HU200942B

HU200942B - Process for producing pharmaceutical compositions suitable for treating tumours, comprising dipyridamol or dipyridamol and interferon

Info

Publication number: HU200942B
Application number: HU883081A
Authority: HU
Inventors: Nobuo Suzuki; Yoshiaki Takakubo
Original assignee: Boehringer Ingelheim Kg
Priority date: 1987-06-16
Filing date: 1988-06-15
Publication date: 1990-09-28
Also published as: AU622404B2; EP0295559B1; DE3861494D1; JPH0529365B2; US4997645A; EP0295559A2; AU1768188A; EP0295559A3; JPS63316722A; PH27069A; ATE59780T1; HUT47033A; DK328088D0; KR890000108A; EP0295317A1; DK328088A; ZA884262B

Description

A találmány tárgya eljárás daganatok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, amely dipiridamolt, illetve dipiridamol és interferon keverékét tartalmazza. Pontosabban, a találmánytárgya olyan eljárás, amelynek során dipiridamolt használunk fel az interferon daganatnövekedést gátló hatásának elősegítése céljából. A találmány szerint előállított gyógyszerkészítménnyel tehát daganatos betegeket dipiridamol és interferon kombinációjával kezelhetünk, továbbá daganatok kezelésére alkalmas, - dipiridamolt és interferonokat tartalmazó - gyógyszerkészítményeket állíthatunk elő.

A humán interferonok (HuIFN) a tenyésztett sejtvonalak növekedésére gyakorolt gátló hatására vonatkozó információ alapján klinikai vizsgálatokat végeztek a HuIFN-nal, mint feltételezhetően daganatellenes kezelésre alkalmas készítménnyel (Adv. Cancer Rés., Vol. 46, Academic Press. London 1986; valamint Stewart, The Interferon System (Az Interferon Rendszer), Springer-Vergal, Wien/New York, 1981).

Újabb kutatások szerint az emberi sejtek érzékenysége a HuIFN anticelluláris hatásaira szoros összefüggést mutat (korrelációban áll) a radioszenzitivitással és/vagy a DNS-károsodást helyreállító képességgel (repair capacity). (Suzuki et al., Virology, 135:20-29,1984, Mutation Rés., 106:357376,1982; J. gén. Virol., 67: 651.661; Yrosh et al., Carcinogenesis, 6: 883-886, 1985: Biophys. Rés. Commun., 72: 732, 1976). Azt is megállapították, hogy a DNS károsítását követő celluláris válaszreakciót módosítja az önmagában alkalmazott HuIFN-nal végzett kezelés; példaként említhetjük erre a DNS-reparáló (repair) szintézis mértékének fokozófását, valamint azon sejtek túlélésének meghosszabbodását, melyeket a DNS szerkezeti károsodását kiváltó szerekkel kezeltek (Suzuki et al., Virology, 135:20-39,1984; Mutation Rés., 175:189193,1986). Nem ajánlatos tehát a HuIFN-nal végzett daganatellenes kezelés során olyan egyéb rákellenes szerekkel kombinálni a HuIFN-t, melyek károsítják a DNS-t, mivel a HuIFN rezisztenciát vált ki ezen szerekkel szemben. Olyan szerre van tehát szükség, mely önmagában nem károsítja a DNS-t, de képes fokozni az interferon daganatellenes hatékonyságát.

A2,6-bisz(dietanol-amino)-4,8-dipiperidino-pirimido-[4,5-d]pirimidint - melynek nemzetközi szabad neve dipiridamol - és az előállítására vonatkozó eljárást pl. a 3,031,450 számú, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti.

A dipiridamol jól ismert értágító (vazodilatátor) hatású szer, melynek vérlemezke-aggregációt gátló tulajdonsága is ismert. E tulajdonságai miatt hosszú éveken keresztül kiterjedten alkalmazták krónikus koronáriaelégtelenség kezelésére, szívinfarktus megelőzésére és kezelésére, valamint artériás trombózis megelőzésére.

A legújabb vizsgálatok is a dipiridamolnak a daganatok kezelése sirán történő esetleges alkalmazhatóságára vonatkoznak. A dipiridamol iránti érdeklődést az a megfigyelés keltette fel, hogy a szer - bár nem károsítja a DNS-t hatékonyan blokkolja a DNS-szintézis ún. „salvage mechaniz2 musát (kész nukleinsav-bázisokből történő szintézis), gátolni képes továbbá a nukleozidok transzportját a sejtmembránon keresztül, és ennek következtében megakadályozza a sejten belüli nukleozid-szintek helyreállítását, potenciálisan gátolja tehát a tumorsejt-szintézis fontos lépéseit (1. Biochem. Biophys. Acta, 158: 435-447,1968, valamint Biochem. Biophys. Acta, 211:88-94,1970).

E tulajdonságai miatt önmagában és különböző daganatellenes szerekkel kombinálva vizsgálták a dipiridamol hatásait. Chan és munkatársai (Cancer Treat. Rep. 69:425-430,1985) megfigyelték, hogy a dipiridamol in vitro és in vivő körülmények között egyaránt fokozza az N-foszfor-acetil-L-aszpartát (PALA) aktivitását: a PALA egypirimidin-antimetabolit, mely a vizsgálatok szerint az intracelluláris pirimidon-nukleotidok deplációját (legyengítését) okozva gátolja a de novo pirimidinszintézis egyik korai lépését. Egy másik vizsgálatukban Chan és munkatársai (Cancer Research 45,3598-3604, August 1985) arról számoltak be, hogy a dipiridamol humán petefészek-karcinóma sejtvonal esetében fokozta a PALA aktivitását, önmagában azonban nem fejtett ki citotoxikus hatást.

Zhen és munkatársai (Cancer Research 43, 1616-1619, April 1983) megfigelték, hogy egyenként 8 μΜ-os, optimális koncentrációban hozzáadott citidin, dezoxicitidin és guanozin kombinációjának alkalmazásával kivédhető az antiglutamin hatású Avicin proliferációt gátló aktivitása patkány-hepatoma 3924 A típusú sejteken, a védelmet azonban 6 μ,Μ koncentrációban alkalmazott dipiridamol megszünteti.

Nelson és munkatársai (cancer Research 44, 2493-2496, June, 1984) közlése szerint a dipiridamol megnövelte a metotrexát (MTX) toxicitását kínai hörcsög petefészeksejtjei esetében, in vitro és in vivő körülmények között egyaránt; nem javította azonban jelentős mértékben a MTX daganatellenes hatékonyságát bizonyos más daganatoknál, amilyen például a Ridgway-féle oszteogén szarkoma és a LIZIO-féle leukémia.

Számos más közlemény is beszámol a dipiridamolnak egyes rákellenes hatású szerekkel kombinált alkalmazásának vizsgálatáról, daganatsejtek esetében. A dipiridamollal kombinált daganatellenes hatású szer a citarabin (Cancer Treat. Rep. 68: 361-336,1984), illetve a 2’-dezoxi-adenozin (Cancer Research 45: 6418-6424, December 1985) volt.

Folytak továbbá vizsgálatok önmagában alkalmazott dipiridamollal - mint rákellenes hatású szerrel - is. Weber (Cancer Research 73, 34663492, August 1983) a dipiridamol (acivin kombinált hatását vizsgáló kísérletében azt is kimutatta, hogy a dipiridamol képes elpusztítani a hepatoma 3924A típusú sejteket. Bastida (Cancer Research 45,40484052. September 1985) a dipiridamol potenciális metasztatikus hatásáról számol be, mely valószínűleg abból ered, hogy a szer gátolja a daganatsejt anyagcseréjét, illetve a daganatsejtek vérlemezkéket aktiváló tulajdonságában szerepet játszó mechanizmusok valamelyikét, vagy közülük többet.

Végeztek kísérleteket egy szerkezetileg rokon feltételezhetően rákellenes hatású - vegyűlettel is, a 2,6-bisz(dietanol-amino)-4-piperidino-pirimi-2HU 200942 Β do[5,4/d]-pirimidinnel (Mopidamol).

Gastpar (laryng. Rhinol., Otol. 62 (1983) 578525) vizsgálatai szerint a mopidamol fokozza az interferonok antimiototikus hatását és a jól ismert, az úgynevezett „killer sejteket aktiváló tulajdonsá- 5 gát. A szerző a fenti közleményben arról is beszámol, hogy a „mopidamolnak humán promielocitaleukémiás sejtvonal tenyészetéhez történő hozzáadása elősegíti a malignus sejtek normál sejtekké történő, fordított irányú transzformációját, ami ál- 10 landófenotipiás változásnak bizonyul. Kimutatható továbbá, hogy a mopidamol szignifikánsan csökkenti a spontán tüdő-metasztázisokat patkányok veleszületett Wilmstumorában (nefroblasztoma), egerek C1300 típusú neuroblasztomájában és pat- 15 kányok HM-Kim típusú emlőkarcinomájában.

A mopidamolnak a fent leírt kísérletekben történt alkalmazása azon a képességen alapult, hogy a szer növeli a cAMP szinteket, ennek következtében pedig gátolni képes a ^H-timidinnek a daganatsej- 20 tekbe történő beépülését (inkorporációját), továbbá közvetlenül gátolja a mitózis sebességét. A cAMP-szintekre gyakorolt hatás azon alapszik, hogy a mopidamol gátolja a foszfodíeszteráz (PDE) által indukált cAMP lebontását, továbbá 25 fokozhatja a prosztaciklin szintézisét és/vagy az érfalból történő leadását (release-ét), ami viszont aktiválja a cAMP szintézisben szerepet játszó adenilát-cikláz enzimet. A dipiridamol azonban sokkal gyengébb PDE gátló, mint a mopidamol. 30

Meg kell azonban állapítanunk azt is, hogy a mopidamolnak interferonokkal való kombinációira vonatkozó irodalmi adatok nem egységesek. Míg például J.L. Ambrus és munkatársai szerint (Proc.

Am. Assoc. Cancer Rés. 23,183 (1982) a mopida- 35 mól fokozza a leukocita- és fibroblaszt-interferonok daganatellenes hatását szövettenyészetben, továbbá a Proc. Sec. Exp. Bioi. Med. [177, 487-490 (1984)] közleménye szerint a mopidamol fokozza a humán fibroblaszt-eredetű béta-interferon proliié- 40 rációt gátló hatását, Wolf és munkatársainak közelménye szerint azonban (J. Med. 75,15-21 (1984) ellentétben a humán fibroblaszt-inteferonnal együtt kifejtett hatásával -, nem volt megfigyelhető szinergista gátló hatás a mopidamol és számos alfa- 45 és gamma-interferon között; végül Ambrus és munkatársai (Proc. Am. Assoc. Cancer Rés. 24, 309 (1983) - ellentétben néhány korábbi közléssel -, azt találják, hogy nincs szinergizmus az interferon és a mopidamol között. 50

A dipiridamollal e kutatási területen végzett további vizsgálatot Galabov, munkatársaival együtt (Acta Virol. 1982 2613/137-147). Galabov vizsgálatain alapul a 0.084.953 számú európai szabadalmi leírás, Galabov és munkatársai szerint a dipirida- 55 mól interferon-termelést képes kiváltani in vitro körülmények között, a szervezetből kivett - egerek peritoneumából nyert - leukocitákban és más sejtekben. A szerző arról is beszámol, hogy a dipiridamol interferon-termelést váltott ki egerekben, int- 60 ravénás alkamazást követően. E vizsgálatokat azonban más kutatócsoportok még nem erősítették meg.

Az irodalmi ismertetések és ajánlások értelmében a dipiridamolnak valamilyen interferonnal tör- 65 ténő kombinációja a daganatok kezelésére alkalmas eljárásnak tűnik, illetve az irodalmi adatok alapján várható, hogy az ilyenfajta kombinált kezelés jelentős eredményre vezethet.

A jelen találmány feltalálói azt tapasztalták, hogy a dipiridamol - egy olyan vegyület, melynek nincsenek DNS-t károsító tulajdonságai illetve annak valamely, gyógyszerészetileg elfogadható sója meglepő módon növeli az alfa-, béta vagy gamma-interferonok csoportjából választott valamely interferon daganatellenes hatékonyságát.

Ennek megfelelően, a találmány alapján egyfelől a daganatos betegek kezelése végezhető el, melynek során dipiridamolt, vagy annak valamilyen sóját adagoljuk a betegnek olyan mennyiségben, mely elegendő ahhoz, hogy fokozza a betegnek szintén beadott interferon daganatellenes hatékonyságát.

A találmány alapján olyan daganatos betegek kezelésére vonatkozó eljárás is alkalmazható, melynek során az adott betegnek valamilyen interferont és dipiridamolt, vagy annak valamely, gyógyszerészetileg elfogadható sóját adagoljuk olyan mennyiségben, mely fokozza az interferon daganatellenes hatékonyságát.

A találmány tárgya tehát olyan gyógyszerkészítmény előállítására vonatkozó eljárás, mely dipiridamolt vagy annak valamely, gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazza, és amely fokozni képes az interferon daganatellenes hatékonyságát, amennyiben a készítményt daganatban szenvedő, interferonnal kezelt betegnek adagoljuk.

A találmány tárgyát képezi olyan gyógyszerkészítmény előállítására vonatkozó eljárás is, mely valamilyen interferont, valamint dipiridamolt vagy annak valamely, gyógyszerészetileg elfogadható sóját tartalmazza, hagyományos gyógyászerészeti adalékanyagokkal együtt.

A találmány leírása során az interferon elnevezézését használjuk a leukocita-(a), fibroblaszt-(p), illetve az immun-Oy) interferonok esetében egyaránt.

A különböző interferonok aminosav-sorrendjét (aminosav-szekvenciáját), rekombinációs eljárással történő előállításukat, valamint az őket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására vonatkozó eljárást a szakirodalom ismerteti.

Például a HuIFNooa aminosav-szekvenciáját és rekombinált készítményeiket a 0.043.980 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentés tartalmazza; a HuIFNa2b-t a 0.032.134 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentés a HuIFNa2c-t pedig a 0.115.613 számú közzétételi európai szabadalmi bejelentés ismerteti. Hasonlóképpen a 0.028.033 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentés a HuIFN-β aminosav-szekvenciáját és rekombinációs eljárással történő előállítását ismerteti. A HuIFN-γ amiosav-szekvenciáját és rekombinációs készítményét a 0.051.873 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentés közli.

A dipiridamolt, illetve annak sóját, valamint az interferont oly módon kell adagolni, hogy azok egyszerrel legyenek jelen a daganatos területen. Előnyös tehát, ha adagolásuk párhuzamosan, vagy lényegében párhuzaosan történik.

Jelenleg a daganatellenes kezelés szempontjá3

-3HU 200942 Β ból előnyös, hatékony dipiridamol plazmaszintnek közülbelül a 0,1 μΜ-t (50 ng=ml) tekintjük, a kezelés szempontjából hatékony interferon plazmaszint pedig körülbelül 10 NE/ml.

Mind a dipiridamolnak, illetve sóinak, mind pe- 5 dig az interferonoknak ajánlott dózisait a fent ismertetett plazmaszintek alapján állapíthatjuk meg. Nyilvánvalóan az aktuális dózisokat a kezelőorvos módosíthatja, az egyes betegek kezelési körülményeitől, illetve állapotától függően. 10

A találmány szerint előállított gyógyszerkészítmény gyakorlati alkalmazása során az interferon adagolása történhez parenterálisan. A dózisok, illetve dózistartományok előnyös körülbelül 1 x 10⁶és 10 x 10⁶ NE közé esnek; intravénás alkalmazás 15 esetén naponta kétszer, előnyösen 1 x 10⁶ és 3 x 10°

NE közé, intramuszkuláris adás esetén a kezelés napi egy alkalommal történik.

A humán interferonok előnyös dózisformáit tartalmazó készítmények jól ismertek. 20

Parenterális alkalmazásra megfelelő adagolási forma előállítása érdekében szükséges mennyiségű HuIFN-t oldunk fel 5%-os humán szérum-albuminban, mely szükség esetén tartalmazhat valamely megfeleld pufferoldatot is. Az így keletkező oldatot 25 ezt követően bakteriológiai szűrőn juttatjuk keresztül, majd az így nyert, megszűrt oldatot steril körülmények között ampullákba töltjük. Valamennyi ampulla megfelelő mennyiségű interferont tartalmaz, szükség esetén liofilizálva. Az üveg-ampullá- 30 kát felhasználás előtt előnyösen lehűtött körülmények között (-20 °C-on) tároljuk. Az interferonok ismert módon feldolgozhatók gyógyszerészetileg felhasználható készítményekké oly módon, hogy az interferont valamilyen, gyógyszerészetileg elfogad- 35 ható vivőanyaggal keverjük össze: a hagyományos vivőanyagok és az előállítás tekintetében hivatkozunk az E.W. Martin által leírtakra (Remington: Pharmaceutical Sciences).

A dipiridamol, illetve annak valamely sója alkal- 40 mazható bármely szokásos adagolási eljárás segítségvei, például perorális vagy parenterálisan. Jelenleg az előnyös adagolási mód a perorális alkalmazás. Az ajánlott dózis naponta kétszer 25-100 mg, előnyösen 30-Ó0 mg. Szükség esetén azonban 45 10-20 mg dipiridamol is alkalmazható egyszeri dózisként, melyet intravénásán adunk be, az interferonnal azonos órában.

A dipiridamol a kereskedelmi forgalomban a védjegyzett Persantin márkanéven szerezhető be, 50 számos adagolási formában. A 10 mg dipiridamolt tartalmazó injekciós oldatot és a 25 mg, illetve 75 mg dipiridamolt tartalmazó drazsét például a Rote Liste 1987-es kiadása ismerteti. A kötet a Bundesverband dér Pharmazeutischen Industrie e.V., D- 55 6000 Frankfurt a.M., NSZK kiadásban jelent meg. Standard eljárások segítségével különböző dipiridalom-mennyiségeket tartalmazó megfelelő adagolási formák állíthatók elő. Az irodalom ezen kívül számos speciális, galenusi készítményt is ismertet, 60 melyek célja gyorsított vagy késleltetett (elhúzódó) dipiridamol-hatóanyagleadás, illetve felszívódás biztosítása. Ilyen például a 0.032.562 közzétételi számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett retard típusú kapszula, illetve a 0.068.191 köz- 65 zétételi számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett, azonnali hatóanyagleadást biztosító készítmény. Egy további, késleltetett hatóanyagleadású galenusi gyógyszerformát ismertet a 2.025.227 számú brit szabadalmi leírás.

A találmány azon a megfigyelésen alapszik, hogy különböző stabilizált humán sejtvonalak esetében a dipiridamol azt a meglepő tulajdonságot mutatta, hogy fokozta a különböző humán interferonok proliferációt gátló hatását. Ezért a következőkben ismertetendő vizsgálatokat végeztük el:

Négy stabilitált sejtvonalat használtunk. Ezek a következők voltak: MM-I CB, mely egy 70 éves férfi malignus melanoma-szövetéből (IV-es szint, PT4N0M0; Jpn. J. Dermatol., 96:947, (1986) származott; KT, mely egy 52 éves nő metasztatikus agydaganatából származott (J. Dai. Rés., 26:59, 1985; The 44th Meethin of Japanese Cancer Association, 718,1985); a PLC/PRF/5, mely humán hepatomából származott (1. Brit. J. Cancer, 34: 509515,1976), valamint egy RSa típusú transzformált sejtvonal (Virology, 135: 20-29, 1984 és J. Natl. Cancer Inst., 56:919-926,1976).

A sejtek tenyésztését Eagle-féle minimális tápfolyadékban (EMEM) végeztük, mely 10%-fötális bovin-szérumot (GIBCO, U.S.A.) és antibiotikumokat (100 μg sztreptomicin/ml és 100 egység penicillin G/ml) tartalmazott. A tenyésztést inkubátorban végeztük, 37 ’C hőmérsékleten, 5%-os széndioxidtartalom mellett.

A természetes HuIFN készítményeket: a/10⁸nemzetközi referencia egység (NE) (mg fehérje), β/10⁷ ΝΕ/μγ φεη'ρφε) 'σ Χλ-β, valamint γ/KF NE/mg fehérje), az ENZO BIOCHEM INC. (U.S.A.), a Flow-Rentschler Inc. (NSZK), valamint a Paesel GmbH Co. (NSZK cégtől szereztük be. A dipiridamolt és a mopidamolt a Boehringer Ingelheim GmbH (NSZK) biztosította számunkra. Egyéb kémiai szerepeket a Nakarai Co., Ltd. (Japán) cégtől szereztük be.

