HU219540B - C-KIT receptor-ligandum és eljárás alkalmazására - Google Patents

C-KIT receptor-ligandum és eljárás alkalmazására Download PDF

Info

Publication number
HU219540B
HU219540B HU9403054A HU9403054A HU219540B HU 219540 B HU219540 B HU 219540B HU 9403054 A HU9403054 A HU 9403054A HU 9403054 A HU9403054 A HU 9403054A HU 219540 B HU219540 B HU 219540B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
csf
cell
bone marrow
cfc
Prior art date
Application number
HU9403054A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9403054D0 (en
HUT70696A (en
Inventor
Peter Besmer
Jochen Buck
Malcolm A.S. Moore
Karl Nocka
Original Assignee
Sloan-Kettering Institute For Cancer Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sloan-Kettering Institute For Cancer Research filed Critical Sloan-Kettering Institute For Cancer Research
Publication of HU9403054D0 publication Critical patent/HU9403054D0/hu
Publication of HUT70696A publication Critical patent/HUT70696A/hu
Publication of HU219540B publication Critical patent/HU219540B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2006—IL-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/202—IL-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/14—Decongestants or antiallergics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

A találmány rekombináns módszerekkel előállított c-kit ligandumot,valamint TNF?-t és egy hematopoietikus faktort tartalmazógyógyszerkészítményekre, valamint a készítmények alkalmazásáravonatkozik, éspedig olyan ex vivo eljárásokra, amellyel őssejtekdendritsejtekké történő expandáltatását és differenciálódását, illetveperifériás vérsejtek ex vivo expandáltatását segítik elő. Azeljárásokban az őssejteket, illetve perifériás vérsejteket a találmányszerinti készítményekkel kezelik. ŕ

Description

A találmány c-kit ligandumot, TNFa-t és egy hematopoietikus faktort tartalmazó gyógyszerkészítményekre, ilyen készítmények alkalmazásával őssejteknek dendritsejtekké történő ex vivő expandáltatására és differenciálására, valamint perifériás vérsejtek ex vivő expandáltatására szolgáló eljárásra vonatkozik.
A leírásunkban zárójelbe tett arab számokkal publikációkra hivatkozunk, amelyek teljes felsorolása az igénypontok előtt található. E publikációk teljes egészében kitanításunk részét képezik, és a technika állásának részletesebb ismertetését szolgálják.
A c-kit protoonkogén a kolóniastimuláló faktor-1 (CSF-1) - vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) - hí-receptor alcsalád egyik tagja, amely egy meghatározatlan ligandum számára transzmembrán tirozin-kináz-receptort kódol (7, 41, 57, 23). Az utóbbi időben a c-kit-rői megállapították, hogy az egér whitespotting (W) lokuszával alléi kapcsolatban van (9, 17, 35). A W lokuszon bekövetkező mutációk a fejlődés és a felnőtt élet alatt befolyásolják a csírasejtek, a pigmentsejtek és a vérképző rendszer meghatározott sejtpopulációinak proliferációját és/vagy vándorlását és differenciálódását (47, 51). A vérképzésre gyakorolt hatások a vörösvérsejt- és hízósejtcsaládokon, valamint a stemsejteken keresztül érvényesülnek, s vörösvértestes vérszegénységet - amely a legsúlyosabb hatású W allélekre homozigóta egyedek számára letális (46) -, valamint a kötőszövet és nyálkahártya hízósejtjeinek teljes hiányát okozzák (72). A W mutációk sejtautonóm módon fejtik ki hatásukat (28, 46), és e tulajdonsággal összhangban, kimutatták, hogy a c-kit RNS-transzkriptumok a W mutációk célsejtjeiben expresszálódnak (35). C-kit RNStranszkriptumokat nagy mennyiségben találtak a primer csontvelő eredetű hízósejtekben és hízósejtvonalakban, és valamivel kisebb mennyiségben a melaconitákban és a vörösvérsejtvonalakban.
A c-kit ligandum azonosítása a különböző, c-kitet expresszáló, s in vivő W mutációkkal befolyásolt sejttípusra gyakorolt esetleges pleiotropos hatásai miatt nagy jelentőséggel bír. A c-kit ligandum előállítására képes sejttípusokról a c-kit/W működésének ismerete alapján szerezhetünk lényeges információkat. A W/Wv egerek kötőszövetében és gasztrointesztinális nyálkahártyájában a hízósejtek hiánya a c-kit hízósejtfejlődésre ható működését jelezte. A csontvelőből származó hízósejtek (BMMC) interleukin-3 (IL-3)-fuggőek, s hasonló hízósejtek találhatók a gasztrointesztinális nyálkahártyában is (MMC) (92, 93). A hasüregből származó kötőszöveti hízósejtek proliferációjukhoz in vitro IL-3-at és IL-4et egyaránt igényelnek (79, 75). Az IL-3 és IL-4 interleukinok jól karakterizált növekedési faktorok, amelyeket a T-sejtek és az aktivált hízósejtek termelnek (92, 94, 95, 96, 97). Egy további, fibroblasztok által termelt hízósejt-növekedési faktor létezését előre megjósolták (47). A BMMC és a hasüregből származó CTMC IL-3 hiányában 3T3 fíbroblasztokkal együtt tenyésztve tartható fenn (98). A W/W* egerekből továbbá számos egyéb W alléira homozigóta egerekből származó BMMC azonban a fibroblasztos együttes tenyésztési rendszerben IL-3 nélkül nem képes a proliferációra (99,100, 38). Ez felvetette a c-Arí-receptor érett hízósejtekben való működésének lehetőségét, és azt sugallta, hogy a c-tö-receptor ligandumát a fibroblasztok termelik. Az utóbbi időben Huff és munkatársai a Nippostronglyus brasiliensis fonalféreggel fertőzött egerek nyirokcsomósejtjeiből származó hízósejttelepek NIH 3T3 fibroblasztokból készített koncentrált, kondicionált tápközeg felhasználásával végzett stimulálásáról számoltak be (84). Egy rövid időtartamú proliferációs vizsgálatot fejlesztettek ki, amely fibroblaszt eredetű aktív anyag (KL) tisztítására szolgál, amely IL-3 hiányában elősegíti a normális BMMC és a peritoneális (hasűri) hízósejtek proliferációját, a fV/Wv BMMC sejtekét azonban nem. Úgy tűnik, a KL ezenkívül elősegíti az eritroid burstök (BFU-E) kialakulását. A KL biológiai tulajdonságai a hízósejt biológiáját és a vörösvérsejt-képződést illetően megegyeznek a c-kit ligandummal kapcsolatban elvártakkal. A hibás W mutációk hatása sejtautonóm; ezzel összhangban, bizonyított, hogy a c-kit RNS-expressziója a W mutációk célsejtjeiben történik (35, 39). A különböző mutáns allélek molekuláris hibáinak újabb karakterizálása azt mutatta, hogy ezek működésbeli fogyatékosságokat okozó mutációk, amelyek károsítják a c-te-receptor normális aktivitását vagy expreszszálódását (35, 100,101, 36).
Az egér 10-es kromoszómájának Steel (Sl) fókuszának mutációi a W mutációkat hordozó egerekben tapasztalhatókhoz hasonló fenotípusos jellemzőket eredményeznek; befolyásolják a vérképzést, az ivarsejt- és melaninképződést (5, 47, 51). Az Sl fókuszon sok alléi ismert; ezek féldomináns mutációk, s az egyes allélek a különféle sejtcsaládokra gyakorolt hatásukat és súlyosságuk mértékét illetően különbözőek (47,51). Az eredeti Sl alléi súlyos mutáció. A SIISI homozigóták kevés csírasejttel rendelkeznek, szőrzetük pigmenthiányos, és születés előtt vörösvértestes (makrocita) vérszegénységben pusztulnak el (5, 50). Az Sl allélre homozigóta egerek, bár életképesek, súlyos vörösvértestes vérszegénységben szenvednek, meddők, s szőrzetük pigmenthiányos. Az SII+ és Sld/+ heterozigóták egyaránt halvány szőrzetszínnel és mérsékelt vörösvértestes vérszegénységgel rendelkeznek, de termékenyek (annak ellenére, hogy ivarmirigyeik csökkent méretűek). A W mutációkkal ellentétben, az Sl mutációk nem sejtautonómok, s úgy gondolják, hogy ezen mutációkat céljaik mikrokörnyezetének defektusa okozza (28, 30, 12). Az Sl és W mutációkat hordozó egerek párhuzamos és egymást kiegészítő jellemzői miatt hozzánk hasonlóan korábban mások is azt feltételezték, hogy az Sl gén terméke a ckú-receptor liganduma (51, 9).
A c-kit protoonkogén a HZ4 macskaszarkóma-vírus (7) v-kit onkogénjének normális celluláris páqa. A c-kit egy transzmembrán tirozin-kináz-receptort kódol, amely a vérlemezke eredetű növekedési faktor receptoralcsalád egyik tagja, s az egér white-spotting fókuszának génterméke (9,17,23, 35,41, 57). A c-kit és a 1F fókusz azonosságának bizonyítása a c-kit receptorrendszer - az embriogenezis ideje alatt, illetve a kifejlett állatban a melanin- és ivarsejtképződés, valamint a vérképzés különböző vonatkozásaiban mutatott - működését sejteti
HU 219 540 Β (47, 51). Ezen előre meghatározott működésekkel összhangban a c-kit mRNS a W mutációk célsejtjeiben expresszálódik (3, 24, 25, 35, 39).
A c-h'/-receptor ligandumát, a KL-t az utóbbi időben a c-kit! W hízósejtekben mutatott, ismert működése alapján azonosították és karakterizálták (2, 14, 37, 38, 56, 58, 59). A c-h'f-receptor vérképzésben tapasztalható, előre jelzett szerepével összhangban a KL serkenti a csontvelő és kötőszövet eredetű hízósejtek proliferációját, és a vörösvérsejt-képződés során - az eritropoetinnel együtt - elősegíti az eritroid burstök (7-14 napos BFU-E) képződését. Sőt a KL-lel végzett újabb in vitro kísérletek azt bizonyították, hogy eritropoetinnel, GM-CSF-fel- G-CSF-fel, illetve IL-7-tel együtt alkalmazva serkentik a vörösvérsejt-, velősejt- és nyiroksejt-progenitorok (őssejtek) proliferációját és differenciálódását, azt sugallva ezzel, hogy a c-kit receptorrendszer szerepet játszik a különböző vérképzési sejtcsaládok őssejtjeiben (27, 37).
Az egér 10-es kromoszómájának Steel lokuszának mutációi a W mutációkat hordozó egerekben tapasztalhatókhoz hasonló fenotípusos jellemzőket eredményeznek; befolyásolják a vérképzést, az ivarsejt- és melaninképződést (5, 47, 51). Az utóbbi időben annak alapján, hogy jó néhány súlyos Sl alléiban hiányoznak a KL-szekvenciák, kimutatták, hogy a c-k/í-receptor liganduma (KL) és az egér Steel lokusza között allélizmus van (11, 38, 59). A KL és a c-kit ligandumreceptor kapcsolatnak megfelelően az Sl mutációk ugyanazokra a celluláris célokra hatnak, mint a W mutációk, miközben a W mutációkkal ellentétben az Sl mutációk nem sejtautonómok, és a c-fo'í-receptor mikrokörnyezetét befolyásolják (12,28,30). A Steel lokusz mutációi féldomináns mutációk, s az egyes allélok a különféle sejtcsaládokra gyakorolt hatásukat és súlyosságuk mértékét illetően különbözők (47, 51). Az eredeti Sl alléi a súlyos Sl mutációra példa. Az Sl/Sl homozigóták kevés csírasejttel rendelkeznek, szőrzetük pigmenthiányos, és születés előtt vörösvértestes vérszegénységben pusztulnak el (5, 50). Az Sld allélre homozigóta egerek, bár életképesek, súlyos vörösvértestes vérszegénységben szenvednek, meddők, s szőrzetük pigmenthiányos (6). Az SI/+ és Sld/+ heterozigóták egyaránt halvány szőrzetszínnel és mérsékelt vörösvértestes vérszegénységgel rendelkeznek, de termékenyek (annak ellenére, hogy ivarmirigyeik csökkent méretűek). Az Sld/+ - DNS-próbaként KL cDNS alkalmazásával végzett Southern biot analízise EcoRI polimorfizmust mutatott, azt sugallva, hogy ez a mutáció a KL gén deléciójának, pontmutációjának vagy DNS-átrendeződésének eredménye (11).
A találmány tárgya gyógyszerkészítmény, amely az általunk tisztított vagy rekombináns módszereinkkel előállított c-kit ligandumot (KL) egyéb vérképzési faktorokkal - így TNFa-val és egy hematopoietikus faktorral és gyógyszerészetileg megfelelő hordozóval együtt tartalmazza.
A találmány tárgya továbbá eljárás őssejtek dendritsejtekké történő ex vivő expandáltatására és differenciálására, amelynek során az őssejteket olyan készítménynyel kezeljük, amely c-kit ligandumot, TNFa-t és egy hematopoietikus faktort tartalmaz az őssejtek szaporításához és dendritsejtekké történő differenciálódásához elegendő mennyiségben.
A találmány tárgya ezenkívül eljárás perifériás vérsejtek ex vivő expandáltatására, amelynek során a perifériás vérsejteket olyan készítménnyel kezeljük, amely ckit ligandumot, TNFa-t és egy hematopoietikus faktort tartalmaz az őssejtek szaporításához és dendritsejtekké történő differenciálódásához elegendő mennyiségben.
Az ábrák rövid leírása
1. ábra: a +/+ és W/Wv BMMC proliferációs reakciója a fíbroblasztos kondicionált tápközeg és IL-3 hatására. A +/+ és WfWv csontvelőből származó hízósejteket 1% 3-CM és 10% FCM (20-szorosára koncentrált) jelenlétében vagy kizárólag tápközegben tenyésztettük. A 3H-timidin beépülését 24-30 órás tenyészetből határoztuk meg.
2. ábra: a KL tisztításának kromatográfiás görbéi.
A 2/A. ábrán az ACA 54 Ultrogelen végzett gélfiltrációs kromatográfia eredményei láthatók. A 280 nmnél mért abszorbanciát szaggatott vonallal, a bioaktivitást folytonos vonallal jelöljük. A protein méretmarkerek elúciójának helyét kD-ban adjuk meg.
A 2/B. ábrán DEAE-5PW-oszlopon végzett anioncserélő FPLC eredményei láthatók. A NaCl-gradienst pontozott vonallal jelöljük.
A 2/C. ábrán félpreparatív C18-oszlopon végzett elválasztás eredményei láthatók. Az l-propanolgradiensh pontozott vonallal jelöljük.
A 2/D. ábrán analitikai C18-oszlopon végzett elválasztás eredményei láthatók.
3. ábra: a KL elektroforetikus analízise. Az egyes· frakciókból származó anyagokat SDS/PAGE (12%) alkalmazásával választottuk el, s ezüsttel festettük. A KL (28-30 kD) elhelyezkedését nyíllal jelöljük. A megfelelő frakciók KL-aktivitása: a 3/A. ábrán az ammónium-acetát-pufferrel és 1-propanolgradienssel eluált analitikai C18-oszlopról származó 0,5 ml-es frakciók analízisét mutatjuk be. A 3/B. ábrán a vizes 0,1 %-os TFA-val 2-merkapto-etanol hiányában eluált analitikai C4-oszlopról származó 0,5 ml-es frakciók analízise látható.
4. ábra: a JF* mutáns hízósejtek proliferációja a KL hatására. A hízósejtek a W!+ χ fT/+ párosításból származó magzati májból, vagy a vad típusú 1FV és 1F41 heterozigóták és homozigóták csontvelőjéből származtak. A mutáns hízósejtek proliferációs jellemzőit proliferációs vizsgálatokban, növekvő KL-koncentrációk alkalmazásával határoztuk meg. A homozigóta mutáns hízósejteket folytonos vonallal, a heterozigóta mutáns hízósejteket szaggatott vonallal, a vad típusú hízósejteket pedig pontozott vonallal jelöljük, kivéve a W esetében, ahol a normális magzatok egyaránt lehetnek +/+-ak vagy W/+-ak.
5. ábra: a c-to-expresszió és a növekedésifaktorérzékenység összehasonlítása a csontvelői (BMMC) és a peritoneális hízósejtek (CTMC/PMC) esetében.
Az 5/A. ábrán a tisztított peritoneális hízósejtekből (PMC) és a csontvelői eredetű hízósejtekből (BMMC)
HU 219 540 Β származó heparin-proteoglikánok berberin-szulfáttal végzett fluoreszcenciafestése látható.
Az 5/B. ábrán a peritoneális hízósejtek (PMC) és a csontvelői eredetű hízósejtek (BMMC) felületi c-kit expressziójának c-faf-antitestek és FACS alkalmazásával végzett meghatározása látható.
Az 5/C. ábrán a peritoneális hízósejtek KL hatására tapasztalható proliferációs képességének meghatározása. 5000 darab sejtet 0,5 ml térfogatban 1000 E/ml KL és 10% Wehi-3CM, vagy kizárólag RPMI-C jelenlétében szélesztettünk, s az életképes sejtek számát 2 héttel később határoztuk meg.
6. ábra: a KL burstképződést előmozdító aktivitásának meghatározása. A csontvelő- és lépsejteket eritropoetin (2 E/ml) jelenlétében szélesztettük, s a feltüntetett koncentrációkban tiszta KL-t adtunk a tenyészethez. A BFU-E számát 7 napos tenyésztés után határoztuk meg. Az ábrázolt adatok két független kísérlet átlagát jelentik. A kísérleteket minden KL-koncentrációnál két ismétléssel végeztük.
7. ábra: a W/W magzati májból történő, KL-függő BFU-E-képződés meghatározása. A W/+ állatok keresztezéséből származó magzatokat a megtermékenyülés után 16,5 nappal gyűjtöttük össze. Négy közül egy magzat volt W/W homozigóta. A májsejteket 105 sejt/ml mennyiségben kontrolltápközeg, IL-3 (50 E/ml) vagy KL (2,5 ng/ml) jelenlétében szélesztettük. Mindegyik tenyészet 2 E/ml eritropoetint tartalmazott. Az adatokat a BFU-E májankénti számával fejezzük ki (két ismételt szélesztés átlagaként). A +/+ vagy W/+ magzatok adatai három normális magzat májából származnak.
8. ábra: a KL N-terminális aminosavszekvenciája és a megfelelő nukleinsavszekvencia leszármaztatása PCR-rel. A felső sor a KL N-terminális aminosavszekvenciáját (10-36. aminosavgyök) ábrázolja. A középső sor a 101 bp hosszúságú PCR-termék (lásd 10. ábra) Ml3-ba történő klónozásával és az azt követő szekvenciameghatározással nyert három cDNS nukleotidszekvenciát ábrázolja. Az alsó sor a cDNS első szálának szintetizálásához és a PCR-hez használt degenerált szensz és antiszensz primerek szekvenciáit ábrázolja. Az aminosavszekvenciát a szekvencialista 2. számú szekvenciájaként is azonosítjuk.
9. ábra: az izolált c-kit ligandum polipeptidnek megfelelő, PCR-rel előállított oligonukleotidpróbák alkalmazásával végzett Northern biot analízis. A 6,5 kb hoszszú mRNS-t jelölt próbákkal izoláltuk.
10. ábra: a KL 10-36. N-terminális aminosavainak megfelelő cDNS-ek leszármaztatása RT-PCR-rel. A cDNS-szintézishez és az azt követő PCR-amplifikációhoz a két degenerált oligonukleotid primerrel együtt templátként a BALB/c 3T3-ból származó poli(A)+ RNS egy mikrogrammját használtuk. Az ábrán a 101 bp hoszszúságú PCR-termék agarózon végzett elektroforetikus analízisének eredménye látható.
11. ábra: az 1,4 kb hosszúságú KL cDNS-klón nukleotidszekvenciája és az abból származtatott aminosavszekvencia. A hosszú, nyitott leolvasási keret leszármaztatott aminosavszekvenciája egybetűs kóddal leírva a felső sorokban, a nukleotidszekvencia pedig az alsó sorokban látható. A sorok jobb oldalán lévő számok az aminosavak sorszámát jelentik; a metionin (16-18. nukleotidok) az első. A potenciális N-terminális szignálszekvenciát (SP) és a transzmembrán domént (TMS) a szekvencia fölött pontozott vonallal jelöljük, az extracelluláris doménban lévő ciszteingyökök betűjelét pedig bekarikáztuk. A leszármaztatott proteinszerkezet vázlatát a 11/D. ábra alján mutatjuk be, melyen jelöljük az N-kötött glikozilálási helyeket és az N-terminális peptidszekvencia elhelyezkedését (Pept. szekv.). A nukleinsavszekvenciát a szekvencialista 1. számú szekvenciájaként is azonosítjuk.
12. ábra: a KL-specifikus RNS-transzkriptumok azonosítása BALB/c 3T3 sejt RNS-ben Northern biot analízissel. A BALB/c 3T3 sejtekből származó poli(A)+ RNS-t (4 gg) elektroforézissel választottuk el, nitrocellulózra vittük, s 32P-izotóppal jelölt 1,4 kb hosszúságú KL CDNS-sel hibridizáltuk. Az ábrán a 18S és 28S riboszóma RNS-ek vándorlását mutatjuk be.
13. ábra: a KL SDS-PAGE-analízise. A 13/A. ábrán a KL ezüstös festésének, a 13/B. ábrán pedig a 125I-KL autoradiográfiás vizsgálatának eredménye látható.
14. ábra: a 125I-KL kötődése hízósejtekhez és c-kit expresszáló 2 sejtekhez.
A 14/A. ábra a pLJ c-kit expressziós vektort tartalmazó, és a c-tó-proteint nagy mennyiségben expreszszáló NIH 2/c-tö-sejtek vizsgálatának eredményeit mutatja be.
A 14/B. ábrán a +/+ vagy W/Wv felnőtt egerek csontvelőjéből, vagy a W/W (vagy ugyanabból az alomból származó normális, W/+ vagy +/+ kontroll) magzatok májsejtjeiből származó hízósejtek vizsgálatának eredményei láthatók.
15. ábra: a 12SI-KL hízósejteken lévő c-ktí-receptorral végzett együttes kicsapása és keresztkötése.
A 15/A. ábrán a KL normális nyúlszérummal (NRS) vagy két anti-c-tö nyúlantiszérummal (a-c-kit) végzett együttes kicsapásának eredményei láthatók.
A 15/B. ábrán a KL c-tó-receptorhoz történő keresztkötésének eredményei láthatók. Az SDS-PAGE analízist 12%-os és 7,5%-os poliakrilamidgélen végeztük. A keresztkötött mintákat „KL+cK”-val jelöljük.
16. ábra: az S1/+ és SIISI egerekből származó, Taql-gyel emésztett DNS RFLP-analízise. A C3HeB/Fej a/a CaJ SÍ Hm egerekből származó SÍ alléit C57BL/6J SÍ Hm egerekbe (C57BL/6J genetikai háttérbe) vittük be, s a C57BL/6J SlC3HxS1C3H keresztezésből származó utódokat vizsgáltuk.
A 16/A. ábrán az 1,4 kb hosszúságú KL cDNSpróba két nem vérszegény (SI/+ sávok), és két vérszegény (SI/SI sávok) egérből származó DNS-hez való hibridizációját mutatjuk be. Az SI/SI egerekből származó DNS-hez hibridizációt nem tapasztaltunk.
A 16/B. ábrán az előzővel megegyező lenyomat TIS Dra/Sal-hez (az S 1-hez szorosan kapcsolódó próbához; lásd a részletes leírást) való hibridizációja látható. Ez a próba az SIc3H/Slc3H homozigóták 4 kb hosszúságú C3HeB/Fej eredetű allélját és 2 kb hosszúságú C57BL/6J allélját ismeri fel.
HU 219 540 Β
17. ábra: a KL-1, KL-2 és KL-Sld cDNS-ek nukleotid- és leszármaztatott aminosavszekvenciái. Az ábrán a Balb 3T3 sejtplazmid cDNS-könyvtárból nyert KL DNS nukleotidszekvenciáját mutatjuk be. A különböző RT-PCT termékeket és az Sld/+ teljes RNS-t, KL-l-et, KL-2-t és KL-Sld-t szubklónoztuk, s szekvenciaanalízissel vizsgáltuk. Az ábrán az üres háromszögek a KL-2-ből kivágott exon 5’ és 3’ végét; a sötét háromszögek pedig az Sld cDNS deléciójának végpontjait jelzik. Az Sld cDNS 67 nukleotidhosszúságú belső szekvenciáját a KL cDNS-szekvencia fölött ábrázoljuk. A nyilak a KL-1 extracelluláris régiójának feltételezett proteolitikus hasítási helyeit jelölik. A szignálpeptidet (SP) és a transzmembránszegmenst (TMS) a nukleotidszekvenciák fölötti vonallal jelöljük.
18/A. és 18/B. ábra: a normális szövetekből és Sld mutáns fibroblasztokból származó KL cDNS-ek azonosítása RT-PCR klónozással. A C57BI6/J egerek különböző szöveteiből és az Sld/+ fibroblasztokból teljes RNS-t nyertünk. A normális szövetekből és a Balb 3T3 sejtekből származó RNS-sel (10 pg) az 1. és 2. primer felhasználásával RT-PCR-reakciókat végeztünk. A +/+ és Sld/+ fibroblasztokból származó RNS-sel a reakciókat az 1.+2.; 1.+3.; és 1.+4. primer kombinációkkal végeztük. A reakciótermékeket 0,25 pg/ml etidium-bromid jelenlétében 1%-os NuSieve agarózgélen végzett elektroforézissel analizáltuk. Az ábrákon a oX174 HaelII DNS-markerek vándorlását mutatjuk be.
19. ábra: különböző KL proteintermékek topológiája. Az árnyékolt területek az N-terminális szignálpeptideket, a rácsozott területek a transzmembrán doméneket, az Y-ok pedig az N-kötött glikozilálási helyeket ábrázolják. A szaggatott vonalak az alternatív splicinggal kialakult exon határait jelzik, melyeknél feltüntettük a megfelelő aminosavsorszámokat. A nyilak a feltételezett proteolitikus hasítási helyeket mutatják. A KL-Sld C-terminálisán az árnyékolt terület a nem KL által kódolt aminosavakat jelzi. A KL-S a KL proteolitikus hasításával vagy a KL C-terminális deléciós mutációjával létrejött oldékony formáját jelöli.
20. ábra: a KL-1- és KL-2-transzkriptumok különböző szövetekben RN-áz protection (védési) vizsgálattal történő azonosítása. A 32P-izotóppal jelölt antiszensz ribonukleotidpróbákat (625 nukleotid) a szövetekből és fibroblasztokból származó 20 pg (a tüdő és a szív esetében 10 pg) teljes sejt-RNS-sel hibridizáltuk. RN-ázos emésztés után a reakcióelegyeket 4% poliakrilamid/karbamid gélen végzett elektroforézissel analizáltuk. A KL-1 és KL-2 esetében 575, illetve 449 nukleotidból álló, védett ffagmenst kaptunk. Az autoradiográfiás expozíciós idő 48 vagy 72 óra, a 3T3 fibroblaszt RNS esetén 6 óra volt.
21/A-C. ábrák: a KL-1 és KL-2 proteintermékek bioszintetikus jellemzői COS sejtekben. A COS-1 sejteket a DEAE-dextrán-eljárás alkalmazásával a KL-1 és KL-2 expressziós plazmidok 5 pg-jával transzfektáltuk. 72 óra elteltével a sejteket 30 percig 35S-metioninnal jelöltük, majd komplett tápközegbe vittük. A felülúszókat és a sejtlizátumokat anti-KL nyúlszérummal immunprecipitáltuk. Az immunprecipitátumokat SDS-PAGE (12%) analízissel vizsgáltuk. A molekuláris tömegmarkerek vándorlását kilodaltonban (kD) adjuk meg.
22/A-C. ábrák: a KL-1 és KL-2 proteintermékek PMA-val indukált hasítása. A COS-1 sejteket a KL-1 és KL-2 expressziós plazmidok 5 pg-jával transzfektáltuk, majd 72 óra elteltével a sejteket 30 percig 35Smetioninnal jelöltük, s (A) szérum nélküli; (B) PMA forbol-észtert (1 pM) és (C) A23187 kalcium-ionofort (1 pM) tartalmazó tápközegbe vittük. A felülúszókat és a sejtlizátumokat anti-KL nyúlszérummal immunprecipitáltuk. Az immunprecipitátumokat SDS-PAGE (12%) analízissel vizsgáltuk. A molekuláris tömegmarkerek vándorlását kilodaltonban (kD) adjuk meg.
23/A-B. ábrák: a KL-Sld és KL-S proteintermékek bioszintetikus jellemzői COS sejtekben.
24. ábra: biológiai aktivitás meghatározása COS sejt felülúszókban. A KL-1, KL-2, KL-Sld és KL-S expressziós plazmidokkal transzfektált COS sejtekből származó felülúszókat hízósejt-proliferációs módszerrel vizsgáltuk az aktivitásra. A felülúszók sorozathígításait csontvelő eredetű hízósejtekkel inkubáltuk, s a 3H-timidin beépülését 24-30 órás tenyészetből határoztuk meg.
25. ábra: a rekombináns humán (rh) IL-Ιβ (100 E/ml, 10-100 ng/ml rmKL) és az rhm-CSF, rhG-CSF és rmIL-3 (mindegyik 1000 E/ml) közötti szinergia (együttes működés) meghatározása HPP-CFUvizsgálattal. Az 5-FU-kezelést követően 4 nappal összegyűjtött egércsontvelősejteket 60 mm-es Petri-csészékben tenyésztettük, melyekben az alsó réteg citokineket tartalmazó, 2 ml 0,5%-os agaróz, a felső réteg pedig 2,5 x1ο4 csontvelősejtet tartalmazó, 0,36%-os agaróz volt. Csökkentett oxigénkoncentrációval végzett 12 nar pos inkubálás után a 0,5 mm-nél nagyobb átmérőjű telepeket számoltuk.
26. ábra: másodlagos CFU-GM vagy delta-vizsgálat, amely a 24 órás 5-FU-val végzett kezelés után gyűjtött egércsontvelő 7 napos szuszpenziótenyészetében a GM-CSF-re érzékeny GFU-GM számának viszonylagos növekedését mutatja be. A velősejteket (2/5 x 105/ml) 7 napig a feltüntetett citokinkombinációkkal tenyésztettük, s a kinyert sejteket GM-CSF-stimulálta telepvizsgálattal újraklónoztuk. A CFU-GM számának viszonylagos növekedése a másodlagos klonális vizsgálatban nyert CFU-GM számának a GM-CSFfel végzett primer klonális vizsgálatban meghatározott CFU-GM számához viszonyított arányát jelenti. Az rmKL-t 20 ng/ml, az rhIL-6-ot 50 ng/ml, az rhIL- Ιβ-t 100 E/ml, az rhGM-CSF-et vagy rmIL-3-at 1000 E/ml koncentrációban alkalmaztuk.
27. ábra: a vérképződés kiterjesztése az 5-FU-val végzett kezelést követően 24 órával begyűjtött csontvelő IL-1+IL-3+KL jelenlétében végzett 7 napos szuszpenziótenyészeteiben. 104 sejtet (a granulociták és a limfociták kivonása után) 2,5%, IL-l+IL-3+KL-re érzékeny HPP-CFU-t tartalmazó szuszpenzióban primer klonális vizsgálattal inkubáltuk, s az összes sejtszámot, valamint az IL-l+IL-3+KL-re érzékeny HPP-CFU, illetve az rmGM-CSF-re érzékeny CFU-GM számát 7 napos másodlagos klonális vizsgálatban határoztuk meg. A számításokat a végső sejt5
HU 219 540 Β számnak a kiindulási HPP-CFU számra vonatkoztatott aránya alapján végeztük.
28. ábra: az IL-6, IL-1 és KL önálló vagy együttes hatásai a normális egércsontvelőből való telepnövekedésre. A kontrolltenyészeteket növekedési faktorok nélkül neveltük. Az IL-6, IL-1 és KL hét kombinációját teszteltük önmagukban vagy a G-CSF-fel, M-CSF-fel, GM-CSF-fel és IL-3-mal együtt. Az adatokat három tenyészet átlaga+standard hiba értékekként ábrázoltuk.
29. ábra: az IL-6, IL-1 és a CSF-ek közötti szinergia az 5-FU-val tisztított csontvelőből származó HPP-CFC stimulálásában. A csontvelőt az 5-FU beadása után 1-7 nappal gyűjtöttük össze (fentről lefelé), s G-CSF, M-CSF és IL-3+IL-6, IL-1; vagy IL-6+IL-1 jelenlétében neveltük. Az adatok az 5-FUkezelést követően 1-7 nappal begyűjtött lxlO4-lxlO5 csontvelősejtre jutó összes CFU-C-(HPP-CFC+LPP-CFC) mennyiséget jelentik. Az adatokat három tenyészet átlaga+standard hiba értékekként ábrázoltuk.
30. ábra: a KL egyéb citokinekkel kombinációban szinergikusan stimulálja a HPP-CFC-t. A 28. ábrával kapcsolatban leírtakhoz hasonlóan a citokinek 40 kombinációját teszteltük az 5-FU-injektálás után begyűjtött csontvelőből származó CFU-C-t (HPP-CFC+LPP-CFC) stimuláló képességükre. A telepszámok az lxlO5 darab, az 5-FU-kezelést követően egy nappal begyűjtött, vagy lxlO4 darab, az 5-FUkezelést követően 7 nappal begyűjtött csontvelősejt háromszor ismételt tenyészeteinek átlag+standard hiba értékeit jelentik.
31. ábra: a delta-tenyészetekben a teljes sejtszám növeléséhez több növekedési faktor összetett stimulációjára van szükség. A delta-tenyészetekben a nemtapadó sejtek számát az anyagok és módszerek részben leírt módon 7 napos tenyésztést követően határoztuk meg. A szaggatott vonal a tenyészetek beoltásához alkalmazott 2,5 x 105 darab, az 5-FU-kezelést követően 1 nappal begyűjtött csontvelősejtet jelöli. A kinyert sejtek morfológiáját a leírásban tárgyaljuk. Az adatokat 2-16 kísérlet átlaga+standard hiba értékekként ábrázoljuk.
32. ábra: az IL-6, IL-1 és a KL önmagukban vagy egymással alkotott kombinációkban a delta-tenyészetek LPP-CFC számának növelésében szinergikusan működik a CSF-ekkel. A G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IL-3 vagy IL-l+IL-3 jelenlétében tenyésztett négy LPP-CFC-t az anyagok és módszerek részben leírtak szerint értékeltük. A delta-értékeket a háromszor ismételt primer és szekunder telepszámlálás átlagából számítottuk. Az eredményeket a két vagy három kísérletből származó 6-11 delta-érték átlagai standard hiba értékeként ábrázoljuk. Megjegyezzük, hogy az LPP-CFC delta-értékek logaritmusértékek.
33. ábra: az IL-6, IL-1 és KL önmagukban vagy egymással alkotott kombinációkban a delta-tenyészetek HPP-CFC mennyiségének növelésében a CSF-ekkel működnek együtt. Valamennyi HPP-CFC-t IL-l+IL-3 jelenlétében tenyésztettük. A delta-értékeket a háromszor ismételt primer és szekunder telepszámok átlagából számítottuk. Az eredményeket 2-11 kísérlet átlagai standard hiba értékeiként ábrázoljuk. Megjegyezzük, hogy a HPP-CFC delta-értékek logaritmusértékek.
