HU217107B - Sejtek adhézióját módosító oligonukleotidok, és eljárás ezek, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Sejtek adhézióját módosító oligonukleotidok, és eljárás ezek, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217107B
HU217107B HU9300373A HU37393A HU217107B HU 217107 B HU217107 B HU 217107B HU 9300373 A HU9300373 A HU 9300373A HU 37393 A HU37393 A HU 37393A HU 217107 B HU217107 B HU 217107B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
analog
sequence
specifically hybridizes
nucleic acid
Prior art date
Application number
HU9300373A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9300373D0 (en
HUT68322A (en
Inventor
Clarence Frank Bennett
Christopher K. Mirabelli
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc. filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc.
Publication of HU9300373D0 publication Critical patent/HU9300373D0/hu
Publication of HUT68322A publication Critical patent/HUT68322A/hu
Publication of HU217107B publication Critical patent/HU217107B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3531—Hydrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Abstract

Vegyületeket ismertetnek őlyan betegségek kezelésére, amelyek asejtadhéziós mőlekűlák szintézisének vagy metabőlizműsánakmódősításával gyógyíthatók. Ezek a vegyületek őligőnűkleőtidők vagyőligőnűkleőtid-analógők, amelyek egy előnyös kiviteli alakban azintercellűláris adhéziós mőlekűla-1-et, a vaszkűláris sejtadhéziósmőlekűla-1-et vagy endőteliális leűkőcita adhéziós mőlekűla-1- etkódőló nűkleinsavakkal (DNS-sel vagy RNS-sel) hibridizálódnakspecifikűsan. Egy előnyös kiviteli alak szerint az őligőnűkleőtidők ésőligőnűkleőtid-analógők egy transzkripciós iniciációs hellyel, egytranszlációs iniciációs hellyel, egy 5’-transzlatálatlanszekvenciával, egy 3’-transzlatálatlan szekvenciával vagy egyközbeékelődő szekvenciával hibridizálódnak specifikűsan. Ismertetik afenti vegyületek, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítményekelőállítását is. ŕ

Description

A találmány oligonukleotidokra vagy oligonukleotidanalógokra vonatkozik, amelyek diagnosztikai célokra kísérleti reagensként, és a sejtadhéziós molekulák szintézisének módosításával vagy metabolizmusával összefüggő kóros állapotok gyógyítására alkalmasak. Közelebbről a találmány a fehérvérsejtek egymással és egyéb sejtekkel való adhézióját szabályozó proteinek szintézisében részt vevő messenger ribonukleinsavakkal (mRNS-sekkel) és DNS-ekkel hibridizálódni képes antiszensz oligonukleotidokra vonatkozik. Olyan antiszensz oligonukleotidokat terveztünk, amelyek az intercelluláris adhéziós molekula-1-gyei (ICAM-1), az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1-gyei (ELAM-1) és a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-l-gyel (VAMC-1) hibridizálnak. Ezek az oligonukleotidok az RNS vagy DNS aktivitásának módosításához vezetnek, ezáltal módosítják a specifikus sejtadhéziós molekulák szintézisét és metabolizmusát. Fentiek következtében tüneti gyógyító hatást és gyógyászati hatást fejtenek ki. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a fenti oligonukleotidok vagy oligonukleotid-analógok, valamint az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.
A gyulladás egy lokalizált védekező válasz, amelyet a szövetek sérülésre, fertőzésre vagy a szövet bomlására válaszul fejtenek ki, és a fertőző vagy károsító ágens megsemmisítését, és a sérült szövet izolációját eredményezi. A tipikus gyulladásválasz az alábbiak szerint játszódik le: idegen antigén felismerése vagy szövetsérülés felismerése, oldható gyulladásmediátorok szintézise és felszabadítása, gyulladásos sejtek koncentrálása a fertőzés vagy szövetsérülés helyére, a fertőző organizmus vagy sérült szövet megsemmisítése és eltávolítása, a fertőző organizmus vagy sérülés elbontása után a rendszer dezaktiválása. A gyulladással járó emberi betegségekben a gyulladásra adott válaszokat gyengítő normális hemosztatikus mechanizmusok fogyatékosak, és ez a normális szövetek károsítását vagy megsemmisítését eredményezi.
A fent ismertetett folyamat minden lépésében sejt-sejt kölcsönhatások vesznek részt az immunválasz aktiválásában. A normális gyulladásos válasz esetén az egyik leghamarabb detektálható esemény a leukociták tapadása (adhéziója) a véredények belhámjához, majd a leukociták vándorlása az érrendszerből a fertőzés vagy sérülés helyére. A fenti leukociták vagy fehérvérsejtek adhéziója a véredények belhámjához szükségszerű lépés az érrendszerből való kijutáshoz [Harlan J. M., Blood 65, 513-525 (1985)]. Általában az első gyulladásos sejtek, amelyek a gyulladás helyén megjelennek a neutrofilek, amelyeket a monociták, majd a limfociták követnek. A sejt-sejt kölcsönhatások szintén kritikusak mind a B-limfociták, mind a T-limfociták szaporodásához, amelyek fokozott humorális, illetve celluláris immunválaszokat eredményeznek.
A fehérvérsejtek tapadását a véredények belhámjához vagy egyéb sejtekhez specifikus proteinek közötti kölcsönhatások mediálják. A fenti specifikus proteineket adhéziós molekuláknak nevezik, és ezek mind a fehérvérsejtek, mind a véredények belhámsejtjei plazmamembránján lokalizálódnak. Az adhéziós molekulák közötti kölcsönhatások a klasszikus receptor-ligandum kölcsönhatásokhoz hasonlóak, azzal az eltéréssel, hogy a ligandum egy sejt felületén rögzítve van, ahelyett hogy oldható lenne. A leukocitaadhézió genetikus fogyatékosságában szenvedő betegek felismerése lehetővé tette a kutatók számára a proteinek azon családjának azonosítását, amely a fehérvérsejtek tapadásáért felelős. A fogyatékos leukocitaadhézió (LAD) ritka autoszomális betegség, amelyre jellemző a bakteriális fertőzések kiújulása és a kisebb mértékű gennyképződés és sebgyógyulás. A fogyatékosság a normális esetben a fehérvérsejtek külső sejtmembránján expresszálódott három heterodimer glikoprotein, a Mac-1, az LFA-1 és a pl50,95 közös B-egységében jelentkezik [Anderson és Springer, Ann. Rév. Med. 38, 175-194 (1987)]. Az LAD-ben szenvedő betegek a granulociták, monociták és limfociták adhéziótól függő funkcióinak széles spektrumában fogyatékosságot mutatnak. Az LFA-1 két ligandumját azonosították már, úgymint az intercelluláris adhéziós molekula-1-gyet és -2-t (ICAM-1 és ICAM-2). Mind a Mac-1, mind a pl50,95 kötődik a C3bi komplementer fragmenshez, és valószínűleg egyéb, még ismeretlen ligandumokhoz is.
További adhéziós molekulákat is azonosítottak, amelyek a fehérvérsejtek véredények belhámjához való adhéziójában és ezt követően az érrendszerből való kivándorlásában játszanak szerepet. Ezek közé tartozik az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 (ELAM-1), a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM-1) és a granula membránprotein-140 (GMP-140), illetve ezek receptorai. A fehérvérsejtek véredények belhámjához való tapadását valószínűleg legalább részben, de lehet hogy teljes egészében öt sejtadhéziós molekula, az ICAM-1, ICAM-2, ELAM-1, VCAM-1 és GMP-140 mediálja [Dustin és Springer, J. Cell Bioi. 107, 321-331 (1987)]. Az ICÁM-1, ELAM-1, VCAM-1 és GMP-140 adhéziós molekulák expresszióját a sejt felületén gyulladásos stimulusok indukálják. Ezzel szemben az ICAM-2 expressziója lényeginek és a citokinek általi indukcióra nem érzékenynek tűnik. Általában a GMP-140-et autocoidok - például hisztamin, leukotrién B4, vérlemezke aktiváló faktor és trombin - indukálják. A maximális expresszió a belhámsejteken a stimulálás után 30 perc-1 óra elteltével észlelhető, és 2-3 óra múlva visszaáll az alapértékre. Az ELAM-1 és VCAM-1 expresszióját a belhámsejteken citokinek - például interleukin-ΐβ és tumomekrózis-faktor - indukálják, de a gamma-interferon nem. Az ELAM-1 maximális expressziója a belhámsejteken a stimulálás után 4-6 óra elteltével észlelhető, és 16 óra múlva visszaáll az alapértékre. Az ELAM-1 expressziója új mRNS- és proteinszintézistől függ. Fokozott VCAM-1 expresszió mutatható ki tumomekrózis-faktorral való kezelés után 2 órával, maximális a stimulálás után 8 órával, és megemelkedett szinten marad a stimulálást követően legalább 48 órán keresztül [Rice és Bevilacqua, Science, 246, 1303-1306 (1989)]. Az ICAM-1 expresszióját belhámsejteken a citokin interleukin-ΐβ és tumomekrózis-faktor és a gamma-interferon indukálja. Az ICAM-1 maximális expressziója az ELAM-l-ét követi, a stimulálás után 8-10 órával észlel2
HU 217 107 Β hető, és megemelkedett szinten marad legalább 48 órán keresztül.
A GMP-1 és az ELAM-1 elsődlegesen a neutrofilek véredények belhámsejtjeihez való tapadásában játszik szerepet. A VCAM-1 elsődlegesen T- és B-limfocitákat köt meg. Ezenkívül a VCAM-1 a melanoma és feltehetőleg egyéb rákok metasztázisában is szerepet játszhat. Az ICAM-1 a neutrofilek véredények belhámsejtjeihez, valamint a monociták és limfociták véredények belhámsejtjeihez, szövet fíbroblasztokhoz és külhám keratinocitákhoz való tapadásában játszik szerepet. Az ICÁM-1 az antigént termelő sejt T-sejt felismerésében, a célsejtek természetes gyilkos sejtek általi lízisében, a limfociták aktiválásában és szaporodásában és a T-sejtek timuszban való érésében is szerepet játszik. Ezenkívül a legújabb adatok azt bizonyítják, hogy az ICÁM -1 a celluláris receptora a rinovírus fő szerotípusának, ami a közönséges meghűlések több, mint 50%-áért felelős [Stauton és munkatársai, Cell 56, 839-847(1989)].
Az ICAM-1 expressziója a gyulladásos bőrbetegségek számos fajtájával kapcsolatban van, ilyenek például az allergiás kontakt dermatitisz, az állandósult gyógyszer okozta kiütés, lapos sömör és psoriasis [Ho és munkatársai, J. Am. Acad. Dermatol. 22, 64-68 (1990); Griffiths és Nickoloff, Am. J. Pathology 135, 1045-1053 (1989); Lisby és munkatársai, Br. J. Dermatol. 120, 479-484 (1989); Shiohara és munkatársai, Arch. Dermatol. 125, 1371-1376 (1989)]. Ezenkívül az ICAM-1 expresszióját kimutatták reumás ízületi gyulladásban szenvedő betegek ízületi hártyájában [Halé és munkatársai, Arth. Rheum. 32, 22-30 (1989)], cukorbetegek hasnyálmirigy B-sejtjeiben [Campbell és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 4282-4286 (1989)], Gravesféle betegségben szenvedő betegek pajzsmirigy tüszős sejtjeiben [Weetman és munkatársai, J. Endocrinol. 122, 185-191 (1989)] és vese- és májátültetések kilökődésekor [Faull és Russ, Transplantation 48, 226-230 (1989); Adams és munkatársai, Láncét, 1122-1125 (1989)].
Találmányunk alapját az a gondolat képezi, hogy az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expressziójának inhibitorai olyan új, gyógyászatilag alkalmazható gyulladáscsökkentő anyagokat jelentenek, amelyek gyulladásos vagy gyulladással járó betegségek, például asztma, reumás ízületi gyulladás, szövettranszplantátumok kilökődése, különféle bőrbetegségek és psoriasis elleni aktivitással rendelkeznek. Ezenkívül az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 inhibitorai a rinovírus fertőzések által okozott meghűlések, AIDS, valamint bizonyos rákok és ezek metasztázisai kezelésére is alkalmazhatók. Ez idáig nem ismeretes olyan gyógyászati szer, amely hatásosan gátolná az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 sejtadhéziós molekulák expresszíóját. Az ICAM-l-et semlegesítő monoklonális antitestek állatkísérletes modellekben való alkalmazása bizonyítja, hogy amennyiben sikerül ilyen inhibitorokat azonosítani, ezek gyógyászatilag alkalmazhatók asztma [Wegner és munkatársai, Science 247, 456-459 (1990)] és vesetranszplantátum kilökődése [Cosimi és munkatársai, J. Immunoi. 144, 4604-4612 (1990)] ellen. Az ICAM-1 molekula egyik oldható formája is hatásosnak bizonyult sejttenyészetek rinovírussal való fertőzésének megakadályozására [Mariin és munkatársai, Natúré 344, 70-72 (1990)].
Az intercelluláris adhéziós molekulákat befolyásoló jelenlegi szerek közé tartoznak a szintetikus peptidek, a monoklonális antitestek és az adhéziós molekulák oldható formái. Ez idáig még nem sikerült olyan szintetikus peptideket találni, amelyek gátolnák a kölcsönhatásokat az ICAM-l-gyel, VCAM-1-gyei vagy ELAM-1-gyei. A monoklonális antitestek feltehetőleg alkalmasak az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expressziójának következtében fellépő akut gyulladásos válaszok kezelésére. Azonban krónikus kezelésekben a gazdaállat antitesteket termel a monoklonális antitestek ellen, és ezáltal azok hatékonyságát korlátozza. Ezenkívül a monoklonális antitestek nagyméretű proteinek, és ez megnehezítheti azt, hogy a gyulladás helyét eléijék. A sejtadhéziós molekulák oldható formáinak alkalmazása esetén ugyanazon hátrányokkal kell számolni, mint a monoklonális antitestek esetén. Mindezek következtében szükség van olyan molekulákra, amelyek hatékonyan gátolják az intercelluláris adhéziós molekulákat. Az antiszensz oligonukleotidok nem rendelkeznek az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 hatásának gátlására jelenleg alkalmazott szerek sok hátrányával.
Hession és munkatársai (PCT/US90/02357) ismertették a belhámsejt adhéziós molekulákat, például az ELAM-l-et, VCAM-l-et és VCAM-lb-t kódoló DNS-szekvenciákat. Ismertették a fenti szekvenciák, különféle alkalmazását is, például (1) a fenti molekulákkal reagáló monoklonális antitest preparátumok előállítása, amelyek gyógyászati szerként alkalmazhatók a leukociták belhámsejtekhez való kötődésének gátlására; (2) ELAM peptidek előállítása, amelyek úgy gátolják a leukociták belhámsejtekhez való kötődését, hogy a leukocitákon lévő ELAM-ligandumokhoz kötődnek, amelyek viszont a belhámsejteken lévő ELAM-hoz kötődhetnek;
(3) ELAM-hoz kötődő molekulák (például anti-ELAM antitestek vagy markerek, például ezek ligandumjai vagy fragmensei) alkalmazása gyulladás kimutatására;
(4) ELAM és ELAM ligandum DNS-szekvenciák alkalmazása olyan nukleinsav-molekulák előállítására, amelyek transzlációs szinten zavarják az ELAM vagy ELAM-ligandum expresszióját antiszensz nukleinsav és ribozimek alkalmazásával a specifikus mRNS transzlációjának gátlására, vagy a mRNS antiszensz nukleinsav általi maszkírozásával, vagy annak ribozimmel való hasításával. Ismertették, hogy a kódoló régiók jelentik a támadható pontot. A VCAM-1 számára legvalószínűbbnek az AUG tűnt; egy, az AUG hellyel hibridizáló 15-mert a 17. példában ismertetnek.
A találmány alapvető célkitűzése az immunológiai összetevővel, szövetátültetéssel, rákokkal és áttételeikkel, meghűléssel, AIDS-szel kapcsolatos betegségek gyógykezelésére alkalmas vegyületek kidolgozása volt, a gyulladásos sejtadhéziós molekulák szintézisének megzavarásával.
A találmány célját képezi továbbá az olyan antiszensz oligonukleotidok vagy oligonukleotid-analógok kidolgozása, amelyek képesek az intercelluláris adhé3
HU 217 107 Β ziós proteineket kódoló nukleinsavak funkciójának gátlására.
A találmány fenti és további céljai az alábbiakból világosan kitűnnek.
A rajzokat röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábra a humán intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1) mRNS-szekvenciáját mutatja.
A 2. ábrán a humán endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 (ELAM-1) mRNS-szekvenciája látható.
A 3. ábra a humán vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM-1) mRNS-szekvenciáját mutatja.
A 4. ábra grafikusan mutatja az ICÁM-1 expressziójának indukálását interleukin-1-gyei és tumomekrózisfaktorral különféle humán sejtvonalak felületén.
Az 5. ábra grafikusan mutatja a választott antiszensz oligonukleotidok hatását ICAM-1 expressziójára humán köldökvéna belhámsejteken.
A 6. A és 6. B ábra grafikusan mutatja egy antiszensz oligonukleotid hatását ICAM-1 expressziójára tumornekrózis-faktorral és interleukin-1-gyei stimulált humán köldökvéna belhámsejteken.
A 7. ábra grafikusan mutatja az antiszensz oligonukleotidok hatását a DMSO-val differenciált HL-60 sejtek ICÁM-1 által médiáit adhéziójára a kontroll és a tumornekrózis-faktorral kezelt humán köldökvéna belhámsejtekhez.
A 8. ábra grafikusan mutatja a választott antiszensz oligonukleotidok hatását ICAM-1 expressziójára A549 humán tüdőkarcinóma sejtekben.
A 9. ábra mutatja grafikusan a választott antiszensz oligonukleotidok hatását ICAM-1 expressziójára primer humán keratinocitákban.
A 10. ábra mutatja grafikusan az összefüggést az oligonukleotid lánchossza, Tm értéke és az ICAM-1 expressziójára kifejtett hatása között.
A 11. ábra grafikusan mutatja a választott antiszensz oligonukleotidok hatását a DMSO-val differenciált HL-60 sejtek ICAM-1 által médiáit adhéziójára a kontroll és a tumomekrózis-faktorral kezelt humán köldökvéna belhámsejtekhez.
A 12. ábra mutatja grafikusan a választott antiszensz oligonukleotidok hatását ELAM-1 expressziójára tumomekrózis-faktorral kezelt humán köldökvéna belhámsejteken.
A találmányt röviden az alábbiakban ismertetjük. A találmány oligonukleotidokra és oligonukleotid-analógokra vonatkozik, amelyek specifikusan hibridizálnak az intercelluláris adhéziós molekula-l-et (ICAM-1), vaszkuláris sejtadhéziós molekula-l-et (VCAM-1) és endoteliális leukocita adhéziós molekula-l-et (ELAM-1) kódoló nukleinsavakkal. Az oligonukleotidokat és oligonukleotid-analógokat úgy terveztük meg, hogy azok vagy közvetlenül a mRNS-hez kötődjenek, vagy egy hármas szálú szerkezetet kialakítva egy választott DNS-részhez kötődjenek, ezáltal módosítsák a génből képződő mRNS mennyiségét.
Az előbbi kölcsönhatást nevezik egyszerűen antiszensznek. Az oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok képesek az RNS vagy DNS működését gátolni, vagy proteinné való transzlációjának, vagy citoplazmába való átjutásának, vagy bármely egyéb, általános biológiai funkciójához szükséges aktivitásának gátlásával. Az a hiányosság, hogy az RNS vagy DNS nem képes funkcióit részben vagy teljesen ellátni, a genom azon részének hibáját eredményezi, amely a sejtadhéziós molekulák megfelelő expresszióját szabályozza, így a fenti metabolizmus megváltozik.
Az antiszensz támadás célpontjaként előnyösen specifikus géneket választunk. Felismertük, hogy az ICAM-l-et, VCAM-l-et és ELAM-l-et kódoló gének különösen alkalmasak erre a célra. Az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expressziójának gátlása várhatóan alkalmas lesz a gyulladásos betegségek, a gyulladással járó betegségek, szövetkilökődések, rákok és metasztázisaik, valamint virális fertőzések kezelésére.
A találmány szerinti eljárással előállított készítmény a sejtadhéziót módosítja azáltal, hogy hatóanyagként olyan oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot tartalmaz, amely egy sejtadhézió módosítására képes proteint kódoló nukleinsavakkal hibridizálható. Előnyösek az ICAM-l-et, VCAM-l-et és ELAM-1 -et kódoló RNSsel vagy DNS-sel hibridizálódó oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok. A fenti készítmények diagnosztikai célokra is alkalmazhatók.
A találmány előnyös kiviteli alakjait az alábbiakban részletesen ismertetjük.
Az antiszensz oligonukleotidok terápiás szerként! alkalmazása nagy lehetőséget jelent számos humán betegség kezelésében. Elvileg sokkal könnyebb olyan vegyületeket tervezni, amelyek egy molekula, például egy RNS-molekula primer szerkezetével lépnek kölcsönhatásba bázispárosodással, mint olyanokat, amelyek egy enzim aktív helyével vagy egy receptor ligandumot kötő helyével lépnek kölcsönhatásba. Az oligonukleotidok specifikusan kötődnek vagy a pre-mRNS vagy az érett mRNS komplementer szekvenciájával a WatsonCrick-féle bázispárosodás szerint, ezáltal gátolják a genetikai információ áramlását a DNS-ből a proteinbe. Az antiszensz oligonukleotidok tulajdonságai, amelyek a célszekvenciával szemben specifikussá, egyben különösen sokoldalúvá is teszik ezeket. Mivel az antiszensz oligonukleotidok négy monomer egységből kialakult hosszú láncok, bármely cél-RNS-szekvencia számára: könnyen szintetizálhatok. Számos újabb tanulmányban dokumentálták az antiszensz oligonukleotidok alkalmazását biokémiai eszközként a célproteinek vizsgálatára [Rothhenberg és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst., 81, 1539-1544 (1989); Zon G., Pharmaceutical Rés. 5, 539-549], Az oligonukleotidok kémiájában, a nukleázzal szemben rezisztens oligonukleotidok szintézisében és a sejtek által jobban felvehető oligonukleotid-analógokban elért fejlődés lehetővé teszi azt, hogy az antiszensz oligonukleotidok mint új terápiás szerek alkalmazását megfontoljuk.
Az antiszensz oligonukleotidok ideális megoldást jelentenek mindazon problémákra, amelyek a korábbi megoldásokkal kapcsolatban jelentkeztek. Úgy tervezhetők, hogy szelektíven gátoljanak egy adott izoenzimet, gátolják az enzim képződését, és elkerüljék a nemspecifikus mechanizmusokat, például a szabadgyök be4
HU 217 107 Β fogást vagy a többszörös receptorokhoz való kötődést. A specifikus inhibitorok megtervezéséhez nem szükséges az enzimmechanizmusok vagy a receptor-ligandum kölcsönhatások teljes megértése.
A neutrofilek beszűrődése a gyulladás helyére feltehetőleg a GMP-140, ELAM-1 és ICAM-1 belhámsejtek felületén való fokozott expressziójának következménye. A limfociták és monociták megjelenését a gyulladásos reakció későbbi fázisában feltehetőleg a VCAM-1 és ICAM-1 médiaija. Az ELAM-1 és GMP-140 a vaszkuláris belhámsejteken átmenetileg expresszálódik, míg a VCAM-1 és ICAM-1 krónikusan expresszálódik.
