HU200367B

HU200367B - Process for producing indanomycin and homoindanomycin

Info

Publication number: HU200367B
Application number: HU219788A
Authority: HU
Inventors: Piroska Toth; Valeria Szell; Istvan Koczka; Gyula Horvath; Istvan M Szabo; Marta Szayly; Gabor Ambrus; Julianna Bedoe
Original assignee: Gyogyszerkutato Intezet
Priority date: 1988-04-29
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1990-05-28
Also published as: HUT49909A

Description

A találmány tárgya eljárás az la képletű indanomicin - ahol Rí jelentése metilcsoport - és az lb képietú új homoindanomicin - ahol Rí jelentése etilcsoport - antibiotikum előállítására aerob fermentációval, amely abban áll, hogy a Streptomyces galbus sugárgomba faj NCAIM B(P) 001036 számon letétbe helyezett új törzsét vagy annak valamely - indanomicint és/vagy homoindanomicint termelő - mutánsát vagy variánsát szerves nitrogén és szénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon 24 és 32 *C közötti hőmérsékleten tenyésztik, majd a bioszintetizált antibiotikumokat a tenyészetből elkülönítik és kívánt esetben egymástól elválasztják

A leírás terjedelme: 12 oldal, 2. ábra

la - lb

N (0 <0 o

o

CM

HU 200367 Β

A találmány tárgya, eljárás indanomicin és homoindanomicin előállítására aerob fermentációval.

Állatgyógyászatban és állattenyésztésben hsznosítható új antibiotikumok felismerésére irányuló kutatási programunk keretében egy Magyarországon begyűjtött talajmintából izoláltuk a 83-394 jelű, Actinomycetales rendbe tartozó mikroorganizmust, mely két, Grampozitív baktériumok szaporodását alacsony töménységben jelentősen gátló, ionofór tulajdonságú antibiotikumot bioszintetizál. Ezek közül az egyik antibiotikum a szerkezetvizsgálat során azonosnak bizonyult a már korábban feltalált indanomicinnel (857 513 sz. belga szabadalom), mely kérődző haszonállatok tenyésztésénél takarmány kiegészítőként alkalmazva elősegíti a tápanyag hsznosítását. A másik antibiotikumot az indanomicinnel rokon szerkezetű és hasonló biológiai tulajdonságú új hatóanyagnak találtuk, és homoindanomicinnek neveztük el. Az indanomicint először Ch.-M. Liu és munkatársai izolálták [J. Antibiotics 32: 95,(1979)] a Streptomyces antibioticus mikroorganizmus tenyészetéből.

Az általunk izolált 83-394 jelű mikroorganizmust a rendszertani meghatározás során a Streptomyces 10 galbus fajjal azonosítottuk. E fajnak indanomicint termelő törzse eddig még nem volt ismeretes.

A 83-394 jelű Streptomyces törzs rendszertani vizsgálatának eredményeit az alábbiakban adjuk meg:

1. táblázat

A Streptomyces sp. 83-394 jelű törzs összehasonlítása autentikus Streptomyces galbus törzsekkel

Vizsgált tulajdonság	Streptomyces galbus (ISP 5089)+	Streptomyces galbus (ISP 5480)++	Streptomyces sp. 83-394
Spóra-lánc morfológia	Retinaculiaperti	Spiráles	Retinaculiaperti
Spórák száma lánconként	>50	>50	>50
Spórafelszín (elektr.opt.)	sima	sima	sima
Spóratömeg szín-sorozat	szürke	szürke	szürke
Szubsztrátmicélium szín-sorozat	sárgás-barna	sárgás-barna	sárgás-barna
Melanoid pigment pepton-élesztőkivonat- -vas-agar	pozitív	pozitív	pozitív
Tirozin-agar	negatív	gyengén pozitív	negatív
Oldódó pigment	sárga	sárgás v. sárgászöld	sárga
Szubsztrátmicélium indikátor-karaktere	negatív	negatív	negatív
Oldódó pigment indikátor-karaktere Szénforrás értékesítés	negatív	negatív	negatív
D-glükóz	pozitív	pozitív	pozitív
L-arabinóz	pozitív	kérdéses	kérdéses
D-xilóz	pozitív	pozitív	pozitív
i-inozit	pozitív	pozitív	pozitív
D-mannit	pozitív	pozitív	pozitív
D-fruktóz	pozitív	pozitív	pozitív
Szacharóz	negatív	negatív	negatív
Rammóz	negatív	negatív	gyengén pozitív
Raffinóz	negatív	kérdéses	negatív

+= W.Frommer: Archív für Mikrobiologie 32, 187 (1959), ⁺⁺= M. Murase és munkatársai: J. Antibiotics, Ser. A. 12, 126 (1959).