34. ábra: az IL-liKL-re érzékeny őssejtek nem szaporodnak a delta-tenyészetekben. A delta-vizsgálatban a primer és szekunder HPP-CFC és LPP-CFC stimulálásában mutatott hatékonyság szempontjából az IL-l+IL-3 kombinációt az IL-1 +KL kombinációval hasonlítottuk össze. A delta-értékeket a háromszor ismételt CFU-C vizsgálatok átlagából számítottuk. A bemutatott adatok egy kísérlet eredményeit reprezentálják. Megjegyezzük, hogy a delta-értékek logaritmusértékek.
35. ábra: a CFU-S száma növekszik a delta-tenyészetekben. Összehasonlítottuk az in vitro delta-vizsgálatban, illetve az 5-FU-val végzett kezelés után 5 nappal végzett in vivő vizsgálatban előforduló HPP-CFC, LPP-CFC és CFU-S szaporodásra vonatkozó deltaértékeket. Az őssejtek in vivő szaporodásával kapcsolatos delta-értékeket úgy határoztuk meg, hogy az őssejtek 5-FU-val végzett kezelés után 8 nappal tapasztalható combcsontonkénti átlagos számát elosztottuk az 5-FU-val végzett kezelés után 1 nappal tapasztalt átlagos számmal. Az adatokat 1-3 kísérlet átlag+standard hiba értékeként ábrázoljuk.
Meghatároztuk a KL c-h'Z-receptorhoz való kapcsolatát, s kötési és keresztkötési kísérletek alapján úgy tűnik, a KL a c-kit liganduma. A KL-specifikus cDNSklónok leszármaztatásához a KL N-terminális proteinszekvenciáját alkalmaztuk. Ezeket a cDNS-klónokat használtuk a KL gén és az SÍ lokusz kapcsolatának vizsgálatához, s bebizonyítottuk, hogy a KL-t az SÍ lokusz* kódolja.
A KL vérképzési növekedési faktort az utóbbi időben BALB/c 3T3 fibroblasztok kondicionált tápközegéből tisztították, s a c-kit ligandumtól elvárt biológiai tulajdonságokkal rendelkezik (37). A KL-t azon képessége alapján tisztították, hogy a normális, s nem W mutáns egerekből származó csontvelői hízósejtek (BMMC) proliferációját IL-3 hiányában serkenti. A tisztított faktor IL-3 hiányában serkenti a BMMC és a CTMC proliferációját, s ilyenformán úgy tűnik, fontos szerepet játszik a hízósejtek érésében. A c-kit vörösvérsejtképzésben való előre jelzett működését illetően a KL az eritropoetinnel együtt serkenti az eritroid burstök (7-14 nap BFU-E) kialakulását. A KL oldékony formája, amelyet Balb/c 3T3 sejtek kondicionált tápközegéből izoláltak, 30 kD molekulatömeggel és 3,8 izoelektromos pont (pl) értékkel rendelkezik; a KL ezen formája nem diszulfiddimer, bár a gélfiltrálás alapján kapott jellemzők fiziológiai körülmények között nem kovalensen kötött dimerek kialakulását mutatják.
A KL cDNS-ek nukleinsavszekvenciájának alapján leszármaztatott aminosavszekvenciája azt jelzi, hogy a KL transzmembrán proteinként, s nem szekretált proteinként expresszálódik. A KL oldékony formája, így a KL membránasszociált formájának proteolitikus hasításával állítható elő. A CSF-1 receptor liganduma, amely a c-kit legközelebbi rokona, a KL-hez hasonló to6
HU 219 540 Β pológiai jellemzőkkel rendelkezik, s proteolitikus hasításával oldékony növekedési faktor állítható elő (44, 45). A KL feltételezett szerkezeti jellemzőinek újabb analízise a KL és a CSF-1 között az aminosavhomológia, a másodlagos szerkezet és az exonok elrendeződése alapján fejlődési rokonságot jelez, s megerősíti azt a nézetet, hogy a két receptorrendszer egymásból fejlődött ki (4).
Az utóbbi időben alternatív splicinggal kialakult KL mRNS-eket írtak le, amelyek a KL-protein két különböző formáját, a KL-l-et és a KL-2-t kódolják (15). A KL kódolta proteintermékeket a KL cDNS-sel transzfektált COS sejtekben azonosították és karakterizálták. Amint fentebb említettük, a KL transzmembránproteinként expresszálódik, melynek proteolitikus hasításával a KL oldékony formája jön létre. Az alternatív splicinggal kialakult KL (KL-2) transzkriptum - melyből hiányzik a feltételezett proteolitikus hasítási helyet kódoló exon - proteinterméke a KL-1 tulajdonságaitól eltérő, átmeneti tulajdonságokat mutat. Ezenfelül, mind a KL-1, mind a KL-2 proteolitikus hasítása szabályozható olyan szerekkel, mint a PMA vagy az A23187 kalcium-ionofor. A KL-1 és KL-2 relatív gyakoriságát sok különböző egérszövetben meghatározták. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a KL-1 és KL-2 expressziója szövetspecifikus módon kontrollált.
Az Slá alléi géntermékeit szintén meghatározták (15). Az Sld a KL-en belüli deléció eredménye, amely magában foglalja a protein transzmembrán és citoplazmikus doménjeit kódoló szekvenciákat, miáltal biológiailag aktív, szekretált mutáns KL proteint eredményez. A KL oldékony és sejtasszociált formáinak a ckit proliferációt és sejtvándorlást érintő működésében játszott szerepét a fenti eredmények alapján tárgyaljuk.
A találmány tárgya tisztított emlősprotein, amely a c-kit ligandumának felel meg, s amely két, 30 kD molekulatömegű és körülbelül 3,8 pl (izoelektromos pont) értékkel rendelkező polipeptid homodimeréből áll. A „c-kit ligandum” kifejezésen olyan polipeptidet vagy proteint értünk, amelyet stemsejt (retikulumsejt) faktorként, hízósejt faktorként és Steel faktorként is említenek. A c-kit ligandum protein vagy polipeptid a természetben előforduló és rekombináns alakokat (azaz a protein és a polipeptid természetben nem található alakjait, amelyek megfelelő mértékben azonosak a természetben előforduló c-kzítel ahhoz, hogy azzal hasonló biológiai aktivitással rendelkezzenek) egyaránt magában foglalja. Az ilyen polipeptidekre nem kizárólagos példa a KL-1,4 és az S-KL jelzésű polipeptid. Az említett proteinek és polipeptidek közé tartoznak a származékok és analógok is.
A találmány egyik megvalósítási módjában a tisztított emlősprotein egérprotein. A találmány egy másik megvalósítási módjában a tisztított emlősprotein humán protein.
A találmány egy másik tárgya c-kit ligandumnak megfelelő tisztított protein, amely glikozilált. A protein glikozilálatlan alakjai is a találmány tárgyát képezik. A találmány további tárgya olyan tisztított emlősprotein, amely a természetben előforduló, a c-kit ligandumnak megfelelő, tisztított emlősproteinhez hasonló mértékben glikozilált. Ez a protein úgy állítható elő, hogy a fent említett polipeptid homodimerek közé a szakemberek számára ismert eljárásokkal cisztein keresztkötést viszünk be.
A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény, amely a fentebb leírt, c-kit ligandumnak megfelelő, tisztított emlősprotein hatásos mennyiségét, valamint gyógyszerészetileg megfelelő hordozót tartalmaz.
A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény emlősök leukopénia (alacsony fehérvérsejtszám) betegségének kezeléséhez, amely a fentebb említett gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét, valamint egy vérképzési faktor hatásos mennyiségét tartalmazza. Vérképzési faktorként a leukopénia kezeléséhez emlősökben hatásos G-CSF, GM-CSF és IL-3 valamelyikét alkalmazzuk.
A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény emlősök vérszegénységének (anémia) kezeléséhez, amely a fentebb leírt gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét, valamint a vérszegénység kezeléséhez emlősökben hatékony EPO (eritropoetin) vagy IL-3 hatásos mennyiségét tartalmazza. A vérszegénység - többek között - a „Diamond Black fan” anémiát és az aplasztikus (veleszületett) anémiát foglalja magában. A „Black fan” és az aplasztikus anémia kezeléséhez azonban a fentebb leírt gyógyszerkészítményt, és az anémia kezeléséhez hatásos G-CSF és GM-CSF hatásos mennyiségét tartalmazó gyógyszerkészítmény az előnyben részesített. A találmány tárgya továbbá eljárás emlősök vérszegénységének kezelésére, melynek során az emlősöknek a fenti készítményt adjuk. A találmány egy további tárgya az emlősökben végzett transzplantáció során a csontvelő átültetés sének elősegítéséhez hatásos gyógyszerkészítmény, amely a fentebb leírt gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségéből, és az emlősökben végzett transzplantáció során a csontvelő gyarapodásának fokozásában hatékony IL-1 vagy IL-6 hatásos mennyiségéből áll. A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény sugárzással, vegyszerrel, illetve kemoterápiával indukált csontvelő-aplázia (hiányos fejlődés) vagy mieloszuppresszió kezelésében a csontvelő regenerálódásának fokozásához, amely a fentebb leírt gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét, és emlősökben a csontvelő regenerálódásának fokozásában hatékony IL-1 hatásos mennyiségét tartalmazza. A találmány egy további tárgya gyógyszerkészítmény szerzett immunhiányos betegség (AIDS) kezeléséhez egy páciensben, amely a fentebb leírt gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét, és az AIDS kezeléséhez a páciensben hatékony AZT vagy G-CSF hatásos mennyiségét tartalmazza.
A találmány további tárgya készítmény idegsérülés kezeléséhez, amely a fentebb leírt gyógyszerkészítmény - az idegsérülés emlősben való kezeléséhez - hatásos mennyiségét tartalmazza.
A találmány egy további tárgya készítmény hiányos tüdőfejlődési tüneteket mutató csecsemők kezeléséhez, amely a hiányos tüdőfejlődési tüneteket mutató csecsemők kezeléséhez hatásos, tisztított emlősproteinből, és gyógyszerészetileg megfelelő hordozóból áll.
HU 219 540 Β
A találmány további tárgya készítmény a kezelt beteg haja (szőre) kihullásának megakadályozására, amely a kezelt beteg haja (szőre) kihullásának megakadályozásában hatásos, a c-kit ligandumnak megfelelő, tisztított emlősproteinből, valamint gyógyszerészetileg megfelelő hordozóból áll. A találmány egy további tárgya gyógyszerkészítmény a kezelt beteg haj(szőr)pigmentjei elvesztésének gátlásához, amely a kezelt beteg haj(szőr)pigmentjei elvesztésének gátlásához hatásos, a c-kit ligandumnak megfelelő, tisztított emlősprotein hatásos mennyiségét, valamint gyógyszerészetileg megfelelő hordozót tartalmaz.
A találmány tárgya továbbá eljárások a fentebb felsorolt rendellenességek kezelésére, melyek során a hatékony készítményt az adott rendellenesség kezeléséhez hatásos mennyiségben alkalmazzuk.
A „páciens” kifejezésen - nem kizárólagosan - emlőst, állatot vagy embert, egeret vagy patkányt kell érteni. Az „emlős” kifejezésen - nem kizárólagosan - egeret (patkányt) vagy embert kell érteni.
A találmány további tárgya izolált nukleinsavmolekula, amely c-kit ligandumnak (KL) megfelelő aminosavszekvenciát kódol. Az ilyen nukleinsavak nem korlátozó jellegű példái közé tartozik a KL-1,4, KL-1, KL-2 vagy S-KL. A találmány további tárgya az említett aminosavszekvenciákat kódoló nukleinsavaktól eltérő nukleinsavak, amelyek azonban ugyanolyan fenotípusos hatásokat fejtenek ki. Ezeket a megváltoztatott, de fenotípusosan egyenértékű nukleinsavmolekulákat „egyenértékű nukleinsavak” néven említjük. A találmány további tárgya a nem kódoló régiókban lévő módosításokkal jellemezhető nukleinsavmolekulák, melyekben a módosítások - a fentebb leírt nukleinsav által kódolt polipeptid fenotípusához képest - nem változtatják meg a nukleinsav által kódolt polipeptid fenotípusát. A találmány további tárgya a találmány szerinti nukleinsavmolekulával hibridizáló nukleinsavmolekulák. A „nukleinsav” kifejezés az RNS-t, illetve az egyés kétszálú DNS-t és a cDNS-t egyaránt magában foglalja. Ezenfelül a „polipeptid” kifejezés magában foglalja bármely, a természetben előforduló allélváltozatot, illetve a rekombináns alakokat.
A találmány céljaihoz alkalmas c-kit ligandum (KL) a humán c-kit ligandum (KL) vagy az egér (patkány) c-kit ligandum (KL).
A találmány további tárgya c-kit ligandumnak (KL) megfelelő aminosavat kódoló nukleinsavmolekulát tartalmazó vektor. Ez a vektor - nem kizárólagosan - lehet plazmid-, vírus- vagy kozmidvektor.
A találmány további tárgya RNS transzkripciós promoterhez, valamint egyéb szabályozószekvenciákhoz működőképesen kapcsolt (találmány szerinti) izolált nukleinsavmolekula. A „működőképesen kapcsolt” kifejezésen olyan elhelyezési módot értünk, amelynek eredményeként a promoter képes irányítani az RNS nukleinsavmolekuláról történő transzkripcióját. Az ilyen promoterekre példa az SP6, a T4 és a T7. A tudományban jól ismertek azok a vektorok, amelyek promotert és klónozási helyet, melynél az inszertált DNS-szakasz működőképesen kapcsolódik a promoterhez, egyaránt tartalmaznak. Előnyösen az ilyen vektorok alkalmasak az RNS in vitro transzkripciójához. Az ilyen vektorokra példa a pGEM sorozat (Promega Biotec, Madison, WI).
A találmány további tárgya gazdavektorrendszer a c-kit ligandum (KL) polipeptid előállításához, amely megfelelő gazdában tartalmazza a fentebb leírt vektorok valamelyikét.
A találmány céljaihoz alkalmas gazdák közé tartoznak - nem kizárólagos jelleggel - az eukariótasejtek, például emlőssejtek, vagy baculovírus-expresszióhoz a rovarsejtek. Alkalmas gazda lehet baktériumsejt is, mint az E. coli, vagy élesztősejt. Az E. coliban expresszálódott protein kinyeréséhez az E. coli sejteket az igénypontok szerinti nukleinsavakkal transzfektáljuk, hogy a c-kit ligandumproteint expresszálják. Az E. colit egyliteres tenyészetben két különböző tápközegben (LB és TB) neveljük, és pelletezzük. Mindegyik baktériumpelletet két szakaszban, 20 ml feltárópufferben (lásd alább) Frenchsejtpasszírozóval, 1,04 x 106 Hgmm nyomással homogenizáljuk. 120 000 percenkénti fordulattal 20 percig végzett centrifúgálás után a felülúszót egy másik kémcsőbe tesszük. A c-kit protein vagy polipeptid a szemcsés frakcióban helyezkedik el, amely 6 M guanidin-HCl alkalmazásával, vagy 8 M karbamiddal, és az azt követő dializálással vagy hígítással szolubilizálható.
Feltárópuffer 50 mM Hepes, pH=8,0 20% glicerin
150 mM NaCl mM MgSO4 mM DTT mM EGTA 20 pg/ml DN-áz I
A találmány további tárgya tisztított, oldékony c-kit ligandum (KL) polipeptid, valamint fragmense.
A találmány egyik megvalósítási módjában a c-kit ligandum polipeptid az 1-164. aminosavaknak felel meg. A találmány egyéb megvalósítási módjaiban a ckit ligandum polipeptid az 1-től a körülbelül 148. aminosavig teijedő szekvenciának felel meg, illetve a körülbelül 165. aminosavtól a körülbelül 202. vagy 205. aminosavig terjedő aminosavszekvenciához fuzionált, az 1. aminosavtól a körülbelül 148. aminosavig terjedő aminosavszekvenciának megfelelő fúziós polipeptideknek, valamint a körülbelül 177. aminosavtól a körülbelül 202. vagy 205. aminosavig terjedő aminosavszekvenciához fuzionált, az 1. aminosavtól a körülbelül 164. aminosavig terjedő aminosavszekvenciának megfelelő fúziós polipeptideknek.
A találmány egy másik megvalósítási módjában a c-kit ligandum polipeptid az 1. aminosavtól a körülbelül 164. aminosavig terjedő szekvenciának megfelelő, biológiailag aktív kötőhelyhez kapcsolt polipeptidet foglalhat magában. Az ilyen biológiailag aktív kötőhelyek közé tartoznak - nem kizárólagos jelleggel - a sztrómasejtek és az extracelluláris mátrix kötődési helyeinek, a heparinkötő doménnek, a hemonektinkötődési helynek vagy a sejtkapcsolódási aktivitásnak megfelelő aminosavak [lásd például a 4 578 079 számú
HU 219 540 Β (1986. 03. 25.), a 4 614 517 számú (1986. 09. 30.) és a 4 792 525 számú (1988. 12. 20.) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat],
A találmány egyik megvalósítási módjában az oldékony c-kit ligandum (KL) polipeptidet nyomon követhető ágenshez konjugáljuk. A nyomon követhető ágensek a szakemberek számára jól ismertek, s többek között lehetnek radioaktív izotópok, festékek vagy enzimek (mint a peroxidáz vagy a lúgos foszfatáz). Az alkalmazható radioaktív izotópok közé tartozik, többek között, a 125I-, a 32P- és a 35S-izotóp.
Az említett, konjugált polipeptidek felhasználhatók a c-kit receptorproteint expresszáló sejtek jelenlétének in vitro vagy in vivő kimutatásához. Ha a kimutatást in vitro végezzük, a tesztelni kívánt sejt- vagy szövetmintát megfelelő körülmények között érintkezésbe hozzuk a konjugált polipeptiddel, hogy az hozzákötődjön a sejt vagy szövet felületén jelen levő c-Azí-receptorhoz, majd eltávolítjuk a kötetlen konjugált polipeptidet, s kimutatjuk a kötött, konjugált polipeptidet, miáltal kimutatjuk a c-kit receptorproteint expresszáló sejteket vagy szöveteket.
Más módon, a konjugált polipeptidet például intravénás injekcióval beadhatjuk a páciensnek. A konjugált polipeptidet megfelelő mennyiségben kell beadni a páciensnek; ezek a mennyiségek általában a páciens testméretétől, testtömegétől és egyéb jellemzőitől függően változók. A szakemberek könnyen meghatározhatják a szükséges mennyiségeket.
A beadás után a sejtek vagy a szövet felszínén jelen levő c-Azí-receptorhoz kötődött, konjugált polipeptidet intracelluláris nyomon követéssel mutatjuk ki.
A találmány szerinti eljárásban az intracelluláris nyomon követéshez a nyomon követés számos módszere alkalmazható, ilyenformán a radioaktív izotóp által kibocsátott sugárzás kimutatása, illetve láthatóvá tétele is. Például, ha a radioaktív izotóp jódizotóp, például 125I-izotóp, az izotóp által kibocsátott gamma-sugárzás gamma-kamera alkalmazásával mutatható ki (illetve tehető láthatóvá).
Ezenfelül az oldékony c-kit ligandum (KL) polipeptidfragmens gyógyszerekhez, például toxinokhoz, kemoterápiás szerekhez vagy radioaktív izotópokhoz konjugálható, így ha a páciensnek a konjugált molekula hatásos mennyiségét adjuk be, az szövetspecifíkus hordozórendszerként működik, amely a gyógyszert a c-kitreceptort expresszáló sejthez juttatja.
A találmány egy további tárgya eljárás c-kit ligandum (KL) polipeptid előállítására, melynek során a fentebb leírt gazdavektorrendszert a c-kit ligandum (KL) polipeptid előállítását és a kapott c-kit ligandum (KL) polipeptid kinyerését elősegítő, megfelelő körülmények között tenyésztjük. A találmány további tárgya az ezen eljárással előállított c-kit ligandum (KL) polipeptid.
A találmány további tárgya c-kit ligandumantagonisták, melyek lehetnek - a c-A/7-receptoron screeneléses vizsgálattal talált - kis molekulájú antagonisták, továbbá antiszensz nukleinsavmolekulák, DNS-ek, RNS-ek [ribóz- (vagy más cukor-) vázalapú molekulák, a cukormolekulák között tio-foszfát-, metil-foszfát- vagy metil-foszfonát-kötésekkel]. Ezek az antiszensz molekulák in vivő gátolhatják a c-kit ligandum transzlációját.
A találmány további tárgya oldékony, mutációval megváltoztatott c-kit ligandum- (KL-) antagonista, melyben a mutált polipeptid megőrzi a c-Az7-receptorhoz való kötődésének képességét, de a biológiai reakció, amelyet a működőképes ligandum receptorhoz való kötődése közvetít, megsemmisül. Ilyenformán, a mutált c-kit ligandum (KL) polipeptidek a normális, működőképes ligandumok c-Azí-receptorhoz való kötődésének gátlásával a ligandum által a c-AzZ-receptorhoz közvetített biológiai működés antagonistájaként működnek. A KL-antagonista randommutagenezissel állítható elő. A dimerképzésre nem képes, mutált vagy módosított KL-molekula hatásos antagonista lehet. A KL nagyfokú homológiát mutat az M-CSF-fel, amely több, a dimerizáció szempontjából fontosnak tartott (102) ahélixet tartalmaz. A helyre irányuló mutagenezis ezeken a helikális régiókon képes gátolni a dimerizációs képességet. Más módon, a mutált KL heterodimert képezhet a normális, működőképes KL-lel, de ez a heterodimer nem képes aktiválni a c-Azz-receptort. Mivel ahhoz, hogy a c-Az'Z-receptor aktív kinázzá alakuljon, dimerizálódnia kell, a c-AzZ-receptorhoz kötődő, sőt a receptor dimerizálódását is gátló mutált KL hatékony antagonista lehet.
A találmány további tárgya gyógyszerkészítmény, amely az általunk tisztított vagy rekombináns módszereinkkel előállított c-kit ligandumot (KL) és gyógyszerészetileg megfelelő hordozót tartalmaz. A c-kit ligandum magában foglalhatja a találmány szerinti izolált, oldékony c-kit ligandumot, annak ffagmensét vagy a fentebb leírt, mutált c-kit ligandum (KL) polipeptidet A találmány leírásában használt „gyógyszerészetileg megfelelő hordozó” kifejezésen hagyományos gyógyszerhordozókat értünk, mint amilyen a foszfátpufferelt sóoldat, a víz, az emulziók (például olaj/vízben vagy víz/olajban emulziók) és a nedvesítőszerek különböző típusai. A gyógyszerhordozók közé tartozhatnak a porlasztóit aeroszolok is.
A fentebb leírt KL-antagonisták számos betegség kezelésében alkalmazhatók, beleértve az asztmát, az allergiás betegségeket, az anafílaxiát, az allergiás eredetű asztmát, az ízületi gyulladást (artritisz, beleértve a reumatoid artritiszt), a szemölcsös kötőhártya-gyulladást, a leukémiát, a melanomát, a bőr allergiás reakcióit és a bőrkeményedést.
A találmány további tárgya a fentebb leírt c-kit ligandum proteinnel, az oldékony c-kit ligandum (KL) polipeptiddel vagy fragmensével komplexet specifikusan kialakítani képes anyag. A találmány egy további tárgya a c-kit ligandum (KL) receptorproteinnel komplexet specifikusan kialakítani képes anyag. A találmány egyik megvalósítási módjában ez az anyag monoklonális antitest, például humán monoklonális antitest.
A találmány további tárgya eljárás a c-kit celluláris aktivitással kapcsolatos biológiai működés módosítására, melynek során a módosítani kívánt működésű sejt mintáját a fentebb leírt, a sejt biológiai működésének módosításához hatásos gyógyszerkészítmény hatásos
HU 219 540 Β mennyiségével hozzuk érintkezésbe. Ezen eljárás gyakorlati megvalósításával módosítható biológiai működések közé tartozik többek között a sejt-sejt interakció, a c-tóet expresszálni képes sejt szaporodása, és az in vitro megtermékenyítés. Az eljárás in vivő és in vitro egyaránt megvalósítható. Amennyiben az eljárást in vivő végezzük, a páciensnek a fentebb leírt, a c-tö-működéssel összefüggő biológiai működés módosításában hatékony gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségét adjuk be.
A találmány további tárgya ex vivő eljárások, és az ex vivő alkalmazáshoz való, a KL-t megfelelő hordozóban tartalmazó készítmények. E vonatkozásokat illetően a találmány tárgya:
(1) eljárás a korai vérképzési őssejtek adott génnel való transzfektálásának fokozására, melynek során (a) a korai vérképzési sejteket először KL-t és vérképzési faktort tartalmazó készítménnyel hozzuk érintkezésbe, majd (b) az (a) lépésben tenyésztett sejteket transzfektáljuk a génnel;
(2) eljárás a gén emlősbe vitelére, melynek során (a) a korai vérképzési sejteket először KL-t tartalmazó készítménnyel hozzuk érintkezésbe;
(b) az (a) lépésben tenyésztett sejteket transzfektáljuk a génnel; majd (c) a (b) lépésben transzfektált sejteket bejuttatjuk az emlősbe. Ezekben az eljárásokban az alkalmazott gén antiszensz RNS vagy DNS lehet.
A KL-t és vérképzési növekedési faktor vagy faktorok hatásos mennyiségét tartalmazó készítmények felhasználhatók a perifériás vér szintjének ex vivő növelésére. Az IL-1, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF vagy kombinációik különösen alkalmasak (lásd 26. ábra). A találmány egy további tárgya eljárás perifériás vér gyarapítására.
A találmány további tárgya eljárások és KL-t tartalmazó készítmények a vérlemezkék vagy más sejttípusok mennyiségének növelésére (melyben az IL-6 különösen alkalmasnak tűnik).
A találmány további tárgya eljárás a c-kit celluláris aktivitással kapcsolatos biológiai működés módosítására, melynek során a sejtet KL-lel hozzuk érintkezésbe. A sejt lehet c-kitel expresszáló vagy vérképzési sejt, vagy az in vitro megtermékenyítésben részt vevő sejt.
A találmány további tárgya eljárás hízósejtek proliferációjának a kezelt betegben történő serkentésére, melynek során a páciensnek a fentebb leírt gyógyszerkészítmény hízósejtek proliferációjának a páciensben való serkentéséhez hatásos mennyiségét adjuk be. A beadás módjai a szakemberek számára jól ismertek, s ezek közé tartozik többek között, az orális, intravénás és parenterális beadás. A készítményt a hízósejtek proliferációjának serkentéséhez hatásos adagolásban adjuk. A beadás folyamatosan vagy időszakosan végezhető oly módon, hogy a páciensben a készítmény mennyisége elégséges legyen a hízósejtek proliferációjának serkentéséhez.
A találmány további tárgya eljárás hízósejtek vagy vörösvérsejtőssejtek differenciálódásának kezelt betegben való indukálására, melynek során a fentebb leírt gyógyszerkészítményt a hízósejtek vagy vörösvérsejtőssejtek differenciálódásának indukálásához hatásos mennyiségben adjuk be a páciensnek. A beadás módjai a szakemberek számára jól ismertek, s ezek közé tartozik, többek között, az orális, intravénás és parenterális beadás. A készítményt a hízósejtek vagy vörösvérsejtőssejtek differenciálódásának indukálásához hatásos dózisban adjuk be. A beadás folyamatosan vagy időszakosan végezhető, oly módon, hogy a páciensben a készítmény mennyisége elégséges legyen a hízósejtek vagy vörösvérsejtőssejtek differenciálódásának indukálásához.
A találmány további tárgya eljárás az őssejtek szintjének növelésére vagy serkentésére a c-kit ligandum önmagában vagy kombinációban való alkalmazásával. A különösen alkalmas kombinációk a G-CSF-fel, a GM-CSF-fel, az IL-l-gyel, az IL-3-mal, az IL-6-tal, az IL-7-tel és az ΜΙΡΙ-α-val képzett kombinációk. A leghatárosabb kombináció a KL+IL-1, IL-3 és IL-6 volt. Az IL-1, IL-3, IL-6 és GM-CSF önmagában azonban mérsékelten hatásos, különösen az 5fluor-uracillal (5-FU) kezelt csont nagy proliferatív potenciálú telepképzési vizsgálatában (HPP-CFU; high proliferative potential colony forming assay). Az említett faktorok kombinációi in vivő, in vitro vagy ex vivő egyaránt alkalmazhatók.
A találmány további tárgya eljárás csontvelő-átültetés elősegítésére vagy leukémia kezelésére páciensben, melynek során a fentebb leírt gyógyszerkészítmény csontvelő-átültetés elősegítéséhez vagy leukémia kezeléséhez hatásos mennyiségét adjuk be a páciensnek. A beadás módjai a szakemberek számára jól ismertek, s ezek közé tartozik, többek között, az orális* intravénás és parenterális beadás. A készítményt a; csontvelő-átültetés elősegítéséhez vagy a leukémia kezeléséhez hatásos dózisban adjuk be. A beadás folyamatosan vagy időszakosan végezhető oly módon, hogy a páciensben a készítmény mennyisége hatásos legyen. Ez az eljárás különösen alkalmas akut csontvelői leukémia kezelésére és krónikus csontvelői leukémia enyhítésére. A c-kit ligandum növelheti a fehérvérsejtek fejlődésének mértékét, s ezáltal kemoterápiára fogékonynyá teszi azokat.
A találmány további tárgya eljárás melanoma kezelésére a páciensben, melynek során a fentebb leírt gyógyszerkészítmény melanoma kezeléséhez hatásos mennyiségét adjuk be a páciensnek. A beadás módjai a szakemberek számára jól ismertek, s ezek közé tartozik, többek között, az orális, intravénás és parenterális beadás. A készítmény beadását a melanoma kezeléséhez alkalmas adagolásban végezzük. A beadás folyamatosan vagy szakaszosan végezhető oly módon, hogy a páciensben a készítmény mennyisége hatásos legyen.
Az oldékony c-kit ligandum (KL) polipeptid mutációval úgy is megváltoztatható, hogy a c-kit biológiai aktivitása megszűnjön, miközben a c-Árihez kötődő képessége fennmarad. Ilyenformán a találmány további tárgya eljárás allergiás betegségek kezelésére a páciensben, melynek során a fentebb leírt oldékony, mutált c-kit ligandumot és gyógyszerészetileg megfelelő hordozót az allergia kezeléséhez hatásos mennyiségben adunk a páciens10
HU 219 540 Β nek. Az ilyen készítmény a mutált c-kit ligandumantagonista vizes formáját tartalmazó aeroszolként alkalmazható. A fentebb leírt KL-antagonista, ugyancsak aeroszol formában, szintén hatásos lehet az allergia ellen.
A c-kit ligandumantagonistát tartalmazó, helyileg alkalmazott gyógyszerkészítmény hatásos gyógyszer lehet az artritisz, a reumatoid artritisz, a bőrkeményedés és a bőr akut allergiás reakcióinak kezelésében. A c-kit ligandumantagonista szintén hatásos lehet allergiás kötőhártya-gyulladás, allergiás betegséget követő szövetkárosulás ellen, valamint profilaktikus szerként anafilaxiás sokk ellen. Mivel a hízósejtek hisztaminreakciót közvetítenek, a c-kit antagonista vagy a c-kú-ligandummal komplementer antiszensz molekula hatásos lehet a hisztamin közvetítette reakciók (beleértve az allergiás reakciókat és a gyomorsav-szekréciót) gátlásában.
A c-tö-antagonista hatásos lehet a melanoma kezelésében, mivel a melanociták fejlődése erősen függ a ckit ligandumtól. Hasonlóan a KL-antagonista felhasználható a leukémia elleni kezelésben is.
Amint az a szakemberek számára jól ismert, a készítmény allergia kezeléséhez hatásos mennyisége a kezelt pácienstől és a kezelni kívánt allergia típusától függően változik. A készítmény beadása folyamatosan vagy szakaszosan végezhető oly módon, hogy a készítmény a páciensben hatásos legyen.
A találmány további tárgya eljárás c-kit (KL) polipeptid biológiai aktivitásának mérésére, melynek során a normális csontvelői hízósejteket proliferációjuk indukálásához alkalmas körülmények között a c-kit (KL) polipeptidmintájával inkubáljuk, a kétszeresen mutáns csontvelői hízósejteket megfelelő körülmények között a c-kit ligandum (KL) polipeptidmintájával inkubáljuk, a kapott termékeket 1 * 3H-timidinnel inkubáljuk, meghatározzuk a normális csontvelői hízósejtek DNS-ébe, illetve a kétszeresen mutáns csontvelői hízósejtek DNS-ébe beépült timidin mennyiségét, s összehasonlítjuk a normális és a kétszeresen mutáns csontvelői hízósejtekbe épült timidin mennyiségét, s így mérjük a c-kit ligandum (KL) polipeptid biológiai aktivitását.
A találmány leírásában a DNS-molekulák specifikus nukleotidjaira utaló hivatkozások a DNS kódolószálának nukleotidjaira vonatkoznak. A leírásban az alábbi, hagyományos rövidítéseket alkalmazzuk:
C - citozin; T - timidin; U - uracil; A - adenozin; G - guanozin
1. példa: c-kit ligandum tisztítása
Kísérleti anyagok
Egerek; az embriók azonosítása
WBB6 +/+ és W/W, C57B16 1FV/+ és WB W/+ egereket a Jackson Laboratorytól (Bar Harbor, ME) szereztünk be. Heterozigóta fF41/+ egereket dr. J. Barker (Jackson Laboratory) biztosított számunkra, melyeket tenyészetünkben testvérkeresztezéssel szaporítottunk. A vemhesség 14-15. napján a W!+ egerek párosításából származó magzatok máját kivettük. A W/W magzatokat halvány színük, és az alomban lévő JJ7+ és +/+ magzatokéhoz képest kis méretű májuk alapján azonosítottuk. Azonosságukat az egyes magzatokból származó hízósejtek c-kit proteinjének analízisével is megerősítettük.
Hizósejttenyészetek; peritoneális hízósejtek előállítása; áramlásos citometria
A hízósejteket felnőtt egerek csontvelőjéből és 14-15 napos magzatok májsejtjeiből 10% magzati borjúszérummal (FCS), WEHI-3B sejtekből származó kondicionált tápközeggel, nemesszenciális aminosavakkal, nátrium-piruváttal és 2-merkapto-etanollal kiegészített RPMI-1640 (RPMI-Complete [C]) (60) tápközegben tenyésztettük. A nemtapadó sejteket begyűjtöttük, hetente új tenyészeteket készítettünk, s a sejtsűrűségét 7 x 105 sejt/ml alatt tartottuk. A tenyészetek hízósejttartalmát hetenként sejtcentrifüga-készítmények 1% toluidinkékkel metanolban történő festésével határoztuk meg. 4 hét elteltével a tenyészetek általában több mint 95%-ban tartalmaztak hízósejteket, s ezeket használtuk a proliferációs vizsgálathoz. A peritoneális hízósejteket C57B1/6 egerekből hasüregük 7-10 ml RPMI-C tápközeggel végzett kiöblítésével nyertük. A hízósejteket sűrűséggradiens-centrifügálással PBSben (Ca2+ és Mg2+ nélkül) 22% metrizamidon (Nycomed, Oslo, Norvégia), lényegében egy korábbi leírás szerint (61) tisztítottuk. A hízósejteket standard eljárással metanolban 5 percig toluidinkékkel festettük, majd 5 percig vízzel és berberin-szulfáttal mostuk (62). A hízósejteket egy korábbi leírás szerint (38) c-tö-specifikus nyúlantiszérummal jelöltük (amely felismeri a ckit extracelluláris determinánsait), s FACSCAN-en analizáltuk (Becton Dickinson).
