HU209149B - Process for producing humane prouroquinase - Google Patents

Description

A jelen találmány tárgya rekombináns DNS-eljárás nem glikozilezett egyláncú prourokináz (a továbbiakban proUK) előállítására. Előnyösebben olyan eljárás nem glikozilezett proUK előállítására, ami abban áll, hogy egy fenntartott sejtvonalból kinyerjük az mRNS-t, az említett mRNS alapján cDNS-t készítünk, a cDNS-t beépítjük egy vektorba, a kapott plazmidot bejuttatjuk egy baktérium-sejtbe, ezzel előállítunk egy transzformánst, majd a nem glikozilezett proUK-t kinyerjük az említett baktérium-sejtből.

A találmány tárgyai továbbá a fenti módszerben alkalmazott bizonyos expressziós plazmidok.

A fiziológiás fibrinolízist szabályozó molekuláris kölcsönhatások növekvő megismerése fontos megállapításokra vezetett a vérrögök feloldása mechanizmusának megismerésében, valamint új trombolitikus anyagok kifejlesztésében.

A humán fibrinolitikus rendszerben egy proenzim a plazminogén aktiválható az aktív enzimmé, plazminná különböző típusú plazidogén aktivátorokkal [Collen, D. and Lijnen, H. R., CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 4, n. 3, p. 249 (1986); Verstraete M. and Collen D.: Blood, 67, n. 6, p. 1529 (1986)]. A plazmin az a fő proteáz, amely egy vérrögben szereplő fibrin komponens lebomlásáért felelős [Rákóczi, I., Wiman, B. and Collen, D.: Biochim. Biophys. Acta, 540, 295 (1978); Robbins, K. C., Summaria, L., Hsieh, B. and Shah, R. S.: J. Bioi. Chem. 242, 2333 (1967); Wiman, B., Eur. J. Biochem, 76, 129 (1977)].

A plazmin azonban proteolitikus hatását számos más plazmafehérjén is kifejtheti, amelyek között megtalálhatók a koagulációs bioszintézis út komponensei, az V-ös és VlII-as faktor [Collen, D. and Lijnen, H. R., CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 4, n. 3, p. 249 (1986); Verstraete M. and Collen D.: Blood, 67, n. 6, p. 1529 (1986); Wiman B., Lijenn, H. R. and Collen, D.: Biochim. Biophys. Acta, 579, 142 (1979)].

A plazminogén aktiválódása megtörténhet szisztémás szinten, ezáltal olyan keringő plazmin keletkezik, amelyet gyorsan semlegesít az alfa2-antiplazmin, ezáltal elvész a fibrinolízis számára [Collen, D. and Lijnen, H. R,, CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 4, n. 3, p. 249 (1986);Verstraete M. and Collen D.: Blood, 67, n. 6,p. 1529(1986)].

Ha az alfa2-antiplazmin szint jelentősen lecsökken és a plazmin kevésbé gyorsan semlegesítődik, proteolitikus hatását nem csak a fibrinen fejti ki, hanem a korábban leírt módon a vér-koagulációs fehérjéken is.

A fíbrinogén, V-ös és VlII-as faktor plazmakoncentrációjának jelentős csökkenése fíbrinogén lebomlási termékeknek a hemosztatikus folyamatokra, a vérlemezeke aggregációra és a fibrin polimerizációra gyakorolt gátló hatásával együtt hemosztatikus problémákhoz, hiányosságokhoz vezet, ezt követően erős vérzési problémákhoz [Latallo. Z. S. and Lopaciuk, S.: Thrombos. Diath. Haemouh., 56, 253 (1973); Totty, W. G., Gilula, L. A., McClenman M., Ahmed P. and Sherman, L.: Radiology, 143, 59 (1982)]. Másrészt a plazminogén aktiválódása előfordulhat a fibrin szintjén (fibrinhez kötött plazminogén aktiválás), ami fibrinhez kötött plazmin képződéséhez vezet [Collen, D. and Lijnen, H. R., CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 4, n. 3, p. 249 (1986); Verstraete M. and Collen D.: Blood, 67, n. 6, p. 1529 (1986)], amelyet nem befolyásol az alfa2-antiplazmin és nem képes szisztémás fibrinogenolízis indukálására.

Az urokináz és a sztreptokináz, a konvencionális humán trombolitikus terápiában legtöbbet alkalmazott plazminogén aktivátorok nem rendelkeznek a fibrinre specifikus aktivitással. Mindkét anyag viszonylag megkülönböztetés nélkül akiválja mind a keringő, mind a fibrinhez kötött plazminogént [Zamarron, C., Lijnen, H. R. van Hoef, B. and Collen, D.: Thromb. Haemostas., 52, 19 (1984); Samama, M. and Kher, A.: Sem. Hop. Paris, 61, n. 20,1423 (1985)]. Ennélfogva a sztreptokinázos vagy urokinázos kezelés során tapasztalt szisztémás hemosztatikus leromlás, és ennek következtében a megnövekedett vérzési veszély gyakran visszavetik ezeknek a trombolitikus anyagoknak a széles körű klinikai alkalmazását, a bizonyított klinikai hatékonyságuk ellenére [Samama, M. and Kher, A.: Sem. Hop. Paris, 67, n. 20, 1423 (1985); Maizei, A. S. and Bookstein, J. J.: Cardiovasc. Intervent. Rádiói., 9, 236 (1986); Bell, W. R., Thromb. Haemostas., 35, 57 (1976); Acar, J. Vahanian, A., Michel, P. L., Slama, M., Cormier, B. and Roger, V: Seminars in Thromb and Haemost., 73(2), 186 (1987); Gruppo Italiano per lo stúdió della Streptochinase nell’infarto miocardico (GISSI); Láncét, 7, 397 (1986)].

