HU203578B - Process for producing carg carbomycin biosynthetical gene applicable in streptomyes and other organism - Google Patents

Process for producing carg carbomycin biosynthetical gene applicable in streptomyes and other organism Download PDF

Info

Publication number
HU203578B
HU203578B HU88848A HU84888A HU203578B HU 203578 B HU203578 B HU 203578B HU 88848 A HU88848 A HU 88848A HU 84888 A HU84888 A HU 84888A HU 203578 B HU203578 B HU 203578B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
streptomyces
carbomycin
plasmid
gene
dna
Prior art date
Application number
HU88848A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT46738A (en
Inventor
Janet Kay Epp
Brigitte Elisabeth Schoner
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HUT46738A publication Critical patent/HUT46738A/hu
Publication of HU203578B publication Critical patent/HU203578B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A jelen találmány egy új, carG-nek nevezett karbomícin bioszintetikus génnel, a cargG gén alkalmazási módszereivel, az új gént tartalmazó rekombináns DNS klónozó vektorokkal és az új vektorokat tartalmazó transzformánsokkal foglalkozik. A Streptomyces δ thermotolerans (ATCC11416) törzs karbomicint termel, amely 16 tagú ciklusos laktonból és két cukorgyökből áll. A karbomicin antibiotikus aktivitása, a többi makrolidhoz hasonlóan a fehérje szintézis gátlásának tulajdonítható olyan mechanizmus révén, 10 amely a karbomicinnak a riboszómához való kötődésén alapul. A carG gén kódolja azt az aktivitást, amely a karbomicin 16-tagú ciklusos laktonjának előállításához szükséges.
Ajelen találmánykarbomicin bioszintetikus génki- 1 δ fejező vektorokat nyújt Streptomyceshen és más gazdasejtekben való felhasználásra. A rekombináns DNS technológia fejlődését és művelését Streptomyceshen az a kívánság hajtja előre, hogy javítsák ezeknek az iparilag fontos organizmusoknak az antibiotikum-ter- 20 melő képességét nem csupán az antibiotikum kitermelés növelése érdekében, hanem új antibiotikumok előállítása érdekében is. Ezt a fejlődést valamelyest hátráltatja a jelenleg rendelkezésre álló olyan antibiotikum bioszintetikus gének kis száma, amelyek rekom- 25 bináns DNS technológia segítségével Streptomyces módosítására felhasználhatók. A jelen találmány hasznos és különösen fontos abban, hogy kiterjeszti az ilyen alkalmazáshoz megfelelő antibiotikum biosztintetikus gének számát. 30
A jelen találmány szerinti vektorok különösen hasznosak, mert a vektorokat sokféle Streptomyces sejtjeibe lehet bevezetni és ki lehet választani a transzformánsokat. A klinikailag fontos antibiotikumok felét a Streptomyces szolgáltatja, így kereskedelmileg 35 igen fontos csoport.
A jelen találmány új és hasznos vektorokat és módszereket nyújt, de nem csupán ahhoz az iparilag fontos csoporthoz, hanem más antibiotikum-termelő organizmusokhoz is, és lehetővé teszi a karbomicin terme- 40 lését fermentációval, valamint lehetővé teszi új antibiotikumok és antibiotikum-származékok előállítását.
A jelen találmány céljaira, amint ezt a későbbiekben leírjuk és igénypontokba foglaljuk, az alábbi kifejezéseket határozzuk meg. 45
AmR—az apramicin rezisztencia átadó gén
Antibiotikum — mikroorganizmusok által termelt anyag, amely, akár természetes formában vagy korlátozott módosítással, gátolja más mikroorganizmusok vagy eukarióta sejtek növekedését, vagy elpusztítja 50 azokat.
Antibiotikum bioszintetikus gén — DNS szegmens, amely egy vagy több olyan aktivitást kódol, amely a primer metabolitok antibiotikumokká való átalakításának biokémiai folyamatához szükséges. 55
Antibiotikum bioszintetikus út — antibiotikum bioszintetikus gének teljes készlete, amely a primer metabolitok antibiotikumokká való átalakításának folyamatához szükséges.
Antibiotikum-termelő organizmus — bármilyen 60 organizmus, pl. (a korlátozás szándéka nélkül) Actinoplanes, Actinomadura, Bacillus, Cephalosporium, Micromonospora, Penicillium, Nocardia vagy Streptomyces, amely vagy antibiotikumot termel, vagy tartalmaz olyan géneket, amelyek, ha kifejlődnek, antibiotikumokat termelhetnek.
Antibiotikum rezisztencia átadó gén — DNS szegmens, amely olyan enzimes vagy más aktivitást kódol, amely antibiotikumra való rezisztenciát biztosit.
ApR- az ampicillin rezisztencia átadó gén
Bifunkcionális klónozó ingázó vektor — rekombináns DNS klónozó vektor, amely replikálódni és/vagy integrálódni képes két különböző faj organizmusaiba.
Klónozás—egy DNS szegmens beépítésének folyamata valamely rekombináns DNS klónozó vektorba és egy gazdasejt transzformálása a rekombináns DNSsel.
carA — A típusú, karbomicin rezisztencia átadó gén carB—B típusú, karbomicin rezisztencia átadó gén carG — DNS szekvencia, amely egy vagy több olyan gént tartalmaz, amelyek a karbomicin 16-tagú, ciídusos laktonjának képződéséhez szükséges aktivitásokat kódolják.
cos — a lambda kohézív vég szekvencia.
Kozmid — rekombináns DNS klónozó vektor, amely nemcsak replikálódni képes egy gazdasejtben a plazmáddal azonos módon, hanem képes beburkolni magát a fág fejébe.
Gén — DNS szekvencia, amely egy promotort és egy kódoló szekvenciát tartalmaz úgy elhelyezve, hogy a promotor ösztönözze a kódoló szekvencia átírását.
Genetikai könyvtár — rekombináns DNS klónozó vektorok készlete, amelyekbe a szóban forgó organizmus DNS-ének lényegében mindegyikét tartalmazó DNS szegmenseket klónozták.
Hibrid antibiotikum — antibiotikum, amelyet egy gazdasejt természetes formában nem állít elő, de termeli az a gazdasejt, amelyet egy antibiotikum bioszintetikus gént tartalmazó rekombináns DNS vektorral transzformáltak.
Hibridizálás -- két egyszálú DNS molekula összeforrasztásának folyamata DNS molekula képzésére, amely lehet teljesen bázispáros, de nem teljesen bázispáros is.
NmR—a neomicin rezisztencia átadó gén. őri -- egy plazmid replikációs origója.
Fazmid — rekombináns DNS vektor, amely működhet fágként vagy plazmidként.
Rekombináns DNS klónozó vektor — bármilyen autonóm módon replikálódó vagy integrálódó anyag, beleértve (de nemcsak erre korlátozva) a plazmidokat, amelyek előreviszik egy géntermék, pl. mRNS, tRNS, rRNS, és az mRNS transzlációja után, egy fehérje kifejeződését egy gazdasejtben.
Rekombináns DNS vektor — bármilyen rekombináns DNS klónozó vagy kifejező vektor.
Restrikciós fragmentum—bármilyen lineáris DNS molekula, amely egy vagy több restrikciós enzim működése következtében alakult ki.
HU 203 578 Β rRNS—riboszomális ribonukleinsav.
Érzékeny gazdasejt — gazdasejt, amely nem képes nőni egy adott antibiotikum jelenlétében egy olyan DNS szegmens nélkül, amely arra az abtibiotikumra rezisztenciát ad át.
TcR — tetraciklin-rezisztens fenotípus vagy az azt átadó gén.
Transzduktáns — befogó gazdasejt, amelyet transzformációnak vetettünk alá rekombináns fág fertőzéssel.
Transzformáns — befogadó gazdasejt, amelyet transzformációnak vetettünk alá.
Transzformálás — DNS bevezetése valamely befogadó gazdasejtbe, amely bevezetés megváltoztatja a genotípust és változást eredményez a befogadó sejtben.
tsrR — a tiosztrepton-rezisztens fenotípus vagy az azt átadó gén.
A bejelentéshez tartozó, alább ismertetett ábrák léptékben vannak ábrázolva; a megfigyelt restrikciós fragmentum méret azonban eltérhet valamelyest a térkép távolságain alapuló kalkulált mérettől. Néhány restrikciós enzimnél, pl. Mbol-nél, csak bizonyos hasítási helyeket tüntetünk fel a jobb áttekinthetőség miatt.
Az 1. ábra a pOJ171 plazmid restrikciós hely- és működési térképe.
A2. ábra a pOJlóO plazmid restrikciós hely- és működési térképe.
A 3. ábra a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és működési térképe.
A jelen találmány új karbomicin bioszintetikus génnél foglalkozik, ezt carG-nek nevezzük, ezt fel lehet használni az antibiotikum kitermelés fokozására és új antibiotikumok előállítására. A carG gén hasznos egy karbomidn-termelő organizmus képességének fokozására alkalmas módszerben, amely módszer abban áll, hogy a carG géntermék kifejeződését kódoló rekombináns DNS vektorral az organizmust transzformáljuk, és a transzformált sejtet karbomicin-termelésre alkalmas körülmények között tenyésztjük. A módszer különösen előnyös a Streptomyccs thermoto lerans gazdasejt karbomicin-termelő képességének fokozására. A carG gént a pOJ171 plazmidból lehet izolálni a ~14 kb-s BglII restrikciós fragmentumban; a pOJ171 plazmidot azE. coliK12SF8/pOJ171 törzsből lehet izolálni, ez a törzs letétbe van helyezve az Agricultural Research Service [Northern Régiónál Research Center (NRRL), Peoria, Illinois 61604] állandó törzsgyűjteményében és annak részét képezi NRRL B-18169 letéti számon. ApOJ171 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábrában mutatjuk be.
A pOJ171 plazmid hasznos kiindulási anyagként szolgál más olyan vektorok megalkotásához, amelyek tartalmazzák a carG karbomicin bioszintetikus gént. így pl. a pOJ171 plazmid ~14,0 kb-s BglH restrikciós fragmentumát, amely tartalmazza a karbomicin bioszintetikus gént, izoláljuk, és BglH-vel emésztett pOJlóO plazmidba (NRRL B-18088) iktatjuk, így alakítjuk ki a pOJ325 és pOJ325A plazmídokat, amelyek csak a -14,0 kb-s, karbomicin bioszintetikus gént tartalmazó BgUI restrikciós fragmentum orientációjában különböznek. A pOJ325 és pOJ325A plazmidok előállítási munkamenetét a 2. példában adjuk meg; a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra adja meg.
A carG-t tartalmazó jelen találmány szerinti -14 kb-s BglII restrikciós fragmentum valójában egynél több gént tartalmazhat. A carG gén aktivitását legjobban úgy lehet megérteni, hogy meghatározzuk azt a mutációt, amelyet a carG gén kiegészít. A Streptomyces thermotolerans bizonyos mutánsai, mint pl. az NRRL 15270, amelyet a 4 522 919 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet, nem termel karbomicint vagy karbomicin-rokon vegyületeket, hacsaknem egészítjük ki a karbomicin vagy hasonló antibiotikumok 16-tagú ciklusos laktonjával. A jelen találmány szerinti carG gén azt az enzimes aktivitást kódolja, amely ahhoz szükséges, hogy az olyan organizmus, mint az NRRL 15270, képes legyen karbomicint termelni a 16-tagú ciklusos lakton hozzáadása nélkül.
A jelen találmány módszert nyújt hibrid antibiotikum termelésére is valamilyen gazdasejtben, a módszer abban áll, hogy egy gazdasejtet olyan rekombináns DNS vektorral transzformáljuk, amely előreviszi a carG géntermék kifejeződését, és a transzformált gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely a hibrid antibiotikum előállítgásához alkalmas. A módszer különösen alkalmas makrolid-termelő gazdasejtekhez, elsősorban a Streptomyces makrolid-termelő törzseihez.
A carG gént Streptomyces thermotolerans egy karbomicintermelő törzséből (ATCC 11416) izoláljuk, így a S. thermotolerans genomiális DNS-ét részlegesen emésztjük Mbol restrikciós enzimmel és az így létrejövő DNS-t beiktatjuk Hpal-gyel és BamHI-gyel emésztett pKC462A kozmidba, hogy egy sor carG-t tartalmazó plazmidot kapjunk, köztük a pOJ 171-et. A pKC462A plazmid (NRRL B-15973) olyan típusú kozmid ingázó vektor, amelyet a 842,102 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1986.03.20.) ismertet.
A jelen találmány szerinti vektorokat lehet alkalmazni egy sor organizmus transzformálására, hogy növeljük az organizmus karbomicin-termelő képességét vagy lehetővé tegyük, hogy az organizmus szintetizálja a karbomicin 16-tagú ciklusos laktonját, amely hasznos köztes termék az antibiotikum bioszintézisben. Ezen kívül a carG gént lehet alkalmazni különböző antibiotikum-termelő organizmusok, különösen makrolid antibiotikum-termelő organizmusok transzformálására abból a célból, hogy új antibiotikumokat állítsunk elő. A carG gént magát lehet rekonstruálni, rekombináns DNS technikát alkalmazva, abból a célból, hogy a carG génterméket állítsuk elő nem Streptomyces fajokban. Az alábbi táblázatok különböző antibiotikum-termelő organizmusok mintáit tartalmazzák, amely organizmusokban a carG gént lehet alkal3
HU 203 578 Β mazni vagy új antibiotikum termelés növelésére.
I. Táblázat
Anzamicin antibiotikum-termelő organizmusok
Organizmus Antibiotikum
Micromonospora
különböző fajok különböző anzamicinek
Nocardia mediterránéi rif amiéin
Streptomyces collinus anzatriének és naf tomicinek
diastatochromogenes anzatriének és naf tomicinek
galbus, griseosporeus alfa] naftomicinB
hygroscopicus herbimicin
hygroscopicus var geldanus
var nova geldamicin
nigellus 21 -hidroxi-25-dimetil-25-metil-tio-
-prostostreptovaricin
rishiriensis mikotriének
sp.E/784 aktamicin ésmikotriének
sp.E88 mikotriének
spectabilis streptovaricinek
tolypophorous tolipomicin
Π. Táblázat
Antraciklin és kínon antibiotikum-termelő organizmusok
Organizmus Antibiotikum
Streptomyces
caespitosus A, B és C mitomicinek
coelicolor aktinorodin
coendeorubidicus daunomicin
cyaneus ditrizarubicin
flavogriseus cianociklinA
galilaeus aklacinomicin A, auramicinek és szulfurmicir
lusitanus naftiridinomicin
peuceticus daunomicin és adriamicin
violochromogenes arugomicin
III. Táblázat
Makrolid, linkózamid és streptogramin antibiotikum-termelő organizmusok
Micromonospora Antibiotikum
rosaria rosar amicin
Streptomyces
albireticuli karbomicin
albogriseolus mikonomicin
albus albomicetin
albus v&rcoilmyceticus koleimicin
ambofaciens spiramicin és foromacidin D
antibioticus oleandomicin
acermitilis acermektinek
bildniensis kalkomicin
bruneogriseus albociklin
caelestis M188 ésceleszticetin
cinereochromogenes cineromicinB
cirratus cirr amicin
deltae deltamicinek
djakartensis niddamicin
erythreus eritromicinek
HU 203 578 Β
IH. Táblázat folytatása
Makrolid, linkózamid és streptogramin antibiotikum-termelő organizmusok
Micromonospora Antibiotikum
eurocidicus meticin
ewythermus angolaiméin
fasciculus amaromicin
felleus argomicin és pikromicin
fimbríatus amaromicin
flavochromogenes amaromicin és sinkomicinek
fradiae tilozin
fungicidus var. espinomyceticus espinomicinek
furdicidicus midekamicin
goshikiensis bandamicin
groseoflavus akumicin
griseofuscus bundlin
gríseolus griseomicin
griseospiralis relomicin
griseus borrelidin
griseus, sulphurus alfa.) holstedi karbomicin és leukanicidin
hygroscopicus tilozin
hygroscopicus, aureolacrimosus alfa'} milbemicinek
kitastoensis leukomicin A3 és joszamicin
lavendulae aldgamicin
lincolniensis linkomicin
loidensis vernamicin AésB
macrosporeus karbomicin
maizeus ingramicin
mycarofaciens acetil-leukomicin és espinomicin
narbonensis joszamicin és narbomicin
narbonensis var josamiceticus leukomicin A3 és joszamicin
olivochromogenes oleandomicin
platensis platenomicin
rimosus tilozin és neutramicin
rochei lankacidin és borrelidin
rochei vsavolubilis T2636
roseocitreus albociklin
roseocitreus albociklin
spinichromogenes var. surogaoensis kujimicinek
tendae karbomicin
thermotolerans karbomicin
venezuelae meticinek
ciolaceoniger lankacidinek és lankamicin
ÍK Táblázat Vegyes antibiotikum-termelő Streptomyces
Antibiotikum típus Streptomyces faj Antibiotikum
ciklopentán gyűrűt tartalmazók coelicolor metilenomicinA
erithrochromogenes szarkomicin
kasugaensis aureotricin ;s tiolutin
ciolaceoruber metilenomicinA
poliének griseus kandicidin
nodosus amfotericinB
noursei nisztatin
tetraciklmek auereofaciens tetraciklin, klór-tetraciklin, dimetil-tetraciklin
rimosus és demetil-klór-tetraciklin oxitetraciklin
HU 203 578 Β
V. Táblázat
Poliéter antibiotikum-termelő organizmusok
Organizmus_
Actinomadura különböző fajok oligosporus Dactylosporangium különböző fajok Nocardia különböző fajok Streptomyces albus aureofaciens bobili cacaoi var. asoensis chartreusis cinnamonensis conglobatus eurocidicus var. asterocidicus flaveolus gallinaríus griseus hygroscopicus lasilaensis longwoodensis mutabilis pactum ribosidificus violaceoniger
Streptoverticillium különböző fajok
Antibiotikum különböző poliéterek
A80190 különböző poliéterek különböző poliéterek
A204, A28695A és B, és szalinomicin narazin
A80438 lizocellin
A23187 monenzin ionomicin laidlomicin
CP38936
RP 30504 grisorixin
A218, emericid, DE3936, A120A, A28695AésB, eteromicin és dianemicin lazalocid lizocellin
S-l1743a
A80438
Ionomicin nigericin különböző poliéterek
A jelen találmányt illusztráló vektorokat Streptomyces thermotolerans NRRL 15270-be vezetjük be abból a célból, hogy példát nyújtsunk a carG gén alkalmazására egy organizmus karbomicin-termelŐ képességének növelésére. A S. thermotolerans NRRL 15270 a S. thermotolerans ATCC 11416-ból szárma- 40 zik mutagenezissel, amint ezt a 4 552 919 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás bemutatja. Az NRRL 15270 nem termel karbomicint, mivel a kromoszóma carG területében egy kiiktatás (deléció) van. Ez a kiiktatás mintegy 6 kb méretű, 46 amely azt jelzi, hogy a jelen találmány szerinti -14 kbs, carG-t tartalmazó restrikciós fragmentumot méretben le lehet csökkenteni, hogy még adjon át carG aktivitást. Amikor a jelen találmány szerinti carG gént tartalmazó vektorokat alkalmazzuk NRRL 15270 60 transzformálására, az így létrejövő transzformánsok több karbomicint termelnek, mint a S. thermotolerans ATCC 11416. A S. thermotolerans NRRL 15270 transzformálását és az így létrejövő transzformánsok összehasonlítását S. thermotolerans ATCC 11416-tal 66 a 3. és 4. példákban mutatjuk be.
A carG gén különösen a Streptomyces thermotoleransban működik jól. Még ha az eredeti carG gén nem is fejeződik ki egy adott organizmusban, pl. E. coliban, mivel pl. a Streptomyces promotor nem képes működ- 60 ni ebben az organizmusban, a jelen találmány szerinti carG kódoló szekvenciát ligálni lehet egy megfelelő promotort és riboszóma-kötő helyet tartalmazó DNSbe, hogy a carG gén kifejeződését elérjük a kiválasztott gazdaszervezetben.
A pOJ 171 plazmid tartalmazza a carG gént: (1) egy promotort, amely irányítja a fehérje-kódoló szekvenciát; (2) egy olyan szekbenciát, amely — amikor mRNS-be át van írva — irányítja az átirat transzlációját; (3) egy fehérje-kódoló szekvenciát; és (4) egy átírási terminátort. Ezeknek az elemeknek mindegyike függetlenül alkalmazható, és ezeket—a rekombináns DNS technológia révén — alkalmazni lehet nagyon sokféle rekombináns gén képzésére. Mivel a carG gén DNS szekvenciája meghatározza a carG kódoló szekvencia helyét, meghatározza más promotorok elhelyezhetőségét is a carG kódoló szekvenciával leolvasó fázisban. Ilyen más promotorok lehetnek pl: az E. coli trp, lpp és lac promotor jai, a hibrid tac promotorjai, a hibrid tac promotor, a Bacillus vég promotorja. A megfelelő promotor kiválasztásával lehet olyan vektorokat alkotni, amelyek előreviszik a carG géntermék kifejeződését bármilyen gazdasejtben. A carG gén promotorja saját működése szerint alkalmas. A carG gén promotor ját és más szabályozó elemeit össze lehet kapcsolni egy nem-karbomicin antibiotikum bioszin-61
HU 203 578 Β tetikus gén kódoló szekvenciájával, hogy olyan hibrid antibiotikum bioszintézis-út gént állítsunk elő, amely más Streptomyces fajokban működik, így állítva elő hibrid antibiotikumokat. így az itt leírt plazmidokban levő gén egyedi elemei a jelen találmány fontos részeit tartalmazzák
Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy az NRRL B-18169 letéti számon deponált carG szekvenciát lehet alkalmazni DNS vizsgáló minták előállítására is, más bioszintetikus gént tartalmazó gén-szegmensek kinyerésében való alkalmazásra, különösen olyan gén-szegmensekére, amelyek makrolid bioszintetikus géneket kódolnak. Ezen kívül a Streptomyces thermotolerans törzsek sokfélesége miatt mind a természetben, mind a laboratóriumban, a carG gén sokféle alléi variánsait lehet izolálni, a jelen találmány szerinti carG gént tartalmazó anyagot adva. Ezek az alléi változatok, amelyek olyan aminosavszekvenciával rendelkező génterméket kódolnak, amelyek csak néhány gyökben térnek el a carG géntermék aminosavszekvenciájától, funkcionálisan ekvivalensek a jeS len találmány szerinti carG génnel.
Sokféle ismert Streptomyces replikont alkalmazhatunk a carG génnel összekapcsolva, hogy a jelen találmány szerinti kifejező vektorokat megalkossuk. A VI. Táblázat bemutató, d e nem korlátozó listája azoknak a plazmidoknak, amelyekből Streptomyces replikonokat lehet kapni. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy amíg a replikon funkció nincs elpusztítva, a plazmidok egészét vagy részét lehet alkalmazni olyan vektorok megalkotására, amelyek a jelen talál15 mány szerinti carG gént tartalmazzák. A plazmid-tartalmú gazdaszervezetek és a deponálást számok szintén a VI. Táblázatban vannak felsorolva.
VI. Táblázat Streptomyces plazmidok
Plazmid Gazdaszervezet Letéti szám
SCP2 Streptomyces coelicolor A3(2) NRRL 15042
SCP2* Streptomyces coelicolor Μ110 NRRL 15041
pEL7 Streptomyces ambofacíens/pEL7 NRRL 12523
pUCó Streptomyces espinosus NRRL 11439
pUC3 Streptomyces 3022A NRRL 11441
SLP1 Streptomyces lividans NOB* 11417
pNMIOO Streptomyces Virginiáé NRRL 15156
pEL103 Streptomyces granuloruber A39912.13/pEL 103 NRRL 12549
pU702 Streptomyces Ucidans ATCC**39155
♦National Collection of Industrial Bacteria (NCEB), Torry Research Station, Post Office Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB98DB, Skócia, Egyesült Királyság ♦♦American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852
A jelen találmányt bemutató vektorok megalkotásához alkalmazott restrikciós fragmentumokat könynyen lehet módosítani, hogy megkönnyítsük a ligálást. így pl. molekuláris kapcsolókat alkalmazhatunk egy adott carG bioszintetikus gént tartalmazó restrikciós fragmentumhoz, vagy egy olyan DNS-hez, amely vektor replikációs vagy integrációs funkciókat tartalmaz, így az ez után következő ligáláshoz könnyen ki lehet alakítani fajlagos helyeket. Ezen kívül különböző bioszintetikus gént tartalmazó restrikciós fragmentumokat, replikációs origót, vagy egy adott vektor kromoszomális integrációjához adott szekvenciákat lehet módosítani bizonyos nukleotidok hozzáadásával, eltüntetésével vagy helyettesítésével, hogy megváltoztassunk jellemzőket és különböző restrikciós helyeket szolgáltassunk DNS ligálásához. Azok, akik a szakterületen jártasak, ismerik a nuldeotid-kémiát és a genetikai kódot, így tudják, hogy mely nukleotidok cserélhetők ki egymás között és milyen DNS módosítások kívánatosak bizonyos speciális célok elérésére. Meg kell jegyeznünk, hogy egy adott carG bioszintetikus gént tartalmazó estrikciós fragmentum nem korlátozódik egy klónozó vektor egy adott helyzetére mindaddig, amíg a kritikus, vektorral szabályozott funkciók el nem roncsolódnak. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják és könnyen meg tudják határozni, hogy a vektoron mely helyek előnyösek a ligáláshoz vagy egy adott carG gént tartalmazó restrikciós fragmentum beiktatásához.
A carG gént természetesen lehet alkalmazni más vektorok megalkotására is, nemcsak plazmidokéra. A 0C31 fág jól ismert Streptomyces fág, amely kiváló forrása a kiindulási anyagnak integratív karbomicin rezisztencia átadó vektorok megalkotásához, amelyek további példákat nyújtanak a jelen találmányhoz. A 0C31 fág egyik származéka, a pKC331 fazmid, különösen előnyős az Uyen integráló vektorok megalkotá50 sához, és ezt E. coli K12 BE447/pKC331-ből (NRRL B-15828) kaphatjukA 0C31 típusú fágok integratív vektorok, és ezeket könnyen lehet módosítani, hogy beépítsük a carG gént és így carG aktivitást vigyünk át Streptomcesbe. Még azok a plazmidok is, amelyek olyan replikációs origót tartalmaznak, amely a plazmid extrakromoszomális fenntartását biztosítja, néha integrálódnak a gazdasejt genomjába, általában a replikon szekvenciák ezzel együtt járó kiiktatásával. A jelen találmány így nem korlátozódik sem az alkalma60 zott vektor-típusra, hogy a carG gént bevezessük a cél
HU 203 578 Β gazdasejtbe, sem a carG gén elhelyezésére, amikor a bevezetés megtörténik
A jelen találmány szerinti vektorok tartalmaznak egy Streptomyces replikációs origót és egy carG gént tartalmazó restrikciós fragmentumot. Mivel a plazmidok sokszorozása és manipulációja gyorsabb és hatékonyabb E. coli-ban, mint Streptomycesben, kényelmes eljárás olyan DNS szekvenciákat hozzáadni, amelyek lehetővé teszik a replikációt E. coli-ban. így E. coli plazmidokból származó funkcionális replikációs origót tartalmazó és antibiotikum rezisztenciát átadó restrikciós fragmentumok nagymértékben előnyösek, és hozzájárulnak a jelen találmányt bemutató vektorok általános hasznosságához, a fenti plazmidokra példák a pUC8, pUC18, pUC19, pBR322, pACYC184, pBR325, pBR328 és hasonlók.
A Streptomyces thermotolerans két karbomicin rezisztencia átadó gént tartalmaz, amelyeket carA-nak, illetve carB-nek nevezünk. Ez a két karbomicin rezisztencia gén működhet Összhangban, így magasszintű rezisztenciát idézve elő karbomicinre Streptomyces thermotoleransban, így ezek előnyösek lehetnek a jelen találmány szerinti vektorként alkalmazva. A carA gént a pOJ158 plazmádból lehet izolálni, amely S. griseofuscus gazdasejtben az NRRL-nél rendelkezésre áll NRRL18090 letéti számon. A jelen találmány foglalkozik olyan vektorokkal is, amelyek tartalmazzák a carG gént és a carA és carB gén egyikét, vagy mindkettőt. A pOJ171 plazmid pl. tartalmazza mind a carG, mind a carB géneket.
A jelen találmány szerinti klónozó vektorok és transzformánsok a gének olyan jellegű klónozásához valók, amely növeli a különböző termékek kitermelését, amelyek Streptomycesben és rokon sejtekben képződnek Az ilyen termékekre — nem korlátozó jelleggel —példák a karbomicin, streptomicin, tilozin, cefalosporinok aktaplanin, narazin, monezin, tobramicin, eritromicin és hasonlók. A jelen találmány szelektálható vektorokat is nyújt, amelyek alkalmasak sokféle hasznos DNS szekvencia klónozásához, jellemzéséhez és helyreállításához.
A Streptomycest sokféle módon lehet tenyészteni, sokféle különböző tápközeg bármelyikét alkalmazva. Előnyös szénhidrátforrások a tápközegben lehetnek pl. a melasz, glükóz, dextrin és glicerin. Nitrogénforrások lehetnek pl. a szójaliszt, aminosav-keverékek, és peptonok. A tápközegbe szervetlen sókat is be kell építeni, ezek lehetnek pl. az olyan, kereskedelmi forgalomban levő sók, amelyek nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, klorid, szulfát, és hasonló ionok termelésére képesek Amint ez szükséges más mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez is, esszenciális nyomelemeket is adunk a tápközeghez. Az ilyen nyomelemek általában adódnak a tápközeg többi alkotórészének véletlenszerű szennyeződéséből.
A Streptomyces aerob tenyésztési körülmények között nő, viszonylag széles pH tartományban, mintegy 5 és 9 között, 15’-40 'C közti hőmérséklettartományban. A plazmid stabilitásához és fenntartásához kívánatos mintegy pH 7,2 értékű tenyésztő tápközeggel kezdeni, és a tenyészet hőmérsékletét mintegy 30 ’Con tartani.
Az alábbi példák tovább illusztrálják és részletesen leírják az itt bemutatott találmányt. A találmány oltalmi köre nem korlátozódik az alábbi példák egyikére sem; a reagensek vagy berendezések forrásait csak kényelmi szempontok miatt adjuk meg, és semmiképpen sem korlátozás céljából. Mind a találmány megalkotásához szükséges magyarázatokat, mind a szükséges eljárásokat leírjuk, ahol szükséges.
l.példa
A pOJ171 plazmid izolálása
A.AzE. coli KI 2 SF8/pOJ171 tenyésztése
A pOJ171 plazmidot a Northern Régiónál Research Center-tői szerezhetjük be. E. coli K12 SF8/pOJ 171 liofilezett tenyészetét L-agar lemezre helyezzük (10 g Bacto-tripton, 10 g NaCl, 5 g Bactoélesztökivonat, és 15 g agar literenként), amely még 200 pg/ml apramicint is tartalmaz, ilyen módon kapjuk a törzs egy egyedi telepizolátumát. Ezt a telepet alkalmazzuk mintegy 500 ml 200 μ-g/ml apramicint is tartalmazó L-tápközeg inokulálására (L-agar agar nélkül), az így létrejött tenyészetet 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett, amíg a sejtek elérik a stacionárius fázist.
A sejtekből plazmid DNS-t nyerünk ki a pOJ325 plazmid megalkotásához való felhasználásra az alábbi eljárás szerint, amely eljárást Maniatis és társai munkája alapján dolgoztunk ki [Molecular Cloning (Cold SpringHarborLaboratory) 1982].
Ugyanezt az eljárást alkalmazzuk, csak kisebb lépésekben és az ultracentrifugálási lépés helyett fenolos, majd kloroformos extrahálást alkalmazva, a plazmid DNS előállítására akkor is, amikor az E. coli KI 2 RRlÁM15/pOJ325 transzformánsok azonosítására alkalmazzuk
Mintegy 500 ml stacionárius fázisban levő E. coli/pjl 71 sejtet nyerünk ki 4000 g értéknél, 10 percen át, 4 ’C hőmérsékleten végzett centrifugálással, és a felülúszót elöntjük A sejtüledéket 100 ml jéghideg STE pufferban mossuk [0,1 mól/1 NaCl, 10 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,8) és 1 mmól/1 EDTA]. A sejtüledék mosása után a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml 1. oldatban50 mmól/1 glükóz, 25 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,0), és 10 mmól/1 EDTA [], amely 1 mg/ml lizozimot is tartalmaz, és 10 percen át szobahőmérsékleten tartjuk 20 ml 2. oldatot (0,2 n NaOH és 11% SDS) adunk ezután a lizozimmal kezelt sejtekhez, és az oldatot enyhén keverjük megforgatással. A keveréket jégen inkubáljuk 10 percen át.
ml jéghideg, 3 mól/l-es nátrium-acetát oldatot (pH 4,8) adunk a lizált sejtkeverékhez, és az oldatot enyhén keverjük megforgatással. Az oldatot jégen inkubáljuk 60 percen át. A 3 mól/l-es nátrium-acetát oldatot ügy készítjük, hogy összekeverünk azonos térfogatú 3 mól/1 ecetsavat és 3 mól/1 nátrium-acetátot.
A lizált sejtkeveréket Beckman SW27 rotorban (vagy ezzel egyenértékű berendezésben) centrifugáljuk 20000 fordulat/percnél, 20 percen át 4 ’C hőmér-81
HU 203 578 Β sékleten. Mintegy 36 ml felülúszót nyerünk ki, és 2,5 térfogat etanolt adunk hozzá, összekeverjük, és az így létrejött oldatot jégen hagyjuk 15 percen át. A plazmid DNS-t centrifugálással összegyűjtjük 12000 g-nál, 30 percen át, szobahőmérsékleten. A felülúszót elöntjük, a DNS üledéket 70%-os etanollal mossuk szobahőmérsékleten. Az etanolos mosóoldatot dekantáljuk, és az üledéket vákuumos szárítóban szárítjuk. Az üledéket ezután újra szuszpendáljuk 8 ml TE pufferban [10 mmól/1 trisz-HQ (pH 8,0) és lmmól/lEDTA].
g CsCl-t adunk a DNS oldathoz. Mintegy 0,8 ml-t adunk 10 mg/ml-es vizes etidium-bromid oldatból minden 10 ml CsQ-DNS oldathoz. Az oldat végső sűrűsége mintegy 0,761 g/ml, és az etidium-bromid koncentráció mintegy 800 pg/ml. Az oldatot átvisszük Beckman Type 50 centrifugacsőbe, tetejére TE puffer réteget helyezünk, amely 0,761 g CsCl-t tartalmaz milliliterenként, a csövet lezárjuk, és 45000 fordulat/percnél centrifugáljuk 24 órán át 20 *C hőmérsékleten. Centrifugálás után két DNS csík látható normál fénynél, ezek még szembetűnőbbek UV fényben. A fedőt eltávolítjuk a csőről és az alsó DNS csíkot kinyerjük, injekciós tűvel ellátott fecskendőt alkalmazva a centrifugacső oldalán keresztül.
Az etidium-bromidot úgy távolítjuk el a plazmid DNS oldatából, hogy az oldatot többször extraháljuk vízzel telített 1-butanollal, míg a CsCl-t TE-pufferral szemben végzett dialízissel távolítjuk el. Pufferolt fenollal, majd kloroformmal végzett extrahálás után a DNS-t kicsapjuk, 70%-os etanollal mossuk, és szárítjuk. Ezzel az eljárással mintegy 0,5 mg pOJ171 plazmid DNS-t kaphatunk. A pOJ171 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábrában mutatjuk be.
2. példa
A pOJ325 és pOJ325A plazmdok megalkotása
A. A pOJlóO plazmid izolálása
A pOJ 160 plazmidot a Northern Régiónál Research Center-tői szerezhetjük be, E. coli K12 JM109 törzsben, NRRL B-18088 letéti számon. Az E. coli K12 JM109/pOJ160 liofilizett tenyészetét L agar lemezre helyezzük (10 g Bacto-tripton, 10 g NaQ, 5 g Bacto élesztőkivonat, és 15 g agar literenként), amely még 200 pg/ml apramicint is tartalmaz, ilyen módon kapjuk a törzs egyedi telep-izolátumát. Ezt a telepet alkalmazzuk mintegy 500 ml, 200 pg/ml apramicint is tartalmazó L-tápközeg inokulálására (L-agar agar nélkül), az így létrejött tenyészetet 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk levegőztetés mellett, amíg a sejtek elérik a stacionárius fázist.
A sejtekből plazmid DNS-t nyerünk ki a pOJ325 plazmid megalkotásához való felhasználásra a fenti 1. példában leírt eljárással összhangban. Mintegy 0,5 mg pOJ160 plazmid DNS-t kaphatunk ezzel az eljárással. A pOJ160 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábra mutatja be.
B. A pOJ325 plazmid végső megalkotása
Mintegy 10 pg (10 pl) pOJ160 plazmid DNS-t adunk 2 pl lOxBamHI pufferhez [60 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,9), 1,5 mól/1 NaCl, 1 mg/ml BSA, és 60 mmól/1 MgQ2], 6 pl H20-hoz és 2 pl BamHI restrikciós enzimhez [-30 egység; az egység definíciója itt annak felel meg, amelyet a New England Biolabs (32 Tozer Road, Beverly, Massachussets 01915-9990) megadott, hacsak másképpen nem jelezzük]. Az így kapott reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A BamHI-gyel emésztett pOJ16Q plazmid DNS-t úgy nyerjük ki, hogy a reakciókeverék nátriumacetát (NaAc) koncentrációját 0,30 mól/l-re állítjuk be, hozzáadunk 2,5 térfogat etanolt, a reakciókeveréket -70 ’C-ra hűtjük le, és centrifugálunk, hogy a kicsapott DNS-t üledékbe vigyük. A BamHI-gyel emésztett pOJ160 DNS üledékétújra szuszpendáljuk 400 pl TE pufferban [10 mmól/1 trisz-HQ (pH 8,0) és 1 mmól/1 EDTA], Mintegy 1 pl (0,1 egység) bakteriális alkálikra foszfatázt (International Biotechnology, Inc., Ρ.Ο,Βοχ 1565, New Haven, Connecticut 06506) adunk a DNS oldathoz, és a reakciókeveréket 65 ‘C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk. A reakciókeveréket 400 pl fenolikloroform 1:1 keverékkel extraháljuk, majd 400 pl kloroformmal extraháljuk. A BamHI-gyel emésztett, defoszforilezett pOJ160 plazmid DNS-t a fentiek szerinti etanolos kicsapással és centrifugálással összegyűjtjük, és a DNS üledéket újra szuszpendáljuk 10 pl TE pufferban.
Mintegy 10 pg pOJ171 plazmidot 100 pl TE pufferban hozzáadunk 13 pl 10 x Bgin pufferhoz [1,0 mól/1 NaQ, 100 mmól/1 trisz-HQ (pH 7,4), 100 mmól/1 MgQ2,100 mmól/12-merkapto-etanol, és 1 mg/ml BSA], 13 pl H2O-hoz és 4 pl (-60 egység) BglII restrikciós enzimhez. Az így létrejött reakciókeveréket 37 ’C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A reakciókeveréket extraháljuk, és a DNS-t a fentiek szerint összegyűjtjük. A DNS üledéket feloldjuk 50 pl TE pufferban, ez mintegy 2,5 pg-ot tartalmaz a pOJ171 plazmid kívánt -14 kb-s BglII fragmentumából.
A BamHI-gyel emésztettt, defoszforilezett pOJ160 plazmid DNS-t (1 pl) hozzáadjuk 10 pl (-0,5 pg), BglH-vel emésztett pOJ171 plazmid DNS-hez, 2 pl 10 x ligás pufferhez [660 mmól/1 trisz-HQ (pH 8); 66 mmól/1 MgQ2, 10 mmól/1 ditiotreitol (DTT), és 10 mmól/1 ATP], és 6 pl H2O-hoz. Mintegy 1 pl (~100 egység) T4 DNS ligázt adunk a DNS oldatához, és az így létrejött reakciókeveréket 15 ’C hőmérsékleten egy éjszakán (-16 órán) át inkubáljuk. A ligáit DNS tartalmazza a kívánt pOJ325 plazmid DNS-t; a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és funkciós térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra mutatja be. Mivel a POJ171 plazmid -14 kb-s, carG gént tartalmazó BglII restrikciós fragmentumot a pOJ160 plazmidba a két orientáció mindegyikébe be lehet építeni, a ligálás létrehozza a pOJ325A plazmidot is, amely a pOJ325 plazmidtól csak a carG gént tartalmazó restrikciós fragmentum orientációja tekintetében különbözik.
A pOJ160 plazmid BamHI helye egy olyan polilinkeren belül helyezkedik el, amely maga a lacZ «-fragmentumot kódoló DNS szekvencia részét képezi. A
HU 203 578 Β lacZ α-fragmentum kifejeződése valamely E. coli ΔΜ15 törzsben, pl. E. coli K12 RR1AM15 (NKRL B15440) törzsben, helyreállítja a törzsnek azt a képességét, hogy funkcionális β-galaktozídás enzimet termeljen. így a pOJlőO plazmid helyreállítja a β-galaktozidáz aktivitást az E. coli K12 RR1AM15 törzsnél. A DNS beiktatása azonban a pOJ 160 plazmidon levő polilinker restrikciós helyébe, ahogyan ez a POJ 325 megalkotásánál történik, szétroncsolja a lacZ «-fragmentum kódoló szekvenciát, következtében elpusztítja a pOJlőO plazmid származéknak azt a képességét, hogy kiegészítse a M15 mutációt. A β-galaktozidáz hidrolizálja azX-gal-t (5-bróm-4-klór-3-indolü-p-Dgalaktopiranozid, színtelen vegyület) indigó-színű termékké és így kényelmes átvizsgálást lehetőséget nyújt a transzformánsok megkülönböztetésére, megkülönböztetve azokat a plazmidokat, amelyek a pOJlőO kiindulási plazmidot tartalmazzák, azoktól a plazmidoktól, amelyek egy pOJlőO származékot, pl. pOJ325 plazmidot tartalmazzák.
AzE. coliK12RRl M15 sejtek, amelyek transzformációhoz kompetensek, előállítására az NRRL-től kapott E. coli K12 RR1AM15 liofilizátumot helyreállítjuk, hogy egyedi telepeket izolálhassunk. Az RR1AM15 egy egyedi telep izolátumát 10 ml L-tápközegbe inokuláljuk (10 g Bacto-tripton, 10 g NaCl, 1 gBacto-élesztőkivonat literenként), és a tenyészetet 37 ‘C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. Az egy éjszakán át nőtt tenyészetet alkalmazzuk 200 ml L-tápközeg inokulálására, hogy mintegy 0,1 OJ)600 értékű tenyészetet kapjunk. A tenyészetet 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, amíg az OD600 érték eléri a 0,6-ot. A tenyészetet 4000 g-n, 10 percen át, 4 ’C hőmérsékleten végzett centrifugálással összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 100 ml hideg, 50 mmól/l-es CaCl2 oldatban és jégen inkubáljuk 15-30 percig.
A sejteket ismét összegyűjtjük centrifugálással és újra szuszpendáljuk 10 ml hideg, 50 mmól/l-es, 20% glicerint tartalmazó CaCl2 oldatban. A sejtek 200 μΐnyi alikvotjait adjuk a fenti ligáit DNS-hez. A sejtDNS keveréket jégen inkubáljuk egy órán át, centrifugáljuk, és a sejtüledéket újra szuszpendáljuk egy órán át, centrifugáljuk 0,5 ml L-tápközegben, 1,5 ml-es csőben, és levegőztetés mellett inkubáljuk 37‘C hőmérsékleten 1/2 órán át.
A transzformáns keverékből alikvotokat szélesztünk L-agar (L-tápközeg 15 g/liter agarral) lemezekre, amelyek 200 pg/ml apramicint, 40 pg/ml X-gal-t és 40 pg/ml IPTG-t tartalmaznak. Az IPTG arra szolgál, hogy derepresszálja a pOJ 160 plazmidon jelen levő lac promotort. A lemezeket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. Azok a telepek, amelyek beiktatás nélküli plazmidot tartalmaznak, mint pl. azE. coliK12 RRlÁM15/pJO160, kék színnel tűnnek elő ezeken a lemezeken. Azok a telepek, amelyek beiktatással rendelkező plazmidot tartalmaznak, mint pl. az E. coli K12 RRl&M15/pOJ325, fehérek. Számos apramicinrezisztens, fehér telepet választunk ki, majd plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével átvizsgáljuk ezeket. Amint a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és működési térképben feltüntettük, amikor egy BaHI átfedést ligálunk egy BglII átfedéshez, XhoH helyet hozunk létre. Sem a BamHI, sem a BglII nem hasítja azonban a BamHI-gyel hasított fragmentumnak a BglU-vel hasított fragmentumnak a BglH-vel hasított fragmentumához való egyesítéséből, és ezeket be lehet iktatni a BamHI-gyel emésztett pOJlőO plazmidba. Az ilyen nem kívánt vektorokat úgy különböztetjük meg a pOJ325 plazmidtól, hogy Aha Dl és Xbal restrikciós enzimekkel emésztünk. Ezek a helyek a pOI171 plazmidnak olyan részeiben vannak jelen, amelyek a pKC 462A plazmidból származnak, így jelen varrnak a pOI171 plazmid nem kívánt -14 kb-s Bgin restrikciós fragmentumaiban, de teljesen hiányzanak a pOJ171 S.thermotolerans DNS beiktatási részében, amely a carG gént tartalmazza. A plazmid DNS-t az E. coli K12 RRlAM15/pOJ325 transzformánsokkal kapjuk meg, a pOJlőO plazmid DNS izolálására alkalmas, fentebb leírt eljárás szerint. A pOI325 plazmid DNS-t lehet alkalmazni Streptomyces thermotolerans transzformálására, amint ezt a 3. példában leírjuk.
3. példa
Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270) transzformálása S. thermotolerans/pOJ171 és S. thermotolerans/pOJ325 előállítására
A.Az oldatok jegyzéke
Az alábbi oldatokra utalunk a példák során, ezeket az egyértelműség kedvéért itt megadjuk.
1. P tápközeg (-100 ml):
Alkotórész Mennyiség
Szacharóz 10,3 g
K2SO4 0,025 g
Nyomelemoldat (lásd 2.) 0,2 ml
MgCl2.6H2O 0,203 g
víz 80 ml
Autoklávozás után hozzáadandó:
KH2PO4(0,5%) Imi
CaCl2.2H2O(3,68%) 10 ml
[N-trisz-(hidroxi-metü)-
-metü-2-amino-etán-szulfonsav],
”TES” puffer, 0,025 mól/1 (pH 7,2)
2. Nyomelemoldat (~11)
Alkotórész Mennyiség
ZnCl2 40 mg
FeCl3.6H2O 200 mg
CuC12.4H2O 10 mg
MnCl2.4H2O 10 mg
Na2B4O7.10H2O 10 mg
(NH4)6M07O24.4H20 10 mg
h2o 11
3. R2 regeneráló tápközeg (~11)
Alkotórész Mennyiség
Szacharóz 103 g
W 0,25 g
Nyomelemoldat 2ml
MgQ2.6H2O 10,12g
-101
HU 203578 Β
Alkotórész Mennyiség
glükóz 10g
L-aszparagin. 1H2O 2,0 g
kazaminosavak 0,1 g
agar 22g 5
víz 700ml-re
A pH-t pH 7,2-re állítjuk be autoldávozás előtt. Autoklávozásután a kővetkezőket adjuk hozzá:
KH2P04(0,05g/100ml) CaCl2 (2,22 g/100 ml) TES puffer 5,73 g/100 ml (pH 7,2) 100 ml 100 ml 100 ml 10
4. Lágy tápagar (SNA, ~11)
Alkotórész Mennyiség
Difco Bacto Nutrient Broth 8g 15
Agár 5g
5. AR2YE tápközeg olyan R2 tápközeg, amelynek li-
teréhez 20 ml 25%-os élesztőkivonatot adunk.
6. Élesztőkivonat—Malátakivonat (YEME, ~ 11):
Alkotórész Mennyiség 20
Élesztőkivonat 3g
Pepton 5g
Malátakivonat 3g
Glükóz 10g
7. YEME + 34% szacharózh folyékony teljes tápközeg 25
az YEME 340 g/1 szacharózzal
8. YMX tápközeg (-11)
Alkotórész Mennyiség
Élesztőkivonat 3g
Malátakivonat 3g 30
Glükóz 2g
Agar 20 g
9. Az YMX agar: 0,3% élesztőkivqnat, 0,3% malátaki-
vonat, 0,2% dextróz és 2,0% agar
10CSI tápközeg (-11) 36
Alkotórész Mennyiség
Szójaliszt 15g
Kazein lg
Keményítőcukor 25g
Melasz 3g 40
CaCO3 2,5 g
Czapek ásványisó törzsoldat 2 ml
Ionmentesített víz 1 liter
pH 7,2-re beállítva sterilizálás előtt
llCzapek ásványisó keverék (-11): 45
κα 100 g
MgSO4.7H2O 100 g
Ionmentesített víz 900 g
FeSO4.7H2O-t (2 g) feloldunk 100 ml ionmentesí-
tett vében, amely 2 ml koncentrált HQ-t tartalmaz. 50
Ezt az oldatot adjuk a fenti KCl/MgSO4.7H2O ol-
dathoz, hogy teljessé tegyük a Czapek ásványisó ke-
ver ék elkészítését.
12BennetAgar(~ll)
Alkotórész Mennyiség 55
Ionmentesített víz 1000 ml
Burgonyadextrin 10g
N-2aminA 2g
Gibco Bacto agar 15g
Gibco marhahúskivonat 2g 60
Alkotórész Mennyiség
Élesztőkivonat 1 g
Czapek ásványisó törzsoldat 2 ml
B, Transzformálás
A pOJ171 plazmidot a pOJ325 plazmidot küiönkülön alkalmazzuk Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270) transzformálására lényegében a fentebb már ismertetett eljárással összhangban.
Streptomyces thermotoleranst (NRRL 15270) Bennett agarra szélesztünk és 30 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán át. Spóra-kaparékot távolítunk el a lemezről, és felhasználjuk 10 ml TSB inokulálására [a TSB-t 30 g/l-esre készítjük, ezt a Baltimore Biological Laboratories-től (BBL) kapjuk, a P.OJBox 243, Cockeysville.Maryland 21031], A tenyészetet levegőn rázó inkubátorban inkubáljuk 30 ’C hőmérsékleten 3 órán ít. Ezt a tenyészetet homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük; ezután 3 ml tenyészetet alkalmazunk 17 ml, 0,4% glicint tartalmazó TSB inokulálására. A tenyészetet levegőn rázó inkubátorban inkubáljuk 30 *C hőmérsékleten mintegy 24 órán át Ezt a tenyészetet ismét homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük, ezután 3 ml tenyészetet alkalmazunk 17 ml 0,4% glicint tartalmazó TSB inokulálására. A tenyészetet ismét homogenizáljuk és ultrahanggal kezeljük, majd a micelizális fragmentumokat centrifugálissal kinyerjük és kétszer mossuk 10,3%-os szacharóz oldattal. A miceliális fragmentumokat újra szuszpendáljuk 20 ml P-tápközegben (3A1 példa), amely 1 mg/ml lizozimot is tartalmaz, és az így létrejött oldatot szobahőmérsékleten inkubáljuk mintegy 11,5 órán át. Ennek a protoplasztképzési lépésnek a során a sejteket fel-le pipettázzuk, hogy a csomókat eloszlassuk. A protoplasztokat összegyűjtjük és kétszer mossuk P tápközeggel. A protoplasztokat ezután 2 ml P tápközegben szuszpendáljuk. Ez az eljárás általában 2-5.107 protoplasztot alkit ki 200 pl oldatra számítva.
Mintegy 200 pl protoplaszt oldatot alkalmazunk a transzformációhoz. Mintegy 1 pg transzformáló DNS-t, 10 pl ligáló, vagy TE pufferban oldva, adunk 50 pl 1 mg/ml-es heparin-oldathoz (Sigma Chemical Co., P.OJBox 14508, St. Louis, Missouri 63178). és összekeverjük. ADNS oldatot hozzáadjuk protoplasztokhoz; ezután mintegy 0,9 ml, P-tápközegben levő 55%-ospolietilénglikol 1000-t (Sigma) adunk hozzá és összekeverjük a protoplasztokkal. A sejt-DNS keveréket Vortex berendezésen keverjük, majd R2 tápközegre (3A3. példa) szélesztjük, minden lemezt mintegy 0,1 ml, ~3 ml R2 módosított lágy agarral [103 g szacharóz, 0,5% agar, 10,12 g MgClj, 2,22 g CaClj és 5,72 g TES (pH 7/2) literenként] kevert sejttel inokulálunk. A lemezeket 30 *C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán (~16 órán) át, majd felülrétegezzük -3 ml R2-módosított lágy agarral, amely annyi apramicint tartalmaz, hogy diffúzió után végső koncentrációja 25 pg/ml legyen. A lemezeket azután mintegy 4 napon át inkubáljuk 30 ’C hőmérsékleten, amikor a telepek láthatóvá válnak szabad szemmel.
-111
HU 203 578 Β
4. példa
A. Lemez-dugó vizsgálat
Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270) pOJ325 transzformánsokat viszünk át R2-agar regeneráló lemezekről Bennett agar (3A12) és 25 pg/-ml apramicint tartalmazó lemezekre, és 37 ‘C hőmérsékleten inkubálunk 2-3 napon át, amíg a telepek 510 milliméter átmérőjűek lesznek A telepeket azután kilékeljük és a dugókat átvisszük, steril átvivő csöveket (Spectrum Medical Industrial, Inc. Los Angeles, Kalifornia 90054) alkalmazva, triptikázszója agar (TSA) lemezekre, amelyeket előzőleg felülrétegezünk lágy-agar tápközeggel (Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48232), amely Micrococcus Luteus X160at (ATCC 9341) tartalmaz. A lemezeket 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk 16-24 órán át, A Micrococcus Luteus (ATCC 9341) érzékeny karbomicinre és rezisztens apramicinre. Következésképpen ez a M. Luteus törzs nem képes nőni olyan dugó körül, amely karbomicint termelő Streptomycest tartalmaz. A lemezdugó vizsgálatokban, amelyeket S. thermotolerans vad-típusú sejtekkel (ATCC 11416), S. thermotolerans (NRRL 15270/pOJ235-tel és S. thermotolerans (NRRL 15270)/pOJ171-gyel végzünk, aM. luteus növekedés gátlásának világos zónái láthatók a dugók körül. Ezek a gátlási zónák kb. 20-25 mm mérettel, amelyek a S. thermotolerans NRRL 15270 dugók közül hiányoznak, jelzik, hogy a transzformánsok termelnek karbomicint.
B. Bioautográfía
Számos dugót készítünk a 4A. példában alkalmazott, Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270)/pOJ325-öt tartalmazó lemezekből. A dugókat vékonyréteg kromatográfiás lemezre (Merck, P.O. Box 2000, Rahway, New Jersey 07065, előre burkolt szilikagél #60 F-254) helyezzük a karbomicin standard mintájához közel. A dugókat a lemezeken annyi ideig hagyjuk, amely elegendő, hogy diffúzió következzék be; ezután a lemezeket felszálló folyadékkromatográfiának vetjük alá etil-acetát:dietil-aminmetanol 95:5:5 rendszerben. A kifejlesztett kromatogramokat alaposan megszárítjuk szívófűikében, legalább két óráig. A kromatogramokat azután lappal lefelé Micrococcus luteus X160-nal beoltott TSA lemezekre helyezzük mintegy 15 percre. A kromatogramokat a lemezekről eltávolítjuk, és a lemezeket inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten 16-24 órán át.
A Streptomyces thermotolerans/pOJ325 transzformánsokból készített dugókhoz tartalmazó kromatogramok gátlási zónákat alakítanak ki, amely a kromatogramon levő anyagok eredménye, amelyek együtt vándorolnak a karbomicin standarddal.
C. Fermentálás
Streptomyces thermotolerans ATCC 11416, S. thermotolerans NRRL 15270 és S. thermotolerans (NRRL 15270)/pOJ325 tenyészeteit növesztjük 25 |ig/ml apramicint tartalmazó Bennett tápközeg ferde tenyészetem. Ezeket a tenyészeteket külön-külön alkalmazzuk vegetatív tápközeg több 50 ml-es alikvotjának inokulálására. A vegetatív tápközeg 27,5 g triptikáz-szója tápközeget tartalmaz 1 liter ionmentesitett vízben.
Az inokulált tápközeg minden 50 ml-es alikvotját 250 ml-es Erlenmeyer lombikban inkubáljuk 37 ‘C hőmérsékleten 48 órán át levegőn rázó inkubátorban, amely 5,08 cm-es köríven forog 260 fordulat/perccel. Az egyes vegetatív tenyészetek 2 ml-es alikvotjait használjuk CSI (3A10) fermentációs tápközeg több 50 ml-es alikvot jának inokulálására. Az inokulált fermentációs tápközeg minden 50 ml-es alikvotját 48 órán át inkubáljuk 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 37 ’C hőmérsékleten, levegőn rázó inkubátorban, amely 5,08 cm-es köríven forog 260 fordulat/perccel. Az egyes fermentációs tenyészetekből minden 24 órában kiveszünk 20 ml-t, és vizsgáló korongra helyezzük [1/2” (-1,27 mm), Schleicher és Schuell Analytical Paper]. Megszáradás után ezeket a korongokat Micrococcus luteussal beoltott agar lemezekre helyezzük. A lemezeket azután 37 ’C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk. A gátlási zónákat mérjük és rögzítjük.
A fermentáció 48 órája után 400 ml teljes tápközeget minden tenyészetből pH 8,5-re állítunk be 1 n NaOH-val, és háromszor extraháljuk etil-acetáttal. Az így keletkezett szuszpenzió etil-acetátos részét eltávolítjuk és Rotavapor-EL-en (Bűchi) szárazra koncentráljuk. A nyers, szárított készítményt metanolban szuszpendáljuk, és fordított fázisú HPLC-vel elemezzük, RaininDynamax 150-C8 oszlopot (4,5 x 350mm) alkalmazva. A karbomicint 55% acetonitril/víz/nátrium-perklorát (0,1 mól/1, pH 2,3) rendszert alkalmazva vizsgáljuk, 2 ml/perc áramlási sebességnél. A karbomicint 239 nm-nél UV abszorpcióval mutatjuk ki. A mennyiségi összehasonlítást karbomicin-standardot (Pfizer, 2 mg/ml) alkalmazva végezzük.
Amint ezt HPLC-vel mérjük, a Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270/pOJ325 4,8-szor több karbomicint termel, mint a S. thermotolerans ATCC 11416. A S. thermotolerans NRRL 15270 nem termel karbomicint. Az antimikrobiális aktivitás alapján mérve a Streptomyces thermotolerans (NRRL 15270)/pJO325 több antibiotikumot termel, mint akár a S. thermotolerans ATCC 11416, akár a S. thermotolerans NRRL 15270.
-121
HU 203 578 Β
VII. Táblázat
Törzs Tápközeg HPLC mérés
S. thermotolerans ATCC11416 CSI 1,85 pg/ml teljes tenyészlé
S. thermotolerans (NRRL 15270)/pOJ325 CSI 8,95 (xg/ml
teljes tenyésztő
Zóna-méret — CSI tápközeg (XI86 aktivitás)
Törzs 24 óra 48 óra
S. thermotolerans ATCC 11416 21 mm 22 mm
S. thermotolerans (NRRL 15270)/pOJ325 29 mm 29 mm
S. thermotolerans NRRL 15270 Ómra Omm
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (5)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás Streptomyces karbomícin -termelő képességének növelésére, azzal jellemezve, hogy (1) Streptomycest a carG gén kifejeződését kódoló valamely rekombináns DNS vektorral transzformáljuk; és (2) az (1) lépésben transzformált organizmust a karbomicin termelésére alkalmas körülmények között tenyésztjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Streptomycesként Streptomyces thermotolerans 30 vagy Streptomyces thermotolerans NRRL 15270 törzseket transzformálunk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS vektorként pOJ171 vagy pOJ325 plazmiddal transzformálunk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben Streptomyces
    25 thermmotolerans/pOJ171törzsettenyésztünk
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (2) lépésben Streptomyces thermotolerans/pOJ325 törzset tenyésztünk
    -13HU 203578 Β Int. Cl.5: C 12 N 15/31
    1. ábra
    A pOJ171 plazmid restrikciós helyei és funkciós térképe
    -14HU 203578 Β Int. Cl.5: C12 N15/31
    2, ábra
    A pOJlőO plazmid restrikciós helyei és funkciós térképe
    -15HU 203578 Β Int. Cl.5: C 12 N15/31
    3.. ábra
HU88848A 1987-02-24 1988-02-23 Process for producing carg carbomycin biosynthetical gene applicable in streptomyes and other organism HU203578B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/017,660 US4952502A (en) 1987-02-24 1987-02-24 Carbomycin biosynthetic gene, designated carG, for use in streptomyces and other organisms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT46738A HUT46738A (en) 1988-11-28
HU203578B true HU203578B (en) 1991-08-28

Family

ID=21783846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU88848A HU203578B (en) 1987-02-24 1988-02-23 Process for producing carg carbomycin biosynthetical gene applicable in streptomyes and other organism

Country Status (8)

Country Link
US (1) US4952502A (hu)
EP (1) EP0284205A3 (hu)
JP (1) JPS63263091A (hu)
AU (1) AU602954B2 (hu)
CA (1) CA1311431C (hu)
DK (1) DK90088A (hu)
HU (1) HU203578B (hu)
IL (1) IL85478A (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL83601A0 (en) * 1986-08-28 1988-01-31 Lilly Co Eli Method for selecting recombinant dna-containing streptomyces and other host cells
US5068189A (en) * 1988-05-13 1991-11-26 Eli Lilly And Company Recombinant dna vectors encoding a 4"-o-isovaleryl acylase derived from a carbomycin biosynthetic gene, designated care, for use in streptomyces and other organisms
IL91797A0 (en) * 1988-09-29 1990-06-10 Lilly Co Eli Carbomycin biosynthetic genes,designated carl and carm,for use in streptomyces and other organisms
US5589385A (en) * 1990-07-26 1996-12-31 American Cyanamid Company Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein
WO1997022711A1 (en) 1995-12-19 1997-06-26 Regents Of The University Of Minnesota Metabolic engineering of polyhydroxyalkanoate monomer synthases
US6265202B1 (en) 1998-06-26 2001-07-24 Regents Of The University Of Minnesota DNA encoding methymycin and pikromycin
US20030194784A1 (en) * 2001-04-17 2003-10-16 Sherman David H. DNA encoding methymycin and pikromycin
CN113588840A (zh) * 2021-08-17 2021-11-02 丽珠集团福州福兴医药有限公司 一种检测米尔贝霉素含量的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2902412A (en) * 1956-06-04 1959-09-01 Olin Mathieson Fermentative carbomycin production
DE3141691A1 (de) * 1981-10-21 1983-05-19 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Plasmid pac 1, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung
DK144084A (da) * 1983-03-03 1984-09-04 Lilly Co Eli Makrolid, dets fremstilling og anvendelse
ATE88215T1 (de) * 1983-09-06 1993-04-15 Microlife Technics Abgeleitete nisin produzierende mikroorganismen, verfahren zur herstellung und verwendung und so erhaltene produkte.
IL81892A (en) * 1986-03-21 1995-10-31 Lilly Co Eli Recombinant AND molecule containing a sequence encoding O-methyltransfer macrocin
US4904591A (en) * 1986-08-28 1990-02-27 Eli Lilly And Company Carbomycin resistance-conferring gene, designated cara, for use in streptomyces and other organisms

Also Published As

Publication number Publication date
JPS63263091A (ja) 1988-10-31
IL85478A0 (en) 1988-07-31
EP0284205A3 (en) 1989-08-23
IL85478A (en) 1993-01-31
HUT46738A (en) 1988-11-28
EP0284205A2 (en) 1988-09-28
AU602954B2 (en) 1990-11-01
DK90088A (da) 1988-12-15
DK90088D0 (da) 1988-02-22
AU1201988A (en) 1988-08-25
US4952502A (en) 1990-08-28
CA1311431C (en) 1992-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5098837A (en) Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms
US4935340A (en) Method of isolating antibiotic biosynthetic genes
US5672497A (en) Method for increasing the antibiotic-producing ability of antibiotic-producing microorganisms
Chater The improving prospects for yield increase by genetic engineering in antibiotic-producing streptomycetes
CA1340599C (en) Antibiotic-producing microorganisms
US5190871A (en) Use of the site-specific integrating function of phage φC31
HU203578B (en) Process for producing carg carbomycin biosynthetical gene applicable in streptomyes and other organism
US5149638A (en) Tylosin biosynthetic genes tylA, tylB and tylI
Mao et al. Genetic localization and molecular characterization of two key genes (mitAB) required for biosynthesis of the antitumor antibiotic mitomycin C
EP0176321B1 (en) Recombinant dna cosmid shuttle vectors
US5068189A (en) Recombinant dna vectors encoding a 4"-o-isovaleryl acylase derived from a carbomycin biosynthetic gene, designated care, for use in streptomyces and other organisms
EP0354727A2 (en) Novel single stranded phasmid vectors and methods for transforming streptomyces and other actinomycetes
US4886757A (en) Spiramycin resistance-conferring cloning vectors
EP0361905A2 (en) Carbomycin biosynthetic genes, designated carL and carM, for use in streptomyces and other organisms
US4921801A (en) Novel recombinant DNA cosmid shuttle vectors
US5057425A (en) Picromycin resistance-conferring gene, designated pica, for use in streptomyces and other organisms
US4904598A (en) Novel plasmid shuttle vectors conferring spiramycin resistance in streptomyces
US4904591A (en) Carbomycin resistance-conferring gene, designated cara, for use in streptomyces and other organisms
US4914030A (en) Carbomycin resistance-conferring gene, designated carb, for use in streptomyces and other organisms
FR2848567A1 (fr) Souches de micro-organismes dont l'operon phok/phor est inactive pour la mise en oeuvre d'un procede de surproduction de metabolites, notamment a activite antibiotique ou enzymatique
HUT52155A (en) Process for producing new tylosin biosynthetic genes
NZ232685A (en) Tylosin biosynthetic pathway and genetically engineered organisms

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee