HU190915B - Process for preparing new tripeptide derivatives - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás fájdalomcsillapító hatású új tripeptid-származékok előállítására.

Újabban morfinszerű tulajdonságokkal rendelkező endogén vegyületeket vontak ki emlős agyból vagy agyvízből. Ezeket az enkefalinnak nevezett vegyületeket Hughes és munkatársai [Natúré 258, 577 (1975)] azonosították, mint a következő szerkezetű pentapeptideket:

H-Tyr-Gly-GIy-Phe-Met-OH,

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH.

Ezeket a vegyületeket metionin-enkefalinnak, illetve leucin-enkefalinnak nevezik.

Habár a metionin- és leucin enkefalinról kimutatták, hogy intracerebroventikulárisan beadva fájdalomcsillapító hatást fejtenek ki egérben [Buscheret al.. Natúré, 261, 423 (1976)], gyakorlatilag semmi hasznos fájdalomcsillapító hatást nem mutatnak parenterális adagolás esetén.

Ennélfogva az enkefalinok felfedezése óra sok energiát szenteltek enkefalin-analógok előállítására, abban a reményben, hogy olyan vegyületeket találnak, melyek parenterális vagy szájon át történő adagolás esetén is megnövekedett aktivitással és gyakorlati haszonnal rendelkeznek.

Dutta és munkatársai [Life Sciences 21, 559-562 (1977)] beszámolnak bizonyos szerkezeti módosításokról, melyekről azt állítják, hogy megnövelik a hatást. Úgy vélik, hogy a következő módszerek egyikével vagy az összessel együtt az aktivitás növelhető:

a) A 2, helyzetben lévő Gly helyettesítése bizonyos D- vagy <7-aza-aminosavakkal;

b) A terminális karboxilesöpört átalakítása metilészterré vagy amiddá;

c) A 4. helyzetben levő Phe módosítása «-aza helyettesítéssel N-metilezéssel vagy az aromás gyűrű hidrogénezésével.

Ezenkívül Roemer és munkatársai [Natúré, 268, 547-549 (1977)] hasznos módosításként a Mcf megfelelő karbinollá alakítását, valamint a Met kénjének szulfoxiddá oxidálását javasolják.

Más jelentős szerkezeti módosítást a 4 322 342 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölnek. Ez a közlemény azenkefalin analógok aktivitásának és biológiai hozzáférhetőségének növelésére a 2-es helyen vagy D-aminosav-maradék beépítését, a terminális karboxilcsoport amiddá alakítását és az 5-ös helyen lévő aminosav-maradék Nalkilezését javasolja.

Kiso és munkatársai [Naturwissenschaften. 68 210-212 (1981)] karbinollal végződő tetrapeptideket írnak le, például Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OL, Tyr-DMet-(O)-Gly-Phe-OL és rokon szerkezeteket.

A találmány tárgya eljárás új (I) általános képletű, fájdalomcsillapító hatású vegyületek előállítására. Ezek a vegyületek az enkefalin tetrapeptidek analógjai, melyekben a C-terminális aminosavat metil-vagy etil-ketonnal helyettesítjük.

Az (I) általános képletű tripeptid-származékokban vagy azok farmakológiailag elfogadható savaddíciós sóiban

R jelentése hidrogénatom,

R, jelentése hidrogénadom vagy 1-3 szénatomszámú primer alkilcsoport, és

Z jelentése metil- vagy etilcsoport.

E vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy az (I) általá2 nos képletű, megfelelően védett peptidról a védőcsoportot vagy védőcsoportokat a peptidl.émiában ismert módszerekkel lehasítjuk, és kívánt esetben egy kapott szabad tripeptid-származékot farmakológiailag elfogadható savaddíciós sójává alakítunk.

A farmakológiailag elfogadható savaddíciós sók. idetartozhatnak szerves és szervetlen savaddíciós sók, például a sósav, kénsav, szulfonsav, borkösav, fumársav, hidrogén-bromid, glikolsav, citromsav, maleinsav, foszforsav, borostyánkősav, ecetsav, salétromsav, benzoesav, aszkorbinsav, p-toluol-szulfonsav, benzol-szulfonsav, naftalin-szulfonsav vagy propionsav sói. Az előnyös tulajdonságú savaddíciós sók a hidrokloridok, acetátok vagy tartarátok. A fenti sók bármelyikét hagyományos módszerekkel készítjük.

A találmány szerinti vegyületek lényeges tulajdonsága a sztereokonfigurációja. Kényelmi szempontból a találmány szerinti tetrapeptidek aminosav-maradékait a terminális aminofunkciót hordozó maradéknál kezdve egymás után számozzuk. Az 1-es helyből a 4es felé haladva az aminosav-maradékok kiralitása L. D. semmi és L. A 3-as helyen levő maradék egy glicin egység, így ennek a maradéknak nem létezik kiralitása.

