HU190751B

HU190751B - Process for producing mixotroph tissue-cultures and herbicide-resisting plants

Info

Publication number: HU190751B
Application number: HU84152A
Authority: HU
Inventors: Agnes Hu Cseploe; Peter Hu Medgyesy; Laszlo Hu Menczel; Laszlo Hu Marton; Pal Hu Maliga
Original assignee: Mta Szegedi Biologiai Koezpont
Priority date: 1984-01-16
Filing date: 1984-01-16
Publication date: 1986-11-28
Also published as: ES8601646A1; DK418185A; IT1183269B; HUT37648A; WO1985003085A1; DK418185D0; JPS61501187A; IT8519118A0; ES539629A0; EP0169230A1; IT8519118A1

Description

A vegyszeres gyomirtás egyik legnagyobb problémája, hogy a gyomirtószerek (herbicidek) általában nemcsak a gyomokat, hanem a haszonnövényeket is károsítják. Λ szelektivitás biztosítására számos megoldással próbálkoznak. Így például a herbicidet csak preemergensen (vetés után, kelés előtt) használják, vagy magasnövésű haszonnövény esetén irányított permetezéssel biztosítják, hogy a herbicid csak a gyomra jusson. Fel lehet használni a haszon- és a gyomnövények közötti morfológiai, fiziológiai, biokémiai különbségeket is, amennyiben ezek azt eredményezik, hogy az adott herbicid és módszer mellett a haszonnövény jóval kevésbé érzékeny a gyomoknál. Ezek a módszerek főleg a gabonaféléknél váltak be, viszont éppen emiatt a legveszélyesebb gyomnövények (kakaslábfű, CBillagpázsit, vadcirok) is az egyezíküekhez tartoznak. A kiszorított gyomok helyére ugyanie gyorsan benyomulnak azok a gyomfélék, amelyek az adott haszonnövényhez hasonló tulajdonságaik miatt elkerülik a herbicidkezelés károsító hatását. Leginkább a kukorica vegyszeres gyomirtása tekinthető megoldottnak, idetartozó probléma viszont, hogy vetésforgó alkalmazásakor a korábban gyomirtöszerrel kezelt területre a legtöbb haazonnövényfaj nem vethető, mert elpusztulnak, vagy jelentős terméscsökkenést mutatnak (Varga, M. JATE Növényélettani Tanszéke, Szeged].

A szelektivitás megbízható módja az lenne, ha az egyes haszonnövények genetikailag lennének rezisztensek a herbicidekre.

Új tulajdonságú növények előállításának messze leghatékonyabb módja a sejttenyészetben történő mutánsizolálás [Maliga, P., Int. Rév. Cyt. Suppl. 11A, 225-250 (1980)]. A növényi sejtek totipotensek, azaz egyetlen növényi sejtből is újra regenáltatható a teljes nővény. Ezért sejttenyészetben néhány Petri-CBészényi területen potenciális növények millióit lehet tesztelni. Ez különösen fontos lenne a herbicidrezisztencia esetében, ahol egy ilyen tulajdonságú nővénymegjelenésének valószínűségét egy a tizmilliárdhoz becsülik (Gressel, J., Outlook on Agriculture 9, 283-287 (1987)].

Ismeretesek szántófőldön véletlenszerűen megjelent herbicidrezisztene gyomok, melyekből e tulajdonságot haszonnövényekbe lehet bevinni. Ezt azonban legtöbbször a fajok közötti ivaros összeférhetetlenség meggátolja. Sejtgenetlkai módszerekkel, amennyiben a herbicidrezieztenciára szövettenyészetben lehet szelektálni, nagy hatékonysággal elvégezhető a tulajdonságátvitel, nem keresztezhető fajok esetében is ÍMaliga, P. és mtsai: Academic Press, New York, 221-237 (1982)1.

A szövette nyészetnek a herbicidek hatásmechanizmusának tanulmányozásában is számos előnye lehet az intakt növénnyel szemben. A szövettenyészetek sterilek, homogének, stacionárius és exponenciálisan növekedő állapotban egyaránt fenntar! hatók, alkalmasak mikrotesztre. Szövettenyészeíben nincsenek felvételi problémák, nem zavarnak szállítási jelenségek és jól követhetők a gyors kinetikája folyamatok ia.

Célszerűnek látszik tehát a lierbicidrozisztens növények előállítására szövettenyésztési módszerek alkalmazása.

Sok herbicid a fotoszintézis gátlásán keresztül fejti ki hatását [Fedtkc, C., Springer-Verlag, Berlin-New York (1983)]. A növények autotrófok, azaz képesek fényenergiát kémiai energiává alakítani, pontosabban fényenergia segítségével széndioxidból és vízből nagyenergiájú vegyületet, cukrot előállítani. Ennek a folyamatnak, a fotoszintézisnek központi eleme egy elektrontranszport-lánc. Az ebben folyó „eiektronáramot gátolják a fotoszinlézisgátló herbicidek, és a növény pusztulását az így keletkező szabad gyökök fotodestrukciós hatása okozza. A klorofillmolekulák lebomlása miatt jellegzetes tünet a kezelt növények elsárgulása, kifehéredése.

A problémát az jelenti, hogy a növényi szövettenyészetek heterotrófok; külső cukorellátás nélkül elpusztulnak. Még a zöld színű szövettenyészetek sem (vagy csak igen kismértékben) fotoszintetizálnak. A fotoszintézisgátló herbicidek ezért szöveltenyészetben, standard laboratóriumi körülmények között (3% cukrot tartalmazó mesterséges táptalaj, 1000-2000 lx megvilágítás) hatástalanok. Pontosabban, csak olyan koncentrációban hatnak, mely sötétben nevelt tenyészetek növekedését. is gátolja, tehát ahol nem az elsődleges, fotoszinlézisgátló hatásról van szó.

A probléma egyik lehetséges megoldása autotróf növényi szövetek előállítása, melyek intenziven fotoszintetizálnak, és ezért cukor távollétében is nőnek. Az ilyen szöveltenyészetek [Yamada, Y. és mtsai, Univ. of Calgary Press, Calgary, 453-462 (1978); Kaloh, fi. és mtsai, Planta 144, 509-510 (1979)] azonban számos hátránnyal rendelkeznek. A megoldás szerint előbb egy szelekciós eljáráasal mugas fotoszintetikus aktivitású és klorofilltarlalmú sejtvonalakat kell előállítani, majd ezek növesztéséhez extrém körülményekre (10 000 lx fényintenzitás, 1% COj koncentráció) van szükség ahhoz, hogy kielégítő növekedést kapjanak. Az eljárás technikai hátránya, hogy hosszadalmas, bonyolult, sok átoltást igényel, ami rontja a tenyészet tulajdonságait, és végsősoron ahhoz vezet, hogy a tenyészet növény regeneráltatasára már nem alkalmas. További porbléma, hogy a magas fotoszintetikus aktivitású és klorofilllartalniü sejtvonalak szelektálásával esetleg a növények alaptulajdonságait is megváltoztatják, így még ha végre is lehetne hajtani a növények regeneráltaláeát az így kapott szövettenyészetből, akkor sem biztos, hogy aluptu-24 lajdonságaikban megfelelő növényekhez lehetne jutni.

Célul tűztük ki olyan oljárás kidolgozását, amellyel a fotoszintózisgátló herbicidekre rezisztens növények szelekcióját normál laboratóriumi körülmények között, szövettenyésztéses módszerrel meg lehet oldani.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a szövettenyósztéshez szokásosan alkalmazott táptalajok cukorkoncentrációjának csökkentésével található egy olyan alacsony cukorkoncentréció, melyen a kalluszok növekedése még elfogadható mértékű, de ahol a növekedésért már számottevően a fotoszintézis felelős. Az Így kapott, anyagcseréjüket kis mértékben a külső cukorellátásra, de elsősorban a fotoszintézisre alapozó szővettenyészeteket raixolróf szövettenyészeteknek nevezzük, utalva az autotróf és a heterotróf rendszerek között elfoglalt közbenső helyükre.

Ennek megfelelően találmányunk tárgya eljárás mixotróf szövettenyészetek előállítására magból, bármely növényi részből, protoplasztból vagy egyedi sejtből előállított fotoszintézisre képes vagy fotoszintézisre képes részeket tartalmazó szővettenyészetben, cukrot tartalmazó ismert táptalajon, megvilágítás mellett végzett tenyésztéssel, amelyet az jellemez, hogy a tenyésztést 1%-nél kevesebb cukrot tartalmazó táptalajon végezzük.

A fenti meghatározásban és a leírás egészében - mint már említettük - mixotróf szövettenyészetek alatt olyan tenyészeteket értünk, amelyek növekedéséhez mind a táptalaj cukortartalma, mind a fény jelentős mértékben hozzájárul.

A tenyészetek létrehozásakor az erre a célra szokásosan alkalmazott, tetszőleges növényi anyagokból indulhatunk ki. Megjegyezzük, hogy a lehetséges kiindulási anyagként megadott mag fogalma alatt a magból preparált embriót és a magból vagy embrióból kapott csiranövényeket értjük.

Növényi részként levelet, szárat, gyökeret, virágot stb. vagy ezek részeit használhatjuk.

A protoplasztok sejtfal nélküli növényi sejtek, amelyek az általunk használt értelmezésben magukba foglalják a fúzióval vagy egyéb sejtgenetikai módszerekkel megváltoztatott protoplasztokat is.

Az egyedi sejtek (single cell) sejtfallal rendelkező növényi sejtek, beleértve a pollent is.

Cukor alatt a növények számára hasznosítható cukrokat, előnyösen szacharózt és glükózt értünk [Plánt Sci. Letters, 21, 209-214 (1981)].

A találmány szerint a mixotróf szővettenyéezetek előállításához előnyösen steril levél- vagy szárdarabkákból ismert magas cukortartalmú táptalajon készített szővettenyészetekből indulunk ki; tehát 1% körüli cukrot tartalmazó táptalajon, 1000 lx körüli megvilágítás és 25 °C körüli hőmérséklet mellett kalluszképzödést indukálunk. Pór hetes tenyésztés után a kalluszokból kivett inokulumokat alacsony (1% alatti) cukorkoncentröciójú táptalajra helyezzük, majd folytatjuk a növesztést, 1000 lx körüli megvilágítás mellett, 25 °C körüli hőmérsékleten.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganalosítási módja szerint a tenyésztési 0,2-0,8%, előnyösebben 0,2-0,5%, legelőnyösebben 0,2-0,3% cukrot tartalmazó, ismert táptalajon végezzük. A tenyésztéshez nincs szükség extrém körülményekre, az eljárás szokásos, steril laboratóriumi körülmények között, Így 1000 lx körüli megvilágítás mellett, 25 °C körüli hőmérsékleten végrehajtható, és egyaránt alkalmas autotróf növekedésre képes és képtelen szövetek tenyésztésére.

Az Így kapott mixotróf szöveltenyészelek alkalmasnak bizonyullak fotoszintézisgátló herbicidek elsődleges hatásának kimutatására, beleértve a fotodestrukció okozta kifehéredést is.

Felhasználhatók a találmány szerinti szövettenyészetek fotoszintézisgátló herbicidek hatásának elkülönítésére más típusú herbicidek hatásától, (gy egyszerű, könnyen végrehajtható módszerrel megállapítható, hogy egy adott herbicid a fotoszintézis gátlásán keresztül fejti-e ki a hatását, és ha igen, van-e másodlagos hatása magasabb koncentrációban.

Végül, a találmány szerinti eljárással előállított mixitróf szövettenyészetek alkalmasak a találmány alapcélkitűzésének megvalósítására: herbicidrezisztens növények szövettenyésztéaes eljárással történő előállitására.

Ennek megfelelően, a találmány további tárgya eljárás fotoszintézisgátló herbicidekre rezisztens növények előállítására szővettenyészetben végzett szelekcióval. Az eljárás lényege abban áll, hogy a találmány szerint előállított mixotróf szövettenyészetek alkalmoszintézisgátló herbiciddel kezeljük, a tenyészet zöldülésre képes részeit izoláljuk, majd ezekből ismert módon növényeket regenerálta lünk.

A találmány szerinti eljárással előállított szövettenyészetek a legkülönfélébb típusú herbicidek, Így karbamid-származékok, triazin-származékok, uracil-származékok, difenil-éter, piridazin, hidroxi-benzonitril, nitrofenol, triadiazin-bipiridin, amid, anilid, triazol, tiokarbamát, illetve glicin típusú herbicidek vagy például klórszulfon hatásának tesztelésére, illetve ezekből a fotoszintézisgátló hatásúnak bizonyult herbicidekre rezisztens növények előállítására is alkalmasak.

A herbicid fotoszintézist befolyásoló hatását az jelzi, hogy a fényben, alacsony cukorkoncentréciójú táptalajon nevelt kalluszok ilyen herbicidek hatására kifehérednek. Kivételt képeznek a herbicid-rezisztenssé vált kalluszok, amelyek szelekciója legegyszerűbben éppen e tulajdonságuk alapján lehetséges.

A találmány szerinti szelekciós módszer egyszikű ás kétszikű herbicid-rezisztens növények előállítására egyaránt alkalmas. Ilyen növényként a példákban felsorolt növényeken kívül szinte valamennyi kultúrnövény, 5 így gabonafélék, kukorica, paradicsom, burgonya, cukorrépa, napraforgó, szója, gyapot, szóló stb. szóbajőhet. Az, hogy kísérleteink jelentős részét dohánynövényen folytattuk, csupán annak következménye, hogy ez a ki- 10 Bérleti célra leggyakrabban alkalmazott modell növény.

A találmány szerinti eljárás ezen felül alkalmas herbicid rezisztencia átvitelére rezisztens növényfajból azenzitiv növényfajok- 15 ba. Az átvitel előnyösen protoplaezt fúzióval történik.

A herbicid-rezisztencia tesztelését legelőnyösebb protoplaezt módszerrel végrehajtani, mert ez az eljáráe teszi lehetővé idő- 20 egység alatt a lehető legnagyobb mennyiségű sejt tesztelését. Míg egy Petri-csészében csak mintegy 9 kallusz vizsgálható, ugyanekkor az edényben körülbelül 1000 kolónia tesztelhető. A protoplaezt eredetű kolóniák 25 további előnye, hogy egysejt eredetűek, és azért lényegesen homogénebbek, mint a többse jteredetű, ezért genetikailag kevert kalluszok. Így a rezisztens növények legelőnyösebben protoplaezt eredetű tenyészetek- 30 ben állíthatók elő.

Találmányunk további részleteit a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy találmányunkat a példákra kívánnánk korlátozni. 35

1. példa

Nicotiana plumbaginifolia mixotróf szövette- 40 nyéezetének előellítása

Nicotiana plumbaginifolia steril levéldarabkáiból ismert táptalajon szővettenyészetet készítettünk. A növényeket a következő ősz- 45 szetételű táptalajon tartottuk fenn:

RM I:

NH«N0j KNOa

CaCh x 2HjO MgS0« (vízmentes)

KHjP0«

-— --- 55

RM II:

FeSO* * x7HjO 557 mg/100 ml

EDTA 745 mg/100 ml

6600 mg/1

7600 mg/1 50

1753 mg/1 723 mg/1 680 mg/1

KJ

NaaMoO» x 2HjO CuS0« x 5HjO CoCh x 6HjO szacharóz agar

8.3 mg/100 ml

2.5 mg/100 ml 0.25 mg/100 ml 0.25 mg/100 ml vegyes % 0.8 vegyes % liter táptalaj elkészítésekor az RM I törzsoldatből 250 ml-t, az RM II-ből 5,0 ml-t és az RM III törzsoldatből 10 ml-t veszünk.

Az RM I, RM II és RM III komponenseket közösen RM-sóknak nevezzük ÍMurashige és mlsai: Physiol. Plánt. 15, 473-497 (1962)]. A növényeket 1000 Ix megvilágítás és 70% relatív páratartalom mellett, 25 °C-on tartottuk fenn.

A kísérlet megkezdésekor kalluszkópzödést indukáltunk 1% szacharóz tartalmú táptalajon, 1000 lx megvilágítás mellett, 25 ’C-on. Ehhez a következő összetételű táptalajt használtuk:

RM sók (RM I+RM II+RM III) inozit tiamin naftil-ecetsav benzil-adenin szacharóz agar ’az előbb megadott mennyiségben 100 mg/1 mg/1 0.1 rag/1 1.0 mg/1 vegyes %

0.8 vegyes % *1 liter táptalaj elkészítésekor az RM I törzsoldatből 250 ml-t, az RM 11-böl 5,0 ml-t és az RM III törzsoldatból 10 ml-t veszünk.

Kontrollként megvilágítás nélkül, de egyébként azonos körülmények között nevelt tenyészetek szolgáltak.

Négy hetes tenyésztés után a megvilágítás mellett, illetve sötétben indukált kultuszokból 20 mg-os inokulumokat különböző szacharóz-koncentrációjú táptalajokra helyeztünk, majd a tenyésztést továbbra is fényben, illetve sötétben folytattuk. A táptalaj összetétele - a szacharóz-koncentráció kivételével - a fent megadott volt. Négy hetes növesztés után mértük a kalluszok friss súlyát. A fényben és sötétben kapott eredményeket a szacharóz-koncentráció függvényében, az átlagértékek mellett a szórás feltüntetésével az 1. táblázatban adjuk meg. Az átlagértékeket 18 mérésből határoztuk meg (n=18).

RM III:

HaBOa

MnS0« x 4HaO ZnSOi x 4HiO mg/100 ml

223 mg/100 ml mg/100 ml 65

1. táblázat

Fényben és sötétben növesztett dohánykalluszok friss súlya különböző szacharóz-koncentrációjú táptalajokon

Szacharóz-	A kalluszok friss eúlya
-koncentráció	fényben sötétben
(%)	(1000 lx)

Szacharóz-	A kalluszok friss súlya (g)
koncentráció	fényben	sötétben
(X)	(1000 lx)

0.1	0.20±0.05	0.05±0.01
0.2	0.18±0.12	0.11 ±0.04
0.3	0.44±0.10	0.19±0.06
0.4	0.59±0.14	0.25±0.08
0.5	0.63±0.16	0.37±0.10
0.75	0.76±0.16	0.53±0.17
1.0	0.82±0.16	0.76±0.21
1.5	0.92±0.24	0.97±0.25
2.0	0.86±0.23	1.01 ±0.28
3.0	0.70±0.16	1.05±0.33

A táblázatban szerepló adatokbl látható, hogy 1,0% szacharóz-koncentráció felett a kalluszok növekedésének mértéke fényben és sötétben a hibahatáron belül azonos, tehát a növekedés heterotróf. Szacharózt nem tartalmazó táptalajon a kalluszok gyakorlatilag nem nőnek* ami azt jelzi, hogy autotróf növekedésre képtelenek. Alacsony, IX alatti, előnyösen 0,2-0,5% szacharózkoncenlrációnál a fényben nőtt kalluszok súlya számottevően nagyobb, mint a sötétben nőtt kalluszoké, Így 0,2% szacharóz-koncentráció esetében a különbség csaknem kétszeres, 0,3% szacharóz-koncentrációnál közel 2,5-szeres, és 0,4-0,5% cukorkoncentrációnál is ekörül mozog. Ugyanakkor a növekedés mértéke kísérleti szempontból még megfelelő, például 0,3% szacharózt tartalmazó táptalajon a 2,0% szacharóz-koncentrációjú táptalajon mért súly felél kapjuk. A kísérleti adatok egyértelműen igazolják, hogy alacsony szacharóz-koncentrációjú táptalajon a kalluszok, amellett, hogy növekedésükhöz külső cukorellátást is igényelnek, jelentős fotoszintéziefüggő növekedést mutatnak, tehát mixotróf állapotban vannak.

2. példa

Az 1. példával teljesen analóg módon eljárva, de steril levéldarabkák helyett steril szárdarabkákból kiindulva a következő eredményeket kaptuk (n=18).

2. táblázat

Fényben és sötétben növesztett dohánykalluszok friss súlya különböző szacharóz-koncentrációjú táptalajon

0	0.06±0.03	0.06+0.03
0.1	0.22+0.08	0.06+0.02
0.2	0.46±0.10	0.1Η0.03
0.3	0.49±0.17	0.16±0.05
0.5	0.69±0.27	0.28±0.11
1.0	0.70±0.35	0.69+0.26
2.0	1.13±0.30	1.12±0.41
3.0	0.93±0.33	0.87±0.43

A 2. táblázatban összefoglalt kísérleti adatokból az 1. példában tárgyaltakkal teljesen azonos következtetéseket lehet levonni, de itt a különbségek a fényben és sötétben nevelt kalluszok súlyai között még kifejezettebbek (0,2% szacharóz-koncentráció mellett a különbség több, mint négyszeres).

Az 1. és 2. példában ismertetett kísérleteket glükóz-tartalmú táptalajokon is megismételjük, és a fentiekkel teljesen analóg eredményeket kaptunk.

3. példa

Fotoszintézist gátló herbicidek elsődleges hatásának kimutatása mixotróf szövettenyészetben.

Az 1. példa szerint készített Nicotiana plumbaginifolia szövettenyészetben, 0,3%, illetve 3% szacharózt tartalmazó, egyébként az 1. példában megadottal megegyező összetételű táptalajon fényben (1500 lx, 28 °C) és sötétben a fotoszintézisgátló herbicid ként ismert terbutrint teszteltük. A kalluszok friss súlyát az 1. példában leírt módon mértük. A herbicideket szűréssel sterilizált törzsoldalból adtuk a meleg (45 °C-os) táptalajhoz. A terbutrin koncentrációját 10⁴ ós 10⁶ mól között változtattuk. A kapott eredményeket, a szórással együtt, a következő 3. táblázatban tüntetjük fel (n=18).

3. táblázat szacharóz-koncentráció - 3%

Terbutrin- A kalluszok friss súlya (g) konc. fényben sötétben (M)

-510 ll

0	*0.48i0.13	0.21+0.06
io-«	0.1410.04	0.1810.04
io-«	0.1410.03	0.2710.07
io-«	0.15±0.04	0.23+0.07

Szacharóz-koncentráció = 3%
Terbutrin- konc. (M)	A kalluszok fényben	friss súlya (g) sötétben
0	*0.8910.25	0.8710.23
io-«	*1.0610.17	0.86+0.26
10-«	*0.9310.22	1.09±0.26
io-«	*0.8810.32	0.82+0.15

A *-gal jelölt kalluszok zöldek voltak.

A táblázat adataiból látható, hogy 3% ezacharóz-koncentrációjú táptalajon, fényben vizsgálva, illetve sötétben a terbutrin hatástalan volt. Fényben, 0,3% szacharóz-koncentrációjú táptalajon viszont a herbicid már 10*· M koncentrációban is lecsökkentette a növekedést, pontosan olyan szintre, mintha a kalluszok sötétben nőttek volna. Ez a halas magasabb koncentrációnál már nem lett erősebb. Külön ki kell emelni, hogy a 0,3% szacharóz-koncentrációjú táptalajon nőtt kalluszok a herbicid kezelés hatására kifehéredtek, bizonyítva, hogy a kalluszokban működő fotoszintetikus elektrontranszport lánc volt, szemben a 3% szacharóz-koncentrációjú táptalajon kapott eredményekkel.

4. példa

Mindenben a 3. példa szerint eljárva, de a herbicid kezelést a következő herbicidekkel végezve teljesen analóg eredményeket kaptunk:

atrazin prometrín, aziprotrin, metribuzin, diuron, klórbromuron, metabenztiazuron, linuron, monolinuron, lenacil, terbacil, bromoxinil.

Ugyancsak hasonló eredményeket kaptunk, ha a kísérletet Nicotiana plumbaginifolia helyett Nicotiana tabacum, Solanum nigrum vagy Solanum tuborosum fajokon hujloltuk végre.

5. példa

Fotoezintézisgétlö herbicidekrc rcziaztene növények előállítása

Steril Nicotiana plumbaginifolia növények I g-nyi levelét körülbelül 1 mm-ee szeletekre vágtuk, majd 10 ml szűréssel sterilizált enzim-oldatban inkubáltuk sötétben, 25 ®C hőmérsékleten, rázalás nélkül. Az inkubálás időtartama 18 óra volt.

Az enzim összetétele:

0,5% driselase 0,4 M szachurózt tartalmazó Kj oldatban, ahol a Ka táp-oldat a következő összetételű*.

Anyag	Koncentráció (mg l'¹)
KNOa	2400
CaCh x 2HíO	880
NIhNOj	240
NaCl	-
KCl	-
MnSCü x HjO	10
HjBOj	3
ZnSO< x 7H2O	2,3
NajMoOi x2HiO	0.24
CuSOí x 5H2O	0.025
CoCb x 6H2O	0.014
KI	0.75
MgSO<	120
NaHzPOi x 2HaO	156
(NH«)iSO<	130
Nikotinsav	1
Bs	1
Bi	10
2,4-D	0.1
Benziladenin	0.2
Naftilecetsav	1
D-xilóz	250
inozit	100

pH 5.8.

Az inkubálás után a szuszpenziót átszűrtük (63 pm0 nylon szűrő), centrifugáltuk (100 g, 3 perc). A protoplaeztokat, amelyek centrifugálás után a meniszkuszbnn úsznak, W-5 oldatban felszuszpendóltuk. A W-5 mosóoldat összetétele:

NaCl	9000	mg/1
Glükóz	1000	mg/1
CaC'lj x 2H2O	18 400	mg/1
KCl	400	mg/1

-612 pH 5.6.

A kapóit szuszpenziót újra centrifugáltuk (50 g, 2 perc). A centrifugacsö aljában öaazegyűlt proloplaaztokat 0,4 M glükózt tartalmazó K3 tápoldatban tenyésztettük (1 x x 10’ proloplaazt/ml) 100 lx megvilágítás mellett, 25 °C-on. A tenyészeteket 7-10 naponként csökkend glükóz-koncentrációjú .(0,4; 0,3; 0,2; 0,1 Μ) K3 tápoldattal hígítottuk

30-40-szeres végső hígítás eléréséig. A tenyésztés megindítása után kb. 6 héttel a sejtkolóniákat 0,3% szacharózt és 0,4 M terbutrint tartalmazó, egyébként az 1. példában megadott összetételű, táptalajba szélesztettük (10-szeres hígítás, ami végül kb. 1000 kóló-. nia/10 cm átmérőjű Petri-csésze kolóniasűrűséget jelentett).

A kolóniákat 1500 lx megvilágítás mellett, 28 °C-on tenyésztettük. 1-2 hónap múlva a zöldülésre képes kolóniákat izoláltuk, majd ugyanazon a táptalajon kalluszméretűvé növesztettük. Ezekből növényeket regenerállattunk, 2% szacharóz-koncentrációjú terbutrint nem tartalmazó, egyébként a szelekcióhoz használttal azonos összetételű táptalajon. Egy hónapos növesztés után hajtások jelentek meg, amelyeket olyan táptalajon gyókereztettünk és tartottunk fenn, mint az 1. példában leirt. A növesztést körülbelül 10 cm-ee méret eléréséig folytattuk. A 10 cm-es növények leveleiből vágott darabkákat 0,3% szacharózt és 0,4 M terbutrint tartalmazó, egyebekben az 1. példában megadott összetételű táptalajra helyeztünk, majd a tenyésztést az 1. példában ismertetett eljárással folytattuk. Négy hét elteltével vizuális kiértékeléssel ellenőriztük a regenerált növények rezisztenciáját. A rezisztencia kifejlődése esetén mind a kallusz, mind a tenyésztéshez felhasznált levéldarabka zöld, míg nem rezisztens növények esetén a kallusz fehér, ée a levéldarabka is kifehéredik. A rezisztens sejtvonalak megjelenési gyakorisága kb. 1/10⁵ kolónia volt.

A kísérletet terbutrin helyett metobromuron herbicidet használva megismételtük. Rezisztens sejtvonalakat ebben az esetben is izoláltunk és a rezisztencia kifejeződött a regenerált növényekben is. A rezisztens sejtvonalak megjelenési gyakorisága kb. 1/ /10’ kolónia volt.

Ugyancsak analóg eredményeket kaptunk, ha a kísérleteket Solanum tuberoBummal végeztük.

6. példa

Herbicidrezieztencia dohányfajok közötti átvitoie protoplaaztfúzióval

A kísérlet célja atrazin-rezisztons kloroplasztiszok átvitele volt egy mutáns gyomnövényből (Solanum nigrum) dohányba (Nicotiana plunibaginifolia), illetve burgonyába. Az átvitelt a proLoplasztok tenyésztésére az 5. példában ismertetett eljárással, protoplaszf úzión alapuló kloroplasztátviteli módszerrel végeztük TMenczel és misei: Genetics 100, 487-95 (1982); Medgyesy és mtsai: Molec. Gén. Génét. 179, 693-698 (1980), melynek során felhasználtuk azt, hogy alacsony cukorkoncenlráción ki tudjuk szelektálni a rezisztens kloroplasztiszokat tartalmazó sejtvonalakat. A rezisztencia átvitelét, azaz a rezisztencia megjelenését a vizsgált kultúrnövényben az

5. példában ismertetett módszerrel ellenőriztük.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás mixotróf szövettenyészetek előállítására magból, bármely növényi részből, proloplasztból vagy egyedi sejtből előállított fotoszintézisre képes vagy fotoszintézisre képes részeket tartalmazó szövettenyészetben, cukrot tartalmazó ismert táptalajon, megvilágítás mellett végzett tenyésztéssel, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 1%-nal kevesebb cukrot tartalmazó táptalajon végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,2-0,8% cukrot tartalmazó táptalajon végezzük.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,2-0,5% cukrot tartalmazó táptalajon végezzük.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,2-0,3% cukrot tartalmazó táptalajon végezzük.
5. Eljárás fotoszirilézisgátló herbicidekre rezisztens növények előállítására, szövettenyészetben végzett szelekcióval, azzal jellemezve, hogy egy az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított mixotróf szövettenyészetet fotoszintézisgátló herbiciddel kezelünk, a tenyészet zöldülésre képes részeit izoláljuk, majd ezekből ismert módon növényeket regeneráltalunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást sejtgenetikai módszerekkel módosított kiindulási anyagból előállított mixotróf szövettenyészeten hajtjuk végre.