Hízösejt-proliferációs vizsgálat
A hízósejteket az IL-3 eltávolítása érdekében RPMI-ben háromszor mostuk, majd 96 zsebes lemezen a tesztminták kétszeres sorozathígításaival, 0,2 ml térfogatban, óxlO4 sejt/ml koncentrációval RPMI-C tápközegben tenyésztettük. A lemezeket 24 óráig 37 °C-on inkubáltuk, minden zsebhez 2,5 pCi 3H-TdR-t adtunk, s az inkubálást további 6 órán keresztül folytattuk. A sejteket üvegszálas szűrőn gyűjtöttük össze, s meghatároztuk a timidin DNS-be történt beépülését.
Fibroblasztkondicionált tápközeg elkészítése
Balb/3T3 sejteket (1) konfluens állapot eléréséig hengeres palackban, 10% botjúszérummal (CS), penicillinnel és sztreptomicinnel kiegészített, módosított MÉM tápközegben (DME) tenyésztettük. A tápközeget eltávolítottuk, s a sejteket foszfátpufferelt sóoldattal (PBS) kétszer mostuk. A sejtekhez boíjúszérum nélküli DME-t adtunk, s a kondicionált tápközeget 3 nap múlva gyűjtöttük össze. A sejteket szérumot tartalmazó tápközeggel 1 vagy 2 napig újratenyésztettük, majd szérummentesre mostuk, s szérummentes tápközeggel tovább tenyésztettük, s 3 nap elteltével egy második adag kondicionált tápközeget gyűjtöttünk össze. Hogy eltávolítsuk a sejteket, a kondicionált tápközeget (CM) 2500 percenkénti fordulattal 15 percig centrifugáltuk, 0,45 mikronos filteren szűrtük, 4 °C-on fagyasztottuk. A kondicionált tápközeget ezután Pellicon ultrafiltráló készülékkel, majd Amicon sejtkeverővei (mindkettőben 10 000 kD molekulatömegig átengedő membránnal) 100-200-szoros értékre koncentráltuk.
HU 219 540 Β
Oszlopkromatográfia
PBS-sel ekvilibrált, 100 ml térfogatú oszlop alkalmazásával Blue Agarose kromatográfiát (BRL, Gaithersburg, MD) végeztünk. 50-80 ml kondicionált fibroblaszt tápközeg (FCM) koncentrátumot töltöttünk az oszlopra, s 1 órás ekvilibrálás után az aktív anyagot tartalmazó átfolyt frakciót összegyűjtöttük, s PEG 8000-rel dializálócsőben 15-20 ml-re koncentráltuk.
A gélfíltrációs kromatográfiát ACA54 Ultrogel (LKB, Rockland, MD) oszlopon (2,6 x 90 cm) végeztük, amelyet PBS-sel ekvilibráltunk és molekulatömeg-markerekkel - szarvasmarhaszérum-albumin (Mr=68 000), kimotripszinogén (Mr=25 700) és ribonukleáz A (Mr= 14 300), melyeket a Pharmaciától (Piscataway, NJ) kaptunk - kalibráltunk. A Blue Agarose oszlopról lejött koncentrátumot a gélfíltrációs oszlopra töltöttük, az átfolyási sebességet 37,5 ml/óra értékre állítottuk be, s 7,5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.
Anioncserélő és reverz fázisú HPLC (RP-HPLC)
A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát Waters HPLC-rendszer (W600E Powerline controller, programozható, több hullámhosszt érzékelő 490E detektor és 810 Baseline Workstation, Waters, Bedford, MA) alkalmazásával végeztük. A gélfiltrálással kapott aktív frakciókat 0,05 M Tris-HCl-ban (pH=7,8) dializáltuk, s 0,05 M Tris-HCl-dal (pH=7,8) ekvilibrált ProteinPak™ DEAE-5PW HPLC-oszlopra (7,5 mmx 7,5 cm) töltöttük. A kötött proteineket 0-0,05 M közötti TrisHC1 (pH=7,8) lineáris gradienssel eluáltuk. A kötött proteineket 0-0,4 M NaCl (0,02 M Tris-HCl-ban, pH=7,8) lineáris gradienssel eluáltuk. Az átfolyási sebesség 1 ml/perc volt, és 2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.
Az RP-HPLC-t a Vydactól származó félpreparatív és analitikai méretű C18-oszlop alkalmazásával végeztük. Mindkét oszlop esetében az A puffer 100 mM ammónium-acetát (pH=6,0), a B puffer pedig 1-propanol volt. Az anioncserélő kromatográfiával nyert biológiailag aktív frakciókat összegyűjtöttük és a félpreparatív oszlopra töltöttük. A kötött proteineket az első 10 percben 0%-23% 1-propanol meredek gradienssel, majd 70 percig 23%-33% 1-propanol gradienssel eluáltuk. Az átfolyási sebességet 2 ml/perc értékre állítottuk be, s 2 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A biológiailag aktív frakciókat összegyűjtöttük, az A pufferrel 1:1 arányban hígítottuk, majd az analitikai C18 reverz fázisú oszlopra töltöttük. A proteineket 10 percig 0%-26% 1-propanol meredek gradienssel, majd 70 percig 26%-33% 1-propanol enyhébb gradiensével eluáltuk. Az átfolyási sebesség 1 ml/perc volt, és 1 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. Analitikai C4 reverz fázisú oszlopon az elválasztást 0,1%-os vizes TFA-ban 0-80% acetonitril lineráris gradiensével végeztük.
Izoelektromos fokuszálás (IEF)
A részlegesen tisztított KL egy ml-ét 20 v/v% glicerinnel és 2 v/v% amfolinnel (ampholyne) egészítettük ki (pH=3,5-10) (LKB, Gaithersburg, MD). 2% amfolint (pH=3,5-10) tartalmazó 5-60% glicerin sűrűséggradienst töltöttünk az IEF-oszlopba (LKB 8100). A mintát a gradiens azonos denzitású részébe vittük, majd elvégeztük az izoelektromos fokuszálást (2000 V, óra, 4 °C). 5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, s meghatároztuk valamennyi frakció pH-ját. A frakciókat RPMI-C-vel szemben dializáltuk, majd biológiai aktivitásra teszteltük.
Vörösvérsejtőssejtes vizsgálat A kifejlett állatok csontvelőjéből, lépéből és 14 napos magzati májból származó sejteket 105, 106, illetve 107 sejt/ml mennyiségben 1,2% metil-cellulózzal, 30% FCS-sel, 100 μΜ 2-merkapto-etanollal és humán, rekombináns eritropoetinnel (2 egység/ml; Amgen, Thousand Oaks, CA) kiegészített Iscove-féle módosított Dulbecco tápközegben (Iscove, 1978; Nocka és Pelus, 1987) szélesztettük. A tenyészeteket 7 napig inkubáltuk, s inverziós mikroszkóp alatt számoltuk a hemoglobint tartalmazó telepeket és a burstöket. A csontvelősejtek tenyészeteihez az optimális fejlődés érdekében 0,1 mM hemet (Kodak) adtunk. Ahol jeleztük, a tenyészetekhez tisztított KL-t, IL-3-at, illetve WEHI-3 CM-et (10 v/v%) vagy rekombináns egér- (patkány-) IL-3-at (50 E/ml) adtunk.
Kísérleti módszerek
Rövid időtartamú hizósejt-proliferációs vizsgálat fibroblaszt eredetű aktivitás kimutatására Annak érdekében, hogy azonosítsuk és méljük a fibroblaszt eredetű növekedésifaktor-aktivitást (amely elősegíti a normál hízósejtek proliferációját, a W/W* hízósejtekét azonban nem), a csontvelői hízósejteket (BMMC) IL-3-tartalomtól mentes tápközegben mostuk, majd 20-szorosra koncentrált fibroblasztkondicionált tápközeget (FCM) vagy WEHI-3 CM-et (IL—3) tartalmazó tápközegben inkubáltuk, és 3H-timidinnel 24 óráig végzett inkubálás után meghatároztuk a 3Htimidin beépülését. A normális +/+, és a mutáns W/W* egerekből származó csontvelői hízósejtek (BMMC) IL-3-ra adott reakciója hasonló volt (1. ábra), a 20szorosra koncentrált fibroblasztkondicionált tápközeg azonban a +/+ hízósejtek proliferációját segítette elő, miközben a W/W* hízósejtek esetében csekély proliferációt tapasztaltunk. A koncentrált FCM-et más IL-3-függő sejtek proliferációját serkentő képességére is teszteltük. Ismeretes, hogy a 32D mieloidsejtekből hiányzanak a c-kit géntermékek (35). A 32D sejtek esetében FCM-mel nem tapasztaltunk proliferációt, miközben a WEHI-3 CM normális proliferációt eredményezett (ábrát nem közlünk). Ezen eredmények, valamint mind a W, mind a IP allélek ismert c-h'í-defektusai (38) arra engednek következtetni, hogy az FCM-aktivitás a működőképes c-kit protein hízósejtekben (BMMC) való expresszálódásától függ, s hogy ez a protein lehet a c-Aíí-receptor liganduma. Ezenfelül az FCM-aktivitás megkülönböztethető az IL—3-tól. Ilyenformán a normális és W mutáns hízósejtek egyszerű és specifikus vizsgálati rendszert biztosítanak a feltételezett c-kit ligandum (KL) fibroblasztkondicionált tápközegből történő tisztításához.
Hízósejtserkentő aktivitású anyag (KL) tisztítása A KL tisztításához 5 liter, Balb/3T3 fibroblasztokból készített, szérummentes kondicionált tápközeget ultrafiltrálással 50-szeresére koncentráltunk. A koncentrátumot PBS-sel ekvilibrált Blue Agarose oszlopon en12
HU 219 540 Β gedtük át, s összegyűjtöttük a hízósejtserkentő aktivitású anyagot tartalmazó, átfolyt frakciót, majd polietilénglikollal bekoncentráltuk. A normális hízósejtek felhasználásával végzett biológiaiaktivitás-meghatározáson kívül a tisztítás folyamán a csúcsoknak megfelelő frakciókat W/W* hízósejtekkel is teszteltük, melynek során kismértékű akvitivást tapasztaltunk. A Blue Agarose oszlopról nyert anyagot ACA54 oszlopon gélfíltrálással frakcionáltuk (2/A. ábra). A biológiai aktivitás egy nagy (55-70 kD-nak megfelelő) és egy kis (30 kD-nak megfelelő) csúcsként eluálódott. A főcsúcshoz tartozó frakciókat összegyűjtöttük, dializáltuk, és DEAE-5PW-oszlopon NaCl-gradienssel FPLC-kromatográfíával frakcionáltuk (2/B. ábra). Az aktív anyag 0,11 M NaCl-koncentrációnál eluálódott az FPLC-osz- 15 lopról. A csúcshoz tartozó frakciókat összegyűjtöttük, s félpreparatív C18-oszlopon ammónium-acetát/npropanol gradienssel, HPLC-vel kromatografáltuk (2/C. ábra). A C18-oszlopról 30% n-propanolkoncentrációnál eluálódott aktív anyagot 1:1 arányban A puf- 20 ferrel hígítottuk, s analitikai C18-oszlopon újrakromatografáltuk (2/D. ábra). Az aktív anyag egy csúcsban ismét 30% n-propanolkoncentrációnál eluálódott, ami az eluensgörbe fő abszorbanciacsúcsának (280 nm) felelt meg. Hasonló eredményeket kaptunk, amikor víz és 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril oldószerekkel C4oszlopot alkalmaztunk (3/B. ábra). A két oldószerrendszer alkalmazásával végzett elválasztásokból származó aktív frakciók SDS-PAGE-analízisével és ezüstfestésével egy fő sávot mutattunk ki, amelynek mobilitása 5 28-30 kD molekulatömegnek felelt meg. E sáv jelenléte és nagysága jó összefüggést mutat a biológiai aktivitás csúcsával (3. ábra). A sáv vándorlásában a redukált, illetve a redukálatlan feltételek mellett nem volt jelentős különbség, ami azt jelzi, hogy a KL nem diszul10 fiddimer (3/C. ábra). Mind a redukált, mind a redukálatlan SDS-PAGE-vizsgálattal három független sávot tapasztaltunk, s ezek a tisztított anyag méretének heterogenitását jelezték. A protein 280 nm-nél tapasztalt abszorbancia alapján becsült teljes mennyisége összefüggést mutatott a standardként alkalmazott BSA-ra vonatkoztatva ezüstfestéssel kimutatott mennyiséggel. Amint az 1. táblázatban látható, a Balb/3T3 sejtek kondicionált tápközegéből a KL tisztítása több mint 3000szeres, a kezdeti teljes aktivitás kitermelése pedig 47% volt. A 0,2 ml-es vizsgálati térfogatban a +/+ sejtek 50%-os proliferációját 50 egység aktivitásként definiáljuk, ami hozzávetőleg 0,5 ng proteinnek felel meg. A részlegesen tisztított anyag (ioncsere után végzett) izoelektromos fokuszálása 3,7-3,9 pH-tartományban 25 mutatott fő aktivitáscsúcsot, ami azt jelenti, hogy a KL izoelektromos pontja 3,7-3,9.
1. táblázat
A KL tisztítása Balb/3T3 kondicionált tápközegből
Tisztítási lépés Összes protein (mg) Összes aktivitás (Ex 105) Specifikus aktivitás (E/mg) Tisztítás (x-szcrcs) Kitermelés (%)
FCM (51)
50 x koncentráció 152 - - - -
B. Agarose 32 720 2,2 x1ο4 1 100
Gélfiltráció 28 480 lJxlO4 0,77 67
DEAE-5PW 3 720 2,4 xlO5 11 100
Cl8 félpreparatív 0,079 600 7,6x106 345 83
C18 analízis 0,004 340 8,5 xlO7 3863 47
A különböző c-kit/W mutációkkal rendelkező hízósejtek KL-re adottproliferatív reakciói A tisztított KL-t a W, Wv és 1F41 allélekre homozigóta és heterozigóta, vad típusú állatokból származó hízósejtek proliferációját serkentő képességére teszteltük. Az eredeti W alléi egy működésképtelen c-feí-receptort határoz meg, így a W allélre homozigóta állatok súlyosan vérszegények, és születés előtt elpusztulnak, s a W/W magzatokból származó hízósejtek Balb/3T3 fibroblasztokkal együtt tenyésztve nem képesek a proliferációra (3, 38). A W' és 1F41 allélek részlegesen hiányos c-tö-receptort határoznak meg, s a homozigóta mutáns állatok életképesek (64, 65, 38). A homozigóta IF' állatok súlyos vörösvértestes (makrocita) vérszegénységben szenvednek, s hízósejtjeik az együtt-tenyésztéses vizsgálatban csekély reakciót mutatnak. A kevésbé súlyos FF41 allélre homozigóta állatok enyhébb vérszegénységben szenvednek, s hízósejtjeik közepes mértékű reakciót mutatnak az együtt-tenyésztéses vizsgálatban. A homozigóta és heterozigóta mutáns, valamint a +/+ hízósejtek a JF’ és fF41 alléleket hordozó állatok csontvelőjéből, és a W alléit hordozó, 14 napos magzatok májából származtak (amint azt korábban leírták, 38). A magzati májból származó W/W hízósejtek a KL hatására nem mutattak proliferatív reakciót, miközben mind a heterozigóta (W/+), mind a normális (+/+) hízósejtek hasonló mértékű proliferatív reakciót adtak (4. ábra). A Wv/W' egerek csontvelőből származó hízósejtjei nagyon alacsony proliferációs reakciót mutattak a KL-re, bár 100 E/ml koncentrációnál tapasztaltunk némi proliferációt (a +/+ értékek 10%-át; 4. ábra). A W'/+ hízósejtek, a heterozigóta W/+ hízósejtekkel ellentétben, közepes mértékű (40%) reakciót mutattak, ami megfelel e mutáció domináns jellemzőinek. A W4l/W41 és W4l/+ hízósejtek a KL-lel szintén csökkent mértékben voltak képesek a proliferációra, bár nem olyan kifejezetten, mint
HU 219 540 Β a W* és W alléleket hordozó hízósejtek, s ez összhangban áll ezen mutációk in vivő fenotípusával (4. ábra). Az eredmények azt mutatják, hogy kapcsolat van a W, W1 és IF41 alléleket hordozó hízósejtek KL-re vonatkozó érzékenysége és ezen mutációk in vivő tulajdonságainak súlyossága között.
Fentiekkel ellentétben, a mutáns hízósejtek WEHI-3CM-re (IL-3) adott proliferatív reakcióit nem befolyásolták a különböző W mutációk.
A KL hasűri (peritoneális) hízósejtek proliferációját serkentő képessége
A hasüregből származó hízósejteket (PMC) részletesen jellemezték, s a csontvelői hízósejtekkel (BMMC) ellentétben, a kötőszöveti hízósejteket képviselik (66). A hasűri hízósejtek egyedül IL-3 hatására nem szaporodnak, érett fenotípusuk és életképességük azonban NIH/3T3 fíbroblaszttal együtt tenyésztve fenntartható (66). Ennek megfelelően, célunk az volt, hogy meghatározzuk, vajon a KL képes-e serkenteni a PMC proliferációját. Elsőként azt vizsgáltuk, hogy a c-kit expresszálódik-e a PMC-ben A hasűri hízósejteket metrizamid gradiensben ülepítéssel tisztítottuk, s a sejt felületén a c-to-expressziót anti-c-fa'í-szérummal vagy normális nyúlszérummal végzett immunfluoreszcenciával vizsgáltuk. A PMC-készítményről toluidinkékkel és berberin-szulfáttal végzett festés alapján 90-98%-os tisztaságot állapítottunk meg. A berberinszulfát a kötőszöveti hízósejtek szemcséiben lévő heparin-proteoglikánokat festi meg, s ezenkívül ismert az is, hogy a DNS-t is festi (5. ábra) (62). A csontvelői hízósejtek és nyálkahártya-hízósejtek elsősorban diB/E-proteoglikánokat, s nem heparin-proteoglikánokat tartalmaznak (67), így a berberin-szulfát nem festi a csontvelői hízósejtekben lévő szemcséket (5/A. ábra). A c-to-expresszió áramlásos citometriával (sejtelemzéssel) végzett vizsgálata azt mutatta, hogy gyakorlatilag valamennyi PMC a BMMC esetében tapasztalttal azonos szinten expresszálta a c-kitet (5/B. ábra). A KL-t ezek után annak meghatározására vizsgáltuk, hogy befolyásolja-e a PMC életben maradását, illetve serkenti-e a PMC proliferációját (5/C. ábra). Ha a PMC-t kizárólag tápközegben, vagy a BMMC számára optimális koncentrációban adott WEHI-3CM-mel együtt tenyésztettük, a PMC életképessége 3-4 napon belül elvész, annak ellenére, hogy néhány sejt a WEHI-3CM-ben hosszabb ideig fennmaradt. A hasűri hízósejteket (PMC) KL jelenlétében tenyésztve életképességük fennmaradt, s két hét elteltével a sejtszám 5000-ről 60 000-re emelkedett. A KL a csontvelői hízósejtek számának hasonló növekedését eredményezte. A PMC WEHI-3CM-re adott proliferatív reakciójának hiányával ellentétben, a BMMC WEHI-3CM jelenlétében - a várakozásoknak megfelelően - képes volt a proliferációra. 1 és 2 hetes tenyésztést követően a sejteket toluidinkékkel és berberin-szulfáttal festettük. A tenyészetben a PMC érett fenotípusa mindkét festékkel festve a sejtek 100%-ában megmaradt, bár a berberin-szulfátos festés a frissen izolált PMC-vel összehasonlítva némiképp csökkent.
A KL vörösvérsejtburstök (BFU-E) kialakulását serkentő képessége
A W mutációk egy lényeges vonatkozását a vörösvérsejt-sejtcsaládra gyakorolt hatásaik jelentik. A mutációk által okozott defektusok in vivő eredménye a vörösvértestes (makrocita) vérszegénység, amely a legsúlyosabb allélekre homozigóták számára letális (47, 65). A W/W* egerek csontvelőjéből származó vörösvérsejtőssejt-populációk analízise a BFU-E és a CFU-E számának csekély csökkenését mutatja (68, 69). A W/W magzatok májában a BFU-E száma nem változik, de a CFU-E számának nagymértékű csökkenése tapasztalható, ami azt sugallja, hogy a c-kit a vörösvérsejt érésének meghatározott stádiumaiban játszik szerepet, feltételezhetően a CFU-E-stádium előtt (35). Hogy meghatározzuk a KL vörösvérsejt-képződésben játszott szerepét, s hogy még pontosabban meghatározzuk a c-kitreceptorhoz fűződő kapcsolatát, meghatároztuk a KL BFU-E kialakulására gyakorolt hatását. Csontvelői, lép- és magzati máj sejteket standard tenyésztési feltételekkel KL, eritropoetin és WEH1-3CM jelenlétében vagy hiányában szélesztettünk. A BFU-E számát a tenyésztés 7. napján határoztuk meg. Eritropoetin hiányában sem a WEHI-3CM-mel, sem a KL-lel nem tapasztaltunk vörösvérsejt-fejlődést. Eritropoetin jelenlétében a lépsejtekből származó BFU-E-t a KL dózisfüggő módon serkentette; a csak eritropoetinnel végzett tenyésztésnél tapasztalt 12 BFU-E/106 sejt mennyiségről számuk - a maximális serkentést jelentő 2,5 ng/ml KLkoncentrációnál - 50 BFU-E/106 sejtmennyiségre emelkedett (6. ábra) A BFU-E-mennyiségére gyakorolt hatás mellett a KL jelentős mértékben növelte a burstök átlagos méretét is. A lépsejtek KL+eritropoetin kombinációjával végzett tenyésztésével kapott BFU-E mennyiség hasonló volt a WEHI-3 CM+eritropoetin kombináció alkalmazása esetén tapasztalthoz. Ezzel szemben, a KL+eritropoetin kombináció nem serkentette a BFU-E csontvelősejtekből történő proliferációját, míg a KL+eritropoetin kombináció 105 csontvelősejtből 18 BFU-E képződését indukálta. A KL 14 napos magzati májból származó sejtekre gyakorolt hatását is megvizsgáltuk, s a lépsejtekkel kapottakkal hasonló eredményekhez jutottunk. Eritropoetin egyedüli alkalmazásával a magzati májsejtekből jelentős számú BFU-E kialakulását tapasztaltuk, 2,5 ng/ml KL alkalmazásával azonban a BFU-E mennyisége 6±2-ről 20±5-re emelkedett. WEHI-3CM+eritropoetin jelenlétében (a magzati májsejtek esetében) 18±3 BFU-E mennyiséget tapasztaltunk.
Hogy tovább értékeljük a KL (a vörösvérsejtcsaládot illetően) c-fe/hez fűződő kapcsolatát, azt vizsgáltuk, hogy a KL elősegíti-e a vörösvérsejtburstök (BFU-E) W/W egerek magzati májsejtjeiből történő kialakulását. W/W és W/+ vagy +/+ májsejteket W/+ egerek pároztatásából származó magzatokból a megtermékenyítést követően 16,5 nappal preparáltunk. A W/W mutáns embrió májában a magvas sejtek összes száma nyolcszor kevesebb volt, mint az egészséges magzatokban. A W/W és W/+ vagy +/+ magzati májból kialakult BFU-E száma az IL-3+eritro14
HU 219 540 Β poetin kombinációval nevelt tenyészetekben hasonló volt, s a csak eritropoetinnel nevelt tenyészetekben a BFU-E alacsony szintje szintén összehasonlítható volt (7. ábra). A KL a W/W májsejtekből származó BFU-E-t nem stimulálta az eritropoetinnel hasonló szinten, miközben a W/+ vagy +/+ májsejtekből származó BFU-E-t az eritropoetin+IL-3 kombinációval tapasztalttal hasonló szinten serkentette. Ezen eredmény arra enged következtetni, hogy a vörösvérsejtőssejtek KL-re mutatott érzékenysége a c-faV-működéstől függ.
Kötési vizsgálatok tisztított KL-lel A tisztított KL-t a klór-amin T módszerrel 125I-izotóppal, nagy specifikus aktivitással (2,8 xlO5 cpm/ng) jelöltük. A jelölt KL alkalmazásával a KL hízósejtekhez történő specifikus kötődését vizsgáltuk. A W/W hízósejtek esetében nem tapasztaltunk kötődést, az alomtársakból származó hízósejtekhez azonban a KL jó kötődést mutatott. A hízósejtekhez való kötődés után a KL-t c-tó-antiszérummal együtt kicsaptuk. A KL W mutáns hízósejtekhez való kötődése összefüggést mutat a sejt felületén lejátszódó c-fa'f-expresszióval [V, 37(-+-) vs. W(-)].
A c-kit ligandum aminosavszekvenciájának megha10 tározása
A c-h'í-receptorproteint a fentiekben leírtak szerint izoláltuk, s a protein szekvenciáját a szakemberek számára jól ismert eljárásokkal határoztuk meg. A protein aminosavszekvenciája (egybetűs rövidítéssel) az N-ter15 minálistól kezdődően a következő:
KEIXGNPVTDNVKDITKLVANLPNDYMITLNYVAGMXVLP
Az egybetűs rövidítések jelentése: K=lizin; E=glutaminsav; I=izoleucin; X=ismeretlen; G=glicin; N=asz- 20 paragin; P=prolin; V=valin; T=treonin; D=aszparaginsav; L=leucin; A=alanin; Y=tirozin; M=metionin.
Az a felfedezés, hogy a W lokusz és a c-kit protoonkogén allélkapcsolatban áll egymással, lényeges információt szolgáltatott a c-fa'í-fejlődési folyamatokban és 25 a kifejlett állatban játszott szerepéről. A c-hz-receptor működésének ismerete viszont a c-hí-receptor ligandumot termelő szövet- és sejttípusokról nyújt kulcsfontosságú tudnivalókat. A c-kit ligandum azonosítására végzett kísérletben Balb/3T3 fibroblasztok kondíció- 30 nált tápközegéből egy KL-nek elnevezett növekedési faktort izoláltunk. A Balb/3T3 fibroblaszt olyan sejttípus, amelyről feltételeztük, hogy c-kit ligandumot termel, amelynek biológiai tulajdonságai a hízósejtek biológiáját és a vörösvérsejtképzést illetően megfelelnek a 35 c-kit ligandumtól elvártaknak. A KL molekulatömege 30 kD, izoelektromos pontja 3,8. A KL a CSF-1-től, a PDGF-A-tól és a PDGF-B-től eltérően nem diszulfiddimer (70, 71). A KL PBS-ben végzett gélfiltrálása során mutatott viselkedése 55-70 kD molekulatömeget jelzett, ami fiziológiai körülmények között nem kovalensen kötött dimerek jelenlétére utal. A KL annak alapján, hogy a csontvelői (BMMC) és a tisztított hasűri hízósejtek (CTMC) proliferációját serkenti, a W mutáns egerekből származó csontvelői hízósejtekét azonban 45 nem, a hízósejtekre gyakorolt hatását illetően eltér az egyéb vérképzési növekedési faktoroktól, mint amilyen az IL-3 és az IL-4. A Balb/3T3 fibroblasztok a G-CSF, GM-CSF, CSF-1, LIF és IL-6 vérképzési növekedési faktorok forrásául szolgálnak, azonban 50 ezek egyike sem rendelkezik a KL biológiai működésével (35, 71). Sőt a KL proteinszekvenciájának meghatározásából származó előzetes eredmények azt mutatják, hogy a KL különbözik az ismert proteinszekvenciáktól.
Annak alapján, hogy a Wmutáns egerekből hiányoz- 55 nak a hízósejtek, arra következtettek, hogy a c-kit és liganduma a hízósejtek in vivő proliferációjában, differenciálódásában és/vagy életben maradásában kulcsfontosságú szerepet játszik (72, 73). A pontos stádiumok, melyeknél a c-fó-működés szükséges a hízósejtek diffe- 60 renciálódásához, nem ismertek. A csontvelőből, magzati májból vagy lépből származó, in vitro IL-3-mal kezelt hízósejtek hasonlítanak a nyálkahártya eredetű hízósejtekre (MMC), bár azok a végső állapotba differenciálódott két hízósejttípus, az MMC és a CTMC prekurzorát képviselik. Nyilvánvaló, hogy a csontvelői hízósejt (BMMC) vérképződési köztes sejttípusokból való kialakulásához nincs szükség a c-kitre, hiszen az IL-3függő hízósejtek mind a normális, mind a W mutáns egerek csontvelőjéből vagy magzati májából hasonló hatékonysággal alakíthatók ki (60). A c-kit BMMC-ben és CTMC/PMC-ben lejátszódó expressziójának, s a BMMC és az érett CTMC/PMC KL-re vonatkozó érzékenységének bizonyítása azt sugallja, hogy a c-kit a hízósejt-differenciálódás több stádiumában is szerepet játszik. Kimutatták, hogy a fibroblasztokon kívül az IL-3+IL-4, IL-3+PMA kombinációk, valamint az IgE-receptorok keresztkötése szintén serkenti a CTMC in vitro proliferációját (74, 75, 76, ΊΊ, 78). Ezen biológiai reakciómódosítókkal ellentétben, melyek allergiás és gyulladásos reakciókat közvetítenek, a KL FCS 40 jelenlétében egyedül képes stimulálni a CTMC proliferációját. Ilyenformán a KL valószínűleg olyan hízósejt-proliferációs és -differenciálódási aktivitással rendelkezik, amely termelődését és a célsejtek működését illetően független az említett immunreakcióktól.
A hibás W mutációk vörösvérsejt-képződésre gyakorolt hatása azt jelzi, hogy a c-kit a vörösvérsejtek érési folyamatában döntő szerepet játszik (80, 68, 69). A W/W magzatok májából származó vörösvérsejtőssejtek analízise - összehasonlítva a normális alomtársakból származó őssejtekkel - azt sugallja, hogy a chí-működés hiányában az érési folyamat a BFU-Estádiumig normálisan zajlik, de a CFU-E-stádiumba való továbbfejlődés gátolt (35). Ez a rendellenesség in vitro úgy küszöbölhető ki, hogy a tenyészethez IL-3-at adunk, amely az eritropoetinnel együtt elegendő a W/W* és +/+ csontvelőből származó BFU-E érésének elősegítéséhez (78). Ebben a folyamatban az IL-3 in vivő szerepét nem ismerjük, s ilyenformán a vörösvérsejt-differenciálódás ezen stádiumában a c-kit biztosíthatja a kritikus fontosságú működést. A KL azon képes15
HU 219 540 Β sége, hogy a lép és magzati máj sejtjeiből az eritropoetinnel együtt serkenti a vörösvérsejtburstök kialakulását, összhangban áll azzal, hogy a c-kit a vörösvérsejtképződés ezen szakaszában működik. Sőt, a KL W/W BFU-E-t serkentő képessége arra enged következtetni, hogy a c-tó-működés szükséges a KL-közvetített BFU-E-képződéshez, s ez hasonló ahhoz, hogy a KLközvetített hízósejt-proliferációhoz is szükség van a ckit működésére. A Balb/3T3 sejtek - a BFU-E magzati májsejtből történő differenciálódása során - burstképződést elősegítő hatását korábban leírták (79). Valószínű, hogy a Balb/3T3 sejtek ezen aktivitásáért a KL a felelős. Találmányunkkal kapcsolatos érdekes felfedezés, hogy a KL nem képes stimulálni a 7 napos BFU-E csontvelőből történő differenciálódását. Ez azt sugallja, hogy a magzati májban, a kifejlett egyedek lépében és a kifejlett egyedek csontvelőjében különböznek a BFU-E fejlődési szükségletei. Az újabb kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a KL a csontvelőben egy korábbi multipotens vörösvérsejtőssejtet serkent, amely a tenyészetben később (14-20. napon) jelenik meg. Annak érdekében, hogy a KL BFU-E-képződésre gyakorolt közvetlen hatását bizonyítsuk, s hogy kirekesszük az egyéb járulékos sejtek és endogén növekedési faktorok jelenlétét, a kísérleteket tisztított őssejt-populációkkal kell végezni.
Úgy gondoljuk, a W mutációk a vörösvérsejt-képződés és a hízósejtfejlődés rendellenességeinek előidézésén kívül befolyásolják a vérképzési rendszer stemsejt kompartmentjeit is. A befolyásolt sejtpopulációk közé tartozhatnak a léptelepképző egységek (spleen colony forming units; CFU-S), amelyek a letálisan sugárkezelt egerek lépében mieloidtelepeket termelnek, továbbá a különböző sejtcsaládokat illetően hosszú időtartamú újratelepítési képességgel rendelkező sejtek. Célunk annak meghatározása, hogy a KL-nek - esetleg más vérképzési növekedési faktorokkal együtt - van-e hatása a vérképződési stemsejt-populációk önmegújulási, illetve differenciálódási képességére, miáltal azonosíthatjuk a stemsejt kompartment azon stádiumát (stádiumait), ahol a c-kit! W géntermék működik.
Az egér Steel lokuszának (SÍ) mutációi a W mutációkat hordozó egerekben tapasztalhatókhoz hasonló pleiotrópiás fenotípusokat eredményeznek a vérképzésben, a melaninképződésben és az ivarsejtképződésben (47, 51). Az SÍ mutációk azonban az W mutációkkal ellentétben a mutációk celluláris céljainak mikrokömyezetére hatnak, s nem sejtautonómok (46). A W és az Sl mutációk párhuzamos és egymást kiegészítő hatásai miatt felvetették annak lehetőségét, hogy az Sl gén a ctó-receptor ligandumát kódolja, vagy egy olyan génterméket, amely közvetlen kapcsolatban áll e ligandum termelésével és/vagy működésével (9). E feltevéssel összhangban, az Sl/Slá embrió eredetű fibroblasztok vagy az Sl/Sld fibroblasztokból készített kondicionált tápközeg nem serkentik a csontvelői hízósejtek (BMMC), illetve a hízósejtőssejtek proliferációját, s feltehetően nem termelnek működőképes KL-t (16, 84). Ha a KL a c-kit liganduma, úgy molekuláris analízissel meghatározható a KL és az Sl géntermék azonossága, sőt előre meghatározhatjuk, hogy a KL-t Sl mutációkat hordozó egérnek adva a mutáció legalább néhány tünete kezelhető-e.
Humán fibroblaszt vagy humán méhlepény könyvtár screeneléséhez a fentebb leírt eljárásokkal 1,4 kb hosszúságú cDNS-t használtunk. A humán c-kit ligandumot kódoló gént izolálva a gént a fentebb leírt eljárásokkal karakterizáljuk.
2. példa: Nukleinsavszekvencia izolálása
Kísérleti anyagok: egerek és szövettenyészetek
WBB6+/+, C57BL/6J, C57BL/67 Wv/+,
WB6 W/+, C3HeB/Fej a/a CaJ Sl Hm és M. spretus egereket a The Jackson Laboratorytól (Bar Harbor, ME) szereztünk be. Az interspecifikus keresztezéshez nőstény C57BL/6J és hím M. spretus egereket párosítottunk, s ezen keresztezés utódjaiban a C57BL/6J és M. spretus allélek öröklődését vizsgáltuk (lásd alább). A (C57BL/6J xM. spretus) F, nőstény utódokat C57BL/6J hímekkel kereszteztük vissza.
Felnőtt +/+, Wv/Wv és W/+ egerek csontvelőjéből, és 14-15 napos W/W magzatok májából 10% magzati borjúszérummal (FCS), WEHI-3B sejtekből készített kondicionált tápközeggel, nemesszenciális aminosavakkal, nátrium-piruváttal és 2-merkapto-etanollal kiegészített RPMI-1640 tápközegben (komplett RPMI) (36, 60) hízósejteket tenyésztettünk. BALB/c 3T3 sejteket (1) Paul O’Donneltől (Sloan-Kettering Institute, New York, NY) kaptunk, s ezeket 10% borjúszérummal, penicillinnel és sztreptomicinnel kiegészített Dulbeccoféle módosított MÉM tápközegben neveltük.