Ezzel szemben a szöveti típusú plazminogén aktivátorról (t-PA) [Hoylaerts, M., Ryken, D. C., Lijnen, H. R. and Collen, D. J.: Bioi. Chem. 257(6), 2912 (1982)] és újabban a prourokinázról (proUK) [Húsain, S. S. and Gurewich, V, Arch. Biochem. Biophys., 220, 31 (1983)], mindegyik természetes fehérje, kiderült, hogy gyengén aktiválják a keringő plazminogént, és ezzel ellentétben erősen aktiválják a fibrinhez kötött plazminogént, nem okozva sem szisztémás hemosztatikus leromlást, sem az alfa2-antiplazmin és a plazminogén elfogyását, ezáltal klinikai alkalmazásuk kisebb vérzési problémákat okoz.

A t-PA fibrin-specifikus trombolitikus aktivitása magyarázható azzal a képességével, hogy a fibrinhez kötődik specifikus lizin-kötő helyeken keresztül, amelyek a molekula tripla-diszulfid-kötésű „kringle domén”-jében találhatók.

Ennek következtében a fibrinhez kötött plazminogént jelentős hemosztatikus leromlás nélkül aktiválhatjuk [Collen, D. and Lijnen, H. R.: Haemostasis, 76(3), 25 (1986)]. Másrészről a proUK (hívják még egyláncú urokináz típusú plazminogén aktivátomak, scu-PAnak) nem kötődik a fibrinhez, ezzel szemben fibrinspecifikus trombolitikus aktivitást mutat, szisztémás hemosztatikus hatás nélkül [Pannell, R. and Gurewich, V: Blood, 67, 1215 (1986); Gurewich V. and Pannell, R.: Seminars in Thromb. and Haemost., 73 (2), 146 (1987); Lijnen, H. R., Zamarron, C., Blaber, M., Winbler, Μ. E., and Collen; D.: J. Bioi.. Chem., 267, 1253 (1986)].

HU 209 149 Β

A rekombináns t-PA-t multicenteres klinikai vizsgálatoknak vetették alá olyan betegeken, akiknek akut szívinfarktusuk van, és kimutatták, hogy lényegesen hatékonyabb mint a sztreptokináz a meggátolt koszorúerek beindításában [The European Cooperative Study Group fór Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator; Láncét, 1, 842 (1985); Sheehan, Ε H., Braunwald, E., Canner, P., Doodge, H. T., Gore, J., Van Natta, P., Passamani, E. R., Williams, D. 0., Zárét, B.: Circulation, 75 (4), 817 (1987)].

A prourokináz jelenleg előrehaladott klinikai kipróbálás állapotában van, és az gondolják róla, hogy legalább olyan hatékony mint a t-PA a trombolitikus aktivitás és a biztonság szempontjából [Van de Werf, E, Nobuhara, M. and Collen, D.: Annals os Internál Medecine, 104, 345 (1986); Van de Werf, E, Vanhaecke,

J., De Geest, H., Verstraete, M. and Collen, D.: Circulation, 74 (5), 1066 (1986)].

Az urokináz típusú plazminogén aktivátorokat (uPA-k) legalább három különböző formában találhatók meg a humán vizeletben, plazmában, valamint különböző sejtvonalak kondicionált tenyészfolyadékában. Az első, u-PA-ként jellemzett forma egy 410 aminosavból álló fibrinolitikus hatású polipeptid, látszólagos molekulatömege 54000 dalton, amely két diszulfid híddal összekötött láncot tartalmaz [Gunzler, W. A., Steffens, G. J., Oetting, E, Kim, SM. A., Frankus, E. Flohé, L.: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 1155 (1982)].

Az A-lánc, vagy könnyű lánc 157 aminosavból áll, és egy háromszoros diszulfid híddal kialakult „kringle” szerkezettel. Ez a lánc tartalmaz még egy receptor-kötő domént is a normális és neoplasztikus sejtekhez (monociták, monocita-szerű sejtek és A 431 epidermoid sejtek). A B-lánc, vagy nehéz lánc (molekulatömege 30000 dalton) 253 aminosavat tartalmaz, és itt található a katalitikus dómén.

Az u-PA-nak ezt a formáját általában urokináznak (UK), kétláncú urokináznak (TC-UK), vagy nagy molekulatömegű urokináznak (HMW-UK) hívják [Gunzler, W. A., Steffens, G. J,, Oetting, E, Bűze, G. and Flohé, L.: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 133 (1982)].

Az urokináz másik formájának a molekulatömege 33 000 dalton, és a HMW fonna plazminos vagy tripszines proteolitikus lebomlásából keletkezik. Ezt alacsony molekulatömegű urokináznak (LMW-UK) hívják. Az aminosav-sorrend meghatározása felfedte, hogy az LMW-UK és a HMW-UK azonosak egymással, az a különbség, hogy az LMW-UK-ból hiányzik 153 N^-terminális aminosav, amelyeket a plazmin vagy a tripszin specifikus aktivitása távolít el [Steffens, G. J., Gunzler, W. A., Oetting, E, Frankus, E. and Flohé, L.: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 363, 1043 (1982)].

A natív urokináz (proUK) egy egyláncú (molekulatömege 54000) formája az urokináznak, és nevezik egyláncú urokináz típusú plazminogén aktivátornak is (scu-PA). Amint azt az előzőkben leírtuk, a pro-UK egy fibrin-speeifikus trombolitikus aktivitással rendelkezik, ennélfogva a jelenleg használt magas vagy alacsony molekulatömegű urokinázhoz viszonyítva egy jobb trombolitikus hatású anyag.

