HU193522B - Process for producing pharmaceutical preparations containing human proinsulin - Google Patents

Description

A találmány gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt humán proinzulínt tartalmazó új gyógyszerészeti készítmények' előállítására vonatkozik, mely cukorbaj kezelésére alkalmas.

A cukorbaj (Diabetes mellitus) olyan anyagcserezavar, amelyet az jellemez, hogy a testszövetek nem képesek a szénhidrátokat normális mértékben oxidálni. Legfontosabb oka az inzulinhiány. Az utóbbi 60 évben a cukorbajban szenvedő emberek szabályozott mennyiségű inzulint kaptak. Jelenleg a cukorbaj kezelésére használt inzulint állati, elsősorban marha és sertés hasnyálmirigyből izolálják. Mind a marha, mind a sertés inzulin szerkezetileg különbözik az emberi hasnyálmirigyben képződő inzulintól. A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-módszerrel jelenleg lehetségessé vált a humán hasnyálmirigyben keletkező inzulinhoz hasonló molekula előállítása. Ilyen inzulin használatával az eddiginél nagyobb mértékben utánozhatjuk a természetes rendszert.

Régóta tudjuk, hogy az inzulin adagolása a betegnek egymagában kevés az anyagcsere normális állapotának visszaállítására és/ vagy fenntartására. Bár az inzulin rendelkezik a szénhidrát-anyagcserére kifejtett hatással, a cukorbaj további rendellenességekkel jár, a legtöbb, vagy az összes ilyen tünet a vérerek szerkezetével és funkciójával függ össze. A fenti rendellenességekhez vezető rendellenességek ritkán szűnnek meg a hagyományos inzulin-terápiával.

A cukorbajjal összefüggő érrendszeri abnormalitásokat gyakran cukorbajjal együttjáró komplikációknak nevezzük. Ezek általában kapilláris falelváltozásokkal járnak együtt, ezek retinás bevérzéseket és vesevérzéseket okoznak. További, cukorbajjal együttjáró komplikáció az idegrendszeri zavar, amely vagy nem függ össze, vagy közvetlenül, vagy közvetetten összefügg a jelzett kapilláris falelváltozásokkal. A diabetes komplikációk specifikus megjelenései a következők:

1) szembetegségek, ideértve a retina-megbetegedést, szürkehályog képződését, glaukómát és a belső szemizmok bénulását;

2) szájbetegségek, ideértve a fogínygyulladást, fokozott · foglepedék-képződést, fognyak- és fogágy-elváltozásokat és az állcsont nagyfokú felszívódását;

3) motoros, szenzoros és autonóm idegrendrendszeri elváltozások;

4) nagy erek megbetegedése;

5) kapilláris falelváltozás;

6) bőrbetegségek, ideértve a xanthoma diabeticorumot, a necrobiosis lipoidica diabeticorumot, furunkulózust, mikózist és pruitist;

7) vesemegbetegedések, például diabetikus glomerulosclerosist, arterioláris nephrosclerosist és pyelonephritist; és

8) terhesség alatti problémák, ideértve a nagy testű újszülöttet, a halvaszülést, a magzati vetélést, az újszülöttkori halált és a vele született fejlődési rendellenességeket.

Sok, vagy talán az összes diabetikus komplikáció az inzulin-hiányra vezethető vissza, amikor a test nem képes fenntartani természetes hormonális egyensúlyát.

\ proinzulin extrakciós úton történő előállítását ismerteti például D. F. Steiner és Ρ. E. Oyer, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 57, 473 (1967) és W.Kemmler és D.F.Steiner, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 41, 1223 (1970).

proinzulin szintézist például a következő szerzők ismertetik:

W. Kemmler és munkatársai, J. Bioi. Chem. 246, 6786 (1971) és 248, 4544 (1973), .?. E. Oyer és munkatársai, J. Bioi. Chem., 246 1365 (1971),

\. Yanaihara és munkatársai, Diabetes, 27(Suppl. 1), 149 (1978),

Benisek és munkatársai, Biochemistry, 6, 3780 (1967),

3erndt és munkatársai, Peptides 1976, 273 kiadó: A. Loffet Univ. of Brussels Press, Brussels, ^aber, 0. K- és munkatársai, Diabetes, 27 (Suppl. 1) 170 (1978),

Cray, W. R. Methods in Enzymology, XI., 139 (1967) kiadó: Academic Pfess, New York,

Kaneko, T. és munkatársai, Endocr. jap. 21, 141 (1974),

Kuzuya, H. és munkatársai, Diabetes 27, (Suppl. 1) 161 (1978),

Morgan, C. R. és Lazarow, A. Diabetes 12, 115 (1963), ^!