A humán ICAM-l-et egy 3,3 kb hosszúságú mRNS kódolja, egy 55219 dalton móltömegű protein szintézisét eredményezve (1. ábra). Az ICAM-1 erősen glikozilezett a N-kötött glikozilezési helyeken keresztül. Az érett protein látszólagos móltömege 90 kDa, SDS-poli(akril-amid)-gél elektroforézissel meghatározva [Staunton és munkatársai, Cell 52, 925-933]. Az ICAM-1 az immunglobulin szupergén család tagja, aminoterminálisán öt immunglobulinszerű domént tartalmaz, amelyet egy transzmembrán dómén és egy citoplazmatikus dómén követ. Az LFA-1 és rinovírus számára az elsődleges kötőhely az első immunglobulinszerű doménben található. Azonban a kötőhelyek egymástól eltérőnek tűnnek [Staunton és munkatársai, Cell 61, 243-354 (1990)]. A legújabb elektronmikrográfiás vizsgálatok szerint: az ICÁM -1 hajlított pálcika alakú, amelynek hosszúsága 18,7 nm, és átmérője 2-3 nm [Staunton és munkatársai, Cell 6, 243-254 (1990)].
Az ICAM-1 széles spektrumú szöveti és sejtmegoszlást mutat, és megtalálható a fehérvérsejteken, belhámsejteken, fibroblasztokon, keratinocitákon és egyéb hámsejteken. Az ICAM-1 expressziója a vaszkuláris belhámsejteken, fibroblasztokon, keratinocitákon, asztrocitákon és számos sejtvonalon szabályozható bakteriális lipopoliszacharidokkal és citokinekkel, például interleukin-l-gyel, tumomekrózis-faktorral, gamma-interferonnal és limfotoxinnal végzett kezeléssel [lásd például Frohman és munkatársai, J. Neuroimmunol. 23, 117-124 (1989)]. A citokinnel végzett kezelést követően az ICAM-1 fokozott expressziójának molekuláris mechanizmusa még nem tisztázott.
Az ELAM-1 egy 115 kDa móltömegű membránglikoprotein (2. ábra), a membránglikoproteinek szelektrin családjának egyik tagja [Bevilaqua és munkatársai, Science 243, 1160-1165 (1989)]. Az ELAM-1 amino-terminális régiója a lektinszerű proteinekkel homológ szekvenciákat tartalmaz, amelyet egy, az epidermális növekedési faktorhoz hasonló dómén követ, amely után hat, egyenként 60 aminosavból álló tandem ismétlődő egység helyezkedik el, a komplementer receptor 1-ben és 2-ben találtakhoz hasonlóan. Ezek a tulajdonságok a GMP-140-ben és egy limfocita irányított antigénben, a MEL-14 antigénben is közösek. Az ELAM-l-et egy 3,9 kb hosszúságú mRNS kódolja. Az ELAM-1 mRNS 3’-transzlatálatlan régiója számos ATTTA szekvenciamotívumot tartalmaz, amelyek a celluláris mRNS gyors tumoveréért felelősek, az ELAM-1 expresszió átmeneti jellegének megfelelően.
Az ELAM-1 megoszlása a sejtekben korlátozott, mivel csak vaszkuláris belhámsejteken mutatták ki. Az ICÁM-1-hez hasonlóan az ELAM-l-et is számos citokin képes indukálni, például a tumomekrózis-faktor, az interleukin-1, és a limfotoxin és a bakteriális lipopoliszacharidok. Az ICM-l-gyel ellentétben az ELAM-l-et a gamma-interferon nem indukálja [Bevilacqua és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 9238-9242 (1987); Wellicome és munkatársai, J. Immunoi. 144, 2558-2565 (1990)]. Az ELAM-1 mRNS kinetikájában humán köldökvéna belhámsejtekben való indukciója és onnan való eltűnése megelőzi az ELAM-1 sejtfelületen való megjelenését és onnani eltűnését. Az ICÁM-1-hez hasonlóan, az ELAM-1 indukciójának molekuláris mechanizmusa sem ismert még.
A VCAM-1 egy 110 kDa móltömegű membránglikoprotein, amelyet egy 3,2 kb hosszúságú mRNS kódol (3. ábra). A VCAM-l-et láthatólag egy egyetlen példányban lévő gén kódolja [Osbom és munkatársai, Cell 59, 1203-1211 (1989)]. Az ICAM-l-hez hasonlóan a VCAM-1 is az immunglobulin szupergén család tagja, amely hat H-típusú immunglobulinszerű domént tartalmaz. A VCAM-1 receptora feltehetőleg a CD29, amit az bizonyít, hogy a CD29 elleni monoklonális antitestek képesek gátolni a Ramos sejtek VCAM-1-hez való kötődését. A VCAM-1 elsődlegesen a vaszkuláris belhámsejteken expresszálódik. Az ICAM-l-hez és ELAM-1-hez hasonlóan, a VCAM-1 vaszkuláris endotéliumban való expresszióját is szabályozza a citokinekkel végzett kezelés [Rice és Bevilacqua, Science 246, 1303-1306 (1989); Rice és munkatársai, J. Exp. Med. 171, 1369-1374 (1990)]. Az expresszió fokozódása láthatólag az mRNS indukciójának következtében lép fel.
Ha egy állat olyan betegségben szenved, amely az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expressziójának csökkentésével kezelhető, az állatnak terápiás célra egy találmány szerinti oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot adagolunk. Az adagolandó dózis nagyságának, az adagolás módjának és az adagolás gyakoriságának megállapítása a szakemberek kötelező tudásához tartozik. A kezelést általában addig folytatjuk, amíg a gyógyulás bekövetkezik, vagy a kóros állapotban javulás áll be. Bizonyos betegségek esetén valószínűleg tartós kezelést kell alkalmazni.
A találmány értelmében az oligonukleotidokat és oligonukleotid-analógokat a gyulladásos sejtadhéziót módosító proteineknek megfelelő RNS és DNS funkciójának antiszensz gátlására alkalmazzuk. A leírásban oligonukleotid alatt természetben előforduló bázisokból és natív foszfodiészter-kötésekkel összekapcsolt íuranozilcsoportokból képzett polinukleotidokat értünk. A fenti kifejezés egyaránt utalhat természetben előforduló és természetes alegységekből szintetikusan előállított ilyen molekulákra, valamint közeli homológjaikra.
Oligonukleotid-analóg kifejezéssel a leírásban olyan maradékokra utalunk, amelyek funkciója az oligonukleotidokéhoz hasonló, de tartalmaznak nem természetes
HU 217 107 Β részeket is. így az oligonukleotid-analógok tartalmazhatnak módosított cukor-maradékokat vagy cukrok közötti kötéseket. Az utóbbiakra említhetjük a foszforotioát-kötést és az egyéb kéntartalmú kötéseket, amelyek a szakirodalomból ismertek. A találmány szerinti előnyös kiviteli alakok közé tartoznak azok, amelyekben a foszfodiészter-kötéseknek legalább egy részét olyan szerkezet helyettesíti, amelynek képes fokozni a vegyület penetrálóképességét azokba a sejtrégiókba, ahol az az RNS vagy DNS lokalizálódik, amelynek aktivitását módosítani kívánjuk. A fenti helyettesítés például foszforotioátkötés, foszfonátkötés, rövid szénláncú alkil- vagy cikloalkil-szerkezet lehet. Másik előnyös kiviteli alak szerint a foszfodiészter-kötések egyéb olyan szerkezetekkel vannak helyettesítve, amelyek egyszerre lényegében nemionosak vagy nemkirálisak, vagy olyan szerkezetekkel, amelyek királisan és enantiomériásan specifikusak. Szakember számára nem jelenthet nehézséget a találmány szerinti megoldásban alkalmazható egyéb kötések kiválasztása.
Az oligonukleotid-analógok olyan molekulák is lehetnek, amelyek legalább néhány módosított bázist tartalmaznak. így alkalmazhatunk olyan purinokat és pirimidineket is, amelyek a természetben normális körülmények között nem fordulnak elő. Hasonlóképpen, a nukleotid alegység furanozil-részében is lehetnek módosítások, ha azok a találmány alapvető elvével kapcsolatosak. A fenti módosításokra példaként említhetjük a 2’-Oalkil- és 2’-O-halogén-szubsztituáltnukieotidokat.
A fenti analógokat legjobban úgy jellemezhetjük, hogy azok fünkcionálisan helyettesíthetők a természetes oligonukleotidokkal (vagy a természetessel összhangban szintetizált oligonukleotidokkal), de a természetes szerkezettől egy vagy több eltérést tartalmaznak. A találmány tárgykörébe tartoznak mindazon analógok, amelyek képesek az intercelluláris adhéziót módosító proteinek valamelyikének megfelelő génből származó DNS-sel vagy RNS-sel hatékonyan hibridizálódni. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok előnyösen mintegy 3-50 alegységből állnak. A fenti oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok még előnyösebben mintegy 8-25, legelőnyösebben mintegy 12-22 alegységből állnak. Alegység alatt egy bázis-cukor kombinációt értünk, amely a szomszédos alegységhez foszfodiészter-kötéssel, vagy egyéb megfelelő kötéssel kapcsolódik.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok célszerűen és rutinszerűen ismert szilárd fázisú szintetikus eljárásokkal állíthatók elő. A fenti szintézis lefolytatásához szükséges eszközöket számos cég, például az Applied Biochem forgalmazza. A szintézist egyéb módon is végrehajthatjuk, az adott oligonukleotidok szintetizálása szakember kötelező tudásához tartozik. Az egyéb oligonukleotid-analógok, például a foszforotioátok és alkilezett származékok előállítása szintén ismert hasonló módszerek alkalmazásával.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány értelmében az azon DNS nyitott leolvasási keretei (ORF-jei) által felismert mRNS, amely DNS-ből átíródott, nemcsak a DNS ORF-jeiből származó információt tartalmazza, hanem a kapcsolatos ribonukleotidokét is, amelyek mint 5’-transzlatálatlan régió, 3’-transzlatálatlan régió és közbeékelődő ribonukleotid-szekvencia ismertek. így a találmány értelmében olyan oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok tervezhetők, amelyek részben vagy teljesen ezeket a társult ribonukleotidokat, valamint az információhordozó ribonukleotidokat célozzák. Az előnyös kiviteli alakok szerint az oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok egy transzkripciós iniciációs hellyel, egy transzlációs iniciációs hellyel, egy közbeékelődő szekvenciával és egy 3’transzlatálatlan régióban lévő szekvenciával képesek specifikusan hibridizálódni.
A találmány értelmében az oligonukleotidok olyan nukleinsavrészekkel hibridizálhatók specifikusan, amelyek a fehérvérsejtek egymással vagy egyéb sejtekkel szembeni adhéziójában szerepet játszó proteint kódolnak. Az előnyös kiviteli alakok szerint a fenti protein az intercelluláris adhézió molekula-1, a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 és az endotéliális leukocita adhéziós molekula-1. A találmány értelmében alkalmazhatók azok az oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok, amelyek a megfelelő szekvenciát vagy annak egy részét tartalmazzák. Az 1. ábra például egy humán intercelluláris adhéziós molekula-1 mRNS szekvenciát mutat. Egy teljesen vagy részben alkalmazható, előnyös szekvencia szegmens az alábbi:
’ 3 ’
TGGGAGCCATAGCGAGGC
GAGGAGCTCAGCGTCGACTG
GACACTCAATAAATAGCTGGT
GAGGCTGAGGTGGGAGGA
CGATGGGCAGTGGGAAAG
GGGCGCGTGATCCTTATAGC
CATAGCGAGGCTGAGGTTGC
CGGGGGCTGCTGGGAGCCAT
TCAGGGAGGCGTGGCTTGTG
CCTGTCCCGGGATAGGTTCA
TTGAGAAAGCTTTATTAACT
CCCCCACCACTTCCCCTCTC.
A 2. ábrán a humán endotéliális leukocita adhéziós molekula-1 mRNS szekvenciája látható. Egy teljesen vagy részben alkalmazható, előnyös szekvenciaszegmens az alábbi:
5’ 3’
CAATCATGACTTCAAGAGTTCT
TCACTGCTGCCTCTGTCTCAGG
TGATTCTTTTGAACTTAAAAGGA
TTAAAGGATGTAAGAAGGCT
CATAAGCACATTTATTGTC
TTTTGGGAAGCAGTTGTTCA
AACTGTGAAGCAATCATGACT
CCTTGAGTGGTGCATTCAACCT
AATGCTTGCTCACACAGGCATT.
A 2. ábrán a humán vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 mRNS szekvenciája látható. Egy teljesen vagy részben alkalmazható, előnyös szekvenciaszegmens az alábbi:
’ 3 ’
CCAGGCATTTTAAGTTGCTGT
HU 217 107 Β
CCTGAAGCCAGTGAGGCCCG
GATGAGAAAATAGTGGAACCA
CTGAGCAAGATATCTAGAT
CTACACTTTTGATTTCTGT
TTGAACATATCAAGCATTAGCT
TTTACATATGTACAAATTATGT
AATTATCACTTTACTATACAAA
AGGGCTGACCAAGACGGTTGT.
A fenti szekvenciák véleményünk szerint pontosak. Amennyiben azonban hibásak lennének, a találmány természetesen a pontos szekvenciákra irányul. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok a fenti szekvenciák valamelyikét, vagy azok egy részét tartalmazzák. Ennek megfelelően előnyösen egy fenti oligonukleotidot vagy annak analógját alkalmazzuk, vagy hasonló oligonukleotidokat vagy oligonukleotid-analógokat, amelyeket egy szakember a gyulladásos sejtadhéziós molekulák szintézisének módosítására előnyös antiszensz célok ismeretében képes szintetizálni.
A találmány néhány előnyös kiviteli alakját az alábbi példákkal illusztráljuk. A célzott mRNS molekulák az intercelluláris adhéziós molekula-1, az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 és a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 módosítására vonatkoznak. Szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a találmány nem korlátozódik ezekre, hanem sokkal általánosabban alkalmazható. Az ICAM-1 és/vagy ELAM-1 és/vagy VCAM-1 képződésének gátlása vagy módosítása várhatólag jelentős gyógyászati előnyökkel jár a betegségek gyógykezelésében. A készítmények hatásosságát vizsgálattal vagy vizsgálatsorozattal lehet meghatározni.
1. példa
Az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expresszióját a sejtek felületén specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával, ELISA módszerrel lehet meghatározni. Az anti-ICAM-1 monoklonális antitestet (84H10) az Amac Inc.-től (Westbrook, ME); az anti-ELAM-1 monoklonális antitestet (BBA-1) az R&D Systems-től (Minneapolis, MN) szereztük be. A humán anti-VCAM-1 monoklonális antitest a BabCo-tól (Richmond, CA) szerezhető be, katalógusszáma MMS-175P. A sejteket összefüggő réteg kialakulásáig tenyésztjük 96-rezervoáros lemezeken. A sejteket vagy interleukin-l-gyel vagy tumomekrózis-faktorral stimuláljuk 4-8 órán keresztül az ELAM-1 meghatározására, és 8-24 órán keresztül az ICAM-1 és VCAM-1 meghatározására. A citokinnel megfelelő időn keresztül végzett inkubálás után a sejteket kalciumot és magnéziumot tartalmazó pufferolt izotóniás oldattal, például Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (D-PBS) óvatosan háromszor mossuk. A sejteket ezután közvetlenül fixáljuk a mikrotitráló lemezen, 1 -2% D-PBS-ben hígított paraformaldehiddel 20 percen keresztül 25 °C-on kezelve. A sejteket D-PBS-sel újra háromszor mossuk. A mikrotitráló lemezhez való nemspecifikus kötődést 2 marhaszérum-albumint tartalmazó D-PBS-sel blokkoljuk 1 órán keresztül, 37 °C-on. A sejteket a blokkolóoldattal hígított megfelelő monoklonális antitesttel 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. A kötetlen antitestet D-PBS-sel háromszor mosva távolítjuk el. A sejtekhez kötődött antitestet a blokkolóoldattal 1:1000 arányban hígított biotinilezett kecske anti-egér IgG-vel (Bethesda Research Laboratories, Gaithersberg, MD) 1 órán keresztül 37 °C-on inkubálva detektáljuk. A sejteket D-PBS-sel háromszor mossuk, majd 1:1000 hígítású β-galaktozidázzal konjugált sztreptavidinnel 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáljuk. A sejteket háromszor 5 percen keresztül mossuk D-PBS-sel. A specifikus monoklonális antitesthez kötött β-galaktozidáz mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a lemezt 3,3 mmol/1 klórfenolvörös β-D-galaktopiranozidot, 50 mmol/1 nátrium-foszfátot, 1,5 mmol/1 magnéziumkloridot tartalmazó oldattal (pH 7,2) 2-15 percen keresztül 37 °C-on előhívjuk. A termék koncentrációját az abszorpció mérésével határozzuk meg 575 nm-en, ELISA mikrotitráló lemezleolvasóval.
A 4. ábra mutatja az ICAM-1 indukcióját néhány humán sejtvonalban interleukin-1 vagy tumomekrózisfaktorral végzett stimulálás után. A sejteket 15 órán keresztül stimuláltuk az interleukin-l-gyel vagy tumornekrózis-faktor növekvő koncentrációival, és a meghatározást a fentiek szerint végeztük. Az ICAM-1 expresszióját a 84H10 monoklonális antitest (Amac Inc., Westbrook, ΜΕ) 1:1000 hígításával inkubálva határoztuk meg. Az alkalmazott sejtvonalak az alábbiak voltak: négyszer átoltott humán köldökvéna belhámsejtek (HUVEC), humán felhámkarcinoma-sejtek (A431), humán melanóma sejtvonal (SK-MEL-2) és humán tüdőkarcinoma sejtvonal (A549). Az ICAM-1 mindegyik sejtvonalon indukálódott, azonban a tumomekrózisfaktor erősebben indukálta az ICAM-1 expresszióját a sejtek felületén, mint az interleukin-1 (4. ábra).
Az antiszensz oligonukleotidok szűrővizsgálatát az ICAM-1, VCAM-1 vagy ELAM-1 expressziójának gátlása szempontjából a fent leírtak szerint végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a sejteket a citokinekkel való provokálás előtt az oligonukleotidokkal előkezeltük. Az ICAM-1 expressziója antiszensz oligonukleotid általi gátlásának egyik példája az 5. ábrán látható. A humán köldökvéna belhámsejteket (HUVEC) 16 pmol/l N-[l(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetil-ammónium-kloridot (DOTMA) tartalmazó Opti MEM-mel (GIBCO, Grand Island, NY) hígított oligonukleotid növekvő koncentrációival kezeltük 4 órán keresztül 37 °C-on, az oligonukleotid felvételének fokozására. A közeget ezután eltávolítottuk és belhámsejt-tápközeggel (EGM-UV; Clonetics, San Diego, CA) helyettesítettük, amely az oligonukleotid megadott koncentrációját tartalmazta. A sejteket 4 órán keresztül inkubáltuk, majd 5 egység/ml koncentrációban interleukin-1-et adtunk a sejtekhez, és 14 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A sejtekben az ICAM-1 expresszióját 84H10 monoklonális antitest 1:1000 arányú hígításának alkalmazásával határoztuk meg a fent leírtak szerint. Az alkalmazott oligonukleotidok az alábbiak voltak:
1. vegyület - (ISIS 1558) foszfodiészter oligonukleotid, amelyet úgy terveztünk, hogy a mRNS AUG transzlációs iniciációs ko7
HU 217 107 Β dönt magában foglaló 64-80. helyzetű nukleotidjaival hibridizáljon, és szekvenciája az alábbi:
5’-TGGGAGCCATAGCGAGGC-3’
2. vegyület - (ISIS 1570) foszforotioát-kötést tartalmazó oligonukleotid, amely ugyanazon szekvenciának felel meg, mint az 1. vegyület
3. vegyület - az 1. és 2. vegyülettel komplementer foszforotioát oligonukleotid, amelynek szekvenciája az alábbi:
’-GCCTCGCTATGGCTCCC A-3 ’
4. vegyület - (ISIS 1572) foszforotioátot tartalmazó oligonukleotid, amelyet úgy terveztünk, hogy a mRNS 3’-transzlatálatlan régiójában a 2190-2210. helyzetű nukleotidokkal hibridizáljon és szekvenciája az alábbi:
5’-GACACTCAATAAATAGCTGGT-3’
5. vegyület - (ISIS 1821) foszforotioátot tartalmazó oligonukleotid, amelyet úgy terveztünk, hogy a kontrollként alkalmazott humán 5-lipoxigenáz mRNS-sel hibridizáljon, és szekvenciája az alábbi:
’-CATGGCGCGGGCCGCGGG-3 ’
A humán ICAM-1 mRNS AUG transzlációs iniciációs régióját célzó foszfodiészter oligonukleotid (1. vegyület) nem gátolta az ICAM-1 expresszióját, azonban a megfelelő, foszforotioátot tartalmazó oligonukleotid (2. vegyület) 0,1 pmol/l koncentrációban 70%-kal, 1 μιηοΐ/ΐ koncentrációban 90-kal gátolta az ICAM-1 expresszióját (4. ábra). A foszforotioát oligonukleotid foszfordiészter oligonukleotidhoz viszonyított nagyobb aktivitása valószínűleg a nagyobb stabilitás következménye. A 2. vegyületnek megfelelő értelmes (szensz) szál (3. vegyület) 10 pmol/l koncentrációban gyengén gátolta az ICÁM-1 expresszióját. Ha a
2. vegyületet a 3. vegyülettel a sejtekhez való hozzáadás előtt hibridizáljuk, a 2. vegyület ICAM-1 expressziójára kifejtett hatása gyengül, amiből arra következtetünk, hogy a 2. vegyület aktivitása az antiszensz oligonukleotid hatás következménye, amihez mRNSsel való hibridizálás szükséges. A 3’-transzlatálatlan szekvenciákat célzó antiszensz oligonukleotid (4. vegyület) 1 pmol/l koncentrációban 62%-kal gátolta az ICAM-1 expresszióját (5. ábra). A kontroll oligonukleotid, amely a humán 5-lipoxigenázt célozza (5. vegyület) 20%-kal csökkentette az ICAM-1 expresszióját. Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy az oligonukleotidok képesek az ICÁM-1 expresszióját gátolni humán köldökvéna belhámsejteken, és arra engednek következtetni, hogy az ICÁM-1 expreszsziójának gátlása antiszensz aktivitásnak tulajdonítható.
Az antiszensz oligonukleotid 2. vegyület 1 pmol/l koncentrációban gátolta az ICAM-1 expresszióját tumomekrózis-faktor és interleukin-1 növekvő koncentrációival stimulált humán köldökvéna belhámsejteken (6. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a 2. vegyület hatása nem specifikus a sejtek interleukin-1-gyei való stimulálására.
Hasonló vizsgálatokkal kimutatható az ELAM-1 és VCAM-1 expressziójának gátlása is antiszensz oligonukleotidokkal.
2. példa
Az antiszensz oligonukleotidok ICAM-1, VCAM-1 vagy ELAM-1 expressziójára kifejtett hatásának kimutatására alkalmas másik celluláris vizsgálat a sejtadhézió vizsgálata. A célsejtekből többrezervoáros lemezen egyrétegű tenyészetet készítünk, és oligonukleotiddal, majd citokinnel kezeljük. A tapadó sejteket ezután az egyrétegű sejtekhez adjuk és 37 °C-on 30-60 percen keresztül inkubáljuk, majd a nem tapadó sejteket mosással eltávolítjuk. Az egy réteghez tapadó sejteket vagy a tapadó sejtek közvetlen számolásával, vagy úgy határozhatjuk meg, hogy a sejteket előzetesen egy radioizotóppal, például 51Cr-mal jelezzük, és az egy réteghez kötött radioaktivitást mérjük [Dustin és Springer, J. Cell. Bioi. 107, 321-331 (1988)]. Az antiszensz oligonukleotidok az ICAM-l-et, VCAM-l-et vagy ELAM-l-et célozhatják a vizsgálatban.