A KL tisztítása és aminosavszekvenciájának meghatározása
A KL-t másutt leírt (37) hízósejt-proliferációs eljárással BALB/c 3T3 sejtek kondicionált tápközegéből tisztítottuk. A kondicionált tápközeget ezután Pellicon ultrafiltráló berendezéssel, majd Amicon sejtkeverővei 100-200-szoros töménységűre koncentráltuk. A koncentrátumot Blue Agarose-on (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) kromatografáltuk, s az aktív anyagot tartalmazó átfolyt frakciót polietilénglikol 8000-rel dializálócsőben koncentráltuk, majd ACA54 Ultrogel-oszlopon (LKB, Rockland, MD) gélfiltrációs kromatográfiával frakcionáltuk. A biológiai aktivitás egy 55-70 kD-nak megfelelő nagy, és egy 30 kD-nak megfelelő kis csúcsként eluálódott. A főcsúcsot képviselő frakciókat összegyűjtöttük, dializáltuk, és NaCl-gradienssel, FPLC-vel DEAE-5PW-oszlopon frakcionáltuk. Az aktív anyag 0,11 M NaCl-koncentrációnál eluálódott az FPLC-oszlopról. A csúcsnak megfelelő frakciókat összegyűjtöttük, s ammónium-acetát/n-propanol gradienssel félpreparatív C18-oszlopon HPLC-vei kromatografáltuk. A félpreparatív C18-oszlopról 30%-os n-propanolkoncentrációnál eluálódott aktív anyagot 1:1 arányban hígítottuk, s analitikai 08oszlopon újrakromatografáltuk. Az aktív anyag egy csúcsban ismét 30% n-propanolkoncentrációnál eluálódott, amely az eluens abszorbanciagörbéje (280 nm) főcsúcsának felel meg. Víz és 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril oldószerek alkalmazásával C4-oszloppal is
HU 219 540 Β hasonló eredményeket kaptunk. Az N-terminális aminosavszekvenciát Applied Biosystems 477A on-line PTH aminosavanalizátorral határoztuk meg (Hewick és munkatársai, 1961).
Jódozás
A KL-t Stanley és Gilbert (1981) módosított eljárásának alkalmazásával klór-amin T-vel jódoztuk. Röviden: a jelölő reakcióelegy 25 μΐ teljes térfogatban, 0,25 M foszfátpufferben (pH=6,5) 200 ng KL-t 2 nmol klór-amin T-t, 10% dimetil-szulfoxidot és 0,02% polietilénglikol 8000-et tartalmazott. A reakciót 4 °C-on 2 percig végeztük, s 2 nmol cisztein és 4 μΜ KJ hozzáadásával állítottuk le. A KL-t PDlO-oszlopon (Pharmacia) végzett gélfiltrálással választottuk el a szabad NaI-tól. A jódozott KL-t maximum 2 hétig 4 °C-on tároltuk.
Kötési vizsgálat
A kötési vizsgálathoz alkalmazott puffer RPMI-1640 tápközegből, 5% BSA-ból (Sigma), 20 mM HEPES-pufferből (pH=7,5) és NaN3-ból állt. A kötési kísérleteket nemtapadó sejtekkel 96 zsebes szövettenyésztő csészékben végeztük, zsebenként 100 μΐ térfogatban 2 χ 105 sejttel. A ψ2 sejtek kötési kísérleteit 24 zsebes csészékben 300 μΐ térfogatban végeztük. A sejteket a kompetitor és a jelölt KL hozzáadása előtt 15 perccel a kötési vizsgálathoz alkalmazott pufferben ekvilibráltuk. A nemspecifikus kötődés meghatározásához a 125I-KL hozzáadása előtt 30 perccel, 10-szeres feleslegben jelöletlen KL-t vagy anti-c-fc'í nyúlszérumot adtunk az elegyhez. A sejteket a 125I-KL-lel 90 percig inkubáltuk, majd a nemtapadó sejteket 150 μΐ FCS-sel pelletáltuk. A pelleteket fagyasztottuk és értékeltük.
Immunprecipitáció és keresztkötésképzés
A csontvelői hízósejteket (BMMC) l25I-KL-lel standard kötődési feltételek mellett inkubáltuk, és 4 °C-on FCS-ben, majd PBS-ben mostuk. A sejteket 1% Triton X-100, 20 mM Tris (pH=7,4), 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 10% glicerin, valamint fenil-metilszulfonilfluorid (1 mM) és leupeptin (20 pg/ml) (proteázinhibitorok) elegyében lizáltuk (lásd 35). A lizátumok immunprecipitációját normál nyúlszérummal, nyulak - vkit tirozin-kináz dómén egy fragmensével (23) végzett - immunizálásával előállított c-tö-specifikus szérummal, vagy rekombináns vacciniavírusban cDNS által expresszált egér (patkány) c-kz/tel (36) végeztük. Az együttes kicsapási kísérletekhez az immunprecipitátumokat A mosóoldattal [0,1% Triton X-100, 20 mM Tris (pH=7,4), 150 mM NaCl, 10% glicerin] háromszor mostuk, SDS mintapufferben szolubilizáltuk, és SDS-PAGE gélelektroforézissel és autoradiográfiával analizáltuk. A keresztkötési kísérlethez a sejteket 30 percig, 4 °C-on, PBS-ben diszukcin-imidil-szubsztráttal (0,25 mg/ml) inkubáltuk, PBS-ben mostuk, s a fentiek szerint lizáltuk. A kicsapást követő mosást a következők szerint végeztük: egyszer B mosóoldatban (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100), háromszor C mosóoldatban (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% SDS, 5 mM EDTA) és egyszer D mosóoldatban (10 mM Tris, 0,1% Triton X-100).
cDNS-szintézis, PCR-ampliflkáció (RT-PCR- és szekvenciameghatározás
Az RT-PCR-amplifikációt lényegében egy korábbi leírás szerint (53) végeztük. A cDNS-szintézishez konfluens BALB/c 3T3 sejtekből származó 1 pg poli(A) RNS-t 40 °C-on 0,05 M Tris-HCl (pH=8,3), 0,075 M KC1, 3 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol 200 μΜ dNTP-k és 25 egység RNSsin (Promega) 25 μΐ-nyi elegyében 50 pmol antiszensz primerrel és 50 egység Moloney egérleukémia-vírus reverz-transzkriptázzal 30 percig inkubáltuk. Az elegyhez újabb 50 egység reverz-transzkriptázt adva az inkubálást további 30 percig folytattuk. A cDNS amplifikálásához a reakcióelegy térfogatát 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH=8,3), 1,5 mM MgCl2, 0,01 m/V% zselatin és 200 μΜ dNTP-k 25 μΐnyi elegyével 50 μΐ-re egészítettük ki, melyhez 50 pmol szensz prímért és 2,5 egység Taq DNS-polimerázt adtunk, s az elegyet 25-30 cikluson keresztül automatikus PCR-készülékben (Perkin-Elmer Cetus) amplifikáltuk. Az amplifikált fragmenseket agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk, megfelelő restrikciós endonukleázokkal emésztettük, s a szekvencia-analízishez M13mpl8 és M13mpl9 fágba szubklónoztuk.
A cDNS izolálása és szekvenálása
Ehhez a vizsgálathoz a Clontech-től beszerzett egér 3T3 fibroblaszt lambda gl 1 cDNS-könyvtárat használtuk. A kétszeres ismétléssel végzett screenelést gazdabaktériumként Escherichia coli Y1090 sejtekkel végeztük (48), s próbaként 5’-jelölt oligonukleotidot alkalmaztunk. A hibridizálást 63 °C-on, 6 x SSC-ben, a filterek utolsó mosását 2xSSC és 0,2% SDS elegyében 63 °C-on végeztük. A rekombináns fágot EcoRI-gyel emésztettük, s az inszerteket a szekvenciaanalízishez M13-ba klónoztuk. A cDNS-ek nukleotidszekvenciáját Sanger és munkatársai (49) didezoxi láncterminációs eljárásával — primerekként szintetikus oligodezoxinukleotidok alkalmazásával - mindkét szálon, és az átfedésekkel együtt határoztuk meg.
DNS- és RNS-analizis
A genom DNS-t „farok”-fragmensekből készítettük, restrikciós enzimekkel emésztettük, elektroforézissel frakcionáltuk, s nejlonmembránra vittük. A hibridizáláshoz próbaként az 1,4 kb hosszú KL cDNS-t, és a TG.EB transzgénvonal transzgéninszerciós helyéből származó TIS Dra/Sal próbát alkalmaztuk.
A BALB/c 3T3 sejteket guanidin-izotiocianátban homogenizáltuk, s az RNS-t Chirgwin és munkatársai (10) eljárása szerint izoláltuk. Teljes celluláris RNS-t (10 pg) és poli(A)+ RNS-t 1% agaróz-formaldehidgélen frakcionáltuk, majd nejlonmembránra (Nytran, Schleichler & Schuell) vittük; az előhibridizálást és a hibridizálást korábbi leírások szerint (86, 35) végeztük. A hibridizáláshoz próbaként 32P-foszfáttal jelölt 1,4 kb KL cDNS-t használtunk (87).
c-kit és c-kit ligandum monoklonális antitestek előállítása
A humán monoklonális antitestek izolálásához 8 hetes Balb/c egerekbe intraperitoneálisan a találmány szerinti, fentiek szerint előállított, tisztított, humán, oldékony c-kit ligandum (KL) polipeptid (vagy oldékony
HU 219 540 Β fragmense) 50 pg-ját (komplett Freund-féle adjuvánsban 1:1 térfogatarányban) injektáltuk. Az egereknek ezután az inkomplett Freund-féle adjuvánssal kevert oldékony ligandum polipeptiddel vagy oldékony fragmensével havonta emlékeztető oltást adtunk, s farki vénájuk- 5 ból vért vettünk. A fúziót megelőző 4., 3. és 2. napon az egereknek intravénásán, sóoldatban oldott 50 pg polipeptiddel (vagy fragmensével) emlékeztető oltást adtunk. A szplenocitákat korábban leírt, s a tudományban ismert eljárások szerint nem szekretáló myeloma- 10 sejtekkel fuzionáltuk. 2 hét múlva a hibridoma felülúszókat a fentebb leírtak szerint c-tó-receptorprotein elleni kötődési aktivitásra vizsgáltuk, majd a pozitív kiónokat izoláltuk és szaporítottuk.
A c-fo'r-receptor elleni monoklonális antitestek előál- 15 lításának másik módszere szerint a fenti eljárást követtük, azzal a különbséggel, hogy az eljárást követően az egereknek a c-áz'Z-receptorproteinnel adtunk emlékeztető oltást.
Más módon, patkánymonoklonális antitestek izolálása érdekében Sprague-Dawley- vagy Louis-patkányokat patkányból származó polipeptiddel oltottuk, s a kapott szplenocitákat patkánymyeloma- (y3-Ag 1.2.3) sejtekhez fuzionáltuk.
Kísérleti eredmények
A KL vérképződési növekedési faktort kódoló egér (patkány)-cDNS izolálása és karakterizálása
A KL-proteint fentebb leírt kromatográfiás lépések sorozatával (beleértve az anioncserélő és reverz fázisú HPLC-t) BALB/c 3T3 sejtekből készített kondicionált tápközegből izoláltuk (37). Amint korábban leírtuk, a KL N-terminális 40 aminosavának szekvenciáját a következőként határoztuk meg:
KEIXGNPVTDNVKDITKLVANLPNDYMITLNYVAGMXVLP
Hogy degenerálatlan, homológ hibridizációs próbát származtassunk, az 5’ végükön endonukleázos felismerési helyekkel együtt a 10-16. aminosavnak (szensz primer), illetve a 31-36. aminosavnak megfelelő (antiszensz primer), teljesen degenerált oligonukleotid pri- 25 mereket szintetizáltunk (8. ábra). A polimeráz-láncreakció reverz-transzkriptázos módosításával (RT-PCR) a KL 10-36. aminosavát meghatározó KL mRNS-szekvenciának megfelelő cDNS-t nyertünk. A cDNS-szintézishez és a PCR-amplifikációhoz degenerált oligo- 30 nukleotid primerekkel együtt BALB/c 3T3 sejtekből származó poli(A)+ RNS-t alkalmaztunk.
Az amplifikált DNS-fragmenseket Ml 3-ba szubklónoztuk, s három inszert szekvenciáját határoztuk meg.
A primerek közötti szekvenciát egyedülállónak talál- 35 tűk, s úgy értékeltük, hogy ez határozza meg a pontos aminosavszekvenciát (8. ábra). Ezután a PCR-termékek egyedülálló szekvenciájának megfelelő oligonukleotidot (49 nukleotid) használtuk a lambda gtl 1 egérfibroblaszt-könyvtár screeneléséhez. 1,4 kb hosszúságú kiónt kaptunk, amely 3’ közepétől 3’ végéig teijedő, nyitott leolvasási keretet tartalmaz, amely 270 aminosavat kódol (11. ábra). A KL aminosavszekvenciájának első 25 aminosava szignálszekvenciára jellemző tulajdonságokkal rendelkezik. A szignálszekvenciát a tiszti- 45 tott proteinből származó N-terminális peptidszekvencia (26-65. aminosav) követi. 21 aminosavból álló hidrofób szekvencia (217-237. aminosav), melyet karboxilvégén pozitív töltésű aminosavak követnek, transzmembrán szegmens (dómén) jellemzőit mutatja. A szig- 50 nálszekvencia és a transzmembrán dómén közötti szekvenciában négy N-kötött glikozilálási hely, és négy, rendszertelenül elhelyezkedő cisztein található. A transzmembrán szegmenst 33 aminosavból álló C-terminális szegmens követi, amely nem éri el a terminációs jelet 55 (a klón végét). A KL aminosavszekvencia ilyenformán transzmembrán proteinjellemzővel rendelkezik: N-terminális szignálszekvencia, extracelluláris dómén, transzmembrán dómén, s C-terminális intracelluláris szegmens található benne.
A KL-specifikus RNS-transzkriptumok BALB/c 3T3 egerekben való azonosításához RNS-blot analízist végeztünk (12. ábra). A poli(A)+ RNS-t tartalmazó lenyomaton, próbaként az 1,4 kb-os KL cDNS-t alkalmazva egy nagy, 6,5 kb-os transzkriptumot, és két kisebb, 4,6 és 3,5 kb-os transzkriptumot azonosítottunk. Az azonos transzkriptumokat az N-terminális proteinszekvenciából származó, végjelölt oligonukleotiddal detektáltuk. Ez az eredmény azt mutatta, hogy a KL-t a BALB/c 3T3 sejtekben nagy mennyiségben expresszálódó, nagyméretű mRNS kódolja.
A KL oldékony formája a c-kit-receptor liganduma
A fibroblasztból származó KL vérképzési növekedési faktorról kimutattuk, hogy serkenti a primer csontvelői hízósejtek és a hasűri hízósejtek proliferációját, s hogy burstképződést elősegítő aktivitást mutat. Hogy meghatározzuk, vajon a KL képezi-e a c-h'í-receptor ligandumát, először a KL c-fo'í-proteint nagy mennyiségben expresszáló sejtekhez [hízósejtek (BMMC) és
NIH ψ2 sejtekhez, melyek expresszálják a c-kit cDNSt] való specifikus kötődését vizsgáltuk. A KL-t nagy specifikus aktivitás eléréséhez módosított klór-amin T eljárással (88) 125I-izotóppal jelöltük. A jelölt anyag SDS-PAGE-analízise egy sávot (28-30 kD; 13. ábra) eredményezett, s a hízósejt-proliferációs vizsgálatok tanúsága szerint a jelölt anyag megőrizte biológiai aktivitását. 4 °C-on mértük a 125I-KL növekvő koncentrációinak a c-kit cDNS-t expresszáló NIH ψ2 sejtekhez, NIH ψ2 kontrolisejtekhez, normális csontvelői hízósejtekhez, és W/W, W/+ és Wv/Wv csontvelői hízósejtekhez való kötődését. A 14. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a jelölt KL kötődött a NIH ψ2 c-kit sejtekhez és a +/+, W/+ és Wv/Wv csontvelői hízósejtekhez, a NIH ψ2 kontrolisejtekhez, illetve W/W hízósejtekhez azonban nem. A Wv mutáció a c-kit kináz doménje „missense” mutációjának eredménye, amely károsítja az in vitro kinázaktivitást, de nem befolyásolja a c-kitprotein sejtfelületi expresszióját (36). Ezzel ellentétben, a W mutáció egy összeillesztési hibából eredő 60 delécióból származik, amely eltávolítja a c-kit protein18
HU 219 540 Β transzmembrán doménjét, miáltal a protein nem expresszálódik a sejt felületén (36). A fentieken kívül, a 125I-KL kötési vizsgálata jelöletlen KL-lel és két, különböző anti-c-k/7 antiszérummal is kiegészíthető. Az eredmények azt mutatták, hogy a 125I-KL olyan sejtekhez kötődik, melyek felületükön c-kitet expresszálnak.
Hogy közvetlenebb bizonyítékot szerezzünk arról, hogy a KL a c-fo7-receptor liganduma, meghatároztuk, hogy a receptor-ligandum komplexek tisztíthatók-e ckit antiszérummal végzett immunprecipitációval. A kísérlethez arra van szükség, hogy a KL-c-h'í komplex stabil legyen, s ne befolyásolják a c-tó-receptor szolubilizálásához használt detergensek. A receptor-ligandum komplexek ilyen tulajdonságainak példái a közeli rokonságban álló makrofág kolóniastimuláló faktor (CSF-1) receptor- és PDGF receptorrendszerekből származnak (89). A 125I-KL-t 4 °C-on végzett inkubálással kötöttük a csontvelői hízósejteken lévő receptorokhoz. A szabad 125I-KL eltávolítása érdekében végzett mosás után a sejteket Triton X-100 lízises eljárással szolubilizáltuk, majd A protein-Sepharose-hoz kötött anti-v-kií és anti-c-fa'í nyúlszérummal precipitáltuk. Amint az immunkomplexek SDS-PAGE analíziséből látható (15/A. ábra) - melynek során bizonyítottuk az intakt 125I-KL antitö szérummal kialakított immunkomplexeket tartalmazó mintákból történő eltávolítását - a 125I-KL az antikií szérummal, s nem az immunanyagot nem tartalmazó kontrollokkal végzett inkubálással nyert immunprecipitátumokban maradt.
A c-áií-KL receptor-ligandum komplexek további karakterizálásához azt határoztuk meg, hogy a KL a ctöhez kapcsolható-e keresztkötéssel. A csontvelői hízósejteket 125I-KL-lel inkubáltuk, s a keresztkötött diszukcinimidil szubsztráttal mostuk és kezeltük. A sejtlizátumok immunprecipitálását anti-v-tö antiszérummal végeztük, és SDS-PAGE-analízissel vizsgáltuk. Autoradiográfiával három mintát kaptunk: az egyik, hozzávetőleg 30 kD-nál a nem keresztkötött c-hitel együtt kicsapódott KL-t reprezentálja, a második 180-190 kD-nál egy kovalens kötésű c-hz-KL monomer-monomer komplexnek felel meg, a harmadik pedig egy nagy molekulatömegű struktúra az elválasztó- és a tartógél közötti érintkezési felületnél (15/B. ábra). Hasonló méretű molekulaszerkezeteket kaptunk akkor is, ha a sejtlizátumokat előzetes immunprecipitáció nélkül közvetlenül SDS-PAGE-analízissel vizsgáltuk. Az immunanyagot nem tartalmazó szérummal végzett kicsapással nem tapasztaltunk l25Iizotóppal jelölt molekulákat. A nagy molekulatömegű struktúrák kialakulását akkor tapasztaltuk, ha a KL-t hízósejtekkel együtt inkubáltuk; a keresztkötéses KL önmagában végzett inkubálásával azonban nem. Összegezve: az eredmények azt bizonyítják, hogy a KL a c-kit liganduma, és specifikusan kötődik a c-hí-receptorhoz.
A KL térképezése az Sl lokusz alapján
Annak tesztelése érdekében, hogy a KL kódolása az Sl lokuszon történik-e, az Sl-hez szorosan kapcsolódó lokuszt illetően a KL térképi helyzetének meghatározásához rekombináns analízist alkalmaztunk. Ez a lokusz a TG.EB transzgénvonal (85) transzgéninszerciójának helye. Meghatároztuk, hogy az inszerciós helyből klónozott genomszekvenciák az Sl-től 0,8±0,8 cM távolságban helyezkednek el, ilyenformán ez képviseli az Sl-hez legközelebbi ismert markert.
A KL transzgéninszerciós hellyel kapcsolatos térképezéséhez interspecifikus térképezési analízist végeztünk, melynek során a C57BL/6J egereket Mus spretus fajba tartozó egerekkel kereszteztük. Ez a módszer azt a tapasztalatot hasznosítja, miszerint a klónozott DNS restrikciós fragmenshosszúság-polimorfizmusa (RFLP) sokkal nagyobb gyakorisággal tapasztalható a különböző fajokba tartozó egerek között, mint a különféle beltenyésztett laboratóriumi törzsek között (90). Az 1,4 kbos KL cDNS-próba, és a transzgéninszerciós helyről származó TIS Dra/Sal próba közötti kapcsoltságot a nekik megfelelő C57BL/6J, illetve M. spretus allélek öröklése azonosságának értékelésével állapítottuk meg. Ezek az allélek a Taq 1 restrikciós emésztéssel feltárt RFLP-k analízisével könnyen megkülönböztethetők. A kapcsoltsági analízis eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be. Az 53 utód közül csak egy volt rekombináns. Ez l,9±l,9%-os rekombinációs gyakoriságnak felel meg. Mivel ez az érték nagyon közel áll a transzgéninszerciós hely és az Sl között mért genetikai térképtávolsághoz, ez az eredmény összhangban áll azzal a elképzeléssel, hogy a KL az Sl lokuszon helyezkedik el.
2. táblázat
A KL gén elhelyezkedésének térképezése interspecifikus keresztezéssel végzett kapcsoltsági analízissel
Próba Utódok
Nem rekombináns Rekombináns
l,4kbKLcDNS B6 Sp B6 Sp
TIS Dra/Sal B6 Sp Sp B6
32 20 0 1
n=53 rekombinációs %= 1,9±1,9
Az interspecifikus keresztezés utódaiban a c57BL/6J (B6), illetve az M. spretus (Sp) allélek öröklése azonosságát (lásd vizsgálati eljárások) a KL 1,4 kbos cDNS próbájának és az Sl-hez szorosan kapcsolt tanszgén inszerciós helyről származó TIS Dra/Sal próba Taq 1 RFLP-inek (lásd eredmények) értékelésével határoztuk meg. A százalékos rekombinációt Green (1981) szerint számítottuk.
A KL által meghatározott lokuszt az eredeti Sl mutációt hordozó egerekben is vizsgáltuk (50). E célból azt a tapasztalatot vettük figyelembe, hogy a tanszgén inszerciós hely lokusza a beltenyésztett törzsekben polimorfiát mutat, s ezt hasznosítottuk az Sl genotípus magzati fejlődés során történő meghatározásához. Párosítással a C3HeB/Fej törzsben fenntartott Sl mutációkat hordozó C57BL/6J egereket hoztunk létre, s az Sl alléit hordozó F, utódokat egymással kereszteztük (C57BL/6J SPCH/+ S1C3H/+). Az ebből a párosításból származó homozigóta SI/SI utódok vérszegények és a C3HeB/Fejből származó RFLP-re (a transzgén integrációs helynél)
HU 219 540 Β homozigóták (16. ábra). A nem vérszegény egerek vagy homozigóta Sl/+-ak (s a C3HeB/Fej-ből vagy a C57BL/6J-ból származó polimorfizmusra heterozigóták) vagy vad típusúak, s a C57BL/6J polimorfizmusra homozigóták. Az SI/+ és SI/SI egerekből származó genom-DNS-t az 1,4 kb-os KL cDNS próbával hibridizálva a homozigóta SI/SI DNS-hez nem tapasztaltunk hibridizációt (16. ábra). Ilyenformán úgy tűnik, a KL proteint kódoló lokusz az SÍ mutációval kiesik. Ez az észrevétel még jobban alátámasztja azt a nézetet, hogy a KL az SÍ génterméke.
A c-kit protoonkogén és az egér (patkány) W lokusz közötti allélizmus felfedezése a c-tó-receptor fejlődésben és a kifejlett állatokban mutatott pleitrópiás működését bizonyította, sőt ez mutatta meg az emlősök transzmembrán tirozin-kináz-receptorának első genetikai rendszerét. Az SÍ lokusz és a c-kit/W lokusz mutációi azonos celluláris célokra hatnak. Ezen mutációk egymást kiegészítő és párhuzamos tulajdonságai miatt feltételeztük, hogy a c-fc'í-receptor ligandumát az SÍ lokusz kódolja.
A találmányban leírt kísérletek azt bizonyítják, hogy az SÍ gén kódolja a c-Az'í-receptor ligandumát. E következtetés bizonyítékai a következők. A c-tó-receptor működésének ismerete alapján a c-Ai'Z-receptor feltételezett ligandumát (KL) azonosítottuk és tisztítottuk (37). A KL működőképes c-Azí-receptort expresszáló sejtekhez való kötődése, és a KL és a c-kit protein közötti stabil komplex kialakulása alapján bebizonyítottuk, hogy a KL specifikusan kötődik a c-Azt-receptorhoz. KL-specifikus cDNS-klónokat származtattunk, s kimutattuk, hogy a KL gén az egér 10-es kromoszómájának SÍ lokuszán helyezkedik el. Azt is bebizonyítottuk, hogy a KL-szekvenciák az SÍ egerek genomjából kiestek. Ezen eredmények együttesen arra engednek következtetni, hogy a KL-t az SÍ lokusz kódolja, és a KL a c-AzZ-receptor liganduma, s így képezi a SÍ defektusának molekuláris alapját.
A KL cDNS-klónból leszármaztatott aminosavszekvencia azt sugallja, hogy a KL egy egységes transzmembrán protein. A KL primer transzlációs termékének szerkezeti jellemzői ilyenformán hasonlítanak a CSF-1 jellegzetességeihez. A CSF-1 transzmembránmolekulaként szintetizálódik, amely proteolitikus hasítással oldékony, szekretálódó termékké alakul (91, 44). A CSF-1-hez hasonlóan, feltételezhetően a KL is sejtfelületi molekulaként expresszálódik, amely oldékony proteinné alakulhat át. A BALB/c 3T3 sejtekből készült kondicionált tápközegből tisztított protein képviselheti a KL oldékony formáját, amely a sejtmembrán formából proteolitikus hasítással szabadul fel. Bár a KL protein poszttranszlációs érési folyamatát és expresszióját még nem jellemezték, a c-kitPW receptorrendszer proliferatív és migrációs működését illetően feltételezhetően a KL sejtfelületen kötött formája közvetíti a sejt-sejt interakciókat. A KL sejtmembránkötött formáját elismerő nézettel egyetértésben, egy oldékony c-Az'Z-receptor-lúgos foszfatáz fúziós proteinről kimutatták, hogy a BALB/c 3T3 sejtek felületéhez kötődik, az SI/SI egerekből származó fibroblasztokhoz azonban nem (14).
A c-Az'Z-receptor liganduma azonosításának legjelentősebb vonatkozása abban rejlik, hogy ezáltal lehetővé válik a c-kit pleiotrópos működéseinek vizsgálata. A vérképzési rendszerben a c-AzZ/W mutációk a vörösvérsejt- és hízósejt vonalakra hatnak, s bizonyították a stemsejt kompartmentre gyakorolt hatást is. A vörösvérsejtek érési folyamatában a c-Az'z/KL kulcsfontosságú szerepet játszik, s ez legjobban a mutáns állatok vérszegénységéből látható. Ezenfelül a W/W és SI/SId állatok májában a CFU-E csökkent mennyiségben van jelen, miközben a BFU-E mennyisége normális, ami arra enged következtetni, hogy a c-kit/KL a BFU-E-stádiumból a CFU-E differenciálódási stádiumba való fejlődést segíti elő (90, 35). E tekintetben a KL-ről kimutatták, hogy a BFU-E (7 napos), valamint a csontvelőben lévő korai multipotens vörösvérsejt-prekurzorok (melyek tenyészetben később, a 14-20. napon jelennek meg) proliferációját és differenciálódását serkenti (37).
A W és SÍ mutáns egerekben a hízósejtek hiánya alapján a c-kit/KL kulcsfontosságú szerepét mutatták ki a hízósejtek in vivő proliferációjában, differenciálódásában és/vagy túlélésében (72, 73). A pontos stádiumok, melyekben a c-Az'Z/KL működés szükséges a hízósejtdifferenciálódáshoz, nem ismertek. A csontvelői hízósejtek (BMMC) csontvelőből vagy magzati májból in vitro leszármaztatásához nincs szükség c-Az'Z/KL működésre, hiszen a csontvelői hízósejtek összehasonlítható mennyiségben állíthatók elő a normál és a W mutáns egerekből egyaránt (60). A csontvelői hízósejtek és a kötőszöveti hízósejtek KL hatására mutatott proliferációjának általunk végzett vizsgálata azt mutatja, hogy a c-Az'Z/KL az IL-3-tól és IL—4-től [melyekről úgy tartják, hogy allergiás és gyulladásos reakciók mediátorai (66)] független hízósejt-proliferációban több stádiumban játszik szerepet. A stemsejt kompartmentben valószínűleg a befolyásolt sejtpopulációk közé tartoznak a léptelepképző egységek (CFU-E), amelyek a letálisan sugárkezelt egerek lépjében mieloidtelepeket képeznek, továbbá a különböző sejtcsaládokat illetően hosszú időtartamú újratelepítési képességgel rendelkező sejtek (80, 81, 82, 83). Célunk annak meghatározása, hogy a KL-nek - esetleg más vérképzési növekedési faktorokkal együtt - van-e hatása a vérképződési stemsejt-populációk in vitro önmegújulási, illetve differenciálódási képességére, miáltal azonosíthatjuk a az(oka)t a stádiumo(ka)t, ahol a c-kit/W géntermék működik a stemsejtekben. A c-kit másik lehetséges működése lehet a nem ciklusos működésű sejtek ciklusos működésűvé való átalakulásának serkentése (31). Az SIISId és a W/Wv egerek megnőtt sugárzási érzékenysége arra enged következtetni, hogy a c-kit hasonló szerepet játszik a stemsejtek dinamikájában is, sőt a rokon PDGF-receptorról ismert, hogy elősegíti a sejtciklusba való belépést.
Az ivarsejtképződésben a W és az SÍ mutációk az elsődleges (ős)csírasejtek proliferációjára és túlélésére, valamint a fejlődés korai stádiumában a petezsák szplanchnopleurájából a genitális redőkbe történő vándorlására hatnak. A születés utáni ivarsejtképződés során a c-A/Z-expressziót az éretlen és az érett oocitákban
HU 219 540 Β és a spermatogónium A- és B-sejtekben, valamint az intersticiális szövetben mutatták ki (39). A melanogenezisben a c-h'í/KL feltehetően a fejlődés korai stádiumában a melanoblasztdúclécből a perifériára való vándorlásában, illetve az érett melanociták vándorlásában működik közre. A KL hozzáférhetősége most már lehetővé teszi a c-foY-receptor fenti sejtrendszerekben mutatott működésének in vitro vizsgálatát.
Az SÍ mutáns egerekben az a mikrokömyezet, melyben a c-fa'/-expresszáló sejtek működnek, hibás, s ez a c-kit ligandum termelődésének feltételezett helyszíne. A mutáció külsődleges természete miatt a KL-t in vivő termelő sejtek pontosan nem ismertek, a W és SÍ mutációk által okozott genetikai defektusokat reprodukáló in vitro rendszerek azonban valamelyest világosabbá teszik ezt a kérdést. A hosszú időtartamú csontvelőtenyészet-rendszerben az SI/SId tapadósejtek hibásak, a nemtapadó vérképzési sejtek azonban nem. A hízósejt-fibroblaszt közös tenyészetrendszerben az SI/SId fibroblasztok hibásak, a hízósejtek azonban nem (12, 16). Ezen in vitro rendszerekből származó eredmények azt sugallják, hogy a vérképzési sztrómasejtek, valamint az embrionális és kötőszöveti fibroblasztok termelik a KL-t. Az embrionális eredetű BALB/c 3T3 sejtvonal jelentős szinten expresszálja a KL-t, s a tisztításhoz ez képezte a KL forrását. A KL-expresszáló sejttípusok ismerete segítheti annak meghatározását, hogy a c-kit működik-e az emésztőtraktusban, az idegrendszerben, a méhlepényben és bizonyos arckoponyái struktúrákban, vagyis azokon a helyeken, ahol c-tó-expressziót írtak le (35, 39). Egy SÍ vagy W fenotípusról sem ismert, hogy kapcsolatban állna az említett sejtrendszerekkel.
A KL gén, az SÍ lokusz és az egér 10-es kromoszómájának Tg.EB transzgéninszerciós lokusza közötti szoros kapcsoltság meghatározásához interspecifikus viszszakeresztezéseket alkalmaztunk. Korábban hasonló megoldást alkalmaztunk az SÍ lokusz szomszédságában lévő Tg.EB lokusz térképezéséhez. Az a tapasztalat, hogy a KL-kódoló szekvenciák kiestek az eredeti SÍ alléiból, az SÍ lokusz és a KL gén azonosságát támasztja alá. Az SÍ alléi deléciójának mérete jelenleg nem ismert. Fontos lenne meghatározni, hogy az SÍ deléció befolyásolja-e a szomszédos géneket.
Az SÍ alléiban a KL-kódoló szekvenciák hiánya azt jelzi, hogy ez az alléi a KL nullmutáció eredménye. A legtöbb, SÍ alléira homozigóta egér születés előtt vörösvértestes (makrocita) vérszegénységben elpusztul, s a kevés túlélő szőrzete pigmenthiányos, s nincsenek csírasejtjeik (5). Ez a fenotípus - a KL és a c-kit ligandumreceptor kapcsolatával összhangban - nagyon hasonló a különböző c-kitfW mutációk okozta fenotípusokhoz. Annak ellenére, hogy léteznek különbségek az SI/SI és a W/W homozigóták között, például a csírasejtfejlődésben az SÍ mutációnak kifejezettebb hatása lehet, s a vérképződést illetően az SÍ súlyosabb vérszegénységet okoz, nem tudjuk, hogy ezek a különbségek a különböző törzshátterek eredményei-e, vagy az SÍ deléció szomszédos génekre gyakorolt esetleges hatásaié (5).
Az eredeti W mutáció a c-kit nullmutáció egyik példája (36). A normális alléllel rendelkező homozigóta
W/+ egerek általában hasi folttal rendelkeznek, de szőrzetük nem halvány, s ivarsejt- és melaninképződésük nem gátolt. A W/+ egerek kevésbé súlyos fenotípusával ellentétben a heterozigóta SI/+ egerek mérsékelt vörösvértestes vérszegénységben szenvednek, s azonkívül, hogy hasi folttal és csökkent méretű ivarmirigyekkel rendelkeznek, szőrzetük halvány színű. Ilyenformán a KL gén 50%-os jelenléte korlátozó hatású, s nem elégséges a c-kz'f-receptor normális működéséhez, míg az c-tö-receptor 50%-os jelenléte, úgy tűnik, a legtöbb esetben nem korlátozó hatású.
A c-hz-receptorrendszer a vér-, ivarsejt- és melaninképződésben az éretlen őssejt-populációkban és az érettebb sejttípusokban egyaránt működik. A súlyos hatású SÍ vagy W mutációk gátolhatják ezen sejtcsaládok fejlődését, s ezáltal az érettebb sejtpopulációkban a c-kit-receptor működése bizonytalan. Azok az SÍ és W mutációk, melyek esetében a c-kitPK működés csak részlegesen károsult, gyakran mutatnak hatásokat az érettebb sejtpopulációkban is. Számos enyhe hatású SÍ alléi ismert, melyek fenotípusa nagy jelentőségű - például az ivarsejt- és melaninképződés vonatkozásában - a c-tö-receptorrendszer pleiotrópiás működésének értelmezésében.
