HU202284B - Process for producing new azoxy derivatives and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új azoxiszármazékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó, gombafertőzések kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására.

Az utóbbi években a különböző okok által előidézett felszíni és mély gombafertőzések világszerte elterjedtek. A gomba fertőzések kezelésére alkalmas ismert kemoterápiás szerek száma nem kevés, de csak négy olyan gyógyszer van, amely szisztémásán alkalmazható, nevezetesen: a griseofulvin (7-klór2’,4,6- trimetoxi-6’-metil-spiro[benzofuran-2(3H),l ’[2]ciklohexén]-3,4’-dion) egy felszíni gombafertőzés a trichophytosis kezelésére, a flucytosine (4-amino5-fluor-2(lH)-pirimidinon), az amphotericin B (egy 38 tagú polién antibiotikum) és a miconazole (l-[2(2,4-diklór-fenil)-2-((2,4-diklór-fenil) -metoxi)-etil]lH-imidazol) a mély-gombafertőzések kezelésére. Mivel ezek a szisztémás szerek erős mellékhatásokkal rendelkeznek, felhasználhatóságuk korlátozott, így szükség van új, jobb, szisztémás hatású gombaellenes szerek kifejlesztésére.

Az eumicétákra erősebb fungicid hatást kifejtő új gombaellenes szerek kifejlesztésének érdekében olyan anyagokat vizsgáltunk, amelyeket talajból izolált mikroorganizmusok termelnek. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a talajból izolált (Japán, Shimane Prefecture), a Streptomyces nemzetségbe tartozó KC7367 jelű törzs olyan gombaellenes anyagokat termel, amelyek eumicétákra erős fungicid hatással bírnak. Ezeket a hatóanyagokat a mikroorganizmus törzs tenyészközegéből sikerült elkülöníteni.

A fenti törzs tenyésztésével nyert anyagok azoxiszármazékok, amelyek a (I) általános képlettel jellemezhetők. A képletben

X jelentése -C- vagy -QH- csoport Ö OH (Krabonil- vagy hidroxi-metilén-csoport).

Az (I) általános képletű azoxiszármazékok a Streptomyces nemzetségbe tartozó (KC-7367 jelű FERM BP-1277 számon letétbe helyezett törzs tenyésztésével állíthatók elő, oly módon, hogy a törzset tenyésztjük, majd a vegyületeket a tenyészközegből elkülönítjük.

Az így előállított vegyületek újak minthogy fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságaik az ismert vegyületekétől különbözőek.

Az (I) általános képletű vegyületek közül azt, amelyben

X jelentése -Q- csoport O

KA-7367A vegyületként, amelyben QH

X jelentése -CH- csoport

KA-7367B vegyületként jelöljük.

A KA-7367A és KA-7367B vegyületek termelésére képes KC-7367 jelű törzset a talajminta (lelőhelye Japán, Shimane Prefecture, Shinjyo-mura) szuszpenziójának, például steril vizes szuszpenziójának tápközegen való szélesztésével, majd 27 ’C hőmérsékleten 7 napon át való tenyésztésével, és a kapott telepek összegyűjtésével nyerjük. A tápközeg pH-ja 7,0, összetétele 0,1% húskivonat, 50 gg/ml mycostatin, 0,4 gg/ml penicillin G, 2 gg/ml polimixin, 8 gg/ml nalidixinsav és 1,5% agar, amelyeket burgonyalekvárba mérünk be (a burgonyalekvár összetétele 10% burgonya, 0,5% paradicsompép és 1% zabliszt). 2

A KC-7367 jelű törzs mikrobiológiai jellemzői a következők. A különböző tápközegkben való jellemzőket a törzsnek 27 ’C hőmérsékleten 14 napon át való tenyésztésével, és a szokásos megfigyelések elvégzésével állapítjuk meg. A szín kifejezését a Color Harmony Manual, 4. kiadás (Container Corporation of America) szerinti osztályozás alapján végezzük.

I. Morfológiai jellemzők

A törzs különféle tápközegeken vegetatív légmicéliumokat fejleszt. A légmicéliumok monopodiáUsan elágazóak, sporofórákkal bírnak. A sporofórák 10-50 spórát tartalmaznak lánconként. A spórák hengeresek, 1,1-1,3x1,3-1,5 nm méretűek, sima felületűek. A szubsztrátmicélium fragmentálódása, ostoros spóra, sporangium és szklerócium nem figyelhető meg.

