HU195837B - Eljárás daunorubicin-hcdrogén'-klorid kinye résére fermentléböl - Google Patents

Abstract

Eljárás gyógyászati célra alkalmas tisztaságú daunorubicin-bidrogén-klorid fermenlléből történő kinyerésére vízzel nem elegyedő oldószerrel végzett extrakció, az extraktum bepárlása, a nyerstermék leválasztása és annak kromatográfiás tisztítása útján. A kromatográfiás tisztítást szilikagél adszorbenst tartalmazó oszlopon, hangyasav

Description

A találmány tárgya javított eljárás a daunorubicin -hidrokloridnak fernienlléből történő kinyerésére és tisztítására folyadék oxtrakció és oszlop-kromatográfia kombinált alkalmazásával.

Mint ismeretes a daunorubicint - az első, klinikai gyakorlatban ie ' alkalmazott, antraciklin típusú, rákellenes antibiotikumot - a Streptomycee genushoz tartozó mikroorganizmusok fermentlevéből az 1960-as évek közepén izolálták először egymástól függetlenül olasz, francia és szovjet kutatók (639.897 sz. és 632.391 sz. belga szabadalmi leírások, Anlibiotiki, 1Γ,763 /1966/).

A mai napig ismertté vált izolációs és tisztítási eljárások - mivel a daunorubicint termelő törzsek a fermentáció során a daunoroubicinhez kémiailag hasonló vegyűletek egész sorát termelik - rendkívül bonyolultak és költségesek. A tiszta anyagot általában többszöri, különböző szerves oldószerekkel, végzett extrakcióval, vagy az extrakciós és szorpcióe módszerek kombinálásával nyerik ki. Biotechnology of Induslriall Antibiotics, Ed. van Damine E.J., Marcel Dekker, New York (1984) pp. 569-594; Advances in Biotechnological Processes, Vol. 3, Ed. A. Mizrahi - Al. van Wezel, Alán R. Láss. Inc., New York /1984/ pp. 141-61.

Így pl· a 639.897 sz. belga szabadalmi leírás szerint a fermentlevet szűrési segédanyag jelenlétében szűrték. A daunorubicin nyersterméket, amely még erősen szennyezett volt, külön-külön vonták ki a szűrési segédanyaggal kevert micéliumból és a szűrt fermenlléből, több lépésben végzett n-bulanolos és kloroformos extrakcióval. A nyerstermék tisztítását n-butanol-foszfátpuffer rendszerben, ellenáramú extrakcióval végezték. A kitermelés a fermenlló hatóanyagára számítva 21% volt.

Egy továbbfejlesztett extrakciós oljárás szorint (Procsss Biocbem., 14 /1979/ 6-11) a fermentlevet n-butanollal kevertették és szűrték. A szűrlotel szétválasztották és a butanolos fázist bepárolták. A sűrítményhez n-hoxánt adtak és savas vízzel extraháltak. A daunorubicint tartalmazó vizes fázist acoLon-Loluol eleggyel mosták és n-butanollal csapták ki a nyers daunorubicin-hidrogéri-klorid-ol, molyból metanol-etanol-kloroform oldószerolegyből végzett álkristályosításBal kapták u tiszta terméket.

A szorpcióvai kombinált extrakciós módszerek adszorbenskónl alkalmazlak az Amberlite IRC-50, gyengén savas, kationcserélő gyantát (1.551.195 sz. francia szabadalmi leírás), kalionceerélő gyantái és aluminium-oxidol (632.391 sz. belga szabadalmi leírás), kationcserélő gyantái és szilikagélt (Fólia Microbiol., 22 275-285 /1977/).

Az ismert eljárások nagy hátránya a sokfajta ós nagymennyiségű Bzorves oldószer alkalmazása és az alacsony kitermelési hatásfok. A szerves oldószerekkel végzett munka, azon túl, hogy rendkívül költségessé teszi ezeket az eljárásokat, fokozott egészségvédelmi intézkedéseket is megkövetel, ami további költségnöveló tényező..

Ismeretes, hogy a daunorubicin maga is karcinogén és kardiotoxikus, így ez is szükségessé teszi a fokozott egészségvédelmi intézkedéseket, melyek annál nehezebben oldhatók meg, minél bonyolultabb, minél több lépésből áll egy kinyerési, tisztítási technológia.

Találmányunk célja, a daunorubicint tartalmazó fermentléböl kiindulva, olyan kinyerési, tisztítási eljárás kidolgozása volt, amely a megfelelően tiszta késztermék előállítását az eddig ismert eljárásoknál egyszerűbben és gazdaságosabban valósítja meg.

Λ daunorubicint tartalmazó fermentlével végzett izolációs és tisztítási kísérleteink során arra a felismerésre jutottunk, hogy a tisztítási lépések száma jelentősen csökkenthető egy olyan oszlopkroinatográfiás lépés alkalmazásával, amely során adszorbenskónl megfelelő szemcseinóretű szilikagélt, eluáló szerként pedig hangyasavat tartalmazó kloroform-metanol oldószerelogyet használunk.

A fermentlevet, vagy szűrt fermentlevet enyhén lúgos közegben n-butanollal extrahált uk. Az extraklumol vákuumban bepárolluk és a sűrítményből a hatóanyagot sósuvas sója formájában leválasztottuk. így egy erősen szennyezett, a daunorubicin mellett számos, nem azonosított antraciklin-glikozidot és aglikont ie tartalmazó nyersterméket kaptunk. Ebből a nyerstermékből a találmányunk szerint imertetelt módon, egyszeri oszlopkromatográfiával, tiszta daunoribicin-hidrogén-klcridot nyertünk. A nyersterméket a lehető legkisebb mennyiségű metanolban oldottuk és egy olyan kromatográfiás oszlopra vittük, amely 0,063-0,2 mm szemcseméretű szilikagélt tartalmazott. Az elválasztás élessége szempontjából fontos, hogy ezt a szilikagélt klorofcrmban szuszpendólva töltsük az oszlopba ős hogy a szuszpendéló kloroform metanolt, vagy egyéb oldószert ne tartalmazzon. Ezután eluáló szerként 82:18:1 arányú kloroform-metanol-hangyasav elegyet vezettünk az oszlopra és az eluólumol frakciókba szedve vékonyréteg kromatográfiásan elemeztük. Az említett körülmények biztosították, hogy a daunorubicin-hidrogén-kloridot tartalmazó frakciókat az egyéb anyagokat tartalmazó frakcióktól élesen külön válva kaptuk meg. Ezekből a frakciókból egyszeri bepárléssal és kristályosítással gyógyászati célra alkalmas tisztaságú daunorubicin-hidrogén-kloridot nyertünk.

A találmány szerinti eljárással a daunorubicin-hidrogón-klorid az eddig ismert eljárásoknál lényegesen magasabb, a fermentló

195937 hatóanyagtarlalmára számítva 60-62%-os kitermeléssel állítható elő. Jelen találmányunkat, 111. annak gyakorlati kiviteli módját a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa

Sheptomyces sp. 69. jelű törzs deponálási szám: MNG-00334 alkalmazásával nyert fermentléhez (500 1, hatóanyag tart.: 40 pg/ml) szobahőmérsékleten, térfogatára számítolt 2% oxálsavat adagoltunk és 45 percig kevertettük. 1% szűrőperlit hozzáadása után továhbi 30 percig kevertettük, majd a micélíumot szűréssel eltávolítottuk. A maradék hatóanyag kinyerése céljából a micélíumot 2%-os oxálsav oldattal (100 1) kevertettük 30 percig és ismét szűrtük.

Az egyesített szűrletek (530 1) pH-ját 40%-os NaOH oldattal 8,0-8,4 közé állítottuk, éa a hatóanyagot n-butanollal (2x200 1) extraháltuk. Az n-butanolos fázist ionmentes vízzel (100 1) mostuk, pH-ját n sósavval 5,1 — -5,5 közé állítottuk és vákuumban, 45 “C-on bepároltuk. A sűrítményhez (4,5 1) térfogatára számítolt 2% ionmentes vizet, adtunk, pH— -ját 6 n aósavas etanollal 1,2-1,4 közé állítottuk, és 45 “C-on 3/4 térfogatra pároltuk, és 5 C-on, 24 órán át kristályosítottuk. A kivált nyers daunorubicin-hidrogén-kloridot (21 g, hatóanyag: 60%) szűrtük, n-butanollal mostuk és vákuumban 25 “C-on megszárítottuk. Az anyalúgot ismételten 3/4 térfogatra pároltuk és 5 “C-on, 24 órán ét kristályosítottuk. A kivált nyersterméket (7 g, hatóanyag: 58%) az előzőhöz hasonlóan szúrtuk, n-butanollal mostuk és megszárítottuk.

Az egyesített nyersterméket (28 g) szili— kagélen, oszlopkromatográfiásan tisztítottuk meg:

A szilikagélt (5 1, szemcseméret: 0,063-0,2 mm) kloroformban szuszpendáltuk és oszlopba (átmérő: magasság = 1:20) töltöttük. A nyersterméket metanolban (124 ml) oldva vittük a kloroformos szilikagélra. Ezután az oszlopra 82:18:1 térfogat arányú kloroform-metanol-hangyasav elegyet vezetünk 800 ml/h sebességgel. Az eluátumot 800 ml-es frakciókba szedtük és azokat vékonyréteg kromatográfiásan olemeztük. Az egyfoltos, daunorubicin-hidrogén-kloridot tartalmazó frakciókat egyesítettük (12 1) és vákuumban, 35 “C-on 1/100 térfogatra pároltuk. 5 “C-on órás kristályosítás után kivált daunorubicin-hidrogén-kloridot (12,5 g, kitermelés a fermentlé hatóanyagára számítva: 62%) szűrtük, kloroformmal mostuk és vákuumban, “C-on megszárítottuk.

A termék analitikai jellemzői:

- Elemanalízis: C27II29N010HCI (Ms: 563,5) számított: talált:

5	c 57.50 11 5.32 N 2.48 Cl 6.30	57.10 5.40 2.51 6.36
10	- Olvadáspont: 188-189 “C (bomlik) - Vékonyréteg kromatográfia:

réteg: Kovasavgél 60 (katalógusszám: Merck

	5724), nálva,	1%-os oxálsav oldattal impreg-
	futtatószer:	n-butanol-ecetsav-viz 4:1:5
15		arányú elegy felső fázisa,
	kifejlesztés 10	cm-re, Rí: 0,4
	-UV spektrum:	E.1* metanolban oldva oldva ic·
20	233 nm	620
	250 nm	440
	286 nm	138
	476 nm	201
	494 nm	199
25	532 nm	115

2. példa

3C A fermentlevet (500 1) micéliumos extraháló berendezésben 1:0,8 arányú n-butanollal 8-8,4 pH-η (40%-oe NaOH-dal lúgositva) ezűrés nélkül extraháltunk. A szerves fázist fél térfogat ionmentes vízzel mostuk. A mosott n-butanolos fázist a továbbiakban az 1. példában leírtak szerint dolgoztuk fel. A kitermelés és a termék analízisének adatai megegyeztek az 1. példa szerint kapott temékével.

Claims (2)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. ) Eljárás gyógyászati célra alkalmas

   45 tisztaságú daunorubicin-hidrogén-klorid fermentléből történd kinyerésére, a fermentléből közvetlenül vagy szűrés után, vízzel nem elegyedő oldószerrel végzett extrakció, az extraktum bepárlésa, nyerstermék leválasztá50 sa és annak kromatográfiás tisztítása útján azzal jellemezve, hogy a kromatográfiás tisztítást szilikagél adezorbenet tartalmazó oszlopon, hangyasav kloroform-metanol eluáló szerrel végezzük, a daunorubicin-hidrogén55 -kloridot tartalmazó frakciókat bepároljuk, ée a sűrítményből a célterméket ismert úton kinyerjük.
2. 2. ) Az 1. igénypont szerinti eljérés azzal jellemezve, hogy olyan eluálószert alkalma60 zunk, amelyben a kloroform:metanol 80:20 90:10 térfogat arányú eluálószer 0,2-2 tf% mennyiségű hangyasavat tartalmaz.