3. példa: KL-1 és KL-2
Kísérleti anyagok: egerek és szövettenyészet
WBB6 +/+, C57BL/6J, és 129/Sv-Sld/+ egereket a The Jackson Laboratorytól (Bar Harbor, ME) (52) szereztünk be. 129/Sv-Sld/+ egereket párosítottunk, s a 14 napos magzatokból Todaro és Green eljárása szerint (54) embrionális fibroblasztokat tenyésztettünk. A hízósejteket felnőtt +/+ egerek csontvelőjéből 10% magzati borjúszérummal (FCS), WEHI-3B sejtekből készített kondicionált tápközeggel, nemesszenciális aminosavakkal, nátrium-piruváttal és 2-merkapto-etanollal kiegészített RPMI-1640 tápközegben (komplett RPMI; C) (36) tenyésztettük. A BALB/c 3T3 sejteket (1) 10% szarvasmarhaszérummal (CS), penicillinnel és sztreptomicinnel kiegészített Dulbecco-féle módosított MÉM (DME) tápközegben tenyésztettük. A dr. Jerrard Hurwitztól (SKI) kapott COS-1 sejteket (18), 10% magzati borjúszérummal, glutaminnal, penicillinnel és sztreptomicinnel kiegészített DME-ben tenyésztettük.
Anti-KL-antitestek előállítása
Egér KL-t Balb 3T3 sejtek kondicionált tápközegéből másutt leírtak (37) szerint végzett hízósejt-proliferációs eljárással tisztítottunk. Anti-KL-antitestek előállításához egy nyulat komplett Freund-féle adjuvánsban adott 1 pg KL-lel szubkután immunizáltunk. 3 hét elteltével a nyúlnak intradermálisan inkomplett Freund-féle adjuvánsban 1 pg KL-lel emlékeztető oltást adtunk. A szérumot 1 hét múlva, majd 2 hetenként gyűjtöttük össze. A vizsgálathoz használt 125I-izotóppal jelölt KL-t Stanley és Gilbert módszerének (38) módosításával klór-amin T-vel jódoztuk.
cDNS-könyvtár screenelése
Balb/c 3T3 fibroblasztból származó teljes RNS-ből oligo(dT)-cellulóz-kromatográfiával poli(A) RNS-t állítottunk elő. Az Invitrogen Inc.-nal ezután sorozatgyártáson kívül plazmid-cDNS-könyvtárat készítettünk. Két21
HU 219 540 Β szálú cDNS-t oligo dT és random primer alkalmazásával szintetizáltunk. A tompa végű cDNS-hez nem palindrom BstXI linkereket ligáltunk, s BstXI enzimmel emésztve a cDNS-t pcDNAI (Invitrogen) expressziós plazmidba szubklónoztuk. A ligálási reakcióelegyet ezután a plaz- 5 midkönyvtár elkészítése érdekében az MC1061/P3 E. coli sejtek elektroporációs módszerrel végzett transzformálásához használtuk. A könyvtár kezdeti mérete hozzávetőleg 107 független telep volt. A plazmidkönyvtár screeneléséhez korábban leírt, végjelölt oligonukleotid- 10 próbát alkalmaztunk (38). A hibridizációt 63 °C-on 6x SSC-ben, a filterek utolsó mosását 2x SSC-ben és 0,2%
SDS-ben, szintén 63 °C-on végeztük. A rekombináns plazmidok inszertjeit HindlII és Xbal restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel szabadítottuk fel, majd a szekvenciaanalízishez M13mpl8 fágba szubklónoztuk.
PCR-amplifikáció (RT-PCR)- és szekvenciameghatározás
A szövetekből és a sejtvonalakból Chirgwin guanidin-izotiocianát/CsCl centrifugálásos módszerével (10) teljes RNS-t készítettünk. Az RT-PCR-amplifikációt lényegében a korábbi leírás szerint (38) végeztük. Ehhez a következő primereket használtuk:
1. primer: 5’-GCCCAAGCTTCGGTGCCTTTCCTTATG-3’ (94-107. nukleotid);
2. primer: 5’-AGTATCTCTAGAATTTTACACCTCTTGAAATTCTCT-3’ (907-929. nukleotid);
3. primer: 5’-CATTTATCTAGAAAACATGAACTGTTACCAGCC-3’ (963-978. nukleotid);
4. primer: 5’-ACCCTCGAGGCTGAAATCTACTTG-3’ (1317-1333. nukleotid).
A cDNS-szintézishez a sejtvonalakból vagy a -szövetekből származó 10 pg teljes RNS-t 0,05 mM TrisHC1 (pH=8,3), 0,75 M KC1, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 200 μΜ dNTP-k és 25 egység RNSsin (BRL) 50 μΐ-nyi elegyében 50 pmol antiszensz primerrel és 400 egység Moloney egérleukémia-vírus reverz transzkriptázzal (BRL) 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáltuk. A cDNS-t 1/10 térfogat 3 M NaOAc (pH=7,0) és 2,5 térfogat abszolút etanol hozzáadásával csaptuk ki, és 50 μΐ ddH2O-ban újraszuszpendáltuk. A PCR-t 30 cikluson keresztül 10 mM Tris-HCl (pH=8,3), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01 m/V% zselatin, 200 μΜ dNTP-k, 500 pmol szensz és 500 pmol antiszensz primer, és 2,5 egység Taq-polimeráz (Perkin-Elmer-Cetus) 100 μΐ-nyi elegyében végeztük. A HindlII és Xbal helyeket a szensz, illetve az antiszensz primeren belül helyeztük el. Az amplifikált DNS-fragmenseket agaróz-gélelektroforézissel tisztítottuk, megfelelő restrikciós enzimekkel emésztettük, s a szekvenciaanalíziséhez M13mpl8 és M13mpl9 fágba szubklónoztuk (49). A KL-1, KL-2, KL-S és KL-SH PCR-termékeket HindlII és Xbal endonukleázokkal emésztettük, és a pCDM8 és pcDNAI (Invitrogen) expressziós plazmidokba szubklónoztuk. Minipreparatív plazmid-DNS-t a lúgos lízis (48) eljárással, s az azt követő fenol-kloroform extrakcióval és etanolos kicsapással állítottunk elő. A COS-1 sejtek transzfektálásához alkalmazott maxipreparatív plazmid-DNS-t a „Qiagen” oszlopkromatográfiás eljárással állítottuk elő.
RN-άζ védési (protection) vizsgálat
Az RN-áz védési vizsgálatokhoz használt ribonukleotidpróbákat a KL-l-et tartalmazó pcDNAI plazmid Spel endonukleázzal végzett linearizálásával állítottuk elő. Az antiszensz ribonukleotidpróbát ezután Promega Gemini kittel SP6 polimeráz alkalmazásával szintetizáltuk. A nagy specifikus aktivitás kialakításához megjelölt ribonukleinsavpróbát ezután 80% formamid jelenlétében 45 °C-on, 1 éjszakán át 10 pg vagy 20 pg teljes RNS-hez hibridizáltuk. A hibridizálási elegyet RN-áz A és TI (Boehringer-Mannheim) enzimekkel emésztettük, s proteináz K-val (48) kezeltük, és a védett, jelölt RNS-ffagmenseket 4% karbamid/poliakrilamid gélen analizáltuk. Az RN-áz védési vizsgálat autoradiogramjait denzitometriával elemeztük, s a filmek részleteit a jobb felbontás érdekében Phospholmage analizátoron (Molecular Dynamics) rekonstruáltuk.
A KL cDNS-ek átmeneti expressziója COS-1 sejtekben
A KL cDNS-ek átmeneti expressziója érdekében a COS-1 sejteket a korábban leírt DEAE-dextrán módszer (20) szerint (kisebb változtatásokkal) transzfektáltuk. Röviden: a COS-1 sejteket a felhasználás előtt 1 nappal konfluens előtti stádiumig (amikor a sejtek még nem érnek egymáshoz) tenyésztettük, majd tripszinnel kezeltük, s 150 mm-es Petri-csészékbe 6χ106 csészénkénti sejtsűrűséggel újraoltottuk. 24 óra elteltével, amikor a tenyészet körülbelül 70%-os mértékben volt konfluens, a sejteket 6-12 órán keresztül 10% DEAE-dextrán (Sigma) jelenlétében 5 pg plazmidDNS-sel transzfektáltuk. A plazmid-DNS-t tartalmazó tápközeget eltávolítottuk, s a sejteket pontosan egy percig 10% DMSO/PBS++ alkalmazásával kémiailag sokkoltuk. A maradék DMSO-t a sejtek kétszeri, PBS++ben végzett mosásával távolítottuk el. A transzfektált COS-1 sejteket 10% magzati borjúszérummal, 100 mg/ml L-glutaminnal és antibiotikumokkal kiegészített DME-ben tenyésztettük.
A KL-proteinek „pulse-chase ” és immunprecipitációs vizsgálata
A transzfektált COS-1 sejteket a transzfekciót követően 72 órával használtuk a „pulse-chase” kísérletekhez. A sejteket 10% dializált magzati borjúszérumot tartalmazó, metioninmentes DME-ben 30 percig inkubáltuk, és 0,5 mCi/ml 35S-metioninnal (NEN) jelöltük. A jelölés végén a jelöléshez használt tápközeget feleslegben lévő metionint tartalmazó, hagyományos tápközeggel helyettesítettük. Hogy meghatározzuk a fórból-12-mirisztát13-acetát (PMA) és az A23187 ionofor KL proteolitikus hasítására gyakorolt hatását, a radioaktív jelölés végén, miután a jelöléshez használt tápközeget hagyományos tápközeggel helyettesítettük, a transzfektált sejtekhez 1 pM PMA-t és 1 μΜ A23187 ionofort adtunk. A sejteket és a felülúszókat a feltüntetett időpontokban különkülön gyűjtöttük össze az immunprecipitációs analízis22
HU 219 540 Β hez. A sejtlizátumokat korábbi leírás szerint (35) 1% Triton X-100, 20 mM Tris (pH=7,5), 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 10% glicerin, valamint 1 mM fenilmetilszulfonil-klorid és 20 pg/ml leupeptin elegyében készítettük. Az immunprecipitációs analízishez KL proteintermékeket és antiegér-KL nyúlantiszérumot használtunk. Az anti-KL szérumot protein-A Sepharose-hoz (Pharmacia) konjugáltuk, s A mosóoldattal [0,1% Triton X-100, 20 mM Tris (pH=7,5), 150 mM NaCl, 10% glicerin] háromszor mostuk. Az anti-KL szérum/protein-A Sepharose konjugátumot a felülúszóval és a sejtlizátummal 4 °C-on legalább 2 óráig inkubáltuk. Az immunprecipitátumokat ezután egyszer B mosóoldatban (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% Triton X-100), háromszor C mosóoldatban (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,1% SDS, 5 mM EDTA) és egyszer D mosóoldatban (10 mM Tris, 0,1% Triton X-100) mostuk. A gélanalízishez az immunprecipitátumokat SDS mintapufferben 5 perces forralással szolubilizáltuk, és SDS-PAGE (12%), illetve autoradiográfíás analízissel vizsgáltuk.
Az oldékony KL biológiai aktivitásának meghatározása
Kifejlett WBB6 +/+ egerek csontvelőjéből 10% magzati borjúszérummal (FCS), WEHI-3B sejtekből készített kondicionált tápközeggel, nemesszenciális aminosavakkal, nátrium-piruváttal és 2-merkapto-etanollal kiegészített RPMI-1640 tápközegben (komplett RPMI) hízósejteket neveltünk (37). A nemtapadó sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, hetenként új tenyészeteket képeztünk, s a sejtsűrűséget 7 χ 105 sejt/ml alatt tartottuk. A tenyészetek hízósejttartalmát hetenként a sejtcentrifuga-készítmények 1% toluidinkékkel (metanolban) végzett festésével határoztuk meg. 4 hét elteltével a tenyészetek általában több mint 95% hízósejtet tartalmaztak, s ezeket használtuk a proliferációs vizsgálathoz. A transzfektált COS-1 sejtek felülúszóit 48-72 órával a transzfekció után gyűjtöttük össze. Az oldékony KL biológiai aktivitását a felülúszókban úgy határoztuk meg, hogy a csontvelői hízósejteket (BMMC) 1L-3 nélkül különböző COS-1 sejtfelülúszó-hígításokon tenyésztettük. A csontvelői hízósejteket komplett RPMI-vel háromszor mostuk, s 0,2% IL-3 jelenlétében tenyésztettük. A sejteket a következő napon összegyűjtöttük, IL-3 nélküli komplett RPMI-ben szuszpendáltuk, és 96 zsebes lemezen zsebenként 100 pl térfogatban 104 csontvelői hízósejtet oltottunk. Minden zsebhez azonos térfogatú hígított felülúszót adtunk, s a tenyészeteket 37 °C-on 24 órán át inkubáltuk, majd zsebenként 2,5 pCi [3H]-timidint adtunk, s az inkubálást további 6 órán keresztül folytattuk. A sejteket üvegszálas szűrőn (GF/C Whatman) gyűjtöttük össze, s a timidin beépülését szcintillációs számolóval határoztuk meg. A vizsgálatokat háromszori ismétléssel végeztük, s az átlagos értékeket mutatjuk be. A mérések standard szórása általában nem haladta meg az átlagértékek 10%-át.
Vizsgálati eredmények
A KL alternatív splicinggal kialakult transzkriptumai a KL-protein csonka transzmembrán formáját kódolják
Ebben a példában olyan cDNS-klónt írtunk le, amelyet egér 3T3 fibroblasztkönyvtárból izoláltunk, s amely a KL kódolószekvenciáinak nagy részét (267 aminosav) tartalmazta. A 6,5 kb-os KL mRNS-nek megfelelő teljes cDNS-szekvenciák izolálása érdekében Balb/c 3T3 fíbroblasztokból származó poli(A)+ RNS alkalmazásával plazmid-cDNS-könyvtárat készítettünk. Az ehhez használt pcDNAI plazmid egy emlős-expressziósvektor, amelyben a cDNS-inszertek CMV promoterből kiindulva expresszálódnak, s amely a COS sejtekben való átmeneti (tranziens) expresszióhoz SV40 kezdőhelyet tartalmaz (Invitrogen). A könyvtárat a KL N-terminális és Cterminális kódolószekvenciáknak megfelelő oligonukleotidpróbákkal screeneltük. Olyan cDNS-klónt nyertünk, amely a teljes KL-kódoló szekvenciákat, és az 5’ és 3’ transzlálatlan szekvenciákat is tartalmazta. E klón nukleotidszekvenciája (17. ábra) összhangban áll a korábban leírt szekvenciákkal, azzal a különbséggel, hogy a 664. helyen egy bázis megváltozott, amely a 206. szerin alaninnal való kicserélődését eredményezi (2, 38).
Anderson és munkatársai az egér KL cDNS vizsgálatával egy olyan splicinggal összeillesztett cDNS-t mutattak ki, melyben leolvasási kereten belül 48 nukleotid hiányzott (deléció miatt). Ez arra utal, hogy a KL-t expresszáló sejtekben alternatív splicinggal kialakult KL RNS-transzkriptumok vannak jelen (2). A szövetekből és sejtvonalakból származó RNSben az alternatív splicinggal kialakult KL RNS-transzkriptumok azonosításához RT-PCR-eljárást alkalmaztunk. Primerekként a KL cDNS 5’ és 3’ transzlálatlan régiónak megfelelő printereket alkalmaztunk, melyeket úgy módosítottunk, hogy egyetlen restrikciós hasítási helyet tartalmazzanak. Az RT-PCR-reakciótermékek elektroforézises analízisének eredményeit a 18. ábrán mutatjuk be. A Balb 3T3 sejtekből és az agyból származó mintákban egy, hozzávetőleg 870 bp hosszúságú fragmens, míg a lépből, heréből és tüdőből származó mintákban két, hozzávetőleg 870 és 750 bp hosszúságú fragmens látható. A további vizsgálathoz a két PCR reakcióterméket a pCDM8 emlős-expressziósvektorba szubklónoztuk. A DNS-szekvenciaanalízis azt mutatta, hogy a nagyobb PCR-termék az ismert KL cDNS-szekvenciának felel meg (melyet a továbbiakban KL-1gyel jelölünk). A kisebb szekvenciában azonban a KL kódolószekvenciájának 84 nukleotid nagyságú szegmense hiányzik, ami leolvasási kereten belüli deléciót jelent. A deléció végpontjai megfelelnek a patkány és a humán KL gén exonhatárainak, s nagyon valószínű, hogy ezek a határok konzerválódtak az egér génjében is (27). Ilyenformán úgy tűnik, a kisebb PCR-termék egy alternatív splicinggal kialakult KL RNS-transzkriptumnak felel meg, amelyet KL-2-vel jelölünk. A KL-2ből hiányzó exon elhelyezkedésében megelőzi a transzmembrán domént, a KL oldékony formájának négy Nkapcsolt glikozilálási helye közül egyet tartalmaz, s magában foglalja az ismert C-terminálisát is (Ala-166 és Ala-167) (58). Ezek alapján a KL-2-ről azt mondhatjuk, hogy a KL-1 csonkított változatát kódolja, amely feltehetően transzmembránproteinként szintetizálódik (17. és 19. ábra).
HU 219 540 Β
A KL-2 szövetspecifikus módon expresszálódik
Az alternatív splicinggal kialakult KL-2-transzkriptumot a lép-, a here- és a tüdő-RNS-ben mutatták ki, a fibroblasztból és az agyból származó RNS-ben azonban nem. Ez arra enged következtetni, hogy a KL-2 expressziója szövetspecifíkus módon kontrollált. E probléma részletesebb megoldásához a különféle szövetekből származó RNS-ekben RN-áz védési vizsgálattal meghatároztuk a KL-1 és KL-2 RNS-transzkriptumok tartós szintjét. A KL-1 cDNS-t tartalmazó pcDNAI-plazmidot Spel endonukleázzal emésztettük, hogy SP6 RNS-polimeráz alkalmazásával 626 nukleotidból álló RNS-hibridizációs próbát hozzunk létre. A próbát 40 napos egér Balb/c 3T3 fibroblasztjaiból, agyából, lépéből és heréjéből, illetve kifejlett egér agyából, csontvelőjéből, kisagyából, szívéből, tüdejéből, májából, lépéből, veséjéből és (megtermékenyítés utáni 14 napos) méhlepényéből származó teljes RNS 20 pgjával hibridizáltuk. A mintákat ezután RN-ázzal emésztettük, és a reakciótermékeket 4% karbamid/poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel analizáltuk. A kísérletekben a KL-1 mRNS egy 575 bázisból álló fragmenst, míg a KL-2 449 és 49 nukleotidból álló fragmenseket védett. Amint a 20. ábrán látható, a Balb/c 3T3 fibroblasztokban a KL-1 az uralkodó transzkriptum, s a KL-2 alig mutatható ki. Az agyban és a tímuszban a KL-1 a fő transzkriptum, de a lépben, herében, méhlepényben, szívben és a kisagyban mind a KL-1-, mind a KL-2-transzkriptumok különböző arányokban vannak jelen. A KL-1 KL-2-höz viszonyított, denzitometriával meghatározott aránya az agyban 26:1, a csontvelőben 3:1, a lépben 1,5:1, és a herében (40 napos) 1:2,6. Ezen eredmények azt sugallják, hogy a KL-1 és a KL-2 expressziójának szabályozása szövetspecifikus módon történik.
A KL-proteintermékek bioszintetikus jellemzői a COS sejtekben
Bár a KL-t Balb/c 3T3 sejtek kondicionált tápközegéből tisztítottuk, s oldékony protein, a KL-1 és KL-2 előre megjósolt aminosavszekvenciái arra utalnak, hogy ezek a proteinek membránasszociáltak. A KL-S és a KL-1, illetve a KL-2 közötti rokonság vizsgálata érdekében meghatároztuk bioszintetikus tulajdonságaikat. Az RT-PCR-rel előállított KL-1 és KL-2 cDNS-eket a COS sejtekben való átmeneti expresszióhoz a pcDNAI vagy pCDM8 expressziós vektor HindlII és Xbal helyeire szubklónoztuk. Hogy elősegítsük a KL-1- és KL-2-proteintermékek átmeneti expresszálódását, a COS-1 sejteket az itt leírt DEAE-dextrán/ /DMSO eljárás alkalmazásával KL-1- és KL-2-plazmidokkal transzfektáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy a COS-1 sejtekben a transzfekció után 72-96 órával a KL-protein szintézise maximális volt. A KL-1- és KL-2-proteinek bioszintetikus jellemzőinek meghatározása érdekében „pulse-chase” vizsgálatokat végeztünk. A transzfekció után 72 órával a tenyészeteket 30 percig 35Smetioninnal (0,5 mCi/ml) jelöltük, majd hagyományos tápközegben inkubáltuk („chase-elés”). A sejtlizátumot és a felülúszót a feltüntetett időpontokban összegyűjtöttük, s az immunprecipitáláshoz (nyulak tisztított egérKL-lel végzett immunizálásával előállított) anti-KL-antiszérummal kezeltük, majd SDS-PAGE-analízist (12%) végeztünk. A KL-l-plazmiddal transzfektált sejtekben a radioaktív jelölés végén 24, 35,40 és 45 kD molekulatömegű KL-specifíkus proteintermékeket találtunk (21. ábra). Ezek a proteinek feltehetően a primer proteinterméket, és a glikozilálással fokozatosan módosított KL-proteintermékeket képviselik. Az egyre hosszabb inkubálási idők a 45 kD-os formát eredményezték, mint az érett KL-proteinterméket, s nagyon valószínű, hogy ez a protein képviseli a KL-sejtmembrán formáját. A felülúszóban 30 perctől kezdődően a 28 kD molekulatömegű proteintermék látható, amelynek mennyisége az idővel nő. A növekvő idővel két kisebb mennyiségű 38 és 24 kD-os terméket is találtunk. Ezek az eredmények összhangban állnak azzal az elképzeléssel, miszerint a KL-1 először membránkötött proteinként szintetizálódik, majd - valószínűleg proteolitikus hasítás útján - kiszabadul a közegbe.
A KL-2-plazmiddal transzfektált COS-1 sejtekkel végzett „pulse-chase” vizsgálat eredményeit a 20. ábrán mutatjuk be.
A KL-2-proteintermékeket megfelelően kezelve 32 kD és 28 kD molekulatömegű termékeket nyerünk, melyek valamelyike feltételezhetően a KL-2 membránalakja. A KL-2-sejtmembrán alakja (több mint 5 órás felezési idővel) stabilabb, mint a megfelelő KL-l-protein. A sejtfelülúszóban 3 óra elteltével a KL-2 hozzávetőleg 20 kD molekulatömegű, oldékony formája látható. A KL-2 oldékony formájának a sejtfelülúszóban való megjelenése és felhalmozódása a KL- 1-hez képest késleltetett, ami összhangban áll a KL-2-proteintermék kevésbé hatékony proteolitikus hasítási folyamatával. A KL-2-ben, az eltérő összeillesztés eredményeként a KL oldékony formájának ismert C-terminálisát magában foglaló szekvenciák (s így a KL-1 feltételezett hasítási helye is) hiányoznak. A KL-2-ben jelen van. A felülúszóban kimutatható 38 kD-os KL-2 proteolitikus hasítása ilyenformán, feltehetően egy másodlagos hasítási helyen történik, amely a kiesett exon által kódolt szekvenciák akár N-terminális, akár C-terminális oldalán, mind a KL-1-ben, mind a KL-2-ben jelen van. A felülúszóban kimutatható 38 kD-os KL-l-proteintermék valószínűleg a transzmembrán doménhez közeli hasítási helyet magában foglaló hasítási terméket képviseli (19. ábra).
A COS sejtekben a KL-1 és KL-2 proteolitikus érési folyamatát módosítja a PMA és az A23187 ionofor
A protein-kináz C-t indukáló PMA-ról ismert, hogy elősegíti a sejtmembránproteinek proteolitikus hasítását, miáltal ezen proteinek extracelluláris doménjeinek oldékony formái jönnek létre, amint azt a CSF-l-receptor, a c-fo'í-receptor és a TGF-α példáján kimutatták (13, 4). A COS-1-sejtekben meghatároztuk a PMA-kezelés KL-1 és KL-2 bioszintetikus jellemzőire gyakorolt hatását. A „pulse-chase” kísérletek 22/B. ábrán bemutatott eredményei azt jelzik, hogy a PMA hasonló kinetikával indukálja mind a KL-1, mind a KL-2 gyors hasítását, s a felszabadult KL-1- és KL-2-proteintermékek megkülönböztethetetlenek a PMA nélkül végzett kezeléssel nyert termékektől. Ezen eredményekből arra következ24
HU 219 540 Β tethetünk, hogy a PMA a KL-1 és a KL-2 esetében hasonlóan aktiválja a proteolitikus hasítási mechanizmust. Egyrészről ez azt jelentheti, hogy a PMA két különböző, a KL- 1-re, illetve a KL-2-re specifikus proteázt aktivál, vagy más módon, jelentheti azt is, hogy egyetlen, nagyon magas szinten aktivált proteáz létezik, amely a KL-l-et és a KL-2-t egyaránt hasítja, de különböző mértékben. A KL-1 fő hasítási helye - a patkányKL C-terminális aminosavszekvenciája alapján - a PPVAASSL (186-193.) aminosavakat foglalja magában, s egy elasztázszerű enzim felismerési helyeként szolgálhat (22,34). A KL-2 felismerési helye, szintén a fenti alapon, feltehetően a kiesett exonon található, s ilyenformán valószínűleg az RKAAKA (202-207.) aminosavakat foglalja magában, s a KL-1 proteázhoz hasonló specifitású enzim, vagy más módon, egy tripszinszerű proteáz felismerési helyeként szolgálhat. Az A23187 ionofor KL-hasításra gyakorolt hatását is meghatároztuk. Ez a reagens a KL-1 és a KL-2 hasítását egyaránt serkentette, ami azt mutatja, hogy a KL-1 és a KL-2 proteolitikus hasítását olyan mechanizmusok is képesek közvetíteni, amelyeknek nincs közük a proteinkináz C aktiválásához (22/C. ábra).
A felszabadult KL-proteintermékek biológiai aktivitása
A felszabadult KL-proteintermékek biológiai aktivitásának teszteléséhez a transzfektált COS-1 sejtek felülúszóit a transzfekciót követően 72 órával összegyűjtöttük, s aktivitásukat hízósejt-proliferációs vizsgálattal határoztuk meg. A csontvelői eredetű hízósejteket (BMMC) az összegyűjtött felülúszók különböző hígításaival 24 órán keresztül inkubáltuk, s a korábban leírt módon vizsgáltuk a 3H-timidin beépülését (23. ábra). A KL-1 transzfektánsból származó felülúszók 3-5-ször nagyobb aktivitást eredményeztek, mint a KL-2 transzfektánsok, ami összhangban áll azzal, hogy az oldékony KL különböző mértékben szabadul fel a KL-1-ből, illetve a KL-2-ből. A KL-1 és KL-2 transzfektánsból felszabadult proteinek a hízósejt-proliferációs vizsgálatban lényegében hasonló specifikus aktivitást mutattak.
A Steel dickie alléi a KL-transzmembrán és citoplazmikus doméneket magában foglaló C-terminális kódolószekvenciája deléciójának eredménye
Az Sld allélre homozigóta egerek, annak ellenére, hogy halvány szőrzetszínnel rendelkeznek, sterilek, és vörösvértestes (makrocita) vérszegénységben szenvednek, az Sl allélre homozigóta egerekkel ellentétben, életképesek. Ennek alapján úgy tűnik, ezekben az egerekben a c-Aú-receptorrendszer mutat valamilyen mértékű maradékaktivitást. Az Sld mutáció a három sejtcsaládra hasonló mértékben hat, ami arra enged következtemi, hogy a mutáció a KL belső, lényeges tulajdonságára hat. Az Sld molekuláris alapjának vizsgálatához a KLkódoló szekvenciákat ebben az allélben először PCR klónozásos eljárással karakterizáltuk. Sld/+ embrióból standard eljárások szerint primer embriófibroblasztokat származtattunk. Az Sld KL-kódoló régió amplifikálásához Sld/+ embrionális fibroblasztokból készített RNS-t és különböző primereket alkalmaztunk, figyelembe véve azt a lehetőséget, hogy az Sld deléciós mutáció.
Sld/+ teljes RNS és az 1. és 2. primer alkalmazásával végzett RT-PCR amplifikálással olyan DNS-fragmenst állítottunk elő, amely a +/+ fibroblaszt RNS-ből nyert termékkel azonos mozgékonysággal vándorolt, s amelynek szekvenciaanalízise azt mutatta, hogy az ismert KL-szekvenciától megkülönböztethetetlen. Ez a fragmens feltehetően a normális alléit képviselte. Amikor az 1. és 3., illetve az 1. és a 4. primerekkel végeztük a kísérletet, mindkét esetben nagyobb vándorlási sebességű DNS-ffagmens amplifikálódott (18). Az 1.+3., illetve az 1.+4. primerkombinációval nyert 850 bp, illetve 1070 bp hosszúságú DNS-fragmenst pCDM8-plazmidba szubklónoztuk, s szekvenáltuk. A KL-Sld cDNSben a vad típusú szekvencia 660-902. nukleotidjaiból álló szekvencia kiesett, s helyette egy 67 bp-ból álló szekvencia inszertálódott (17. ábra). A deléció-inszerció eredménye az 5’ deléciós végponttól három aminosav távolságban egy terminációs kodon. A KL-Sld cDNS előre megjósolt aminosavszekvenciája az ismert KL-szekvencia 1 -205. aminosavaiból, valamint három további aminosavból áll (17. és 19. ábra). A KL-Sld aminosavszekvencia mind a négy N-kötött glikozilálási helyet, továbbá a KL oldékony formájának valamennyi szekvenciáját magában foglalja, míg a vad típusú KL-1-transzmembrán és citoplazmatikus doménjei hiányoznak. Következésképpen, a KL-Sld proteintermék szekretált protein, amely biológiai aktivitást mutat.
A KL-Sld- és a KL-S-proteintermékek bioszintetikus jellemzői és biológiai aktivitása
A KL-Sld proteintermékkel való összehasonlítás kedvéért a KL-1 csonkított változatát állítottuk elő (KL-S), melyben a terminációs kodont a 191. aminosavhelyre inszertáltuk, amely az oldékony KLprotein feltételezett C-terminálisa. A COS-1 sejteket a KL-Sld- és a KL-S-plazmidokkal transzfektáltuk, s a két proteintermék bioszintetikus jellemzőinek meghatározása érdekében „pulse-chase” vizsgálatokat végeztünk. A KL-Sld-proteintermék érése gyorsan végbemegy, feltehetően glikozilálással, majd a tápközegbe szekretálódik, ahol már 30 perces „chase” idő múlva is kimutatható, s mennyisége a későbbiekben növekszik (24. ábra). A KL-S-proteintermék bioszintetikus jellemzői nagyon hasonlítanak a KL-Sld-proteinéhez (24. ábra). Még egyszer : a növekvő idővel egyre növekvő mennyiségű szekretált anyag mutatható ki a közegben, a sejtasszociált KL-S-proteintermék mennyisége viszont az idővel csökken. A szekretált KL-Sld- és a KL-S-proteintermékek biológiai aktivitásának értékeléséhez hízósejt-proliferációs vizsgálatokat végeztünk. A transzfektált COS-1 sejtekből készült tápközeget a transzfekciót követően 72 órával gyűjtöttük össze, s a csontvelői hízósejtek (BMMC) proliferációjára IL-3 nélkül gyakorolt hatás értékeléséhez különböző hígításokat használtunk. Mindkét minta a KL-1 aktivitásánál bizonyos mértékben nagyobb, jelentős biológiai aktivitást mutatott (23. ábra). Összegzésül: ezen eredmények meggyőzően bizonyítják, hogy a KL-Sld-proteintermékek szekretálódnak, s biológiailag aktívak.
A c-kit és az egér W lokusz közötti allélizmus bebizonyítása fényt derített a c-Aú-receptor fejlődés során,
HU 219 540 Β valamint a kifejlett állatban mutatott pleiotrópiás működéseire, s lehetővé tette ligandumának (KL) azonosítását. A KL és az egér Steel lokusz közötti allélizmus felfedezése továbbá a W és Sl mutációk közötti molekulárisalapú rokonsági kapcsolat elméletet bizonyította, amelyet az egér genetikájával foglalkozó kutatók e mutációk párhuzamos és egymást kiegészítő fenotípusai alapján előre megjósoltak. A KL előre meghatározott transzmembránszerkezete azt jelenti, hogy a KL membránasszociált és oldékony formája egyaránt jelentős szerepet játszik a c-kit működésben. A találmányban e feltételezés kísérletes bizonyítékait bocsátjuk rendelkezésre.
Először: a KL oldékony formája hatékony proteolitikus hasítás útján egy transzmembránprekurzorból, a KL-1-ből képződik. Másodszor, a KL-1 alternatív splicinggal kialakult változata, a KL-2, melyben a fő proteolitikus hasítási hely a splicing során elvész, szintén a KL biológiailag aktív, oldékony formáját hozza létre, bár némileg csökkent hatékonysággal. Harmadszor: a KL-1 és a KL-2 hasítása a COS-1 sejtekben módosítható folyamat. Negyedszer: a KL-1 és a KL-2 szövetspecifikus módon expresszálódik. Ráadásul, az életképes Sld mutációról kimutattuk, hogy olyan deléció eredménye, amely a transzmembrán doménnel együtt magában foglalja a KL kódolószekvenciájának C-terminálisát, s ezzel a KL biológiailag aktív, szekretált formáját hozza létre. Az Sld alléit hordozó egerek fenotípusa további bizonyítékát szolgáltatja annak az elképzelésnek, hogy a c-kit működésben a KL szekretált és sejtmembrán-asszociált formája egyaránt szerepet játszik.
A c-kit és a CSF-1R közötti szoros fejlődési rokonság miatt indokolt volt a megfelelő növekedési faktorok, a KL és a CSF-1 közötti, szerkezeti és topológiai vonatkozású rokonság feltételezése. A CSF-1 mRNS-ek alternatív splicinggal kialakult formáiról ismert, hogy olyan proteintermékeket kódolnak, amelyek a transzmembrán dómén N-teiminális szekvenciáját, a protein ligandum része és transzmembrán doménje között elhelyezkedő, 298 aminosavból álló spacerszegmenst illetően eltérőek (43). Az alternatív splicinggal kialakult CSF-1 RNS-transzkriptumok ráadásul a 3’ transzlálatlan régióikban is különböznek (21). A KL RNS-transzkriptumok különböző szövetekben végzett vizsgálatával egy alternatív splicinggal kialakult RNS-transzkriptumot azonosítottunk, melyben - a CSF-1-hez hasonlóan - a feltételezett ligandumszakasz és a transzmembrán dómén közötti spacer kiesett. Érdekes módon, ezen alternatív splicinggal kialakult RNS-termék expressziójának szabályozása szövetspecifikus módon történik. A KL és a CSF -1 ligandum részleteinek újabb összehasonlító vizsgálata a korlátozott aminosavhomológia, a megfelelő exonok összehasonlítása és az „exon kódolta másodlagos szerkezet” szembeállítása alapján szerkezeti homológiát mutat a két protein között (4). Sőt a 4ahelikális dómén szuperpozíciója, és a molekulán belüli diszulfidhidakat kialakító ciszteingyökök a KL és a CSF-1 ligandum doménjeinek rokon tercier szerkezetére utalnak, s a két protein N-terminális szignálpeptidjei, transzmembrán doménjei és intracelluláris doménjei közötti homológra azt jelzi, hogy ezek a domének lényeges, egymással rokon funkciót töltenek be a két proteinben. Ezen eredmények megerősítik azt az álláspontot, miszerint a KL és a CSF-1 között fejlődési rokonság és szerkezeti homológja van.