Schlichtkrull, J. és munkatársai, Diabetes 21 (Suppl. 2), 649 (1972),

Steiner, D. F. és Clark, J. L., Proc. Nat. Acad. Sci. (Wosh), 60, 622 (1968), íager, H. S. és munkatársai, J. Bioi. Chem., 248, 3476 (1973),

Wrigley, C. W., New Techniques ín Amino Acid, Peptides and Protein Analysis, 291. old.; Science Publishers Inc., Ann. Arbor, MI.,

Yanaihara, N. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 59, 1124 (1974),

Yanaihara, N. és munkatársai, Diabetes, 116 old. (1977), Excerpta Medica, Amsterdam,

Yanaihara, N. és munkatársai, Peptide Chemistry, 1977, 195. old., Protein Research Foundation, Osaka,

Yanaihara, N. és munkatársai, Diabetes, 27 (Suppl. 1), 149 (1978).

A proinzulin rekombináns DNS eljárással történő előállítását ismerteti a 0 012 494 és 0 026 598 sz. európai szabadalmi leírás, valamint a 0 037 255 sz. európai nyilvánosságrahozatali irat. Ezenkívül a következő irodalmi

-2193522 helyek foglalkoznak a humán proinzulin előállításával:

Peptides: Synthesis-Structure-Function: Proc. of the Seventh American Peptide Symposium, 1981: Pierce Chemical Company,

Goeddel és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 106-110 (1979),

Ross, M. J.: National Institutes of Health Recombinant DNA Technology Bulletin, 3, 1-11 (1980).

A humán proinzulin előállításával ezenkívül még a következő összefoglaló munkák (reviews) foglalkoznak:

Steiner, D. F. és munkatársai: Diabetes, 8th. Proc. Congr. Int. Diabetes Fed; Excerpta Med., Amsterdam, 1974,

Rubenstein, A. H. és munkatársai: Pec. Prog. Horm. Rés., 33; Academic Press, New York, -1977,

Kitaloshi, Metabolism., 26, 547-587 (1977), Proinsulin, Insulin, C-peptides: Excerpta Medica, Amsterdam,, 1979, 468. old.

összefoglalva, a fenti irodalmak egyike sem tartotta alkalmasnak a proinzulint gyógyászati alkalmazásra, annak jelentőségét kizárólag inzulin prekurzorként látták. Hatását az inzulinéval azonosnak, azonban lényegesen gyengébbnek tartották. Az inzulin ipart előállítása során is arra törekedtek, hogy a proinzulint teljesen eltávolítsák a készítményből, anélkül, hogy az elválasztott proinzulint felhasználták volna.

A találmány olyan gyógyszerészeti készítményekre vonatkozik, amelyekkel a cukorbajos beteg szervezetének természetes hormonális állapotát jobban fenntarthatjuk, mintha egyedül inzulint adagolnánk.

Így a találmány olyan gyógyszerészeti készítmények előállítására vonatkozik, amely humán proinzulint tartalmaz, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt.

A találmány szerinti hatóanyagot úgy állítjuk elő, hogy

a) proinzulint kódoló DNS-szekvenciával rendelkező, rekombináns DNS-technikával előállított E. coli törzset fermentációs körülmények között tenyésztünk, majd a kapott proinzulint elkülönítjük, vagy

b) a proinzulin peptid-szekvenciájának megfelelő, a peptidkémiában ismert védőcsoportokkal védett termékről lehasítjuk a védőcsoportokat, vagy

c) a proinzulin lineáris peptid-szekvenciájának megfelelő, szabad -SH csoportokat tartalmazó pepiidben létrehozzuk a diszulfid- kötéseket, majd az előállított humán proinzulint legalább egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, adott esetben kétértékű cinkion-forrással és/vagy protaminnal keverve szokásos dózisformává, célszerűen oldat vagy injekció formává alakítunk.

A találmány szerinti gyógyszerészeti készítmények alapvető összetevője a fenti módszerekkel előállított humán proinzulin.

A találmány szerinti készítményekkel ada golt humán proinzulin lévén természetesebben használódik fel a glükóz, és a vér glükóz - tartalma jobban szabályozódik, ezzel elkerülhetők az előzőekben ismertetett kedvezőtlen diabetikus komplikációk. A humán proinzulint több forrásból beszerezhetjük; például szerves szintézissel, ismert módszerrel való humán hasnyálmirigyből kiinduló izolálással és — jelenleg — a rekombináns dezoxi-ribon íkleinsav-módszerrel.

A rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-módszerrel való proinzulin előállítása — a 37255 sz. európai nyilvánosságrahozatali irat szerint — nagy vonalakban úgy történik, hogy izolálással, szintézissel vagy e kettő kombinációjával a humán proinzulin aminosav-szekvenciáját meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő. Ezután a humán proinzulint meghatározó dezoxi-ribonukleinsavat leolvasási fázisban beépítjük egy megfelelő klónozó és kifejeződő hordozóba. A hordozóval megfelelő mikroorganizmust transzformálunk , a transzformált mikroorganizmust pedig ezután megfelelő fermentációs körülmények között tenyésztjük. Ekkor további proinzulin gént tartalmazó vektorokat kapunk, és kifejeződik a proinzulin vagy egy proinzulin prek irzor.

Abban az esetben, ha a kifejezendő termék egy proinzulin prekurzor, úgy az általában a humán proinzulin aminosav-szekvenciájáböl áll, amely amino-terminális végén egy olyan protein fragmenshez kapcsolódik, amely közönséges körülmények között annak a génnek a terméke, amelybe a proinzulin gént beépítettük. A proinzulin aminosav-szekvenciája specifikusan hasítható helyen kapcsolód k a protein fragmenshez, ez általában metion n. Ezt a terméket általában fuzionált génterméknek nevezzük.

A proinzulinnak megfelelő aminosav-szekvenciát cián-bromiddal lehasítjuk a fuzionált géntermékről, ezután ismert módszerekkel stabilizáljuk a proinzulin aminosav-szekvencia ciszteineiben lévő szulfhidril-csoportokat, o'y módon, hogy a megfelelő S-szulfonátokká alakítjuk azokat.

A kapott proinzulin S-szulfonátot tisztítjuk, a tisztított proinzulin S-szulfonátot ezután a három megfelelően elhelyezkedő diszulfid-kémiai kötés kialakításával proinzulinná alakítjuk át. A kapott proinzulin terméket tisztítjuk.

Ahogy azt már jeleztük, a találmány szerinti készítményekkel elősegítjük a természetes hormonális állapot fenntartását, és ezáltal meggátoljuk vagy gyakorlatilag teljesen kiküszöböljük vagy késleltetjük a diabetikus komplikációkat. Felismerték, hogy egyes betegek képtelenek hatékonyan felvenni az inzulint szubkután injekción át; ennek oka proteázok jelenléte az injekció helyén, ezek az enzimek, mielőtt az inzulin abszorbeálódhatna a véráramba és elvándorolhatna a. receptor helyek3

-3193522 hez, gyorsan lebontják azt. Ezek a betegek, ha egyáltalán inzulint kapnak, intravénás injekcióhoz vannak kötve. A szükséges ismételt intravénás injekciók a vénákra kifejtett ártalmas hatásuk miatt előnytelenek, előnyte- 5 lenek továbbá azért is, mert fertőzést okozhatnak. Ügy találtuk, hogy a humán proinzulint ezek az inzulint bontó proteázok nem hasítják, így ez szubkután.injekcióval is adható. Stabilitása és a szervezet számára való hoz- 10 záférhetősége elősegíti a természetes hormonális homoestasis fenntartását.

Jelenlegi kutatások eredményeiből nyilvánvaló, hogy a humán proinzulin eljut a eélszövetekhez, például a zsírsejtekhez [Pod- 15 lecki és munkatársai, Diabetes, 31, 126/A (1982)]. Bár sejten belüli hatása molekuláris szinten jelenleg még nem ismert, ezek az eredmények alátámasztják azt, hogy a humán proinzulin aktív szerepet játszik, és szűk- ²⁰ séges a természetes hormonális állapot fenntartásában.

Schluter és munkatársai (Diabetes, 31,

135/A (1982)] leírják, hogy a humán in- 25 zulin receptorok kötőképessége növekedik humán proinzulin jelenlétében. Ez a megfigyelés ismét alátámasztatja azt, hogy a humán proinzulin jelenléte elősegíti vagy visszaállítja a természetes hormonális állapotot. 30

A találmány szerinti készítményeket a természetes hormonális homeostasis fenntartására, vagy ennek az állapotnak a megközelítésére cukorbetegnek természetesen a cukorbaj állapotának súlyossága szerint adagoljuk. 35 Az adagolt mennyiség az adagolás módjától is függ. Végül is az adagolt készítmény menynyiségét és az adagolás gyakoriságát a kezelőorvos határozza meg. Általában azonban azt számítva, hogy 1 mg humán proinzulin 3,5 40

Egység humán inzulin-aktivitásnak felel meg, az adagolt humán proinzulin mennyisége testsúlykilogrammra és egy napra számítva 0,02 és 5 Egység humán inzulinnak felel meg, előnyösen 0,1 és l Egység/testsúlykilogramm/ /nap közötti mennyiségű humán inzulin aktivitásnak.

A találmány szerinti készítményt parenterálisan, például szubkután, intramuszkulárisan és intravénásán adagoljuk. A találmány 50 szerinti készítmények aktív összetevőként humán proinzulint tartalmaznak, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, és adott esetben más, terápiás hatású összetevőkkel együtt. A készítményben lévő 55 aktív összetevő mennyisége 99,99% és 0,01 % között változhat. A vivőanyagot úgy választjuk meg, hogy az megfeleljen a készítményben jelenlévő más komponenseknek, és ne zavarja azok betegre kifejtett hatását. θθ

A találmány szerinti parenterális adagolásra alkalmas készítmények előnyösen steril, vizes oldatokban és/vagy szuszpenziókban tartalmazzák a gyógyszerészeti szempontból aktív összetevőket. Az oldatokat vagy szusz- θ₅ penziókat előnyösen a beteg véréhez viszonyít4 va izotóniásra állítjuk be, általában nátrium-kloriddal, glicerinnel, glükózzal, mannittal, szorbittal vagy más, hasonló szerrel.