Az ICÁM-1 mRNS-t célzó antiszensz oligonukleotidok hatása DMSO-val differenciált HL-60 sejtek [Gallagher R. és munkatársai, Blood 54, 713-733 (1979)] (ATCC, Manassas VA) tumomekrózis-faktorral kezelt humán köldökvéna belhámsejtekhez való adhéziójára a 7. ábrán látható. A humán köldökvéna belhámsejteket 12 rezervoáros lemezeken 80%-ban összefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztjük. A sejteket 37 °C-on 4 órán keresztül 8 pmol/l DOTMA-t tartalmazó Opti-MEM-mel hígított 2 pmol/l oligonukleotiddal kezeljük. A tápközeget eltávolítjuk és friss belhámsejttenyésztő tápközeggel (EGM-UV) helyettesítjük, amely 2 pmol/l megadott oligonukleotidot tartalmaz. A sejteket 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáljuk, majd 1 ng/ml koncentrációban hozzáadjuk a tumornekrózis-faktort, és a sejteket 19 órán keresztül tovább inkubáljuk. A sejteket egyszer mossuk EGM-UV-vel, és 1,6 χ 106 sejtet 1,3% DMSO hozzáadásával 4 napon keresztül differenciálunk. A sejteket 37 °C-on 1 órán keresztül hagyjuk megtapadni, majd 37 °C-ra melegített Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (DPBS) négyszer óvatosan mossuk. A megtapadt sejteket az egysejtrétegről 0,25 ml hideg (4 °C-os), 5 mmol/1 EDTA-t tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal leválasztjuk és jégen 5 percen keresztül inkubáljuk. Az EDTA-s kezeléssel eltávolított sejtek számát hemocitométerrel végzett számlálással meghatározzuk. Az egysejtrétegről EDTA-s kezeléssel leválasztott belhámsejtek morfológiai eltéréseik alapján könnyen megkülönböztethetők a HL-60 sejtektől.
Tumomekrózis-faktor nélkül a HL-60 sejtek 3%-a kötődik a belhámsejtekhez. A belhámsejt egysejtréteget 1 ng/ml tumomekrózis-faktorral kezelve a tapadó sejtek száma az összes hozzáadott sejtek számának 59%-ára növekedik (7. ábra). Az antiszensz oligonukleotid 2. vegyülettel vagy a kontroll 5. vegyülettel való kezelés hatására nem változik meg az egysejtréteghez tapadó sejtek száma tumomekrózis-faktorral végzett kezelés nélkül (7. ábra). Az antiszensz oligonukleotid
HU 217 107 Β
2. vegyület a tapadó sejtek számát az összes hozzáadott sejtek 59%-áról az összes hozzáadott sejtek 17%-ára csökkentette (7. ábra). Ezzel szemben a kontroll oligonukleotid 5. vegyület nem csökkentette szignifikánsan a tumomekrózis-faktorral kezelt belhámsejt egysejtrétegen megtapadt sejtek számát, azaz az összes hozzáadott sejt 53%-a tapad meg az 5. vegyülettel való kezelés esetén, szemben a kontroll sejtek 59%-os tapadásával.
Ezek az adatok azt jelzik, hogy az antiszensz oligonukleotidok képesek az ICAM-1 expresszi óját gátolni belhámsejteken, és azt, hogy az ICAM-1 expressziójának gátlása szekvenciaspecifikus módon összefügg a neutrofilszerű sejtek belhám egysejtréteghez való tapadásának csökkenésével. Mivel más molekulák - például az ELAM-1 és VCAM-1 - is mediálják a fehérvérsejtek belhámsejtekhez való tapadását, nem várható, hogy a tapadás teljes mértékben gátlódik.
3. példa
Oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok szintézise és jellemzése
A módosítatlan DNS oligonukleotidokat automatizált DNS-szintetizátorban (Applied Biosystems model 380B) szintetizáltuk, standard foszforamidit módszert alkalmazva, jóddal való oxidálással. A β-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditeket az Applied Biosystemstől szereztük be (Foster City, CA). A foszforotioát oligonukleotidok előállítására a standard oxidációs lombikot 0,2 mol/1 koncentrációjú acetonitriles 3H-l,2-benzoditiol-3-on-l,l-dioxid-oldattal helyettesítettük a foszfitkötések szakaszos tiálása céljából. A tiálási ciklusban a várakozási időt 68 másodpercre növeltük, majd ezt követte a védési lépés.
A 2’-O-metil-foszforotioát oligonukleotidokat 2’-Ometil^-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditek (Chemgenes, Needham, MA) és a módosítatlan oligonukleotidok előállítására használt standard ciklus alkalmazásával szintetizáltuk, azzal az eltéréssel, hogy a várakozási időt a tetrazol és bázis beadagolása után 360 másodpercre növeltük. A szintézis indítására alkalmazott 3’-bázis egy 2’-dezoxiribonukleotid volt.
A 2’-fluor-foszforotioát oligonukleotidokat 5’-(dimetoxi-tritil)-3 ’-foszforamiditek alkalmazásával szintetizáltuk a 463358 számon 1990. január 11-én és 566977 számon 1990. augusztus 13-án bejelentett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett eljárások szerint, amelyek saját bejelentéseink voltak, és teljes tartalmukra hivatkozunk jelen leírásunkban. A 2’-fluor-oligonukleotidokat foszforamidit módszerrel állítottuk elő, a standard DNS-szintézis protokollját kismértékben megváltoztatva: a védőcsoport eltávolítását szobahőmérsékleten, metanolos ammónia alkalmazásával végeztük.
A szabályozott pórusméretű üvegoszlopról (Applied Biosystems) való lehasítás és a védőcsoport 55 °C-on 18 órán keresztüli tömény ammónium-hidroxidos kezeléssel végzett eltávolítása után az oligonukleotidokat 0,5 mol/1 koncentrációjú NaCl-oldatból 2,5 térfogat etanollal kétszer kicsapva tisztítjuk. Az analitikai gélelektroforézist 20% akrilamidban, 8 mol/1 karbamid jelenlétében, 45 mmol/1 Tris-borát pufferben (pH 7,0) végezzük. Az oligonukleotidok és foszforotioát analógjaik a gélelektroforézis alapján több, mint 80%-ban teljes hosszúságúak voltak.
Az RNS oligonukleotidokat ABI model 380B szintetizátorban állítottuk elő. A standard szintézisciklust úgy módosítottuk, hogy a tetrazol beadagolása utáni várakozási időt 900 másodpercre növeltük. A bázisok védőcsoportját metanolos ammóniával egy éjszakán keresztül inkubálva távolítottuk el. A bázisok védőcsoportjának eltávolítása után az oligonukleotidokat vákuumban szárítottuk. A 2’-hidroxil-csoport terc-butil-dimetil-szilil-védőcsoportját úgy távolítottuk el, hogy az oligonukleotidot 1 mol/1 koncentrációjú tetrahidrofürános tetrabutil-ammónium-fluorid-oldatban egy éjszakán keresztül inkubáltuk. Az RNS oligonukleotidokat Cllg SepPak tölteten (Waters, Division of Millipore Corp., Milford, MA) és etanolos kicsapással tisztítottuk tovább.
A fenti szintézissel kapott foszforotioát- és foszfodiészter-kötések relatív mennyiségét időnként 31P-NMR spektroszkópiával ellenőriztük. A spektrumot szobahőmérsékleten, oldószerként deutérium-oxidot vagy deuterált dimetil-szulfoxidot (DMSO-d6) alkalmazva vettük fel. A foszforotioát minták általában 1%-nál kevesebb foszfodiészter-kötést tartalmaztak.
A második kiértékelést a tritilezett formában HPLC eljárással, PRP-1 oszlopon (Hamilton Co., Reno, Nevada) acetonitril grádiens alkalmazásával 50 mmol/1 trietil-ammónium-acetátban (pH 7,0) (4%-32% acetonitril 30 perc alatt, átfolyási sebesség 1,5 ml/perc) tisztított oligonukleotidokkal végeztük. A megfelelő frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk és szobahőmérsékleten 15 percen keresztül 5% ecetsavval kezeltük. Az oldatot azonos térfogatú etil-acetáttal extraháltuk, ammónium-hidroxiddal semlegesítettük, fagyasztottuk és liofilizáltuk. A HPLC-vel tisztított oligonukleotidok hatásukban nem különböztek lényegesen a kicsapott oligonukleotidoktól az ICAM-1 expressziójára végzett ELISA vizsgálatban.
4. példa
Sejtek tenyésztése és kezelése oligonukleotidokkal
Az A549 humán tüdőkarcinóma sejtvonalat [Lieber M. és munkatársai, Int. J. Cancer 17, 62-70 (1976)] az American Type Culture Collection-től (Bethesda MD) szereztük be. A sejteket 1 g/1 glukózt és 10% magzati borjúszérumot tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközegben (DMEM, Irvine Scientific, Irvine CA) tenyésztettük. A humán köldökvéna belhámsejteket (HUVEC) (Clonetics, San Diego CA) EGM-UV tápközegben (Clonetics) tenyésztettük. A HUVEC-et a második és a hatodik átoltás között használtuk. Az A431 humán felhámkarcinóma sejteket [Giard D. J. és munkatársai, J. Natl. Cancer Inst. 51, 1417-1423 (1973)] az American Type Culture Collectiontől (Bethesda MD) szereztük be, és 4,5 g/1 glukózt tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. A primer humán keratinocitákat a Cloneticstől szereztük be és KGM-ben (keratinocita tápközeg, Clonetics) tenyésztettük.
HU 217 107 Β
A 96 rezervoáros lemezeken tenyésztett sejteket háromszor mostuk 37 °C-ra előmelegített Opti-MEM tápközeggel (GIBCO, Grand Island NY). Minden egyes rezervoárba 100 pl Opti-MEM-ben 10 pg/ml N-[l(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetil-ammóniumkloridot (DOTMA, Bethesda Research Labs, Bethesda MD) adtunk a HUVEC sejtek esetében, vagy 20 pg/ml DOTMA-t adtunk az A549 sejtek esetében. Az oligonukleotidokat 0,2 pm Centrex cellulóz-acetát szűrőn (Schleicher és Schuell, Keene, NH) keresztül centrifugálva sterilizáltuk.
Az oligonukleotidokat 20-szoros töménységű törzsoldatként adtuk a rezervoárokba és 37 °C-on 4 órán keresztül inkubáltuk. A tápközeget eltávolítottuk és az oligonukleotidot a megadott koncentrációban tartalmazó 150 pl megfelelő tápközeggel helyettesítettük. A sejteket 37 °C-on további 3-4 órán keresztül inkubáltuk, majd 14-16 órán keresztül a megadott megfelelő citokinnel stimuláltuk. Az ICAM-1 expresszióját az 1. példában ismertetett módon határoztuk meg. A DOTMA jelenléte az oligonukleotiddal végzett inkubálás első órájában legalább 100-szorosra növelte az oligonukleotid hatását. Ez a hatásfokozódás összefüggésben van sejtek oligonukleotid-felvételének növekedésével.
5. példa
További antiszensz oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok ICÁM-1 génexpresszióra kifejtett hatásának ELISA vizsgálata interleukin-Ifi-val stimulált sejtekben
Az antiszensz oligonukleotidokat eredetileg úgy terveztük, hogy a humán ICAM-1 mRNS-en lévő öt célhellyel hibridizáljanak. Az oligonukleotidokat mind foszfodiészter (P=O, ISIS 1558, 1559, 1563, 1564 és 1565), mind foszforotioát (P=S, ISIS 1570, 1571, 1572, 1573 és 1574) formában előállítottuk. Az oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok az 1. táblázatban láthatók.