Az R, „1-3 szénatomszámú primer alkil kifejezés alatt metil-, etil- és n-propil-csoportot értünk.

Az (I) általános képletű vegyület 4-heIyzetében levő csoport nem aminosav-maradék, hanem az L-fenilalaninnak megfelelő keton. Az így meghatározott, és a molekula megmaradó részéhez -NR,-en keresztül kapcsolódó csoport 2-oxo-l-benzil-propil- vagy 2oxo-1-be nzil-butil-csoport.

A következő, általában jól ismert és a szakterületen alkalmazott rövidítéseket használjuk:

Abu	- «-aminovajsav
Alá	- alanin
Cys	- cisztein
Cys(Me)	- S-metil-cisztein
Cys(Me)(O)-(S-metil)-cisztein-szulfoxid
Gly	- glicin
Gly(Al)	- allilglicin
Gly(Cp)	- ciklopropil-metil-glicin
Hse	- homoszerin
He	- izoleucin
Leu	- leucin
Met	- metionin
Met(O)	- metionin-szulfoxid
Nle	- norleucin
Nva	- norvalin
Phe	- fenilalanin
Ser	- szerin
Ser(Me)	- O-metilszerin
Thr	- treorin
Tyr	- tirozin
Val	- valin
Ac	- acetilcsoport
AcOMe	- acetoxi-metil-csoport
Al	- allilcsoport
Cp	- ciklopropil-metil-csoport
Me	- metilcsoport
Et	- etilcsoport
Ip	- izopropilcsoport
Pr	- n-propilcsoport
OMe	- metoxicsoport

190.915

Etm - etiltiometil-csoport

Fle - 2-fluor-etil-csoport

Ppg - propargilcsoport

Bu - n-butilcsoport i-Bu - izobutilcsoport t-Bu - terc-butil-csoport s-Bu - szek-butil-csoport

Boc - t-butiloxi-karbonil-csoport

Bzl - benzilcsoport

Cbz - benziloxi-karbonil-csoport

DCC - N.N'-diciklohexil-karbodiimid

HBT - 1-hidroxi-benzotriazol

DMF - N.N-dimetilformamid

TFA - trifluorecetsav

THF - tetrahidrofurán

DEAE - dietilaminoetil

NMM - N-metilmorfolin

IBCF - izobutil-klórformiát

18-korona-6-1.4,7,10,13,16-hexaoxaciklooktadekán.

A jelen találmány szerinti vegyületeket a peptidszintézis rutinmódszereivel állítjuk elő. A vegyületek némelyikénél a szintézis során részleges racemizáció lehetséges. A racemizáció mértéke azonban, ha elő is fordul, nem olyan nagy, hogy lényegesen megváltoztassa a találmány szerinti vegyületek fájdalomcsillapító hatását.

A találmány szerinti kiindulási vegyületeket a klasszikus folyadékfázisú szintézissel vagy szilárd fázisú peptid-szintézissel állíthatjuk elő. A szilárd fázisú módszernél a peptidláneot gyanta alapot, rendszerint /?-metil-benzhidrilamin-gyantát vagy polisztirol gyantát használva egymás után építjük ki. A terméket 0 °C-on hidrogén-fluoriddal vagy ecetsavval hasítjuk le a gyantáról, és tisztítjuk általában kromatográfiás módszerrel. Hasítás után a karboxil-terminális véget az alábbiakban leírt módon kezeljük a megkívánt ketocsoport létrehozására, ügyelve arra, hogy megfelelően megvédjünk más reaktív helyeket a peptidmolekulában. Az oldatfázisú szintézisben a peptidláneot a különböző aktivált és védett aminosavakat reagáltatva hozzuk létre, majd a megmaradó védőcsoportokat eltávolítjuk, például trifluor-ecetsavval (TFA), p-toluol-szulfonsavval (TSA), benzolszulfonsavval (BSA), metán-szulfonsavval, sósavgázos jégecettel vagy hangyasavval. A karbóniumionok eltávolítására alkalmas anyag általában azanizol, tioanizol vagy trietilszilán, előnyösen anizol. Minden reakció-körülmény hagyományos és a gyakorlott peptidkémikus számára jól ismert. A TFA-reakció hőmérséklete például körülbelül-10 °C-tóI + 30 °Cig terjed.

Bármelyik módszert is használjuk, a kiindulási anyagok előállítása során az aminosavakat vagy peptidfragmenteket kapcsoljuk, az egyiknek a karboxil funkciós csoportját, a másiknak az amin funkciós csoportjával reagáltatva, így amidkötést kapunk. Hogy a kapcsolást hatékonyan végre tudjuk hajtani, kívánatos, hogy először az összes, a reakcióban közvetlenül részt nem vevő reakcióképes funkciós csoportot megfelelő blokkoló csoportok használatával megvédjük, és másodszor, a kapcsolni kívánt karboxil funkciós csoportot megfelelően aktiváljuk, hogy lehetővé tegyük a csatolási reakció lejátszódását. Ez magában foglalja mind a reakció-sorrend, mind a reakció-körülmények körültekintő megválasztását, valamint specifikus védőcsoportok használatát, hogy a kívánt peptidtermék keletkezzen. A találmány szerinti vegyületek előállításában alkalmazott, egyenként védőcsoportokat vagy aktivált funkciós csoportokat tartalmazó aminosavakat a peptidkémia szakterületen jól ismert módszerekkel állítjuk elő.

A találmány szerinti vegyületek totál-szintézisének minden egyes pontjában védőcsoportok kiválasztott kombinációit alkalmazzuk. Ezeket az egyes kombinációkat választva játszódik le a reakció legelőnyösebben. így például benziloxi-karbonil, r-buti'oxi-karbonil, f-aniloxi-karbonil.p-metoxi-benziloxikarbonil, adamantiloxi-karbonil és izoborniloxi-karbonilcsoportok használhatók a jelen találmány szerinti vegyületek szintézisében amino-védőcsoportokként. Továbbá általában a benzil- (Bzl) csoportot használják a tirozilmaradék hidroxil-védőcsoportjaként, jóllehet más csoportok, példáulp-nitro-benzili PNB) vagy p-metoxi-benzil (PMB) csoport is használható.

A találmány szerinti vegyületek előállítása során használt karboxi-védőcsoport lehet bármely tipikus észterképző csoport, ideértve például a metil-, etil-, benzil-, p-nitrobenzil-, p-metoxibenzil vagy 2,2,2triklór-etil-csoportokat.

A találmány szerinti vegyületek előállítása során a megfelelően védett, N-védett aminosav vagy peptidfragment összekapcsolása - egy megfelelően karboxi'édett aminosavval vagy peptidfragmenttel - abból all, hogy az aminosav vagy peptidfragment szabad funkciós karboxilcsoportját a kapcsolási reakcióhoz aktiváljuk. Ezt a számos jól ismert technika bármelyikével végrehajthatjuk. Egy ilyen aktiválási módszer abból áH, hogy a funkciós karboxilcsoportot vegyes anhidriddé alakítjuk. A szabad funkciós karboHlcsoportot másik savval, tipikusan egy karbonsavszármazékkal, például savkloriddal reagáltatva akti\ áljuk. A vegyes savanhidridek előállítására használható savkloridokra példa az etil-klór-formiát, fenilHór-formiát, xzek-butil-klór-formiát, izobutil-klórformiát vagy pivaloil-klorid. Előnyösen az izobutilklór-formiátot használjuk.

A karboxilcsoportnak a csatolási reakció végrehajtásához való aktiválására másik módszer a megfelelő aktív-észter származékká való átalakítás. Az ilyen aktív-észterek közé tartozik például a 2,4,5-triklórfenil-észter. pentaklórfenil-észter vagy a p-nitrofenilészter. Más, a gyakorlatban alkalmazható kapcsolási módszer a jól ismert azidcsatolási módszer.

A találmány szerinti vegyületek előállításában előnyösen használt csatolási módszerben az N,N’-dicikIohexíl-karbodiimidet (DCC) használjuk a szabad karboxil funkciós csoport aktiválására. Ezen aktiválási és kapcsolási technika során úgy járunk el, hogy az aminosavra vagy peptidfragmentre számítva ekvimoláris mennyiségű DCC-t használunk, és a reakciót ekvimoláris mennyiségű 1-hidroxí-benzotriazol (HBT) jelenlétében hajtjuk végre. A HBT jelenléte visszaszorítja a nemkívánatos mellékreakciókat, beleértve a racemizáció lehetőségét.

A találmány szerinti vegyületek előállításában alkalmazott szintézis-sor bizonyos pontjainál szükséges a kiválasztott védőcsoportok lehasítása. A pep3

190.915 tidszintézisben átlagos gyakorlattal rendelkező vegyész könnyen képes a védőcsoportok közül olyanokat választani, melyek abból a szempontból kompatibilisek, hogy a termék szelektív hasítását úgy hajtjuk végre, hogy az aminosavon vagy peptidfragmenten jelenlévő védőcsoportok közül egyet vagy többet, de nem az összesét távolítjuk el. Ezek a módszerek jól ismertek a peptidkémia területén. A szelektív hasításra használható módszerek részletesebb tárgyalását megtaláljuk Schröder és Lübke könyvében [The Peptides, Volume I, Academic Press, New York (1965)] (Lásd főleg a 72-75. oldalon lévő táblázatot.)

A karboxil védőcsoportok lehasítását végrehajthatjuk lúgos szappanosítással. Viszonylag erős lúgos körülményeket tipikusan alkálifém-hidroxidot, úgymint nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot vagy lítium-hidroxidot használunk, általában a védett karboxilcsoport deblokkolására.

A szappanosítás végrehajtásának körülményei jól ismertek a szakterületen. Számos karboxil védőcsoportot katalitikus hidrogenolízissel is eltávolíthatunk, például hidrogenolízissel katalizátor, úgymint csontszenes palládium jelenlétében. Továbbá azokban az esetekben, mikor a karboxil védőcsoport pnitrobenzil vagy 2,2,2-triklór-etil-csoport, a hasítást cink-sósavas redukcióval hajthatjuk végre. Ezenkívül a karboxil védőcsoportokat enzimes hasítással is eltávolíthatjuk.

Számos amino védőcsoport lehasad, ha a védett aminosavat vagy pepiidet savval, például hangyasavval, trifluor-ecetsavval (TFA), p-toluol-szulfonsavval (TSA), benzol-szulfonsavval (BSA) vagy naftalin-szulfonsavval kezeljük. Ilyenkor a megfelelő savaddíciós só termék képződésével. Más védőcsoportok lehasítását a védett aminosavat vagy peptideket hidrogén-bromid-ecetsav keverékkel kezelve végezzük, így kapjuk a megfelelő hidrogén-bromid savaddíciós sót. Az alkalmazott módszer vagy reagens a specifikus hasítási reakcióban résztvevő anyagok kémiai vagy fizikai jellemzőitől függ. A kapott savaddíciós sót gyógyászatilag elfogadhatóbb formává alakíthatjuk megfelelő ioncserélő gyantával, úgymint DEAE Sephadex A25, Amberlite A 27 és hasonlókkal kezelve.

A hidroxil védőcsoportot az előállítás során végig meghagyhatjuk a peptiden, és az utolsó szintézis-lépésben, az amino-blokkoló csoport hasítása során távolítjuk el. Azonban a karboxi védőcsoport eltávolításánál használt körülményektől függően, az előállítás során előbb is eltávolíthatjuk. Ha a karboxiesoportot lúgos szappanosítással hasítjuk le, a hidroxi védőcsoport megmarad, ha azonban a karboxi-védőcsoport eltávolítására katalitikus hidrogénezést használunk, a hidroxi-védőcsoport is lehasad. Az utóbbi helyzet nem okoz komoly problémát, mivel a jelen találmány szerinti vegyületeket védetlen tirozil-maradék jelenlétében is előállíthatjuk.

A találmány szerinti vegyületek előállítására előnyösen alkalmazott speciális módszer abban áll, hogy a 2- és 3-helyzetben lévő aminosav-maradékokból álló dipeptidet kapcsoljuk a C-terminális aminosavhoz, majd a kapott tripeptidet kapcsoljuk az N-terminális tirozinnel. A C-terminális aminosavnak olyan szerkezete lehet, hogy a metil- vagy etil-keton-egységet is tartalmazza.

Az általános sorrendet az alábbi A reakcióvázlaton mutatjuk be. A reakcióvázlatban a Z betű jelentése a C-terminális egység, AA jelentése aminosav-maradék, és az AA jel melletti szám az aminosav helyzetét jelöli a végső peptid-termékben.

A fenti séma a találmány szerinti vegyületek előállításának csak egyik lehetséges sorrendjét mutatja. Egy eltérő eljárás során külön előállított N-terminális tripeptidet kapcsolunk egy külön előállított C-terminális metil- vagy etil ketonnal, majd a megmaradt védőcsoportokat megfelelő módszerrel eltávolítjuk. Másik használható oldószeres módszerben a C-terminális metil- vagy etil-keton egységgel kezdődő peptid-láncot lépésenként, az egyes aminosavak egymás utáni hozzáadásával állítjuk elő. A fentiekben ismertetett reakció-technikát az ismertetett, valamint bármely más tervezett előállítási eljárásban használunk. Bármely N-monoszubsztituált aminosavat előállíthatunk N-védett aminosavat használva kiindulási anyagként a következő B reakcióvázlat alapján.

Mint a B reakciósorban látható, az amminosavat először kálium-hidriddel kezeljük megfelelő koronaéter jelenlétében a di-anion előállítására. A közbenső terméket a megfelelő allil-, ciklopropil-metil-, propargil-, etil-tio-metil-, 2-fluor-etiI- vagy alkil-jodiddal kezelve kapjuk a kívánt N-szubsztituált aminosavat.

A peptid-szintézisben átlagos gyakorlattal rendelkező szakember felismeri, hogy a fenti alkilezési eljárásban alkalmazott erősen lúgos körülmények között előfordulhat az α-szénatom racemizációja. A racemizálás mértéke az érintett aminosavtól függően változhat. A racemizációt minimálisra csökkenthetjük az alkilező szer feleslegben való alkalmazásával, valamint a lehető legrövidebb reakcióidő alkalmazásával. Mindazonáltal, ha elő is fordul a racemizáció, a terméket a d-(+)-ct-fenil-etilamin sójaként átkristályosítva tisztíthatjuk.

A találmány szerinti vegyületek értékes gyógyászati anyagok. Fájdalomcsillapító és neuroleptikus hatást is mutatnak. Különösen hasznosak fájdalom csillapításában és érzelmi zavarok enyhítésében, ha parenterálisan vagy szájon át emlős állatoknak-ideértve az embert is - adják be.

A találmány szerinti vegyületeket beadhatjuk tisztán vagy farmakológiailag elfogadható hordozóval kombinálva, mely utóbbi arányát a vegyület oldhatósága és kémiai természete, az adagolás választott módja és az elfogadott gyógyászati gyakorlat határoz meg.

Azok az előnyösen használható készítmények, melyek alkalmasak parenterális, azaz intramuszkuláris, intravénás vagy szubkután adagolásra. Ide tartoznak a steril, injektálható oldatok vagy szuszpenziók, valamint a steril injektálható depó vagy lassan felszabaduló készítmények. Különösen kényelmes a steril, injektálható oldatokat izotóniás só vagy izotóniás szőlőcukoroldatban készíteni. A steril injektálható készítményeket felhasználásra készíthetjük el és tárolhatjuk vagy közvetlenül felhasználás előtt készítjük el, az ismert súlyú steril hatóanyaghoz, melyeket a hatóanyag sterilitásának megtartása érdekében steril hordozóban, úgymint üvegben vagy ampullában tartunk, steril közeget, például vizet adunk. Az ismert súlyú steril hatóanyag tartalmazhat annyi steril

190.915 szőlőcukrot vagy nátrium-kloridot, hogy a steril közeg hozzáadása után izotóniás oldatot vagy szuszpenziót kapjunk.

Előnyösen használható készítmények még azok, melyek szájon át történő adagolásra alkalmasak. Ezeket külön egységekben állíthatjuk elő, az aktív adalékból előre meghatározott mennyiséget tartalmazó kapszulák vagy tabletták formájában. Előállíthatjuk por vagy granulátum formájában, vizes vagy nem vizes közegben, oldatként vagy szuszpenzióként vagy emulzióként.

A tablettát általában egy vagy több kiegészítő adalékanyaggal sajtolva állíthatjuk elő. A tabletták előállítása során az aktív adalékanyagot szabadonfolyó formában, úgymint por vagy granulátum, általában egy vagy több adalékanyaggal, úgymint kötőanyagokkal, csúsztatókkal, semleges hígítóanyagokkal, kenőanyagokkal, felületaktív anyagokkal, pufferokkal, illatanyagokkal, vastagítókkal, konzerválószerekkel vagy adagolóanyagokkal keverve sajtolással készítik.

A találmány szerinti vegyületek legmegfelelőbb dózisát orvosok határozzák meg. A kiválasztott dózisok az adagolás módjától, az éppen adagolt hatóanyagtól, a kezelés alatt álló betegtől és a kezelés módjától függenek. Parenterális adagolás esetén azonban a dózis általában 0,1 yzg-2 mg/testsúlykilogramm között változik, előnyösen 10-100/ig/testsúly-kilogramm között változik intramuszkuláris vagy szubkután adagolás esetén, intravénás adagolás esetén 0,1 /zg-200 /<g/testsúlykilogramm között, előnyösen 1 ^g-50 /zg/testsúlykilogramm között változik. Szájon át történő adagolás esetén a dózis 100 wg100 mg között változik a befogadó testsúlykilogrammjára számítva, előnyösen 500 ^g-50 mg/testsúlykilogramm, még előnyösebben 1 mg-10 mg/testsúlykilogramm között.

A találmány különböző szempontjainak további bemutatására a következő, nem korlátozó jellegű példákat adjuk meg.

1. példa

L-Tirozil-D-alanil-N-(2-oxo-l-benzil-propil)-glicinamid acetát só előállítása

A) 3-(férc-butiloxi-karbamido)-4-feniIbután-2-on.

15,9 g (0,06 mól) N’-íerc-butiloxi-karbonil-L-fenilalanin 100 ml vízmentes éterben, szobahőmérsékleten kevert oldatához nitrogén-atmoszféra alatt, 13,0 ml (0,13 mól) 1 yV-metil-lítiumot adunk cseppenként, 30 perc alatt. A kapott keveréket további 6 órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd cseppenként 25 ml vizet adunk hozzá. A reakcióelegyet vízzel és etilacetáttal hígítjuk, majd a kapott keveréket választótölcsérbe helyezzük. Az etilacetátos réteget elválasztjuk, és 1,5 n citromsavval, majd vízzel mossuk. Az etilacetátos oldatot vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson besűrítve olajat kapunk. Az olajat 10x2 cm-es, Grace and Davidson 62 minőségű szilikagél diklórmetános szuszpenziójából készült oszlopra visszük. Az oszlopot lépcsőzetes diklórmetán-kloroform gradienssel eluáljuk (diklórmetán - diklórmetán:kloroform 50:50 elegye). A kapott leoldott frakciókat a vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) profil alapján egyesítjük. Az oldószer lepárlása után 2,8 g (az elméleti termelés 18%-a) olajat kapunk.

[a]²⁵- 7,45° (c = 0,5; MeOH)

A) C₁₅H,,NO, (263,3)-ra számított elemanalízis: számított: C = 68,42%, H = 8,04%, N = 5,32%; mért: C = 68,14%, H = 7,86%, N = 4,93%.

B) 3-amino-4-fenilbután-2-on sósavas sója

Az A) pontban előállított terméket (4,4 g, 16,7 millimól) 1,0 N sósavat és 5 ml anizolt tartalmazó 50 ml jégecetben oldjuk. Az elegyet szobahőmérsékleten 30 percig kevertetjük, majd etiléterbe öntjük. A kapott csapadékot összegyűjtve és szárítva 3,1 g (93%) címbeli vegyületet kapunk, olvadáspontja 131-134°C.

[a]²⁵ + 34,36° (c = 0,5; MeOH)

A C_WH_I4NOC1 (199,7)-re számított elemanalízis·, számított: C = 60,15%, H = 7,07%, N = 7,01%; mért: C = 60,38%, H = 7,02%, N = 7,06%.

C) N-ferc-butiloxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-N(2-oxo-l-benzil-propil)-glicinamid

2,96 g, 0,5 mmól N-Boc-L-Tyr-D-Ala-Gly-diciklohexil-ammónium-sót szuszpendálunk 20 ml DMFben, majdazelegyet-15°C-rahűtjük. 4cseppNMMet és 0,66 ml (0,5 mmól) IBCF-et adunk gyorsan a kevert, hűtött oldathoz. A következő előállítás során az oldatot -15 °C-on keverjük.

A B) pontból származó terméket (1 g, 0,5 mmól) 5 ml DMF-ben oldjuk. Az elegyet 0 °C-ra hűtjük, és 0,55 ml (0,5 mmól) NMM-et adunk hozzá egy részletben. A kapott elegyet keverve biztosítjuk a reakció teljes lejátszódását. Az elegyet ezután gyorsan a fentiekben elkészített oldathoz adjuk, majd az újonnan keletkezett keveréket 4 órán át-15 °C-on keverjük. A keveréket ezután lassan, körülbelül két nap alatt hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. A kapott csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és a szűrletet csökkentett nyomáson bepárolva olajat kapunk. Az olajat etilacetát és 1 n vizes nátrium-hidrogén-karbonát elegyében oldjuk. A szerves fázist elválasztjuk és egymás után mossuk vízzel, 1,5 n citromsavval, majd vízzel. Az etilacetátos fázist vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson besűrítve 2,3 g címben szereplő vegyületet kapunk olaj formájában.

D) L-tirozil-D-alanil-N-(2-oxo-l-benzil-propil)glicinamid- ace tátsó j a

A C) pontból származó terméket (2,3 g) 15 ml, 3 inl anizolt tartalmazó trifluorecetsavban oldjuk. Az elegyet 0 °C-on 30 percig keverjük, majd liofilezzük. A kapott szilárd anyagot 22% acetonitrilból és 0,1 n ammónium-acetátból álló pufferben oldjuk és ugyanezzel a pufferrel egyensúlyba hozott fázisú szilikagélből készült 4x70 cm-es oszlopra visszük. Az eluátumot 280 nm-en ellenőrizzük. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és liofilezés után 773 mg (37%), a címben szereplő vegyületet kapunk fehér por formájában.

[a²⁵ + 68,97° (c = 0,5; 1 n HCl)

A C₂₆H₃₄N₄O₇ (514,6) összegképlet alapján számított elemanalízis:

számított: C = 60,69%, H = 6,66%, N = 10,89%; mért: C = 60,50%, H = 6,80%, N = 10,93%. Aminosav-elemzés: Tyr = 0,99, Alá = 1,01,

Gly = 0,99, NH₃ = 0,21.

190.915

2. példa

L-tirozil-D-alanil-N-etil-N-(2-oxo-l-benzil-propil)-glicinamid-acetátsó előállítása

A) 3-[N-(etiI-í-butiIoxi-karbamido)]-4-fenilbután-2-on

3,4 g (0,012 mól) N-/ez-c-butiloxi-karbonil-N-etilL-fenilalanint oldunk 100 ml vízmentes éterben szobahőmérsékleten, nitrogén-atmoszférában. Az elegyhez ezután 14,4 ml (0,023 mól) 1,6 m metil-lítiumot adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten 24 órát keverjük, majd 10 perc alatt 10 ml vizet adunk hozzá. A kapott szerves fázist elválasztjuk és 1,5 n citromsavval, majd vízzel mossuk. Az etiléteres oldatot vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson bepárolva 2,6 g olajat kapunk. Az olajat diklórmetánban oldva Grace and Davidson 62 szilikagélt tartalmazó 10x2 cm-es oszlopra visszük. Az oszlopot diklórmetán- és kloroformlépcsős gradienssel eluáljuk (diklórmetán-diklórmetán:kloroform 50:50). A vékonyréteg-kromatográfiás profil alapján egyesítjük a frakciókat. Az oldószer bepárlásaután 1,4 g (40%) címben szereplő vegyületet kapunk.

NMR ó(Boc) 1,5; ó(-COCH₃) 2,2; ó(fenil) 7,2.

B) N''-terc-butiloxi-karbonil-D-alanil-N-etil-N-(2oxo- l-benzil-propil)-glicinamid

Az A) részből származó terméket (1,3 g, 4,5 mmól) oldunk 25 ml 1,0 n sósavgázt és 3,0 ml anizolt tartalmazó jégecetben. A keveréket szobahőmérsékleten keverjük 30 percig, majd etiléter és petroléter elegyére öntjük. A kapott csapadékot összegyűjtve és szárítva 1 g 3-etilamino-4-bután-2-on sósavas sót kapunk. Ezt az anyagot oldjuk 20 ml 1,19 g (4,5 mmól) N-íerc-butiloxi-karbonil-D-alanil-glicint tartalmazó DMF-ben. Az elegyet 0 °C-ra hútjük és 0,9 ml (4,5 mmól) diciklo-hexilamint, 0,61 mg (4,5 mmól) HBT-t és 0,93 mg (4,5 mmól) DCC-t adunk a reakcióelegyhez. Az elegyet 0 °C-on 6 órán át keverjük, majd szobahőmérsékleten 3 napig. Az elegyet ezután 0 °C-ra hűtjük, a csapadékot szűréssel eltávolítjuk, és s szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk. A kapott maradékot etilacetátban oldjuk, majd az etilacetátos oldatot egymás után extraháljuk 1 n nátrium-hidrogén-karbonáttal, vízzel, 1,5 n citromsavval és vízzel. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepárolva 1,3 g (69%) címben szereplő vegyületet kapunk szilárd anyag formában.

C) Nⁿ-rerc-butiloxi-karbonil-L-tirozil-D-alanil-Netil-N-(2-oxo-l-benzil-propil)-glicinamid

A B) pontból származó terméket (1,3 g; 3,1 mmól) 15 ml, 3 ml anizolt tartalmazó trifluorecetsavban oldjuk. Az elegyet 30 percig keverjük 0 °C-on. Az oldószert ezután csökkentett nyomáson, melegítés nélkül bepároljuk. A kapott olajat etiléterrel hígítjuk. A felülúszót dekantáljuk, és a kapott olajat csökkentett nyomáson szárítjuk.

871 mg (3,1 mmól) N^a-íerc-butiloxi-karbonil-L-tirozint oldunk 10 ml DMF-ben, és az oldatot -15 ’Cra hűtjük. A kevert DMF oldathoz 0,34 ml (3,1 mmól) NMM-et és 0,41 ml (3,1 mmól) IBCF-et adunk. Az oldatot a további reakcióig -15 °C-on keverjük.

A fentiekben készített trifluoracetát sót 5 ml DMF-ben oldjuk, és az oldatot -15 °C-ra hűtjük. 6

0,34 ml (3,1 mmól) NMM-et adunk hozzá egy részletben, és az oldatot a reakció teljes lejátszódásáig keverjük. Ezt az oldatot adjuk az előzőleg elkészített, kevert anhidridhez. A kapott keveréket 4 óráig -15 °C-on, majd 24 óráig szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet 1 π vizes nátrium-hidrogén-karbonátoldatba öntjük, és a vizes oldatot etilacetáttal extraháljuk. A szerves fázist elválasztjuk, majd vízzel, 1,5 n citromsavval és újra vízzel extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, és csökkentett nyomáson bepárolva 1,2 g (66%) címben szereplő vegyületet kapunk olaj formában.

D) L-tirozil-D-alanil-N-etil-N-(2-oxo- 1-benzilpropil)-glicinamid-acetátsója

A C) pontból származó terméket (1,2 g) 20 ml 3 ml, anizolt tartalmazó trifluorecetsavban oldjuk, és az elegyet 0 °C-on 30 percig keverjük. Az elegyet ezután liofilezzük. A kapott szilárd anyagot annyi pufferban (20% acetonitril, 0,1 m ammónium-acetát pH 4,0) oldjuk, hogy 9,0 ml oldatot kapjunk. Az oldatot ugyanezzel a pufferral szuszpendált reverz fázisú szilikagélt tartalmazó 4x70 cm-es oszlopra visszük. Az eluátumot 280 nm-en ellenőrizzük, és a megfelelő frakciókat egyesítjük, majd liofilezve fehér, szilárd anyagot kapunk. A terméket 10 ml 0,2 m ecetsavban oldjuk, és az oldatot 2,5x90 cm-es Sephadex G-10 oszlopra visszük. Az oszlopot 0,2 m ecetsavval eluáljuk, és az eluátumot 280 nm-en ellenőrizzük. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és liofilezve 509 mg (46%) címbeli vegyületet kapunk fehér, szilárd anyagként.

[a]²⁵ + 28,3 (c = 0,5;MeOH)

A C₂₈H_3sN₄O₇ (542,6) összegképlet alapján számított elemanalízis:

számított: C = 61,98%, H = 7,06%, N = 10,33%; mért: C = 62,00%, H = 7,23%, N = 10,56%. Aminosav-elemzés: Tyr = 1,01, Alá = 1,01,

Gly = 0,98, ΝΗ₃ = 0,12.

A találmány szerinti vegyületek fájdalomcsillapító hatását az egérforró-lap teszttel mutatjuk ki. Ebben a vizsgálatban egy függőleges műanyag henger aljában egy 55 °C-on tartott forró lap található. Egy Harlan ND4 egérnek szubkután injekcióval előre meghatározott mennyiségű, megfelelő hordozóban oldott vagy szuszpendált tesztvegyületet adunk be, és 15 perccel a beadás után az egeret a forró lapra helyezzük. Azt az időt mérjük, ami az egérnek forró lapról való felugrásáig eltelik. Egy fájdalomcsillapító hatású vegyület megnöveli ezt az időtartamot a csak hordozót kapott kontroll egerekkel szemben. Ennek olyan dózistartományban kell megtörténnie, mely még nem okoz inkoordinációt vagy tehetetlenséget. A következő táblázat az ebből a tesztből származó ED₅₀ értékeket mutatja be. Az „ED₅₀” kifejezés azt a dózist jelenti, mely a vizsgált egerek 50%-ánál fájdalomcsillapító hatású. A fájdalomcsillapítást úgy határozzuk meg, mint azt a válaszbeli késést a vizsgált vegyület jelenlétében, mely egyenlő vagy nagyobb, mint a kontroll válasz-késés plusz két standard deviáció. A százalékos fájdalomcsillapítási adatokat probitokká alakítjuk, és az ED₅₀-et a dózis-válasz adatok regressziós analízise alapján számoljuk ki. Miután a dózis-válasz görbének legalább négy pontot kell tartalmaznia, és mindegyik pontot minimum tíz kezelt egér és tíz kontroll egér adatai alapján határozzuk meg.

-611

190.915

A fájdalomcsillapító hatással kapcsolatban a találmány szerinti vegyületek az enkefalin (ő) receptornál fejtenek ki hatást. Az enkefalin (ó) receptor-aktivitást az elismert egér-ondóelvezetőcső teszttel mutatjuk ki.

Az egér-ondóelvezető tesztben felnőtt egerek (Harlan ND4, 30-40 g) ondóelvezető csövét függesztjük fel 3 ml módosított, 95% O₂-5% CO,-vel levegőztetett Krebs-oldatban, és 37 °C-on tartjuk.

A mezőgerjesztéssel (0,15 Hz, 1 msec, 40 V) indukált összehúzódást izometríkus átalakítón keresztül poligráfon rögzítjük. A tesztvegyületet 20-30 μΐ-es alikvotokban adjuk a fürdőhöz. A dózis-hatás görbét a megfelelő mennyiségű vegyületnek a fürdőbe való kumulatív hozzáadásával szerkesztjük. A ó-receptornál a relatív agonista potenciál összehasonlítását az IC₅₍,-értékek alapján végezzük (az elektromosan kiváltott összehúzódás 50% csökkenését okozó koncentráció).

A következő táblázatban a találmány szerinti vegyületeknek az egér-ondóelvezető tesztben mutatott eredményei is láthatók:

H-L-Tyr-D-Ala-Gly-L-QV-R)Phe-Me

Vegvület	Egérugrás	Egér-ondóelvezető
R	EDS(I mg/kg	(receptor) !C,„.nM
H	3,2	0,49
Et	0,006	0.71

Szabadalmi igénypont

Claims (1)

1. Eljárás az (I) általános képletű peptid, vagy annak farmakológiailag elfogadható savaddiciós sói előállítására, ahol

   R jelentése hidrogénatom,

   15 Rj jelentése hidrogénatom vagy 1-3 szénatomszámú primer alkilcsoport, és Z jelentése metil- vagy etilcsoport, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű, a peptidkémiában ismert módon védett pepiidről a védő20 csoportot vagy védőcsoportokat lehasitjuk, és kívánt esetben egy keletkezett szabad vegyületet farmakológiailag elfogadható savaddiciós sójává alakítunk.