A készítmények ezenkívül tartalmazhatnak több adjuvánst, például puffereket, konzerválószereket, diszpergálószereket, a hatás gyors kifejlődését elősegítő szereket, a hatást hosszú ideig fenntartó segédanyagokat és más komponenseket. Konzerválószerként például fenolt, m-krezolt, metil-p-hidroxi-benzoátot vagy másokat használunk. Pufferként általában nátrium-foszfátot, nátrium-acetátot, nátrium-citrátot vagy más, ismert puffereket használunk. A készítmény pH-jának beállítására savat, például hidrogén-kloridot, esetenként bázist, például nátrium-hidroxidot használunk. A vizes készítmények pH-ját általában 2 és 8 közé, előnyösen 6,8-és 8,0 közé állítjuk be.

A készítményhez adott esetben például kétértékű cinkionokat adunk, amelyek, ha jelen vannak, 100 Egység humán proinzulinra számítva 0,1 mg és 3 mg közötti koncentrációjúak. Adagolhatunk protaminsót is (például szulfátsóként), amely 100 Egység humán proinzulinra számítva általában 0,5 mg és 20 mg közötti mennyiségben van jelen. A találmány szerinti gyógyszerészeti készítmények egy-egy előállítási példáját az alábbiakban adjuk meg.

1. példa

Semleges, szabályos humán proinzulint tartalmazó készítmény előállítása (a készítmény nú-enként 40 Egység humán proinzulint tartalmaz).

ml készítmény előállítására az alábbi anyagokat keverjük: t urnán proinzulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) desztillált fenol 20 mg glicerin 160 mg.

Az elegyhez vizet és annyi 10%-os hidrogén-klorid vagy 10%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, hogy a készítmény térfogata 0 ml és végső pH-ja 7,0 — 7,8 legyen.

2. példa

Protamint és humán cink proinzulint tartalmazó készítmény előállítása (a készítmény ml-enként 40 E humán proinzulint tartalmaz).

ml készítmény előállítására az alábbi anyagokat keverjük:

humán proinzulin (3,5 E/mg) desztillált fenol cink-oxid glicerin protamin-szulfát kristályos nátrium-foszfát

114 mg (400 25 mg

0,95—3,8 mg 160 mg — 64 mg 38 mg

E)

Az elegyhez vizet és annyi 10%-os hidrogén-klorid vagy 10%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, hogy a készítmény térfogata 10 ml legyen, és végső pH-ja 7,1 — 7,4 közötti értékre álljon be.

-4193522

3. példa

Izofán protamint és humán proinzulint tartalmazó készítmény előállítása (a készítmény ml-enként 40 E humán proinzulint tartalmaz). 10 ml készítmény előállítására az alábbi anyagokat keverjük:

humán proinzulin (3,5 E/mg) 114 mg (400 E) desztillált m-krezol 16 mg desztillált fenol 6,5 mg glicerin 160 mg protamin-szulfát 9.6 — 19,2 mg kristályos nátrium-foszfát 38 mg

Az elegyhez annyi vizet és 10%-os hidrogén-klorid vagy 10%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, hogy a készítmény térfogata 10 ml és végső pH-ja 7,1 — 7,4 legyen.

4. példa

Humán cink proinzulint tartalmazó készítmény előállítása (a készítmény ml-enként 40 E humán proinzulint tartalmaz) ml készítmény előállítására az alábbi anyagokat keverjük: humán proinzulin (3,5 E/mg) Π4 mg (400 E) vízmentes nátrium-acetát 16 mg szemcsés nátrium-klorid 70 mg metil-p-hidroxi-benzoát 10 mg cink-oxid 1 — 8 mg

Az elegyhez ennyi vizet és 10%-os hidrogén-klorid vagy 10%-os nátrium-hidroxid oldatot adunk, hogy a készítmény térfogata 10 ml és végső pH-ja 7,2 — 7,5 legyen.

A találmány szerinti készítmények biológiai hatását — inzulin készítményekkel összehasonlítva — az alábbiakban ismertetjük: A/ A humán proinzulin perifériás és hepatikus hatása

Az ellenőrző vizsgálatokat 10 egészséges kísérleti személyen (5 férfin és 5 nőn) végeztük, életkoruk: 25—40 év (átlagos életkoruk: 29 ± 3 év), átlagos relatív testsúlyuk: 0,96 ± 0,02. Valamennyi vizsgálati időszak előtt a kísérleti személyek legalább 72 órán át olyan, a testsúlyt állandó értéken tartó táplálékot fogyasztottak, amely 45% szén-hidrátot, 40% zsírt és 15% fehérjét tartalmazott.

A humán inzulinnal és humán proinzulinnal szemben mutatott, in vivő érzékenységet a DeFronzo, R. A., Tobin, J. D. és Andres R. által leírt [Am.J.Physiol., 237, E214—E223 (1979)], euglikémiás (normális vércukorszint mellett végzett) glükóz-terheléses vizsgálattal határoztuk meg. E vizsgálat során az egyik könyökvénába a vérárammal azonos irányban egy kanült helyezünk, ezen keresztül adjuk be az infúziókat. Ezenkívül a kézfej egyik vénájába is kanült helyezünk, mégpedig a vérárammal ellentétes irányban, ezt a kanült egy melegítő berendezésben (70°C) tartjuk, ezáltal megkönnyítjük a vénás vérminták vételét, és arteria 1 izált vénás vért állítunk elő. A katéterek elhelyezése után a hormon-infúzió megkezdése előtt legalább félórán át [3—³H]—-glükózt infundálunk. A hormon-infúzió megkezdésekor az inzulint vagy proinzulint egy kezdeti, feltöltő dózisban adagoljuk, amelynek koncentrációja logaritmikusán csökken,ezáltal akutan megnöveljük a szérum hormonszintjét. Az ezen kezdeti 10 perces időszakban beadott inzulin vagy proinzulin mennyisége durván kétszerese annak a mennyiségnek, amelyet a következő 10—10 perces időszakokban folyamatos hormon-infúzió formájában adunk be. A szérum glükózszintjét a teljes vizsgálati időszakban 80 mg/dl és 90 mg/dl közötti értéken tartjuk (variációs koefficiens kisebb mint 5%\ oly módon, hogy változó sebességgel 20%-os dextróz-oldatot infundálunk. A vizsgálat során 20 percenként, izotópos módszerrel meghatározzuk a teljes glükóz-felhasználás sebességét.

kísérleti személyen előkísérleteket végeztünk, és meghatároztuk, mennyi idő alatt áll be a hormonok biológiai hatásának egyensúlya a humán inzulin vagy humán proinzulin infúziójának megkezdése után. Az egyik napon a kísérleti személyeknek 6 órán át 5,0 gg/ /m²/perc (120 mE/m²/perc) sebességgel infúzió útján inzulint adtunk. A következő napon a kísérleti személyeknek 8 órán át 22,5 gg/m²/perc sebességgel, ugyancsak infúzió útján proinzulint adtunk. A glükóz-felhasználás egyensúlyi sebessége inzulin esetében 3 óra alatt, proinzulin esetében pedig 5 óra alatt állt be. Ezen eredmények alapjánaz összes további vizsgálat során az inzulint 180 percen át adtuk infúzió formájában, és a hormon biológiai hatásait az összes vizsgálat során a harmadik óra adataiból határoztuk meg. A proinzulin infúziókat 300 percig folytattuk, és a biológiai hatásokat az összes xizsgálatban az ötödik óra mennyiségi eredményei alapján határoztuk meg. Az összes vizsgálatban az utolsó három 20 perces időszak adatait átlagoltuk, és ezt az átlagértéket használtuk, mint az adott vizsgálat adatpontját.

Minden kísérleti személyen összesen 8 euglikémiás glükóz-terheléses vizsgálatot végeztünk, e vizsgálatokat más és más napokon hajtottuk végre. Az inzulin hatásának dózis-hatás görbéjét úgy határoztuk meg, hogy az inzulint 15, 40, 120 és 240 mE/m²/perc sebességgel infundáltuk. Ezzel a módszerrel kíséreltük meg, hogy 40 μΕ/ml és 80 μ/ml közötti, egyensúlyi inzulin-koncentrációkat érjünk cl (I. táblázat). Ugyanakkor valamennyi kísérleti személynek a proinzulint 4 különböző koncentrációban infundáltuk. A proinzulininfúziók sebességét úgy választottuk meg 2,75, 7,5, 22,5 és 45,0 pg/m²/perc), hogy körülbelül 3.10*¹² mól/ml és 50.10'¹² mól/ /ml közötti egyensúlyi hormonszinteket érjünk el, vagyis moláris alapon, durván 10-szer akkora értékeket, mint az inzulinnal (1. táblá5

-5193522 zat). Abból a célból, hogy egyszerűbben öszszehasonlíthassuk a humán inzulin és a humán proinzulin biológiai hatásait, a fenti infúziókat A, B, C és D betűvel jelöljük, ahol a hormonok infúziójának sebessége az A, B, C sorrendjében nő. A hepatikus glükóz-kibocsátást (a máj glükóz kibocsátását) az alapállapotban és az összes terheléses vizsgálat során úgy határoztuk meg, hogy a kísérleti személyeknek egy folyamatos, feltöltő [3—³H]-glükóz-infúziót adtunk. A hepatikus glükóz-kibocsátás átlagos alapértéke: 87 ± 3 mg/m²/perc. Az inzulin és proinzulin visszaszorítja a hepatikus glükóz-kibocsátást. E hatás dózis-hatás összefüggéseit úgy határoztuk meg, hogy valamennyi terheléses vizsgálat során kiszámítottuk a hepatikus glükóz-kibocsátás alapértékének %-os csökkenését az euglikémiás terheléses vizsgálat során kialakuló, adott egyensúlyi hormon-koncentráció mellett. Ahhoz, hogy a hepatikus glükóz-kibocsátás az inzulinnal kiváltotthoz hasonló mértékben csökkenjen, sokkal nagyobb proinzulin szérumszintekre volt szükség. Például a 90%-os csökkentéshez a proinzulin 3,35.10^-12 mól/ml koncentrációja volt szükséges, szemben az inzulin

I. T

0,38.10*'² mól/ml koncentrációjával. Több különböző inzulin és proinzulin koncentráció hatásának összehasonlítása azt mutatja, hogy molárisán számítva a proinzulinnak a hepati5 kus glükóz-kibocsátást csökkentő hatása körülbelül 12%-a az inzulin hasonló hatásának.

Amint ezt az alábbi, II. táblázat mutatja, a humán proinzulinnak a hepatikus glükóz-kibocsáíást csökkentő relatív biológiai hatása erősebb, mint a glükóz-kibocsátást serkentő hatása. Az A-vizsgálat során a proinzulin-infúzió 10-szer nagyobb szérumszinteket eredményezett, mint a megfelelő inzulin-infúzió (1. táblázat).

Amint ezt a II. táblázat szemlélteti, e két hormon infúziója összehasonlítható mértékben csökkentette a hepatikus glükóz-kibocsátást. Ezzel szemben a proinzulin infúziója során mért glükóz-felhasználási sebesség csak

70 %-a volt annak, amelyet az inzulin infúziója során mértünk (p kisebb mint 0,01). így az A-vizsgálatban elért proinzulin- és inzúlinszint^k összehasonlítható mértékben gátolták a hepatikus glükóz-kibocsátást, de a glükóz25 -felhasználás serkentése tekintetében a proírzulin hatása az inzulin hatásának csak 70%-a volt.

b 1 ázat

Az inzulin- és proinzulin-infúziók sebessége az euglikémiás terheléses vizsgálatokban, és az elért egyensúlyi hormonszintek Hormon-infúziók: A 3 C D

Inzulin (mF+m²/perc) 15 Inzulin ( pg/m²/perc) 0,63

Proinzulin ( pg/m²/ /perc)

Egyensúlyi hormonszintek (átlag ± SEM):

1,67

120 240

5,0 10,0

Inzulin ( pE/ml) Inzulin (10^-12 mól/ml) Proinzulin (10^-l2mól/ /ml)

37	+	3	93 +	7	291	+	14	800 +	65
0,26	+	0,02	0,66	+	0,05 2,	09	+ 0,10 5,25	± 0,47
2,55	+	0,16	6,24	+	0,49 21	»2	+ 1,4	40,0	+ 1,9

II. T á b lázat

A hormon-infúziók perifériás és hepatikus hatása az A-vizsgá1 a tban (átlag + SE)

Inzulin Proinzulin

A hepatikus glükóz-kibocsátás %-os csökkenése 82 + 6 80 + 6

Glükóz-felhasználás sebessége (mg/m²/perc) 176+17 122 + 11* ^xp kisebb mint 0,01.

-6193522

B/A humán proinzulinnak a perifériás glükóz-felvételre és a hepatikus glükóz-kibocsátásra gyakorolt hatása

A biológiai hatások aktiválásának és dezaktiválásának kinetikája Tanulmányoztuk azon biológiai hatások aktiválásának és dezaktíválásának kinetikáját, amely hatásokat a proinzulin a perifériás glükóz-felvételre és a hepatikus glükóz-kibocsátásra gyakorol. Amikor e kísérletek során a humán inzulint feltöltő, folyamatos infúzió formájában adagoltuk, akkor az infúzió megkezdése után 5—10 perccel a humán inzulin szintjének egy kezdeti csúcsát figyeltük meg, és a humán inzulin egyensúlyi szintjét körülbelül 20 perc alatt értük el. Ezzel szemben, amikor hasonló módon humán proinzulint adagoltunk, akkor nem figyelhettük meg kezdeti hormonszint-csúcsot, és az egyensúlyi szintek csak 90—120 perc alatt álltak be. így a humán proinzulin kezdeti eloszlási térfogata eltérő (sokkal nagyobb), mint az inzuliné, és az egyensúlyi szint eléréséhez szükséges idő sokkal hosszabb. Ez utóbbi megfigyelést csak részben lehet azzal megmagyarázni, hogy a humán proinzulin metabolikus kiürülési (clearance) sebessége kisebb mint a humán inzuliné.

A biológiai hatások tanulmányozása során a két hormon között lényeges különbségeket figyeltünk meg. Például a humán proinzulin esetében a biológiai hatások egyensúlya sokkal lassabban állt be, mint a humán inzulin esetében, mind a glükóz-felhasználás, mind pedig a hepatikus glükóz-kibocsátás tekintetében. így a humán inzulin hatására bekövetkező glükóz—felhasználás növekedése 2—3 óra alatt eléri az egyensúlyi állapotot. Ezzel szemben a humán proinzulinnak a glükóz-felhasználásra gyakorolt biológiai hatása csak 5 óra alatt éri el az egyensúlyi állapotot. A humán proinzulin aktiválási sebességének ez a lényegesen hosszabb volta csak részben magyarázható meg azzal, hogy ez a hormon hosszabb idő alatt éri el az egyensúlyi vérszintet. Ez a jelenség arra utal, hogy a humán proinzulin celluláris (sejtbeli) hatása eltér az inzulinétól, és így aktiválási sebessége lényegesen kisebb, mint a humán inzuliné.E jelenség valószínű mechanizmusa arra a megfigyelésre alapozható, hogy a humán proinzulinnak a celluláris receptorokhoz való kötődésének sebességi állandója tizedakkora, mint a humán inzulin receptorokhoz való kötődésének sebességi állandója.

A humán proinzulin hatásának kinetikájával kapcsolatban egy rendkívül meglepő és fontos megfigyelést tettünk, amikor e hormon dezaktíválásának sebességét tanulmányoztuk. E vizsgálatokat úgy végeztük, hogy humán inzulint és humán proinzulint 5 órán át 0,55pg/m²/perc és 2,75 μg/m²/ρerc sebességgel infundáltunk, ezalatt a hormonoknak a glükóz-felhasználást serkentő és hepa12 tikus glükóz-kibocsátást gátló hatása eléri az egyensúlyt. Ekkor a hormonok infúzióját hirtelen leállítottuk, és a glükóz-szintet az infundált hormonok biológiai hatásának a kimutalhatóság határa alá való csökkenéséig állandó értéken tartottuk. Az eredmények azt mutatták, hogy mindkét hormon gyorsan kiürül a keringésből. A humán inzulki felezési ideje (t,/₂) 5—7 perc, míg a humán proinzulin felezési ideje 20 perc. Habár a humán proinzulin felezési ideje nagyobb, mint a humán inzuliné, a biológiai hatások megszűnésének időtartamához képest mindkét hormon viszonylag gyorsan eltűnik a keringésből. A humán inzulinnak a glükóz-felhasználásra gyakorolt hatása felezési ideje 41 ± 6 perc, míg a humán proinzulinnak a glükóz - felhasználásra gyakorolt hatása felezési ideje 87 ± 14 perc. A glükóz-felhasználás sebesség-értékei a humán proinzulin infúziójának megszüntetése után csak 160 perc múlva tértek vissza az alapértékre. így a humán inzulinhoz képest a humán proinzulinnak a glükóz - 'elhasználást serkentő biológiai hatása 2,2szer lassabban szűnik meg. Meg kell jegyeznünk, hogy ezekben a kísérletekben mindkét ho'mon viszonylag gyorsan kiürült a keringésbő', és a hormonok vérszintje a humán inzulin esetében 20 perc alatt, a humán proinzulin esetében pedig 90 perc alatt a biológiailag ha^Tásos értékek alá esik. E vizsgálatok leginkább figyelemreméltó eredménye a humán proinzulinnak a hepatikus glükóz - kibocsátást csökkentő hatásával kapcsolatos. Amikor a humán inzulinnak a hepatikus glükóz - kibocsátást csökkentő hatásának a megszűnését vizsgáltuk, azt találtuk, hogy a humán inzulin ha'ásának felezési ideje 49 ± 8 perc, és a hepatikus glükóz - kibocsátás értékei körülbelül 120 perc alatt tértek vissza az alapértékre.

Ezzel éles ellentétben, amikor a humán proinzulin infúzióját leállítottuk, 120 percen át nem lehetett kimutatni, hogy a humán proinzulinnak a hepatikus glükóz—kibocsátásra gyakorolt gátló hatása csökkenne, és a dezakti* válódás (a hatás megszűnése) felezési ideje 230 ± 19 perc. A kísérletek során a görbe extrapolálás azt jelzi, hogy a hepatikus glükóz - kibocsátás értéke csak 6 óra múlva tér vissza az alapértékre. Bár a hormon 90 perc alatt lényegében teljesen eltávozik a keringésből, ennek ellenére a hepatikus glükóz—kibocsátásra gyakorolt hatás 4 órán át fennáll, és valamennyi ilyen hatás még további, legalább 2 órán át megmarad. Ez a megfigyelés megerősíti a humán proinzulin kifejezett hepatik is hatását,amennyiben csökkenti a glükóz tér nelését. Tehát a humán proinzulin nemcsak erősebben hat a májra mint a perifériára,hanem e hatások tartósak,és még akkor is megmaradnak, amikor a hormonnak a plazmában fennálló koncentrációja már erősen lecsökkent. Ennek a ténynek igen nagy a jelentősége a humán proinzulin fontossága tekintetében.

-7193522

A fenti vizsgálatok során tett egyik legfontosabb megfigyelés az, hogy a humán proinzulinnak a hepatikus glükóz—kibocsátásra gyakorolt hatása rendkívül lassan szűnik meg. Mivel a humán proinzuiín nagyobb mértékben hat a hepatikus glükóz - kibocsátásra, mint a perifériás glükóz—felhasználásra, belátható a humán proinzulinnak a cukorbaj kezelésében való gyógyászati jelentősége. Például, a nem inzulintól függő cukorbajban (diabetes mellitus) az anyagcsere egyik lényeges rendellenessége, amely fenntartja a hiperglikémiás (kórosan magas vércukorszintű) állapotot, a megnövekedett hepatikus glükóz-termelés. Nyilvánvaló, hogy ha a humán proinzulint olyan dózisokban adagoljuk, hogy a keringésben koncentrációja körülbelül 1,5—2.10^-12 mól/ml, akkor a nem inzulintól függő cukorbajban szenvedő betegekben a hepatikus glükóz-kibocsátás körülbelül 50 %-kal csökken, ily módon a hepatikus glükóz - kibocsátás a normális értékre esik vissza. A humán proinzulin dezaktiváiódásával kapcsolatos megfigyelések arra utalnak, hogy ha a humán proinzulin ilyen koncentrációjával járó biológiai hatások teljesen kialakultak, akkor e hatások több órán át meg is maradnak. E megközelítés egyik lényeges előnye abban áll, hogy a humán proinzulinnak ez a szintje vagy egyáltalán nem, vagy csak kismértékben befolyásolja a perifériás glükóz-felhasználást, még abban az esetben is, ha ugyanakkor a hepatikus glükóz-kibocsátás körülbelül 50 %-kal csökkenne. Mivel a humán proinzulinnak ez a koncentrációja még nem serkenti észrevehető mértékben a glükóz -felhasználást, kicsi az esély arra, hogy hipoglikémia (kórosan alacsony vércukorszint) lépjen fel.

Ha humán proinzulint folyamatos szubkután infiízió vagy egyszeri szubkután injekció formájában adagolunk, és így körülbelül 3 órán át 1.5 — 2.10^-12 mól/ml humán proinzulinszintet tartunk fenn, a hepatikus glükóz-kibocsátás körclbelül 50%-kal csökken, a plazma glükózszintje a gyógyászatilag elfogadható értékre esik vissza, és a hipoglikémia veszélye minimális. Továbbá, a humán proinzulinnak a hepatikus glükóz-kibocsátásra gyakorolt hatásának dezaktiválási kinetikája alapján várható, hogy a hepatikus glükóz-kibocsátás és a plazma glükózszintje több órán át elfogadható értéken marad. Egy ilyen kezelés 8 — 10 órán át megfelelő értéken tartja a vércukorszintet. így többféle lehetőség kínálkozik arra nézve, hogy a humán proinzulint a táplálékkal, más orális hatóanyagokkal vagy inzulinnal együtt adagolva alkalmazzuk a nem inzulintól függő cukorbaj kezelésében.

Például adagolhatjuk a humán proinzulint éjszakára, és így a vércukorszintet a hipoglikémia veszélye nélkül szabályozhatjuk, és így az éhezés hatására kialakuló glükózszint reggel is elfogadható lesz. Ezenkívül a nap folyamán az étrenddel, orális hatóanyagokkal vagy akár nappal adagolt inzulinnal szabályozhatjuk a vércukorszintet, majd éjszakára újra humán proinzulint alkalmazhatunk.

Hasonló módon kezelhetjük az I. típusú cukorbajos betegeket is, bár így adott esetben a fentivel egyidejűleg inzulin - kezelés is szűk- ' j séges lehet. Az ilyen betegeknél a humán N proinzulinnak a hepatikus glükóz - kibocsátásra gyakorolt erős és tartós hatása miatt a · humán inzulin és a humán proinzuiín kombinációjával végzett kezelés útján csökkenthetjük a szükséges inzulin mennyiségét és ami még fontosabb, egyenletesebbé tehetjük az inzulinnak a vércukorszintre gyakorolt szabályozó hatását. így a vércukorszint kisebb hullámzást mutat, és ezáltal könnyebben lehet a napi egy vagy két inzulin — injekcióval kezelt,

I. típusú cukorbajos betegek vércukorszintjét szabályozni. Továbbá, a folyamatos szubkután irzulin - infúzióval kezelt, I. típusú betegek 3 esetében kisebb a humán proinzuiín - egyen- >

é ték és inzulin összmennyisége, amelynek , a szövetek ki vannak téve. Ez a hiperinzulinémia szempontjából fontos, amely a folyamatos szubkután inzulin - infúzióval kezelt betegeknél felléphet.

Claims (1)

1. Eljárás cukorbaj kezelésére alkalmas , gyógyszerészeti készítmény előállítására, melynek során

   40 a) proinzulint kódoló DNS - szekvenciával j rendelkező, rekombináns DNS - technikával előállított E. coli törzset fermentációs körül- J rtények között tenyésztünk, és a kapott proinzulint elkülönítjük,

   45 b) a proinzuiín peptid - szekvenciájának megfelelő, a peptidkémiában ismert védőcsoportokka! védett termékről elhasítjuk a védőcsoportokat, vagy ( ) a proinzuiín lineáris peptid -szekvenciájá50 nak megfelelő, -SH csoportokat tartalmazó pepiidben létrehozzuk a diszulfid—kötéseket, azzal jellemezve, hogy a kapott humán proinzulint legalább egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyaggal, adott esetben

   55 xétértékű cinkion— forrással és/vagy protaTiinnal keverve szokásos dózisformává, célszerűen oldat vagy injekció formává alakítunk.

   Rajz nélkül

   Kiadja: Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető

   Ν» 673. Nyomdaipari vállalat, Uzsgorod