A KL egyedülálló tulajdonsága az előre jósolt, transzmembránproteinként három részből álló szerkezete. A KL mindkét formája (KL-1 és KL-2) transzmembránproteinként szintetizálódik, amely proteolitikus érési folyamaton keresztül a KL biológiailag aktív, oldékony formáját szabadítja fel, igaz, az érési folyamat a két forma esetében (a COS sejtrendszerben meghatározottak szerint) különböző kinetikával megy végbe. A KL-1 proteolitikus hasítása nagyon hatékony, míg a KL-2 protein stabilabb, illetve ellenállóbb a proteolitikus hasítással szemben. A kiesett exon által kódolt, a 174. aminosavtól a 201. aminosavig tartó szekvencia az oldékony KL protein C-terminálisát és feltételezett hasítási helyét foglalja magában (27). Ilyenformán az oldékony KL-2 protein kialakításához feltételezhetően egy másodlagos proteolitikus hasítási hely használatos, amely egy másik proteáz működését igényli. A KL-1 és KL-2 proteolitikus hasításának COS-1 sejtekben proteinkináz C aktivátor PMA-val és A23187 ionoforral végzett indukálása arra a következtetésre vezet, hogy a különböző sejttípusokban a hasítási folyamat különböző szabályozás alá esik. Érdekes módon, az oldékony KL-2proteintermék normális biológiai aktivitást mutat, ami azt jelzi, hogy a kiesett exon által kódolt szekvenciák az aktivitást illetően nem kulcsfontosságúak.
A KL-1 és a KL-2 egyrészt membránasszociált formájukban úgy működhetnek, hogy jelüket sejt-sejt érintkezés során közvetítik, vagy más módon, sejtadhéziós molekulákként működhetnek (19, 26). Más részről, a KL oldékony formái diffúzibilis faktorok, amelyek a célsejteket és receptoraikat viszonylag hosszabb távolságokon keresztül érhetik el. A KL oldékony formái azonban az FGF, LIF és int-1 esetében tapasztalhatóval analóg módon asszociálódhatnak vagy elkülönülhetnek az extracelluláris mátrixban, miáltal a membránasszociált formához hasonlóan csak kis távolságokban működnek. (8, 33, 42). A KL sejtmembrán-asszociált formájában a receptort hordozó célsejtekkel való interakcióhoz nagy koncentrációjú, lokalizált jelet biztosít, illetve tart fenn, a KL oldékony formája viszont alacsonyabb és változó koncentrációjú jelet biztosít. Úgy tartják, a c-kit különböző sejtrendszerekben serkenti a sejtproliferációt, a sejtek vándorlását, a sejtek életben maradását és a posztmitótikus működéseket, A CSF-1-receptorrendszerrel mutatott analógia alapján, a c-kúnek a sejt életben maradásával és vándorlásával kapcsolatos működéséhez kisebb faktorkoncentrációra van szükség, mint a sejtek proliferációjával kapcsolatos működéshez (55). A KL sejtmembrán-asszociált és oldékony formája így a c-kit működés különböző vonatkozásait szolgálhatja. A megfelelő extracelluláris domének protein-kináz C-közvetítette proteolitikus felszabadításával a CSF-1- és a c-k/'í-receptor egyaránt leszabályozható (13). E folyamat funkcionális értelme nem ismert, de feltételezhető, hogy a receptorok felszabadult extra26
HU 219 540 Β celluláris doménje a jelek módosítása érdekében semlegesítheti a CSF-l-et, illetve a KL-t. A KL proteolitikus hasítása bizonyos esetekben a c-kit működés leszabályozását eredményezi, s ilyenformán komplementernek vagy analógnak ítélhető. Összegzésül : a különböző sejtmembrán-asszociált KL-molekulák szintézise, és a KL oldékony formáit eredményező proteolitikus hasítása a fejlődés során, illetve a kifejlett állatokban eszközt biztosít a c-kit működés különböző sejttípusokban való szabályozására és módosítására.
Az SP mutáció molekuláris alapjának jellemzésével egyedülálló lehetőséget biztosítottunk a KL oldékony formájának fejlődés során és kifejlett állatban játszott szerepének meghatározására. Az SP alléi a KL-transzmembrán doménjét és C-terminálisát érintő deléció eredményeként a KL szekretált formáját, s nem membránasszociált formáját kódolja. Az SP/SP és Sl/SP biológiai jellemzői ilyenformán megoldást adhatnak a KL oldékony és membránasszociált formája szerepének tisztázására. Az Sl/Sld egerek csak az SP proteint termelik, mivel az SÍ alléi egy KL nullmutáció (11,38). Ezek az egerek életképesek, de súlyos vörösvértestes (makrocita) vérszegénységgel, szöveti hízósejtek hiányával, hiányos szőrzetszínnel és meddőséggel (sterilitással) jellemezhetők. Ezek az egerek mutáns fenotipusuk legtöbb vonatkozásában hasonlítanak a U7IP egerekre (47, 51), azonban léteznek bizonyos lényeges különbségek. Az Sl/SP egerek vérszegénysége sokkal érzékenyebb a csökkent oxigénkoncentrációra, mint a W/W* egereké (46, 47). Az ivarsejtképződést illetően, a IK/IP egerekben az elsődleges (ős-)csírasejtek nem képesek a proliferációra, s vándorlásuk akadályoztatott (32). Az Sl/SP embriókban az elsődleges csírasejtek a W/W* embriókhoz hasonlóan szintén nem képesek proliferációra, a megmaradó sejtek azonban megfelelően vándorolnak, s fejlődés megfelelő szakaszán érik el a gonadális (ivarmirigy) redőket (29, 51). E kísérleti eredményekből arra következtethetünk, hogy az SP KL-proteintermék képes fenntartani a sejtvándorlást, a sejtek proliferációját azonban nem, s ennek megfelelően, a KL-transzmembrán formája kulcsfontosságú szerepet játszik a ckit proliferatív reakciójában. Az Sl/SP fibroblasztok továbbá IL—3 hiányában nem segítik a csontvelői hízósejtek proliferációját és fennmaradását, ellentétben a normális embrióból származó fibroblasztokkal, amelyek rendelkeznek ezzel a tulajdonsággal (16). Feltéve, hogy az S//S/d-fibroblasztok valóban szintetizálják az Sld proteinterméket, az a tény, hogy az Sl/SP fibroblasztok nem képesek segíteni a hízósejtek proliferációját, egyrészt azt jelezheti, hogy az ezen sejtek által kibocsátott, oldékony KL-Sld protein mennyisége nem elégséges a proliferáció serkentéséhez, másrészről, jelentheti azt is, hogy ebben a folyamatban a KL sejtmembrán-asszociált formája játszik kulcsfontosságú szerepet.
A KL hatása az IL-l-gyel, IL-3-mal, G-CSF-fel, illetve GM-CSF-fel együtt
Ezekhez a vizsgálatokhoz normális egércsontvelőtenyészetekben egér-KL-t (rekombináns egér-c-kit ligandumot) használtunk, s a KL egyedüli serkentésével nagyon kevés mieloidtelepet tapasztaltunk. Ha a KL-t
G-CSF-fel, GM-CSF-fel és IL-3-mal együtt alkalmaztuk, a telepek számának és méretének jelentős növekedését tapasztaltuk, az M-CSF-fel való együttes alkalmazásnak azonban nem volt ilyen hatása (103). Az 5-FUkezelést követően 24 órával felhasznált csontvelővel végzett HPP-CFC vizsgálatokban a citokines kombinációkkal a telepek serkentésének növekedését tapasztaltuk. A KL G-CSF-fel, GM-CSF-fel, IL-3-mal, IL-7tel vagy IL-6-tal való együttes alkalmazása hatásos volt a HPP-CFC stimulálásában, három vagy négy faktor kombinációja még hatásosabb volt, s a maximális hatást az IL-l-gyel, IL-6-tal és KL-lel együttesen alkalmazott CSF-ekkel vagy IL-3-mal értük el. A 25. ábra a citokinek kombinációival serkentett HPP-CFC mennyiségét mutatja be az 5-FU-kezelés utáni 4 napos egércsontvelő-tenyészetekben. Két citokin kombinációja (IL-l+GM-CSF vagy IL—3) összemérhető számú HHP-CFC-t serkentett, mint a KL+IL-1 vagy a KL+IL-3 kombináció, de maximális hatékonyságot három faktor kombinációjával (1L-1+KL+G-CSF vagy IL-3) értünk el.
A korai vérképzési sejtek delta- vagy másodlagos CFU vizsgálata, Egérkísérletek
A delta-vizsgálat során az odavaló őssejtekben elszegényített, s a korai stemsejtek számát illetően gyarapítóit csontvelő rövid időtartamú (7 napos) szuszpenziótenyészetében a különböző citokinek stemsejtek és őssejtek életben maradását, megerősödését, differenciálódását és szaporodását elősegítő hatását másodlagos klónozási vizsgálattal határoztuk meg. Az 5-FUrezisztens stemsejteket primer HPP-CFC vizsgálatban több citokinnel serkentve, hagyományos CFU-GM vizsgálatokban pedig egyetlen CSF-fel serkentve vizsgáltuk. A másodlagos HPP-CFC és CFU-GM vizsgálatokat a szuszpenziótenyészetet követően végeztük. Általában három paramétert értékeltünk. Az első az egyes sejtcsaládok őssejtjeinek szaporodása: a másodlagos tenyészetben egy CSF fajtára (például G-CSF) érzékeny GFU-GM összes száma (kimeneti érték) osztva a primer tenyészetben ugyanarra a CSF fajtára érzékeny CFU-GM teljes mennyiségével (kezdeti érték). A második paraméter: a másodlagos tenyészetben lévő CFU-GM őssejtek összes száma osztva a HPP-CFC kezdeti értékével. Mivel feltételezhető, hogy a CFU-GM korábbi prekurzorokból, azaz HPPCFC-ből származik, ez az arány adja a stemsejt őssejtté differenciálódásának jelzőszámát. Végül a harmadik paraméter: a másodlagos HPP-CFC összes száma osztva a HPP-CFC kezdeti értékével. Ez a paraméter a stemsejt önmegújulásának legjobb mérőszáma, különösen, ha az elsődleges és másodlagos tenyészetben a HPP-CFC serkentését az IL-1, IL-3 és KL kombinációjával végezzük.
Korábbi vizsgálatokban (mikor a KL még nem állt rendelkezésre) az egyes CSF fajtákra érzékeny CFC-GM és HPP-CFC-1 és -2 számának különböző mértékű növekedését tapasztaltuk; az IL-l-et M-CSFfel alkalmazva 20-30-szoros, G-CSF-fel alkalmazva 50-100-szoros növekedést tapasztaltunk; az IL-3 és a GM-CSF az őssejtek korlátozott mértékű szaporodását
HU 219 540 Β eredményezte, míg az M-CSF és G-CSF egyáltalán nem eredményezett szaporodást. Az M-CSF-fel, GM-CSF-fel vagy G-CSF-fel való együttes működésben az IL-6 az IL-1-hez képest kevésbé volt hatékony. Az IL-1+IL-6 a három CSF-fel és az IL-3-mal együtt még fokozottabb interakciókat mutatott. Ha [a jelen találmány szerint, vagy más módon, a WO 92/00376 számú PCT nemzetközi közrebocsátási iratban („Mást Cell Growth Factor”, Immunex Corporation, 1992.01.09.), vagy szintén más módon, a 423 980 számú európai szabadalmi bejelentésben („Stem Cell Factor”, Amgen Inc., 1991. 04. 24.) leírtak szerint előállított] KL önmagában volt jelen a szuszpenziótenyészetben, az őssejtek termelésének csak kismértékű gyarapodása következett be (26. ábra), ha azonban GM-CSFfel, IL-3-mal vagy IL-l-gyel együttesen alkalmaztuk, 200-800-szoros gyarapodást tapasztaltunk. Az IL-l+KL+GM-CSF vagy IL-3 kombináció még hatásosabb volt az őssejtek gyarapításában, s az IL-1+KL+IL-6+IL-3 vagy GM-CSF kombináció az őssejtek számának maximálisan 2500-szoros gyarapodását eredményezte. Az őssejtképződésre vonatkozó számítások a CFU-GM kimeneti értéken alapulnak. A HPP-CFC kezdeti értékek azt mutatták, hogy a háromfaktoros kombinációk (IL-l+KL+IL-3 vagy CSF-ek) 6000-10 000-szeres arányokat, a négyfaktoros kombinációk pedig (IL-6-tal együtt) 8000-15 000szeres arányokat eredményeztek. Az önmegújulás mértékeként a HPP-CFC kezdeti értékre vonatkoztatott arányként kifejezett másodlagos HPP-CFC-1 képződés a KL IL-l-gyel, IL-3-mal vagy CSF-ekkel képzett kétfaktoros kombinációjával 50-70 értéket ért el, az IL-l+KL IL-6-tal, IL-3-mal vagy CSF-ekkel képzett háromfaktoros kombinációja pedig 700-1300 értékeket eredményezett.
A 27. ábra a 7 napos, IL-1+IL-3+KL kombinációval kezelt, gyarapítóit HPP-CFC tenyészetben termelődött, teljesen differenciálódott sejtek alapján az óriási mértékű proliferációt mutatja be. Ez a másodlagos HPP-CFC-1 képződéssel mért önmegújulási komponensből, az alacsony proliferatív potenciállal rendelkező CFU-GM alapján mért őssejtképződésből, és morfológiailag azonosítható, differenciálódó mieloidsejtekből áll. Ezen sejtek egy prekurzorból kiinduló képződéséhez szükséges sejtpopuláció-kétszereződési idő eléri az ismert emlős-sejtproliferációs szintek határait. Ha ezt a proliferációt a HPP-CFC-nél korábbi, s még ritkább sejttel tartottuk volna fenn, még rövidebb populációkétszereződési időre lett volna szükség. Valószínűtlen, hogy a hosszú időtartamú regenerálósejtek szaporodása összehasonlítható mértékben tükrözze a HPP-CFC rövid időtartamú tenyészetben tapasztalt szaporodását, s valószínűbb, hogy a képződött HPP-CFC többsége a stemsejt-hierarchián belül későbbi stádiumokat képvisel. A D12 CFU-S vizsgálata az IL-l+IL-3 vagy KL kombinációval kezelt, 7 nap utáni szuszpenziótenyészetben szintén határozott sejtszámnövekedést mutatott. Más kutatók kimutatták, hogy hasonló szuszpenziótenyészetekben a CFU-GEMM prekurzorai (valószínűleg hosszú időtartamú regeneráló stemsejtek) IL-l+IL-3 jelenlétében szintén szaporodtak, IL-6 és IL-3 vagy GM-CSF kombinációk jelenlétében azonban nem.
Korai vérképzési sejtek delta- vagy másodlagos CFU vizsgálata; humán vizsgálatok
Emberek esetében azt tapasztaltuk, hogy a csontvelő 4-HC-vel végzett kezelése a GM-CSF-re közvetlenül reagálni képes őssejtek többségét eltávolítja, miközben fenntartja a csontvelő-átültetéssel kapcsolatos telepképzésre és vérképzési regenerációra képes stemsejteket. A korai transzplantációs vizsgálatokban a CD34+ szelekció szintén a hosszú időtartamú regenerálódási képességgel rendelkező hízósejtek mennyiségét növelte. A 4-HC-kezelés és a CD34+ sejtek immunsej«apadással (immuncitoadherencia) végzett szelekciójának együttes alkalmazásával a G-CSF és a GM-CSF hatására létrejött primer telepképződés szélsőségesen alacsony volt. A 7 napos szuszpenziótenyészet, majd a GM-CSF-fel végzett másodlagos újraklónozás azonban azt mutatta, hogy az IL-1 és IL-3 kombinációjával 7 napig szuszpenzióban tartott, kezelt csontvelősejtek egyenletesen maximális számú szekunder CFU-GM-et hoztak létre. Az IL-3 + IL-6 kombináció nem volt kevésbé hatásos, mint az IL-3 egyedüli alkalmazása, más citokinkombinációk azonban lényegesen kisebb hatást eredményeztek. E vizsgálatban a másodlagos telepképződést az IL-l+KL, és a KL+IL-3 kombináció maximálisan serkentette, s az őssejtképződés kiterjesztésében a mindhárom citokint magában foglaló kombináció volt a leghatásosabb.
A c-kit ligandum (KL), valamint azIL-Ιβ, IL-6 és egyéb vérképzési faktorok közötti kölcsönhatás
A csontvelő 5-FU-val végzett in vivő tisztítása a nyugvó vérképzési őssejtek gyarapításának egyszerű technikája. Az egy dózisban adott 5-FU 24 órán belül képes a korai megjelenésű CFU-S, és az érettebb CFU-C populáció mennyiségét 99%-nál nagyobb mértékben csökkenteni, miközben a csontvelő több éretlen őssejtjét elszaporítja. A késői megjelenésű CFU-S szintén érzékeny a csontvelő 5-FU-val végzett tisztítására, tovább erősítve azt az elképzelést, hogy ezek a sejtek nem azonosak a hosszú időtartamú csontvelő regenerálásáért felelős stemsejtekkel. A csontvelőt regeneráló stemsejtekről kimutatták, hogy az 5-FU-kezelés citotoxikus hatásaival szemben ellenállóak (105). 5-FU-val tisztított csontvelő alkalmazásával Bradley és Hodgson egy HPP-CFC őssejtkompartmentet azonosítottak, amely agartenyészetben nagy celluláris telepek kialakítására képes.
Az IL-1, IL-6 és KL kölcsönhatásait eredeti egérőssejt-kompartmenteken vizsgáltuk (104). Klonális tenyészetek alkalmazásával bizonyítékokat nyújtunk ezen faktorok önmagukban vagy CSF-ekkel együtt mutatott szinergikus és additív hatásaira. Eredményeink azt sugallják, hogy az IL-1, IL-6 és KL a korai vérképződésre gyakorolt serkentő hatásukat illetően egyedülállóan működnek. A klonális tenyészetekkel nyert tapasztalatokat egy rövid időtartamú folyadéktenyészet-vizsgálattal, a korábban leírt delta-vizsgálattal tovább bizonyítottuk. Vizsgálatainkkal az IL-1, IL-6 és KL korai
HU 219 540 Β és késői vérképzési kompartmentek szaporodását szabályozó képességét mutatjuk be.
Anyagok és módszerek
Egerek
Hím és nőstény (C57BL/6X DBA/2)Fj (B6D2F1) egereket a The Jackson Laboratorytól (Bar Harbor, ME) szereztünk be. Az egereket réteges áramlási körülmények között, savanyított és/vagy autoklávban kezelt ivóvízzel ellátva tartottuk. A tenyészettel együtt tartott jelzőegereket specifikus patogénekre vizsgáltuk. Az alkalmazott egerek mindegyike legalább 8 hetes volt.
Csontvelőkészítmény és szövettenyésztési feltételek
A csontvelőt normális, valamint az 5-FU-val kezelt egerek combcsontjából (femur), s időnként sípcsontjából (tibia) nyertük, kísérletenként legalább három egérből. Az egereket 150-250 μΐ térfogatban adott 150 mg/kg 5-FU-t tartalmazó intravénás injekcióval kezeltük. A csontvelőt a szövettenyésztés előtt centrifugálással kétszer mostuk. Ha másképp nem jelezzük, a csontvelőt IMDM-et (Bibco, Grand Island, NY) tartalmazó, 20% FCS-sel (HyClone Laboratories Inc., Logan, UT) és 0,05 mg/ml gentamicinnel (Gibco) kiegészített tenyészettápközegben tenyésztettük és kezeltük. A csontvelősejteket Coulter model ZBI sejtszámlálóval (Coulter Electronics, Hialeah, FL) számoltuk. Valamennyi alkalmazott műanyag eszköz szövettenyésztési minőségű volt.
Citokinek és antitestek
Tisztított rhlL-ip-t (fajlagos aktivitás=l,32x 107 E/mg; Syntex Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) 100 E/ml mennyiségben alkalmaztunk. Részlegesen tisztított és tisztított rhIL-6-ot Steven Gillistől (Immunex Corporation, Seattle, WA) kaptunk : a részlegesen tisztított IL-6-ot 3000 CESS E/ml mennyiségben, a tisztított IL-6-ot 50 ng/ml mennyiségben alkalmaztuk. A találmányunk szerinti eljárással vagy a fentebb említett leírások szerint más módokon előállított KL-t alkalmaztunk. A tisztított rhG-CSF-et (Amgen Biologicals, Thousand Oaks, CA) (fajlagos aktivitás=l χ 108 E/mg) 1000 E/ml koncentrációban alkalmaztuk. A tisztított rhM-CSF-et (Immunex) 1000 E/ml koncentrációban alkalmaztuk. Átmenetileg transzfektált COS-7 sejtekből rmIL-3-at tartalmazó kondicionált tápközeget készítettünk, s valamennyi egyéb növekedési faktorhoz hasonlóan, maximális CFU-C serkentést eredményező koncentrációban alkalmaztuk. Patkány anti-egér IL-6 monoklonális antitesteket a Genzyme-tól (Cambridge, CA) szereztünk be.
CFU-C vizsgálat
Az LPP-CFC-t citokineket és 0,36% agarózt (SeaPlaque; FMC, Rockland, ME) tartalmazó tenyészettápközegben szuszpendált 1 ml 5 χ 104 normál csontvelősejtet tartalmazó 35 mm-es Petri-csészében vizsgáltuk. Ezeket a tenyészeteket 7 napig 37 °C-on maximális páratartalmú, 5% CO2-ot tartalmazó atmoszféra alatt inkubáltuk. A HPP-CFC-t a korábban leírt kétrétegű agarózrendszer alkalmazásával vizsgáltuk. A HPP-CFC-t 60 mm-es Petri-csészékben vizsgáltuk (tenyészetenként 1χ1Ο3-1χ1Ο5 sejttel), melyekben a táptalajt, a citokineket és 0,5% agarózt tartalmazó 2 ml térfogatú alsó réteget a vizsgálat előtt 1-8 nappal (1-8 napos 5-FU csontvelősejt) 1 ml 5-FU-val fedtük be. A kétrétegű tenyészeteket 12 napig, 37 °C-on maximális páratartalmú, 5% CO2-ot és 7% O2-t tartalmazó atmoszférában inkubáltuk. A csészékben a legalább 50 sejtből álló, alacsony proliferatív potenciálú telepeket (LPP-CFC), valamint a soksejtes, nagy proliferatív potenciálú, legalább 0,5 mm átmérőjű telepeket (HPP-CFC) számoltuk. Valamennyi CFU-C vizsgálatot három tenyészetből származó adatok alapján értékeltük.
CFU-S vizsgálat
Az egereket 137Cs gamma-sugárzási forrásból kibocsátott 1250 Gy-vel, hozzávetőleg 90 Gy/perc dózisaránnyal sugárkezeltük. Az 1250 Gy sugárdózist két dózisban adtuk; először 800 Gy-vel, majd 3 óra múlva 450 Gy-vel végeztük a kezelést. A csontvelősejteket az utolsó sugárkezelést követően 2-3 órával intravénásán injektáltuk. A késői megjelenésű CFU-S-t a csontvelőátültetés után 12 nappal Bouin-féle oldatban rögzített lépben számoltuk.
Delta-vizsgálat
A korábbiakban leírtak szerint szuszpenziótenyészeteket végeztünk. 24 zsebes clusterlemezeken négy példányban 1 ml-es, 2,5 χ 105 db/ml 1 napos 5-FU csontvelősejtet tartalmazó tenyészeteket hoztunk létre, amelyeket növekedési faktorok jelenlétében, maximális páratartalmú, 5% CO2-ot tartalmazó atmoszféra alatt, 37 °C-on 7 napig inkubáltuk. Az 1 hetes tenyészetekből élénk pipettázás után nemtapadó sejteket gyűjtöttünk. A négy példányban készített delta-tenyészetekből származó reszuszpendált csontvelősejteket összegyűjtöttük, s a tenyészet sejtes összetételének vizsgálatához 1 ml-t használtunk fel. A maradék 3 ml sejtet 5 ml FCS rétegen keresztül centrifugálással tisztítottuk. A mosott sejteket másodlagos LPP-CFC, HPP-CFC és CFU-S jelenlétére vizsgáltuk. A G-CSF-re, GM-CSF-re és IL-3-ra érzékeny másodlagos LPP-CFC mennyiségét 7 napos CFU-C tenyészetekben határoztuk meg. Az IL-l-re és IL-3-ra érzékeny másodlagos HPP-CFC és LPP-CFC mennyiségét a HPP-CFC tenyésztéséhez fentebb leírt körülmények között 12 napos tenyészetben értékeltük. A delta-tenyészetekből származó sejteket a másodlagos CFU-C-meghatározáshoz 20-20 000-szeresre hígítottuk. A delta-tenyészetekben 1 hetes tenyésztés után jelen lévő CFU-S számát úgy határoztuk meg, hogy az egerekbe 2-200-szoros hígítású mosott sejteket ültettünk át.
A delta-tenyésztés után a csontvelőőssejt-populációk számának aránybeli növekedése adja a delta-értéket. A kiindulási, 1 napos 5-FU csontvelősejt-populációban az elsődleges LPP-CFC, HPP-CFC és CFU-S számát a szuszpenziótenyészetekkel párhuzamosan mértük. A delta-értékeket úgy határoztuk meg, hogy a szekunder LPP-CFC, HPP-CFC, illetve CFU-S összes végső mennyiségét a primer LPP-CFC, HPP-CFC, illetve CFU-S kezdeti mennyiségével osztottuk.
A tapadósejtek számának csökkentésével végzett delta-vizsgálat cm3-es szövettenyésztő palackban 12,5 ml-es, 2,5 xlO5 db/ml 1 napos 5-FU csontvelősejtet (az
HU 219 540 Β
5-FU-val végzett kezelést követően 1 nappal tenyésztett sejt) tartalmazó delta-tenyészeteket hoztunk létre. A tenyésztés megkezdése előtt tenyészettápközegben 37 °C-on 4 órán keresztül végzett inkubálással lecsökkentettük a tapadósejtek mennyiségét. A nemtapadó sejteket egy másik, 25 cm3-es palackba vittük, s mindkét sejtpopulációt a fentebb delta-tenyészetekhez leírt körülmények között kezeltük.
A citokinaktivitás vizsgálata
A 25 cm3-es szövettenyésztő palackokban nevelt tenyészetekből származó delta-tenyészet-felülúszókat centrifugálással gyűjtöttük össze. A felülúszókat az 1 napos 5-FU csontvelővel, a lecsökkentett tapadósejttartalmú csontvelővel, valamint a tapadó csontvelősejtekkel készített tenyészetekből gyűjtöttük össze. Az IL-6-aktivitást a korábban leírt egér-B9 hibridomasejtproliferációs vizsgálattal határoztuk meg. A citokinaktivitást az NSF-60 növekedésfüggő vérképzési sejtvonal alkalmazásával is mértük. Az NSF-60 sejtek növekedésifaktor-működésének hatására mutatott proliferációját a korábban leírtak szerint mértük.
Az eredmények értékeléséhez a szignifikanciát a Student-féle t-teszt alkalmazásával határoztuk meg.
Eredmények
Az IL-1, IL-6 és KL normális csontvelőben mutatott aktivitása
A G-CSF, M-CSF, GM-CSF és IL-3 IL-l-gyel, IL-6-tal és KL-lel együtt a normális csontvelőből való telepképződésre gyakorolt hatását az 1. ábrán mutatjuk be. Az IL-1, IL-6, KL, és az IL-l+KL-6 kombináció hatására tapasztalható telepképződés minimális mértékű volt. Az IL-1 M-CSF-fel, GM-CSF-fel vagy IL-4-gyel való kombinálása a csak CSF-ek alkalmazásával tapasztalhatónál nagyobb mértékre növelte a telepképződést, s ami még jelentősebb, az IL-l-gyel és az M-CSF-fel külön-külön végzett serkentés hatásának (melyeket az ismételt vizsgálatokban egyenletes szinten tapasztaltunk) összeadásával kapott értéknél is nagyobbra. Ha a CSF-et tartalmazó tenyészetekhez IL-6-ot adtunk, a telepképződés additív módon növekedett. Az IL-l+IL-6 kombináció önmagában vagy CSF-ekkel együtt az additív értéknél nem lényegesen nagyobb mértékben növelte a telepképződést. Az IL-l-et, IL-6-ot, G-CSF-et, GM-CSF-et vagy IL-3-at tartalmazó tenyészetekben a KL hozzáadása hasonló módon stimulálta a CFU-C-t. Az IL-1+KL vagy IL-6+KL kombinációval serkentett tenyészetekhez a CSF hozzáadása additív vagy annál is kisebb mértékű telepnövekedést eredményezett.
Az IL-1, IL-6 és KL 5-FU-val kezelt csontvelőben mutatott aktivitása
Az egerek egyszeri 5-FU-val végzett kezelését követően 1-7 nappal történt HPP-CFC és LPP-CFC regenerálódást a 2. és 3. ábrán mutatjuk be. Az IL-l-re és/vagy IL-6-ra reagálva kevés telep fejlődött, annak ellenére, hogy több HPP-CFC-t, illetve LPP-CFC-t mutattunk ki. Az egyes sejtcsaládokra korlátozódó CSF-ek, a G-CSF és az M-CSF a HPP-CFC serkentését illetően csekély képességgel rendelkezett, míg a GM-CSF és az IL-3 mind a HPP-CFC-t, mind az
LPP-CFC-t serkentette. A HPP-CFC legnagyobb mértékű serkentéséhez a növekedési faktorok kombinációira volt szükség.
A kit ligandum gyakorlatilag alig kimutatható telepképződést serkentő aktivitással rendelkezik; 1 χ lő4 7 napos 5-FU csontvelősejt közül átlagosan 1,3 HPP-CFC és 2,7 LPP-CFC serkentését eredményezi (30. ábra). E vizsgálat legnagyobb részében 20 ng/ml koncentrációjú KL-t használtunk. Ez a KL-koncentráció IL-1 és IL-6 jelenlétében nagy proliferatív aktivitású telepek képződését serkenti. 1 ng/ml KL-koncentrációval átlagosan 6,7 telepet tapasztaltunk, míg 10 ng/ml és 100 ng/ml koncentráció között a telepek száma elérte a maximumot, 2,5 x1ο4 4 napos 5-FU csontvelősejt között 120-140 HPP-CFC volt (az adatokat nem ábrázoljuk). A G-CSF-et tartalmazó tenyészetekhez KL-t adva az 1 napos 5-FU csontvelőben a HPP-CFC száma megnövekedett, csakúgy, mint az LPP-CFC száma az 1 napos, valamint a 7 napos 5-FU csontvelőben. A 4 napos 5-FU csontvelő tenyészeteiben a HPP-CFC serkentését illetően a KL és a G-CSF között határozott szinergiát (együtt működést) tapasztaltunk (az adatokat nem ábrázoljuk). A KL+M-CSF alkalmazása nem eredményezett additív mértékűnél nagyobb telepképzést serkentő aktivitást. A KL a HPP-CFC stimulálásában GM-CSF és IL-3 jelenlétében azonban jelentős szinergiát mutatott. Az IL-3+KL kombináció mind az 1 napos, mind a 7 napos 5-FU csontvelősejt-populációban nagyobb mértékű serkentést eredményezett, mint az IL-l+IL-3 kombináció; ha az IL-3-at tartalmazó tenyészethez KL-t adtunk, az 1 napos, illetve 7 napos 5-FU csontvelőben a HPP-CFC száma 6-35-szörösére emelkedett.
Bár az IL-1, az IL-6 vagy a KL nem rendelkezik kimutatható CSF-aktivitással, a KL IL-l-et vagy IL-6ot, vagy IL-l-et+IL-6-ot tartalmazó tenyészethez való hozzáadása a HPP-CFC növekedését illetően ezen faktorok igen nagy mértékű szinergiáját eredményezte (30. ábra). A KL IL-6-tal, illetve IL- 1-gyel való kombinálása 1 χ 105 1 napos 5-FU csontvelősejt közül átlagosan 4,0, illetve 13,7 nagy proliferációs potenciálú telep serkentését eredményezte. Sőt a három citokinegyüttes alkalmazása 1 χ 105 sejtre vonatkoztatva átlagosan 42,0 HPP-CFC serkentését eredményezte. Ezen eredmények világosan bizonyítják egy olyan HPP-CFC szubpopuláció létezését, amely a nagymértékű telepképződéshez IL-1, IL-6+KL serkentő hatását igényli. A 7 napos 5-FU csontvelősejtek ezen növekedési faktorokra mutatott érzékenysége hasonló volt az 1 napos 5-FU csontvelősejtek által mutatotthoz. A 7 napos 5-FU csontvelősejtek populációjában az IL-1+IL-6+KL kombináció serkentésével elért HPP-CFC-mennyiség kevesebb, mint tizedrésze volt annak a mennyiségnek, amit a három faktor kombinációjához GM-CSF-et adva érhetünk el. Az 1 napos 5-FU csontvelősejt-populációban a négy citokinnel stimulált HPP-CFC száma csak kétszerese volt az IL-1+IL-6+KL kombinációval stimulált mennyiségnek.
Az IL-6 KL és CSF-ek kombinációit tartalmazó tenyészetekhez való hozzáadása az IL-6, KL és CSF két30
HU 219 540 Β faktoros kombinációival elért hatások összeadásával kiszámíthatónál nem eredményezett nagyobb telepképződési mennyiséget (30. ábra). Például az IL-6+KL+ +GM-CSF kombináció 1 χ 105 1 napos 5-FU csontvelősejt közül hozzávetőleg 30 nagy proliferációs potenciálú telepet eredményezett. E HPP-CFC-mennyiség nagyobb része az IL-6+KL+GM-CSF-fel stimulált tenyészetekben tapasztalható mennyiségek alapján is kiszámolható (4, illetve 20 HPP-CFC), ami arra enged következtetni, hogy az IL-6, KL+CSF nem kombinálódik további HPP-CFC proliferációjának serkentésében.
Az IL-6-tal kapott fenti eredményekkel ellentétben, az IL-1 a KL-t és CSF-et tartalmazó tenyészetekhez való hozzáadása szinergiát mutatott (30. ábra). Ez az együtt működés az IL-1, KL+G-CSF kombinációival nevelt 7 napos 5-FU csontvelőtenyészetben volt a legnyilvánvalóbb. E három faktor bármelyike 5 vagy kevesebb HPP-CFC-t serkentett, miközben az IL-1, KL+G-CSF kombináció 1 χ 104 csontvelősejtre vonatkoztatva átlagosan 100 HPP-CFC-t eredményezett. Bár nem ilyen kifejezetten, de az IL-1, KL+GM-CSF vagy IL-1 között a 7 napos 5-FU csontvelősejtek serkentésében is nyilvánvaló volt az együtt működés. Ezek az additív értéken felüli hatások szintén egyértelműek voltak az 1 napos 5-FU csontvelősejt-populáció IL-1, KL+G-CSF vagy M-CSF kombinációkkal történő kezelése esetén. Az IL-1, KL+GM-CSF vagy IL-3 kombinációkkal stimulált 1 napos 5-FU csontvelősejtek esetében a HPP-CFC nagy száma azonban ezen növekedési faktorok különböző HPP-CFC populációkra gyakorolt összeadódó hatásainak tulajdonítható.