A találmányt részletesebben az ábrák és példák segítségével ismertetjük. Ábráink közül:

- az 1. ábrán az MM-ICB proliferáciős görbéi láthatók. Jelzések: 0-10 egység/ml HuIFN-B-nak megfelelő ál-HuIFN-B-val végzett kezelés; o - 0,1 μπι dipiridamollal végzett kezelés; Δ -10 egység/ml HuIFN-B-val végzett kezelés; 1 -10 egység/ml Hu1 FN-p-val és 0,1 μΜ dipiridamollal végzett kezelés; n - a hatóanyagokkal végzett kezelés időtartama;

- 2. ábrán a morfológia és sejtmegosztás látható 6 nappal a HuIFN-B-val és dipiridamollal végzett folyamatos kezelést követően, MM-ICB sejtvonal esetében éspedig a 2A képen 10 egység/ml HuIFNβ-nak megfelelő ál-HuIFNp; a 2B képen 0,1 μΜ dipiridamol; aa 2C képen 10 egység/ml HuIFN-β; és a 2D képen 10 egység/ml HuIFN-β és 0,1 μΜ dipiridamol;

- a 3. ábra A jelű diagramján sejt-túlélési százalékok láthatók, 6 nappal a 0,1 μΜ dipiridamollal és a HuIFNa (Δ és s), - β (0 és 1), valamint - γ (o és n) különböző mennyiségeivel (egységek) végzett folyamatos kezelést követően, MM-ICB sejtvonal esetében. A jelzések jelentése:

Δ, 0 és 0 - önmagában adott HuIFN-nel végzett kezelés;

-4HU 200942 Β s, 1 és η - HuIFN-nel és dipiridamollal végzett kezelés.

A B jelű diagram a sejt-túlélési százalékokat mutatja 6 nappal a 10 egység/ml HuIFN-a(s), -β(1) és -γ(η), valamint a különböző koncentrációjú dipirídamol kombinációjával végzett folyamatos kezelést követően, MM-1CN sejtvonal esetében.

A o jelzés jelentése: önmagában adott dipiridamollal végzett kezelés;

- a 4. ábra A diagramja a sejt-túlélési százalékokat mutatja 4 nappal a 0,1 μΜ dipiridamollal és különböző mennyiségű (egységek) HuIFN-a-val végzett folyamatos kezelést követően, KT sejtek esetében. A jelzések jelentése:

o- önmagában adott HuIFN-a-val végzett kezelés;

- HuIFN-a-val és dipiridamollal végzett kezelés.

A B diagramon sejt-túlélési százalékokat láthatunk, 4 nappal a 10 egység/ml HuIFN-a-val és külöböző koncentrációjú dipiridamollal végzett, folyamatos kezelést követően. A jelzések közül:

o - önmagában adott dipiridamollal végzett kezelés;

- HuIFN-a-val és dipiridamollal végzett kezelés;

- az 5. ábra A diagramján sejt-túlélési százalékok láthatók, 6 nappal a 0,1 μΜ dipiridamollal és különböző mennyiségű (egységek) HuIFN-p-val végzett, folyamatos kezelést követően, PLC/PRF/5 sejtek esetében.

A jelzések:

o-önmagábanadott HuIFN^-val végzett kezelés;

- HuIFN-B-val és dipiridamollal végzett kezelés, a B diagram sejt-túlélési százalékokat mutat, 6 nappal 10 egység/ml HuIFN-O-val és különböző koncentrációjú dipiridamollal végzett, folyamatos kezelést követően.

A jelzések jelentése:

p - önmagában adott dipiridamollal végzett kezelés;

- HuIFN-O-val és dipiridamollal végzett kezelés.

- a 6. ábrán morfológia és sejtmegoszlás látható, 2 nappal a HuIFN-a-val és dipiridamollal végzett kezelést követően, KT sejtek esetében. A 6A kép a Kontroll; a 6B kép a 0,1 μΜ dipiridamol; a 6C kép a 10 egység/ml HuIFN-α; a 6D kép a 10 egység/ml HuIFN-α és 0,1 μΜ dipiridamol;

- a 7. ábrán morfológiai és sejtmegoszlás látható, 6 nappal a HuIFN-p-val és dipiridamollal végzett kezelést követően, PLC/PRF/5 sejtek esetében. A 7A kép a Kontroll; a 7B kép a 0,1 μΜ dipiridamol; a 7C kép a 10 egység/ml HuIFN-β; a 7D kép a 10 egység/ml HuIFN-β és 0,1 μπι dipiridamol;

- a & ábra DNS-szintézis aktivitási tesztet mutat be KT sejtek esetében, savban oldhatatlan sejt-alkotórészekbe (anyagokba) történő[³H]-dezoxi-timidin inkorporációval vizsgálva, 24 órával az ezen szerekkel végzett kezelést követően.

A jelzések jelentése: o - HuIFN-a

- HuTFN-a és 0,1 μΜ dipiridamol.

A sejt-proliferáció gátlási teszt során vala8 mennyi sejtvonal logaritmikusán növekvő számú sejtjeivel végeztünk leoltásokat; egy 60 mm-es Petri-csészére l-5xl0⁴ sejt jutott (IWAKI, Japán), majd a leoltást követően 2Q órával a sejteket átmos5 tűk, és olyan tenyésztő közeggel töltöttük fel, mely HuIFN készítményeket és dipiridamolt tartalmazott, illetve nem tartalmazott. A hatóanyagokat tartalmazó, illetve nem tartalmazó közegeket minden második nap lecseréltük. A sejtek életképességét tripán-kék vitális festék kizárásos módszerrel állapítottuk meg, és hemocitométer segítségével számláltuk meg a sejteket. A túlélés százalékos arányát a következőképpen fejeztük ki: az életképes sejtek száma a vizsgálati anyagot tartalmazó Petri-csé15 székben (az életképes sejtek száma a kontroll Petri-csészékben) x 100%, a leírásoknak megfelelően, például Mutation Research, 106: 357-376,1982 és J. Gén. Virol., 67:651-661,1986.

A DNS-szintézis aktivitásának vizsgálata során [³H] dTHD-nek savban oldhatatlan anyagokba történő felvételét állapítottuk meg, különböző szerekkel kezelt KT, illetve RSa sejtekben, a J. Gén. Virol., 67:651-661,1986. leírásának megfelelően.

A mikroszkópos vizsgálatot úgy végeztük, hogy a vizsgálati Petri-csészékbe leoltott sejteket OLYMPUS IMT-2 típusú mikroszkóp segítségével figyeltük meg és fényképeztük le (100-150-szeres nagyítás).

A kísérletek többségét tompított fénynél vagy sötétben végeztük. Az eredményeket több, mint két független kísérletből nyert értékek átlagaként fejeztük ki.

Az MM-ICB sejteken végzett vizsgálat során azt tapasztaltuk, hogy valamely, önmagában alkalma35 zott szer -10 NE/ml HuIFN-β vagy 0,1 μΜ dipiridamol - csak kismértékben gátolta a sejt-proliferációt; a sejtproliferáció jelentős gátlása volt azonban megfigyelhető abban az esetben, amikor mindkét fent említett szert együtt adagoltuk, 4 napnál hosszabb ideig (1. ábra). A kombinált kezelést követően a sejtek morfológiai szempontból károsodottnak bizonyultak, összehasonlítva az ál-HuIFNβ-val kezelt sejtekkel, az egyes szerekkel külön-külön kezelt sejtek azonban nem sérültek (1.2. ábra).

Amikor a sejteket folyamatosan kezeltük 0,1 μΜ dipiridamollal, a HuIFN-α, -β és g - additív hatása is megfigyelhető volt (3A ábra). Magasabb koncentrációk, sőt még alacsonyabbak - egészen 0,01 μΜ dipiridamol koncentrációig lefelé - is hatéko50 nyan fokozták a HuIFN antícelluláris hatását (3B ábra).

A két sejtvonal (sejtfajta) - a metasztatíkus agydaganat (KT) és a hepatoma (PLC/PRF/5) sejtvonal - HuIFN-nel és dipiridamollal végzett kombi55 nált kezelésekor azt tapasztaltuk, hogy mindkét sejtfajta igen érzékeny a szerek szinergetikus gátló hatására (4. és 5. ábra). Bár a KT sejtek szaporodását már az önmagában adott HuIFN-α is nagymértékben gátolta, a sejtszaporodás gátlása azonban az egyidejű dipiridamol-adagolás következtében fokozódott (4. ábra). Még a 0,1 μΜ-nál kisebb dózisú dipiridamol is - mely önmagában adagolva alig befolyásolta a KT sejtek szaporodását - képes volt a HuIFN-α gátló hatásának fokozására (4B ábra).

Mindkét sejtvonal celluláris morfológiai tulajdonc

-5HU 200942 Β ságai nyilvánvalóan romlottak a kombinációs kezelést követően (6. és 7. ábra).

A dipiridamol vérkoncentrációja az adagolását követő néhány óra folyamán néhány mikromol. A találmány feltalálói szerint azonban a HuIFN hatékonyságát szinergetikus módon fokozó hatásos koncentráció ennél jóval kisebb, azaz kisebb 0,1 μΜ-nál (3B, 4B és 5B ábra). A 3A, 4B és 5B ábrákon látható eredmények alapján nyilvánvaló, hogy még igen alacsony HuIFN-koncentrációk (10 egység/ml-nél alacsonyabbak) is kifejezett anticelluláris hatást fejtenek ki, még abban az esetben is, ha alacsony koncentrációjú dipiridamollal kombinálva alkalmazzuk őket. A dipiridamol tehát még a HuIFN dózisának csökkentését is lehetővé teheti a daganatok kezelése folyamán.

A különböző sejttípusok IFN-érzékenysége eltérő (Strander et al., Adv. Cancer Rés., Academic Press, London, 46,1986; Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, Wien/New-York, 1981; Yarosh et al., Carcinogenesis, 6, 883-886, 1985), pozitív korreláció figyelhető meg azonban a kezelt sejtek túlélési képessége és a DNS-szintézis mértéke között (Suzuki et al., J. Gén. Virol., 67:651-661, 1986). A NDS-szintézis mértékének megállapítása hasznos módszernek bizonyult az IFN-érzékenység meghatározására, és nem igényel hosszabb időt, mint az ehelyütt alkalmazott sejt-proliferáció gátlási teszt. Ily módon, a megfigyelt szinergetikus hatást a DNS-szintézis mértékével is bizonyíthatjuk a KI és az RSa sejtekben, melyek közismertek igen érzékenyek a HuIFN-ra (Suzuki et al., J. Gén. Virol., 67: 651-661,1986).

A DNS-szintézist a KT sejtekben a HuIFN-gátolta, és e gátló hatást 0,1 μΜ dipiridamol jelentősen fokozta, amint az a 8. ábrán látható.

Az itt közölt eredmények az elsők azok között, amelyek a dipiridamolnak a HuIFN anticelluláris hatására gyakorolt meglepő befolyását mutatják. Amint arról már az előzőekben említést tettünk, a mopidamol - egy dipiridamolszármazék - szinergetikus hatásáról a HuIFN daganatellenes hatékonyságát illetően egyszer már jelent meg közlemény, a továbbiakban azonban már arról számoltak be a cikkek, hogy szinergizmus nem volt megfigyelhető. A találmány feltalálói által végzett összehasonlító vizsgálat folyamán a 0,1 μΜ dipiridamollal vagy mopídamollal kezelt sejtek DNS-szintézisének aktivitását e kezelés kevésbé gátolta, mint a HuIFN-a-val végzett kombinált kezelés. Amint azt az 1. táblázat mutatja, amikor 1 NE/ml HuIFN-aval kombináljuk a szert, a DNS-szintézis még nagyobb mértékben bizonyult hatékonyabbnak, mint a mopidamol/HuIFN-α kombináció.

1. táblázat. A DNS-szintézisre gyakorolt gátló hatás összehasonlítása dipiridamol és mopidamol esetében (a kontroll értéke %-a)⁺

Hatóanyagok (0,1 μΜ)	HulFN-a 0	(cgység/ml) 1
Nem kezelt	100	91
Dipiridamol	92	61
Mopidamol	95	84

⁺Logaritmikusán növekvő számú RSa sejteket a fenti hatóanyagokkal kezeltünk, illetve nem kezeltünk, 24 órán keresztül, majd ezt kővetően [³H] dTHD-vel jelöltük őket, a J. Gén. Virol., 67: 651661,1986. leírásának megfelelően.

Galabov és munkatársainak csoportja - a fent említetteknek megfelelően - arról számolt be, hogy a dipiridamol IFN-képződést váltott ki. A találmány feltalálóinak véleménye szerint azonban nem volt mérhető antivirális aktivitási szint a 0,1 μΜ dipiridamollal kezelt sejtek tenyésztő közegében. A kísérleti körülmények megfeleltek a J. Gén. Virol., 67:651-661,1986. közleményben leírtaknak.

1. példa mg rHuIFN-*y-t tartalmazó liofilizált készít-

mény
(1) rHuIFN-y	2 mg/ml (2xl0⁶ NE)
(2) szérum-albumin (humán)	10,000 mg/ml
(3) NaCl	1,750 mg/ml
(4) mannitor	40,000 mg/ml
(5) poli-oxi-etilén (20)
szorbitán-monooleát	0,300 mg/ml
(6) borostyánkősav	2,36 mg/ml
(7) IN NaOH	36,26 mg/ml
(8) aqua dest.pro inj.	1,00 ml

Elkészítés

A sókat és egyéb adalékanyagokat ¢2)-(7) az összes szükséges vízmennyiség 2/3 részében feloldottuk. Ezután hozzáadtuk a pontosan meghatározott mennyiségű HuIFN-y-t, majd az oldatot - a megmaradt víz hozzáadásával - a kívánt végső térfogatra egészítettük ki. Ezt követően az oldatot 0,22 μΜ-os szűrőn bocsátottuk keresztül, majd ampullákba töltöttük, líofilizáltuk, és lezártuk az ampullákat.

2. példa

0,03 mg rHuIFN-ooc-t tartalmazó liofilizált ké-

szítmény
(1) rHuIFN-aac	0,03 mg (3x10° NE)
(2) izotoniás foszfát-pulTer
pH = 7	q.s.
(3) humán szérum-albumin	20,0 mg
(4) aqua dest. pro inj.	1,0 ml

Elkészítés

A készítmény előállítása az 1. példával leírtakkal azonos módon történik.

3. példa lxlO⁶ NE HuIFN-β-ί tartalmazó liofilizált ké-

szítmény
(1) rHuIFN-β	1x10⁶NE
(2) izotoniás foszfát-puffer
pH = 7	q.s.
(3) humán szérum-albumin	20,0 mg
(4) aqua dest. pro inj.	1,0 ml

Elkészítés

A készítmény előállítása az 1. példában leírtakkal azonos módon történik.

-6HU 200942 Β

4.p lxll

- 3x10® NE rHuIFN-oű-t tartalmazó lioft-

lizált készítmény
(1) rHuIFN-cc	1x10®-3x10® NE
(2) κα	0,2 mg
(3) Na₂HPO4.12H₂O	2,88 mg
(4)ΚΗ₂ΡΟ₄	0,2 mg
(5) NaCl	8,0 mg
(6) humán szérum-albumin	20,0 mg
(7) aqua dest. pro inj.	1,0 ml

Elkészítés

A puffer-anyagokat (2),(3),(4), a stabilizálószert (6), a nátrium-kloridot (5) és az aktív hatóanyagot (1) a vízben (7) feloldottuk. Steril szűrést követően az oldatot - steril körülmények között - ampullákba töltöttük, majd gyorshűtéssel szárítottuk.

5. példa

1-3x10® NE rHuIFN-β-ί tartalmazó liofilizált készítmény

Az eljárás végén nyert keveréket ezután drazsékká préseltük.

Mag súlya 80 mg

Az ily módon előállított drazsé-magokat az ismert módon felületi bevonattal láttuk el. Ez a bevonat lényegében cukorból és talkumből áll, s tartalmazhat esetleg engedélyezett színezőanyagokat is. Az elkészült drazsékat viasszal fényezzük.

Drazsé súlya 120 mg & példa mg dipiridamolt tartalmazó ampulla mg 4 mg

100 mg

q.s. (~ 0,018 ml) 2 ml dipiridamol borkősav poli-etilén-glikol sósav (IN) a pH 2,7-re történő beállításához aqua dest. pro inj.

A dipiridamolt és a többi összetevőt vízben feloldjuk. Steril szűrést követően az oldatot ampullákba töltjük, majd hevítéssel sterilizáljuk.

(1) rHuIFN-β	l-3xlO®NE
(2) KC1	0,2 mg 25
(3) N_a2HPO4.12H₂O	2,88 mg
(4) KH₂PO₄	0,2 mg
(5) NaCl	8,0 mg
(6) humán szérum-albumin	20,0 mg
(7) aqua dest. pro inj.	1,0 ml 30

Elkészítés

A készítményt a 4. példában leírtakkal azonos módon állítottuk elő.

6. példa lxl0®-3xl0® NE rHuIFN-y-t tartalmazó liofili-

zált készítmény
(1) IFN-y	lxl0®-3xl0® NE
(2) N_a2HPO4.12H₂O	231 mg
(3) NaH₂PO4-2H₂O	0,55 mg
(4) humán szérum-albumin	1,0 ml

Elkészítés

A készítményt a 4. példában leírtakkal azonos 45 módon állítottuk elő.

7. példa mg dipiridamolt tartalmazó drazsé Összetétel

(1) dipiridamol	30 mg
(2) tejsav	30 mg
(3) bugonyakeményítő	17,5 mg
(4) Aerosil	1,5 mg
(5) magnézium-sztearát	1,0 mg

Az (l)-es, (2)-es és a (3)-as összetevőt összekevertük, majd a keverékhez vizet adtunk, nedves massza előállítása céljából.

A nedves masszát 1,66 mm-es nyílásokkal ellá- 60 tott szűrőn juttattuk keresztük, majd 45 °C hőmérsékleten, szárítókamrában szárítottuk. A száraz szemcséket (granulákat) ezt követően 1 mm-es nyílásokkal ellátott szűrőn juttattuk keresztül, majd összekevertük a (4)-es és az (5)-ös összetevőkkel. 65

9. példa

Az 1-6. példák alapján előállított készítményt ampullás injektációs készítménnyé oly módon alakítjuk át, hogy desztillált vizet vagy izotóniás só-oldatot használunk fel annak érdekében, hogy 2 ml injekciós oldatot nyerjünk.

10. példa

Dipiridamolt és HuIFN-t tartalmazó kombinációs készítmény

Az 1-6. példák alapján előállított készítményt tartalmazó ampullák tartalmát a 8. példa szerint készített ampulla dipiridamoltartalmával kiegészítjük.

a HuIFNoű és az IFN-β dipiridamollal alkotott kombinációs készítménye szobahőmérsékelten körülbelül 6 órán keresztül stabil marad. A HuIFNy/dipiridamol-készítményt a liofilizált készítménynek az oldattal végzett kiegészítését követően azonnal fel kell használni.

11. példa

Késleltetett hatóanyagleadású dipiridamol-készítményeket tartalmazó kapszulák kg mennyiségű, borkősavból álló, gömbölyített kiindulási szemcsére - speciális üstben - olyan oldatot permeteztünk, mely izopropanolt, dipiridamolt és polivinil-pirrolidont tartalmaz, mindaddig, amíg a keletkező aktív hatóanyag-szemcsék körülbel 45 tömeg%-nyi dipiridamolt nem tartalmaznak.

A szemcséket ezt követően lakkal permetezzük be, mely 85:15 és 50:50 közötti tömegarányban metakril-sav/metil-metakrilát kopolimert (gyári nevén Eudragit S-et), valamint hidroxi-propil-metil-cellulóz-ftalátot (gyári nevén HP 55-öt) tartalmaz.

A szerves lakkoldat tartalmaz a fentieken kívül valamilyen lágyítószert és talkumot is. A szemcséket kétféle, 5 vagy 7%-os bevonattal permetezzük be, a lakk-összetevőket - a megadott határokon belül - különböző arányban alkalmazva, majd a különböző szemcséket összekeverjük.

20-25 mg dipiridamolnak megfelelő szemcse7

-7HU 200942 Β mennyiséget megfelelő méretű kapszulákba csomagolunk, speciális, kapszulákat előállító gép segítségével.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1, Eljárás 2,6-bisz(dietanol-amino-4,8-dipiperidino-pirimido[5.4-d]pirimidint (dipiridamol)t vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított 2,6-bisz(dietanol-amÍno)-4,8-dipiperidinopirimido[5,4]pirimidint vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját a gyógyszerkészítésben szokásos segédanyagokkal együtt interferon daganatellenes hatását fokozó gyógyszerkészítménnyé dolgozzuk fel.
5 2. Eljárás interferont és 2,6-bisz(dietanol-amino)-4,8-dipiperidino-pirimido[5,4-d]pirimidint vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazó, daganatellenes hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy interferont és
10 2,6-bisz(dietanol-amino)-4,8-dipiperidino-pirimi do[5,4-d]pirimidint vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját 10-10' NE:10-100 mg arányban összekeverve gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.