A prourokináz előállítása céljából a jelen találmány szerzői rekombináns DNS-módszert fejlesztettek ki, amely alkalmas a proUK polipeptid lánc nagy mennyiségben való előállítására.

A tudományos és szabadalmi irodalomban számos módszert írtak le a proUK előállítására [Holmes, W. E., Pennica, D., Blaber, M., Rey, M. W., Gunzler, W. A., Steffens, G. J. and Heynecker, H. L.: Biotechnology, 3, 923 (1985); 0092182 sorszámú európai szabadalmi bejelentés]. Azonban a jelen találmány szövegében leírt módszer kihasználja azokat a paramétereket, amelyekről ismert, hogy fontosak a heterológ fehérjék E. coliban való expresszálásában, de amelyeknek a kombinációját azelőtt soha nem alkalmazták rekombináns proUK előállításában.

A fő paraméterek amelyeknek a kombinációja hozzájárul ahhoz, hogy létrehozzunk egy proUK előállítására képes rekombináns E. coli törzset, és amelyek a jelen találmány tárgyát képezik, a következők: a Ptrp E. coli promoter, az MS-2 fágból származó MS-2 Shine-Dalgamo szekvencia, valamint gazdasejtként a B típusú E. coli törzs a humán proUK expresszálásában (lásd alább).

Ez a kombináció kritikus fontosságú. Ezek közül a paraméterek közül egynek vagy többnek a helyettesítése egy alternatív exrpesszió jellel, azt eredményezheti, hogy kevesebb proUK keletkezik.

A jelen találmány tárgya tehát eljárás rekombináns nem glikozilezett humán proUK előállítására egy, a proUK génjét kifejező expressziós vektorral transzformáit E. coli gazdasejt tenyésztésével, azzal jellemezve, hogy a proUK gént egy Ptrp E. coli promoter és egy MS-2 Shine-Dalgamo szekvencia szabályozása alatt kifejező expressziós vektort E. coli B törzsben expresszálunk.

Abból a célból, hogy a fenti eljárásban alkalmazott rekombináns E. coli baktérium-törzseket előállítsuk, a következő lépéseket szükséges elvégezni:

- a keresett proUK-t kódoló humán cDNS gén izolálása

- az említett gén beépítése egy megfelelő expressziós plazmidba

- a kiválasztott E. coli törzs transzformálása a manipulált plazmiddal, és a transzformánsok tenyésztése megfelelő körülmények között

l.A proUK-t kódoló humán cDNS-gén klónozása

A humán prourokinázt kódoló cDNS klón előállításához a szerzők az irodalomban publikált fehérjeszekvencia adatokat használták [Gunzler, W. A., Steffens, G. J., Oetting, E, Kim, SM. A., Frankus, E. Flohé, L.: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem., 363, 1155 (1982); Gunzler, W. A., Steffens, G. J., Oetting, E, Bűze, G. and Flohé, L.: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 133 (1982); Steffens, G. J., Gunzler, W. A., Oetting, E, Frankus, E. and Flohé, L.: Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 363, 1043(1982)].

Ennek megfelelően specifikus próbák készültek, és egy megfelelő cDNS-könyvtárat vizsgáltunk át.

HU 209 149 Β

Az egyláncú urokináz típusú plazminogén aktivátor (proUK) kiválasztott peptidjeit kódoló oligonukleotidokat kémiai szintézissel állítjuk elő [Caruthers, Μ. H., Gassen, H. G. and Láng, J. A (eds), Verlag-chimie, Weinheim, Deefield Beach, Basel, 71 (1982)], ezeket használjuk a proUK mRNS feldúsulásának követésére, és azoknak a kiónoknak a szelektálására egy feldúsított cDNS könyvtárból, amelyek prourokináz cDNS-t tartalmaznak. Az oligomerek 14, illetve 17 nukleotid hosszúak, mindegyiket vagy egyetlen szekvenciaként (p7 jelű) vagy kettő oligonukleotidot tartalmazó poolban (pl, p2, p3 jelűek), illetve 16 oligonukleotidot tartalmazó poolban (jele p6) szintetizáljuk, az 1. ábra szerint. Az oligonukleotidok proUK specifitását Northern-hibridizációval vizsgáltuk. Ennek a vizsgálatnak a céljára poli-A tartalmú RNS-t vonunk ki HEp-3 epidermoid karcinómából [Miskin,

R. , Haemostasis (Switzerland), 11, No. suppl. 1, 63 (1982)]. Mindegyik oligomerhez a hibridizációs reakciót követő mosás hőmérsékletét úgy állítjuk be, hogy 2-5 Celsius-fokkal legyen a minimális olvadási hőmérséklet alatt, Suggs és munkatársainak a Southern-blotokra vonatkozó számításai alapján [Suggs,

S. V., Hírőse, T., Miyake, T., Kawashime, E. G., Johnson, Μ. Y., Itakura, K. and Wallach, R. B.: Developmental Biology Using Purified Genes; Brown D. D. and Fox, C. F. (eds) Academic Press, New York, 638 (1981)]. Ebben a szövegben az öt proUK próba, amelyek az 1. ábrán láthatók, egyetlen általános fő karcinóma mRNS csíkkal reagáltak, amelynek molekulatömege körülbelül 2,3 kb, és ez a proUK mRNS várt mérete.

A klónozást HEp-3 epidermoid karcinómából származó dúsított mRNS frakcióval végezzük. Az RNS preparátumokat extraháljuk, majd körülbelül háromszorosra dúsítjuk két egymást követő szacharóz gradiensen. A cDNS-t a publikált eljárás szerint szintetizáljuk [Efstratiadis, A., Kafatos, F. C., Maxam, A. M., and Maniatis, T.: Cell, 10, 279 (1976); Buell, G. N„ Wickens, M.P., Payvar, F. and Schimke, R. T.: J. Bioi. Chem, 253, 2471 (1978)], indító molekulaként oligodT-t használva. A hosszabb molekulákat poliakrilamid gélelektroforézissel, majd a megfelelő gélfrakciók elektroeluálásával izoláljuk. A cDNS-t ezután standard fenol/kloroform extrakcióval extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk.

Ezeket a cDNS molekulákat először EcoRI linkerekhez ligáljuk, majd a lambda gtlO vektorba klónozzuk a Davis-féle technika módosításával [Maniatis, T., Fritsch, E. F. et Sambrook, J.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY (1982)]. Ezzel e kísérlettel 2xl0⁵ pfu-t (tarfoltképző egység) tartalmazó könyvtárat kapunk.

A könyvtár felét dupla szűrőkön vizsgáljuk át, az egyik szűrőt ³²p-vel jelzett pl jelű próbával, a másik megfelelő szűrőt a p3 és p6 próbák elegyével. Összesen 36 pozitív kiónt kapunk, ezek közül hét pozitív volt mindkét szűrőn, jelezve ezzel, hogy a cDNS-inszert a proUK kódoló régióinak egy nagy részét tartalmazza.

A három próbával hibridizáló rekombináns fágokat tarfolt-tisztítjuk, a pl próba felhasználásával majd tovább jellemezzük EcoRI enzimmel végzett restrikciós térképezéssel és DNS szekvenálással. A teljes cDNS könyvtárban levő pozitív kiónok aránya azt mutatja, hogy a prourokináz mRNS gyakorisága a HEp-3 karcinómában körülbelül 0,01%.

Négy proUK cDNS klón DNS-szekvenciájának vizsgálata felfedte, hogy a kiónok közül háromban deléciók vannak, illetve olyan szekvenciák, amelyek nem egyeznek az enzim aminosav-szekvenciájával. Csak egy klón, a lambda Ucl7 mutatott teljes egyezést az ismert aminosav-szekvenciával.

A lambda Ucl7 azonban nem tartalmazta az mRNS teljes 3’ nem kódoló régióját, és 30 nukleotid hiányzik a kódoló régióból is. Egy teljes hosszúságú pro-urokináz cDNS kiónt úgy állítunk elő, hogy egy 1325 bp méretű lambda Ucl7 Smal-BamHI fragmentumot, amely az 5’ nem kódoló régiót és a kódoló régió legnagyobb részét tartalmazza, egy olyan BamHI-EcoRI fragmentummal ligáljuk, amely egy másik, szintén a fenti könyvtárból kapott lambda Uc6 jelű klónból származik, és a hiányzó 3’ régiót tartalmazza (2. ábra).

Ezt a konstrukciót a pUN121 plazmid-vektor [Nilsson B., Uhlen M., Josephson S., Gatenbeck S. and Philipson L.: Nucleic acids Research, 11, 8019 (1983)] Smal-EcoRI helyére ligáljuk, ezzel a cl gén legnagyobb részét eliminálva, ez a vektor a pcUK176 jelet kapja (3. ábra).

A teljes cDNS klón DNS szekvenciáját a 4. ábrán mutatjuk be. 2296 nukleotidot tartalmaz, beleértve 69 nem kódoló nukleotidot az 5’ végen, 1296 kódoló nukleotidot, és 931 nem kódoló nukleotidot a 3’ végen, majd ezt követi egy több mint 80 csoport hosszúságú poli(A) farok.

A kódoló szekvencia 60 olyan bázissal indul, amely a „pre-prourokinázt” tartalmazó 20 aminosavat kódoló [Heyneker, H. L., Holmes, W. E. and Vehar, G. A., 0092182 számú európai szabadalmi bejelentés, (1983)], majd ezt követi a teljes prourokináz fehérjét kódoló szekvencia, ami teljes összhangban van a megállapított aminosav-szekvenciával.

A teljes fragmentumot restrikciós analízissel és a szekvenciája alapján ellenőrizzük. Az érett prourokinázt kódoló szekvenciát a termeléshez használt expressziós vektorba építjük.

2. A proUK expressziós plazmid készítése

Az eredeti teljes hosszúságú cDNS-t, amely a pcUK 176-ban található, használjuk egy prourokináz expressziós plazmid előállítására, jele pFC44, amelyben a proUK gén a Ptrp promoter és az MS-2 „ShineDalgarno” szekvencia transzlációs, illetve transzkripciós szabályozása alatt áll. A pFC44 plazmid a 7. ábrán látható.

A pFC44 készítéséhez számos intermedier plazmidot állítottunk elő. A pDS20-szal kezdve (5. ábra) [Duester, G„ Helfard, R. M. and Holmes, W. M.: Cell, 30, 855 (1982)], először helyettesítettük a Pgal galaktóz operon promotert kódoló EcoRI-HindlII fragmentet az M13mp8 vektorból származó EcoRI-HindlII po4

HU 209 149 Β lilinker szekvenciával [Vieirea, J. and Messing, I.: Gene, 19, 259 (1982)], így kapjuk a pABl jelű új plazmidot (5. ábra).

A Ptrp promotert a pDR720 plazmidból állítjuk elő (Pharmaciától vásároltuk), egy EcoRI-Sall restrikciós fragment formájában. Ezt a fragmentet építjük be a pABl polilinker régiójába az EcoRI és a Sáli hely közé. így kapjuk az új plazmidot, amelynek jele pFCIO (5. ábra).

A pFCIO tekinthető annak az alapvektornak, amelybe beépítjük a proUK gént és az MS-2 fágból származó „Shine-Dalgarno” szekvenciát.

Ahhoz, hogy az érett prourokinázt expresszáljuk, az szükséges, hogy a proUK kódoló szekvenciát az érett fehérje első kodonjától egy indító ATG triplethez fuzionáljuk. Ezt a fúziót előzheti meg azután a „ShineDalgarno” szekvencia.

Az MS-2 bakteriofágból származó riboszomális kötőhely (RBS) ismert, és nukleotid szekvenciáját már publikálták [Fiers, W., Contreras, R., Duerinck, E, Haegeman, G., Iserentant, D., Merregaert, J., Min Jou, W., Molemans, R, Raeymakers, A., Van den Berghe, A., Volckaert, G. and Ysebaert, M.: Natúré, 260, 500 (1976)].

Ismert róla, hogy az mRNS transzlációja szempontjából egy erős jel. Ezért választottuk ezt a régiót a proUK előállításához transzlációs jelként. Azért, hogy korrekt nukleotid szintű fúziót kapjunk a proUK génnel, ezért az MS-2 RBS kettőszálú régióját megszintetizáltuk a proUK gén elejéhez közvetlenül hozzákapcsolva. Az érett proUK szekvencia 25. nukleotidjánál egy Tgl hasítási hely található. Kihasználtuk ezt a helyet, és kémiai szintézissel a következő DNS-szekvenciát állítottuk elő:

Hindlll MetSer ’ -AGCT TTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCC ATGAGCA

AATTATCTGCGGCCGGTAAGTTTGTACTCCTAATGGGTACTCGT

Taql

ATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3’ TACTTGAAGTAGTTCAA GGTAGC-5’ amelyet megelőz egy Hindlll hasítási hely és utána pedig egy Taql hasítási hely található. Az indító ATG kodont kiemelten mutatjuk. Az érett proUK szekvencia elejét kódoló szekvenciáját aláhúzzuk.

A szintetikus fragmenst használjuk egy ligáló reakcióban a következő két restrikciós fragmenssel:

- a pcUK176-ból (3. ábra) származó Taql-BglII fragmens, amely a proUK szekvenciát tartalmazza a 155-ös nukleotidtól a 392-es nukleotidig (lásd a 4. ábrát);

- a pFC 10-ből (5. ábra) származó BamHI-HindlII fragmens, amely az ampicillin rezisztencia gént és a Ptrp promotert tartalmazza.

Ezzel a konstrukcióval egy új plazmidot izoláltunk, jele pAB8, amelynek térképét a 6. ábrán mutatjuk be. Ebben a plazmidban a Ptrp promotert és az MS-2 RBS-t fuzionáltatjuk az érett proUK gén első 260 nukleotidjával (megfelel a 4. ábrán a 131—191-es nukleotidoknak). Emellett a pAB8 rendelkezik egyetlen Ncol hellyel, amelybe beépítettük a proUK szekvencia maradékát a pcUK176-ból származó Ncol-Ncol restrikciós ffagmens formájában. Ez a ligálás egy, a proUK gén utáni NcoI-BglII fragmensnek a duplikálódását okozza a nem kódoló régióban. Ez a duplikálódás azonban nem érinti a plazmid stabilitását. Az előállított konstrukcióban a szabályozó jelek irányítják a teljes proUK szekvencia szintézisét (6. ábra).

Az eddig leírt összes plazmidot az E. coli K-12 C-600 galK gazdaszervezetben (ATCC 33955) lehetett szelektálni az ampicillin rezisztencia alapján. A plazmidok hordozzák a β-laktamázt kódoló gént, ez az enzim bontja le az ampicillin nevű antibiotikumot a táptalajban. A korai kísérletek kimutatták, hogy a pFC16-ot sikeresen be lehet juttatni az E. coli B típusú törzsekbe, és ezzel nagy mennyiségű rekombináns proUK állítható elő.

Azonban abból a célból, hogy megfeleljünk a rekombináns DNS eredetű termékek előállítására vonatkozó nemzetközi előírásoknak, módosítottuk a pFC16ot oly módon, hogy egy új, tetraciklin rezisztenciát kódoló plazmidot állítottunk elő, amely képes magas szinten expresszálni a proUK gént. Pontosabban, a jól ismert pBR322 plazmidból [Maniatis, T., Fritsch, E. F. et Sambrook, J.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY (1982)] (6. ábra) izoláltunk egy EcoRIAval fragmentet, amelyen a ragadós végeket feltöltöttük a DNS-polimeráz I Klenow fragmentjével [Perbal, B., A Wiley-Interscience Publication John Wiley And Sons, 231 (1984)]. Ezzel a β-laktamáz gén amino-terminális részét és a szabályozó szekvenciáit a tetraciklin rezisztenciát kódoló génnel helyettesijük. A ligálást követően a tetraciklin rezisztencia gén ugyanabban az orientációban található mint a proUK gén.

Emellett egy újEcoRI restrikciós hely keletkezik a korábban feltöltött Pvull és az EcoRI helyek között. Az új plazmid, a pCF44 (lásd 7. ábra) a végső konstrukció, amelyet a rekombináns urokináz előállítására használunk.

A pFC44 (tetraciklin rezisztenciát kódoló) és a pFC16 (ampicillin rezisztenciát kódoló) plazmidok a jelen találmány tárgyai. Az ezen a két plazmidon található expressziós szabályozó szakaszokat, azaz a Ptrp promotert és az „MS-2” Shine-Dalgarno szekvenciát már leírták az irodalomban heterológ fehérjék expresszálására [Remaut E., Sranssens, P. and Fiers W.: Nucl. Acids Rés. 11, 4677 (1983)]. Kombinációjukat azonban még soha nem alkalmazták a proUK gén expresszálására.

HU 209 149 Β

3. Az E. coli B típusú törzsek transzformálása

A jelen találmány másik fő tárgya az E. coli B típusú törzsek alkalmazása prourokináz expresszálására és termelésére. Valóban, a jelentalálmány szerzői úgy találták, hogy a pFC44 vagy pFC16 törzsek bejuttatása az E. coli B típusú sejtjeibe nagy mennyiségű proUK polipeptidlánc keletkezését eredményezi. Érdekes módon a pFC44 vagy pFC16 plazmidok más E. coli törzsekbe juttatása (K-12 típusú, C típusú, W típusú) nem eredményez olyan sok proUK-t. Ennek következtében a gazdasejt típusa kritikus fontosságú a proUK sikeres előállításában.

Számos B típusú E. coli törzs ismert és használható a proUK gén sikeres expresszálására. Az előnyös törzsek a következőek: ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537. Az alábbiakban megadunk egy példát az NCTC törzs pFC44 plazmiddal való transzformálására és a transzformáns tenyésztésére.

A NCTC törzs kompetens tenyészetét Mandel és Higa kalcium-kloridos eljárásával állítjuk elő [Mandel, M. and Higa, A.: J. Mól. Bioi, 53, 154 (1970)]. Ezeknek a sejteknek a preparátumából körülbelül 200 pl-t (lxlO⁹ sejt/milliliter) transzformálunk 2 μΐ plazmid DNS-sel (hozzávetőlegesen koncentrációja 5 pg/ml). A transzformánsokat 12,5 pg/ml tetraciklinnel kiegészített L-agarlemezen szelektáljuk. Két kis telepet szélesztünk fogpiszkálóval (mindegyiket körülbelül 1 cm hosszan) ugyanilyen antibiotikumot tartalmazó L-agarra. 12 órás, 37 °C-os inkubálás után a szélesztések egy részét levizsgáljuk, hogy termelnek-e prourokinázt oly módon, hogy 10 ml LB táptalajba oltjuk (2,5 pg/ml tetraciklint tartalmaz), majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A következő napon a tenyészeteket 1:100 arányban meghígítjuk M9 táptalajban, amely az előzővel megegyező koncentrációban tartalmaz tetraciklint, majd 6 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A tenyészet (OD₅₅₀) 250 pl-es alikvot részéből származó sejtek fehérjéit nátrium-szulfátos poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel vizsgáljuk, Laemmli szerint [Laemmli, U. K. Natúré, 227, 680 (1970)]. Egy fő fehérjecsík, amelynek a molekulatömege megfelel a nem glikozilezett humán prourokináznak (45 000 dalton) figyelhető meg a két független mintában (8. ábra).

A 2. számú telep utódait választottuk ki önkényesen további jellemzésre, majd választottuk proUK termelő törzsnek.

Az ábrák magyarázata

1. ábra: A Pl, P2, P3, P6 és P7 próbák nukleotid szekvenciája, valamint a komplementer mRNS szekvencia és a próbák által kódolt proUK peptidek szekvenciája.

2. ábra: A restrikciós endonukleáz hasítási termékek helyét és méretét eletroforézissel becsüljük meg, majd DNS-szekvencia analízissel határozzuk meg. A betöltött régió jelzi az érett proUK fehérje kódoló szekvenciáját, a keresztben vonalkázott régió mutatja a „prepro” pepiidet kódoló szekvenciát, a nyitott régiók mutatják az 5’ és 3’ nem transzlálódó régiót. Az mRNS 5’ régiója bal oldalon van.

A restrikciós térkép alatti vonalak a két részleges klón (lambda Ucl7 és lambda Uc6) hozzájárulását mutatják a teljes kiónhoz.

3. ábra: A cDNS kiónt EcoRI-Smal fragmentet beépítjük a pUN121 plazmidba, ezáltal helyettesítve benne a cl gén legnagyobb részét. A pcUK176 plazmid még tetraciklin és ampicillin rezisztenciát is kódol. *cl egy inaktivált cl fehérjét jelöl.

4. ábra: A pcUK176 klón DNS szekvenciáját mutatjuk be a megfelelő, lefordított aminosav szekvenciával együtt. A plazmidok készítésében használt restrikciós helyeket aláhúztuk. A 2264-es és 2277-es pozícióban két poliadenilezési helyet, valamint az érett proUK szekvencia 1-es pozíciójában található szerincsoportot aláhúztuk.

5. ábra: Ezen az ábrán négy intermedier konstrukciót mutatunk be. A kiindulási pDS20 plazmidon található meg az összes kiindulási elem, amelyek közül a különböző intermedier plazmidok kialakítása során elvész a Pgal promoter, a galK gén és a β-laktamáz gén.

6. ábra: Három további intermedier konstrukció látható itt, köztük a pFC16 plazmid, amely magas szinten expresszál proUK-t. A részleteket lásd a szövegben.

7. ábra: A pFC44-ben az érett proUK kódoló szekvencia a Ptrp promoter és az MS-2 fág „riboszomális kötőhely” kontrollja alatt áll. A tetraciklin gént a β-laktamáz gén helyére illesztettük. A pFC44 tehát ampicillin érzékeny.

