HU186007B

HU186007B - Process for preparing peptides with antagonistic activity against gonadotropic harmone

Info

Publication number: HU186007B
Application number: HU821217A
Authority: HU
Inventors: Jean E F Riveer; Vale Wyle W Ifj
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1981-04-21
Filing date: 1982-04-20
Publication date: 1985-05-28
Also published as: IL65371A; ZA822053B; ES8307720A1; DK173082A; DK151033B; JPS57181047A; NZ200125A; EP0063423A1; IL65371A0; EP0063423B1; PH18965A; GR75542B; DD202694A5; CA1241950A; US4409208A; IE52442B1; AU8283882A; IE820819L; ES511525A0; KR830010052A

Description

A találmány tárgya eljárás gyógyászati hatású X-Rj -R₂ -R₃ -Ser-Tyr-R₄-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂általános képietű dekapeptidek és savaddiciós sóik előállítására, ahol

X hidrogénatomot, 14 szénatomos alkanoil- vagy

2-5 szénatomos alkenoil csoportot jelent,

Rj jelentése dehidro-Pro,

R₂ jelentése F-D-Phe és

R₃ és R4 jelentése D-Trp vagy B D-NAL, azzal a kikötéssel, hogy vagy R₃ vagy R₄ B-D-NAL-t jelent.

Az eljárás során

X‘ -Rj -R₂-R₃-Ser(X² )-Tyr(X³)-R4-Leu-Arg(X⁴ )-Pro-Gly-NH2 (II) általános képietű dekapeptidektől, ahol X¹, X², X^ és X⁴ a peptidkémiában önmagában ismert védőcsonort, és Rt, Rj > Rj ás Rí a fenti, es az N-terminális aminosav adott esetben a peptidkémiában önmagában ismert gyantahordozóhoz kapcsolódik, a védőcsoportokat és az adott esetben jelenlévő gyantahordozót lehasitjuk, és - kívánt esetben a kapott pepiidet savaddiciós sójává alakítjuk át.

A találmány tárgya eljárás új dexapeptidek előállítására, amelyek emlősöknél - beleértve az embert - gátolják a hipofízis (agyalapi mirigy) gonadotropin-termelését, és az ovuláció (érett tüsző felrepedése és a petesejt kiszabadulása) gátlására és/vagy szteroid hormonok leadásának visszaszorítására alkalmasak. Közelebbről meghatározva a találmány szerint olyan peptideket állítunk elő, amelyek gátolják az ivarmirigyek működését és szteorid hormonok, mint progeszteron és tesztoszteron termelését.

A hipofízis nyélen keresztül kötődik a hipotalamuszként ismert agyalapi részhez. A hipofízis termeli egyebek mellett a follikulust (tüszőt) stimuláló hormont (FSH) és a luteinizáló hormont (LH), melyeket gonadotropinoknak vagy gonadotrop hormonoknak is nevezünk. E hormonok együttesen szabályozzák az ivarmirigyek funkcióját, amikor azok a herében tesztoszteront és a petefészekben progeszteront és ösztrogént termelnek, és szabályozzák a csírasejtek (gaméták) termelését és érését is.

Az agyalapi mirigy elülső lebenyének hormontermeléséhez általában a hipotalamuszban képződő más hormoncsjport előzetes felszabadulása szükséges. A hipotalamuszhormonok egyike gonadotrop hormonok, főleg az LH felszabadulását megindító faktorként („releasing factor ) hat, az LH számára felszabadító faktorként ható hipotalamusz-hormont e leírásban GnRH-nak nevezzük, bár az LH-RH és az LRF megjelölés is használatos.

A GnRH-t a következő szerkezetű dekapeptidként izolálták és jellemezték:

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

A peptidek két vagy több aminosavat tartalmazó vegyüíetek, melyekben az egyik aminosav karboxilcsoportja a másik aminosav aminocsoportjához kapcsolódik. A GnRH fenti képlete összhangban áll a peptidek szokásos jelölésével, ahol az aminocsoport a bal oldalon és a karboxilcsoport a jobb oldalon helyezkedik el - Az aminosavmaradék helyzetének azonosítása céljából az aminosavmaradékot balról jobbra menve számozzák. A GnRH esetében a glicin karboxilcsoportjának hidroxilrészét aminocsoport (NH₂) helyettesíti. A fenti aminosavmaradékok rövidítései szokványosak és az aminosavak triviális nevén alapulnak, így p-Glu = hisztidin

HIS = hísztidín

Trp = triptofán

Ser = szerin

Tyr = tirozin

Gly = glicin

Leu - leucin

Arg = arginin

Pro = prolin

Phe = fenil-alanín és

Alá = alanin.

Ezeket az aminosavakat á valinnal, izoleucinnal, treoninnal, lizinnel, aszparaginsawai, aszparaginnal, glutaminnal, ciszteinnel, metioninnal, fenil-alaninnal és prolinnal együtt általában szokványos, természetes előfordulású aminosavaknak tartják. A glicin kivételével a találmány szerinti peptidek aminosavai L-konfigurációjúak, ha erre nézve külön utalás nincs.

Ismeretes, hogy ha a GnRH dekapeptid ó-helyzetében a Gly-t D-aminosavak helyettesítik, a kapott pepiid emlősöknél mintegy 1-35-ször hatásosabban serkenti az LH és egyéb gonadotropinok hipofízis általi leadását, mint a GnRH. K. U. Prased és munkatársai szerint (J. Med. Chem. 19,492 (1976)) a nagyobb hatékonyság úgy is elérhető, hogy a 3-helyzetben 3•/1-naftil-Ala szubsztituenst alkalmaznak. E felszabadító hatás létrejön, ha emlősöknek intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, orálisan, intranazálisan vagy intravaginálisan alkalmazzák a GnRH-analógot.

Az is ismeretes, hogy a GnRH dekapeptid 2helyzetében a His különböző aminosavakkal való helyettesítése (vagy a His elhagyása) olyan analógokat eredményez, amelyek emlősöknél gátolják az UH és más gonadotropinok hipofízis általi leadását.

Egyes nőstény emlősök, melyeknek nincs ovuláeiós ciklusuk és nem rendelkeznek hipofízis- vagy petefészek-rendellenességgel, normális mennyiségű LH és FSH gonadotropint kezdenek szekretálni Gn-RH megfelelő alkalmazása után. Így a GnRH alkalmasnak látszik terméketlenség kezelésére olyan esetekben, ahol a hipotalamuszban működésbeli lába áll fenn.

Bizonyos okokból az ovuláció meggátlása kívánatos nőstény emlősöknél, és a GnRH normális működését antagonizáló GnRH-analógokat alkalmazzák az ovuláció megakadályozása céljából. Emiatt kiterjedten vizsgálják a GnRH-antagonista GnRH-analógoknak fogamzásgátlásra vagy a fogamzási periódusok szabályozására való esetleges alkalmazását. Olyan peptidek létrehozása kívánatos, amelyek hatásos antagonistái az endogén GnRH-nak és megakadályozzák az LH szekrécióját és az emlősök ivarmirigyeinek szteorid-termelését.

A találmány céljául annak a feladatnak a megoldását tűztük ki, hogy emlősöknél — beleértve az embert - gonadotropin-felszabadulást gátló peptideket állítsunk elő, melyek alkalmasak hím és nőstény emlősök ivarmirigyei szteorid-termelésének gátlására. A tökéletesített GnRH-analógok GnRH-antagonisták és emlősöknél gátolják a szaporodási folyamatot. Ezen analógok a gonadotropinok és szexuálhormonok képződésének gátlására használhatók különböző körülmények között, beleértve a korai nemi érést, hormondependens rosszindulatú daganatokat, menstruációs zavarokat és endometriózist (a méhnyáikahártya szabálytalan elhelyezkedésével járó állapotot).

Általában a találmány szerint olyan dekapeptideket szintetizálunk, amelyek emlősöknél — beleértve az embert - erősen gátolják a gonadotropinok hipofízis — szekrécióját, és/vagy gátolják az ivarmirigyek szteorid-leadását. E peptidek olyan GnRH-analógok, melyek 1-helyzetű dehidro-prolin formájában 3- és/ vagy 6-helyzetben B-(naftil)-D-alanint (a következőkben: B-D-NAL) tartalmaznak, és előnyösen a

2-helyzetben is szubsztituens van jelen. Az 1-helyzetű szubsztituens módosítható úgy, hogy a a-amino-csoportja acilcsoportot, például formil-, acetilvagy akrililcsoportot tartalmaz. Az 1-helyzetben előnyös a dehidro-L-Pro alkalmazása. A 2-helyzetben fluoratommal szubsztituált D-Phe található, ami a benzolgyűrű specifikus módosítása következtében fokozott antagonista aktivitást eredményez. A fenilgyűrű előnyösen a 4-helyzetben tartalmazza a fluoratomot. A 3-helyzetben előnyös a B-D-NAL aminosav, de D-Trp is használható. A 6-iielyzetben ugyancsak B-D-NAL vagy D-Trp foglal helyet.

Minthogy ezek a dekappeptidek igen hatásosan gátolják az LH-felszabadulást, gyakran GnRH-antagonistáknak nevezik őket. E peptidek nőstény emlősöknél gátolják az ovulációt, ha igen alacsony dózisszinten a proösztruszban (ivarzás előtti ciklusban) alkalmazzuk őket, és hatásosan hozzák létre a megtermékenyített peték reszorpciójátis röviddel a fogamzás után alkalmazva. E peptidek hím emlősök kontraceptív kezelésére is használhatók.

Közelebbről meghatározva, a találmány szerinti peptidek a következő általános képlettel ábrázolnatók:

X-R! -R₂ -R₃ -Ser-Tyr-R₄-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, (I), ahol

X hidrogénatomot, 1-4 szénatomos alkanoil- vagy

2-5 szénatomos alkenoilcsoportot jelent,

Rí jelentése dehidro-Pro,

R₂ jelentése F-D-Phe és

R₃ és R₄ jelentése D-Trp vagy B-D-NAL, azzal a kikötéssel, hogy vagy R₃ vagy R₄ B-D-NAL-t jelent,

X¹ olyan típusú α-amino-védőcsoport, hielynek hasznossága jól ismert peptidek lépésenként! szintézisénél és, ha az előállítani kívánt pepiidben X acilcsoportot jelent, úgy az a csoport használható védőcsoport gyanánt. Az X¹ jelentésének megfelelő α-amino-védőcsoportok osztályaiba tartoznak (1) acil-típusú védőcsoportok, mint a formilcsoport, (Fór), trifluor-acetil-, ftalil-, p-toluolszulfonil-. {Tos). benzoil- (BZ), benzolszulfonil-, ο-nitro-fenil-szulfenil-, 0-nitro-fenoxi-acetil-, akrilil- (Acr), klór-acetil-, acetil- (Ac) és -klór-butiril-csoport, (2) aromás uretán-típusú védőcsoportok, például benzil-oxi-karbonil- (Z) és szubsztituált benzil-οχί-karbonil-, mint p-klór-benzil-oxo-karbonil-, ρ-nitro-benzil-oxi-karbonil-, p-bróm-benzil-oxi-karbonil- és p-metoxi-benzil-oxi-karbonil-csoport, (3) alifás uretán-típusú védőcsoportok, mint terc-butil-oxi-karbonil- (Boc), diizopropil-metoxi-karbonil-, izopropil-oxi-karbonil-, etoxi-karbonil-, és allil-oxi-karbonil-csoport, (4) cikloalifás uretán-típusú védőcsoportok, mint cikiopentil-oxi-karbonil-, ada mantil-oxi-karbonil- és ciklohexil-oxi-karbonil-csoport, (5) ti ouretán-típusú védőcsoportok, mint fenil-ti o-karbonil-cső port, (6) alkil-típusú védőcsoportok, mint allil- (Aly), trifenii-metil- (tritil) és benzilcsoport (Bzl), (7) trialkil-szilán-csoportok, mint trimetil-szilán. Előnyös Oramino-védőcsoport a Boc, ha X hidrogénatomot jelent.

X³ a Ser alkoholos hidroxilcsoportjának védőcsoportja, és jelentése aceitl-, benzoil-, tetrahidropiranil-, terc-butil-, tritil-, benzil- vagy

2,6-diklór-benzil-csoport.

Előnyben részesítjük a benzilcsoportot.

X^s a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának védőcsoportja és jelentése tetrehidropiranil-, terc-bulil-, tritil-, benzil-, benzil-oxi-karbonil-,

4-bróm-benzil-oxi-karbonil- vagy 2,6-diklór-benzil-csoport. Előnyben részesítjük a diklór-benzil -csoportot.

X⁴ az Arg nitrogénatomjának védőcsoportja és jelentése nitro-, Tox, benzll-oxl-karbonll-, adamentil-oxi-karbonil-csoport vagy Boc,

X⁴ azonban hidrogénatom is lehet, ami azt jelenti, hogy nincsenek védőcsoportok az Arg oldalláncbeli nitrogénatomjain. Előnyben részesítjük a Tos csoportot.

Az X²-X⁴ oldallánc-védőcsoportok kiválasztásának kritériuma, hogy a védőcsoport stabil legyen a reagenssel szemben annak a reakciónak a körülményei között, melyet a szintézis minden lépésénél az O-antíno-csoport eltávolítására alkalmazunk. A védőcsoportnak nem szabad lehasadnia a kapcsolás körülményei között, és eltávolíthatónak kell lennie a kívánt aminosav-szekvencia szintézisének befejezése után, a peptidláncot nem befolyásoló reakciókörülmények között.

Az N-terminális aminocsoport szilárd fázisú szintézis esetén a peptídkémiában önmagában ismert gyantahordozóhoz kapcsolódik.

Ha X acetil-, formil-, akrilil- vagy valamely más, fent definiált acilcsoportot jelent, akkor X úgy használható, mint az X¹ védőcsoport az aminosav α-aminocsoportjához, és ebben az esetben az utolsó aminosavnak a peptidlánchoz való kapcsolása előtt alkalmazhatjuk. Azonban úgy is eljárhatunk, hogy a reakciót a gyantán lévő pepiiddel hajtjuk végre, például ecetsavval reagáltatjuk diciklohexil-karbodiimid (DCC) jelenlétében, vagy előnyösen ecetsavanhidriddel.

A teljesen megvédett peptid a klórmetilezett gyantahordozóról ismert módon ammonolízissel hasítható le és így teljesen megvédett amid közbenső terméket kapunk. A peptid védőcsoportjainak eltávolítását, valamint a peptid lehasítását a benzhidril-amin gyantáról 0°C-on hidrogén-fluorid (HF) segítségével hajtjuk végre. A HF-os kezelés előtt előnyösen anizolt adunk a pepiidhez. A HF vákuumban való eltávolítása után a lehasított, védőcsoportmentesített peptidet célszerűen éterrel kezeljük, dekantáljuk, híg ecetsavban felvesszük és liofilizáljuk.

A peptid tisztítása ioncserélő kromatográfiával történik karboxi-metil-cellulóz (CMC) oszlopon, majd megoszlásos kromatografálást végzünk Sephadex G-25 oszlopon n-butanol - 0,1 n ecetsav (1 : 1 térfogatarány) eluenst használva, vagy ismert módon nagynyomású folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmazunk.

A találmány szerinti peptidek 200 üg/testsúlykg-nál alacsonyabb dózisszinteken gátolják nőstény patkányok ovulációját, ha déltájban a proösztrusz napján alkalmazzuk őket. Az ovuláció tartós visszaszorítása céljából körülbelül 0,1—5 mg/testsúly-kg dózisszintek alkalmazása szükséges. A találmány szerinti antagonisták hatásos fogamzásgátlók is, ha szabályos ütemben hím emlősöknél alkalmazzuk őket. Mivel e vegyületek csökkentik a tesztoszteronszintet (nem la'vánatos következmény normális, szexuálisan aktív hímeknél), célszerű lehet tesztoszteron utánpótlási dózisokat alkalmazni a GnRH-antagonistával együtt. Ezen antagonisták más célokra is használhatók gonadotroplnok és nemi hormomonok szabályozására, mint fentebb említettük,

A következő példa a találmány további jellegzetességeit ismerteti, anélkül, hogy a találmány hatókörét korlátozná.

186 007

Példa

A fentebb említett szilárd fázisú technikával az alábbi általános képletü peptideket állítjuk elő: X-dehidro-Pro-R₂ -R₃ -Ser-Tyr-R₄ -Leu-Arg-Pro-GlyNHj

1, Táblázat

X	r₂	r₃	Ra	O^°(c=l, 50%-os ecetsav)
1.	Ac	4-F-D-Phe	D-Trp	B-D-2NAL	-16,1°	±	π-
2.	Ac	4-F-D-Phe	B-D-2NAL	D-Trp	-69,2°	±	1°
3.	Acr	4-F-D-Phe	B-D-1NAL	D-Trp	—83,66°	±	1°
4.	Acr	4-F-D-Phe	D-Trp	B-D-1NAL	-70,3°	±	1°
5.	Ac	4-F-D-Phe	B-D-1NAL	B-D-1NAL	-72,5°	±	1°
6.	Ac	4-F-D-Phe	B-D-2NAL	B-D-2NAL	-85,15°	±	1°
7.	Ac	4-F-D-Phe	B-D-1NAL	B-D-2NAL	⁺⁸¹>⁹ A		1°
8.	Ac	4-F-D-Phe	B-D-2NAL	B-D-INAL	-73,48°	±	1°
9.’	H	4-F-D-Phe	B-D-2NAL	B-D-2NAL	-71,23°	±	1°
acetát-só

* = A sót úgy állítjuk elő, hogy 3Ó ml 1 n ecetsavat adunk 50 mg dekapeptid oldatához.

Példa gyanánt a fenti, (Ac-Dehidro Pro¹, 4-F-D-Phe⁵, D-Trp³, B-D-2NAL⁶)-nak nevezett 1. számú peptid szilárd fázisú szintézisét az alábbiakban ismertetjük. E peptid képlete a következő:

Ac-Dehidro Pro-4-F -D-Phe-D-Tip-Sei-Tyr-B-D-2NAL-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.

BHA gyantát használunk, és Boc-védett Gly-t kapcsolunk a gyantához metilén-dikloridban (CH₂-Cl₂) 2 óra alatt, a Boc-származékot háromszoros feleslegben alkalmazzuk, és aktivátorként diciklohexil-karbodiimidet (DCC) használunk. A glicin-rész a BHA-részhez amidkötéssel kapcsolódik.

Minden aminosav hozzákapcsolása után mosást, védőcsoportlehasítást és a következő aminosav hozzákapcsolását az alábbi munkamenet szerint hajtjuk végre automatizált készülék segítségével és körülbelül 5 g gyantából kiindulva:

Keverési idők

Lépés _Reagensek és műveletek_(perc)

Cft₂Cl₂ mosás - 80 ml (kétszer) 3

Metanol (MeOH) mosás - 30 ml (kétszer) 3

CH₂CL₂ mosás - 80 ml (háromszor) 3

50% trietanol-amin (TEA)+ 5% 1,2-etán-ditiol CH₂ Cl₂ -ben 70 ml (kétszer) 10

CH₂C1₂ mosás - 80 ml (kétszer) 3

612,5% TEA CH₂CH₂-ben - 70 ml (kétszer) 5

MeOH mosás — 40 ml (kétszer) 2

CH₂C1₂ mosás - 80 ml (háromszor) 3

Boc-aminosav (10 millimól) 30 ml dimetil-formamidban (DMF) vagy CH₂Cl₂-ben, függően az illető védett aminosav oldhatóságától (egyszer) plusz DCC (10 millimól) CH₂Cl₂-ben 30—300

MeOH mosás - 40 ml (kétszer) 3

12,5% TEA CH₂Cl₂-ben - 70 ml (egyszer) 3

MeOH mosás — 30 ml (kétszer) 3

Cll₂Cl₂ mosás — 80 m) (kétszer) 3

A 13. lépés után alikvotot veszünk ki ninhidrinpróbához: ha a próba negatív visszatérünk az 1. lépéshez a következő aminosav kapcsolása céljából, ha a próba pozitív vagy enyhén pozitív, megismételjük a 9—13. lépést.

A találmány szerinti peptid minden egyes aminosavának kapcsolásához a fenti munkamenetet alkalmazzuk, miután az első aminosavat a hordozóhoz kapcsoltuk. NaBoc-védelmet alkalmazunk a fennmaradó összes aminosavhoz a szintézis folyamán. NöBocB-D-NAL-t ismert módszerrel állítunk elő, például a 4,234,571 számú, 1980. november 18-án közzétett Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban részletesen leírtak szerint. Az Arg oldalláncot Tos csoporttal védjük meg. Oldalláncvédő csoportként OBzl csoportot használunk a Ser hidroxilcsoportjához, és 2,6-dikIór-benzil-csoportot alkalmazunk oldalláncvédő csoportként a Tyr hidroxílcsoportjához. Végső aminosavként N-acetil-dehidro-Pro-t építünk be. A CH₂Cl₂-ben rosszul oldódó Boc-Arg(Tos) és Boc-D-Trp kapsolását DMF/CH₂C1₂keverékben hajtjuk végre.

A peptid lehasítása a gyantáról és az oldalláncok teljes védőcsoportmentesítése igen könnyen végbemegy 0°C-on HF hatására. Szennyezések eltávolítására szolgáló anyagként anizolt alkalmazunk a HFkezelés előtt. Miután a HF-ot vákuumban eltávolítottuk, a gyantát 50%-os ecetsawal extraháljuk és a mosófolyadékokat liofilizálva nyers peptidport kapunk.

A peptidet ezután ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk CMC-oszlopon (Whatman CM 32), az oszlopot 50 : 50 arányú metanol/víz eleggyel készült 0,05-0,3 mólos ammónium-acetát gradienssel eluáljuk, majd megoszlásos kromatográfiai végzünk célszűrő oszlopon, n-butanol/0,1 n ecetsav 1 : 1 térfogatarányú eluens rendszert használva.

A peptid rétegkromatográfiával homogénnek bizonyul számos különböző oldószerrendszert hasznává. Hasonló eredményt kapunk fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, vizes trietil-ammónium-foszfátot és acetonitrilt használva. A kapott tisztított peptid aminosavanaiizise megfelel az előállított struktúrának, egészszámú értékeket kapva a láncban levő minden aminosavra. Fotoelektromos polariméterrel az optikai forgatóképesség:

[«F,° = 16,1⁰ (c = 1,50% ecetsav).

A peptidet in vitro és in vivő vizsgáljuk. Az in vitro p.óbához disszociált patkány-hipofízissejteket használunk, melyeket a próba előtt 4 napig sejttenyészetben tartunk fenn. A peptidek alkalmazására válaszképpen kialakult LH-szinteket a patkány-LH-ra specifikus radioimmunpróbával határozzuk meg. A sejttenyészeteket tartalmazó kontroll csészékhez csak 3 nanomol GnRH-t adunk, míg a kísérleti csészékhez 3 nanomol GnRH-t plusz 0,01—3 nanomol vizsgálandó peptidet. A csak GnRH-val kezelt mintákban szekretált LH mennyiségét összehasonlítjuk a peptiddel pluszGnRH-val kezelt mintákban szekretált LH-mennyiséggel. Akiszámított eredmények alapján meghatározzuk a vizsgált peptid és a GnRH mólkoncentrációjának azon arányát (aníagonista per GnRH), amely 3 nanomol GnRH által felszabadított LH mennyiségét a kontroll érték 50%ára csökkenti (ICR_S0): ezt az értéket 0,005-nek találtuk.

ín vivő próbában meghatározzuk a fenti peptidek nőstény patkányok ovulációjára gyakorolt gátló hatását. E próbában meghatározott számú, 225250 g súlyú érett nőstény Sprague-Dawley patkányt beoltunk kukoricaolajban felvett 5 pg peptiddel, déltájban a proösztrusz napján. A proösztrusz az ösztrusz (ovuláció) előtti dáutánra esik. Kontrollként külön nőstény patkánycsoportot használunk, melynek nem adunk be peptidet. A kontroll nőstény patkányok mindegyikénél ovuláció következik be az ösztrusz idején, a kezelt patkányok egyikénél sem jön létre ovuláció. A pepiid tehát nagyon hatásosan gátolja a nőstény patkányok ovulációját igen alacsony dózisokban, és a peptidet tökéletesen hatásosnak tartjuk 1 mg os dózisban.

A 2. számú peptidet hasonlóan szintetizáljuk és tisztítjuk. Az aminosavelemzés megtörténte után az optikai forgatóképességet fotoelektromos polariméterben meghatározva [cr|f) = -69,3° ± 1 (c = 1,50% ecetsav).

Az in vitro próbát hasonló módon végrehajtva azt találjuk, hogy a peptid ICR₅₀ értéke 0,011. In vivő 5pg dózist alkalmazva 10 patkány közül zérus,

2,5 pg dózisban pedig 2 állatnál következik be ovuláció.

A 6. számú peptidet hasonlóan szintetizáljuk és tisztítjuk. Az aminosavanalízis után hasonló módon végzett in vitro próba szerint a peptid ICR₅o értéke 0,008. In vivő próbában 2,5 pg dózis esetén 10 patkány közül zérus számú ovulál. A 8. számú peptidet hasonlóan vizsgáljuk in vivő 5 pg dózisban és 10 patkány közül csak 2 ovulál. A 2. számú peptidet vizsgálva 5 pg dózis alkalmazásakor 10 patkány közül zérus A 2,5 pg dózis esetén 10 patkány közül csak 3 ovulál.

A többi peptidet hasonlóan tesztelve azt találjuk, hogy színién hatásosan gátolják nőstény patkányok ovulációját igen alacsony dózisban.

A találmány szerinti peptideket gyakran alkalmazzuk gyógyszerészetileg elfogadható savaddíeiós sók, vagy fémkomplexek, például cinkkel, báriummal, kalciummal, magnéziummal, alumíniummal és hasonlókkal képezett sók (melyeket ennél az alkalmazásnál addíciós sóknak tekintünk), vagy a kettő kombinációjának formájában. Jellemző savaddíeiós só a hidroklorid, hidrogén-bromid, szulfát, foszfát, nitrát, oxalát, fumarát, glükonát, tannát, maleát, acetát, citrát, benzoát, szukcinát, alginát, pamoát, malát, aszkorbát, tartarát és hasonlók. Ha a hatóanyagot tabletta formájában kell alkalmazni, a tabletta gyógyszerészetileg elfogadható hígítót tartalmazhat, kötőanyaggal, mint tragankanttal, kukoricakeményítővel vagy zselatinnal, szétesést elősegítő szerrel, mint alginsawal, és sikosító anyaggal, mint magnézium-sztearáttal együtt. Ha folyékony formát kívánatos alkalmazni, a gyógyszerészetileg elfogadható hígító részeként édesítő és/vagy ízesítő anyagot lehet használni. Intravénás adagoláshoz izotóniás sóoldatot, foszfát puffer oldatokat és hasonlókat alkamazhatunk.

A találmány szerinti peptideket orvos irányítása mellett kell alkalmazni. A gyógyászati készítmények a peptidet általában szokványos, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt tartalmazzák. A dózis szokásosan mintegy 0,1-100 °g peptid per testsúly kilogramm. E peptidekkel a kezelés általában ugyanúgy történik, mint egyéb GnRH-antagonistákkal a klinikai kezelés.

E peptidek emlősöknek intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, orálisan, intranazálisan vagy intravaginálisan alkalmazhatók megtermékenyülés-gátlás és/vagy-szabályozás céljából. A hatásos dózisok az alkalmazás módjától és a kezelt emlős fajtájától függnek. Egy jellemző dózisforma fiziológiás konyhasóoldatban oldott pepiidből áll, melyet körülbelül 0,1 5 mg per testsúly kilogramm tartományban alkalmazunk. Orálisan a peptid szilárd vagy folyékony formában adható.

Bár a találmányt előnyös megvalósításának figyelembevételével írtuk le, mégis a szakember előtt nyilvánvaló módon változtatások és módosítások hajthatók végre a találmány szellemétől való eltérés nélkül. így például a peptidkémiában ismert egyéb szubsztitúciók, amelyek nem csökkentik jelentősen a peptidek hatékonyságát, szintén alkalmazhatók a találmány szerinti peptidekben.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás

X-Ri-R₂-R₃-Ser-Tyr-R₄-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (I) általános képietű dekapeptidek és savaddíeiós sóik előállítására, ahol

X hidrogénatomot, 1 -4 szénatomos alkanoil- vagy 2-5 szénatomos alkenoilcsoportot jeient,

Rj jelentése dehidro-Pro

R₂ jelentése F-D-Phe és

R₃ és R₄ jelentése D-Trp, vagy B-D-NAL, azzal a kikötéssel, hogy vagy R₃ vagy R₄ B-D-NAL-t jelent, azzal jellemezve, hogy

X’ R, -R₂ -R₃ -Ser(X² )-Tyr(X³ )-R₄ -Leu-Arg(X*)-Pro-Gly-NIIj (II) általános képietű deka pepiidről, alvói

X¹, X², X^s és X⁴ a peptidkémiában önmagában ismert védőcsoport, és

R_t, R₂, R₃ és R₄ a fenti,

186 007 és az N-terminális aminosav adott esetben a peptidkémiában önmagában Ismert gyantahordozóhoz kapcsolódik, a védőcsoportokat és az adott esetben jelenlévő gyantahordozót lehasítjuk, és - kívánt esetben a kapori peptidet savaddíciós sójává alakítjuk át.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű dekapeptidek előállítására, ahol

Rj jelentése 4-F-D-Phe, és

X, R,, R₃ és R₄ az 1. igénypontban megadott, azzal jellemezve, hogy olyan 01) általános képletű védett dekapetídekből indulunk ki, ahol R^r a fenti és X¹, X³, X⁴, X, R,, R₃ és R4 az 1. igénypontban megadott.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű dekapeptidek előállítására, ahol

R, jelentése dehidro-Pro.és

R₂, X, R₃ és R4 az 1. igénypontban megadott, azzal j e 11 e m ez v e, hogy olyan (II) általános képletű védett dekapeptidekből indulunk ki, ahol R, és Rj a fenti, és

X , X³, X³, X⁴, R₃ és R4 az 1. igénypontban megadott.
4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű dekapeptidek előállítására, ahol

R³ jelentése B-D-NAL, és

Rj,X, Rj és R₄ az 1. igénypontban megadott,
5 azzal j e I 1 e ra ez v e, hogy olyan 01) általános képletű védett dekapeptidekből indulunk ki, ahol R* és R³ a fenti, és

X¹, X¹, X³, X⁴ Rj és R4 az 1. igénypontban megadott.

5. A 4. Igénypont szerinti eljárás olyan 0) általá10 nos képletű dekapeptidek előállítására, ahol

R₃ jelentése B-D-2NAL és Rj, X, Rj és R₄ az 1. igénypontban megadott, azzal ] e 11 e m ez ve, hogy olyan (II) általános képletű védett dekapt,etidekből indulunk ki, ahol Rj ésR₃ a fenti, és '5 Xj, X₂, X₃, X_4> Rj és R4-4Z 1. igénypontban megadott.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás 0) általános képletű dekapeptidek előállítására, ahol

R₃ és R₄ jelentése B-D-2NAL, «θ Rj 4-F-D-Phe, és * X és Rj az 1. igénypontban megadott, azzal j e 11 e m ez v e, hogy olyan (II) általános képletű védett dekapeptidekből indulunk ki, ahol Rj, R₃ és R₄ a fenti, és

X , X , X³, X⁴ és Rj az 1. igénypontban megadott.