HU201679B - Process for producing synergetic pharmaceutical compositions against retrovirus contaminations - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás retrovírus-fertőzések megelőzésére és kezelésére szolgáló új készítmény előllítására. A készítmény olyan retrovírus-fertőzések gyógyítására alkalmas, amelyek immunológiai károsodásokhoz vezetnek, mint amilyenek a szerzett immunhiány szindróma (AIDS) bekövetkezéséért felelősnek tartott fertőzések.

Az AIDS a sejtimmunitás átörökíthető hiányossága, amelyet esetenkénti fertőzések és bizonyos rosszindulatú megbetegedések jellemeznek, nevezetesen a Pneumocystis carinii tüdőgyulladás és a Kaposi-szarkoma, olyan betegeknél, akiknél nincs felismerhető ok arra, hogy megkapják ezeket a ritka betegségeket [Gottlieb, M. és munkatársai, New Engl. J. Med., 305,1425-1431 (1981); Masur H. és munkatársai, New Engl. J. Med., 305,1431-1438 (1981); Siegal.F.és munkatársai,New Engl. J. Med., 305,1439-1444 (1981)].

Az AIDS kifejezett limfocitaszám-csökkenésben, általános kután allergiás érzéketlenségben, valamint abban nyilvánul meg, hogy jelentősen csökken a proliferatív reagálás mitogénekre, antigénekre és allogén sejtekre, valószínűleg annak következtében, hogy elfogy az OKT4⁺ T-limfocita. Jóllehet a humorál is immunitásra viszonylag csekély a hatás, egyre több biznyíték áll rendelkezésre a hiperaktív B-scjt proliferációs reagálásra vonatkozólag, amely oksági kapcsolatban állhat azzal, hogy a beta-limfoma igen gyakran fordul elő az AIDS-ben szenvedő betegek körében [Scligman, M. és munkatársai, New Engl. J. Med., 311, 1286-1292 (1984); Lane, H., Masur, H., Edgár, G. Whalen G. és Fauci, A., New Engl. J. Med., 309, 453^458 (1983); Zieglcr, J. és munkatársai, New Engl. J. Med., 311, 565-570 (1984)]. A teljesen kialakult szindrómán túlmenően egy hasonló betegségből álló járvány is megjelent: az AIDS-szel összefüggő komplex (ARC), amelyet általános krónikus nyirokcsomó-megbetegedés jellemez. Ennél a szindrómánál is sok az epidemiológiai jellemző és az immun-rendellenesség, s gyakran megelőzi az AIDS klinikai megnyilvánulásait

Újabban bizonyítékok támasztják alá azt, hogy egy limfocototrop retrovírus az AIDS és az RCA elsődleges kóroka. A nyirokcsomó-megbetegedéssel kapcsolatos vírust (LAV) eredetileg nyirokcsomó T-sejtek tenyészetéből különítették el. Ehhez a tenyészethez nyirokcsomó-megbetegedésben és AIDS-ben szenvedő betegek nyirokcsomóját, továbbá egy AIDS-es beteg és tünetmentes testvére nyirokcsomóját használták fel (e két utóbbi betegnél hemofilia B volt kimutatható [Barre-Sinoussi, F. és munkatársai, Science, 220, 868 (1983); Montagnier, L. és munkatársai, „Humán T-cell Leukémia Viruses”, 363-379, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1984); Vilmer, E. és munkatársai Láncét, I, 753-757 (1984)]. Egy hasonló vírust - humán T-limfotróf vírust, III. típus (HTLV-III) - különítettek el nagy számú AIDS-es és ARC-s beteg vérmintájából a H9 T-sejtvonallal történő együttes tenyésztéssel [Popovic, M., Samgadharan, M., Read, E. és Gallo, R., Science, 224, 497-500 (1984); Gallo, R. és munkatársai, Science, 224, 500-503 (1984)]. A LAV és a HTLV-ΠΙ vírusnak, valamint AIDS betegekből újabban elkülönített hasonló retrovfrusoknak [Feorino, P. és munkatársai, Science, 225,69-72 (1984); Levy, J. és munkatársai, Science, 225, 840-842 (1984)], több fontos közös jellemzőik vannak. Vírusreplikáció fellép in vivő és in vitro az OKT4* T-limfocita populációban, és ez a káro2 sodott sejtburjánzással, valamint citopatikus hatások megjelenésével van összefüggésben [Montagnier, L. és munkatársai, „Humán T-cell Leukémia Viruses”, 363— 379, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1984; Popovic, M., Samgadharan, M., Read E. és Gallo, R., Science, 224,497-500 (1984); Klatzmann, D. és munkatársai, Science, 225,59-63 (1984)]. A vírusban megtalálható egy magnézium (Il)-ionoktól függő fordított transzkriptáz, a sűrű, hengeres magú morfológiája hasonló a D típusú retrovírusokéhoz [Montagnier, L. és munkatársai fentebb idézett munkája; Levy, J. és munkatársai, Science, 225, 840-842 (1984); Schupbach, J. és munkatársai, Science, 224, 503-505 (1984)], és a vírust felismerik azok az antitestek, amelyek gyakorlatilag valamennyi AIDS és ARC beteg szérumában megtalálhatók [Montagnier, L. és munkatársai fentebb idézett munkája; Levy, J. és munkatársai fentebb idézett munkája; Samgadharan, M., Popovic, M„ Bruch, L., Schupbach, J. és Gallo, R., Science, 224, 505-508 (1984); Safai, B. és munkatársai,Láncét,/., 1438-1440 (1984); Brun-Vezinet, F. és munkatársai, Láncét, 1253-1256 (1984); Brun-Vezinet, F. és munkatársai, Science, 226,453-456 (1984); Goedert, J. és munkatársai, Láncét, 11., 711-715 (1984); Lawrence, J. és munkatársai, New Engl. J. Med., 311, 1269-1273 (1984)]. Jelenleg úgy vélik, hogy a HTLV-III és a LAV ugyanannak a vírusnak a törzsei, s ez a vírus a humán immunhiányos vírus (HÍV) elnevezést kapta.

Súlyosan veszélyeztetett az immunfunkció az AIDSes vagy ARC-s betegeknél. Továbbra is vizsgálják azonban a HÍV által kiváltott kóros jelenségek pontos természetét. Különleges jelentőségű volt a HÍV fertőzésnek a limfokinok immunsejtek általi termelésére gyakorolt hatása az ilyen betegeknél, valamint a külsőleg beadott limfokinokra való reagálásuk.

AIDS-ben szenvedő betegnél vizsgálták meg a T limfocitáknak makrofág-aktiváló termékeket, közöttük gamma-interferont kiválasztó kapacitását. Közülük 14 beteg egyáltalán nem termelt aktív lifmokinokat, 13-14 pedig egyáltalán nem választott ki gamma-interferont. Ezen túlmenően, az AIDS betegektől származó makrofágok megnövelt antimikrobiális aktivitást mutattak gamma-interferonnal történő in vitro inkubálásnál, felvetve annak lehetőségét, hogy az ilyen sejtek in vivő reagálhatnak a kívülről bevitt gamma-interferonra [Murray, H. és munkatársai, New Engl. J. Med., 310, 883-889 (1984); Náthán, C. és munkatársai, J. Exp. Med., 158,670-689 (1983)].

A szakirodalomban arról is beszámoltak, hogy az AIDS-ben szenvedő betegektől származó limfocitáknak csökkent az interleukin-2 termelésére irányuló képessége (az interleukin-2 egy olyan limfokin, amely szerepet játszik a T limfociták proliferációjában és elkülönülésében, és amely előmozdítja a gamma-interferon termelését [Fauci, A. és munkatársai, Ann. Int. Med.,/00,92-106 (1984)].

Végül ismeretes, hogy a gamma-interferon közvetlen vírusellenes hatást gyakorol a vezikuláris sztomatítisz vírussal (VSV) fertőzött sejtekre, és potencírozza egy citokinnak a VSV-vel fertőzött sejtekre kifejtett hatását [Aderka és munkatársai, Cell. Immun., 92,218— 225 (1985)]. Ezt a citokint az utóbbi szerzők kísérletképpen egy olyan polipeptidként azonosították, amelyet a leírásban tumomekrózis alfa-faktornak nevezünk. [Lásd még Eifel és munkatársai, Cell. Immun.,

HU 201 679 Β

47,197-203 (1979)]. Az immunrendszert kiegészítő terápia az AIDS kezelésére ezért biztató lehetőségnek tűnt, és klinikai vizsgálatokhoz kezdtek hozzá.

Az AIDS-ben szenvedő betegek limfokin terápiájával kapcsolatos várakozások ellenére az in vivő vizsgálatok eredményei csalódást okoztak. Az in vitro kísérleteknél tapasztalt eredményekkel ellentétben úgy tűnt, hogy rekombinált gamma-interferon intravénás beadásával hosszabb ideig végzett kezelés inkább gátolja, semmint javítja a monocita légzési funkciót [Pennington, J. és munkatársai, J. InfecL Dis., 153, 609-612 (1986)], s AIDS-es betegek intravénás kezelése interleukin-2 vagy gamma-interferon különféle dózisaival arra a következtetésre vezetett, hogy az in vivő limfokin terápiának nincs különösebb értéke az AIDS-ben szenvedő betegek kezelésénél [Lane, H. és munkatársai, Clinical Research, 32, 351A (1984)]. Ténylegesen, a jelen találmány kidolgozásának idejére kialakult egy olyan elméleti iskola, amely szerint az AIDS gyógyításának immunstimulációs vagy rekonstrukciós megközelítése „veszélyes” mivel úgy gondolták, hogy a limfokinokkal történő sejtaktiválás hozzájárul a vírus szétterjedéséhez és a T4 sejtek hiányához, s ennek következtében meggyorsítja a betegség előrehaladását [Klatzmann, D. és munkatársai, Natúré, 319, 10-11 (1986)]. 1986 júniusában Yamamoto és munkatársai [J. Interferon Rés., 6, 143-152 (1986)] nyilvánosságra hozták azt, hogy a humán alfa- és béta-interferon (a gamma-interferon azonban nem) elnyomja a HÍV törzsek replikációját in vitro, amikor azonban megszüntetik az interferonok adagolását, megnövekszik a megfertőzött sejtek vírustermelése. Ez ismét arra mutatott, hogy az AIDS immunterápiája kérdéses.

Végül, felvetették azt a lehetőséget, hogy a HIV-vel fertőzött T sejtek limfotoxint termelnek a T sejtek endogén limfotoxin génjének vírusok által kiváltott átaktiválásával, és így mérgező mennyiségű limfotoxint választanak ki [Ruddle, N. és munkatársai, Immunology Today, 7,8-9 (1986)].

A tumomekrózis faktorok olyan polipeptidek, amelyeket mitogénekkel serkentett makrofágok (tumomekrózis alfa-faktor esetén) vagy limfociták (tumomekrózis béta-faktor esetén) termelnek, és amelyek citotoxikusak bizonyos, rosszindulatúvá transzformált sejtekre. Felvetették azt, hogy a tumomekrózis alfa-faktor felelős a lesoványodásért és leromlásért súlyos fertőzéses rákos betegeknél [Science, 229, 811 (1985)], s beszámoltak arról, hogy a tumomekrózis alfa-faktorral szembeni passzív immunizáció megvédte az egereket az endotoxin halálos hatásával szemben [Beutler, B. és munkatársai, Science, 229,869 (1985)]. Közismert, hogy a tumomekrózis alfa-faktor daganatellenes hatását potenetrozzák az interferonok.

A találmány célja immunterápia biztosítása retrovírusokkal, különösen limfocitotróp vírusokkal, például HIV-vel fertőzött személyek eredményes kezeléséhez.

A találmány további célja készítmény biztosítása azoknak a kezelésére, akiknél fennáll az aktív retrovírus-fertőzés veszélye: ilyenek például a látens retrovírussal fertőzött személyek.

A találmány még további célja olyan készítmény biztosítása, amely immunterápiás profilaxist nyújt a retrovírussal való fertőzésekkel szemben.

Meglepő módon azt találtuk, hogy egy tumomekrózis faktor terápiásán hatékony mennyiségének önmagában vagy egy interferonnal együtt történő beadása védelmet nyújt olyan személyeknek, akiknél fennáll a retrovfrussal való fertőzés veszélye, és elpusztítja a rctrovírussal fertőzött sejteket Míg a gamma-interferon önmagában alig vagy egyáltalán nem fejt ki védőhatást a retrovírussal történő fertőzéssel szemben, és alig citotoxikus a retrovírussal fertőzött sejtekre, s a tumor nekrózis faktor is csak közepesen aktív nagy koncentrációkban, e két hatóanyag kombinációja rendkívüli hatékonyságú. Ez a jelenség in vivő megfigyelhető, annak ellenére, hogy a retrovírussal fertőzött betegek immunrendszere sérült állapotú. Ez az eredmény különösen meglepő, mivel nem tudtuk, hogy a tumor nekrózis faktorból hiány volna az ilyen betegeknél.

Az 1. ábrán egy Northem-gél látható, amely a HÍV vírussal fertőzött HuT78 sejtekben a HÍV vírus mRNStartalmának rendkívüli mértékű csökkenését mutatja be tumomekrózis alfa-faktorral és gamma-interferonnal történő előkezelés után, összehasonlítva olyan sejtekkel, amelyek nem részesültek előkezelésben.

A 2. ábra tumomekrózis alfa-faktorral és/vagy gamma-interferonnal kombinált kataláz antivírális védőhatását mutatja.

A retrovírusok olyan vírusok, amelyek egy vagy két ribonukleinsavat (RNS) tartalmaznak. Ezek a vírusok a replikációhoz felhasználják a gazdasejtek metabolizmusát a vírus RNS genetikai anyagának fordított átírásához. Az így képződő nagy mennyiségű dezoxiribonukleinsav (DNS) transzlációval HÍV fehérjévé és RNS-sé alakul át az utód virionok kialakításához. Ilyen vírusok például az úgynevezett „lassú” vagy lencsevírusok és a T-sejt leukémia vírusok, mint a HTLV-I és HTLV-Π, különösen azonban az AIDS-szel kapcsolatos HÍV törzsek.

A fenti felismerések alapján a találmány szerinti készítményekben a tumomekrózis alfa-faktor gamma-interferonnal kombináljuk, kívánt esetben egy oxigéntartalmú szabad gyököket megkötő enzim hozzáadásával. A tumomekrózis alfa-faktort a 168 213 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentésünkben útuk le (USA elsőbbsége: 1986. július 2.), a rekombináns sejttenyészetben történő szintézisének módszereivel együtt. Az ott leírt tumomekrózis alfa-faktorok közé citotoxikus aminosav-szekvenciájú és glikozilezett változatok is tartoznak, amelyek a találmány szerinti eljáráshoz is felhasználhatók. A találmány szerinti eljáráshoz természetes eredetű és rekombinációs úton készült tumomekrózis alfa-faktor egyaránt felhasználható.

A tumomekrózis faktor nem fajtaspecifikus, ezért az állatoktól, például sertéstől vagy szarvasmarhától származó tumomekrózis faktorok is használhatók a találmány szerinti eljáráshoz. Előnyös a rekombinációs mikrobiológiai sejttenyészetből származó, érett humán tumomekrózis alfa-faktor. A tumomekrózis faktor citolitikus aktivitása rendszerint meghaladja az lxlO⁶ egység/mg értéket az érzékeny L-929 patkány sejteken, ahol az egység definíciója a fentebb hivatkozott szabadalmi bejelentésekben megadott.

Az interferonok jól ismertek. Ide tartozik a gammainterferon, mely szintén jól ismert. A találmány szempontjából legfontosabb jellemzője, hogy képes a sejteknek a vírusfertőzésektől való megvédésére in vitro és in vivő. A találmány szerinti eljáráshoz alkalmazhatjuk a rekombinációs sejttenyészetekben termelt gamma-interferont, a természetes fonásból elkülönített gamma3

HU 201 679 Β interferont vagy a stabil transzformálatlan sejtvonalaktól származó gamma-interferont. A gamma-interferonnak ugyanattól az állatfajtától kell származnia, amelynek a gyógyítására fel kívánjuk használni, mivel ismeretes, hogy a gamma-interferon fajtaspecifikus. A felhasznált interferon célszerűen homogén, és a fajlagos aktivitása meghaladja a mintegy lxlO⁶ nemzetközi egység/mg értéket.

A találmány szerinti készítmények gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot/anyagokat tartalmaznak a fenti hatóanyagok mellett, például az interferonok, a tumomekrózis faktor vagy az LT gyógyászati célú beadásához alkalmazott vivőanyagokat, így fiziológiás sóoldatot vagy 5%-os dextróz-oldatot, a szokásos stabilizátorokkal és/vagy segédanyagokkal együtt, mint amilyen a humán szérum albumin vagy a mannit. A találmány szerinti készítmények liofilizáltak vagy steril vizes oldatok.

A szakember több tényezőt is figyelembe vesz, amikor meghatározza a gamma-interferon és a tumomekrózis alfa-faktor közötti arányt. Ezek a következők: az interferon és a tumomekrózis faktor közötti tiszta arány, az interferon és a tumomekrózis faktor koncentrációja a készítményben, valamint a kezelt egyed testsúly kg-jára számított dózis. Szintén meggondolást igénylő terápiás tényező a kezelni kívánt állatfajta, a beadás módja és a kezelt egyed állapota (ideértve a kezelés kezdetén esetleg már fennálló, retrovírus okozta fertőzés és/vagy járulékos szervfertőzés stádiumát és mértékét). Alkalmas kezdeti dózisszint az interferonból 1—50 gg/m². A dózis célszerűen ne haladja meg a 25 pg/m² körüli értéket.

A találmány szerinti, tumomekrózis faktort és az interferont tartalmazó készítményt többszörös ciklusban is adagolhatjuk, a beteg szervezetének reagálásától függően. Ez a kezelési módszer olyan, látens módon fertőzött sejteknél hatékony, amelyek a fertőzés aktív fázisába lépnek be, akár exogén módon bevitt T-sejt mitogénck következménye a fertőzés, akár a T-sejt aktiválásához vezető járulékos fertőzésekről van szó.

Tekintettel arra, hogy a tumomekrózis faktorral és interferonnal végzett kezelés elbontja a vírussal fertőzött sejtekek és fertőző vírus felszabadulását eredményezheti, a gyógykezelés folyamán előnyös olyan anyagok beadása, amelyek képesek a vírus további fertőzőképességét semlegesíteni. Ez különféle módszerekkel vitelezhető ki. A gyógykezelés folyamán beadhatunk antitesteket, például monoklón vagy poliklón antirctrovfrus antitesteket, előnyösen a tumomekrózis faktor beadásával egyidejűleg. Úgy is eljárhatunk, hogy az immunológiai szempontból megfelelő betegeket beoltjuk a retrovírus ellen, hogy hatékonyan indukáljuk a semlegesítő antitest képződését. Az erre a célra alkalmas vakcina HÍV gp¹²⁰ env-et tartalmaz, és a 187 041 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentésben szerepel (US elsőbbsége: 1986. május 8.). A leírás szerint ez a vakcina HÍV vírust semlegesítő antitestek képződését váltja ki, ami felhasználható a fenti passzív immunizációs kezeléshez. Más olyan szereket is beadhatunk a tumomekrózis faktorral együtt, amelyek megszüntetik a felszabaduló vírusok lehetséges fertőző hatását. Ilyen például a gp¹²⁰ env vagy töredékei, amelyek a szóban forgó retrovírus által felismert sejtfelületi receptorhoz kötődnek (a HÍV vírus esetén ez az OKT4⁺ sejtfelületi jelző, amely jelen van a segéd T-sejteken), és így kom4 petitív módon gátolják a vírus hozzákötődését a célt képező sejtfelületekhez.

A tumomekrózis faktor és/vagy az interferon szinergista vírusellenes és daganatellenes hatását tovább növelhetjük, ha a készítményhez oxigéntartalmú szabad gyököt megkötő, az oxigéntől védő enzimeket is adunk. Ezek az anyagok, így a kataláz, a szuperoxid-demutáz, a peroxidáz vagy a klórperoxidáz, jelentős mértékben fokozzák a tumomekrózis faktor és az interferon aktivitását. Ismeretes, hogy ezek az enzimek katalizálják a hidrogénperoxid elbontását vízre és oxigénre, illetve a következő reakciót:

H₂O₂ + HO-R-OH 2H₂O + O-R-O jóllehet jelenleg nem tudjuk, hogy milyen mechanizmus(ok) szerint potencírozzák az ilyen anyagok a tumomekrózis faktor és az interferon hatását. A kataláz a kereskedelemből könnyen beszerezhető (gyártó: ICN Biochemicals, Ohio, ÚSA) és előállítható az emberi szövetekből, például a vörös vérsejtekből. A peroxidáz a tormából hozzáférhető. A peroxidatíven hatékony anyag, a tumomekrózis faktor és az interferon közötti arány 1000:1:0,1 -100:50 : 25 általában, azonban a tényleges dózisokat és arányokat úgy állítjuk be, hogy megfeleljenek a beteg állapotának és a beadás módjának, hogy csak ezeket említsük meg a szakember számára ismert befolyásoló tényezők közül.

A tumomekrózis faktort és az interferonokat tartalmazó készítményt például intravénásán, intranazálisan vagy intramuszkulárisan adjuk be, esetleg beadhatjuk nyújtott hatású készítmény alakjában, például polilaktid vagy polihidroxi-butirát implantátumokként vagy liposzómaként, a 17,2007A sz. európai szabadalmi leírásban megadott módon, vagy folyamatos infúzióval történhet a beadás. Jelenleg előnyösen úgy járunk el, hogy intravénásán infúzióval adjuk be a tumomekrózis faktort és az interferont a fenti dózisokban.

Annak érdekében, hogy elkerüljük a kombinált terápiától származó mellékhatásokat nagy dózisok alkalmazása esetén, a tumomekrózis faktort és az interferont tartalmazó készítményt extrakorporalis kezelésben alkalmazhatjuk, amelyet korábban adoptív immunterápiának neveztek (4 690 915 és 6 743 570 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely 1985. augusztus 8-án, illetve június 11-én lett benyújtva). E módszerek értelmében a beteg mononukleáris vagy limfocita perifériás vésejtjeit extrakorporális plazmaferezis ciklusban elkülönítik a vérből, interleukin-2-vel vagy interferonnal kezelik őket, majd ismét visszavezetik őket a beteg vérébe. Ez az eljárás jelentős mértékben serkentette a beteg immunreakcióját rosszindulatú megbetegedésekkel szemben. A retrovfrusok okozta fertőzések kezelésénél ugyanezt az általános eljárást alkalmazzuk, csak a perifériális monocitákat és/vagy limfocitákat tumomekrózis faktor jelenlétében vagy tumomekrózis faktor és interferon jelenlétében inkubáljuk. A vírusokkal megfertőzött sejteket elpusztítja a tumomekrózis faktor vagy a két hatóanyag kombinációja. Az extrakorporális sejteket ölősejt-aktiváló sejttel, például nyiroksejt mitogénncl (így fitohemagglutininnel) és/vagy interleukin 2-vel is inkubálhatjuk. A sejteket ezután infúziós közeggel mossuk és infúziós közegben szuszpendáljuk, s a szuszpenziót infúzióval visszave-47

HU 201 679 Β

1. táblázat zetjük ugyanabba a betegbe, akiből a sejteket kivontuk. Ezután tumomekrózis faktort és interferont adhatunk be, a találmánynak megfelelően. A tumomekrózis faktor vagy a tumomekrózis faktor és az interferon optimális mennyiségét, valamint a betegek nyiroksejtjeinek extrakorporális kezelésénél alkalmazandó optimális körülményeket rutinszerűen határozzuk meg a betegek vírustitere és az állapotuk javulása alapján.

A találmány szerinti készítménnyel olyan személyeket kezelünk, akiknél fennáll a retro vírus fertőzés veszélye, vagy akiknél megjelennek a tényleges fertőzés tünetei. Olyan veszélyeztetett csoportok tartoznak ide, mint a homoszexuálisok, a kábítószerélvezők (akik a kábítószert intravénásán adják be maguknak), valamint azok a személyek, akik HÍV antitestekre nem vizsgált vért vagy vérkészítményeket kaptak infúzióban. A retrovfrus okozta fertőzést például a következők bizonyítják: a vérsavó átalakulása HÍV elleni antitestek hatására; pozitív vérsavó-vizsgálati eredménye HIV-re nézve; az ARC-vel összefüggő tünetek vagy AIDS. Az AIDS-betegeknél esetleg kimutathatók a következő betegségek Kaposi-szarkoma vagy más rosszindulatú megbetegedés; járulékos, mikrobák okozta fertőzés, például Pneumocystis carinii vagy szájpenész, idegkárosodás vagy cachexia (lesoványodás).

A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük. A példákban felhasznált interferonok rekombináns baktériumtenyészetek ismert és leírásunkban is idézett módszerekkel előállított termékei, és a tisztításuk 10* egység/mg körüli fajlagos aktivitásértékig történt. A tumomekrózis alfa-faktort szintén rekombinációval állítottuk elő, a fajlagos aktivitásuk 5xl0⁷ egység/mg körüli volt.

1. példa

A HÍV fertőzés megelőzése

Az OKT4*-pozitív humán T-sejt leukémia H9, HuT78 és U937 sejtvonalakat RPMI-1640 közegben szuszpendálva tenyésztjük 37 *C-on. Centrifugálással elválasztjuk a sejteket a tápközegtől, és friss RPMI1640 közegben szuszpendáljuk a sejteket lxlCf/ml sűrűség mellett Ehhez az újraszuszpendált tenyészethez -annyi tumomekrózis alfa-faktort és gamma-interferont adunk, hogy a koncentrációjuk 0,1 pg/ml tumomekrózis alfa-faktor és 0,1 pg/ml gamma-interferon legyen. A tumomekrózis alfa-faktor és a gamma-interferon kombinációja nem toxikus vírusfertőzés nélküli HuT78 és H9 sejtekre. A tenyészetet ezután 37 ’C-on inkubáljuk 24 órán át, majd 1x10® cpm egység/ml HÍV vírust adunk hozzá. A cpm egységet a fordított transzkriptáz aktivitás alapján határozzuk meg [Hoffman, A. és munkatársai, Virology, 147, 326-335 (1985)]. Az egyes egységeket úgy kalibráljuk, hogy egy virion fordított transzkriptáz aktivitásának feleljenek meg. További inkubálást végzünk 3 napig 37 ’C-on, majd megvizsgáljuk vírus antigének jelenlétét közvetlen immunfluoreszcens vizsgálattal, a HÍV vírus p24 (középső) fehérjével szembeni patkány monoklón antitest és izotóppal jelzett kecske antiegér immunglobulin alkalmazásával [Kaminsky, L. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82,5535-5539 (1985)]. A párhuzamos kísérletek eredményét az 1. táblázatban tüntetjük fel, ahol azoknak a sejteknek a százalékos mennyiségét adjuk meg, amelyek a HÍV vírus középső fehérjéjét tartalmazzák.

Hatóanyag Fertőzött sejtek mennyisége %

HuT78 H9 U937

12 12

Kontroll	54	68	48	36	11	14
Tumomekrózis alfa-faktor	27	34	32	18	7	8
gamma- -Interferon	63	51	42	41	12	11
Tumomekrózis alfa-faktor és gamma-interferon	1	8	4	3	2	1

Az 1. táblázat adatai azt mutatják, hogy a tumomekrózis alfa-faktorral és az interferonnal együttesen végzett kezelés igen hatékonyan gátolja a HÍV vírussal való fertőzést az erre egyébként érzékeny T-sejteknél.

2. példa

HÍV vírussal fertőzött sejtek kezelése

H9 és RPMI-1788 limfoblasztoid sejtek RPMI-1640 tápközeggel készült, lxlíP/ml kncentrációjú szuszpenzióját 1x10’ cpm/ml HÍV vírus behatásának tesszük ki 1 pg/ml polibién jelenlétében, hogy növeljük a HÍV vírussal fertőzött sejtek százalékos mennyiségét A sejteket mintegy 30 napig tenyésztjük, miközben 3-5 naponként kicseréljük a tápközeget és körülbelül hetenként egyszer altenyészetet készítünk a sejtekből. A milliliterenként lxlO⁶ sejtet tartalmazó tenyészetekhez gyakorlatilag egyidejűleg adunk annyi tumomekrózis alfa-faktort és gamma-interferont, hogy a 2. táblázatban feltüntetett koncentrációkat kapjuk. A tumomekrózis alfa-faktor és a gamma-interferon kombinációi ezekben a koncentrációkban nem fejtenek ki citotoxikus hatást a vírusokkal nem fertőzött H9 és RPMI-1788 sejtekre. A tenyészeteket 27 ’C-on inkubáljuk 3 napig, majd meghatározzuk az életképes sejtek százalékos mennyiségét trifánkékkel történő megfestéssel. A párhuzamos kísérletek eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be. (A táblázatban ND jelentése: nincs vizsgálat).

2. táblázat

H9	1788
1 2	1 2

Életképes sejtek

Hatóanyag Koncentráció mennyisége, %

Kontroll		89	76	95	86
TNF-alfa	l,0ng/ml	ND	ND	90	81
	0,1 pg/ml	85	74	81	76
gamma- interferon	l,0ng/ml	ND	ND	83	84
	0,1 pg/ml	85	74	80	82
TNF-alfa és
gamma- interferon	l,0ng/ml	ND	ND	68	72
	0,1 pg/ml	50	42	34	53

A 2. táblázatban bemutatott eredmények jelzik, hogy a tumomekrózis faktor és az interferon kombinációja a

HU 201 679 Β koncentrációtól függően pusztítja el a vírussal fertőzött sejteket. Az elért hatás kisebb mértékű egyedül tumornekrózis alfa-faktor használata esetén. Figyelembe véve, hogy a tumomekiózis faktor, illetve az interferonnal alkotott kombinációja védőhatást fejt ki a vírusfertőzésmentes sejtekre, a 2. táblázat igazolja, hogy a találmány szerinti készítmény kedvező hatású a retrovfrus okozta fertőzések kezelésénél.

3. példa

A HÍV vírus replikációjának csökkentése tumomekrózis faktorral és interferonnal

HuT78 sejteket 0,1 pg/ml tumomekrózis alfa-faktorral és 0,1 pg/ml gamma-interferonnal kezelünk, majd megfertőzzük őket HÍV vírussal az 1. példában leírt módon. 37 *C-on 2 napig végzett inkubálás után az összes ribonukleinsavat kivonjuk a HÍV vírussal megfertőzött sejtekből az alábbiak szerint A sejteket PBSsel mossuk, majd 0,35 ml TSM pufferoldatban szuszpendáljuk 0 ’C körüli hőmérsékleten. A használt TSM pufferoldat 10 mM íriszből, pH = 7,5,0,15 M nátriumkloridból és 2 mM magnézium-kloridból állt, és emellett 0,5% ΝΡ-40-et és 17 μΐ VRC-t (BRL) is tartalmazott. 3-5 perc elteltével a sejtmagokat centrifugálással elválasztjuk a feltárt sejtektől. Az mRNS-t tartalmazó felülúszó folyadékot 0,35 ml TSE pufferoldathoz (10 mM trisz, pH = 7,5, 0,15 M nátriumklorid és 5 mM EDTE) adjuk, amely 1% SDS-t is tartalmaz, és 3 x 0,7 ml fcnol(kloroform)izoamilalkohol 24 : 24:1 arányú eleggyel extraháljuk. A fenolt egyensúlyba hozzuk vízzel és 0,1% 8-hidroxi-kinolinnal. A vizes fázisból kicsapjuk a ribonukleinsavat etanol és nátriumacetát segítségével. Ezután poli(A) RNS-t készítettünk oligo(dT) cellulóz elektroforézissel [Aviv, H. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 1408-1412 (1972)]. Northem-hibridizációt végeztünk 1-1 sorban 1 pg RNS felhasználásával a szakirodalomban leírt módon [Thomas, P., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 77,52015205 (1980)]. Az 1. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a tumomekrózis alfa-faktorral történő előkezelés elnyomja a HÍV RNS megjelenését a gazdasejtekben, és lényegesen kevesebb RNS jelenik meg, amikor tumomekiózis faktort és interferont együttesen alkalmazunk. Ezek az eredmények megfelelnek a fertőzőképességgel kapcsolatos, az 1. táblázatban feltüntetett adatoknak. Nem figyelhető meg változás az aktin mRNS-tartalomban (ez egy szerkezeti fehérje), akár végzünk kezelést tumomekrózis faktorral és interferonnal, akár nem. Ez arra mutat, hogy a tumomekrózis alfa-faktor és az interferon hatása inkább a vírust, mint általában a sejtnövekedést célozza meg.

4. példa

AIDS-ben vagy ARC-ben szenvedő betegek gyógyításának jegyzőkönyve

A vizsgálatba olyan férfiakat vonunk be, akiknek a vérsavója pozitív a HÍV antitestre, és a vérük in vitro sejttenyészete pozitív kimutatható HÍV titemél. Ezeknél a betegeknél általában az AIDS-nek vagy az ARCnek megfelelő tünetek jelennek meg, és szerológiai átalakulás történik HÍV antitest esetén. A kezelésbe bevont személyeket csoportokra osztjuk a következő kezelési változók alapján:

1. Kezelés egyidejűleg vagy egymást követően tumomekrózis faktorral és interferonnal.

2. Intravénás vagy intramuszkuláris befecskendezés, és intravénás befecskendezés esetén kezelés bolusszal vagy folyamatos bevitel infúzióval (1,2,5 és 10 nap).

3. A kiindulási dózis 1 pg/m² tumomekrózis faktor és 1 pg/m² interferon, majd mindegyik hatóanyag dózisát 5, 10, 25, 50... pg/m² értékre növeljük a beteg szervezet toleranciája szerint

4. A tumomekrózis faktor és az interferon egymáshoz viszonyított aránya: 1:100 -100:1.

5. Egy-öt alkalommal megismételjük a kezelési ciklusokat, miközben 1,2,5 vagy 10 napra felfüggesztjük a kezelést

6. Az egyes alkalmazott interferontípusok és arányuk:

alfa-interferon és gamma-interferon 1: 10 - 10: 1 arányban;

béta-interferon és gamma-interferon 1:10 - 10:1 arányban;

gamma-interferon, alfa-interferon vagy béta-interferon egyedül 1:1:1-10:1:1-1:5:5 arányban.

A célszerű kezdeti kezelés abból áll, hogy az ARCben szenvedő betegeket a tumomekrózis alfa-faktor, gama-interferon és alfa-interferon kombinációjával kezeljük. Ezt a kombinációt folyamatos infúzióval adjuk be olyan intravénás infúziós szivattyú segítségével, amely a kalibrálás szerint 1-10 pg/m² tumomekrózis alfa-faktort, 1-10 pg/m² gamma-interferont és ΙΙΟ pg/m² alfa-interferont továbbít 24 (ka alatt A betegek nagyobb dózisokat is kaphatnak, ha nem jelentkezik tolerancia probléma. Ezt az infúziós kezelést egy hétig végezzük. Hagyjuk, hogy a következő héten a betegek pihenjenek, majd az infúziós kezelést megismételjük. A mellékhatásokat, például a lázat, hidegrázást stb. A szokásos módon kezeljük, vagy csökkentjük a dózist. Ha a fenti hatóanyagok mellett vírusellenes szerként anti-HIV antitestet vagy gpl20 env-t is beadunk, az antitestet vagy az env polipeptidet olyan dózisban alkalmazzuk, hogy megkösse azokat a virionokat, amelyeket a találmány szerinti kombinációs készítménnyel végzett kezelés felszabadít Ez a dózis függ az antitestnek a virionnal szembeni affinitásától és a semlegesítő titerétől, valamint a beteg vírustiterétől. A célszerű dózis meghatározását a gyakorlott szakember könnyen elvégezheti.

A kezelés alatt és utána ellenőrizzük a betegek állapotát és vírusfertőzést titerét. Az 1-3. példában ismertetett in vitro vizsgálatoknak megfelelően a kezelés eredményeként javult a betegek statisztikailag szignifikáns hányadának az immunállapota és a vírustitere.

J

5. példa

A kataláz potencírozza a gamma-interferon és/vagy a tumomekrózis alfa-faktor vírusellenes aktivitását bemélyedést tartalmazó, laposaljú tálcákban (gyártó: Falcon Plastics) elhelyezett táptalajra A549 sejteket oltunk bemélyedésenként 2x10* mennyiségben, 24 órával a vizsgálandó mintákkal történő inkubálás előtt. A vizsgált mintákat a 2. ábrán tüntetjük fel, ahol „CAT” jelentése kataláz (gyártó: ICN Biochemicals, Óhio, USA) IFN jelentése interferon, TNF jelentése tumomekrózis faktor. A minták egyébként Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalajt tartalmaznak (DME), amelyet 5% mennyiségű, hőkezeléssel inaktivált magzati borjúszérummal (FCS), 2 mM glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztrepto-611

HU 201 679 Β micinnel egészítünk ki. A tenyészeteket 18 órán át inkubáljuk 37 *C-on, majd a felülúszó folyadékokat olyan friss DME táptalajra cseréljük ki, amely mentes az interferontól, tumomekiózis faktortól vagy a kataláztól, azonban 2% magzati borjúszérumot és EMC vírust tartalmaz, ahol a fertőzés mértéke („Μ0Γ, az egy sejtre jutó fertőző vírusok száma) 1. A citopatikus hatást (CPE) úgy határozzuk meg, hogy kristályibolyával megfestjük az életképes sejteket, majd kvantitatíve mérjük mikroeliza önleolvasó készülék (MR580, gyártó: Dynatech) segítségével, és további vizuális kiértékelést is alkalmazunk. A CPE vírusellenes titert annak a hígításnak a reciprokaként fejezzük ki, amely a sejtcitopátía 50%-át gátolja. A kalibráláshoz emberi gammainterferon nemzetközi vonatkoztatási mintát (Gg 23901-630) használunk.

Amint az a 2. ábrán látható, a kataláz rendkívüli mértékben és szinergista módon növeli a gamma-interferon és a tumomekrózis alfa-faktor vírusellenes hatását. Ez a hatás nem korlátozódik az EMC vírusra, hanem sokféle, vírusfertőzésre hajlamos sejt és sokféle vírus esetén megfigyelhető.

Ugyanezt az eljárást a leírt módon, de kataláz enzim helyett szuperoxid demutáz, klórperoxidáz, illetőleg peroxidáz enzim (ICN Biochemicals, Ohio, USA) ugyanilyen mennyiségeinek alkalmazásával megismételve azt tapasztaljuk, hogy az említett enzimek mindegyikének tumomekrózis alfa-faktorral és gamma-interferonnal való kombinációja esetében a kombináció hasonlóan nagymértékű szinergista hatást mutat.

Claims (5)

1. Eljárás retrovírus-fertőzések elleni szinergista hatású gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy tumomekrózis alfa-faktort 1,0 ng/ml és 1,0 mg/ml közötti koncentrációban, és gamma-interferont 1,0 ng/ml és 1,0 mg/ml közötti koncentrációban, kívánt esetben oxigéntartalmú szabad gyököt megkötő enzimként kataláz, peroxidáz, klór-peroxidáz vagy szuperoxid-demutáz enzim és/vagy HIV-antitest hozzáadásával, gyógyászati szempontból elfogadható, injekció útján történő beadásra alkalmas vivőanyaggal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gamma-interferonként természetes eredetű vagy rekombináns sejttenyészetbent érméit, legalább 1.10® NE/mg fajlagos aktivitású gamma-interferont használunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tumomekrózis alfa-faktorként természetes, előnyösen humán eredetű vagy rekombináns sejttenyészetben termelt, előnyösen legalább 1.10® egység/mg, érzékeny L-929 egérsejteken mért fajlagos alfa-faktort használunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tumomekrózis alfa-faktort és gamma-interferont 100:1 és 1: 100 közötti mennyiségi arányban alkalmazzuk.

5. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kataláz enzimként humán eritrocita katalázt alkalmazunk.