HU 200367 Β

Mikromorfológia: A spóratartók morfológiája azonos a Streptomyces galbus típus törzsekével: különböző tápagar közegeken, variálva laza vagy tömött,

3-8 kanyarulatú spirál vagy retinaculum-apertum típusú spóraláncok képződnek, melyekben általában több mint 50 spóra helyezkedik el. A spórák nem omamentáltak és hatezerszeres nagyításnál sima felületű spóraburokról tanúskodnak.

A törzs ISP-táplalajokon erőteljesen fejlett, sárgásbarna telepeket fejleszt, amelyeket porszem, hamuszürke spóratömeg borít.

A szubsztrát micélium színe nem indikátorkarakterű, és az esetenként termelt világossárga oldódó pigment sem az. A törzs pepton-élesztőkivonat-vas agráron melanoid pigmentet termel, míg tirozin agaron nem képez pigmentet.

Az 1. táblázatban a 83-394 jelű Streptomyces törzs rendszertani tulajdonságait összehasonítottuk a korábban leírt Streptomyces galbus törzsek rendszertani jellemzőivel.

A fenti rendszertani vizsgálatok adatai szerint a törzs a Streptomyces galbus faj tipikus alakja.

A 83-394 jelű Streptomyces galbus törzset 1988. január 20-án letétbe helyeztük Budapesten a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében, ahol az NCAIM B(P) 001036 letéti számot kapta.

A fentiek alapján a találmány eljárás az la képletű indanomicin - ahol Rí jelentése metilcsoport - és az Ib képletű homoindanomicin - ahol Rí jelentése etilcsoport - antibiotikumok előáll Ittasára aerob fermentációval, amely abban áll, hogy a Streptomyces galbus sugárgomba faj NCAIM B(P) 001036 számon letétbe helyezett törzsét vagy annak valamely - indanomicint és/vagy homoindanomicint termelő - mutánsát vagy variánsát szerves nitrogén és szénfonást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon 24 és 32 °C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a bioszintetizált antibiotikumokat a tenyészetből elkülönítjük és a kívánt esetben egymástól elválasztjuk.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott Streptomyces galbus törzs tenyésztésére a sugárgombák tenyésztésére szolgáló általánosan ismert módszereket használhatjuk.

Az indanomicin és homoindanomicin antibiotikumokat bioszintetizáló 83-394 jelű treptomyces galbus törzs tenyésztésénél szénforrásként glükóz, keményítő és növényi olajok, nitrogénforrásként szójaliszt, kukoricalekvár, illetve kazein, szervetlen sóként NaCl, K2HPO4 és CaCO₃ alkalmazható előnyösen.

A törzset célszerűen élesztőkivonat-keményítő agaron tartjuk fenn. Ezen a táptalajon a törzs megőrzi termelőképességét háromhavonkénti átoltás esetén.

A törzs süllyesztett tenyészetben, 24-32 ’C közötti hőmérsékleten jó növekedést mutat, az antibiotikum bioszintézis szempontjából előnyös a tenésztést 26-30 ’C között végezni.

A savas jellegű, erősen lipofil indanomicin és homoindanomicin a fermentlé pH 4,0-4,5-en történő szűrésénél nagyrészt a mikroorganizmus sejtjeihez kötődik és a sejtekről extrakciós módszerekkel nyerhető ki. A szűréskor kapott nedves micéliumról az antibiotikumok előnyösen vízzel elegyedő neutrális, szerves oldószerekkel, pl. alkoholokkal (metilalkohol, etilalkohol, butanol), illetve acetonnal oldhatók le.

Az így kapott kivonatot csökkentett nyomáson bepárolva vizes maradékhoz jutunk, melyből vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel, előnyösen etilacetáttal extrahálhatjuk az antibiotikumokat. Az etilacetátos extraktum vákuumban történő bepárlásával kapjuk a nyersterméket. Az antibiotikum-komplex tisztítására és komponenseinek egymástól való elvásztasztására oszlop és vékonyréteg-kromatográfiás módszereket alkalmazhatunk.

A tisztításnál különösen előnyösen a szilikagél oszlopkromatográfia, eluensként n-hexán-kloroform elegyet, majd kloroformot, végül kloroform-metanol elegyet alkalmazva.

Az indanomicin és a homoindanomicin előnyösen elválasztható preparatív vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel is, szilikagél G adszorbenst és etilacetátkloroform-metanol (2:1:0,15) arányú oldószerelegyet használva kifejlesztőszerként.

Az izolált antibiotikumok szerkezetét az alábbi módon igazoltuk. Az indanomicin fizikai állandói (olvadáspont, optikai forgatóképesség), elemi analízise, valamint spektroszkópiai adatai: ultraibolya-, infravörös-, ’H-NMR-, ’³C-NMR és tömegspektrumai egyeztek a szakirodalomban közöltekkel.

A homoindanomicin szerkezetét tömegspektroszkópiai vizsgálatokkal állapítottuk meg. Összehasonlítottuk az indadomicinnek, a homoindanomicinnek, valamint diazometánnal végzett észterezéssel előállított metilésztereiknek elektron bombázás hatására végbemenő fragmentációját. A vizsgált 4 vegyület töredezést mechanizmusát az 1. ábra és 2. táblázat mutatja.

Az a, b, c, d, e töredék-ionok összevetésével és nagyfelbontású tömegmérésekkel megállapítottuk, hogy a homoindanomicin és az indanomocin rokonszerkezetű vegyűletek, melyek abban különböznek egymástól, hogy a kettes helyzetűszénatomhoz az indanomicin esetében metilcsoport, a homoindanomicin esetében pedig etilcsoport kapcsolódik. A tömegspektroszkópiai vizsgálatok alapján meghatározott szerkezettel összhangban van a homoindanomicin ultraibolya, infravörös, ’H-NMR és ’³C-NMR spektruma. A feltételezett szerkezetet proton- proton korrelációs NMR-vizsgálatokkal is alátámasztottuk.

A homoindanomicin és az indanomicin biológiai hatásainak vizsgálatára végzett kísérleteink eredményeit az alábbiakban foglaltuk össze.

A homoindanomicin és indanomicin biológiai hatékonysága igen hasonló. A homoindanomicin antibakteriális hatásspektruma egyező az indanomicinével, azaz a Gram szerint pozitívan festődő baktériumok szaporodását igen alacsony koncentrációban meggátolja, de a Gram szerint negatívan festődő baktériumok, továbbá élesztőgombák szaporodására gyakorlatilag hatástalan. A lét antibiotikum antibakteriális spektrumát a 3. táblázat mutatja.

A homoindanomicin és az indanomicin ugyanolyan mértékben gátolja a különböző, más típusú hatóanyagok hatásával szemben rezisztens Gram szerint pozitívan festődő mikroorganizmusok szaporodását, mint az érzékenyekét, mert a MIC értékek azonosak más antibiotikumokra és kemoterápiás szerekre érzékeny vagy rezisztens törzsekre egyaránt.

HU 200367 Β

2. táblázat

Az indanomicin és metilészterének tömegspektroszkópiai vizsgálata

Vegyület neve Képletben levő Töredékionok:

szubsztituensek

	M	a	b	c	d	e
indanomicin	(Ri=CH₃	R2=H)	493	464	420	399	251	94
indanomicin-metilészter	(Rl=CH₃	R2=CH₃)	507	478	420	413	265	94
homoindanomicin	(Ri=CH₂CH₃	R2=H)	507	478	420	413	265	94
homoindanomicin- -metilészter	(Rl=CH₂CH₃	r₂=ch₃)	521	492	420	427	279	94

3. táblázat

A homoindanomicin és indanomicin antibakteriális spektruma Módszer: Makrodilúciós eljárás, 3 ml táptalaj (Penassay Broth, BACTO B-243, Difco Laboratories Inc.,

Detroit, USA), 24^h inkubációs idő, leolvasás szabad szemmel.

MIC⁺ mg/1

Homoindanomicin

Tesztorganizmusok

Indanomicin

Bacillus subtilis ATCC 6633	0,03	0,03
Staphylococcus aureus SMITH,	0,06	0,06
béta-Iaktamáz -
Staphylococcus aureus 1110++,	0,06	0,06
béta-laktamáz +
Streptococcus faecalis	0,03	0,03
Streptococcus pneumoniae	2,5	6,2
Streptococcus pyogenes A 118	2,5	2,5
Streptococcus pyogenes A 115	1,25 ·	6,2
Clostridium perfringens 70500	-	0,04
Mycoplasma pneumoniae	-	25,0
Acinetobacter anitratus	>100	>100
Alcaligenes faecalis 14001	>100	>100
Bordetella bronchiseptica ATCC 4617	>100	>100
Escherichia coli K12 béta-laktamáz -	>100	>100
Escherichia coli 6R béta-laktamáz +	>100	>100
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031	>100	>100
Proteus inconstans NCTC 8055	>100	>100
Pseudomonas pyogenes NCTC 10490	>100	>100
Salmonella typhimurium	>100	>100
Serratia marcescens	>100	>100
Candida albicans	>100	>100
'MIC = legkisebb gátló töménység,
= rezisztens penicillin-G, sztreptomicin, eritromicin,	oxitetraciklin hatásával	szemben.
Az indanomicin és homoindanomicin hatékonysá-	lehet megfigyelni. A 4.	táblázatban az antibakteriális

gának mértéke jelentősen függ a baktériumok tenyésztésére használt tápfolyadék hidrogén-ion koncentrációjától, és a legnagyobb baktériumellenes hatást enyhén lúgos (pH = 7,5 és pH = 8,0) közegben hatékonyság változást mutatjuk be a pH függvényében Bacillus subtilis 6633 indikátor törzset és agar-diffúziós mérési módszert használva.

4. táblázat

Homoindanomicin és indanomicin hatékonyságának változása a pH függvényében Módszer: Agar-diffúziós technika [Analytical Microbiology, Π. kötet 31. oldal, szerkeszti:

F. Kavanagh (1972) Academic. Press, New York].

Konc.		Gátolt zóna átmérő (mm)
mg/1	Indanomicin	Homoindanomicin
	pH = 8,0 pH = 7,0	pH = 6,5 pH = 8,0 pH = 7,0 pH	= 6,5
10	23,36 19,7	17,6 26,5 21,7	19,8

HU 200367 Β

Konc. Gátolt zóna átmérd (mm) mg/1 Indanomicin Homoindanomicin

	pH = 8,0	pH = 7,0	pH = 6,5	pH = 8,0	pH = 7,0	pH = 6,5
5	20,5	19,4	17,2	22,86	21,2	19,2
2,5	17,6 0*	17,66	16,1	19,2	19,0	18,2
1,25	15,2	14,5	0	15,4	16,1

* = nincs gátlásgyűrű

A vizsgált antibiotikumok melegvéníek sejtjeire kifejtett toxicitását a 5. táblázat tartalmazza.

5. táblázat

A homoindanomicin és indanomicin szövettoxicitásának vizsgálata

Módszer S. Horváth: Toxicology. 16: 59, (1980) Szövet: HeLa sejttenyészet

Vegyület CT₀ (mg/1)	CT50 (mg/1)
Homoindanomicin	0,5	2,0
Indanomicin	0,079	0,158

CT₀ = a hatóanyag olyan legnagyobb koncentrációja, amely a HeLa sejtekre még mérhető károsodást nem fejt ki.

CT50 = a hatóanyag olyan koncentrációja, amely a HeLa sejtek felén látható toxikus hatást okoz.

HeLa sejt = humán cervix-carcinoma laboratóriumi tenyészetben fenntartott sejtvonala.

A táblázatból kitűnik, hogy a homoindanomicin kevésbé szövettoxikus, mint az indanimicin.

Ames tesztben [D.M. Maron, B.N. Ames: mutation Research 113: YTi (1983)] sem az indanomicin, sem a homoindanomicin nem emeli a revertánsok számát jelentősen még 500 gg/lemez, azaz kb. 20 pg/ml töménységben sem. Ez a töménység hatástalan Gram negatív tesztorganizmusok szaporodására, de sokszorosa a melegvérű állatok sejtjeire toxikus koncentrációnak.

Az indanomicin és homoindanomicin akut toxicitását egerekben határoztuk meg. Az eredményeket az

5. táblázat tartalmazza.

6. táblázat

A homoindanomicin és indanomicin akut, egyszeri toxicitásának vizsgálata egerekben

Egerek: OFi (LATI, Budapest) fajtájú, 21-23 g-os hím egerek csoportonként 3 db.

Megfigyelés: 14 nap

Kiértékelés módja: grafikus

A homoindanomicin Tween 80-nal és fiziológiás sós vízzel készített szuszpenzióját vizsgáltuk, a hígításokat is fiziológiás sós vízzel készítettük.

Az indanomicint dimetilszulfoxidban oldottuk és fiziológiás töménységű sós vízzel hígítottuk. Az így keletkező szuszpenzióval végeztük az állatok kezelését.

A vegyület jele Adagolás módja LD50 mg/kg

Indanomicin	p.o. s.c. i.p.	110 42 23
Homoindanomicin	p.o.	60
	s.c.	-
	i.p.	40

_

Az indanomicin és a homoindanomicin, illetve a két antibiotikumot tartalmazó antibiotikum-komplex jól alkalmazható haszonállatok, főleg sertések és kérődzők takarmánykeigészítőjeként. Mivel nem szívó25 dik fel, hatását helyileg fejti ki, ezért az állatok szerveiben, izomzatában és szekrétumaiban maradék antibiotikum megjelenésére nem kell számítani. Az indanomicin és a homoindanomicin a hatás csökkenése nélkül kombinálhatok más takarmány-adalékok30 kai.

A találmány eljárást az alábbi kiviteli példákkal szemléltetik.

1. példa

Streptomyces galbus NCAIM 001036 sz. törzs élesztővelkivatot és keményítőt tartalmazó ferdeagaron növesztett tenyészetéről készített spóraszuszpenzióval 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml R-jelű, alábbi összetételű táptalajt oltunk:

Glükóz 3,0 % kazein-hidrolizátum (10 %-os oldat) 1,0% kukoricalekvár (50 % szárazanyag tartalom) 0,2 %

Napraforgóolaj 0,2 % nátrium-klorid 0,5 % kalcium-karbonát 0,5 % csapvízben.

Sterilezés előtt a táptalaj pH-ja 7,0-1(2. A táptalajt 121 ‘C-on, 25 percig sterilezzük.

A tenyésztést síkrázógépen (270 fordulat/perc, 3,5 cm kitérés) végezzük, 28 ‘C-on. A fermentáció során keletkező antibiotikumok mennyiségét mikrobiológiai 55 módszerrel, agar-diffüziós technikával mérjük [Analytical Microbiology, I. kötet: 87. oldal, szerkeszti: F. Kavanagh (1963) Academic, Press, New York], Bacillus subtilis ATCC 6633 tesztorganizmust és 8-as pH-jú agartáptalajt valamint indanomicin standardot 60 alkalmazva. A tenyésztés 96. órájában a fermentlében

180 mg/ml-es antibiotikum-koncentrációt mérünk.

2. példa

A Streptomyces galbus NCAIM 001036 sz. törzs 65 élesztőkivonatot és keményítőt tartalmazó ferdeagaron

HU 200367 Β növesztett tenyészetéről készített spóraszuszpenzióval 2 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100-10Ó ml 1. példában megadott összetételű, R-jelű táptalajt oltunk, majd a lombikokat síkrázógépen (270 fordulat/perc, 3,5 cm kitérés) 28 ”C-on rázatjuk 48 óráig. Ezután a két lombik tenyészetével 10 1-es üvegfermentorban 5 liter steril F-jelű táptalajt oltunk, melynek összetétele a következő:

Glükóz 2,0 % burgonya-keményítő 2,0 % szójaliszt 2,5 % kazein-hidrolizátum (10 %-os oldat) 2,0 % kukoricalekvár (50 % szárazanyag tartalom) 0,2 % napraforgóolaj 0,4 % kalcium-karbonát 0,5 % csapvízben.

A táptalaj pH-ját In nátrium-hidroxid oldattal 7,07,2-re állítjuk, majd 121 °C-on 1 órán át sterilezzük.

A fermentációt 28 ’C-on végezzük 300 liter/óra levegőztetés és 375 fordulat/perc kevertetés mellett Habzás esetén polipropilén- glikolt adagolunk. A fermentáció 120. órájában 550 mg/ml antibiotikum koncentrációt mérünk a fermentlében az 1. példában leírt módon.

Ezután a fermentlé pH-ját 4-es értékre állítjuk telített oxálsav oldattal, majd a fermentlét szűrjük. A szűrletet kétszer 500 ml etil-acetáttal extraháljuk és az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük.

A kiszűrt mikroorganizmus sejteket háromszor 1,5 liter metanollal kivonatoljuk, a metanolos kivonatokat egyesítjük és a metanolt csökkentett nyomáson, 50 ’C-on lepároljuk. A vizes maradék pH-ját telített oxálsavval 4-es értékre állítjuk, majd a megsavanyított oldatot kétszer 500 ml etil-acetáttal extraháljuk. A kapott etil- acetátos kivonatokat és a fermentlé szírletetének etil-acetátos extraktumát egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és vákuumban bepároljuk. A kapott olajos bepárlási maradékot 100 ml n-hexánnal eldörzsöljük, és hidegen egy napig állni hagyjuk. Ezután a kivált csapadékot leszűrjük, így

4,1 g nyersterméket kapunk.

A kapott nyersterméket 200 g Kieselgel (szemcseátmérő: 0,05-0,2 mm, Reanal, Budapest) adszorbenst tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. Az elúciót 1,5 liter n-hexán-kloroform (1:1) eleggyel, majd 1,0 liter kloroformmal, végül 1,5 liter kloroformmetanol (1:1) eleggyel végezzük. Az oszlopkromatográfiás frakciók antibiotikum tartalmát vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel analizáljuk [adszorbens: szilikagél G (Reanal, Budapest), kifejlesztő elegy: etil-acetátkloroform-metanol (2:1:0,3) elegy, előhívás foszformolibdénsav reagenssel]. Az oszlopról n-hexán- kloroform (1:1) eleggyel először homoindanomicin, majd homo-indanomicin és indanomicin keveréke oldódik le, s végül kloroform, illetve kloroform-metanol (1:1) eleggyel az indanomicin. A megfelelő frakciókat vákuumban bepárolva 475 mg homoindadomicint, 1,3 g indanomicint és 430 mg homoindanomicinből és indanomicinből álló keveréket kapunk.

A keveréket preparatív rétegkromatográfiás módszerrel választjuk szét, szilikagél G adszorbenst és 6 az oszlopkromatográfiás frakciók vizsgálatánál alkalmazott kifejlesztő elegyet használva. így további 80 mg homoindanomicint és 202 mg indanomicint kapunk.

A kromatográfiásan tiszta antibiotikumokat diklórmetánban oldjuk, az oldatot 2n sósav oldattal, majd vízzel mossuk, végül szántjuk és vákuumban bepároljuk. Az így tisztán sav formában kapott antibiotikumokat acetonitrilből krisztályosítjuk át.

A homoindanomicin fizikai és spektroszkópiai adatai:

Op.: 84-87 ’C

Optikai forgatóképesség:[a]D²⁰ = -360’ (c=0,5, CHCb)

Elemanalízis: C: Η: N: számított: 75,6 % 8,48 % 2,76 % talált: 74,2 % 9,1 % 2,85 %

Ultraibolya színkép (metanol): X_max nm (Ei_cm ^1%):

245 (610), 252 váll (599), 291 (325).

Infravörös spektrum, jellemző sávok (KBr, cm-i): 3245, 2965, 2935, 1710, 1635, 1410.

’H-NMR spektrum, jellemző jelek (CDCb δ, ppm):

2,84 (H-2), 4,17 (H-3), 4,38 (H-7), 5,4-6,0 (H-9, 10, 11, 12, 13, 14), 6,87 (H-23), 6,25 (H-24), 7,04 (H-25), 0,93 (H-27, 32), 0,69 (H- 29), 0,79 (H-30). ⁱ³C-NMR spektrum (CDG3, δ, ppm): 179,5 (C-l),

49.3 (DEPT:CH) (C-2), 73,3 (C-3), 22,8 (C-4), 26,1 (C-5), 29,1 (DEPT:CH) (C-6), 76,0 (C-7), 140,0 (C-8), 122,4 (C-9), 126,5 (C- 10), 132,5 (C-l 1), 46,4 (C-12), 129,4 (C-13, C-14), 49,7 (C-15), 43,6 (C-16),

29.6 (C-17), 26,9 (C-18), 40,9 (C-19), 52,9 (C-20),

191.6 (C-21), 132,9 (C-22), 116,7 (C-23), 109,8 (C-24), 125,5 (C- 25), 27,4 (C-26), 12,5 (C-27), 22,6 (C-28), 13,0 (C-29), 12,2 (C- 30), 22,7 (DEPT:CH2) (C-31), 12,5 (DEPT:CH3) (C-32).

Tömegspektrum

Molekulatömeg: 507

Jellemző ionok: m/z (R.I.%): 507 (37), 478 (7), 420 (3), 413 (5), 265 (56), 94 (100).

Az indanomicin fizikai és spektroszkópiai adatai:

Op.: 146-149 ’C

Optikai forgatóképesség:[a]D²⁰= -338' (c=l;

CHCb)

Elemanalízis: C: Η: N: számított: 75,42 % 8,78 % 2,84 % talált: 75,45 % 8,97 % 2,61 %

Ultraibolya színkép (metanol): Xmax nm (Eicm^1%):

243 (691), 249 váll (677), 289 (340).

Infravörös spektrum, jellemző sávok (KBr, cm^-1): 3240, 2965, 2940, 1710, 1625, 1410, 1215, 760.

’H-NMR spektrum, jellemző jelek (CDCb, δ, ppm): 2,85 (H-2), 3,90 (H-3), 4,20 (H-7), 5,2-6,0 (H-9, 10, 11, 13, 14), 6,95 (H-23, 25), 6,25 (H-24), 0,95 (H-27), 0,75 (H-29), 0,85 (H- 30), 1,15 (H-31, d, J = 6,5 Hz).

’³C-NMR spektrum (CDQ3, δ, ppm): 179,4 (C-l),

41.4 (C-2), 75,0 (C-3), 22,1 (C-4), 26,5 (C-5), 30,6 (C-6), 74,8 (C- 7), 140,7 (C-8), 124,6 (C-9), 127,4 (C-10), 132,6 (C-ll), 45,5 (C-12), 129,6 (C-13, 14), 50,0 (C-15), 43,8 (C-16), 29,7 (C-17), 27,2 (C-18), 40,7 (C-19), 52,7 (C-20), 192,0 (C-21), 132,6 (C22), 116,3 (C-23), 110,4 (C-24), 125,6 (C-25), 27,4 (C-26), 12,6 (C-27), 22,1 (C-28), 13,6 (C-29, 30), 14,0 (C-31).

Tömegspektrum

HU 200367 Β

Molekulatömeg: 493

Jellemző ionok: m/z (R.I.%): 493 (44), 464 (7), 420 (5), 399 (7), 251 (78), 94 (100).

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Eljárás az la képletú indanomicin - ahol Rí jelentése metilcsoport - és az Ib képletű homoindanomicin - ahol Rí jelentése etilcsoport antibiotikumok előállítása aerob fermentációval, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces galbus sugárgomba faj NCAIM B(P) 001036 számon letétbe helyezett törzsét vagy annak valamely - indanomicint és/vagy homoindanomicint termelő - mutánsát vagy variánsát szerves nitrogén és szénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon 24 és 32 ’C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a bioszintetizált antibiotikumokat a tenyészetből elkülönítjük és kívánt esetben egymástól elválasztjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemve, hogy a fermentálást süllyesztett tenyészetben, 26 és 30 ’C közötti hőmérsékleten végezzük.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal 5 jellemezve, hogy szénforrásként glükózt, keményítőt és/vagy növényi olajokat, nitrogénforrásként szójalisztet, kukoricalekvárt és/vagy kazeint; szervetlen sóként nátrium-kloridot, dikáliumhidrogénfoszfátot és/vagy kalciumkarbonátot alkalmazunk.

10 4. Eljárás állattakarmányozási célokat szolgáló készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az

1. igénypont szerinti eljárással előállított homoindanomicint vagy indanomicin-homoindanomicin keveréket önmagukban vagy egyéb, az állatte15 nyésztésben és takarmányozásban szokásos vivőanyagokkal, hígító- és/vagy tartósítószerekkel, valamint tápanyagokkal együtt, orális készítménnyé alakítjuk.

-72/1

HU 200367 Β l α — Ib