8. ábra A mintákat a szövegben leírt módon állítjuk elő és analizáljuk, majd 12,5%-os SDSpoliakrilamid gélre visszük (az akril: biszakril arány 40:1). Az 1-es és 2-es sávok a pFC44-gyel transzformált NCTC 10537 törzsből származó két tenyészetből tartalmaznak anyagot. A rekombináns prourokináz fehérje pozícióját a nyíl mutatja. A 3-as sáv az NCTC 10537 kontroll gazdatörzsből származó anyagot tartalmaz, a 4-es sávban molekulatömeg standardok láthatók.

Anyagok és módszerek

Növesztő táptalaj:

A használt táptalajokat a Maniatis és munkatársai által leírt receptek alapján készítettük [Maniatis, T., Fritsch, E. F. et Sambrook, J.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY (1982)]. Az LB táptalajt, LB agart és a McConkey-agart a Difcobacto Products előírásai szerint készítettük. Az M9 táptalaj összetétele a következő: Na₂-HPO₄, 6 gramm/liter; KH₂PO4, 3 gramm/liter, NaCl, 0,5 gramm/liter, NH₄C1, 1 gramm/liter. A fenti komponensek autoklávval való sterilezése után (1 atm; 120 °C, 20 perc), 1 ml 1 mólos MgSO₄-et, 0,1 ml 1 mólos CaCl₂-t, 16 ml glükózt, 20 ml 0,5 mg/ml-es tiamint (SIGMA) és 20 ml 20%-os

HU 209 149 Β kazaminosavat (DIFCO) adunk hozzá literenként. A fenti oldatokat szűréssel sterilezzük.

Restrikciós enzimek és más enzimek használata

A restrikciós endonukleázokat, a T4 ligázt és a DNS-polimeráz I-et (Klenow fragment) a New England Biolabstól és a Boehringer Mannheimtől vásároltuk, és az előállító utasításai szerint használtuk.

Plazmid DNS előállítása

A plazmid DNS-t a Birnboim-Doly módszerre alapozott [Bimbóim, H. C. and Doly, J.: Nulcleic Acids Rés. 7,1513 (1979)] egyensúlyi sűrűséggradiens módszerrel állítjuk elő.

DNS-szekvencia analízis

A szekvencia adatokat az Amersham M13 szekvenáló kit felhasználásával nyerjük, az előállító előírásai szerint. Röviden, ez a technika, amely a Sanger módszeren alapul [Sanger, F., Science, 214, 1205 (1981)], abból áll, hogy különböző restrikciós fragmenteket megfelelő M13 vektorokban (az „mp család”) szubklónozzuk, amelyeket egyszálú formájukban állíthatunk elő. Miután az egyláncú formát univerzális indító molekulával hibridizáltuk, lehetséges lemásolni a DNS templátot DNS-polimeráz I-gyel (Klenow-fragment). A templátot a négy didezoxi-nukleotid jelenlétében lemásolva lehetséges a lánchosszabbítás véletlenszerű leállítása. A csonkított fragmenteket ezután denaturáló poliakrilamid gélen elválasztjuk, és az elektroforetikus profilt autoradiográfiával értékeljük ki.

Oligonukleotidok

A szintetikus oligonukleotidokat, amelyeket a plazmidok készítésében, valamint a DNS-szekvenálásban indító molekulaként használunk, az Applied Biosystems (ABI) DNS-szintetizátorával állítjuk elő, az ABI kézikönyv szerint.

Más eljárások

A nukleinsavak agaróz és poliakrilamid gélelektroforézis módszereit Maniatis és munkatársai írták le [Maniatis, T., Fritsch, E. F. et Sambrook, J.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY (1982)]. A fehérjéket poliakrilamid gélelektroforézissel választjuk el Laemmli szerint [Laemmli, U. K. Natúré, 227, 680 (1970)]. A DNS-t úgy extraháljuk az agaróz gélből, hogy dialízis zsákokba elektroforetizáljuk, majd etanollal kicsapjuk.

A jelen találmány tárgya rekombináns DNS eljárás nem glikozilezett prourokináz előállítására. Ez az eljárás azon alapul, hogy a proUK-t kódoló humán gént E. coli baktériumtörzsbe juttatjuk be, majd az említett transzformált törzset tenyésztjük.

Heterológ fehérjék előállítása E. coliban a modern biotechnológiának egy alaposan tanulmányozott területe [Harris, T. J. R. and Emtage J. S.: Microbiological Sciences, 3, 28-31 (1986)]. Ma a molekulárbiológusok számos expressziós szabályozó szekvenciával rendelkeznek, például promoterekkel, Shine-Dalgamo szekvenciákkal, terminátorokkal stb., amelyek felhasználhatók a választott fehérjékhez. A promoter felelős az mRNS szintéziséért, míg a Shine-Dalgamo szekvencia biztosítja az mRNS hatékony transzlációját polipeptid lánccá.

Azonban ezeknek a paramétereknek a kombinációja fontos paramétere a heterológ génexpressziónak. Például egy hatékony Shine-Dalgarno szekvenciát különböző promoter régiókkal kombinálva különböző expressziós szinteket kaphatunk. Emellett az expreszsziós szabályozó jeleket hordozó restrikciós fragmentek hossza gyakran befolyásolja a termelés szintjét [McCarthy, J. R. G., Sebald, W., Gross, G. and Lammers, R.: Gene, 41,201 (1986)].

A gazdasejt kiválasztása is kritikus lépés egy hatékony termelési módszer kifejlesztésében. Az ismert, hogy ugyanaz az expressziós plazmid különböző törzsekben nagyon különböző expressziós hatékonyságot eredményez [Harris, T. J. R. and Emtage J. S.: Microbiological Sciences, 3, 28-31 biotechnológiának egy alaposan tanulmányozott területe, Harris, (1986)].

Jóllehet a jelen találmányban leírt expressziós szabályozó szakaszok már ismertek a szakirodalomban, kombinációjukat ezelőtt soha nem használták fel humán prourokináz specifikus expressziójára. Pontosabban, a pFC16 és pFC44 plazmidok a proUK gént tartalmazzák a Ptrp E. coli promoter és az MS-2 fág ShineDalgarno szekvenciájának szabályozása alatt.

Ennek következtében a jelen találmány szövegében ismertetett termelési eljárás olyan expressziós plazmidokon alapul, amelyek lényegesen különböznek a korábban leírt expressziós plazmidoktól. Ezek a plazmidok, a pFC16 és pFC44, tehát a jelen találmány újdonságát jelentik, és mint már említettük, a tárgyát képezik.

Emellett az ismertetett eljárás kihasználja a B típusú E. coli törzset. A szakirodalomban leírt expressziós módszerek túlnyomó többsége a K-12 típusú E. coli törzseken alapul. Tehát a proUK előállítása B típusú E. coli törzsekkel, ez is a találmány újdonságát képezi.

Ez a második szempont rendkívül fontos. A mikroorganizmus megválasztása számos lépésben érintheti az össztermelést.

Például a nagy biomassza tartalomnál végzet fermentációkat drámaian befolyásolhatja a gazdaszervezet. A jelen találmány szerzői, valamint más kutatócsoportok is következetesen azt találták, hogy a B típusú E. coli törzsek sokkal könnyebben tenyészthetők mint például a K-12 törzsek. Ugyanazt az expressziós plazmidot, például a pFC16-ot vagy pFC44-et egy K12, például C600 törzsbe bejuttatva olyan rekombináns törzs keletkezik, amely nem nő fermentorokban olyan hatékonyan, mint a rekombináns B törzs. Másszóval, a nem glikozilezett proUK kinyerhető mennyisége nagyobb B törzsek esetében, ha ugyanazt az expressziós plazmidot használjuk.

Másik fontos, a gazdasejt megválasztásához kapcsolódó szempont a bakteriális szennyezőanyagok eltérő mivolta a-proUK termelési eljárás során.

HU 209 149 Β

A nemkívánatos szennyezőanyagok, például a proteázok, súlyosan befolyásolhatják a rekombináns termékek mennyiségét.

Érdekes módon 1986-ban Winkler and Blaber [Winkler, Μ. E., Blaber, M.: Biochemistry, 25 (14); 4041 (1986)] leírtak egy proUK termelő eljárást, amely a 294-es K-12 törzsön alapult (ATCC 31446).

Ebben az eljárásban a szerzőknek számos megelőző intézkedést kellett tenniük, hogy megakadályozzák a proUK proteolitikus emésztését. A szerzők szerint ez a proteilitikus aktivitás a gazdasejtben levő bakteriális proteázok következménye.

Ezzel szemben a jelen találmány szerinti B törzsek alkalmazásával olyan sejtextraktumokat kapunk, amelyeknek sokkal kisebb proteolitikus aktivitásuk. Pontosabban azt találtuk, hogy a C600 K-12 törzsből szár5 mazó proUK sokkal nagyobb mértékben van szennyezve urokinázzal mint a B törzsből származó proUK.

Összefoglalva, a jelen találmány szerzőinek az a véleményük, hogy az itt közölt eljárással készült rekombináns proUK megfigyelt magasabb mennyisége, 10 a szakirodalommal összehasonlítva, egy előre nem látható eredményt jelent, valamint az ismert eljárások javítását.

Claims (7)

1. Eljárás rekombináns nem glikozilezett humán prourokináz (proUK) előállítására egy, a proUK gént tartalmazó expressziós vektorral transzformált E. coli gazdasejt tenyésztésével, azzal jellemezve, hogy egy 20 Ptrp E. coli promoter és egy MS-2 Shine-Dalgamo szekvencia szabályozása alatt álló prourokináz gént tartalmazó expressziós vektorral transzformált E. coli

B gazdasejtet tenyésztünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 25 ve, hogy proUK génként a HEp-3 epidermoid karcinó15 ma sejtekből nyert mRNS-ből készített proUK CDNSszekvenciát alkalmazzuk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Ptrp promoterként egy, a pDR-720 plazmidból származó EcoRI-Sall restrikciós fragmenst alkalmazunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi MS-2 Shine-Dalgarno szekvenciát, az ATG startkodont és a proUK gén kezdetét tartalmazó szekvenciát, amelyet balról egy Hindlll hely, jobbról egy Taql hely határol, tartalmazó expressziós vektort expresszáljuk;

5’-AGCTTTAATAGACGCCGGCCATTCAAACATGAGGATTACCCATGAGCA 3 ’ -AATTATCTGCGGCCGGTAAGTTTGTACTCCTAATGGGTACTCGT

ATGA ACTTCATC A AGTTCC AT-3 ’ TACTTGA AGTAGTTC A AGGTAGC-5 ’

5. Eljárás nem-glikozilezett humán prourokináz (proUK) gén E. coli B törzsben történő kifejezésére alkalmas expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Ptrp E. coli promotert, egy MS-2 Shine-Dalgamo szekvenciát, egy antibiotikum-rezisztencia gént és egy, a humán proUK gént tartalmazó DNS-fragmenst működőképesen egy hordozó plazmid- 35 ba építünk.

6. Az 5. igényont szerinti eljárás a pFC-16 plazmid 30 előállítására, azzal jellemezve, hogy rezisztenciagénként pDS20 plazmidból származó ampicillin rezisztencia gént alkalmazunk.

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás a pFC-44 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy rezisztenciagénként pBR322 plazmidból származó tetraciklin rezisztencia gént alkalmazunk.