aaaattttgg aggatttttt tactacctat agagataaat aagagggtat 1307 ttttattatt tttttgaaga tttttatttt caaggaattc gtaaaagaga ttacggttcc 1367 aataaagtat gtatatgtgg aagagaateg gaggagatgg tggaaagttg tatgggaatt 1427 ttattggttc aacacttcct tcacagtgtg cctaccttaa tatataatta ttgataggat 1487 atgataattt ctg 1500 <210> 10 <211> 328 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 10

Met Asp Pro Leu Alá Ser Gin His Gin His Asn His Leu Glu Asp Asn 15 10 15

Asn Gin Thr Leu Thr His Asn Asn Pro Gin Ser Asp Ser Thr Thr Asp 20 25 30

Ser Ser Thr Ser Ser Alá Gin Arg Lys Arg Lys Gly Lys Gly Gly Pro 35 40 45

Asp Asn Ser Lys Phe Arg Tyr Arg Gly Val Arg Gin Arg Ser Trp Gly 50 55 60

Lys Trp Val Alá Glu Ile Arg Glu Pro Arg Lys Arg Thr Arg Lys Trp 65 70 75 80

Leu Gly Thr Phe Alá Thr Alá Glu Asp Alá Alá Arg Alá Tyr Asp Arg 85 90 95

Alá Alá Val Tyr Leu Tyr Gly Ser Arg Alá Gin Leu Asn Leu Thr Pro

HU 225 785

Ser

Ser

Pro 115

Ser

Ser

Val

Ser

Ser 120

Ser

Ser

Ser

Ser

Val 125

Ser

Alá

Alá

Ser

Ser

Pro

Ser

Thr

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Gin

Thr

Leu

Arg

Pro

Leu

130

135

140

Leu

Pro

Arg

Pro

Alá

Alá

Alá

Thr

Val

Gly

Gly

Gly

Alá

Asn

Phe

Gly

145

150

155

160

Pro

Tyr

Gly

Ile

Pro

Phe

Asn

Asn

Asn

Ile

Phe

Leu

Asn

Gly

Gly

Thr

165

170

175

Ser

Met

Leu

Cys

Pro

Ser

Tyr

Gly

Phe

Phe

Pro

Gin

Gin

Gin

Gin

Gin

180

185

190

Gin

Asn

Gin

Met

Val

Gin

Met

Gly

Gin

Phe

Gin

His

Gin

Gin

Tyr

Gin

195

200

205

Asn

Leu

His

Ser

Asn

Thr

Asn

Asn

Asn

Lys

Ile

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

210

215

220

Thr

Asp

Val

Pro

Val

Thr

Asn

Ser

Thr

Ser

Phe

His

His

Glu

Val

Alá

225

230

235

240

Leu

Gly

Gin

Glu

Gin

Gly

Gly

Ser

Gly

Cys

Asn

Asn

Asn

Ser

Ser

Met

245

250

255

Glu

Asp

Leu

Asn

Ser

Leu

Alá

Gly

Ser

Val

Gly

Ser

Ser

Leu

Ser

Ile

260

265

270

Thr

His

Pro

Pro

Pro

Leu

Val

Asp

Pro

Val

Cys

Ser

Met

Gly

Leu

Asp

275

280

285

Pro

Gly

Tyr

Met

Val

Gly

Asp

Gly

Ser

Ser

Thr

Ile

Trp

Pro

Phe

Gly

290

295

300

Gly

Glu

Glu

Glu

Tyr

Ser

His

Asn

Trp

Gly

Ser

Ile

Trp

Asp

Phe

Ile

305

310

315

320

Asp

Pro

Ile

Leu

Gly

Glu

Phe

Tyr

325 <210> 11 <211> 286 <212> DNA <213> Glycine max <220>

<221> promoter <222> (0)...(0) <223> Oleosin promoter (Genbank Accession No. U71381) <400> 11 actaatttat gtaatgtgat ttcaataagt gaggtaaact ccgattgatt gaagatacca 60 ccaacaccaa caccaccacc acctgcgaaa ctgtacgtat ctcaattgtc cttaataaaa 120 atgtaaatag tacattattc tccttgcctg tcattattta tgtgccccca gcttaatttt 180 tctgatgtac ttaacccagg gcaaaactga aacaagttcc tcatgcaaag ccccaactca 240 tcatgcatca tgtaccgtgt catcatccag caactccact tttgca 286

HU 225 785 <210> 12 <211> 940 <212> DNA <213> Brassica juncea <220>

<221> promoter <222> (0)...(0) <223> Oleosin promoter (Genbank Accession No. AF134411) <400> 12 tctagaactt tcgggataaa gcaatcacct ggcgattcaa cgtggtcgga tcatgacgtt 60 cccagaagac atcgagtaag ctctcgaagc tgacctcttg cggatcgtac tgaacccgaa 120 caatctcgtt atgtcccgtc gtctccgaac agacatcctc gtatctcgga ttatcgacta 180 atccatggct atacccaacc tccgtcttcg tcacgcctgg aaccctctgg tacgccaatt 240 ccgctcccca gaaacaaccg gcgccgaatt gcgcgaattg ctgacctggg agacggaaca 300 tcgtcgtcgg gtccttgcgc gattgcggcg gaagccgggt cgggttgggg acgaaaccga 360 atccgagcct ggtgaatagg ttgttcatcg gagatttata gacggagatg gatctagcgt 420 tttgggaaag ggaagtggtt tggctctttt ggatagagag agtgcagctt tggagagaga 480 ctggagaggt ttagagagag acgcggcgga gattaccgga ggagaggcga cgagagatag 540 cattatcgaa gggaagggag aaagagtgac gtggagaaat aagaaaccgt taagagtcgg 600 atatttatta tattaaaagc ccaatgggcc taaacccatt taaacaagac aagataaatg 660 ggccgtgtgg taacagagtg ttacgttcgg cttcaaatgc caacgccata ggaacaaaac 720 aaacgtgtcc tcaagtaaac ccctgccgtt tacacctcaa tgactgcatg gtgaagccat 780 taacacgtgg cgtaggatgc atgacgacgc cattgacacc tgactttctt cccttctctt 840 catatatctc taatcaattc aactactcac agtcatagct attcggaaaa tacatacaca 900 tccttttctc ttcgatctct ctcaattcac aagaagcaaa 940 <210> 13 <211> 807 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <220>

<221> promoter <222> (0)...(0) <223> lpt2 promoter <400> 13 gatctcgatg tgtagtctac gagaagggtt aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc 60 taaaaataag ccgatgagga taaataaaat gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact 120 catcaagagg atgcttttcc gatgagctct agtagtacat cggacctcac atacctccat 180 tgtggtgaaa tattttgtgc tcatttagtg atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg 240 ttttgacatt tcagttttgc cactcttagg ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa 300 aagcaaaaca attttatttt acttttacca ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc 360 cactctagaa attctgttta tgccacagaa tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc 420 caaggtgttc atggcatgga aatgtgacat aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg 480 tactcctcgt aacaagagac ggaaacatca tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat 540 cacctttgga tgatgcgcat gaatggagtc gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca 600 ctgagtccgg gcggcaacta ccatcggcga acgacccagc tgacctctac cgaccggact 660 tgaatgcgct accttcgtca gcgacgatgg ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg 720 catggcggca catggcgagc tcagaccgtg cgtggctggc tacaaatacg taccccgtga 780 gtgccctagc tagaaactta cacctgc 807

Claims (44)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás növényben a magfejlődés, magbélfejlődés vagy magérés során abszcizinsavra (ABA) adott válasz befolyásolására, azzal jellemezve, hogy az illető növénybe egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezetet juttatunk be, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befolyásolás az ABA-ra adott válasz csökkentése.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a következők által alkotott csoportból kiválasztott:

   a) az 1., 3., 5., 7. vagy 9. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvencia;

   b) a 2., 4., 6., 8. vagy 10. számú szekvenciavázlatban bemutatott polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia;

   c) az 1., 3., 5., 7. vagy 9. számú szekvenciavázlatban bemutatottal legalább 70% szekvenciaazonosságot mutató nukleotidszekvencia, amely szekvencia expressziója csökkenti az ABA-ra adott választ;

   d) az 1., 3., 5., 7. vagy 9. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia komplementjével 50% formamidot, 1 M nátrium-kloridot, 1% SDS-t tartalmazó elegyben 37 °C-on szigorú körülmények között végzett hibridizálást és 0,1*SSC-ben 60-65 °C-on végzett mosást követően hibridizáló nukleotidszekvencia, amely nukleotidszekvencia expressziója csökkenti az ABA-ra adott választ;

   e) az a), b), c) vagy d) pont szerinti nukleotidszekvencia antiszensz szekvenciáját tartalmazó nukleinsavmolekula; és

   f) az 1., 3., 5., 7. vagy 9. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia legalább 20 egymást követő nukleotldját tartalmazó nukleinsavmolekula, amely nukleinsavmolekula expressziója csökkenti az ABA-ra adott választ.
4. 4. Eljárás fejlődő növényi magot, érésben levő növényi magot vagy fejlődő magbelet érő stressz káros hatásainak megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az illető növénybe egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezetet juttatunk be, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia expressziója befolyásolja az ABA-ra adott választ.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol a befolyásolás az ABA-ra adott csökkentett válasz.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, ahol az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a 3. igénypontban megadott.
8. 8. A 2. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsolt szekvencia egy, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia antiszensz szekvenciája.
9. 9. A 2. vagy 6. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsolt szekvencia egy, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó mutáns szekvencia, és egy, az aő/Ί és abi2 által alkotott csoportból választott szekvenciát tartalmaz.
10. 10. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia megfelel egy, a növényből származó szekvenciának.
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett növény egy egyszikű vagy kétszikű.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett növény egy gabona.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gabona kukorica.
14. 14. A 2. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bejuttatás keresztezéssel vagy transzformációval történik.
15. 15. Növény, amelybe egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó olyan DNS-szerkezet van stabilan bejuttatva, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest.
16. 16. A 15. igénypont szerinti növény, amelyben az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia expressziója befolyásolja az ABA-ra adott választ.
17. 17. A 16. igénypont szerinti növény, amelyben az említett befolyásolás csökkenti az ABA-ra adott választ.
18. 18. A 16. igénypont szerinti növény, amelyben az említett szekvencia az ABA érzékelésében és jelátvitelében vesz részt, és egy kódolószekvencia.
19. 19. A 15. igénypont szerinti növény, amelyben az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a 3. vagy 8-10. igénypontok bármelyikében meghatározott.
20. 20. A 15. igénypont szerinti növény, amelyben az említett DNS-szerkezet stabilan integrálva van a növény genomjába.
21. 21. Növényi sejt, amelynek genomjába egy olyan DNS-szerkezet van bejuttatva, amely egy korai magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmaz, amelyben az említett korai magbél/embrió promoter az említett kapcsolt szekvenciához képest heterológ.
22. 22. A 21. igénypont szerinti növényi sejt, amelyben az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia expressziója befolyásolja az ABA-ra adott választ.
23. 23. A 22. igénypont szerinti növényi sejt, amelyben az említett befolyásolás csökkenti az ABA-ra adott választ.

    HU 225 785
24. 24. A 21. igénypont szerinti növényi sejt, amelyben az említett szekvencia az ABA érzékelésében és jelátvitelében vesz részt, és egy kódolószekvencia.
25. 25. A 21. igénypont szerinti növényi sejt, amelyben az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a 3. vagy 8-10. igénypontok bármelyikében meghatározott.
26. 26. Eljárás fejlődő növényi magot, érésben levő növényi magot vagy fejlődő magbelet érő stressz káros hatásának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy egy késői magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó DNS-szerkezetet juttatunk be egy olyan növénybe, ahol a növénynek egy, az ABA érzékelésében és jelátvitelében érintett említett szekvenciára funkcióvesztéses mutációja van, és az említett késői magbél/embrió promoter az említett kapcsolt szekvenciához képest heterológ.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bejuttatás egy első növénynek - amelynek genomjába az említett DNS-szerkezet stabilan be van épülve - egy második növénnyel való keresztezéséből - amelynek egy, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciára funkcióvesztéses mutációja van - és az utód izolálásából áll.
28. 28. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befolyásolás az ABA-ra adott válasz csökkentése.
29. 29. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a következők által alkotott csoportból kiválasztott:

    a) az 1. vagy 7. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvencia;

    b) a 2. vagy 8. számú szekvenciavázlatban bemutatott polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia;

    c) az 1. vagy 7. számú szekvenciavázlatban bemutatottal legalább 70% azonosságot mutató olyan nukleotidszekvencia, ahol az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatottal legalább 70% azonosságot mutató nukleotidszekvencia egy VP1-aktivitással rendelkező polipeptidet, a 7. számú szekvenciavázlatban bemutatottal legalább 70% azonosságot mutató nukleotidszekvencia pedig egy ABI3-aktivitással rendelkező polipeptidet kódol;

    d) az 1. vagy 7. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia komplementjével 50% formamidot, 1 M nátrium-klorldot, 1% SDS-t tartalmazó elegyben 37 °C-on szigorú körülmények között végzett hibridizálást és 0,1*SSC-ben 60-65 °C-on végzett mosást jelentő szigorú körülmények között hibridizáló olyan nukleotidszekvencia, ahol az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia komplementjével szigorú körülmények között hibridizáló nukleotidszekvencia egy VP1-aktivitással rendelkező polipeptidet, a 7. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia komplementjével szigorú körülmények között hibridizáló nukleotidszekvencia pedig egy ABI3-aktivitással rendelkező polipeptidet kódol; és

    e) az 1. vagy 7. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia legalább 20 egymást követő nukleotidját tartalmazó olyan nukleinsavmolekula, ahol az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia legalább 20 egymást követő nukleotidját tartalmazó nukleinsavmolekula egy VP1-aktivitással rendelkező polipeptidet, a 7. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia legalább 20 egymást követő nukleotidját tartalmazó nukleinsavmolekula pedig egy ABI3-aktivitással rendelkező polipeptidet kódol.
30. 30. A 26-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett késői magbél/embrió promoter egy oleozinpromoter.
31. 31. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-szerkezetet transzformálással juttatjuk be.
32. 32. Növény, amely egy késői magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó, stabilan beépült DNS-szerkezettel rendelkezik, ahol a késői magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest.
33. 33. A 32. igénypont szerinti növény, amely egy endogén, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciában még egy funkcióvesztéses mutációt is tartalmaz.
34. 34. A 33. igénypont szerinti növény, amelyben az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a 29. igénypontban megadott.
35. 35. A 32-34. igénypontok bármelyike szerinti növény, amelyben az említett késői magbél/embrió promoter egy oleozinpromoter.
36. 36. Növényi sejt, amely egy késői magbél/embrió promoterhez működőképesen kapcsolt, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciát tartalmazó, stabilan beépült DNS-szerkezettel rendelkezik, ahol a késői magbél/embrió promoter heterológ az említett kapcsolt szekvenciához képest.
37. 37. A 36. igénypont szerinti növényi sejt, amely még egy funkcióvesztéses mutációt is tartalmaz egy endogén, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvenciában.
38. 38. A 36. igénypont szerinti növényi sejt, amelyben az említett, az ABA érzékelésében és jelátvitelében szerepet játszó szekvencia a 29. igénypontban megadott.
39. 39. A 15-20. vagy 32-35. igénypontok bármelyike szerinti növény, amely növény egy egyszikű vagy kétszikű.
40. 40. A 39. igénypont szerinti növény, amely egyszikű növény kukorica.
41. 41. A 15-20., 32-35., 39. vagy 40. igénypontok bármelyike szerinti növény transzformált magja.
42. 42. A 15-20., 32-35., 39. vagy 40. igénypontok bármelyike szerinti növény transzformált utódja.
43. 43. A 21-25. vagy 36-38. igénypontok bármelyike szerinti növényi sejt, amely növényi sejt egy egyszikűből vagy kétszikűből származik.
44. 44. A 43. igénypont szerinti növényi sejt, ahol az említett egyszikű kukorica.