Amint korábban említettük, a legtöbb HPP-CFC kialakulását a négyfaktoros kombinációk serkentették, melynek során az IL-1, IL-6, KL+GM-CSF vagy IL-3 kombináció volt az optimális (30. ábra). Az IL-1, IL-6, KL+GM-CSF kombináció a 7 napos 5-FU csontvelősejtek több mint 3%-át volt képes nagy proliferációs képességű telepek kialakítására serkenteni. Úgy tűnik, a tapasztalt HPP-CFC-gyarapodás a kevesebb citokinkombinációval elért telepnövekedésnél nagyobb mértékű telepnövekedés indukálását illetően csak az IL-1, IL-6, KL+M-CSF kombináció esetében tulajdonítható a négy faktor együtt működésének. Az IL-6, IL-1, KL+G-CSF, GM-CSF vagy IL-3 kombinációhoz való hozzáadása nem eredményezett additív szintnél nagyobb telepképződést. Az IL-1, IL-6, KL+G-CSF, GM-CSF vagy IL-3 kombinációkkal stimulált nagy proliferációs képességgel rendelkező telepek száma a legtöbb esetben nem sokkal volt nagyobb az IL-1, KL+G-CSF, GM-CSF vagy IL-3 kombinációkkal stimulált HPP-CFC-mennyiségnél.
Az 5-FU-val kezelt csontvelő szaporítása delta-tenyészetekben
A delta-tenyészetekből 7 napos tenyésztés után kinyert nemtapadó sejtek tükrözték az 5-FU-val kezelt csontvelősejtek klonális tenyészetében a különböző citokinkombinációkkal tapasztalt reakciókat (31. ábra). Az 1 napos 5-FU (5-FU-val végzett kezelést követően 1 nappal tenyésztett) csontvelő-kontrolltenyészetekben, melyeket citokinekkel nem kezeltünk, a sejtes összetétel átlagosan 39%-kal csökkent. A megmaradt sejtek között a monocita/makrofág populáció volt az uralkodó. IL-1, IL-6 vagy KL egyedüli hozzáadása a kinyert sejtek számát nem emelte a kezdeti szintnél nagyobbra. A GM-CSF és az IL-3 hatására mutatott csekély növekedéstől eltekintve, csak azokban a tenyészetekben növekedett a sejtszám, amelyeket több citokin kombinációjával serkentettünk. A legnagyobb mértékű proliferációt az IL-1, KL+GM-CSF vagy IL-3 kombinációkkal stimulált tenyészetekben tapasztaltuk, és az IL-6 további hozzáadása nem növelte jelentősen a sejtek szaporodását. Az éretlen mieloidsejtek megjelenése összefüggést mutat a delta-tenyészetekben tapasztalt proliferációval. Az egyik kísérletben az IL-3-mal stimulált tenyészet körülbelül 50% érett, barázdálódott neutrocitát, 20% mielocitát és 3% magvas (éretlen) vörösvérsejtet tartalmazott. Az IL-3-at tartalmazó tenyészetekhez különböző faktorokat hozzáadva a magvas vörösvérsejtek aránya növekszik; IL-1 (22%), IL-6 (18%), KL (24%), IL-l+IL-6 (12%), IL-l+KL (51%), IL-6+KL (43%), IL-1, IL-6+KL (46%). A legnagyobb magvas vörösvérsejt-mennyiséget (6,1 xlO5) az IL-1, KL+IL-3 kombinációval kezelt tenyészetben kaptuk, ami a kiindulási, 1 napos 5-FU csontvelősejtpopuláció kezdeti mennyiségölek 200-szoros növekedését jelenti.
A citokinek hozzáadása nélküli, kontroll-deltatenyészetekben az LPP-CFC őssejt-populációk nem növekedtek a kezdeti értékeknél nagyobbra (32. ábra). A G-CSF, M-CSF, GM-CSF és IL-3 telepképződést serkentő faktorok hozzáadása eredményeként a populációk szaporodása nyilvánvaló volt (átlagos delta-értékek: 3,4; 2,4; 23, illetve 140). Az IL-1 önmagában az LPP-CFC számának hatvanszoros növekedését eredményezte. Az IL-1 és a CSF-ek kombinálása az LPP-CFC additív értéknél nagyobb mértékű szaporodását eredményezte, ami a faktorok együtt működését jelezte. Például, az IL-l+IL-3 kombináció átlagos delta-értéke 520, s ehhez képest a megjósolt additív delta-érték: 140 (IL—3)+63 (IL-1)=203. Az IL-6 az LFF-CFC kismértékű, de jelentős (delta-érték=3,4; p<0,01) szaporodását eredményezte. Az IL-6+G-CSF és IL-6+IL-3 kombinációk az additív értékeknél nagyobb hatást eredményeztek. A KL a delta-tenyészetekben nem növelte jelentősen az LPP-CFC szaporodását (p=0,08), a KL+CSF-ek kombinációi azonban minden esetben az additív értéknél nagyobb mértékű serkentést eredményeztek, A KL+IL-3 kombináció hatása az LPP-CFC szaporodását illetően hasonló volt az IL-l+IL-3 hatásához (átlagos delta-érték=485, illetve 520; p=0,21). Az IL-l+IL-6 kombinációval CSF-ekkel együtt stimulált delta-tenyészetek minden esetben nagyobb delta-értékekkel rendelkeztek, mint az IL-l-gyel vagy IL-6-tal stimulált tenyészetek. Az LPP-CFC megnövelt gyarapodása valamennyi IL-1, IL-6+CSF-ek kombinációval additív volt, kivéve az IL-1+IL-6+ +M-CSF kombinációval stimulált tenyészetben (deltaérték=300; az IL-l+M-CSF delta-értéke=140, az IL-6+M-CSF kombináció delta-értéke pedig 2,8). Az
HU 219 540 Β
IL-6 és a KL együttes alkalmazásukkor az LPP-CFC szaporodásának serkentésében együttes működést (szinergia) mutattak (több mint 200-szoros növekedést eredményezve), annak ellenére, hogy e két citokin CSF-tartalmú tenyészetekhez adva a progenitor (ős)sejtek csupán additív mértékű szaporodását eredményezte. Az IL-1 és a KL működése az LPP-CFC több mint ezerszeres szaporodásának stimulálásában szinergikus volt. az IL-l+KL kombinációt tartalmazó tenyészetekhez a G-CSF, GM-CSF vagy 1L-3 hozzáadása tovább növelte az LPP-CFC szaporodását (átlagos delta-értékek: 1100, 1200, illetve 1400). Az LPP-CFC legnagyobb mértékű szaporodását az IL— 1, IL-6, KL+CSF-ek kombinációi eredményezték. Az IL-1, IL-6, KL+IL-3 kombinációval stimulált delta-tenyészetekben az LPPCFC száma 1800-szorosára emelkedett. Az IL-l-et és KL-t tartalmazó delta-tenyészetekhez az IL-6 hozzáadása növelte ugyan a delta-értéket, de nem növelte jelentős mértékben az őssejtek gyarapodását (p>0,05).
A HPP-CFC gyarapítása delta-tenyészetben
A különböző citokinkombinációk HPP-CFC szaporodását serkentő képességét teszteltük (33. ábra). Az LPP-CFC szaporításához hasonlóan, a delta-tenyészetekben a HPP-CFC számának legnagyobb emelkedését az IL-l+KL+CSF kombinációval végzett stimulálás eredményezte. A CSF-ek önmagukban csak csekély mértékű HPP-CFC szaporodást stimuláltak. Az IL-6 stimulálta a HPP-CFC szaporodásának növekedését, sőt az IL-6+IL-3 kombinációval végzett stimulálás hatásosabb volt, mint az IL-3-mal önmagában végzett kezelés. Az IL-6-tal ellentétben az IL-1 mind a négy CSF-fel való kombinációban szinergikus működést mutatott. A négy CSF-fel kombinálva a KL is az additív szintnél nagyobb mértékben stimulálta a HPP-CFC szaporodást. Az IL-l+IL-6 kombináció CSF-ekkel együtt vagy azok nélkül hatásosabb volt a HPP-CFC számának gyarapításában, mint az IL-1 vagy az IL-6 önmagában. Az IL-1+IL-6 szinergikus működésének legnyilvánvalóbb esete az M-CSF-fel való együttes alkalmazás (az IL-6+M-CSF kombinációval az átlagos delta-érték=1,0; az IL-l+M-CSF kombinációval =13,2; az IL-1+IL-6+M-CSF kombinációval pedig 65,7). A KL-t tartalmazó delta-tenyészetekhez az IL-1 vagy IL-6 önmagában vagy CSF-ekkel történő együttes hozzáadása a HPP-CFC számának additív szintnél nagyobb növekedését eredményezte. Annak ellenére, hogy valamennyi esetben növekedett a deltaérték, a CSF-ek hozzáadása a KL-t tartalmazó tenyészetekhez (akár önmagukban, akár IL-2-vel vagy IL-6tal együtt) nem növelte jelentősen a HPP-CFC szaporodását. A HPP-CFC legnagyobb mértékű szaporodását az IL-1, IL-6+KL kombinációval stimulált tenyészetekben tapasztaltuk (delta-érték=705).
A delta-tenyészetekben képződött másodlagos HPP-CFC-t rendszerint IL-1 és IL-3 faktorok serkentésével végzett klonális vizsgálattal teszteltük (33. ábra). A citokinek egyéb kombinációit, mint az IL-1 + +GM-CSF vagy IL-l+M-CSF kombinációt másodlagos HPP-CFC-t stimuláló képességére teszteltük. Az IL-l+M-CSF vagy GM-CSF jelenlétében kifejlődött másodlagos HPP-CFC számolását gátolta az ezen faktorok által serkentett másodlagos LPP-CFC másodlagos HPP-CFC-hez viszonyított nagy többsége. A másodlagos HPP-CFC stimulálását illetően teszteltük az IL-1 és KL hatását is (34. ábra). Minden más citokinkombinációval ellentétben, az IL-1 +KL kombinációra érzékeny őssejtek nem szaporodtak drámai mértékben azokban a delta-tenyészetekben, amelyek serkentették az IL-l+IL-3 kombinációra érzékeny HPP-CFC és LPP-CFC szaporodását.
CFU-S szaporítása delta-tenyészetekben
A delta-tenyészetek után megjelenő csontvelősejtpopulációk további jellemzése érdekében vizsgáltuk a CFU-S mennyiségének a delta-tenyészetekben végzett citokinstimulálás eredményeként tapasztalható növekedését (35. ábra). Az IL-1, IL-3, IL-l+IL-3, és IL-1 +KL jelenlétében nevelt tenyészetek a HPP-CFC és LPP-CFC mennyiségének növekedését mutatták, összhangban a 32. és 33. ábrán bemutatott eredményekkel. Ezek a tenyészetek a CFU-S mennyiségének növekedését is mutatták, amely nagyobb volt a HPP-CFC növekedésénél. Az IL-1+IL-3 és az IL-1 +KL kombináció a késői megjelenésű CFU-S számának több mint 100-szoros emelkedését stimulálta. Ezeket az eredményeket összehasonlítottuk HPP-CFC és CFU-S szaporodásával, amelyekről tudjuk, hogy az 5-FU-val végzett kezelésből felépülő egerekben előfordulnak; az in vivő szaporodást (in vivő delta) úgy mértük, hogy a 8 napos 5-FU csontvelőben található összes combcsonti HPP-CFC-, LPP-CFC- és CFU-S-mennyiséget elosztottuk az 1 napos 5-FU combcsontban található telepek mennyiségével. Az őssejtek in vivő szaporodása hasonló volt az in vitro delta-tenyészetekben tapasztalhatóhoz, azzal a különbséggel, hogy az LPP-CFC mennyiségének in vivő mennyisége kevesebb volt, mint az in vitro kísérletben.
Vizsgálatainkkal az IL-1, IL-6 és KL vérképzési őssejtek szabályozásában játszott szerepét igazoltuk. Ezek a citokinek a klonális tenyésztési vizsgálatok során önmagukban alkalmazva az egér vérképzési őssejtek proliferációjának serkentését illetően korlátozott képességgel rendelkeztek (29-30. ábra). A telepnövekedés serkentésében azonban nyilvánvaló volt az IL-1, IL-6 és KL szinergikus működése. Az IL-1, IL-6, KL és telepképződést serkentő faktorok kombinációinak szisztematikus vizsgálatával az 5-FU kezeléssel tisztított csontvelőben jelen levő HPP-CFC- és LPP-CFC-populációkat tudtunk megkülönböztetni. Az IL-1, IL-6 és/vagy KL vérképzési őssejtek telepképzését szabályozó képességét az 1 napos 5-FU csontvelő rövid idejű folyadéktenyésztésével szintén alátámasztottuk. A delta-vizsgálat - amellyel mérhető az őssejt-populációk citokinekkel végzett stimulálásra bekövetkező gyarapodása - azt mutatta, hogy az LPP-CFC és HPP-CFC legnagyobb mértékű gyarapodása az IL-1, IL-6, KL és CSF-ek korai vérképzési őssejtekre gyakorolt együttes hatásainak függvénye (32-35. ábra).
Az IL-1 jelentősége ismert a korai vérképződés szabályozásában, hiszen azonosították az 5637 húgyhólyagkarcinóma-sejtvonalban jelen lévő hemopoetin-132
HU 219 540 Β gyei szinergikus működését. Korábban közölt eredményekkel összhangban kimutattuk, hogy az IL—1 a HPP-CFC serkentésében a G-CSF-fel, M-CSF-fel, GM-CSF-fel, IL-3-mal vagy KL-lel szinergikusan működik (29. és 30. ábra). Az IL—1 korai vérképzési sejtek proliferációját serkentő képességét a delta-vizsgálatban is tapasztaltuk (31-33. ábra). Az IL—1 G-CSF-fel, GM-CSF-fel, IL-3-mal vagy KL-lel szinergikus aktivitása folyadéktenyészetben a sejtek összes számának, valamint a mieloid magvas vörösvérsejtek, az LPP-CFC és a HPP-CFC számának gyarapodását elősegítő képességében nyilvánul meg. A delta-tenyészetekben az IL-l+IL-3 az LPP-CFC, illetve a HPP-CFC mennyiségének 520-, illetve 83-szoros növelésére volt képes, s az őssejt-populációk ilyen mértékű gyarapítása nagyobb volt az IL-1+G-CSF, M-CSF vagy GM-CSF kombinációkkal való stimulálással elért gyarapításnál. Az IL-1 és KL között tapasztalt szinergikus működés az 1 napos 5-FU csontvelő gyarapításában azonban hatásosabb stimulálást eredményezett, mint az IL-1 +IL-3 kombináció hatása.
Az IL-l+KL kombinációval stimulált delta-tenyészetekben az LPP-CFC száma több, mint 1000-szeresére, a HPP-CFC száma pedig 280-szorosára emelkedett.
Úgy találtuk, hogy az IL-6 vérképzési aktivitása különbözik az IL-1 aktivitásától. Az IL-6+IL-3 vagy KL kombinációról kimutattuk, hogy az 1-7 napos 5-FU csontvelőből a HPP-CFC stimulálásában szinergikus működésű (30. ábra). Az IL-6 és a KL a CFU-C normális csontvelőből való stimulálásában is szinergikus működésű volt (28. ábra). A delta-vizsgálatban az LPP-CFC és a HPP-CFC gyarapításában az IL-6 és az IL-3 vagy KL között is nyilvánvaló volt a szinergikus működés (5. és 6. ábra). A HPP-CFC gyarapításában az IL-6+IL-3 kombináció nem volt olyan hatásos, mint az IL-l+IL-3 (delta-értékek: 40, illetve 83). Az IL-1, IL-6 és M-CSF háromfaktoros kombinációjáról azt találtuk, hogy a HPP-CFC 1-7 napos 5-FU csontvelőből való serkentésében is szinergikus. Az LPP-CFC- és HPP-CFC-populációk gyarapítását illetően a delta-vizsgálatban is szinergikus működést mutattunk ki az IL-1, IL-6 és M-CSF között. Az IL-1, IL-6+KL citokinkombináció a HPP-CFC 1 és 7 napos 5-FU csontvelőből való serkentésében mutatott szinergikus működést. A delta-tenyészetekhez IL-1, IL-6+KL kombinációját adva a tapasztalt legnagyobb mértékű HPP-CFC-szaporodást értük el (delta-érték=705). Az IL-1, IL-6, KL és CSF-ek közötti szinergikus működés fenti példái az IL-1, IL-6 és KL pluripotens vérképzési őssejtek szabályozásában játszott egyedülálló szerepét bizonyítja.
A KL vizsgálatunk során tapasztalt, korai vérképzési őssejtekre gyakorolt serkentő hatásai összhangban állnak a stemsejtfejlődéssel, amelynek nagy szerepe van a KL gén klónozásában. A normális csontvelő őssejtjeinek IL-l-re, IL-6-ra, G-CSF-re, GM-CSF-re vagy IL—1re adott reakciója a KL-lel kapcsolatos szinergiát mutatott (28. ábra). Amint korábban leírták, a KL M-CSF-fel együtt nem fokozza a normális csontvelőből való telepképződést. 5-FU-val kezelt csontvelő alkalmazása esetén is hasonló eredményeket tapasztaltunk; a KL szinergikus működésű volt az IL-l-gyel, IL-6-tal, G-CSF-fel, GM-CSF-fel, illetve IL-3-mal; az M-CSF-fel azonban nem (30. ábra). A HPP-CFC stimulálásában az IL-1 és KL nagymértékű szinergikus működése CSF-ek hozzáadásával tovább fokozható. Jelentősebb volt az IL-1, KL és G-CSF közötti, 1 és 7 napos 5-FU csontvelő tenyészetében tapasztalható szinergikus működés. Az optimális vérképződési reakciót az IL-1, IL-6, KL+CSF négyfaktoros kombinációk alkalmazásával tapasztaltuk. A HPP-CFC négyfaktoros serkentésében csak az IL-1 +IL-6+KL+GM-CSF vagy IL-3 kombináció volt szinergikus hatású. Az IL-1+IL-6+KL+ +GM-CSF vagy IL-3 kombinációk stimulálták legnagyobb mértékben a HPP-CFC-t, s a delta-tenyészetekben ezek eredményezték a legnagyobb sejtproliferációt, s a legnagyobb mértékű LPP-CFC-szaporodást (31-33. ábra). Ezek az eredmények bizonyítják a KL jelentőségét a korai vérképzési sejtek proliferációjának szabályozásában.
A HPP-CFC olyan sejtek hierarchiáját jelenti, amelyek növekedési faktor szükségleteik és/vagy fizikai elválasztási technikák alapján különböztethetők meg. A korai vérképzési sejtek két kompartmentjének (HPP-CFC-1 és HPP-CFC-2) azonosítása összhangban áll az őssejtek rodamin-123 mitokondriumfestéket megtartó képességük alapján végzett elválasztásának eredményeivel. A kevés rodamin-123-at tartalmazó sejtek képviselik azon sejtek korábbi HPP-CFC-1 kompartmentjét, amelyek proliferációjukhoz az IL-1, IL-3 és M-CSF szinergikus együtt működését igénylik, míg a HPP-CFC-2 sejtkompartment nem igényel IL-l-es serkentést. Az IL-l+CSF stimulált őssejtek fejletlenebb természete összhangban áll az IL-1 és a CSF-ek (a delta-vizsgálat során az LPP-CFC és HPP-CFC gyarapítását illetően tapasztalt) szinergikus működésével (32. és 33. ábra). A fejletlen vérképzési sejtek szabályozását az IL-6 és KL növekedési faktorok is irányítják. Az IL-6 és KL azon képessége, hogy a delta-tenyészetekben gyarapítja a HPP-CFC mennyiségét, arra utal, hogy szerepük van a HPP-CFC-1nek tartott őssejtek stimulálásában. Ezek az adatok azt az álláspontot igazolják, hogy azok a nyugvó stemsejtek, amelyek a csontvelő 5-FU-val végzett kezelése után megmaradtak, proliferációjukhoz több növekedési faktor általi serkentést igényelnek. Ezen őssejtek HPP-CFC-1 stádiumból a HPP-CFC-2 stádiumba jutását jelentő érése után a több citokin stimulálta proliferációjúkat illetően szűkebbre szabott szükségleteik vannak. A HPP-CFC hierarchiájával összhangban áll az a tapasztalat, hogy IL-3, IL-6, KL+GM-CSF stimuláció hatására a 7 napos 5-FU csontvelősejtek több mint 3%-a képes HPP-CFC képzésére (30. ábra), amely gyakoriság sokkal nagyobb, mint a csontvelőben jelen levő totipotens stemsejtek becsült gyakorisága.
A delta-tenyészetekben a HPP-CFC számának növekedése a multipotens vérképzési őssejtek szaporodá33
HU 219 540 Β sara utal. Ezen delta-tenyészet utáni HPP-CFC elhelyezkedése a HPP-CFC hierarchiában azonban nem világos. A késői megjelenésű CFU-S számának deltatenyészetekben tapasztalt növekedése azt az álláspontot támasztja alá, hogy a delta-vizsgálat körülményei kö- 5 zött a multipotens vérképzési őssejtek száma növekszik (35. ábra). A CFU-S száma a tisztított rodamin-123mal erősen vagy gyengén festődő őssejtek IL-1+IL-3 vagy KL+IL-1 vagy IL-3 kombinációval stimulált szuszpenziótenyészeteiben több mint 100-szorosára emelkedett. Eredményeink ellentétesek a CFU-S számának IL-6+IL-3 vagy KL kombinációval stimulált 2 napos 5-FU csontvelő folyadéktenyészetben tapasztalt, mások által leírt csökkenésével, s előnyösebbek lehetnek a génterápiás eljárásokban. Eredményeink arra 15 engednek következtetni, hogy az őssejtek IL-l+IL-3 vagy KL citokinek hatására tapasztalható szaporodása hasznos lehet a csontvelő-átültetési eljárásokban is. Az IL-l+KL kombinációra érzékeny HPP-CFC száma a delta-tenyészetekben az IL-1, IL-3, IL-6+KL nőve- 20 kedési faktorok kombinációjának hatására minimális gyarapodást mutatott (34. ábra). Az IL-l+KL kombináció azon képessége, hogy elősegíti a HPP-CFC 5-FU-val kezelt csontvelőből való fejlődését, valamint hogy a delta-vizsgálatban nagymértékben serkenti az 25 őssejtek számának gyarapodását, arra utal, hogy az
IL-l+KL a korai multipotens őssejtek egy csoportjára hat. Az IL-l+KL kombinációra reagáló HPP-CFC csökkent mértékű szaporodása arra utal, hogy az IL-1, IL-3, IL-6 és KL növekedési faktorok a delta-vizsgálatban korlátozott mértékben képesek serkenteni a korai vérképzési őssejtek és stemsejtek önmegújulását.
IL-1 és KL-indukálta proliferáció és a TGF§ és MlPl-a. hatása
A TGFp-ról és az ΜΙΡΙ-α-ról (Macrophage Inflam10 matory Protein-Ία) korábban leírták, hogy gátolják az őssejteket. Ezen leírások azt sugallják, hogy ezek a citokinek a vérképzési stemsejt-proliferáció negatív szabályozóiként működnek, bár ezt a kettőt a felismert stemsejtvizsgálatokban közvetlenül nem hasonlították össze. Az egér-HPP-telep-vizsgálatban a stemsejttulajdonságokat úgy vizsgáljuk, hogy a késői megjelenésű őssejtek számát 5-fluor-uracillal csökkentjük, s csak a nagy proliferatív potenciálú telepeket (0,5 mm-nél nagyobb telepátmérő) számoljuk. Az IL-1 és a KL elsősorban a korai vérképzési őssejteket serkenti. Ilyenformán a TGFp és az ΜΙΡΙα IL-1 és KL által indukált HPP-proliferációra gyakorolt hatását értékeltük. Két különálló, háromszori ismétléssel végzett kísérlet eredményeit a HPP-telepek növekedési faktorok kombinációival indukált számának az egyedül GM-CSF-fel (GM) indukált számához viszonyított arányaként fejezzük ki.
GM IL-l+GM KL+GM IL-l+KL+GM IL-l+KL
Kontroll 1,0+0,1 7,0+1,3 3,9+0,8 47,3+6,5 9,7+1,5
TGFpi 1,2+0,2 1,3+0,5 1,4+0,2 2,0+0,2 0+0
TGFP3 1,0+0,2 1,3+0,1 1,1+0,3 1,4+0,2 0+0
ΜΙΡΙα 0,9+0,2 6,9+0,7 6,3+0,6 50,8+6,5 15,8+2,1
(TGFpi és TGFp3: 10 ng/ml; ΜΙΡΙα: 200 ng/ml; az adatok átlag±középcrtck szórása értéket fejeznek ki.)
Az eredmények azt bizonyítják, hogy a TGFp csökkenti az IL-1 és/vagy KL+GM-CSF kombinációkkal stimulált HPP-telepek szinergikus proliferációját, miközben az ΜΙΡΙα-nak nincs ilyen hatása. A TGFp továbbá megszüntette az IL-l+KL kombinációval indukált HPP-telepeket, míg az ΜΙΡΙα ilyen feltételek mellett elősegítette a HPP-telepképződést. Azt a következtetést vonjuk le, hogy az általunk vizsgált vérképzési őssejt-populációk negatív szabályozójaként a TGFp, s nem az ΜΙΡΙα működik. Ennek nagy jelentősége van a kemoterápiás védési eljárások megtervezésében.
A KL humán vizsgálatai az IL-3-mal, EPO-val, illetve GM-CSF-fel együtt
Diamond Blackfan vérszegénységben szenvedő, prednizonrezisztens vagy nagy prednizondózisokat igénylő 11 páciens rhEPO és rhIL-3 stimulációval csökkent átlagos BFU-E gyakorisággal rendelkezett. Egy prednizonérzékeny páciens kivételével ezek az értékek négy normális felnőtt csontvelőjéből nyert 95% konfidenciahatár alatt voltak. Ha rekombináns egér-ckit ligandumot (rmKL) adtunk be, vagy ha az rhIL-3at ezzel helyettesítettük, valamennyi páciens a BFU-E méretének és hemoglobinellátottságának jelentős emelkedését mutatta. Sőt az rhEPO, rhIL-3 és rmKL kombináció 8-11 páciensben legalább kétszeres (2-26-szoros) BFU-E-gyakoriságot eredményezett. Az rhIL-3indukált mieloidtelepek száma 5-11 páciensben szintén a 95% konfidenciahatár alá csökkent. KL beadásával az átlagos mieloidtelep-gyakoriság hat páciensben kétszeresére (vagy többszörösére) nőtt.
Hat Franconi-szindrómában szenvedő, különböző fokú csontvelő-elégtelenséggel rendelkező páciensben az rhEPO+rhIL-3 és/vagy rmKL kombinációval stimulált BFU-E kimutathatatlan volt. Négy esetben a mieloidtelepek sem voltak kimutathatók, s két esetben (akár rhIL-3, akár rhGM-CSF stimuláció ellenére is) mennyiségük jelentősen csökkent. Az rmKL vagy rhIL-3 beadása az utóbbi esetben növelte az átlagos gyakoriságot. Az rhIL-3+rmKL egy harmadik, DC-s páciensben, aki súlyosabb apláziával rendelkezett (sem az rhIL-3-mal vagy az rhGM-CSF-fel önmagában, sem az rmKL-lel együtt nem rendelkezett eritroid- vagy mieloidtelepekkel), mieloidtelepeket indukált, s a második páciens rhEPO és rhIL-3 hatására csökkent átlagos BFU-E-gyakorisággal (a normális kontroll 13%-a) rendelkezett. Az utóbbi páciensből származó BFU-E mérete, hemoglobinellátottsága és -mennyisége rmKL hozzáadásával nőtt. Az rhIL-3- vagy rhGM-CSF-stimulált
HU 219 540 Β mieloidtelepek némileg csökkentek, s a KL az átlagos telepgyakoriságban növekedést eredményezett.
A c-kit ligandum (KL), GM-CSF és tumornekrözis faktor-a kölcsönhatása a humán predendrit- és dendritsejtek fejlődésében
A dendritsejtek a primer antigénspecifikus T-sejtreakciók in vivő és in vitro indukálásának leghatásosabb antigénprezentáló sejtjei. Az in vitro képződött dendritsejtek az immunizáló emlékeztetés antigénadagja után a HÍV- és tumorok elleni vakcinakezelésben alkalmazhatók. Kifejlesztettünk egy in vitro rendszert humán dendritsejtek humán csontvelő, perifériás és köldökzsinóri vér CD34+ sejtjeiből történő előállítására. Ebben a GM-CSF és a TNFa jelenléte szükséges a dendritsejtek szuszpenziótenyészetben és klónozásos vizsgálatban való differenciálódásához, s a c-kit ligandum szinergikusan növeli a dendritsejtek/dendritsejttelepek számát. A 3/A. táblázat azt mutatja, hogy felnőtt humán csontvelői CD34+ sejtek esetében a klónozásos vizsgálatban a dendritsejttelepek fejlődéséhez a GM-CSF-fel és a TNFa-val együtt működve teljes mértékben szükség van a KL jelenlétére. A vérből származó CD34+ populációkban a GM-CSF+TNFa kombináció önmagában is indukált dendritsejttelep-képződést, de a telepképződés gyakorisága a KL hozzáadásával növekedett (3/B. táblázat). Több citokin összehasonlítása azt mutatja, hogy a dendritsejtek telepképzését a KL+GM-CSF+TNFa kombináció serkentette maximálisan (3/C. ábra). A szuszpenziótenyészet-rendszerekben az IL-l+KL+IL-3 kombináció a predendritsejtek mennyiségét 14 napon belül több mint 100-szorosára növelte, s GM-CSF+KL+TNF hozzáadásával ezek a sejtek olyan dendritsejtekké differenciálódtak, amelyek az allogénkevert leukocitareakcióval és a CD3 T-limfocita mitogenezissel összefüggésben képesek az antigénprezentálásra. A KL egyedülálló szaporítási serkentő hatást biztosít a predendrit- és dendritsejtek korai csontvelői őssejtekből/stemsejtekből való kialakulásához.
3/A. táblázat
A csontvelő CD34+ sejtjeinek dendritsejt-differenciálódása a klonális vizsgálatban
Stimulus Telepszám/105
Dendritsejt- telepek Mieloid- telepek
IL-3+KL+IL-3+EPO 0 2567+312
GM-CSF 0 0
GM-CSF+1,0 ng TNFa 0 83+17
GM-CSF+2,5 ng TNFa 0 100+15
GM-CSF+5,0 ng TNFa 0 50+0
GM-CSF+10,0 ng TNFa 0 50+0
GM-CSF+KL 0 83+17
GM-CSF+KL+1,0 ng TNFa 230+12 103+4
GM-CSF+KL+2,5 ng TNFa 312+10 155+6
Stimulus Telepszám/105
Dendritsejt- telepek Mieloid- telepek
GM-CSF+KL+5,0 ng TNFa 175+12 100+8
GM-CSF+KL+10,0ng TNFa 150+30 50+10
A CD34+ sejteket normál humán csontvelő egymagvú sejtfrakcióiból immunmágneses gyöngyök felhasználásával végzett elválasztással izoláltuk. Az IL-l-et, KL-t, IL-3-at és GM-CSF-et 10 ng/ml koncentrációban alkalmaztuk. A sejteket 2xl03 sejt/ml mennyiségben szélesztettük, s 14 nap múlva számoltuk a dendritsejttelepeket.
3/B. táblázat
A köldökzsinór CD34+ sejtjeinek dendritsejt-differenciálódása a klonális vizsgálatban
Stimulus Telepszám/105
Dendritsejt Mieloid/ eritroid
IL-1+KL+IL-3+EPO 0 4817+180
GM-CSF 0 0
GM-CSF+l,0ng TNFa 650+45 217+15
GM-CSF+2,5 ng TNFa 907+23 160+15
GM-CSF+5,0 ng TNFa 840+40 93+4
GM-CSF+10,0 ng TNFa 1067+44 0+0
GM-CSF+KL 0+0 683 +44
GM-CSF+KL +1,0 ng TNFa 1995+126 855+54
GM-CSF+KL+2,5 ng TNFa 2288+57 762+18
GM-CSF+KL+5,0 ng TNFa 2320+61 580+15
GM-CSF+KL+10,0ng TNFa 2597+117 570+26
A CD34+ sejteket immunmágneses gyöngyök felhasználásával végzett elválasztással izoláltuk, s 103 sejt/ml mennyiségben 0,36% agarózt és 20% magzati boíjúszérumot tartalmazó IMDM tápközegben 14 napig tenyésztettük. A dendritsejttelepeket morfológiájuk alapján a 14. napon azonosítottuk. Az rhKL-t, rhIL-3-at, rhGM-CSF-et 10 ng/ml koncentrációban alkalmaztuk.
3/C. táblázat
A köldökzsinór CD34+ sejtjeinek dendritsejt-differenciálódása a klonális vizsgálatban
Stimulus Telepszám/105
Dendritsejt Mieloid
IL-l+KL+IL-3 0 13 767+842
GM-CSF 0 1 233+240
G-CSF 0 1 100+327
IL-3 0 1 833+393
M-CSF 0 67+33
HU 219 540 Β
3/C. táblázat (folytatás)
Stimulus Telepszám/105
Dendritsejt Mieloid
PIXY (GM-CSF/IL3) 0 2500+208
GMCSF+KL 0 7233 ±120
G-CSF+KL 0 6500+666
M-CSF+KL 0 7400+680
PIXY+KL 608+103 2467+350
GM+KL+lOngTNFa 8214+162 7492+800
G+KL+lOng TNFa 1040+40 2053 ±40
IL-3+KL+10ngTNFa 985+182 2427±80
M-CSF+KL+10 ng TNFa 413+20 5582+1030
PIXY+KL+10ngTNFa 1047+64 4186+254
A CD34+ sejteket immunmágneses gyöngyök felhasználásával végzett elválasztással izoláltuk, s 103 sejt/ml mennyiségben tenyésztettük. Az rhKL-t, rhIL-3-at, rhGM-CSF-et, az rhG-CSF-et, az 5 rhM-CSF-et és az rhPIXY-t 10 ng/ml koncentrációban alkalmaztuk. A dendritsejteket a 14. napon morfológiájuk alapján azonosítottuk.
SZEKVENCIALISTA
TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: ismeretlen (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCCATATAAA TATAACCCCA TATAGTTATA G
TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 63 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav 25 (C) SZÁL: ismeretlen (D)ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCCATATAAC CCCCCCATAT AATAATTACA CCAATGCCCA AGCTTCGGTG CCTTTCCTTA TGT 60
TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 72 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav 35 (C) SZÁL: ismeretlen (D)ALAK: ismeretlen (iii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCCATATAAC CCCCCCATAT AATAATTACA CCAATAGTAT CTCTAGAATT TTACACCTCT TGAAATTCTC TT 60
TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 69bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav 45 (C) SZÁL : ismeretlen (D)ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCCATATAAC CCCCCCATAT AATAATTACA CCAATCATTT ATCTAGAAAA CATGAACTGT TACCAGCCT 60
TUDNIVALÓK A 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 60bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav 55 (C) SZÁL: ismeretlen (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCCATATAAC CCCCCCATAT AATAATTACA CCAATACCCT CGAGGCTGAA ATCTACTTGT 60
HU 219 540 Β
TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 116 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: ismeretlen CCCATATAAA TATAACCCCA TATAAAGCTT
GCAAATCTTC CAAATGACTA TATGATAACC
TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 54 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: ismeretlen (D)ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZÉK
VENCIA:
GATAATGTAA AAGACATTAC AAAACTGGTG 60
TCAATTCAGT GGCCGGAATG GGTCC
116 (D)ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZÉK
VENCIA:
CCCATATAAA TATAACCCCA TATACGCCAA GCTTGATAAT GTAAAAGATA TTAC 54
TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ 20 (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 52 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: ismeretlen (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZÁMÚ SZÉK
VENCIA:
CCCATATAAA TATAACCCCA TATATTAATA CAGCGGCCGT ACCCTAGGGG CC
TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 849 bázispár 30 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: ismeretlen (D) ALAK: ismeretlen (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. SZÁMÚ SZÉK
VENCIA:
CCCATATAAA
ATTATCACTT
ATCTGCGGGA
CCAAATGACT
TGTTGGCTAC
TTCTCAAATA
GTGGATGACC
AAGAGGCCAG
ATTGATGCCT
ACATTAGGTC
GTTGCAGCCA
CCTGAAGACT
ATTGGCTTTG
TATAACCCCA
GCATTTATCT
ATCCTGTGAC
ATATGATAAC
GACATATGGT
TTTCTGAAGG
TCGTGTTATG
AAACTAGATC
TTAAGGACTT
CCGAGAAAGA
GCTCCCTTAG
CGGGCCTACA
CTTTTGGAGC
TATAGCGGTG
TCAACTGCTC
TGATAATGTA
CCTCAACTAT
AATACAATTA
CTTGAGTAAT
CATGGAAGAA
CTTTACTCCT
TATGGTGGCA
TTCCAGAGTG
GAATGACAGC
ATGGACAGCC
CTTATACTGG
CCTTTCCTTA
CTATTTAATC
AAAGACATTA
GTCGCCGGGA
TCACTCAGCT
TACTCCATCA
AACGCACCGA
GAAGAATTCT
TCTGACACTA
AGTGTCACAA
AGTCGCAGTG
ATGGCATTGC
AAGAAGAAAC
TGAAGAAGAC
CTCTCGTCAA
CAAAACTGGT
TGGATGTTTT
TGACTACTCT
TAGACAAACT
AGAATATAAA
TTAGTATTTT
GTGACTGTGT
AACCATTTAT
ATAGGAAAGC
CGGCTCTCAT
AGTCAAGTCT
ACAAACTTGG
AACCAAGGAG
120
GGCAAATCCT
180
GCCTAGTCAT
240
TCTGGACAAG
300
TGGGAAAATA
360
AGAATCTCCG
420
CAATAGATCC
480
GCTGTCTTCA
540
GTTACCCCCT
600
CGCAAAGTCC
660
TTCGCTTGTA
720
TACAAGGGCA
780
HU 219 540 Β
GTTGAAAATA TACAGATTAA TGAAGAGGAT AATGAGATAA GTATGCTGCA ACAGAAAGAG 840
AGAGAATTT
849
TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (ii) MOLEKULATÍPUSA: DNS (genom) (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (ix) SAJÁTOS JELLEGZETESSÉGEK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1344 bázispár (A) NÉV/JEL: kódolószekvencia (CDS) (B) TÍPUS: nukleinsav (B) ELHELYEZKEDÉS: 106.. .925 (C) SZÁL: ismeretlen 10 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZÁMÚ SZÉK (D) ALAK: ismeretlen VENCIA:
GGGACTATCT GCAGCCGCTG CTGGTGCAAT ATGCTGGAGC TCCAGAACAG CTAAACGGAC 60
TCGCCACACC GCTGCCTGGG CTGGATCGCA GCGCTGCCTT TCCTT ATG AAG AAG 114
Me t Ly s Ly s 1
ACA CAA ACT TGG ATT ATC ACT TGC ATT TAT CTT CAA CTG CTC CTA TTT 162
Thr Gin Thr Trp Ile Ile Thr Cy s Ile Tyr Leu Gin Leu Leu Leu Phe
AAT 5 CCT CTT GTC AAA ACC 10 AAG GAG ATC TGC GGG 15 AAT CCT GTG ACT GAT 210
Asn Pro Leu Val Ly s Thr Ly s Glu Ile Cy s Gly Asn Pro Val Thr Asp
20 AAT GTA AAA GAC ATT 25 ACA AAA CTG GTG GCA 30 AAT CTT CCA AAT GAC 35 TAT 258
Asn Val Ly s Asp Ile Thr Ly s Leu Val Al a Asn Leu Pro Asn Asp Tyr
ATG ATA ACC CTC 40 AAC TAT GTC GCC GGG 45 ATG GAT GTT TTG CCT 50 AGT CAT 306
Me t Ile Thr Leu Asn Tyr Val Al a Gly Me t Asp Val Leu Pro Ser His
TGT TGG CTA 55 CGA GAT ATG GTA ATA 60 CAA TTA TCA CTC AGC 65 TTG ACT ACT 354
Cy s Trp Leu Arg Asp Me t Val Ile Gin Leu Ser Leu Ser Leu Thr Thr
CTT CTG 70 GAC AAG TTC TCA AAT 75 ATT TCT GAA GGC TTG 80 AGT AAT TAC TCC 402
Leu Leu As p Ly s Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser
ATC 85 ATA GAC AAA CTT GGG 90 AAA ATA GTG GAT GAC 95 CTC GTG TTA TGC ATG 450
11 e Ile Asp Ly s Leu Gly Ly s Ile Val Asp As p Leu Val Leu Cy s Me t
100 GAA GAA AAC GCA CCG 105 AAG AAT ATA AAA GAA 110 TCT CCG AAG AGG CCA 115 GAA 498
Glu Glu Asn Alá Pro Ly s Asn Ile Ly s Glu Ser Pro Ly s Arg Pro Glu
ACT AGA TCC TTT 120 ACT CCT GAA GAA TTC 125 TTT AGT ATT TTC AAT 130 AGA TCC 546
Thr Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Ser Ile Phe Asn Asg Ser
ATT GAT GCC 135 TTT AAG GAC TTT ATG 140 GTG GCA TCT GAC ACT 145 AGT GAC TGT 594
I le Asp Al a Phe Ly s As p Phe Me t Val Al a Ser As p Thr Ser Asp Cy s
CTG CTC 150 TCT TCA ACA TTA GGT 155 CCC GAG AAA GAT TCC 160 AGA GTC AGT GTC 642
Val Leu Ser Ser Thr Leu Gly Pro Glu Ly s As p Ser Arg Val Ser Val
ACA 165 AAA CCA TTT ATG TTA 170 CCC CCT GTT GCA GCC 175 AGC TCC CTT AGG AAT 690
Thr Ly s Pro Phe Me t Leu Pro Pro Val Al a Al a Ser Ser Le u Arg Asn
180 GAC AGC AGT AGC AGT 185 AAT AGG AAA GCC GCA 190 AAG GCC CCT GAA GAC 195 TCG 738
As p Ser Ser Ser Ser Asn Arg Ly s Alá Alá Ly s Al a Pro Glu Asp Ser
CGC CTA CAA TTG 200 ACA GCC ATG GCA TTG 205 CCG GCT CTC ATT TCG 210 CTT GTA 786
Gly Leu Gin Leu Thr Al a Me t Al a Leu Pro Al a Leu Ile Ser Leu Val
215 220 225
HU 219 540 Β
ATT GGC TTT GCT TTT GGA GCC TTA TAC TGG AAG AAG AAA CAG TCA AGT 834
I le Gly Phe Al a Phe Gly Al a Leu Tyr Trp Ly s Ly s Ly s Gin Ser Ser
230 235 240
CTT ACA AGG GCA GTT GAA AAT ATA CAG ATT AAT GAA GAG GAT AAT GAG 882
Leu Thr Arg Al a Val G1 u Asn I le Gin I le Asn Glu Glu Asp Asn Glu
245 250 255
ATA AGT ATG TTG CAA CAG AAA GAG AGA GAA TTT CAA GAG GTG T 925
I le Ser Me t Leu Gin Gin Ly s Glu Arg Glu Phe Gin Glu Va 1
260 265 270
AATTGTGGAC GTATCAACAT TGTTACCTTC GCACAGTGGC TGGTAACAGT TCATGTTTGC 985
TTCATAAATG AAGCAGCCTT AAACAAATTC CCATTCTGTC TCAAGTGACA GACCTCATCC 1045
TTACCTGTTC TTGCTACCCG TGACCTTGTG TGGATGATTC AGTTGTTGGA GCAGAGTGCT 1105
TCGCTGTGAA CCCTGCACTG AATTATCATC TGTAAAGAAA AATCTGCACG GAGCAGGACT 1165
CTGGAGGTTT TGCAAGTGAT GATAGGGACA AGAACATGTG TCCAGTCTAC TTGCACCGTT 1225
TGCATGGCTT GGGAAACGTC TGAGTGCTGA AAACCCACCC AGCTTTGTTC TTCAGTCACA 1285
ACCTGCAGCC TGTCGTTAAT TATGGTCTCT GCAAGTAGAT TTCAGCCTGG ATGGTGGGG 1344
TUDNIVALÓK A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ 25 (D)ALAK: lineáris (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (ii) MOLEKULATÍPUSA: protein (A) HOSSZÚSÁG: 273 bázispár (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. SZÁMÚ SZÉK (B) TÍPUS: aminosav VENCIA:
Me t 1 Ly s Ly s Thr Gin 5 Thr Trp I le I le Thr 10 Cy s I le Tyr Leu Gin 15 Leu
Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Ly s Thr Ly s G1 u I le Cy s G1 y Asn Pro
20 25 30
Val Thr Asp Asn Val Ly s Asp I le Thr Ly s Leu Val Al a Asn Leu Pro
35 40 45
Asn As p Tyr Me t I le Thr Leu Asn Tyr Val Al a Gly Me t As p Val Leu
50 55 60
Pro Ser Hi s Cy s Trp Leu Arg Asp Me t Val I le Gin Leu Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Thr Thr Leu Leu As p Ly s Phe Ser Asn I le Ser Glu Gly Leu Ser
85 90 95
Asn Tyr Ser I le I le Asp Ly s Leu Gly Ly s I le Val Asp As p Leu Val
100 105 110
Leu Cy s Me t Glu Glu Asn Al a Pro Ly s Asn I le Ly s Glu Ser Pro Ly s
115 120 125
Arg Pro Glu Thr Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Ser I le Phe
130 135 140
Asn Asg Ser I le As p Alá Phe Ly s Asp Phe Me t Val Al a Se r Asp Thr
145 150 155 160
Ser As p Cy s Val Leu Ser Ser Thr Leu Gly Pro Glu Ly s As p Ser Arg
165 170 175
Val Ser Val Thr Ly s Pro Phe Me t Leu Pro Pro Val Alá Al a Ser Ser
180 185 190
Leu Arg Asn Asp Ser Se r Ser Ser Asn Arg Ly s Al a Al a Ly s Al a Pro
195 200 205
Glu As p Ser Gly Leu Gin Leu Thr Al a Me t Al a Leu Pro Al a Leu I le
210 215 220
Ser Leu Val I le G1 y Phe Al a Phe Gly Al a Le u Tyr Trp Ly s Ly s Ly s
225 230 235 240
HU 219 540 Β
Gin Ser Ser Leu Thr Arg Alá Va 1 245
Asp Asn Glu I le Ser Met Leu Gin 260
Val
Irodalomjegyzék
1. Aaronson, S. A. and Todaro, G. (1968) J. Cell Physiol., 72, 141-148.
2. Anderson, D. M., Lyman, S. D., Baird, A., Wignall, J. M., Eisenman, I, Rauch, C., March, C. J., Boswell, H. S., Gimpel, S. D., Cosman, D. and Williams, D. E. (1990) Cell 63., 235-243.
3. Andre, C., d’Auriol, L., Lacombe, C., Gisselbrecht, S. and Galibert, F. (1989) Oncogene 4, 1047-1049.
4. Bazan, F. (1991) Cell 65, 9-10.
5. Bennett, D. (1956) J. Morphol. 98, 199-234.
6. Bemstein, S. E. (1960) 23, 33-34.
7. Besmer, P., Murphy, P. C., George, P. C., Qiu, F., Bergold, P. I, Lederman, L., Snyder, H. W., Brodeur, D., Zuckerman, E. E. and Hardy, W. D. (1986) Natúré 320, 415-421.
8. Bradley, R. S. and Brown, A. M. C. (1990) EMBOJ. 9, 1569-1575.
9. Chabot, B., Stephenson, D. A., Chapman, V. M., Besmer P. and Bemstein, A. (1988) Natúré 335, 88-89.
10. Chirgwin, J. M., Przbyla, A. E., MacDonald, J. R. and Rutter, W. J. (1979) Biochemistry. 18, 5294-5299.
11. Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Cho, B. C., Donovan, P. J., Jenkins, N. A., Cosman, D., Anderson, D., Lyman, S. D. and Williams, D. E. (1990) Cell 63, 175-183.
12. Dexter, T. M. and Moore, M. A. S. (1977) Natúré 269, 412-414.
13. Downing, J. R., Roussel, M. F. and Sherr, C. J. (1989) Mól. Cell. Bioi. 9, 2890.
14. Flanagan, J. G. and Leder, P. (1990). Cell 63, 185-194.
15. Flanagan, J. G., Chan, D. and Leder, P. (1991) Cell 64, 1125-1135.
16. Fujita, J., Onoue, H., Ebi, Y., Nakayama, H., Kanakura, Y. and Kitamura, Y. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2888-2891.
17. Geissler, E. N., Ryan, M. A. and Housman, D. E. (1988) Cell 55, 185-192.
18. Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182.
19. Gordon, Μ. Y. (1991) Cancer Cells 3, 127-133.
20. Kriegler, M. (1990) Gene transfer and expression: A laboratory manual. (New York; Stockton Press).
21. Ladner, Μ. B., Martin, G. A., Noble, J. A., Nikoloff, D. M., Tál, R., Kawasaki, E. S. and White, T. J. (1987) EMBO J. 6, 2693-2698.
22. Lee D. C., Rose, T. M., Webb, N. R. and Todaro,
G. J. (1985) Natúré 313, 489-491.
23. Majumder, S., Brown, K., Qiu, F.-H. and Besmer, P. (1988) Mól. Cell. Bioi. 8, 4896-4903.
u Asn I le Gin I le Asn Glu Glu 250 255 n Lys Glu Arg Glu Phe Gin Glu 5 270
24. Manova, K., Nocka, K., Besmer P. and Bachvarova, R. F. (1990) Development 110, 1057-1069.
25. Manova, K., Bachvarova, R. F. (1991) Devel. Bioi. in press.
26. Massague, J. (1991) J. Bioi. Chem. 265, 21393-21396.
27. Martin, F. H., Suggs, S. V., Langley, K. E., Lu,
H. S., Ting, J., Okino, K. H., Morris, C. F., McNiece, I. K., Jacobsen, F. W., Mendiaz, E. A., Birkett, N. C., Smith, K. A., Johnson, M. J., Parker, V. P., Flores, J. C., Patel, A. C,, Fisher, E. F., Erjavec, H. O., Herrera, C. J., Wypych, J., Sachdev, R. K., Popé, J. A., Leslie, I., Wen, D., Lin,
C. H., Cupples, R. L. and Zsebo, K. M. (1990) Cell 63, 203-211.
28. Mayer, T. C. and Green, M. C. (1968) Dev. Bioi. 18, 62-75.
29. McCoshen, J. A. and McCallion, D. J. (1975) Experientia 31, 589-590.
30. McCulloch, E. A., Siminovitch, L., Till, J. E., Russel, E. S., and Bemstein, S. E. (1965) Blood 26, 399-410.
31. McCulloch, E. A. (1970) In Reguládon of hematopoiesis, A. S. Gordon, ed. (New York: Appleton), pp. 649-675.
32. Mintz, B. and Russell, E. S. (1957) J. Exp. Zool. 134, 207-237.
33. Morrison-Graham, K. and Weston, J. A. (1989) Trends Génét. 5, 116-121.
34. Naughton, M. A. and Sanger, F. (1961) Biochem.
J. 78, 156-162.
35. Nocka, K., Majumder, S., Chabot, B., Ray, P., Cervone, K., Bemstein, A. and Besmer, P. (1989) Genes & Dev. 3, 816-826.
36. Nocka, K., Tan, J., Chiu, E., Chu, T. Y., Ray P., Traktman, P. and Besmer, P. (1990a) EMBO J. 9, 1805-1813.
37. Nocka, K., Buck, J., Levi, E. and Besmer, P. (1990b) EMBO J. 9, 3287-3294.
38. Nocka, K., Huang, E., Beier, D. R., Chu, T. Y., Buck, J., Lahm, H. W., Wellner, D., Leder, P. and Besmer, P. (1990). Cell 63, 225-233.
39. Orr-Urtreger, A., Avivi, A., Zimmer, Y., Givol,
D. , Yardén Y. and Lonai, P. (1990) Development 709,911-923.
40. Pandialla, A. and Massague, J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1726-1730.
41. Qiu, F., Ray, P., Brown, K., Barker, P. E., Jhanwar, S., Ruddle, R. H. and Besmer, P. (1988) EMBOJ. 2, 1003-1011.
42. Rathjen, P. D., Tóth, S., Willis, A., Heath, J. K. and Smith, A. G. (1990) Cell 62., 1005-1114.
43. Rettenmier, C. W. (1989) Curr. Top. Micro. Immun. 149, 129-141.
HU 219 540 Β
44. Rettenmier, C. W. and Roussel, M. F. (1988) Mól. Cell. Bioi. 8, 5026-5034.
45. Rettenmier, C. W. Roussel, M. F. Ashmun, R. A., Ralph, P., Price, K. and Sherr, C. J. (1987) Mól. Cell. Bioi. 7, 2378-2387.
46. Russel, E. S. (1970) Abnormalities of erythropoiesis associated with mutant genes in mice. In Reguládon of hematopoiesis, A. S. Gordon, ed. (New York: Appleton), pp. 649-675.
47. Russel, E. S. (1979) Adv. Gén 20, 357-459.
48. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.
49. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977) Pfoc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
50. Sarvella, P. A. and Russel, L. B. (1956) J. Hered. 47, 123-128.
51. Silver, W. K. (1979) White-spotting, patch and rump-white. In the Coat Colors of Mice: A módéi fór Gene Action and Interaction (New York: Springer-Verlag), pp. 206-241.
52. Stevens, L. C. (1979) Inbred Strains of mice. 11, 39.
53. Tan, J. C. Nocka, K., Ray, P., Traktman, P. and Besmer, P. (1990) Science 247, 209-212.
54. Todaro, G. J. and Green, H. (1963) J. Cell Bioi. 17, 299-313.
55. Tushiniski, R. J., Olivér, I. T., Guilbert, L. J., Tynan, P. W., Warner, J. R. and Stanley, E. R. (1982) Cell 28, 71-81.
56. Williams, D. E., Eisenman, J., Baird, A., Rauch,
C. , Ness, K. V., March, C. J., Park, L. S., Martin, U., Mochizuki, D. Y., Bosell, H. S., Burgess, G.
S., Cosman, D. and Stewart, D. L. (1990) Cell 63, 167-174.
57. Yardén, Y., Kuang, W. J., Yang-Feng, T., Coussens, L., Munemitsu, S., Dűli, T. J., Chen, E., Schlessinger, J., Francke, U. and Ullrich, A. (1987) EMBO J. 6, 3341-3351.
58. Zsebo, K. M., Wypych, J., McNece, I. K., Lu, H.
S., Smith, K. A., Karkare, S. B., Sachdev, R. K., Yuschenkoff, V. N., Birkett, N. C., Williams, L. R., Satyagal, V. N., Tung, W., Bosselman, R. A., Mendiaz, E. A. and Langley, K. E. (1990a) Cell 61, 195-201.
59. Zsebo, K. M., Williams, D. A., Geissler, E. N., Broudy, V. C., Martin, F. H., Atkins, H. L., Hsu, R. Y., Birkett, N. C., Okino, K. H., Murdock,
D. C., Jacobsen, F. W., Langley, K. E., Smith,
K. A., Takeishi, T., Cattanach, Β. M., Galli, S. J. and Suggs, S. V. (1990B) Cell 63, 213-214.
60. Yung, Y. P. and Moore, M. A. S. (1982) J. Immunoi. 129, 1256-1261.
61. Yurt, R. W., Leid, R. W., Austen, K. F. and Silbert, J. E. (1977) J. Bioi. Chem. 252, 518-521.
62. Enerback, L. (1974) Histochem. 42, 301-313.
63. Dexter, T. M. and Moore, M. A. S. (1977). Natúré 269, 412-414.
64. Little, C. C. and Cloudman, A. M. (1937) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 23, 535-537.
65. Geissler, E. N., McFarland, E. C. and Russell,
E. S. (1981) Genetics 97, 337-361.
66. Stevens, R. L., Lee, T. D., Seldin, D. C., Austen, K. F, Befus, A. D. and Bienenstock, J. (1986) J. Immunoi. 147, 291-295.
67. Levi-Schaffer, F., Austen, K. F., Caulfield, J. P., Kein, A., Bloes, W. F. and Stevens, R. L. (1985)
J. Immunoi. 135, 3454-3462.
68. Gregory, C. J. and Eaves, A. C. (1978) Blood 51, 527-537.
69. Iscove, N. N. (1978b). In Aplastic Anémia, S. Hibino, S. Takaku and N. T. Shahidi, eds. (Tokyo: University of Tokyo Press), pp. 31-36.
70. Das, S. K. and Stanley, E. R. (198) J. Bioi. Chem. 257, 13679.
71. Gough, N. M. and Williams, L. R. (1989) Cancer Cells 1, 77-80.
72. Kitamura, Y., Go, S., and Hatnaka, K. (1978). Blood 52, 447-452.
73. Kitamura, Y., and Fujita, J. (1989). Blood 53, 492 -497.
74. Nakahata, T., Koboyashi, T., Ishiguro, A., Tsuji,
K. , Naganuma, K., Ando, O., Yagi, Y., Tadokoro, K. and Akabane, T. (1986) Natúré 324, 65-67.
75. Tsuji, K., Natahata, T., Takagi, M., Kobayashi, T., Ishiguro, A., Kikuchi, T., Naganuma, K., Koiki, K., Miyajima, A., Arai, K., Akabane, T. (1990a) J. Immunoi. 144, 678-684.
76. Tsuji, K., Nakahata, T,, Takagi, M., Kobayashi, T., Ishiguro, A., Kikuchi, T., Naganuma, K., Kőiké, K., Miyajima, A., Arai, K., Akabane, T., (1990b) Blood 75, 421-427.
77. Takagi M., Nakahata, T., Kőiké, K., Koboyashi, T., Tsuji, K., Kojima, S., Hirano, T., Miyajima, A., Arai, K. and Akabane, T. (1989) J. Exp Med 170, 233-244.
78. Iscove, N. N. (1978a). In Hematopoietic cell differentiation, D. W. Golde, M. J. Cline, D. Metcalf and F. C. Fox, eds. (New York: Academic Press), pp. 37-52.
79. Hamaguchi, Y., Kanakura, Y., Fujita, J., Takeda,
S., Nakano, T., Tarui, S., Honjo, T., Kitamura, Y. (1987) J. Exp. Med. 165, 268.
80. Russell, E. S. (1970) In Regulation of hematopoiesis, A. S. Gordon, Ed. (New York: Appleton), pp. 649-675.
81. McCulloch, E. A., Siminovitch, L., Till, J. E., Russell, E. S., and Bemstein, S. E. (1985). Blood 26, 399-410.
82. Hamson, D. E. (1980) Blood 55, 77-81.
83. Barker, J. E., and McFarland, E. C. (1988). J. Cell, Physiol. 135, 533-538.
84. Jarobe, D. L., Marshall, J. S., Randolph, T. R., Kukolja, A. and Huff, T. F. (1989) J. Immunoi. 142, 2405-2417.
85. Schmidt, E. V., Patemgale, P. K., Weir, L. and Leder, P. (1988). Proc. Natl, Acad. Sci. USA 85, 6047-6051.
86. Lehrach, H., Diamond, D., Wozney, J. M., and Boedite, H. (1977). RNA molecular weight de41
HU 219 540 Β terminations by gél electrophoresis under denaturing conditions-a critical reexamination. Biochemistry 16, 4743.
87. Feinberg, A. P., and Vogeistein, B. (1963). Anal. Biochem. 122, 6-13.
88. Stanley, E. R., and Guilbert, L. J. (1961). J. Imnunol. Meth. 42, 263-264.
89. Scherr, C. J., Rettenmier, C. W., Sacca, R., Roussel, M. F., Look, A. T. and Stanley, E. R. (1965). Cell 41, 666-676.
90. Chui, D. K., Liato, S. K„ and Walker, K. (1978). Blood 51, 539-547.
91. Avner, P., Amar. L., Dandolo, L., and Guenet, J. L. (1968). Trends Gene, 4, 18-23.
92. Yung, et al. (1981) J. Immunoi. 127, 794-799,
93. Stevens, R. L. and Austen, K. F. (1989), Immunoi. Today 10, 381-386.
94. Schrader, J. W. (1981) J. Immunoi. 126, 452-460.
95. Smith, C. A. and Rennick, D. M. (1986) P.N.A.S. USA 83, 1857-1861.
96. Brown, M. A. et al. (1987) Cell 50, 809-818.
97. Plaut, M. et al. (1989) Natúré 339, 64-67.
98. Levi-Schaffer, F. et al. (1986) P.N.A.S. USA 83, 6485-6488.
99. Fujita, J. et al. (1988) J. Cell. Physiol. 734,78-84.
100. Tan, J. C. et al. (1990) Science 247, 209-212.
101. Reith et al. (1990) Genes Dev. 4, 390-400.
102. Schwartz, L. B. &Huff, T. F. „Mást Cells” in The Lung (ed. Crystal, R. G. et al.) 1991 p. 601-616.
103. Moore, M. A. S. (1991) Blood 78, 1-19 and references therein.
104. Muench, Μ. O. et al. (1992) Exp. Hematology 20, 339-349.
105. Lemer C. and Hamison D. E. (1990) 5-Fluorouracil spares hematopoietic stem cells responsible fór long-term repopulation. Exp. Hematol 18:114.

Claims (21)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy ckit ligandumot, TNFa-t és egy hematopoietikus faktort tartalmaznak az őssejtek szaporításához és dendritsejtekké történő differenciálódásához elegendő mennyiségben.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus faktorként GM-CSF-et tartalmaznak.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus faktorként G-CSF-et tartalmaznak.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus faktorként M-CSF-et tartalmaznak.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus faktorként IL-3-at tartalmaznak.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus faktorként PIXY-t tartalmaznak.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények, azzal jellemezve, hogy hematopoietikus faktorként IL- 1-t tartalmaznak.
  8. 8. Eljárás őssejtek dendritsejtekké történő ex vivő expandáltatására és differenciálására, azzal jellemezve, hogy az őssejteket olyan készítménnyel kezeljük, amely c-kit ligandumot, TNFa-t és egy hematopoietikus faktort tartalmaz az őssejtek szaporításához és dendritsejtekké történő differenciálódásához elegendő mennyiségben.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként GM-CSF-et tartalmaz.
  10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként G-CSF-et tartalmaz.
  11. 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként M-CSF-et tartalmaz.
  12. 12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként IL-3-at tartalmaz.
  13. 13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként PIXY-t tartalmaz.
  14. 14. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként IL-l-et tartalmaz.
  15. 15. Eljárás perifériás vérsejtek ex vivő expandáltatására, azzal jellemezve, hogy a perifériás vérsejteket olyan készítménnyel kezeljük, amely c-kit ligandumot, TNFa-t és egy hematopoietikus faktort tartalmaz az őssejtek szaporításához és dendritsejtekké történő differenciálódásához elegendő mennyiségben.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként GM-CSF-et tartalmaz.
  17. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként G-CSF-et tartalmaz.
  18. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként M-CSF-et tartalmaz.
  19. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként IL-3-at tartalmaz.
  20. 20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként PIXY-t tartalmaz.
  21. 21. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan készítményt alkalmazunk, amely hematopoietikus faktorként IL-l-et tartalmaz.
HU9403054A 1992-04-23 1993-04-16 C-KIT receptor-ligandum és eljárás alkalmazására HU219540B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87396292A 1992-04-23 1992-04-23
PCT/US1993/003640 WO1993021936A1 (en) 1992-04-23 1993-04-16 LIGAND FOR THE c-KIT RECEPTOR AND METHODS OF USE THEREOF

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9403054D0 HU9403054D0 (en) 1995-02-28
HUT70696A HUT70696A (en) 1995-10-30
HU219540B true HU219540B (hu) 2001-05-28

Family

ID=25362700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9403054A HU219540B (hu) 1992-04-23 1993-04-16 C-KIT receptor-ligandum és eljárás alkalmazására

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6159461A (hu)
EP (2) EP0639979B1 (hu)
JP (1) JP3750819B2 (hu)
KR (1) KR100313064B1 (hu)
AT (1) ATE206309T1 (hu)
AU (1) AU675429B2 (hu)
CA (1) CA2133982C (hu)
DE (1) DE69330878T2 (hu)
DK (1) DK0639979T3 (hu)
ES (1) ES2168273T3 (hu)
HK (1) HK1041205A1 (hu)
HU (1) HU219540B (hu)
PT (1) PT639979E (hu)
RU (1) RU2180850C2 (hu)
WO (1) WO1993021936A1 (hu)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7144731B2 (en) 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
US6852313B1 (en) 1989-10-16 2005-02-08 Amgen Inc. Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor
US20050276784A1 (en) * 1990-08-27 2005-12-15 Solan-Kettering Institute For Cancer Research Ligand for the c-kit receptor and methods of use thereof
US5525708A (en) * 1994-03-28 1996-06-11 Cytomed, Inc. Covalent dimer of kit ligand
DE4412794A1 (de) * 1994-04-14 1995-12-14 Univ Ludwigs Albert Verfahren zur Herstellung von dendritischen Zellen, so erhaltene Zellen und Behälter zur Durchführung dieses Verfahrens
PT793714E (pt) * 1994-11-16 2002-12-31 Amgen Inc Utilizacao do factor de celulas estaminais e do receptor de interleucina 6 soluvel para a expansao ex vivo de celulas hematopoieticas multipotentes
CA2301979A1 (en) * 1997-09-10 1999-03-18 Uab Research Foundation Regulation of osteoclast formation by inhibition of osteoblastic stem cell factor
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
WO2002066069A1 (fr) * 2001-02-20 2002-08-29 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Remedes contre l'inflammation/les maladies tumorales
EP1390076A4 (en) * 2001-04-27 2004-12-15 Xcyte Therapies Inc Maturation of antigen-presenting cells with activated cells
US7628988B2 (en) 2002-06-27 2009-12-08 The General Hospital Corporation Methods and compositions for treating type 1 diabetes
US7582313B2 (en) * 2002-06-27 2009-09-01 The General Hospital Corporation Methods of organ regeneration using Hox 11-expressing pluripotent cells
WO2004072264A2 (en) * 2003-02-12 2004-08-26 Johns Hopkins University School Of Medicine Fate determination by hes 1 in hematopoietic stem-progenitor cells and uses thereof
US20080102054A1 (en) * 2005-01-18 2008-05-01 Faustman Denise L Compositions Containing Agm Cells And Methods Of Use Thereof
EP1722275B1 (en) 2005-05-10 2010-10-27 Agfa Graphics N.V. Method for processing lithographic printing plates
EP3936137A1 (en) 2013-02-07 2022-01-12 The General Hospital Corporation Methods for expansion or depletion of t-regulatory cells
RU2563235C1 (ru) * 2014-07-29 2015-09-20 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ увеличения пула стволовых клеток в организме
HRP20231392T1 (hr) 2015-05-15 2024-04-26 The General Hospital Corporation Antagonistička protutijela na superobitelj receptora za faktor tumorske nekroze
EP3355914B1 (en) 2015-09-29 2024-03-06 The General Hospital Corporation A composition comprising bcg for reducing cholesterol.
CN116715767A (zh) 2016-05-13 2023-09-08 综合医院公司 拮抗性抗肿瘤坏死因子受体超家族抗体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991014757A1 (fr) * 1990-03-28 1991-10-03 Nisshin Steel Co., Ltd. Lubrifiant pour laminage a chaud d'acier inoxydable
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
ATE194651T1 (de) * 1989-10-16 2000-07-15 Amgen Inc Stammzellenfaktor
WO1992000376A1 (en) * 1990-06-25 1992-01-09 Immunex Corporation Mast cell growth factor
US20030125519A1 (en) * 1990-08-27 2003-07-03 Peter Besmer Ligand for the c-kit receptor and methods of use thereof
US5767074A (en) * 1990-08-27 1998-06-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Compositions of soluble C-kit ligand and hematopoietic factors
WO1992006220A1 (en) * 1990-10-05 1992-04-16 President And Fellows Of Harvard College Detection and isolation of ligands
CA2107897A1 (en) * 1991-04-09 1992-10-10 Ronald Hoffman System and process for supporting hematopoietic cells
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US6001803A (en) * 1992-04-23 1999-12-14 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Composition of c-kit ligand, GM-CSF, and TNF-α and method of use

Also Published As

Publication number Publication date
KR100313064B1 (ko) 2002-04-06
HK1041205A1 (zh) 2002-07-05
KR950701226A (ko) 1995-03-23
EP0639979A4 (en) 1996-10-23
HU9403054D0 (en) 1995-02-28
CA2133982A1 (en) 1993-11-11
JP3750819B2 (ja) 2006-03-01
DE69330878T2 (de) 2002-05-29
EP1127577A3 (en) 2002-11-27
EP0639979B1 (en) 2001-10-04
DK0639979T3 (da) 2002-12-02
CA2133982C (en) 2008-02-12
EP0639979A1 (en) 1995-03-01
EP1127577A2 (en) 2001-08-29
ES2168273T3 (es) 2002-06-16
DE69330878D1 (de) 2001-11-08
HUT70696A (en) 1995-10-30
AU675429B2 (en) 1997-02-06
AU4106593A (en) 1993-11-29
RU2180850C2 (ru) 2002-03-27
PT639979E (pt) 2002-03-28
WO1993021936A1 (en) 1993-11-11
JPH07508721A (ja) 1995-09-28
RU94046426A (ru) 1997-01-10
US6159461A (en) 2000-12-12
ATE206309T1 (de) 2001-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6403559B1 (en) C-kit ligand-based method for expanding peripheral blood cell levels
Williams et al. Identification of a ligand for the c-kit proto-oncogene
HU219540B (hu) C-KIT receptor-ligandum és eljárás alkalmazására
Nocka et al. Candidate ligand for the c‐kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors.
JP4524340B2 (ja) 血管内皮増殖因子ｃ（ｖｅｇｆ−ｃ）タンパク質およびその遺伝子、変異体、ならびにその使用
DE69932510T2 (de) Vaskularisierungsinhibitoren
US5767074A (en) Compositions of soluble C-kit ligand and hematopoietic factors
IE912135A1 (en) Mast cell growth factor
Williams et al. Characterization of the gene-product of the Steel locus
JP2853905B2 (ja) 未結合ｍｐｌ受容体を用いた血小板産生を刺激するための組成物
US20080152652A1 (en) Ligand for the c-kit receptor and methods of use thereof
EP1466619A2 (en) Method for modulating cell apoptosis
US6001803A (en) Composition of c-kit ligand, GM-CSF, and TNF-α and method of use
Galli et al. The biology of stem cell factor, a new hematopietic growth factor involved in stem cell regulation
US6518043B1 (en) Proteins suppressing proliferation of lympho-hematopoietic cells
EP0850319B1 (en) Method for modulating cell apoptosis
KR100367213B1 (ko) 사람에서 분리한 С6 β-케모카인Ｌｋｎ-1(Ｌｅｕｋｏｔａｃｔｉｎ-1)을 암호화하는ｃＤＮＡ
Ryan Stem cell factor in mast cell and Schwann cell proliferation and hyperplasia
Chandra Molecular and functional characterization of a novel mutation in murine stem cell factor

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees