HU216733B

HU216733B - Eljárás vaszkuláris szivárgás gátlására alkalmas gyógyszerészeti készítmények előállítására

Info

Publication number: HU216733B
Application number: HU9400742A
Authority: HU
Inventors: Edward T. Wei
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 1991-09-13
Filing date: 1992-08-04
Publication date: 1999-08-30
Also published as: AU659670B2; EP0603206A4; EP0603206A1; WO1993006130A1; US5374621A; NO940862D0; FI941186A; JPH06510784A; NO940862L; HU9400742D0; CA2118805A1; HUT69177A; AU2421492A; FI941186A0

Abstract

A találmány tárgya eljárás szöveti sérülésekkel kapcsőlatősvaszkűláris szivárgást gátló készítmények előállítására neűrőtenzin ésrőkőn peptidek alkalmazásával. A készítményekben a hatóanyag ismert,alábbi szekvenciájú: TN–A6–A5–Prő–A3–A2–Leű–OH peptid vagy azőksavakkal és/vagy bázisőkkal alkőtőtt addíciós sója, ahől A6 Arg vagyLys, A5 Asn, Ile, His vagy Arg, A3 Trp vagy Tyr, A2 Phe vagy Ile és TNH-, N-(2–5 szénatőmős)-alkanőil-csőpőrt, pGlű–Gly, H–Ile–Ala–Arg vagypGlű–Leű–Tyr–Glű–Asn–Lys–Prő. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás szöveti sérülésekkel kapcsolatos vaszkuláris szivárgást gátló gyógyszerészeti készítmények előállítására neurotenzin és rokon peptidek alkalmazásával.

Az emberi érhálózat mintegy 40-96 km hosszú, amelyen a szív naponta 4500-9000 liter vért pumpál át. E vaszkuláris hálózat legtávolabbi periferikus elágazásaiban a mikrokeringés képezi a tulajdonképpeni kicserélődési felületet, ahol a vér és a szövetek közötti tápanyagcsere és a salakanyagok eltávolítása végbemegy. Szövetkárosodás után (kémiai, fizikai vagy biológiai ágensek hatására) a mikrovaszkuláris áramlást szabályozó érzékeny helyi mechanizmusok károsodnak. Az érrendszer tágassága csökken, a vörösvértestek az érhez tapadnak, és egy kiülepedésnek nevezett jelenség során felhalmozódnak, és a vér tartalma a szövetekbe szivárog. Súlyos károsodás esetén, főként a légzőrendszerben, a mikrocirkuláció fenti változásai deformálhatják a szövetszerkezetet, akadályozzák az oxigén szállítását a sejtekhez, az érszakaszban nagyfokú folyadékveszteséget okoznak, és ezáltal életveszélyes állapotok, mint tüdőödéma, elektrolitegyensúly-zavar, sokk és más keringési rendellenességek kialakulásához vezetnek. Ezért a mikrocirkuláció megszakadása veszélyes, különösen akkor, ha a vértartalom nagy mértékben lép ki a szövetekbe.

A szöveti károsodás korábbi megítélésekor gyakran a gyulladás jeleire és tüneteire összpontosítottak, melyeket pír, duzzadás, hő és fájdalom jellemzett. A gyulladásos reakcióban kémiai mediátorként számos anyag, például hisztamin, szerotonin, kininek, prosztaglandinok, vérlemezke-aktiváló faktorok, leukotriének és - az idegvégződésekről - a P-anyag vesz részt. A heveny gyulladásos reakciók mediátorai szerepet játszanak a vaszkuláris permeabilitás fokozódásában, kemotaktikus ingerként hatnak a leukocitákra, fájdalmat váltanak ki, helyi ödémát és elhalást okoznak.

A gyulladásos folyamatokat alkotó biológiai események hatására számos fiziológiai válasz jön létre. Különböző szteroid és nemszteroid gyulladásgátlók ismertek. A vaszkuláris integritás megőrzése céljából a kutatások és gyógyszerfejlesztések a mikrocirkuláció megszakadását okozó gyulladásos mediátorok (a sérült szövetekből felszabaduló anyagok) antagonistáinak felfedezésére irányultak. A sérült szövetekből azonban számos gyulladásos mediátor szabadul fel.

Az 1989. január 1-jén nyilvánosságra hozott 4801 612 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint Wei egy betegnél a bőr és a nyálkahártya gyulladásos reakcióját „Corticotropin Releasing Factor” (CRF) vagy analógjai alkalmazása útján gátolta. A CRF gyulladásgátló agonistaként működik, azaz a CRF olyan anyag lehet, amely a szövetek reakcióját gyakorlatilag minden ismert gyulladásos mediátorral szemben hatásosan „kikapcsolja”. E kikapcsolómechanizmust a CRF-nek az epiteliális sejt-sejt, sejtszubsztrátum endoteliális kötőhelyekre gyakorolt agonista hatása indítja meg; e kötőhelyek aktiválják a sejt-sejt, sejt-szubsztrátum adhézió mechanizmusát úgy, hogy a sejt-sejt, sejt-szubsztrátum kapcsolódások és mátrixok szűkülése és feszesebbé válása megakadályozza a vaszkuláris szivárgást. A CRF a kortikoliberin család tagja.

A neurotenzin 13 aminosavmaradékot tartalmazó peptid, melyet először Carraway és Leeman írt le 1973ban. A xenopszinnak nevezett 8 tagú pepiidet béka bőrében körülbelül azonos időben fedezték fel Araki és munkatársai (1973). A neurotenzin és a xenopszin rokon szerkezetű peptidek, és különféle fiziológiai működéseket befolyásolnak, mint a véráramlást (a véredények kitágulását és a vérnyomás csökkenését okozva), az emésztést (e peptidek fokozzák a bél motilitását), hőmérséklet-szabályozást (e peptidek centrális injekciója a beadás helyén csökkenti a hőmérsékletet) és fájdalomérzet-csökkenést (e peptidek alkalmazása csökkenti a káros ingerekre adott motoros válaszokat). A neurotenzin magas hisztamint szabadít fel a hízósejtekből. Leeman az 1975. december 30-án nyilvánosságra hozott, 3 926756 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban „neurotenziri’-ként megjelölt, hipotalamuszból származó anyagot (és egy szintetikusan előállított tridekapeptidet) ismertet. A neurotenzin biológiai aktivitását a patkányoknál észlelt értágulat alapján írták le. Megfigyelték, hogy a peptid intravénás vagy intradermális injekciója után jelentősen fokozódik az ér permeabilitása. A xenopszinnak nevezett oktapeptidet, melynek aminosav-sorrendje hasonló a neurotenzinéhez, az 1975. december 23-án nyilvánosságra hozott, 3 928 306 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertette Uchiyama. Az oktapeptid csökkenti a vérnyomást és gyomorizom-összehúzódásokat okoz.

Foreman és munkatársai a neurotenzin és a P-anyag összefüggését vizsgálták, és feltételezték, hogy a neurotenzin patkányhízósejtek P-anyag receptorain és emberi bőrben részleges agonista hatást fejt ki [Brit. J. Pharmacol., 77, 531-539 (1982)]. A P-anyag antagonizmusa azonban nem jelent teljes gyulladásgátló hatékonyságot a sérülés okozta vaszkuláris szivárgással szemben.

A neurotenzin család néhány más tagját - melyeknek C-terminális régiója rendkívül hasonló - Carraway és Reinecke írta le a „Neurotensin and Related Peptides” közleményben (Comparative Physiology of Regulatory Peptides, Holmgren ed., Chapman and Hall, London, 1989,4. fejezet). Szerkezet/funkció vizsgálataik alapján a neurotenzin és rokon peptidek C-terminális részében az 5. vagy 6. maradék jelentőségére utaltak.

Úgy tűnik, hogy a peptidek C-terminális része a fejlődés folyamán nagymértékben konzerválódik. A fenti peptidcsalád hét peptidjének aminosavszekvenciáját a későbbiekben megadott A. táblázat mutatja.

A neurotenzin és rokon peptidek biológiai aktivitásának vizsgálata ellenére a kutatók nem írták le, hogy e vegyületek gyulladáscsökkentő agonistaként hatnának, és a CRF-hez hasonlóan a szövetek reagálását gyakorlatilag minden ismert gyulladásos mediátorral szemben „kikapcsolnák”. Ehelyett azt feltételezték, hogy a neurotenzin a keringési rendszerben a vaszkuláris szivárgás promotere, vagy általában gyulladásos mediátomak tekintették. Az

HU 216 733 Β irodalom alapos áttanulmányozása során sem találtunk olyan utalást, mely a találmány alapját képező felismerésre utalt volna.

Ezért a találmány szerint olyan gyógyszerkészítményeket állítunk elő, melyekben a hatóanyag ismert, alábbi szekvenciájú:

T_N-A₆-A₅-Pro-A₃-A₂-Leu-OH peptid vagy azok savakkal és/vagy bázisokkal alkotott addíciós sója, ahol

A₆ Arg vagy Lys, A₅ Asn, Ile, His vagy Arg, A₃ Trp vagy Tyr, A₂ Phe vagy Ile és T_N H-, N-(2-5 szénato5 mos)-alkanoil-csoport, pGlu-Gly, H-Ile-Ala-Arg vagypGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro.

A. táblázat

Xenopszin, neurotenzin és néhány más rokon peptid aminosavsorrendje

Xenopszin

Neurotenzin (ökör, nyúl, ember)

Neurotenzin (8-13)

N-Acetil-neurotenzin (8-13)

Neuromedin N

Kinetenzin

LANT-6 pGlu-Gly-Lys-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH

H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH

N-Acetil- Arg- Arg -Pro- Tyr- Ile - Leu - OH

H - Ly s - Ile - Pro - Tyr-Ile - Leu - OH

H-Ile-Ala-Arg-Arg-His-Pro-Tyr-Phe-Leu-OH

H-Lys-Asn-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH

Az 1. ábra grafikusan illusztrál egy olyan kísérletet, melynél kontroll konyhasóoldatot vagy neurotenzin különböző dózisait patkányok talpának bőre alá fecskendeztük, és lemértük a mancs térfogatát. A mancsot ezután 58 °C hőmérsékletű vízbe mártottuk, majd onnan kivettük. A függőleges tengely a mancs térfogatváltozását tünteti fel az eredeti térfogatra vonatkoztatva, míg a vízszintes tengely a hőhatás megszüntetése utáni perceket mutatja. A sajátos neurotenzin, amelyre a feltüntetett adatok vonatkoznak, neurotenzin (8-13).

A 2. ábra hasonló az 1. ábra grafikus ábrázolásához (az adatokhoz is hasonlóképpen jutottunk), de a használt sajátos, neurotenzinnel rokon peptid N-acetilneurotenzin (8-13).

A 3. ábra a neurotenzin család öt peptidjének logprobit dózis/hatás görbéjét mutatja a hővel kiváltott lábödématesztben. Az 1 vegyület xenopszin, a 2 vegyület neurotenzin, a 3 vegyület neurotenzin (8-13), a 4 vegyület N-acetil-neurotenzin (8-13) és az 5 vegyület neuromedin N, és az iv. dózisokat nmol/testsúly-kg formájában adtuk meg; a függőleges tengelyen az ödéma mértékét a konyhasós kontroll %-ában tüntettük fel.

A 4. ábra az idő függvényében ábrázolja a neurotenzin család három peptidjének a vérnyomásra gyakorolt hatását 10 nmol/kg peptid iv. befecskendezése után (a vérnyomás mmHg-ban megadott artériás középnyomás).

A találmány egyik tárgya eljárás szövetsérülés okozta vaszkuláris szivárgás gátlására, mely szerint a szövetbe hatásos mennyiségű neurotenzint vagy neurotenzinnel rokon peptidet juttatunk be.

Az állatoknak beadott, neurotenzinnel rokon peptidek csillapítják a bőr hőhatásra létrejött duzzadását. Ezenfelül a neurotenzinnel rokon peptidek megvédik az agykéreg, a vázizom és az alsó légutak véredényeit a sérülés okozta vaszkuláris szivárgástól. Úgy látszik, hogy a neurotenzin és a vele rokon peptidek átfogó védőhatást gyakorolnak a különböző érrendszerek mikrocirkulációjára, és így e peptidek különféle szövetkárosodások kezelésére használhatók.

A neurotenzin és a neurotenzinnel rokon peptidek a szövetkárosodást követő vaszkuláris szivárgás gátló anyagai. Ez azt jelenti, hogy gyulladásellenes agonistákként hatnak, úgyhogy alkalmazásuk a szöveti választ gyakorlatilag minden ismert gyulladásos mediátorral szemben hatásosan „kikapcsolja”. Például a neurotenzin és a vele rokon peptidek mintegy 10 mmol/kg iv. dózisa károsító stimulus, mint hőhatás után a lábödéma növekedését 60-80%-kal gátolja. A neurotenzin és a vele rokon peptidek védőhatása az agy-, tüdő- és izomszövetben is megnyilvánul.

Minthogy a neurotenzin (és a neurotenzinnel rokon peptidek) gyulladásellenes agonistáknak bizonyultak, széles körű klinikai alkalmazásokra van lehetőség kü30 lönböző szövetek sérülés utáni vaszkuláris szivárgásának megakadályozása céljából. E peptidek klinikai alkalmazását a bőr és nyálkahártyák (szemhéjak, orr-, szájgarati hártyák, felső légutak, nyelőcső, alsó emésztőcsatorna, hólyag), vázizom, sima izom, szívizom, agyi erek és a tüdő- és veseerek sérülésénél javasolják. E peptidek potenciálisan például az alábbi szövetkárosodásoknál használhatók:

Hő okozta égések, besugárzás okozta égések, fagyás vagy a bőr egyéb gyulladásos állapotainál a neurotenzin és a rokon peptidek a duzzadás, fájdalom és plazmaszivárgás csökkentésére használhatók.

Az alsó légutak sérülésekor, bal kamrai elégtelenség, „aduit respiratory distress syndrome” (ARD) okozta tüdőödéma csökkentésére, a tüdőalveolusok daganatgátló szerek vagy környezeti vegyszerek, mint nitrogén-oxidok, paraquat vagy ózon okozta toxikus károsodása ellen a peptidek hatásosan alkalmazhatók.

A szövetek szakadásos vagy traumás sérülésénél, amelyek késsel ejtett sebek, sebészeti műtétek vagy au50 tóbalesetek után előfordulhatnak, a peptidek a duzzadás, fájdalom és gyulladás csökkentésére használhatók.

Szöveti hipoxiát, isémiás anoxiát és ödémát okozó szövetelhalásoknál, aminők agyi hűdés vagy szívizominfarktus után létrejöhetnek, a neurotenzin és a rokon peptidek a vérlemezkéknek a szövetek sejtközötti állományába való kilépésének csökkentésére és a megmaradt szövetek túlélésének növelésére használhatók.

Az endotheliumot közvetlenül károsító endogén vagy exogén vegyi anyagok, mint a szeptikus sokk klini60 kai állapotához vezető endotoxinok vagy gyulladásos

HU 216 733 Β mediátorok hatásának megelőzése céljából adva a neurotenzin és rokon peptidek hatásosan csökkentik a vértérfogat veszteségét.

A neurotenzin és rokon peptidek csökkentik az agyi ödémát, melyet traumás fejsérülés, áttétképző vagy primer daganat vagy agyon belüli vérzések okozhatnak.

E peptidek alkalmazását szervek, mint vese, máj vagy szív transzplantáció előtti vagy alatti eltávolításakor az érhálózat épségének megtartása céljából javasolják.

A peptidek intravaszkulárisan (például 0,001-1 mg/kg) vagy helyileg (például belégzéssel vagy bőrön alkalmazva) használhatók 0,001-5 mg/kg dózisban sérülés vagy szándékos lézió (mint hasi vagy ortopédiai sebészet) után a sérülés okozta vaszkuláris szivárgás megelőzésére vagy gátlására. A peptideket előnyösen mintegy 5-10 μg/kg iv. dózisban alkalmazzuk. így például egyedi vagy különálló injekciók állíthatók elő, vagy a peptidek folyamatos infúzióként adhatók néhány óra és - súlyos állapotokban, mint szeptikus sokk vagy trauma esetén - két hét közötti időtartamon át 0,01-1 mg/kg dózisokban. A rokon hexapeptid neurotenzinek - neurotenzin (8-13) és N-acetilneurotenzin (8-13) - különösen előnyösek kisfokú hipotenzív hatásuk következtében.

A peptidek gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval, mint izotóniás sóoldattal, foszfátpuffer oldattal vagy hasonlóval elkeverve használhatók. Helyi alkalmazás is lehetséges, minthogy e peptidek viszonylag kicsik.

Kis peptidek ormyálkahártyán át történő alkalmazásához megfelelő készítményeket és kötőanyagokat írnak le például a Sandoz Limited 1988. február 24-én közzétett, 8719248 számú egyesült királyságbeli szabadalmi leírásában. Az ép bőrön való áthatolás elősegítése céljából a helyileg használt készítmények előnyösen potencírozóanyagot tartalmaznak; sok ilyen anyagot ismertet Sípos az 1978. május 23-án nyilvánosságra hozott 4091090 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.

A peptidek szerves és szervetlen savakkal gyógyszerészetileg elfogadható sókat képeznek, és só formában alkalmazhatók. Gyógyszerészetileg elfogadható sók előállítására alkalmas sav például a sósav, kénsav, foszforsav, ecetsav, benzoesav, citromsav, malonsav, szalicilsav, almasav, fumársav, borostyánkősav, borkősav, tejsav, glukonsav, aszkorbinsav, maleinsav, benzolszulfonsav, metán- és etánszulfonsav, hidroximetán- és hidroxi-etánszulfonsav.

Gyógyszerészetileg elfogadható szerves bázisokkal alkotott addíciós sók is előállíthatók. A szerves bázisok e csoportjának korlátáit a szakember könnyen felismeri. E csoporthoz tartoznak például mono-, di- és trialkilaminok, mint metil-amin, dimetil-amin és trietil-amin; mono-, di- vagy trihidroxi-alkil-aminok, mint mono-, di- és trietanol-amin; aminosavak, mint arginin és lizin; guanidín; N-metil-glükózamin; L-glutamin; N-metilpiperazin; morfolin; etilén-diamin; N-benzil-fenetilamin; trisz(hidroxi-metil)-amino-metán; és hasonlók. [Lásd például a „Pharmaceutical Salts” közleményt, J. Pharm. Sci., 66, 1-19.(1977)].

A peptidek különböző alkalmas kémiai eljárásokkal, előnyösen kézi vagy automatizált, szilárd fázisú szintézissel állíthatók elő. E módszert Merrifield R. B. fejlesztette ki, és Stewart J. M. és Joung J. D. írta le a „Solid Phase Peptide Synthesis” kézikönyvben (1984). A kémiai szintézis az aminosavakat előre meghatározott sorrendben kapcsolja össze a C-terminális aminosavnál elkezdve. A szilárd fázisú módszereknél a C-terminálison megvédett alfa-aminosavat alkalmas gyantahordozóval kapcsolják össze. A leírt peptidekhez benzhidril-amin- (BHA) és 4-metil-benzhidril-amin(MBHA) gyantára van szükség a C-terminális amid előállítása céljából. Szintézis előtt az aminosavak alfaaminocsoportját meg kell védeni, hogy az előző csoporttal (vagy gyantahordozóval) megfelelő peptidkötés alakuljon ki. Miután a karboxilvégen a kondenzációs reakció végbement, az alfa-aminocsoportot eltávolítjuk, és összekapcsoljuk a következő taggal. Az alfa-aminovédőcsoportok számos osztályát leírták a szilárd fázisú peptidszintézist ismertető, fentebb idézett munkában. A korszerű védőcsoportok közül jelentős a savval eltávolítható, uretán típusú terc-butil-oxi-karbonil-védőcsoport (BOC). Más védőcsoportok és ezekhez megfelelő kémiai stratégiák is alkalmazhatók, beleértve a bázissal lehasítható 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil(FMOC) csoportot. A szintézis befejezéséig átmeneti védelemre szorulnak az aminosavak reakcióképes oldalláncai is. A funkciós csoportokat blokkoló csoportok komplex sorát, valamint használatuk stratégiáit és korlátáit tekintette át Bodansky M. („Peptide Synthesis”, 1976) és Stewart J. M. és Joung J. D. [“Solide Phase Peptide Synthesis” (1984)].

A szilárd fázisú szintézis a kívánt C-terminális, alfavédett aminosavmaradék „oldhatatlan” védőcsoporthoz (a gyantához) való összekapcsolásával kezdődik. A kapcsoláshoz szükséges aktiválóreagens például N,N’diciklohexil-karbodiímid (DCC) lehet 1-hidroxi-benzotriazollal (HOBT) együtt vagy anélkül, diizopropilkarbodiimid (DIIPC) vagy etil-dimetil-amino-propilkarbodiimid (EDC). A C-terminális maradék hozzákapcsolása után az alfa-amino-védőcsoportot trifluor-ecetsawal (±25%) diklór-metánban távolítjuk el sav hatására lehasadó terc-butil-oxi-karbonil- (BOC) védőcsoport esetében. Trietil-aminnal (10%) diklór-metánban semlegesítve a szabad aminhoz jutunk (a sóval szemben). Miután a C-terminális részhez hozzáadtuk a gyantát, a védőcsoport-eltávolítás, a semlegesítés és kapcsolás ciklusát a közbenső mosási műveletekkel együtt megismételjük a védett peptidlánc növelése céljából. Alkalmas oldószerben a védett aminosavakat feleslegben (3-5szörös), a kapcsolóreagenst ekvimoláris arányban alkalmazzuk. Végül a teljesen megvédett peptid felépítése után reagensek segítségével megszüntetjük a gyanta és a peptid kapcsolatát, és eltávolítjuk az oldallánc védőcsoportjait. Az enyhe savas behatásra lehasadó tercbutil-oxi-karbonil-csoportot (BOC) vízmentes hidrogénfluoriddal hasítjuk le. Különböző nukleofil „scavanger”ek, mint dimetil-szulfoxid és anizol segítségével kerüljük el a mellékreakciókat, különösen az oldallánc funkciós csoportjain.

HU 216 733 Β

Kísérleti rész

1. példa

A bőr hőkárosítása. A neurotenzinnek és rokon peptideknek hőkárosodás utáni ödémát csökkentő képességét úgy vizsgáltuk, hogy az elaltatott patkányok mancsát 1 percen át meleg vízbe (58 °C) merítettük, majd lemértük a mancs térfogatváltozását és a víztartalom növekedését. Ezeket az általános módszereket másutt részletesen leírtuk [lásd Wei és munkatársai, J. Pharmacol. Exp. Ther., 247, 1082-1085 (1988)]. A Peninsula Laboratories vagy Bachem Laboratories által rendelkezésre bocsátott peptideket steril sóoldatban oldottuk fel, és a hőbehatás előtt 10 perccel intravénásán fecskendeztük be.

Neurotenzin (8-13) pepiiddel végzett jellemző kísérletet mutat be az 1. ábra. Miután a sóoldattal kezelt állat mancsát kiemeltük az 58 °C-os vízből, a mancs bőre piros lett, majd fokozatosan dagadni kezdett, 5 perc alatt a kezdeti mintegy 1,5 ml térfogat 0,77 ml-re növekedett. 30 perc múlva a sóoldattal kezelt csoport lábtárfogata 1,41 ml-rel növekedett. így a neurotenzin (8-13) dózisfuggően csökkentette a duzzadási reakciót.

Peptidek hatékonyságát a következő eljárással ha10 sonlítottuk össze. A hőkezelés után 30 perc múlva a patkányokat tömény nátrium-pentobarbitál-túladagolással megöltük, mindkét mancsukat a bokaízületnél levágtuk és lemértük. A mancsokat azután 80 °C-on szárítószekrényben 24 órán át szárítottuk, és ismét lemértük a víz15 tartalom%-os növekedésének megállapítása céljából:

(hőkezelt mancs nedvestömege-hőkezelt mancs száraztömege)

-=víztartalom%-os növekedése (kezeletlen mancs nedvestömege-kezeletlen mancs száraztömege)

A peptidek ödémát gátló képességét a sóval kezelt kontrollcsoport százalékában fejeztük ki, és minden peptidre kiszámítottuk az 50%-os hatásos dózist (ED₅₀). Az 1. táblázat eredményei szerint a xenopszin és a neurotenzinnel rokon peptidek hatásos ödémagátló vegyületek, minthogy μg dózisokban hatékonyak.

1. táblázat

Xenopszin, neurotenzin és más peptidek gyulladásgátló hatékonysága hőkárosítás esetében

	Dózistartom ány, nmol/kg	ed₅₀, nmol/kg	ed₅₀, H&Tíg
Xenopszin	0,25-2,0	0,9	0,88
Neurotenzin (NT)	0,50-4,0	1,5	2,5
NT (8-13)	0,75-6,0	1,9	1,6
N-Ac-NT (8-13)	0,75-6,0	2,1	1,8
Neuromedin N	5-40	10,0	7,5
Kinetenzin	200-800	ED₂₀:420=492 pg

LANT-6, a csirkében talált hexapeptid neurotenzin fragmens is hatásosan gátolja az ödémát. 0,5 mg/kg iv. dózisa a duzzadást 69±2%-ról 22±l%-ra csökkenti (n=6 pár, p<0,001). A fenti adatok azt mutatják, hogy e peptidek a bőr duzzadását is gátolni tudják. További kísérleteket végeztünk, melyek szerint e peptidek a nyelőcső, légcsős, hólyag nyálkahártya-duzzadását és a vázizom, tüdő és agy ödémáját is visszaszorítják (lásd alább). Kísérleteink azt mutatják, hogy e peptidek széles spektrumú gyulladásgátló aktivitással rendelkeznek.

2. példa

A kísérleteket 260±6 g tömegű hím Sprague-Dawley patkányokon végeztük (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Az állatok hasüregébe 60 mg/kg nátriumpentobarbitált fecskendeztünk. 10-15 perc múlva, amikor az alvást a felegyenesedési reflex vesztesége és farokbecsípéskor a motoros reflex kiesése jelezte, a véredényekből kilépő makromolekulák kimutatása céljából intravénásán Monastral blue B festék (Sigma Co., St. Louis, MO) konyhasóoldatos szuszpenzióját [30 mg/ml] fecskendeztük be a combi véna ágába 60 mg/kg dózisban, 0,2 ml/100 g testtömeg/min ütemben. A vaszkuláris szivárgást kiváltó eljárásokat a Monastral blue infúzió után 3 perc múlva kezdtük el alkalmazni.

Vázizom-károsítás. A hasat leborotváltuk, és sziké30 vei 4 cm-es középvonalú vágást ejtettünk. A bőrt kézzel széthúztuk, majd azonos hosszúságú bemetszést csináltunk az egyenes hasizomban, és a bőrt összehúztuk a seb elfedése céljából. A hasüregmegnyitás után 30 perc múlva a patkányokat pentobarbitál iv. túladagolásával megöltük, és a bemetszés körüli bőrt és izmot kivágtuk, és pufferrel semlegesített 10% formaiinnal (NBF) legalább 2 napig rögzítettük a vizsgálat előtt.

Agykéreg-károsítás. Agyszövetben az ér eredetű ödéma e modelljét először Chan és munkatársai (1983) írták le. Altatott patkányokat Dávid Kopf-féle sztereotaxikus készüléken rögzítettük, és a leborotvált fejbőr középvonalában 2-2,5 cm bemetszést végeztünk. A bőrt és a kötőszövetet széthúzva a koponyára szárazjéggel és acetonnal megtöltött rézedénnyel összekötött, -50 °C-on tartott 60 mm² lemezt helyeztünk 4 percre. Egy óra múlva az állatot az aortán át fiziológiás sóoldattal, majd 10 NBF-nal perfundáltuk, az agyat eltávolítottuk, és további vizsgálat előtt legalább 2 napon át 10% NBF-ban rögzítettük. Az agy50 kérget borító hártyarészeket is elkülönítettük az alatta lévő szövetektől, és külön vizsgáltuk.

A vaszkuláris szivárgás mennyiségi értékelése. A festékeloszlás területének és a szövetfelszín festődési intenzitásának méréséhez képalkotó eljárást használtunk (JA55 VA, Jandel Videó Analysis System, Corte Madera, CA), melynél a szürke szín különböző intenzitású csúcsaiból összetevődő videoképet numerikusán analizáltuk. A hasizom- és agymintákat nem visszaverő bevonattal ellátott lemezre helyeztük, melyet a szövetek felett 1,65 m-re el60 helyezett hat 60 wattos fluoreszkáló égő világított meg,

HU 216 733 Β

2. táblázat

N-Acetil-neurotenzin (8-13) [AcNT8-13] hasüregmegnyitás után gátolja a hasizomból való vaszkuláris szivárgást és a képeket a fenti állandó körülmények között, nagyítás nélkül videofilmre vettük fel. A festékeloszlás területeit pontkijelölő egérrel körülhatároltuk, és így a megjelölt területekben megkaptuk az átlagos intenzitást. A fényintenzitást a JAVA-rendszeren úgy kalibráltuk, hogy fehér szűrőpapírra különböző koncentrációjú Monastral blue B-t [0,0625-16 mg/ml] vittünk fel, és az intenzitás skáláját 0 és 255 egység közé állítottuk be. A fényintenzitás, azaz a tetszőleges egységekben kifejezett kékség foka és a Monastral blue B koncentráció [mg/ml] összefüggése: fényintenzitás=124+116 lóg MB, egy lineáris regreszszióval kapott egyenlet, ahol a korrelációs együttható r=0,98. A „lézióméret” megjelölés, amely a festődés területének és a fényintenzitásnak a szorzata, a vaszkuláris szivárgás kétdimenziós meghatározására vonatkozik. Ezt az értékelést megfelelőnek tartjuk, minthogy a sérülések az izom és agykéreg felületét érintik, és a léziók mélysége nem több néhány mm-nél. A véredényekből történő szivárgás helyének további jellemzése céljából a mintegy 500 μιη vastagságú izom- és agykéregmintákat mikroszkópos vizsgálathoz glicerin-zselatinba ágyaztuk be.

Használt reagensek és statisztikai módszerek

Xenopszint, neurotenzint és neurotenzinnel rokon peptideket (szilárd fázisú eljárással szintetizálva és nagynyomású folyadékkromatográfiával 95%-nál nagyobb tisztaságig megtisztítva) a Peninsula Laboratories (Belmont, CA) vagy Bachem Corp. (Torrance, CA) cégektől szereztük be, és injekciókészítéshez steril fiziológiás sóoldatban oldottuk fel. Az állatokat a kezeléshez véletlenszerűen választottuk ki párosított kontrolltervezet szerint, csoportonként legalább 6 patkányt használva. Az adatokat középértékek formájában adtuk meg a középérték szórásával (±S. Ε. M.) együtt, és az ED₅₀ értékeket és a 95% megbízhatósági intervallumokat Litchfield és Wilcoxon (1949) módszerével számítottuk ki. A csoportokat Student-féle t-próbával hasonlítottuk össze.

Eredmények

A hasüregmegnyitás után néhány percen belül kékes elszíneződés jelent meg a hasi izomzat felszínén és a környező bőrön, és a festődés 30 perc múlva mintegy 750-850 mm² területre terjedt ki. Mikroszkópos vizsgálat szerint a kék színt a Monastral blue festék szivárgása okozta a legfeljebb 15 pm átmérőjű kis erekből és a vázizomban látott jellemző mintázatot mutatta. Egyes mintáknál a pigment az erekből a kötőszövetbe diffundált. 5 perccel a hasüregmegnyitás előtt vagy után befecskendezett N-acetil-neurotenzin (8-13) 4 nmol/kg iv. dózisa jelentősen csökkentette a festődés területét és intenzitását (2. táblázat), összehasonlítva a konyhasóval kezelt kontrollcsoportokkal.

Az agykéreg fagyasztás okozta károsodása mintegy 38 mm² festődést eredményezett. Mikroszkóposán megfigyeltük, hogy a kék festék beágyazódott a kéreg kis ereinek falába. A fagykárosítás előtt beadott Nacetil-neurotenzin (8-13) 4 mmol/kg iv. dózisa csökkentette a festékszivárgás területét és intenzitását, és az általános lézió kiterjedését (3. táblázat).

A festékszivárgás gátlása mind az agyhártyában, mind az agykéreg felületi rétegeiben megfigyelhető volt.