II. Tenyésztési jellemzők különféle tápközegeken

1. Szacharóz-nitrát agar

Növekedés: jó

Légmicélium: gyenge, fehér (a)

Szubsztrámicélium: halvány elefántcsont-tojáshéjszín (2ca)

Oldható pigment: nincs

2. Glükóz-aszparagin agar Növekedés-azparagin agar Növekedés: gyenge Légmicélium: gyenge, fehér (a) Szubsztrátmicélium: fehér (a)

Oldhatóű pigment: nincs

3. Glicerin-aszparagin agar:

Növekedés: mérsékelt Légmicélium: gyenge, orchidea (lOcb) Szubsztrámicélium: koloniálsárga (2ga)

Oldható pigment: nincs

4. Szervetlen-só-keményító agar Növekedés: mérsékelt Légmicélium: gyenge, rezedazöld (24ig) Szubsztrátmicélium: sötét olivaszínű (1 1/2 ni)

Oldható pigment: nincs

5. Tirozin-agar:

Növekedés: jó

Légmicélium: mérsékelt, fehér (a) - rezedazöld (24 ig)

Szubsztrátmicélium: sötétbarna (3 ni)

Oldható pigment: nincs

6. Táp-agar Növekedés: mérsékelt Légmicélium: gyenge, fehér (a) Szubsztrátmicélium: halványsárga (1 1/2 ea) Oldható pigment: töksárga (2 ia)

7. Élesztő extraktum - maláta extraktum agar: Növekedés: jó

Légmicélium: mérsékelt, rezedazöld (24 ig) Szubsztrátmicélium: beige barna (3 ig) halvány dinnyesárga (3 ea)

Oldható pigment: töksárga (2ia)

8. Zabliszt agar Növekedés: mérsékelt

Légmicélium: mérsékelt, gyöngyszürke (13dc) Szubsztrátmicélium: sötétbarna (3 ni)

Oldható pigment: testszín-bama (4 gc)

HU 202284 Β

III. Fiziológiai jellemzők

1. A növekedés hőmérséklettartománya: 18-40 ’C, előnyös növekedési hőmérséklettartomány: 26-38 ’C

2. Zselatin elfolyósítás: negatív

3. Keményítő hidrolízis: pozitív

4. Sovány tej koagulálás: negatív Sovány tej peptonizálás: pozitív

5. Melanoid pigment képzés: negatív

IV. Szénforrások hasznosítása

A Pridham és Gottlieb agar tápot, L-arabinózt, D-xilózt, D-glükózt, D-fruktózt, inozitot, L-ramnózt és D-mannitot hasznosítja, a szacharózt és raffinózt nem hasznosítja.

V. Sejtfal

A sejtfal hidrolízistermékei között L,L-2,6-diamino-pimelinsavat mutattunk ki.

Az előzőekben ismertetett tulajdonságok alapján a KC-7367 törzset a Streptomyces nemzetségbe tartozónak tekintjük.

Az általunk Streptomyces sp. KC-7367 jellel megjelölt törzset FERM BP-1277 számon letétbe helyeztük a Japán Fermentációs Kutató Intézetben (Fermentation Researc Isntitute, Agency of Industrial Science and Technology, Japán) 1987. 02. 04-én.

A találmány szerint alkalmazhatók a Streptomyces sp. KC-7367 természetes és mesterséges mutánsai is.

A Streptomyces sp. KC-7367 tenyésztésére az aktinomicéták tenyésztésére szokásosan alkalmazott módszerek használhatók. A tápközegben szénforrásként különféle anyagok használhatók, de előnyösek a keményítő, a glükóz, a glicerin, a maltóz, a dextrin, a szacharóz, fruktóz és a melasz, amelyeket egyenként vagy egymással kombinálva is alkalmazhatunk. A mikroorganizmus törzs által való asszimilálhatóságtól függően szénhidrogének, szerves savak és növényi olajok is alkalmazhatók. Nitrogénforrásként alkalmazhatunk például szójabablisztet, élesztőkivonatot, száraz élesztőt, peptont, polipeptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, kazein-aminosavait, desztillációs maradékok oldaható anyagait, ammónium-kloridot, ammónium-szulfátot, karbamidot vagy nátrium- nitrátot egyenként vagy egymással kombinálva. Szükség szerint adhatunk a tápközegbe szervetlen sókat, például nátrium-kloridot, kálium-foszfátot, magnézium-szulfátot, kalcium-kloridot, kalcium-karbonátot, kalciumhidroxidot, kobalt-kloridot, cink-szulfátot, vas-kloridot vagy vas-szulfátot, és igen kis mennyiségben fémeket. A szerves és szervetlen anyagok kívánt módon adagolhatók a mikroorganizmus szaporodásának és a KA-7367 termelésének az elősegítésére. Ha a tenyésztést levegőztetés mellett végezzük, habzásgátló anyagokat, például szilikonolajokat, paraffinokat vagy felületaktív szereket alkalmazhatunk. A tenyésztést végezhetjük szilárd táptalajon. Előnyösen azonban a tenyésztést folyékony tápközegben, előnyösen sülylyesztett folyékony tenyészetben, az antibiotikum-termelésnél általában szokásos eljárással végezzük. A tenyésztést aerob körülmények mellett 20-35 ’C, előnyösen 25-35 ’C hőmérsékleten végezzük.

A KA-7367 vegyületet rázott tenyészetben vagy fermentorban állítjuk elő. Mindkét esetben a mikroorganizmus 1-5 napos tenyésztése után aktív anyagok termelődnek és gyűlnek fel a fermentlében. Ha a fermentlében termelődött anyagok mennyisége eléri a maximumot, amit például Candida albicans alkalmazásával végzett biológiai vizsgálattal ellenőrizhetünk, a tenyésztést leállítjuk, és a KA-7367A és KA-7367B vegyületeket a feimentléből elkülönítjük és tisztítjuk.

A KA-7367A és KA-7367B vegyületek a fermentléből szokásos módon izolálhatók, például a fermentlevet szűrősegédanyag alkalmazásával szűrjük, vagy centrifugáljuk, így a fermentlé szűrletét nyerjük, a kívánt anyagokat abszorbens alkalmazásával különítjük el, vagy a szűrletet oldószerrel extraháljuk. Az adszorbens alkalmazásával járó eljárásnál a tenyészet szűrletét adszorbensen, például aktív szénen vagy adszorbens gyantán, így Diaion HP-10, HP-20 vagy HP- 50 (a Mitsubishi Chemical Co., Ltd. terméke) vagy Amberlite XAD-2, XAD-4 vagy XAD-7 (a Rhom & Haas Co. terméke) gyantán engedjük át. Az adszorbenst ezután például etil-acetáttal acetonnal, metanollal vagy etanollal eluáljuk, és az eluátumot, az eluens kidesztillálásával besűrítjük. így az (IA) képletű KA-7367A és az (IB) képletű KA-7367B vegyületek elegyét kapjuk. Az oldószeres extrahálást szerves oldószerekkel, például kloroformmal, diklórmetánnal, etil-acetáttal, butil-acetáttal, n-butanollal vagy ezek elegyével végezzük, az oldószert vagy oldószerelegyet keverés közben öntjük a fermentlébe, a kapott elegyet a vizes és szerves fázis elkülönüléséig állni hagyjuk, majd a szerves fázisból az oldószert kidesztilláljuk, így az (IA) képletű KA-7367A és az (IB) képletű KA-7367B vegyületek elegyét nyerjük.

A KA-7367A és KA-7367B vegyületek egymástól célszerűen például vékonyrétegkromatográfiás eljárással különíthetők el.

Az elkülönített KA-7367A és KA-7367B vegyületek tovább tisztíthatók például gélszűréssel, például Sephadex LH-20-οη (a Pharmacia cég terméke), vagy Toyopearl TSK HW-40-en (a Toyo Soda Co., Ltd. terméke); adszorpciós kromatográfiás eljárással szilikagélen vagy alumínium-oxidon; vagy nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással. Ezek az eljárások alkalmazhatók önmagukban vagy kombinációk formájában.

A következőkben a találmány szerint előállított KA-7367A és KA-7367B vegyületek fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságait mutatjuk be.

1. Megjelenés

Neutrális színtelen olaj (mind az A, mind a B)

2. Molekulatömeg

198 (A), 200 (B)

3. Elemzési eredmények (A) C%-60,16, H%-9,12, N%-13,98;

(B) C%-59,95, H%-10,3, N%-13,86.

4. Tömegspektrum (A) m/z 199 (MH⁺) (B) m/z 201,1607 (MH⁺)

6. Fajlagos forgatás (A) -186’ (c-0,5, CH3OH) (B) +69’ (c-1,2, CH3OH)

7. UV abszorpciós spektrum

A metanolos oldatban mért UV abszorpciós spektrumokat az 1. és 5. ábrákon mutatjuk be.

(A) 237 (35300) (B) 230 (45000)

HU 202284 Β

8. IR abszorpciós spektrum

A kloroformos oldatban mért IR abszorpciós spektrumokat a 2. és 6. ábrákon mutatjuk be.

9. 1 H-NMR spektrum

A deuterokloroformos oldatban mért ¹ H-NMR spektrumokat a 3. és 7. ábrákon mutatjuk be.

10.13C-NMR spektrum

A deuterokloroformos oldatban mért ¹³C-NMR spektrumokat a 4. és 8. ábrákon mutatjuk be.

11. Oldószerekben való oldahatóság

Mindkét vegyület oldható kloroformban, acetonban és metanolban, oldahatatlanok vízben.

12. Színreakciók

Mindkét vegyület pozitív színreakciót adkálium-permagnáttal reagáltatva, negatív színreakciót adnak ninhidrinnel reagáltatva.

13. Vékonyrétegkromatográfia:

Rf Futtatóelegy (A) 0,53 (B) 0,22 benzol/etll-acetát (10:1) (A) 0,38 (B) 0,28 kloroform

Lemez: szilikagél lemez F254 (Merck & Co.)

14. Szerkezeti képlet

A fenti fizikokémiai jellemzők alapján a KA7367A és a KA-7367B vegyületek szerkezeti képletét az (IA), illetve az (IB) képlet szerintinek tartjuk.

15. Gombaellenes hatás

A következőkben a vizsgált anyagok különféle enmicétákra vonatkozó növekedést gátló minimális koncentrációját (MIC) adjuk meg:

Teszt mikroorganizmus	MIC (gg/ml)
	(A)	(B)
Candida albicans	1,6	50
Aspergillus fumigatus	6,25	100
Cryptococcus neoformans	3,2	100
Trichoptyon mentagrapytes	6,25	100
Trichophyton rubrum	3,2	100

Tenyésztő közeg: Sabouraud dextróz agar Tenyésztési körülmények: 27 ’C, 2-4 nap

Ha a találmány szerint előállított vegyületek fenti tulajdonságait az ismert anyagok megfelelő tulajdonságaival összehasonlítjuk, nem találunk megjegyzést, így a KA-7367A és KA-7367B vegyületeket új vegyűleteknek tekintjük.

A fenti adatoknál az (A) jelölés a KA-7367A vegyületre és a (B) jelölés a KA-7367B vegyületre vonatkozik. Az 1, 2, 3 és 4. ábrák a KA-7367A vegyületre, míg az 5, 6, 7 és 8. ábrák a KA-7367B vegyületre vonatkoznak.

A KA-7367A és KA-7367B vegyületek kémia úton egymásba átalakíthatók. A KA-7367A vegyület redukálószer hatására KA-7367B vegyület oxidálószer hatására KA-7367A vegyületté alakul.

Redukálószerként alkalmazhatunk például nátriumbór-hidridet, kálium-bór-hidridet, lítium-bór-hidridet, vagy diboránt. A redukálást a KA-7367A vegyületnek

1-10 ekvivalens redukálószerrel szerves oldószerben, például alkoholban, éterben, szénhidrogénben, halogénezett szénhidrogénben, dimetil-szulfoxidban vagy dimetil-formamidban 0 és 100 ’C közötti hőmérsékleten néhány perc és néhány óra közötti időtartamon át való keverésével végezzük.

Oxidálószerként alkalmazhatunk például piridinium-dikromátot, piridinium-klór-kromátot, krómsavakat vagy mangán-dioxidot. Az oxidálást a KA-7367B vegyület és 1-10 ekvivalens oxidálószer szerves oldószerben - például az előzőekben említett oldószerek valamelyikében - 1 óra és néhány nap közötti időtartamon át, előnyösen katalizátor - például piridinium-trifluor-acetát - jelenlétében való keverésével végezzük.

A következőkben a találmány példákban mutatjuk be közelebbről.

1. példa

1% oldható keményítőt, 1% glukózt, 1% szójabablisztet, 0,5% kukoricalekvárt, 0,05% magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,3% kalcium-karbonátot és 0,0005% kobalt-klorid-hexahidrátot tartalmazó, pH-7,5-ös folyékony tápközeget burgonya-dextróz agar ferdecsövön tenyésztett Streptomyces sp. KC7367-val oltunk be. A beoltott tápközeget 28 ’C hőméréskleten 2 napon át tenyésztve anyakultúrát nyerünk.

literes fermentorba 10 liter folyékony, pH-7,5-ös tápközeget töltünk, amely tápkőzeg 1% oldható keményítőt, 0,5% polipepton S-t, 0,2% élesztőtraktumot, 0,05% magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,0005% kobalt-klorid-hexahidrátot és 0,2% gyapotmagolajat tartalmaz. Ezt a tápközeget 100 ml, az előzőek szerinti készített anyakultúrával beoltjuk, és a tenytésztést 28 ’C hőmérsékleten 2 napon át folytatjuk 300 ford/perc keverés és 5 liter/perc levegőztetés mellett.

A tenyésztés befejezése után a fermentlevet leszűrjük, a kapott 40 liter szűrletet 6x70 cm-es, Diaion HP-20 töltetű adszorbeáltatjuk. Az oszlopot kevés, 50%-os vizes metanollal mossuk, majd metanollal eluáljuk. A Candida albicanas esetén gombaellenes aktivitást mutató frakciókat összegyűjtjük, és vákuumban szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 200 ml etil-acetátban oldjuk, és 100 ml 5%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 100 ml 0,02 n hidrogén-kloriddal, majd 100 ml vízzel mossuk.

Az etil-acetátos fázist vákuumban szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot kevés metanolban oldjuk, majd gélkromatográfiás eljárással tisztítjuk. 2x90 cmes oszlopot, eluensként metanolt és töltetként Toyopearl TSK HW-40-t alkalmazunk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot prepatív vékonyrétegkromatográfiás eljárással tisztítjuk. Futtatóelegyként benzol és etilacetát 10:1 arányú elegyét alkalmazzuk, a kromatografálást szilikagél 60 lemezen (a Merck & Co. terméke) végezzük. Az Rf-0,53 (KA-7367A) és az Rf-0,22 (KA-7367B) értékű aktív foltokat összegyűjtjük, és mindkettőt etil-acetáttal eluáljuk. Az eluátumokat vákuumban bepároljuk. A viszamaradó anyagot metanolban oldjuk, majd gélkromatográfiásan tisztítjuk. 1,5x90 cm-es oszlopot, eluensként metanolt és töltetként Sephadex LH-20-t alkalmazunk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és vákuumban bepároljuk, így 30 mg KA-7367A-t és 3 mg KA-7367B-t nyerünk színtelen olaj formájában.

HU 202284 Β

2. példa

500 mg KA-7367A-t 10 ml metanolban oldunk, és 160 mg nátrium-bór-hidridet adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. A reakcióelegyet ezután vákuumban bepároljuk. A viszszamaradó anyagot 20 ml etil-acetát és 20 ml és víz elegyében oldjuk. Az etil-acetátos fázist elkülönítjük, és vákuumban szárazra pároljuk. Az így kapott olajos anyagot szilikagélen oszlopkromatográfiás eljárással tisztítjuk /eluens: benzol és etil-acetát 10:1 arányú elegye). így 240 mg KA-7367B és izomerje (1:1 elegy arány) elegyét nyerjük.

Ή-NMR, δ CDC1₃:

1,86 (t), 2,30 (d), 2,37 (d), 2,46 (d).

3. példa mg KA-7367B-t oldunk 3 ml metilén-kloridban és 37 mg piridinium-trifluor-acetátot és 243 mg piridinium-dikromátot adunk hozzá. Az elegyet szobahőmérsékleten 5 órán át keverjük, majd 247 mg piridinium-dikromátot adunk hozzá, és az elegyet szobahőmérsékleten további 15 órán át keverjük. Ezután a reakcióelegyhez 20 ml dietil-étert adunk, és az oldatot szívatással Celite szűrősegédanyagon átszűrve eltávolítjuk a szennyezéseket. A szűrletet vákuumban bepárolva 101 mg nyers olajos anyagot kapunk. Ezt az anyagot szilikagélen oszlopkromatográfiás eljárással tisztítjuk eluensként benzol és etilacetát 50:1 arányú elegyét alkalmazzuk). így 19 mg színtelen olajos anyagot nyerünk.

A kapott anyag fizikai, kémiai és biológiai jellemzői megegyeznek az 1. példa szerint nyert KA7367A vegyület jellemzőivel.

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek előállítására - a képletben

   9 QH

   X jelentése -C- vagy -CH- csoport azzal jellemezve, hogy a Streptomyces nemzetségbe tartozó KC-7367 jeíű; FERM BP-1277 számon letétbe helyezett törzset tenyésztjük, a fermentléböl a kívánt vegyületet izoláljuk, és kívánt esetben a vegyületeket egymásba átalakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IB) képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy az (IA) képletű vegyületet redukáljuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (IA) képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy az (IB) képletű vegyületet oxidáljuk.
4. 4. Eljárás gombaellenes hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az í. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet, a képletben

   O OH

   Η I

   X jelentése -C- vagy -CH- csoport -, gyógyászati célra alkalmas hordozó és/vagy segédanyagokkal összekeverve készítménnyé alakítunk.