HU185677B - Process for preparing calmoduline from red blood cells - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből, a vörösvérsejtek hemolizálása, a hemolizátumból anioncserélő gyantával a kalmodulin kivonása, az anioncserélő gyantával a kalmodulinnak sóoldattal végzett első eluálása, az eluátum hőkezelése, a kicsapódott fehérjék elkülönítése, a kalmodulinnak anioncserélő gyantával végzett másodszori kivonása, majd sóoldattal végzett másodszori eluálása és adott esetben utótisztí- tása útján, amely abban áll, hogy az első eluálás utáni hőkezelést 80 °C és 100 eC közötti, előnyösen 85-90 °C hőmérsékleten 3-15 percen át, előnyösen 5 - 10 percen át végzik, és a másodszori eluálást 0,5 mól/1 és 0,95 mól/1 közötti, előnyösen 0,6-0,7 mól/1 töménységű vizes alkálifémsó-oldattal végzik. A találmány szerinti eljárás a kalmodulinnak olcsó nyersanyagból egyszerű és hatásos módon, tiszta formában való előállítását teszi lehetővé. -1-

Description

A találmány tárgya eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekböl.

Az utóbbi évek biokémiai kutatásának egyik fontos felismerése, hogy valamennyi élő sejtben a szabályozások központi molekulája egy 17 000 í mólsúlyú, kalcium-kötő fehérje, amelyet 1979-ben calmodulin-nak (a továbbiakban: kalmodulin) neveztek el (Sarkadi B., Szász I. és Gárdos G.: Haematologia 14, 121 — 136 (1981); Gietzen, K. és munkatársai, Proceedings of the International Vin- ¹ ca Alkaloid Symposium - Vindesine, Basel,

16-26. oldal, (1981); Cheung W. Y., Science 207, — 27 (1980)). A kalmodulin nagy mennyiségben, olcsón és tisztított formában való előállítása jelentős mértékben előrevinné a sejten belüli szabályo- 1 zások kutatását, gyógyszerként való alkalmazása új távlatokat nyitna a gyógyításban.

Ismeretes, hogy a kalmodulin a különböző szövetekben változó - általában 50 — 250 mg/kg szövet — mennyiségben fordul elő. A tisztított kalmo- 2 dulin előállítása igen sok lépésből álló, munka- és anyagigényes eljárás. Jelenleg két nyugati cég, a Fluka és a Sigma hoz forgalomba tisztított kalmodulint magas áron. Mindkét gyártó cég marhaagyból állítja elő a kalmodulint olyan költséges eljárás- I sál, amelynek megvalósításához a szövet homogenizálása és az oldható fehérjék kinyerése szükséges (Jamieson G. A. és VanamanT. C., Biochem. Biophys. Rés. Coinmun. 90, 1048— 1056 (1979)).

Ismeretesek irodalmi közlemények a kalmodulin ; vörösvérsejtekböl történő előállítására is (Sarkadi

B., Szász I. és Gárdos B., Bíochim. Biophys. Acta 598, 326-338 (1980)), de ezekben az eljárásokban ultracentrifugálással végzett membrán-mentesítés, többszörös gélkromatográfia, ultraszüréssel végzett 1 koncentrálás, valamint egyéb költséges tisztítási eljárások, pl. gél elektroforézis szerepelnek (Muallem S. és Karlish S. J. D., FEBS Letters, 107, 209-212 (1979)). A gyógyszergyárak által forgalomba hozott kalmodulin magas ára jól jelzi az / előállítás költségességét.

A találmány célja az ismert megoldások hátrányainak kiküszöbölésével olyan eljárás biztosítása, amely a kalmodulinnak olcsó és nagy mennyiségben rendelkezésre álló nyersanyagból egyszerű és .· hatásos módon, tiszta formában való előállítását teszi lehetővé.

A találmány alapja az a felismerés, hogy a kalmodulin egy lépésben, anioncserélő gyantás adszorpcióval kinyerhető vörösvérsejt hemolizátumá- [ ból, és így lehetővé válik mindenfajta membránmentesítést célzó eljárás, például ultracentrifugálás elkerülése.

A találmány további alapja az a felismerés, hogy az elkülönített kalmodulin hőkezeléssel és újabb ! ioncserélő gyantás kivonással jó hatásfokkal és nagy tisztaságban kinyerhető.

Fentiek alapján a találmány tárgya eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekböl, a vörösvérsejtek hemolizálása, a hemolizátumbó! anion- i cserélő gyantával a kalmodulin kivonása, az anioncserélő gyantáról a kalmodulinnak sóoldattal végzett első eluálása, azeluátum hőkezelése, a kicsapódott fehérjék elkülönítése, a kalmodulinnak anioncserélő gyantával végzett másodszori kivonása, i βΤ7 majd sóoldattal végzett másodszori eluálása és adott esetben utótisztítása útján,

A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy a; első eluálás utáni hőkezelést 80 °C és 100 °C közötti, előnyösen 85 - 90 °C hőmérsékleten 3-15 percen át, előnyösen 5—10 percen át végezzük, és a másodszori eluálást 0,5 mól/1 és 0,95 mól/1 közötti, előnyösen 0,6-0,7 mól/1 töménységű vizes alkálifémsó-oldattal végezzük.

i A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a vörösvérsejteket hipotóniás oldattal, célszerűen desztillált vízzel hemolizáljuk. A kalmodulin anioncserélő gyantás kivonását előnyösen batch-adszorpcióval végezzük, ami annyit l jelent, hogy a vörösvérsejt hemolizátumhoz keverjük az előre duzzasztott, pufferrel ekvilíbrált és kilevegöztetett anioncserélö gyantát. A kalmodulin néhány perces kevergetés után adszorbeálódik a gyantához. A kalmodulint az anioncserélő gyantá) ról célszerűen alkálifém-kloridot tartalmazó vizes oldattal, előnyösen vizes kálium-kloria oldattal eluáljuk. Az eluátumot célszerűen 70 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 80-90°C hőmérsékleten hőkezeljük. A hőkezeléssel kicsapott fehérjéket előnyösen centrifugálással különítjük el. A kalmodulin utótisztítását és sómentesítését célszerűen gélszűréssel végezzük.

Amennyiben a találmány szerinti eljárással előállított kalmodulint nem azonnal használjuk fel, célD szerű mélyhűtve, ill. fagyasztva-szárítva tárolni.

A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy emlős állatok vörösvérsejtjeit fiziológiás sóoldattal mossuk, majd a vörösvérsejt fiziológiás sóoldattal mossuk, majd a vörösvérsejt koncentrátu5 mot desztillált vízzel hemolizáljuk. A hemolizátumból dietil-amino-etil- (DEAE) Sephadex vagy DEAE cellulóz anioncserélő gyantával, batchadszorpcióval vonjuk ki a kalmodulint, majd a gyantáról 0,64 mól/1 KC1 oldattal eiuáljuk. Az 0 eluátumot 85 “C-on 3 percig hőkezeljük, majd a kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk.

A második kalmodulin kivonást is anioncserélő (DEAE Sephadex vagy DEAE cellulóz) gyantával, batch-adszorpcióval végezzük, majd a gyantát osz5 lopba töltjük. A kalmodulint ismét 0,64 mól/1 KC1 oldattal eluáljuk. A töményen eluált kalmodulint Sephadex gélszűréssel sómentesítjük és utótisztítjuk. A tisztított kalmodulint mélyhűtve tároljuk vagy fagyasztva-szárítjuk.

A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők:

a) Az emlős állatok szervezetében előforduló kalmodulin kémiailag egységes anyag; ezért mind vérpótlásra már fel nem használható készítményekből, mind vágóhídi állatok véréből ki lehet nyerni. Ez annyit jelent, hogy a vérellátó szolgálatban hulladékba kerülő vörösvérsejt-koncentrátum a találmány szerinti eljárással felhasználható kalmodulin előállítására. Ugyancsak felhasználható erre a célra iO a még nagyobb mennyiségben rendelkezésre álló és nagyrészt hulladékba kerülő vágóhídi vér.

b) Feleslegessé teszi az eddig ismert módszerek esetén szükséges szövethomogenizálást, az oldható fehérjék kivonását, valamint az igen nagyszámú _i5 egyéb fehérjefrakcióktól való költséges és munka-2185677 igényes elkülönítést. Ezért egyszerű és olcsó, aminek révén a kalmodulin nagy mennyiségben való előállítását is lehetővé teszi.

c) A kalmodulin natív formájának kinyerését eredményezi, amelyet egyszerűen és gyorsan meg lehet tisztítani az egyéb, hőre kicsapódó fehérjéktől.

d) A termék az olcsó előállítási eljárás ellenére eléri az irodalom szerinti maximális aktivitást és tisztaságot.

A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg.

1. példa '

Kiindulási anyagként két zsák, egyenként 400 ml savanyú citrát-dextróz (ACD) oldatban tartósított humán vérkészítmény hulladékként megmaradt vörösvérsejt koncentrátumát használjuk. A vörösvérsejt-üledéket háromszor mossuk 0,16 mól/1 NaCÍ oldattal, egyenként tíz percig tartó, 2500 g-vel végzett centrifugálásokkal.

A tömény vörösvérsejt masszát (600 ml) desztillált vízzel 5000 ml-re kiegészítjük, majd 5 percig tartó hemolizálás után a hemolizátumoí 8-rétegű gézpólyán átszűrjük. A szűrlethez 4 g DEAE Sephadex A 50 anioncserélő gyantát (Pharmacia, Uppsala, Svédország) adunk, amelyet előzőleg 100 ml 0,16 mól/1 KC1+16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös puíTeroldattal ekvilibráltunk és vákuum alatt kilevegőztettünk. Az oldat pH-ját 10%-os ecetsavval 6,5-re állítjuk, majd 30 percig szobahőmérsékleten kevergetve állni hagyjuk.

A Sephadex-szel elkevert hemolizátumot 10 cm átmérőjű G 1-es üvegszürőn átszűrjük, és a szűrőn fennmaradó Sephadex-et folyamatosan mossuk először 1 liter 0,16 mól/1 KC1+ 16 mmól/i imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal, majd a gél teljes kifehéredéséig kb. 1 liter 0,32 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal.

A kalmodulint tartalmazó fehérje frakciót 250 ml 0,64 mól/1 KC1+ 16 mmól/Ί imidazol-HCl pH

6,5-ös oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 percig 90 °C-on hőkezeljük, majd a lehűtött oldatból kicsapódó fehérjéket 10 percen át 4000 g-vel végzett centrifugálással kiülepítjük.

A felülúszót desztillált vízzel négyszeresére hígítjuk, majd 0,5 g 0,16 mól/1 KC1 + 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal ekvilibrált és vákuumban kilevegőztetett DEAE Sephadex A 50 anioncserélő gyantát adunk hozzá. 30 percig szobahőmérsékleten kevergetjük, majd 2x5 cm-es kromatografáló oszlopba töltjük. Az oszlopot 3 oszloptérfogat 0,16 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös, ill. ezután 0,32 mól/1 KC1+16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldatokkal mossuk. A mosást minden esetben addig folytatjuk, amíg a frakciók 280 nm-cn mért abszorpciója 0,020-nál kisebb nem lesz. A tisztított kalmodulint 12 ml 0,64 mól/1 KC1+16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal eluáljuk.

A 12 ml kalmodulin-íartalmú oldatot 17 mmól/1 imidazol-HCl + 50 mmól/1 CaCl₂ pH 7-es pufiFeroIdattal ekvilibrált Sephadex G 100 oszlopon gélszűréssel sómentesítjük és utótisztítjuk. Az oszlop mérete: 2 ct> x 70 cm; a pufferoldat átfolyási sebessége: 50 ml/óra; az egyes frakciók térfogata: 3 ml. A kalmodulin-aktivitással rendelkező frakciókat (kb. 30 ml) összegyűjtjük és liofilizáljuk.

Az így kapott készítmény nátrium-dodecil-szulfát (SDS) gél-elektroforézissel vizsgálva a kalmodulin 17 000-es mólsúlyának megfelelő helyen standard fehérjékkel ellenőrizve egy fehérjecsíkot ad. A készítmény biológiai aktivitását vörösvérsejt membrán kalcium-transzportjára kifejtett aktiváló hatással mérjük. Irodalmi adatoknak megfelelően (Scharff O., Cell Calcium 2, 1 -27 (1981)) a tisztitett kalmodulin 20-50 nmól/g membrán fehérje arányban fejt ki 50%-os aktivitás-növekedést (K_{0 5}). 500 g vörösvérsejtből 7 mg kalmodulint kapunk, ami 30%-os kinyerésnek felel meg.

2. példa

Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azonban kiindulási anyagként citrát-oldattal frissen levett 1 liter marhavért használunk.

A kalmodulint az 1. példában megadott azonos tisztaságban 26%-os hozammal kapjuk.

3. példa

Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a szűrt hemolizátumhoz 20 g DEAE cellulózt adunk, amelyet előzőleg savval és lúggal ciklizáltunk, majd 100 ml 6,5-ös pH-jú pvfferoldattal (0,16 mól/1 KC1+ 16 mmól/I imidazol-HCl) ekvilibráltunk. Az oldat pH-ját 10%-os ecetsavva! 6,5-re állítjuk be, majd az oldatot 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A DEAE cellulózról a hemolizátumot dekantáljuk, majd a gélt 10 cm átmérőjű, szűrőpapírral kibélelt porcelán szűrőbe öntjük. A továbbiakban az I. példa szerinti módon járunk el.

A kapott termék hozama és tisztasága azonos az

1. példában megadottal.

4. példa

Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az első DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint tartalmazó eluátumot 15 percig hőkezeljük 80 °C-on. A kapott termék hozama és tisztasága azonos az 1. pé'dában megadottal.

5. példa

Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a második DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint 0,55 mól/1 KC1+ 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5ös oldattal eluáljuk. A terméket 24%-os hozammal kapjuk. Tisztasága megegyezik az 1. példában megadottal.

-3185 677

6. példa

Mindenben az 1. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a második DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint 0,9 mól/ 1 KCI + 16 mmól/1 imidazoI-HCI pH 6,5-ös oldattal eluáljuk. A terméket 29%-os hozammal kapjuk. Tisztasága megegyezik az 1. példában megadottal.

7. példa

Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a kalmodulin utótisztítását Sephadex G-100 oszlopon történő gélszürés helyett ammónium-szulfátos precípitálással végezzük. A második DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint tartalmazó fehérje frakciót 0,1 n NaOH oldattal 7,0 pH értékre állítjuk, majd 50% telítésig telített ammónium-szulfát oldatot adunk hozzá. A kicsapódott fehérjéket 30 percig 10 000 x g-n történő centrifugálással eltávolítjuk. A csapadékot eldobjuk, majd a felülúszót pH 4,0-re állítjuk 50% ammónium-szulfátot tartalmazó 0,5 mól/1 H₂SO₄ oldattal. Az oldatot 1 óráig jégfürdőn állni hagyjuk, majd 30 percig 10 000 x g-n történő centrifugálással kiülepítjük a kalmodulin-tartalmú csapadékot. Az így nyert tiszta kalmodulint dialízissel vagy Sephadex G-25 oszlopon történő gélszüréssel szulfátmentesítjük, majd a terméket Iiofilizáljuk. A kapott termék hozama és tisztasága mindenben megegyezik az 1. példában megadottal.

Claims (3)

1. Eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből, a vörösvérsejtek hemolizálása, a hemolizá¹θ tűmből aníoncserélő gyantával a kalmodulin kivonása, az anioncserélő gyantáról a kalmodulinnak sóoldattal végzett első eluálása, az eluátum hőkezelése, a kicsapódott fehérjék elkülönítése, a kalmodulinnak anioncserélő gyantával végzett másodszo¹5 ri kivonása, majd sóoldatta! végzett másodszori eluálása és adott esetben utótisztítása útján, azzal jellemezve, hogy az első eluálás utáni hőkezelést 80 °C és 100°C közötti, előnyösen 85-90°C hőmérsékleten 3-15 percen át, előnyösen 5-10 per20 cen át végezzük, és a másodszori kivonást 0,5 mól/1 és 0,95 mól/1 közötti, előnyösen 0,6-0,7 mól/1 töménységű vizes alkálifémsó-oldattai végezzük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kalmodulin mádo25 szőri eluálását alkálifém-kloridot tartalmazó vizes oldattal végezzük.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kalmodulin másodszori eluálását vizes kálium-klorid oldattal végez30 zük.