Idő (min)		Terület (mm²)	Intenzitás	Lézióméret (xl04)
-10	SÁL	852±27	149±2	12,7±0,4
	AcNT8-13	399±18*	126±2	5,0±0,2*
+5	SÁL	758±39	137±3	10,4 ±0,5
	AcNT8-13	493±27*	108±5*	5,3±0,4*

mmol/kg sóoldatot (SÁL) vagy AcNT8-13-at fecskendezünk be intravénásán a hasüregmegnyitást követő 5 perc múlva. Izommintákat a hasüregmegnyitás után 30 perc múlva veszünk, és a kékre festődött szövetet és a szín intenzitását képelemző rendszerben határozzuk meg. Az adatok középértékek ±S. Ε. M.

* p<0,01 a sóoldattal kezelt kontrollal szemben, N=6-8/csoport (Student-teszt).

3. táblázat

N-Acetil-neurotenzin (8-13) [AcNT8-13] fagykárosítás után gátolja az agykéregből való vaszkuláris szivárgást

Kezelés	Terület (mm²)	Intenzitás	Lézióméret (xl03)
Sóoldat	38±2	151±4	5,7 ±0,2
AcNT8-13	21±2*	119±4	2,4±0,3*

Az agykéreg károsítása előtt 10 perccel 4 mmol/kg sóoldatot vagy AcNT8-13-at fecskendezünk be intravénásán. 60 perc múlva az agyat perfündáljuk, és képanalízishez eltávolítjuk. Az adatok középértékek ±S. Ε. M.

* p<0,01 a sóoldattal kezelt kontrollal szemben. N=8/csoport (Student-féle t-próba).

3. példa

Tüdőkárositás. Patkánynál epineffin (Epi) iv. injekciója után perceken belül heveny tüdőödéma hozható létre. E jelenséget 1904-ben először Meltzer írta le, és az ödéma kialakulásának okát a vérelosztás gyors megváltozásában látta, amikor a vér a szisztémás keringésből a tüdővérkörbe áramlik át. A tüdőben a mikrovaszkuláris nyomás növekedése átmeneti, de ahhoz elegendő, hogy a kis véredények endotheliumát közvetlenül károsítsa, fokozza az ér permeabilitását és vérzést okozzon. A „nyomás”-ödéma e típusa az alsó légiit érzékeny hártyáinak hidraulikus károsodását reprezentálja.

260±9 g tömegű hím Sprague-Dawley patkányokat (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA) használunk a kísérletekhez. Az állatokat intraperitoneálisan nátrium-pentobarbitállal elaltatjuk, majd sóoldatot vagy 10 nmol/kg neurotenzint, neurotenzin (8-13)-at vagy N-acetilneurotenzin (8-13)-at fecskendezünk be intravénásán, az 1-Epi-bitartarát iv. injekciója előtt 10 perccel. Az Epi dózisa 10 pg/kg, amely 30 nmol/kg bázissal egyenértékű. Minden dózis a bitartarátsóra vonatkozik. Az Epi egysze6

HU 216 733 Β ri dózisa elegendő ahhoz, hogy a pentobarbitállal altatott patkányban nem halálos tüdőödémát hozzon létre. Az Epi-injekció után 30 perc múlva az állatokat tömény pentobarbitál oldattal megöljük, és a tüdőket eltávolítjuk. A tüdőödéma mértékét Poulsen (1954) eljárásával határozzuk meg. A tüdőket papírvattával leitatjuk, és lemérjük (nedvestömeg), majd 24 órán át 80 °C-on szárítószekrényben tartjuk, és ismét leméijük (száraztömeg). A [nedvestömeg-száraztömegj/testtömeg érték 1000szeresét ödémaindexnek nevezzük.

Minden adat középérték ±S. E. M. A statisztikai szignifikanciát varianciaelemzéssel (ANOVA) és studentizált „range”-teszttel határoztuk meg.

Eredmények pg/kg Epi-bitartarát iv. injekciója az altatott patkányoknál nehézkes légzést és tüdőödéma-kialakulást eredményezett: a konyhasóval kezelt patkányoknál az ödémaindex 3,6+0,1 (N=6) volt, és az Epi-vel kezelt állatoknál 6,2+0,3 értékig emelkedett. Hasonló testsúlyú normál állatokhoz viszonyítva az Epi-injekció 30 perc alatt 72%-kal növelte a tüdő tömegét. Neurotenzin, neurotenzin (8-13) és N-acetil-neurotenzin (8-13) gátolta a tüdőödéma kifejlődését (4. táblázat).

4. táblázat

Neurotenzin és rokon peptidek gátolják az epinefrin okozta tüdőödémát

Kezelések	Ödémaindex
Sóoldat+sóoldat	3,6+0,1
Sóoldat+Epi	6,2+0,3
Neurotenzin+Epi	4,0+0,1*
Neurotenzin (8- 13)+Epi	4,7+0,2*
N-Ac-Neurotenzin (8-13)+Epi	4,9+0,2*

lOpg/kg iv. 1-epinefrin-bitartarát beadása előtt 10 nmol/kg peptidet fecskendezünk be intravénásán. A tüdőket az Epi beadása után 30 perc múlva távolítjuk el.

* p<0,01 a sóoldat+Epi-csoporttal szemben; egyszeres varianciaanalízis és studentizált „range”-teszt.

A P-anyag antagonizmusa nem elégséges a hő okozta ödéma megakadályozásához. Snider és munkatársai a P-anyag egy új, hatásos antagonistáját írták le [Science, 251, 435-437 (1991)], melyet CP-96,345 kódszámmal jelöltek. Biológiai próbákban azonban e vegyület nem eléggé aktív a vaszkuláris szivárgás gátlásához, amint ezt a 4. példa leírása és az 5. táblázat adatai mutatják.

4. példa

Véletlenpárosított kísérleti tervet alkalmazva sóoldatot vagy 4 mg/kg CP-96,345 jelű P-anyag antagonistát (konyhasóoldatban oldva, 4 mg/ml koncentráció) fecskendezünk be intravénásán a pentobarbitállal elaltatott patkányok jobb mancsába, majd 10 perc múlva a mancsot 1 percre 58 °C-os vízbe merítjük. Tömény pentobarbitál oldattal a patkányokat 30 perc múlva megöljük, mindkét mancsukat a bokaízületnél levágjuk és leméijük, majd 80 °C-on 24 órán át szárítjuk. A kontrollállatok csak 0,1 ml/kg iv. konyhasóoldatot kaptak. A melegített mancs víztartalmának növekedését a következőképpen számítottuk ki: hőkezelt mancs (nedvestömeg-száraztömeg) - hővel nem kezelt mancs (nedvestömeg-száraztömeg). Az adatok középértékek ±S. E. M. A két csoport között nem volt szignifikáns különbség (N = 8/csoport, Student-féle t-próba). Az adatokat az 5. táblázat foglalja össze.

5. táblázat

A hatásos P-anyag antagonista (CP-96,345) hőkárosítás után a bőrben nem gátolja a vaszkuláris szivárgást

Kezelés	A melegített mancs víztartalmának növekedése (mg)
Konyhasóoldat	1117+33
CP-96,345	1057+24

Külön kísérletben kimutattuk, hogy a CP-96,345 jelű vegyület gátolja a P-anyag injekciójával [40 pg/kg, s. c.] indukált nyálelválasztást. így a gyulladásos mediátort - a P-anyagot - antagonizáló vegyületek (mint a CP-96,345) nem eléggé aktívak a hőhatás után kialakuló ödéma megelőzéséhez.

5. példa

Alacsony vérnyomást előidéző értágító szerek hamis gyulladásgátló benyomást kelthetnek a vér áramlásának olyan mértékű csökkentése által, mely az ödéma kialakulásának gátlását eredményezi. Ezen felül gyulladáscsökkentő szerek terápiás alkalmazásánál a hipotenzív hatás nem lenne kívánatos, minthogy a perfüzió (és az oxigénszállítás) veszélyeztetve lehet olyan helyzetekben, amikor a sérült szövetekben az oxigénhiány kárt okoz. Ezért a neurotenzin és két rövidebb ffagmensének hipotenzív hatását összehasonlítottuk. Követtük a vegyületek 10 nmol/kg iv. dózisával kezelt állatok vérnyomását. Kontrollként konyhasóoldatot alkalmaztunk, a vizsgált vegyület pedig neurotenzin, AcNT (8-13) és neurotenzin (8-13) volt. A vérnyomást az injekció beadását követően 30 percen át többször megmértük. Amint a 4. ábra grafikusan illusztrált adataiból kitűnik, a neurotenzinnel rokon két hexapeptid nem fejtett ki vérnyomáscsökkentő hatást, úgyhogy az állat vérnyomása az injekció után 30 percen át lényegében állandó maradt. Ezzel szemben a 13 aminosavból álló peptid, a neurotenzin lényegesen csökkentette a vérnyomást. Bár a neurotenzin hipotenzív hatása kifejezett volt, a vizsgált két hexapeptid gyenge vérnyomáscsökkentő aktivitással rendelkezett (és megfigyelésünk szerint ödémaellenes hatást fejtettek ki akkor is, amikor a vérnyomás nem csökkent). így a neurotenzin (8-13) és az N-acetil-neurotenzin (8-13) előnyös gyulladásgátló hatással rendelkezik, amely független a károsodott szövetek vérátfolyásának változásaitól. E hexapeptidek korlátozott hipotenzív hatása különösen ked7

HU 216 733 Β vezővé teszi őket a különböző gyógyászati alkalmazások számára.

Bár a találmányt előnyös kivitelezéseivel összefüggésben írtuk le, a leírás és a példák csak bemutatják, de nem korlátozzák a találmány igénypontokban meghatározott hatókörét.

Claims

1. Eljárás az alábbi szekvenciájú:

T_N-A₆-A₅-Pro-A₃-A₂-Leu-OH peptideket vagy azok savakkal és/vagy bázisokkal alkotott addíciós sóit tartalmazó gyógyszerészeti készítmények előállítására, ahol

A₆ Arg vagy Lys, A₅ Asn, Ile, His vagy Arg, A₃ Trp vagy Tyr, A₂ Phe vagy Ile és T_N H-, N-(2-5 szénatomos)-alkanoil-csoport, pGlu-Gly, H-Ile-Ala-Arg vagy pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro, azzal jellemezve, hogy az önmagában ismert módon előállított fenti peptidet vagy savakkal és/vagy bázisokkal alkotott sóját legalább egy, gyógyszerkészítésnél elfogadott adalékanyaggal szöveti sérülés okozta vaszkuláris szivárgás gátlására alkalmas gyógyszerészeti készítménnyé alakítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan 1. igénypont szerinti peptidet alkalmazunk, melyben T_N Ν-acetil-, pGlu-Gly vagy pGlu - Leu- Tyr - Glu- Asn- Lys - Pro.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlősnek legalább egy 1-200 μg/kg dózis adagolására alkalmas dózisformát állítunk elő.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlősnek intravaszkulárisan vagy helyileg adagolható dózisformát állítunk elő.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlősnek intravaszkulárisan 0,001-1 mg/kg mennyiségben adagolható dózisformát állítunk elő.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy peptidként a neutrotenzin (8-13) vagy N-acetilneurotenzin (8-13) peptidet alkalmazzuk.

7. Az 1. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlősnek 0,01-1 mg/kg mennyiségben adagolható infuziódózis-formát állítunk elő.