1. táblázat
Humán ICAM-1 elleni antiszensz oligonukleotidok
ISIS szám Szekvencia száma Célrégió Módosítás
1558 1. AUG kodon (64-81) P=O
1559 2. 5’-transzlatálatlan (32-49) P=O
1563 3. 3’-transzlatálatlan (2190-3010) P=O
1564 4. 3’-transzlatálatlan (2849-2866) P=O
1565 5. kódoló régió (1378-1395) P=O
1570 1. AUG kodon (64-81) P=S
1571 2. 5’-transzlatálatlan (32-49) P=S
1572 3. 3’-transzlatálatlan (2190-3010) P=S
1573 4. 3’-transzlatálatlan (2849-2866) P=S
1574 5. kódoló régió (1378-1395) P=S
1930 6. 5’-transzlatálatlan (1 -20) P=S
1931 7. AUG kodon (55-74) P=S
1932 8. AUG kodon (72-91) P=S
1933 9. kódoló régió (111 -130) P=S
1934 10. kódoló régió (351 -370) P=S
1935 11. kódoló régió (889-908) P=S
1936 12. kódoló régió (1459-1468) P=S
1937 13. terminációs kodon (1651-1687) P=S
1938 14. terminációs kodon (1668-1687) P=S
1939 15. 3 ’-transzlatálatlan (1952-1971) P=S
1940 16. 3’-transzlatálatlan (2975-2994) P=S
2149 17. AUG kodon (64-77) P=S
2163 18. AUG kodon (64-75) P=S
2164 19. AUG kodon (64-73) P=S
2165 20. AUG kodon (66-80) P=S
2173 21. AUG kodon (64-79) P=S
2302 22. 3’-transzlatálatlan (2114-2133) P=S
2303 23. 3’-transzlatálatlan (2039-2058) P=S
2304 24. 3’-transzlatálatlan (1895-1914) P=S
HU 217 107 Β
I. táblázat (folytatás)
ISIS szám Szekvencia száma Célrégió Módosítás
2305 25. 3’-transzlatálatlan (1935 — 1954) P = S
2307 26. 3’-transzlatálatlan (1976-1995) P=S
2634 1. AUG kodon (64-81) 2’-fluor-A, C és U P=S
2634 15. 3’-transzlatálatlan (1952-1971) 2’-fluor-A, C ésU
2691 1. AUG kodon (64-81) P=O kivéve az utolsó 3 bázis P=S
2710 15. 3’-transzlatálatlan (1952-1971) 2’-O-metil; P=O
2711 1. AUG kodon (64-81) 2’-O-metil; P=O
2973 15. 3’-transzlatálatlan (1952-1971) 2’-O-metil; P=S
2974 1. AUG kodon (64-81) 2’-O-metil; P=S
3064 27. 5’-CAP (32-51) P=S; G és C spacerként 3’-véghez adva
3067 27. 5’-CAP (32-51) P=S;
3222 27. 5’-CAP (32-51) 2’-O-metil; P=O
3224 27. 5’-CAP (32-51) 2’-O-metil; P=S
Az ICAM-1 expressziójának oligonukleotidok vagy oligonukleotid-analógok általi gátlását az interleukin-l3-val stimulált sejtek felületén ELISA vizsgálattal határoztuk meg az 1. példában leírtak szerint. Az oligonukleotidokat két különböző sejtvonalon vizsgáltuk. A foszfodiészter oligonukleotidok egyike sem gátolta az ICÁM-1 expresszióját. Ez valószínűleg a foszfodiészter oligonukleotidok sejtekben való gyors lebomlásának tulajdonítható. Az öt foszforotioát oligonukleotid közül a legaktívabb az AUG transzlációs iniciációs kodonnal hibridizáló ISIS 1570 volt.
Az öt eredeti célrégióval kapott kezdeti adatok alapján 12 további oligonukleotidot (ISIS 1930, 1940 és 3067, lásd 1. táblázat) terveztünk, amelyek az ICAM-1 mRNS-sel hibridizálódhatnak. Az az antiszensz oligonukleotid (ISIS 3067), amely a vélhető transzkripciós iniciációs hellyel (5’-CAP hely) hibridizál, közelítőleg olyan aktív volt az ΙΕ-Ιβ-val stimulált sejtekben, mint az AUG kodonnal hibridizáló oligonukleotid (ISIS 1570), amint a 8. ábrán látható. Az ISIS 1931 és 1932 az AUG transzlációs iniciációs kodontól 5’, illetve 3’ irányban hibridizálnak. Mind a három AUG régióval hibridizáló oligonukleotid gátolja az ICAM-1 expresszióját, azonban az ISIS 1932 aktivitása valamivel kisebb, mint az ISIS 1540 és ISIS 1931 aktivitása. Azok az oligonukleotidok, amelyek a ICÁM-1 mRNS kódoló régiójával hibridizálnak (ISIS 1933, 1934, 1935, 1574 és 1936) gyenge aktivitást fejtenek ki. Azok az oligonukleotidok, amelyek a transzlációs terminációs kodonnal hibridizálnak (ISIS 1937 és 1938), közepes aktivitást mutatnak. Meglepő módon a legaktívabb antiszensz oligonukleotid, az ISIS 1939 az ICAM-1 mRNS 3 ’-transzlatálatlan régiójában egy specifikus szekvenciához kötődik. Az ISIS 1939 által mutatott antiszensz aktivitást nem mutatták azok az oligonukleotidok (ISIS 1579, 1573, 1940), amelyek a 3’transzlatálatlan régióval hibridizálnak. Az ISIS 1940 amelynek célpontja a poliadenilációs jel - valójában nem is gátolja az ICÁM— 1 expresszióját.
Mivel az ISIS 1939 meglepő módon a legnagyobb antiszensz aktivitást mutatta a eredetileg vizsgált 16 oligonuklentid közül, további oligonukleotidokat is terveztünk, hogy az ICAM-1 mRNS 3’-transzlatálatlan régiójában lévő szekvenciával hibridizáljanak (ISIS 2302, 2303, 2304, 2305 és 2307, lásd 1. táblázat). Az ISIS 2307 - amely az ISIS 1939 célpontjától csak 5 bázissal 3’ irányban lévő hellyel hibridizálódik - volt a legkevésbé aktív a sorozatban (8. ábra). Az ISIS 2302 - amely az ISIS 1939 célpontjától 143 bázissal 3’ irányban lévő hellyel hibridizálódik - bizonyult a sorozat legaktívabb tagjának. A humán ICAM-1 mRNS 3’transzlatálatlan régiója várható másodlagos RNS-szerkezetét megvizsgálva [M. Zuker, Science 244, 48-52 (1989)] kitűnt, hogy mind az ISIS 1939, mind az ISIS 2302 azzal a szekvenciával hibridizál, amely előre láthatólag egy stabil gyökér-hurok szerkezetben van. A jelenlegi tanok szerint az RNS másodlagos szerkezetének régióit el kell kerülni akkor, amikor antiszensz oligonukleotidokat tervezünk. így az ISIS 1939 és ISIS 2302 ICAM-1 expressziót gátló hatását nem lehetett előre várni.
Megvizsgáltunk számos olyan antiszensz oligonukleotid-analógot is, amely a 2’-helyzetben tartalmaz módosítást. Az ISIS 15702’-O-metil-foszforotioát analógja, az ISIS 2974 aktivitása mintegy harmada az ISIS 1570 aktivitásának az ICAM-1 expresszi ójának gátlásában mind HUVEC, mind A549 sejteken. Ezzel szemben az ISIS 19392’-O-metil-foszforotioát analógja, az ISIS 2973 nem gátolja az ICAM-1 expresszióját egyik sejtvonaon sem. Hasonló eredményt kaptunk az ISIS 1570 és ISIS 19392’-fluor analógjával, az ISIS 2634gyel, illetve ISIS 2637-tel is.
Az ISIS 1821 kontroll oligonukleotid az ISIS 1934ével összemérhető aktivitással gátolta az ICÁM-1 expresszióját HUVEC sejteken; azonban A549 sejteken az ISIS 1821 kisebb aktivitást mutatott, mint az ISIS 1934. A negatív kontroll ISIS 1821 kismértékű aktivitást fejtett ki az ICAM-1 expressziójára, valószínűleg részben
HU 217 107 Β annak következtében, hogy képes az ICAM-1 mRNSsel hibridizálódni (12 vagy 13 bázis illeszkedéssel), 15 bázissal 3’ irányban az AUG transzlációs iniciációs kodontól.
Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy az ICAM-1 mRNS-ben az AUG transzlációs iniciációs kodon és a specifikus 3’-transzlatálatlan szekvenciák a legérzékenyebbek az ICAM-1 expresszió antiszensz oligonukleotid általi gátlására.
Az ICAM-1 humán köldökvéna sejteken és humán tüdőkarcinóma sejteken (A549) való expressziójának gátlásán kívül az ISIS 1570, ISIS 1939 és ISIS 2302 humán felhámkarcinóma A431 sejteken és primer humán keratinocitákon is gátolta az ICAM-1 expresszióját (9. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az antiszensz oligonukleotidok számos humán sejtvonalban képesek gátolni az ICÁM— 1 expressziót. Ezenkívül az oligonukleotidok hatáserősségének sorrendje mind a négy vizsgált sejtvonalon azonos volt. Az a tény, hogy az ICAM-1 expressziója primer humán keratinocitákban gátolható, igen nagy jelentőségű, mivel a felhám keratinociták az antiszensz oligonukleotidok egyik kívánt célpontját jelentik.
6. példa
ICAM-1 expresszió gátlása antiszensz oligonukleotidokkal egyéb citokinekkel stimulált sejtekben Két oligonukleotid, az ISIS 1570 és az ISIS
1939 TNF-a-val és IFN-T-val indukált ICAM-1 expressziót gátló hatását is megvizsgáltuk. Az A549 sejtek 1 μιηοΐ/l antiszensz oligonukleotiddal végzett kezelése szekvenciaspecifikus módon gátolta az IL— 1 β, TNF-α és IFN-τ által indukált ICAM-1 expressziót. Az antiszensz oligonukleotidok hasonló mértékben gátolták az ICAM-1 IL— 1 β és TNF-α által indukált expresszióját, míg az IFN-τ által indukált ICÁM-1 expresszió sokkal érzékenyebb volt az antiszensz gátlásra. A kontroll oligonukleotid - az ISIS 1821 - nem gátolta jelentős mértékben az ICAM-1 IL-Ιβ és TNF-α által indukált expresszióját, és az IFN-τ által indukált ICAM-1 expressziót gyengén gátolta. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
Citokin Antiszensz oligonukleotid ICAM-1 expressziót gátló hatása (kontroll %-a)
ISIS 1570 ISIS 1939 ISIS 1821
3 egység/ml IL-Ιβ 56,6±2,9 38,1 ±3,2 95±6,6
1 ng/ml TNF-a 58,l±O,9 37,6±4,1 103,5±8,2
100 egység/ml IFN-τ 38,9±3,0 18,3±7,0 83,0±3,5
7. példa
Antiszensz hatás megszüntetése értelmes szál kontroliakkal
Az ICAM-1 expressziójának antiszensz oligonukleotidok általi gátlása az ISIS 1570 és ISIS 1939 oligonukleotidok esetében visszafordítható oly módon, hogy az oligonukleotidokat a megfelelő értelmes szálakkal hibridizáljuk. Az ISIS 1570-nek megfelelő foszforotioát értelmes szál - az ISIS 1575 - önmagában alkalmazva enyhén fokozta az ΙΕ-Ιβ-val indukált ICAM-1 expressziót. Ha az ISIS 1570-et ekvimoláris mennyiségű ISIS 1575-tel előzetesen összekevertük a sejtekhez való adás előtt, az ISIS 1570 hatása teljesen gátlódott. Az ISIS 1939 komplementer szála, az ISIS 2115 a sejtekhez önmagában adva 46%-kal növelte az ICAM-1 expresszióját. Az ISIS 2115-öt az ISIS 1939-cel előzetesen hibridizálva az ISIS 1939 ICAM-1 expressziót gátló hatása teljes mértékben gátlódott.
8. példa
Oligonukleotid Tm értékének meghatározása
Annak eldöntésére, hogy ICAM-1 expresszió antiszensz oligonukleotidok általi gátlásának erőssége az oligonukleotidok célzott helyekkel szembeni affinitásának tulajdonítható-e, minden egyes oligonukleotid esetén termodinamikai méréseket végeztünk. A foszforotioátok formájában szintetizált antiszensz oligonukleotidokat a foszfodiészter formában szintetizált, megfelelő komplementer DNS-szekvenciákkal hibridizáltuk. Meghatároztuk az abszorpció változását a hőmérséklet függvényében az egyes oligonukleotid szálak 4 μιηοΐ/ΐ koncentrációja mellett, 100 mmol/1 nátriumiont, 10 mmol/1 foszfátot, 0,1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó pufferben (pH 7,0). A Tm értéket (oligonukleotid célzott: helyről való disszociációjának hőmérsékletét) és a duplex képződésének szabad energiáját az adatok kétállapotú modellhez illesztésével határoztuk meg, lineáris meredekségű alapértékekkel [Petersheim M. és D. H. Tumer, Biochemistry 22, 256-263 (1983)]. Az eredmények legalább három független kísérlet átlagát jelentik.
Ha az antiszensz oligonukleotidokat a foszfodiészter formában szintetizált komplementer DNS-szekvenciáikkal hibridizáltuk, az össze antiszensz oligonukleotid Tm értéke legalább 50 °C volt, az ISIS 1940 kivételével. Ezért az összes oligonukleotidnak képesnek kellett volna lennie a célzott ICÁM -1 mRNS-sel hibridizálni, ha a célszekvenciákkal érintkezésbe került. Meglepő módon az antiszensz oligonukleotidok hatáserőssége nincs közvetlen korrelációban sem a Tm, sem a AG°37 értékkel. A legnagyobb biológiai aktivitást mutató oligonukleotid, az ISIS 1939 Tm értéke kisebb volt, mint a legtöbb vizsgált ollgonukleotidé. Ezért a hibridizációs aktivitás nem elegendő a biológiai aktivitás biztosításához.
9. példa
Az oligonukleotid lánchosszának hatása az
ICAM-1 expressziójának antiszensz gátlására
Az oligonukleotid lánchosszának hatását az antiszensz aktivitásra az ISIS 1570 csonkított változatainak (ISIS 2165, 2173, 2149, 2163 és 2164) és az ISIS 1939
HU 217 107 Β csonkított változatainak (ISIS 2540, 2544, 2545, 2546, 2547 és 2548) alkalmazásával vizsgáltuk. Általában az antiszensz aktivitás az oligonukleotid hosszának csökkentésével csökkent. A 16 bázis hosszúságú oligonukleotidok aktivitása valamivel kisebb volt, mint a 18 bázis hosszúságú oligonukleotidoké. A 14 bázis hosszúságú oligonukleotidok aktivitása jelentősen kisebb volt, és a 12 vagy 10 bázis hosszúságú oligonukleotidok csak igen gyenge aktivitással rendelkeztek. Az oligonukleotid hossza és Tm, illetve az antiszensz aktivitás közötti összefüggés vizsgálata azt mutatta, hogy éles átmenet van a 14 és 16 bázis hosszúságok között, míg a Tm értéke a hosszal lineárisan növekszik (10. ábra).
10. példa
ICAM-1 antiszensz gátlásának specifitása
Az ISIS 1570 és ISIS 1939 antiszensz oligonukleotidok specificitását ICÁM-1-re 35S-jelzett proteinek immunprecipitálásával értékeltük ki. Az A549 sejteket 25 cm2-es szövettenyésztő lombikban összefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztettük, és a 4. példában leírt módon kezeltük az antiszensz oligonukleotidokkal. A sejteket 14 órán keresztül interleukin-iP-val stimuláltuk, 10% dializált magzati boíjúszérumot tartalmazó, metioninmentes DMEM-mel mostuk, és 1 órán keresztül inkubáltuk metioninmentes tápközegben, amely 10% dializált magzati borjúszérumot, 1 pmol/1 oligonukleotidot és a megadott koncentrációban interleukin1 β-t tartalmazott. A sejtekhez 100 pCi/ml aktivitásban 35S-metionin/cisztein elegyet (Tran35S-label, ICN, Costa Mesa, CA) adtunk, és 2 órán keresztül tovább inkubáltuk. A celluláris proteineket 50 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,0), 150mmol/1 nátrium-klorid, l,0%NP-40,0,5% dezoxikolát és 2 mmol/1 EDTA tartalmú pufferrel (rezervoáronként 0,5 ml) 4 °C-on 30 percen keresztül inkubálva extraháltuk. Az extraktumot 18000 g-vel 20 percen keresztül centrifugálva tisztítottuk. A felülúszót 200 pg protein G-Sepharose gyöngyön (Bethesda Research Labs, Bethesda, MI)) 4 °C-on 2 órán keresztül előadszorbeáltuk, egyenlő részekre osztottuk, és 4 °C-on 15 órán keresztül 5 pg ICÁM-1 monoklonális antitesttel (AMAC Inc., Westbrook, ME) vagy HLA-A,B antitesttel [W6/32, az ATCC-től (Bethesda, MD) beszerzett rágcsáló hibridóma sejtek termelik] inkubáltuk. Az immun-komplexeket 200 pl 50 térfogat%-os protein G-Sepharose szuszpenzióval 4 °C-on 2 órán keresztül inkubálva nyertük, majd lizáló pufferrel ötször mostuk és SDS-poliakrilamid gélben szétválasztottuk. A proteineket autoradiográfiásan detektáltuk.
Az A549 sejtek kezelése 5 egység/ml interleukinΙβ-val egy 95-100 kDa móltömegű, kettős sávként vándorló protein szintézisét eredményezte, amely az ICÁM-1-gyei szembeni monoklonális antitesttel immunprecipitált. A kettős sáv megjelenése véleményünk szerint az ICAM-1 eltérően glikozilezett formáinak tulajdonítható. A sejteket az ISIS 1570 antiszensz oligonukleotiddal 1 pmol/1 koncentrációban előkezelve az ICAM-1 szintézise mintegy 50%-kal nőtt, míg 1 pmol/1 ISIS 1939 az ICAM-1 szintézist közel a háttérértékre csökkentette. Az ISIS 1949 antiszensz oligonukleotid, amely az ICAM-1 ELISA vizsgálatában inaktív (1. és
5. példa), nem csökkentette jelentősen az ICÁM-1 szintézisét. Az ICAM-1 célpontokkal hibridizálódó antiszensz oligonukleotidok egyike sem fejtett ki mérhető hatást a HLA-A,B szintézisre, bizonyítván ezzel az oligonukleotidok ICAM-1-gyei szembeni specificitását. Ezenkívül az ICAM-1 antitesttel és protein G-Sepharose-zal nemspecifikusan precipitálódó proteinekre nem hatott jelentősen az antiszensz oligonukleotidokkal végzett kezelés.
11. példa
További antiszensz oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok szűrése ICÁM-1 elleni aktivitásra sejtadhéziós vizsgálattal
A humán köldökvéna belhámsejteket (HUVEC) a 4. példában leírtak szerint tenyésztettük és kezeltük az oligonukleotidokkal. A sejteket az ISIS 1939 antiszensz oligonukleotiddal, az ISIS 1940 inaktív antiszensz oligonukleotiddal vagy az ISIS 1821 kontroll oligonukleotiddal kezeltük 4 órán keresztül, majd 20 órán keresztül TNF-a-val stimuláljuk. Alapállapotban a HUVEC minimális, kötődik a HL-60 sejtekhez, míg a TNF-fel stimulált HUVEC az összes hozzáadott sejt 19%-át megköti. A HUVEC egysejtréteget 0,3 pmol/1 ISIS 1939-cel kezelve a HL-60 sejtekkel szembeni adhézió az alapértékre csökkent, ami all. ábrán látható. A kontroll ISIS 1821 oligonukleotid és az inaktív ISIS 1940 oligonukleotid a sejtadhéziót 19%-ról 9%-ra csökkentette. Ezek az adatok jelzik, hogy az ICÁM-1-et célzó oligonukleotidok specifikusan csökkentik egy leukocitaszerű sejtvonal (HL-60) adhézióját a TNF-a-val kezelt HUVEC-hez.
12. példa
További oligonukleotidok és oligonukleotid-analógok szűrése ELISA módszerrel ELAM-1 génexpresszió elleni aktivitásra
2-5-ször átoltott humán köldökvéna belhámsejteket (HUVEC) 96 rezervoáros lemezre szélesztettünk, és összefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztettük. A sejteket háromszor mostuk Opti-MEM-mel (GIBCO, Grand Island, NY). A sejteket 10 pg/ml DOTMA-t (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) tartalmazó Opti-MEM-oldattal hígított oligonukleotidok növekvő koncentrációival 37 °C-on 4 órán keresztül kezeltük. A tápközeget eltávolítottuk és EGV-UV (Clonetics, San Diego, CA) plusz oligonukleotiddal helyettesítettük. A közeghez 2,5 ng/ml koncentrációban hozzáadtuk a tumomekrózis-faktor Ó-t, és a sejteket 37 °C-on további 4 órán keresztül inkubáltuk.
Az ELAM-1 expressziót ELISA módszerrel határoztuk meg. A sejteket háromszor óvatosan mostuk 37 °C-ra melegített Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (D-PBS). A sejteket 95%-os etanollal 4 °C-on 20 percen keresztül fixáltuk, háromszor mostuk D-PBSsel, majd 2% BSA-t tartalmazó D-PBS-sel blokkoltuk. A sejteket 2% BSA-t tartalmazó D-PBS-sel 0,5 pg/ml-re hígított BBA-1 ELAM-1 monoklonális antitesttel (R&D Systems, Minneapolis, MN) 37 °C-on 1 órán keresztül kezeltük. A sejteket háromszor mostuk D-PBS13
HU 217 107 Β sel, majd a megkötött ELAM-1 antitestet az 1. példában leírtak szerint biotinilezett kecske anti-egér szekunder antitesttel, majd β-galaktozidázzal konjugált sztreptavidinnal detektáltuk.
Az ELAM-1 ELISA vizsgálattal meghatároztuk az ELAM-1 cDNS 11 különböző régióját célzó antiszensz foszforotioát oligonukleotid-analóg aktivitását, és kontrollként két ICÁM -1 -et célzó oligonukleotid aktivitását is. Az oligonukleotid-analógok és a megfelelő célrégiók a 3. táblázatban láthatók.
3. táblázat
Humán ELAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok
ISIS szám Szekvencia száma Cclrégió Módosítás
1926 28. AUG kodon (143-164) P=S
2670 29. 3’-transzlatálatlan (3718-3737) P=S
2673 30. 3’-transzlatálatlan (2657-2677) P=S
2674 31. 3’-transzlatálatlan (2617-2637) P=S
2678 32. 3’-transzlatálatlan (3558-3577) P=S
2679 33. 5’-transzlatálatlan (41-60) P=S
2680 34. 3 ’-transzlatálatlan (3715-3729) P=S
2683 35. AUG kodon (143-163) P=S
2686 36. AUG kodon (149-169) P=S
2687 37. 5’-transzlatálatlan (18-37) P=S
2693 38. 3’-transzlatálatlan (2760-2788) P=S
2694 39. 3’-transzlatálatlan (2934-2954) P=S
Az ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok esetében tapasztaltakkal (5. példa) ellentétben az ELAM-1 aktivitás leghatásosabb oligonukleotid modulátora, az ISIS 2679 az ELAM-1 5’-transzlatálatlan régiójában lévő specifikus szekvenciákkal hibridizált. Az az oligonukleotid, amely az ISIS 2679 céljától három bázissal felfelé végződő szekvenciákkal hibridizált (ISIS 2687), nem mutatott jelentős aktivitást (12. ábra). Ezért az ISIS 2679 az ELAM-1 mRNS egyedi helyével hibridizál, amely egyedülálló módon érzékeny az antiszensz oligonukleotidok általi gátlásra. A fenti hely érzékenysége az antiszensz oligonukleotid általi gátlásra nem volt előre látható az RNS másodlagos szerkezetéből várhatóan vagy a szakirodalmi ismeretek birtokában. Az ELAM-1 AUG kodonnal hibridizálódó oligonukleotidok közepes aktivitást mutattak (12. ábra).
Az azonosítási számokkal definiált szekvenciákat az alábbiakban ismertetjük.
1. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 18 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TGGGAGCCAT AGCGAGGC 10 2. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GAGGAGCTCA GCGTCGACTG
3. számú szekvencia 20 (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris 25 (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GACACTCAAT AAATAGCTGG T
4. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 18 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GAGGCTGAGG TGGGAGGA
5. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 18 40 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CGATGGGCAG TGGGAAAG
6. számú szekvencia (i) Szekvencia j ellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GGGCGCGTGA TCCTTATAGC 55 7. számú szekvencia (i) Szekvencia j ellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris
HU 217 107 Β (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CATAGCGAGG CTGAGG TTGC
8. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CGGGGGCTGC TGGGAGCCAT
9. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
AGAGCCCCGA GCAGGACCAG
10. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TGCCCATCAG GGCAGTTTGA
11. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GGTCACACTG ACTGAGGCCT
12. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CTCGCGGGTG ACCTCCCCTT
13. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TCAGGGAGGC ATAACTTGTG
14. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CCTGTCCCGG GATAGGTTC A
15. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 10 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CCCCCACCAC TTCCCCTCTC
16. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TTGAGAAAGC TTTATTAACT 25 17. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 14 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
AGCCATAGCG AGGC
18. számú szekvencia 35 (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 12 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris 40 (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CCATAGCGAG GC
19. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 10 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
ATAGCGAGGC
20. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 16 55 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TGGGAGCCAT AGCGAG
HU 217 107 Β
21. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 16 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GGAGCCATAG CGAGGC
22. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GCCCAAGCTG GCATCCGTCA
23. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TCTGTAAGTC TGTGGGCCTC
24. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői :
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
AGTCTTGCTC CTTCCTCTTG
25. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CTCATCAGGC TAGACTTTAA
26. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TGTCCTCATG GTGGGGCTAT
27. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 22 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC GA
28. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 22 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris 10 (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CAATCATGAC TTCAAGAGTC CT
29. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
ACCACACTGG TATTCACAC
30. számú szekvencia (i) Szekvencia j ellemzői:
(A) hosszúság: 21 25 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GTATGGAAGA TTATAATATA T
31. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CACAATCCTT AAGAACTCTT T 40 32. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
ACCTCTGCTG TTCTGATCCT
33. számú szekvencia 50 (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 20 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris 55 (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
CTGCTGCCTC TGTCTCAGGT
34. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 15
HU217 107Β (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
GGTATTTGAC ACAGC
35. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
AATCATGACT TCAAGAGTTC T
36. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TGAAGCAATC ATGACTTCAA G
37. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
TATAGGAGTT TTGATGTGAA
38. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői :
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:
ACAATGAGGG GGTAATCTAC A
39. számú szekvencia (i) Szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 21 (B) típus: nukleinsav (C) szál típusa: egyes (D) topológia: lineáris (iv) Antiszensz: igen (xi) Szekvencia leírása:

Claims (48)

1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy specifikusan hibridizálódik egy sejtadhézió módosítására képes proteint kódoló nukleinsav legalább egy részével.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy mRNS-sel hibridizálódik specifikusan.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy hármas szálú szerkezet kialakítása közben egy génnel hibridizálódik specifikusan, ezáltal módosítja a génből keletkező mRNS mennyiségét.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
4. A 2. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy egy transzkripciós iniciációs hellyel, egy transzlációs iniciációs hellyel, egy 5’-transzlatálatlan szekvenciával, egy 3’transzlatálatlan szekvenciával, egy exon/intron kapcsolódással vagy az mRNS egy közbeékelődő szekvenciájával hibridizálódik specifikusan.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
5. A 4. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy egy 5’-cap hellyel vagy egy azzal szomszédos szekvenciával hibridizálódik specifikusan.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy a protein az intercelluláris adhéziós molekula-1.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy a protein az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy a protein a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
9. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 3-mintegy 50 alegységből áll.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
10. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 8-mintegy 25 alegységből áll.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
11. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy mintegy 10-mintegy 20 alegységből áll.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
12. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal van elegyítve. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
13. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy az 2’-0-metil-, 2’-fluor-, foszforotioát-, 2’-O-metil-foszforotioátvagy 2 ’ -fluor- foszforotioát-származék.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
14. Oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy az 1. vagy 2. táblázatban megadott szekvenciát tartalmazza.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
HU 217 107 Β
15. A 14. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal van elegyítve. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
16. A 14. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg, azzal jellemezve, hogy az 2’-0-metil-, 2’-fluor-, foszforotioát-, 2’-O-metil-foszforotioátvagy 2 ’ -fluor-foszforotioát-származék.
(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
17. Eljárás oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg előállítására, amely specifikusan hibridizálódik egy sejtadhézió módosítására képes proteint kódoló nukleinsav legalább egy részével, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg szekvenciát szintetikus úton előállítjuk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mRNS-sel specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hármas szálú szerkezet kialakítása közben egy génnel specifikusan hibridizálódó, ezáltal a génből keletkező mRNS mennyiségét módosító oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy transzkripciós iniciációs hellyel, egy transzlációs iniciációs hellyel, egy 5’-transzlatálatlan szekvenciával, egy 3’-transzlatálatlan szekvenciával, egy exon/intron kapcsolódással vagy a mRNS egy közbeékelődő szekvenciájával specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 5’-cap hellyel vagy egy azzal szomszédos szekvenciával specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
22. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az intercelluláris adhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
23. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
24. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
25. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 3-mintegy 50 alegységből álló oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
26. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 8-mintegy 25 alegységből álló oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
27. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 10-mintegy 20 alegységből álló oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
28. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2’-O-metil-, 2’-fluor-, foszforotioát-, 2’-Ometil-foszforotioát- vagy 2’-fluor-foszforotioát-származék oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
29. Eljárás az 1. vagy 2. táblázatban megadott szekvenciát tartalmazó oligonukleotid vagy oligonukleotidanalóg előállítására, azzal jellemezve, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid-analóg szekvenciát szintetikus úton vagy enzimatikus úton állítjuk elő.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2’-O-metil-, 2’-fluor-, foszforotioát-, 2’-O-metilfoszforotioát- vagy 2’-fluor-foszforotioát-származék oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot állítunk elő.
31. Eljárás intercelluláris adhéziós molekulák szintézisének módosítására alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy, a sejtadhézió módosítására képes proteint kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé formálunk.
32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként mRNS-sel specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként hármas szálú szerkezet kialakítása közben egy génnel specifikusan hibridizálódó, ezáltal a génből keletkező mRNS mennyiségét módosító oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
34. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy transzkripciós iniciációs hellyel, egy transzlációs iniciációs hellyel, egy 5’transzlatálatlan szekvenciával, egy 3’-transzlatálatlan szekvenciával, egy exon/intron kapcsolódással vagy a mRNS egy közbeékelődő szekvenciájával specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
35. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy 5’-cap hellyel vagy egy azzal szomszédos szekvenciával specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
36. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az intercelluláris adhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
37. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
38. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
39. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. vagy 2. táblázatban meg18
HU 217 107 Β adott szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
40. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 2’-O-metil-, 2’-fluor-, foszforotioát-, 2’-O-metil-foszforotioát- vagy 2’-fluor-foszforotioát-származék oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
41. Eljárás állatok intercelluláris adhéziós molekulákban bekövetkező változásokkal módosítható betegségeinek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy, a sejtadhéziós molekulák szintézisét vagy metabolizmusát módosító proteint kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé formálunk.
42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy transzkripciós iniciációs hellyel, egy transzlációs iniciációs hellyel, egy 5’-transzlatálatlan szekvenciával, egy 3’-transzlatálatlan szekvenciával vagy az mRNS egy közbeékelődő szekvenciájával specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
43. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az mRNS egy 5’-cap helyével vagy az azzal szomszédos szekvenciákkal specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
44. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az intercelluláris adhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
45. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az endoteiiális leukocita adhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
46. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1-et kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálódó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
47. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. vagy 2. táblázatban megadott szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
48. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 2’-O-metil-, 2’fluor-, foszforotioát-, 2’-O-metil-foszforotioát- vagy 2’-fluor-foszforotioát-származék oligonukleotidot vagy oligonukleotid-analógot alkalmazunk.
HU9300373A 1990-08-14 1991-07-23 Sejtek adhézióját módosító oligonukleotidok, és eljárás ezek, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására HU217107B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56728690A 1990-08-14 1990-08-14

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9300373D0 HU9300373D0 (en) 1993-05-28
HUT68322A HUT68322A (en) 1995-06-28
HU217107B true HU217107B (hu) 1999-11-29

Family

ID=24266532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9300373A HU217107B (hu) 1990-08-14 1991-07-23 Sejtek adhézióját módosító oligonukleotidok, és eljárás ezek, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0544716B1 (hu)
JP (1) JP2732544B2 (hu)
KR (1) KR960009261B1 (hu)
AT (1) ATE230023T1 (hu)
AU (1) AU641539B2 (hu)
BR (2) BR9106746A (hu)
CA (1) CA2089563C (hu)
DE (1) DE69133180T2 (hu)
DK (1) DK0544716T3 (hu)
ES (1) ES2188581T3 (hu)
FI (1) FI930627A0 (hu)
HU (1) HU217107B (hu)
NO (1) NO930513L (hu)
WO (1) WO1992003139A1 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7449186B1 (en) 1990-08-02 2008-11-11 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods of blocking the interaction between stromal cells and hemopoietic cells with anti-VCAM-1 antibodies
US5827670A (en) * 1990-08-02 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods of isolating and detecting bone marrow stromal cells with VCAM-1-specific antibodies
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
WO1993014769A1 (en) * 1992-01-31 1993-08-05 The Regents Of The University Of California Method for making universal donor cells
IL101600A (en) * 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5596090A (en) * 1992-07-24 1997-01-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human VCAM-1 RNA
WO1994005333A1 (en) * 1992-09-02 1994-03-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US6399376B1 (en) * 1993-11-05 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
JPH08113591A (ja) * 1994-10-14 1996-05-07 Taiho Yakuhin Kogyo Kk オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤
WO1996039154A1 (en) * 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
DE10019252A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Klaus Karl Degitz Polydesoxyribonukleotide zur Hemmung der ICAM-1-Genexpression
CN104531843A (zh) * 2014-12-04 2015-04-22 杭州中翰金诺生物信息技术有限公司 肝癌诊断标志物黑素瘤细胞黏附分子及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006702A1 (en) * 1988-01-21 1989-07-27 Chemex Pharmaceuticals, Inc. Selective inhibition of gene expression by photoactivatable oligonucleotides
US5272263A (en) * 1989-04-28 1993-12-21 Biogen, Inc. DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS)

Also Published As

Publication number Publication date
HU9300373D0 (en) 1993-05-28
EP0544716B1 (en) 2002-12-18
WO1992003139A1 (en) 1992-03-05
BR1100617A (pt) 2000-06-13
KR960009261B1 (en) 1996-07-16
JPH05508998A (ja) 1993-12-16
ATE230023T1 (de) 2003-01-15
HUT68322A (en) 1995-06-28
KR930701180A (ko) 1993-06-11
NO930513L (no) 1993-04-01
DE69133180D1 (de) 2003-01-30
DK0544716T3 (da) 2003-03-17
NO930513D0 (no) 1993-02-12
CA2089563C (en) 2004-04-06
EP0544716A1 (en) 1993-06-09
ES2188581T3 (es) 2003-07-01
FI930627A (fi) 1993-02-12
CA2089563A1 (en) 1992-02-15
DE69133180T2 (de) 2003-07-24
FI930627A0 (fi) 1993-02-12
BR9106746A (pt) 1993-07-20
JP2732544B2 (ja) 1998-03-30
AU8313091A (en) 1992-03-17
EP0544716A4 (en) 1994-09-14
AU641539B2 (en) 1993-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5591623A (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5514788A (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5843738A (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
JP2948541B2 (ja) 細胞接着のオリゴヌクレオチド調節
HU217107B (hu) Sejtek adhézióját módosító oligonukleotidok, és eljárás ezek, valamint ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
WO1996018736A2 (en) Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US5883082A (en) Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
CA2130264A1 (en) Oligonucleotide modulation of cell growth
WO1998024797A1 (en) Antisense inhibition of human adhesion molecules
US5856099A (en) Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
WO1996015780A1 (en) Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
CA2158834C (en) Antisense oligos which interfere with mrna cap activity and inhibit translation
US6399376B1 (en) Modulation of vascular cell adhesive molecule expression through oligonucleotide interactions
US6849612B2 (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
MXPA99005066A (en) Antisense inhibition of human adhesion molecules

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee