HU185427B

HU185427B - Process for preparing antagonists of hormone releasing luteinizing hormone

Info

Publication number: HU185427B
Application number: HU811620A
Authority: HU
Inventors: Andrew V Schally; David H Coy
Original assignee: Schally Andrew Victor; Coy David Howard
Priority date: 1980-06-02
Filing date: 1981-06-01
Publication date: 1985-02-28
Also published as: DK239781A; JPS5714568A; ATE8988T1; GR75673B; EP0041286B1; PT73105B; ES502688A0; IE811213L; EP0041286A1; FI811682L; IE51657B1; ES8207511A1; ZA813356B; PT73105A; AU7125381A; DE3165535D1

Description

A találmány tárgya eljárás új, (I) általános képletű dekapeptidek előállítására, amelyek a luteinizáló hormont felszabadító hormon(LH-RH) antagonistái. Az (I) általános képletben

X jelentése hidrogénatom, 1 -4 szénatomszámú alkanoilcsoport, vagy HOOC-(CH₂)_n-CO-csoport, amelyben n értéke 2—6-ig terjedő egész szám;

R¹ jelentése Gly ,L-Ala,D-Ala, D-Trp,D-Phe vagy DPhe, amely szubsztituensként para helyzetben halogénatomot tartalmaz;

R² jelentése D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben halogénatomot tartalmaz;

R³ jelentése D-Trp;

R⁴ jelentése D-Trp vagy D-Phe és

R^s jelentése Gly vagy D-Ala.

Az (I) általános képletű vegyüíetek a szokásos peptid szintézissel, vagy az ún. szilárd fázisú technikával lehet előállítani. A találmány szerinti vegyületet az emberi és állati gyógyászatban a gonadotrop hormonok, folliculus hormonok és a luteinizáló hormon szabályzására lehet felhasználni.

X-R¹-R-R^Ser-Tyr-R^Z,-Leu-Arg-Pro-R⁵-NH₂ . (I )

-1185 427

A találmány tárgya eljárás olyan új, (1) általános képlett! peptidek előállítására, melyek a luteinizáló hormon releasing hormon (LH-RH) antagonistái.

Pontosabban a találmány tárgya eljárás a luteinizáló hormont felszabadító hormon (LH-RH) analógoknak, azok sóinak, valamint ezeket a vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.

A találmány szerinti LH-RH analógok szerkezete abban különbözik az. LH-RH-tól, hogy az 1,2 és 6. helyzetben levő, illetve adott esetben a 3-as és 10-es helyzetben levő aminosav rész más aminosav résszel van helyettesítve.

A kutatók már néhány éve keresik az LH-RH dekapeptidek hatékonya antagonistáit. Ld. D. H. Coy és A. V. Chally, Annals of Clinical Research, 10, 139, 1978-ban megjelent cikkét.

Az ilyen antagonisíákkal kapcsolatos nagy érdeklődés onnan származik, hogy ezek igen hatásosak az endokrinológia és a rák ellenes küzdelem területén. Nagy számú vegyületet állítottak elő, melyek az LH-RH potenciális antagonistái, de közülük legtöbb nem volt hatásos, vagy az LH-RH dekapeptidekkel kevert agonista és antagonista tulajdonságot mutattak. Az eddig előállított fontosabb antagonisták tulajdonképpen módosított struktúrájú LH-RH vegyületek. Ilyenek például a (D-Phe² )-LH-RH, [R. A. W. Rees et. al., J.Med. Chem., 17, 1016 (1974)]; (D-Phe²,D-Phe⁶ )-LH-RH, (D-Phe²,Phe³,D-Phe⁶ )-LH-RH és (D-Phe² ,D-Trp³ -D-Phe⁶ )-LHRH, [D. H. Coy et. al., Peptides 1976, A. Loffet, Ed., Editions de l’Universite de Bruxelles, Brüsszel, Belgium, 1977, p. 463]; (D-p-F-Phe²-D-Ala⁶ )-LH-RH, [C. W. Beattie et. al., J. Med. Chem., 18, 1247 (1975)] és (AcD-Phe¹-D-Phe²-D-Trp^3,6)-LH-RH, [K. Channabasavaiah és J. M. Stewart, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 86, 1266 (1979)].

A találmány szerint előállított tiszta LH-RH antagonisták sokkal hatékonyabbak, mint az eddig közölt LHRH antagonisták bármelyike.

A találmány szerint előállított (1) általános képletü vegyületekben, azaz az LH-RH analógokban

X jelentése hidrogénatom, rövidszénláncú alkanoiicsoport, H00C-(CH₂ )_n —CO csoport, amelyben n értéke 2 6-ig terjedő egész szám;

R¹ jelentése Gly, L-Ala, D-Ala, D-Trp, D-Phe vagy D-Phe, amely szubsztituensként para-helyzetben halogénatomot tartalmaz;

R² jelentése D-Phe, mely a fenil-csoportban szubsztituensként halogénatomot tartalmaz;

R³ jelentése D-Trp,

R⁴ jelentése D-Trp vagy D-Phe és R⁵ jelentése Gly vagy D-AIa.

Azok az (1) általános képletü vegyületek előnyösek, amelyekben X jelentése hidrogénatom, rövidszénláncú alkanoilcsoport, HOOC-(CH₂)_n-CO- csoport, amelyben n jelentése 2—6-ig terjedő egész szám, R¹ jelentése D-Trp, D-Phe vagy olyan D-p-Z-Phe, amelyben Z jelentése halogénatom; R² jelentése D-p-Z-Phe amelyben Z jelentése a fenti; R³ jelentése D-Trp; R⁴ jelentése D-Trp, D-Phe vagy olyan D-p-Z-Phe, amelyben Z jelentése a fenti és R⁵ jelentése D-AIa.

Az (I) általános képletü vegyületek másik előnyös csoportjába azok tartoznak, amelyekben X jelentése hidrogénatom, rövidszénláncú alkanoilcsoport, vagy HOOC-(CH₂)_n-CO, amelyben n értéke a fenti; R¹ jelentése D-Trp, D-Phe vagy D-p-halo-Phe; R² jelentése D-p-halo-Phe; R³ jelentése D-Trp; R⁴ jelentése D-Trp ? agy D-Phe; R⁵ jelentése D-Ala.

Az (I) általános képletü vegyületek további előnyös g csoportjába azok tartoznak, amelyekben X jelentése acetil-csoport, vagy HOOCCH₂CH₂CO-csoport; R¹jelentése D-Trp, D-Phe vagy D-p-Cl-Phe; R² jelentése Dp-Cl-Phe; D-p-Br-Phe vagy D-p-F-Phe; R³ jelentése D-Trp; R⁴ jelentése D-Trp vagy D-Phe; és R⁵ jelentése _1θ D-Ala.

A találmány tárgyát képezik az (I) általános képletü vegyületek gyógyászatilag elfogadható sóinak az előállítása is.

Az (I) általános képletü vegyületeket a szokásos pépig *id szintézissel, vagy szilárdfázisú eljárással állítjuk elő.

Az (I) általános képletü vegyületek előállíthatok, ha eltávolítjuk a védőcsoportot, vagy (védőcsoportokat) valamely (II) általános képletü adott esetben védett Nterminális aminocsoportot tartalmazó peptidről, amely20 ben R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentései a fentiek és R⁶, R⁷és R⁸ jelentései hidrogénatom vagy valamely védőcsoport, és Y jelentése aminocsoport vagy gyantához kötött amin rész, azzal a feltétellel, ha Y jelentése aminocsoport, akkor R⁶, R⁷ és R⁸ csoportok közűi legalább 25 ^,;gy védőcsoport vagy az N terminális aminocsoport védett, továbbá adott esetben az olyan (I) általános kép’etű pepiidet, amelyben X jelentése hidrogénatom, kívánt esetben acilezzük, ily módon olyan (I) általános képletü pepiidet kapunk, amelyben X jelentése a tárgyi 3Q körben megadott acilcsoport és/vagy a kapott peptidet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

A (IV) általános képletü vegyületekben, amelyek valamely szilárd hordozógyantához kapcsolódnak és aimino-védőcsoportot tartalmaznak, R —R⁸ jelentése a 35 fenti és R.⁹ jelentése valamely a-amino-védőcsoport, amely a polipeptidek lépcsős szintézisénél hasznosnak ismert. Alkalmas csoportokat a későbbiekben említünk, ás A jelentése hordozógyantához kötött NH—CHPh-Ph;soport, vagy hordozógyantához kötött 0CH₂-Ph4θ csoport.

A gonadotropin hormonokat antagonizáló gyógyászati készítményeket úgy állítjuk elő, hogy valamely (I) általános képletü vegyületet a szokásos gyógyászati hordozókkal elkeverünk.

A fentiekben használt „rövidszénláncú alkanoilcsoport” olyan egyenes szénláncú alkanoiiesoportokat jelent, melyek 1-4 szénatomosak, például formil, acetil-, propionil-, vagy butirilcsoport, továbbá elágazó szénláncú alkanoilcsoportok, például izobutirilcsoport.

A „szerves proton akceptor” kifejezés szerves bázisokat vagy aminokat jelent, mint például trietil-amin, piridin, N-ctilmorfolin, imidazol és hasonlóak.

A „halogén” kifejezés klór-, bróm-, fluor- vagy jódatomot jelent.

Valamely aminosav „acilrésze” kifejezés olyan csoportot jelent, melyet a megfelelő aminosavból kapunk, ha annak karboxilcsoportjából a hidroxil csoportot eltávolítjuk.

Az „aminosav rész” olyan csoportokra utal, melyeket a megfelelő aminosavból úgy kapunk meg, hogy a karboxilcsoport hidroxilcsoporíját és az aminocsoport egyik hidrogénjét eltávolítjuk.

N^u az arginin oldal láncában levő nitrogénatomot jelenti.

185 427

A Ph-szimbóhim jelentése fenilcsoport, és a -Phjelenlése 1,4-fenilén-csoport.

Ac jelentése „acetilcsoport”. Succ jelentése „HOOC— -<CH₂)₂-CO” csoport, azaz succinil-csoport, egy 3karboxi-1 -propion ilcsoport.

Az itt használt rövidítések, melyeket az aminosavak és a védőcsoportok jelölésére használunk, általában az IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature ajánlásain alapulnak, ld. Biochemistry II, 1726(1972.). Például a t-Boc jelentése t-butil-oxi-karbonil-csoport, Z jelentése benziloxi-karbonilcsoport, Tos jelentése tozilcsoport és Bzl jelentése benzilcsoport. A különböző aminosavak jelölésére használt rövidítések a következők: Alá, alanin; Arg, arginin; Gly, glicin; Leu, leucin; Phe, fenil-alanin; Pro, prolin; Ser, serin; Trp, triptofán; és Tyr, tirozin. Az összes itt leírt aminosav L-konfigurációjú, hacsak másként nem jelöljük. Például D-Ala a Dalanil-csoport, a D-Phe viszont D-fenilalanilcsoport, D-Trp egy D-triptofil csoport.

A találmány szerinti LH-RH analógokat sav-addíciós sók alakjában is előállíthatjuk. A sóképzésre alkalmas szerves savak közül megemlítjük pl. az ecetsavat, tejsavat, borostyánkősavat, benzoésavat, szalicilsavat, metán-szulfonsavat, és a p-toluol-szulfonsavat, valamint polimer savakat, mint például csersav, vagy karboximetil-ceilulóz. A sóképzésre alkalmas szervetlen savak közül a következőket említjük; halogénhidrogénsavak, például sósav, továbbá kénsav, vagy foszforsav. Adott esetben egy bizonyos sav-addíciós só más sav addíciós sójává is átalakítható, az átalakítás úgy történhet, hogy a nem-mérgező, -gyógyászatilag elfogadható savval alkotott sót a megfelelő ioncserélő gyantával kezeljük, R. A. Boissonnas és munkatársai által leírt módszer szerint [Helv. Chim. Acta., 43, 1349 (1960)]. Alkalmas ioncserélő gyanták például a cellulóz kationcserélők, például karboxi-metilcellulóz, vagy a kémiailag módosított hálós szerkezetű dextrán kationcserélők, mely utóbbiakat Sephadex C kereskedelmi néven árulják. Továbbá, az erősen bázikus anioncserélő gyanták, például azok, melyeket J. P. Greenstein és M. Winitz sorolnak fel a „Chemistry of the Amino Acids” (Jolin Wi-ey and Sons, Inc., New York and London, 1961, Vol. 2. p. 1456) című könyvben. Ezeknek a gyógyászatilag elfogadható sav-addíciós sóknak az előállítása is a találmány tárgyát képezi.

így tehát a találmány tárgyát képezik azoknak az (I) általános képletű vegyületeknek az előállítása is, amelyekben a HOOC-(CH₂)_n-CO— csoport, amelyben n értéke 2—6-ig terjedő egész szám, valamely gyógyászatilag elfogadható szerves és szervetlen bázissal alkotott sóinak előállítása is. Ezek a sók ugyanolyan hatékonyak, mint azok a savak, amelyekből származnak. A savak nagyon jó kihozatallal alakíthatók át a megfelelő gyógyászatilag elfogadható sókká úgy, hogy az illető savat a megfelelő szervetlen vagy szerves bázissal közömbösítjük. Ezen savak előállítására alkalmas szervetlen bázisok például a hidroxidok, karbonátok, hidrogén-karbonátok, a gyógyászatilag elfogadható alkáli-fémek vagy alkáliföldfémek, pl. nátrium, kálium, magnézium, kalcium és hasonlók alkoxidjai. Az alkalmas szerves bázisok közül megemlítjük az aminokat, köztük a mono-, di- és trialkilaminokat, azokat az alkilcsoportokat, melyek legfeljebb 3 szénatomot tartalmaznak, például metil-amin, dimetil-amin, trimetil-amin, etilamin, di- és trietil-amin, N-metil-N-etilamin, és hasonlók, továbbá mono-, di- és irialkanolaminokat, amelyek alkanol csoportjai legfeljebb három szénatomot tartalmaznak, például mono-, di-, é: trietanol-amin.

A (II) általános képletű vegyületek közül azokat használhatjuk előnyösen, amelyekben X, R¹-R⁵-ig bezárólag, valamint Y jelentése a fenti, R⁶ jelentése a szerin hidroíilcsoportját védő csoport, amely lehet 2-brómbenzciloxi-karbonil-, benzil-, acetil-, tozil-, benzoil-, tercbutil-, tetrahidropira-2-yl-, tritil-, 2,4-diklórbenzil- vagy benziloxi-karbonil-csoport; R⁷ jelentése hidrogénatom, vágj' a tirozin hidroxil csoportját védő csoport, mely az R⁶ védőcsoportjai közül választható és R⁸ jelentése az arginin N⁵, Ν^ω és Ν^ω nitrogén atomjait védő csoport, amely tozil-, nitro-, benziloxi-karbonil-, vagy adamantiloxi-karbonil-csoport. A (II) általános képletű vegyületek másik célszerű alakja olyan, ahol a szerin és tirozil csoportok. nincsenek védve és az arginin csoportot valamely erős sav addíciós só formájába védjük, például sósavval, p-toluonszulfonsavval, vagy kénsawal alkotott savaddíciós sók formájában.

A találmány szerint előállított vegyületek értékes LHRH arűagonizáló tulajdonságát a szabványos farmakológiái eljárással demonstráljuk. A hatás demonstrálható például A. de la Cruz et. ah, Science, 191, 195 (1976), által leírt vizsgálattal. Ennél a módszernél ivarérett nőstény patkányokat használunk (Charles River Breeding Laboratories, Boston, Mass., USA) melyek körülbelül 200 g súlyúak és normális 4 napos ciklussal rendelkeznek. Az analógokat 20 %-os propilén-glikoiban, fiziológiás só oldatban adagoljuk (ld. 2. táblázat), vagy kukorica olajban szuszpendálva (ld. 1. táblázat) az oestrus előtti napon déli 12 órakor. Másnap a patkányokat elpusztítjuk, a petevezetéküket és az uterust sós vízzel kimossuk és a mosófolyadékot megvizsgáljuk, van-e benne pete.

A különböző analógokkal elvégzett vizsgálati eredményeket a II. táblázat mutatja. Az I. táblázatban azokat az (I) általános képletű vegyületeket hasonlítjuk össze a (7). példa szerint előállított vegyülettel, illetve a korábban ismert (Ac-D-Phe¹, D-Phe², D-Trp^3,6)-LH RH vegyületekkei, amelyekben X jelentése acetilcsoport, R¹ jelentése D-Phe, R² jelentése D-p-Cl-Phe, R³ jelentése D-Trp, R⁴ jelentése D-Trp és R⁵ jelentése Gly. Mint fent megjegyeztük, az 1. és 2. táblázatban közölt vegyületeket különböző hordozók kíséretében adagoltuk.

I. táblázat

Peteérést gátló hatások összehasonlítása

Peptid	Dózis meg	Ovuláció %-os kimaradása
(Ac-D-Phe¹, D-p-Cl-Phe²,	31	100
D-Trp^3f' )-LH-RH	15	100
(Ac-D-Phe¹, D-Phe²,	250	100
D-Trp³·⁶ )-LH-RH*	100	40

*K. Channabasavaiah és J. M. Stewart, Biochem. Bio phys. Rés. Commun.,66, 1226 (1979).

-3185 427

II. táblázat

Az (1) általános képletű vegyületek peteérést gátló hatása.

Peptid	Dózis mg	Az ovuláció %-os kimaradása
(D-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³, D-Phe⁶ )-LH-RH (D-Phe¹, D-p-Br-Phe²,	0,25 0,125 0,25	82 11 50
D-Ττρ³, D-Phe⁶ )-LIíRH (D-Phe¹, D-p-F-Phe², D-Trp³, D-Phe⁶ )-LH-RH
0,25	10
(Succ-D-Phe¹, D-p-Cl-Phe²,	0,125	80
D-Trp³, D-Phe⁶ )-LH-RH	0,062	50
(Ac-D-Phe¹, D-p-Cl-Phe²,	0,062	100
D-Trp³·⁶ )-LH-RH	0,031	64
(N-Ac-D-p-Cl-Phe¹·², D-Trp^3,6 )-LH-RH	0,015	70
(N-Ac-D-Trp^-⁶. D-p-ClPhe² )-LH-RH	0,015	90
(N-Ac-D-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³·⁶, D-Ala¹⁰)-LH-RH	0,015	100
(N-Ac-D-p-Cl-Phe^1,2, D-Trp³, D-Phe⁶, D-A3a¹⁰)-LH-RH	0,0075	88
(N-Ac-D-Trp¹, D-p-Cl-Phe²,	0,0075	75
D-Trp³, D-Phe⁶, D-Ala⁵⁰)LH-RH	0,0050	38
(N-Ac-D-pF-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³’⁶,	0,0075	50
D-Ala¹⁰)-LH-RH (N-Ac-Ala¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³·⁶, D-Ala¹⁰)-LH-RH	0,010	18

A találmány szerinti vegyületek, LH-RH antagonizáló tulajdonságai alkalmassá teszik őket az ember- és az állatorvosi gyakorlatban való alkalmazásra. Például az (I) általános képletű vegyületek alkalmasak, arra, hogy emlősöknél enyhítsük a hipofízis gonadotrop hormonjainak nemkívánt fiziológiai hatásából eredő komplikációkat. Ilyen komplikációk például az idő előtti pubertás, a hormontól függő rosszindulatú és jóindulatú prosztata tumorok, az emlő, a petefészek és hererák; a hirszutizmus; akne; amenorrhea; például második amenorrhea; endometriózis valamint a petefészek és emlők cisztás megbetegedései mind állatok, mind pedig emberek esetében. Az (I) általános képletű vegyületek használhatók továbbá az. ovuláció szabályozására; így alkalmas szernek bizonyultak a termékenység szabályozásánál mint például prekoitális, vagy postkoitális fogamzásgátlók, használhatók továbbá az oesztrusz szinkronizálására, és a „ritmus” módszer tökéletesítésére. Ezek a vegyületek használhatók továbbá az emberi menopauzális gonadotrop hormon, follikulus stimuláló hormon (FSH) és a lüteinizáló hormon (LH) szabályozására, a perimenopauzális és postmenopauzális periódusok alatt nőknél.

Amikor az (I) általános képletű vegyületeket célszerűen savaddíeiós sói formájában az emberi vagy állati gyógyászatban alkalmazzuk, ezek rendszeresen adagol4 hatók akár orálisan, vagy szubkután, illetve iníramuszkuláris injekció formájában, vagy nyelv alatti, nazális vagy vaginális adagolásban, a gyógyászatilag elfogadható adalékanyagok vagy segédanyagok kíséretében.

Az (I) általános képletű vegyületek dózisai függnek az adagolás módjától és a kezelés alatt álló pácienstől magától. A kezelést általában kis dózisokkal kezdjük, lényegesen kisebbekkel mint az illető vegyület optimális adagja. Ezután kis lépcsőkben növeljük a dózist, amíg az illető körülmények között az optimumot el nem érjük. Általában a vegyületeket olyan koncentrációban célszerű adagolni, amely gátolja az LH- és az FSH felszabadítását anélkül azonban, hogy bármely káros, vagy veszélyes mellékhatás lépne fel és célszerűen 10 mcg-tól 1000 meg/testsúly kg tartományban adagoljuk, bár mint korábban már említettük, változtatás lehetséges. A 25 mcg-tól 250 meg/testsúly kg adagolási szint azonban kívánatosabb, a kellő hatás kiváltása érdekében.

A nazális úton történő adagolás cseppek, vagy permet formájában történhet és ez alkalommal célszerű az (I) általános képletű vegyületet steril vizes oldatban használni, amely más egyéb oldószereket, például pufferokat, vagy konzerváló anyagokat, valamint elegendő mennyiségű gyógyászatilag elfogadható sókat, vagy glukózt tartalmaz, amivel az oldatot izotóniássá tesszük. Az intranazális úton történő adagolásnál a dózisok 100 mcg-től 10 mg/kg tartományban vannak, vagy célszerűen 100 mcg-től 1 mg/testsúly kg tartományban.

Az (I) általános képletű vegyületek nazális vagy vaginális alkalmazásnál porok formájában is használhatók. Ilyen célra a dekapeptidet finoman eloszlatott szilárd formában adagoljuk a gyógyászatilag elfogadható sziláid hordozókkal együtt, például finoman eloszlatott polietilén-glikolt, melyet „Carbowax 1540” kereskedelmi néven árulnak; továbbá, finoman eloszlatott laktóz, vagy különösen vaginális alkalmazás esetén nagyon finoman eloszlatott szilikagél, például „Cab-O-Sil” kereskedelmi néven árult szilikagél használható. Ezek a kompozíciók egyéb excipienseket is tartalmazhatnak, finoman eloszlatott formában, például konzerváló anyagokat pufferokat, vagy felületaktív anyagokat.

A nyelv alatti, vagy vaginális adagolás esetében a vegyületet szilárd dózis formában készítjük el, például nyelv alá helyezhető tabletták, vagy vaginális kúpok, melyek elegendő mennyiségű szilárd hordozót, például keményítőt, laktózt, bizonyos típusú agyagokat, pufferokat, nedvesítő anyagokat, szétesést elősegítő anyagokat, vagy felületaktív anyagokat, illetve félig szilárd hordozókat tartalmazhatnak, amelyeket a kúpok készítésénél általában használnak. Az ilyen hordozóanyagokra példákat találunk a szabványos gyógyászati szövegekben, például „Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1970. című könyvben.

Sokszor kívánatos, hogy az (I) általános képletű vegyületeket folyamatosan, hosszú időn keresztül adagoljuk, hosszan ható, lassan felszabaduló, vagy raktározott dózis formájában. Ilyen dózis formák vagy az (I) általános képletű vegyületnek valamely testnedvekben rosszul oldódó gyógyászatilag elfogadható sav addiciós sóját tartalmazzák, például az alább felsorolt sók közül valamelyiket, vagy magát a vízoldható sót valamely olyan védő hordozóval együtt, ami megakadályozza annak gyors felszabadulását. Ez utóbbi esetben például a vegyületet egy nem-antigén, részben hidrolizált zselatinnal együtt, viszkózus folyadék formájában készíthet-41

185 427 jük el; vagy adszorbeáltatliatjuk valamely gyógyászatilag elfogadható szilárd hordozóra, pl. cink-hidroxidra, vagy valamely gyógyászatilag elfogadható folyadékban szuszpendálva adagolhatjuk; vagy elkészíthetjük a dekapeptidet gél, vagy szuszpenzió formájában is, valamely védő, 5 nem-antigén hidrokolloiddal együtt, pl. nátrium-karboximetilcellulóz, polivinil-pirrolidon, nátrium-alginát, zselatin, poligalakturon-sav, például pektin, vagy bizonyos mukopolíszaharidok kíséretében vizes, vagy nem-vizes gyógyászatilag elfogadható folyadékokkal, konzerváló -jq anyagokkal, vagy felületaktív anyagokkal együtt.

Az ilyen készítésmódokra a szabvány gyógyászati szövegekben találhatunk példákat, pl. a Remington’s Pharmaceutical Sciences, fent idézett című műben. Hosszan ható, lassan felszabaduló készítményeket mikro-kapszulázás útján is előállíthatunk, ahol gyógyászatilag elfogadható bevonóanyagokat alkalmazunk, pl. zselatint, polivinil-alkoholt, vagy etil-cellulózt. A mikro-kapszulázás céljaira használható bevonóanyagokia további példákat találunk a J. A. Herbig „Encyclopedia of Chemical Technology”. Vol. 13. 2. kiadás, Wiley, New York, ²θ 1967, pp. 436—456. oldalán. Az ilyen készítésmódok, valamint a vegyület sójának szuszpenziói, amelyek csak lassan oldódnak a testnedvekben, azt a célt szolgálják, hogy testsúly kilogrammonként kb. 10-1000 milli centigramm mennyiség szabaduljon fel naponta, és ezeket célszerűen intramuszkuláris injekció formájában adagoljuk. Más változat szerint a fent felsorolt szilárd formájú dózisok elkészíthetők tabletták formájában például úgy, hogy bizonyos vízben rosszul oldódó sókat, vagy diszperziókat a vegyület sójára, mint szilárd hor- ³dozóra abszorbeálunk, például használhatjuk az etilénglikol-metakrilát, vagy hasonló monomerek hálós szerkezetű polimerjének semleges hidrogéljét, melyet a 3 551 556 lajstromszámú egyesült államokbeli szabadalmi leírás tartalmaz (1970. dec. 29. K. Kliment és ³társai). Ezekből a tablettákból a hatóanyag kb. hasonló mértékben szabadul fel, mint a fent említettekből és ezeket szubkután, vagy intramuszkuláris injekciók formájában adagolhatjuk. _4Q

Megint más változat szerint hosszú ideig tartó, lassú hatást érhetünk el azáltal, ha a találmány szerinti vegyületet egy intra-vaginális eszköz, vagy ideiglenes implant formájában adagoljuk. Ez lehet például egy nem irritáló szilikon polimerből, például polisziloxánból készült tartály, amit kereskedelmi néven „Silastic” elnevezéssel árusítanak, vagy valamely fent említett polimer semleges hidrogéljéből készült tartály, amely olyan mértékű áteresztő képességgel rendelkezik, hogy testsúly kilogrammonként kb. 0,1 mcg-től 50 meg mennyiségű anyag felszabadulását teszi naponta lehetővé. Az ilyen intravaginális vagy implant dózis formának az az előnye a hosszú ideig tartó adagolásnál, hogy kívánt esetben eltávolíthatók, és így a kezelés megszakítható vagy határidőzhető. 55

Annak a bizonyos oldalláncot védő csoportnak a kiválasztásánál, melyet a találmány szerinti dekapeptid szintézisénél használunk, a következő szabályokat kell figyelembe venni:

a) a védőcsoport legyen stabil a reagenssel szemben és 60 a reakció körülményei között, amelyet az α-amino védőcsoport eltávolítására választottunk a szintézis bármely lépésében; b) a védőcsoport tartsa meg a védő tulajdonságait (azaz ne hasadjon le az összekapcsolás feltételei mellett) és c) az oldalláncot védő csoport legyen eltávo- 65 látható, amikor a kívánt aminosav sorrendet tartalmazó peptid szintézise befejeződött, olyan reakciókörülmények között, amelyik nem változtatja meg a peptid láncot.

Az α-amino védó'csoportokkal, így például az R⁹ csoporttal kapcsolatban, az alábbi használható védőcsoportokat említjük meg. 1) alifás uretán védőcsoportok, például ί-butiioxikarbonil-, diizopropil-metoxi-karbonil-, bifenil-szopropil-oxikarbonil-, izopropil-oxikarbonil-, tamil-oxikarbonil-, etoxi-karbonil- és alliloxikarbonilcsoportok, 2) cikloalkil-uretán típusú védőcsoportok, melyeket például a ciklopentil-oxikarbonil-, adamantiloxikarbonü-, d-izobornil-oxikarbonil-, és ciklohexil-oxikarbcnil-csoportok képviselnek; továbbá a nitrofenilszulfenil-csoport, tritil-szulfenU-csoport; alfa,alfa-dimetil3,5-dimetoxi-benziloxikarbonil-csoport és tritilcsoport. a-amino-védőcsoportok gyanánt célszerűen t-butil-oxikarbcnil-, ciklopentil-oxikarbonil-, t-amil-oxikarbonil-, d-izobornil-oxikarbonil-, ο-nitrofenil-szulfenil-, bifenilizopropil-oxikarbonil-, vagy alfa-alfa-dimetil-3,5-dimetoxi-bt nzil-oxikarbonil-csoportot használunk.

A szilárd fázisú technika alkalmazásánál a szintézist a pepiid C-terminális végénél kezdjük és olyan a-aminovédett aminosavat használunk, amely egy szilárd gyantához kapcsolódik. Az ilyen kiindulási anyagot például úgy készítjük el, hogy egy α-aniino-védett glicint valamely benzhidrilamin gyantához, klórmetilezett gyantához, vagy egy hidroxímetil gyantához kapcsolunk. Az első használata célszerűbb. A benzhidril amin gyanta előállítását P. Rivaille, et al., írták le Helv. Chim. Acta 54 2772 (1971)-ben, míg a hidroxímetil gyanta előállítását M Bodanszky és J. T. Sheehan, Chem. Ind. (London), 38, 1597 (1966) írták le. A klórmetilezett gyanta a keresi edelemben kapható a Bio Rád Láb. Richmond, California cégnél. Ha a benzhidrilamin gyantát használjuk, egy amid kötő csoportot alakítunk ki az a-amino védett glicinnel, vagy a D-alaninnal, az (V) általános képlet szerint.

Ez lehetővé teszi, hogy miután az aminosav sorrend szintézisét befejeztük a C-terminális amid funkciót közvetlenül megkapjuk azáltal, hogy a kapcsolódó peptid hordozógyantáját és kötő-csoportját lehasítjuk és így a kívánt vegyület C-terminális részén aminosav-amidot alakítunk ki. Ebben a lépésben a hordozógyanta lehasítására használt hidrogénfluorid az oldalláncot védő csopoitot is eltávolítja és a találmány szerinti dekapeptidet kapjuk meg.

Ha más gyantákat használunk, a kötőcsoport benzilészter-csoport, mint azt korábban illusztráltuk. Ebben az esetben az összekapcsolt védett pepiidnek C-terminálís amiddá történő átalakítására alkalmas módszer az, hogy a védett peptidet ammonolízissel választjuk le a gyantáról, majd ezután a keletkező amid védőcsoportjait folyékony ammóniában oldott nátriummal történő kezeléssel, vagy hidrogén-fluoridos hasítással távolítjuk el. Egy más eljárás szerint a lehasítást úgy is végezhetjük, hogy valamely róvidszénláncú alkanollal, célszerűen metanollal vagy etanollal trietilamin jelenlétében átészteresítünk és a kapott észtert amiddá alakítjuk át, majd ezt követően eltávolítjuk a védőcsoportokat a fent leírtak szerint. Lásd még J. M. Steward és J. D. Young, „Soiid Phasc Peptide Synthesis”, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 1969 pp. 40—49. oldalon.

Speciális esetben a találmány szerinti eljárás értelmében valamely α-amino-védett aminosavat, nevezetesen

-5185 427 egy α-amino-védett glicint, célszerűen t-butil-oxikarbonilglicint, vagy valamely α-amino-védett D-alanint, célszerűen t-butil-oxikarbonil-D-alanint hozzákapcsolunk a benzhidrilamin gyantához valamely karboxil csoportot aktiváló vegyület, célszerűen diciklohexil-karbodiimid, vagy diizopropil-karbodiimid segítségével. Az a-aminovédett aminosavnak és a hordozógyantának összekapcsolása után az α-amino-védőcsoportot eltávolítjuk például trifluor-ecetsav metilén-kloridos oldatával, vagy trifluorecetsavval egyedül, vagy dioxánban oldott sósavval. A védőcsoport eltávolítása 0 °C és szobahőmérséklet között történik (például 20-24 °C-on). Az a-aminovédőcsoportok eltávolítására egy másik szabványos reagenst és a hozzátartozó reakció körülményeket E. Schroder és K. Lubke írták le „The Peptides” c. könyvben. Vol. 1., Academie Press, New York, 1965. pp. 7275. Az α-amino védőcsoport eltávolítása után a visszamaradó α-amino-védett aminosavakat a kívánt sorrendben lépésről lépésre összekapcsolva megkapjuk a pepiidet. Az összes védett aminosavat kb. 3-szoros feleslegben juttatjuk be a szilárd fázisú reaktorba és az összekapcsolást metilén-klorid vagy dimetil-formamid és metilénklorid elegyében végezzük. Abban az esetben, ha az összekapcsolás nem teljes, az összekapcsoló folyamatot megismételjük, mielőtt az α-amino-védőcsoportot eltávolítanánk, mielőtt még a következő aminosavat hozzákapcsolnánk a sziláid fázisú reaktorhoz. Az összekapcsolási reakció eredményét a szintézis minden lépésében ninhidrin reakció segítségével ellenőrizzük, ahogy azt E. Kaiser és társai leírták az Analyt. Biochem., 34 595 (1970)-ben. Hy módon megkapjuk azt a (II) általános képietű vegyületet, amelyben X jelentése hidrogénatom.

Miután a kívánt aminosav sorrendet szintetizáltuk, a peptidet eltávolítjuk a hordozógyantáról alkalmas reagenssel, például hidrogén-fluoriddal kezelve, amely nemcsak a peptidet hasítja ie a gyantáról, de lehasítja az összes, még visszamaradt oídaliánc védő-csoportot is, és így közvetlenül megkapjuk azt az (I) általános képietű peptidet, amelyben X jelentése hidrogénatom, amennyiben az eljárásnál benzhidrilamin gyantát használtunk.

Ha klórmetilezett gyantát használunk, a peptidet valamely rövidszénláncú alkanollal, célszerűen metanollal vagy etanollal történő átészteresítés segítségével választhatjuk le a gyantáról. Ezután a kapott terméket szilikagélen kromatografáljuk és az összegyűjtött frakciót ammóniával kezelve a rövidszénláncú észtert, célszerűen a metil- vagy etil-észtert, C-terminális amiddá alakítjuk. Ily módon olyan (II) általános képietű vegyületeket kapunk, amelyekben Xjelentése hidrogénatom. Az oldalláncot védő csoportokat ezután a fent leírt módon távolítjuk el, például folyékony ammóniában oldott nátriummal való kezeléssel, vagy hidrogénfluorid segítségével, így megkapjuk az (I) általános képietű vegyületet, amelyben X jelentése hidrogénatom.

Az olyan (I) általános képietű peptid vegyületeket, amelyekben X jelentése hidrogén atomtól különböző, úgy kapjuk meg, ha a (II) általános képietű vegyületeket, amelyben X jelentése hidrogénatom, valamely alkalmas acilező szerrel acilezzük. Ezután a fent leírt eljárás szerint lehasítjuk a hordozógyantát akötő-csoporttalegyütt, valamint az acilezett termék összes, még rajta levő oldallánc védő csoportjait is. Az olyan (II) általános képietű vegyületek előállítására, amelyekben X jelentése rövidszénláncú alkanoil-csoport, célszerűen valamely rövidszénláncú alkánsav-kloridot, vagy -bromidot vagy vala6 mely rövidszénláncú alkánsav-anhidridet használunk acilező szer gyanánt egy szerves proton akceptor, például piridin, vagy imidazol jelenlétében. Hasonlóképpen ugyancsak valamely szerves proton akceptor jelenlétében készíthetjük el az olyan (11) általános képietű vegyületeket, amelyekben X jelentése HOOC-(CH₂)_n-CÖ vagy benzoilcsoport, ha az X csoportnak megfelelő sav-kloridot vagy sav-bromidot használjuk. Például ha olyan (II) általános képietű vegyületeket kívánunk készíteni, amelyben X jelentése HOOCCH₂CH₂CO- csoport, borostyánkősav-kloridot használhatunk.

Az olyan (I) általános képietű peptid vegyületek, amelyben X jelentése hidrogénatom, szintén használhatók az olyan (1) általános képietű vegyületek előállítására, amelyekben X jelentése hidrogénatomtól különbözik azáltal, hogy az előbbi vegyületet a megfelelő acilező szerrel kezeljük.

Bár az előzőkben a szilárd fázisú szintézist írtuk le az (1) általános képietű vegyületek előállítására, de ezeknek a vegyületeknek az előállítása a klasszikus oldószeres eljárással is megoldható.

A következő példák tovább kívánják illusztrálni a találmány szerinti eljárást. A példákban az oldószer elegyekkel kapcsolatban megadott arányok az illető oldószerek térfogatának relatív arányait jelzik.

1. példa

D - Fenilalanil - D -p - klór - fenilalanil - D - triptofilL - seril(0 - benzil) - L - tirozil -D - triptofil - L - leucilL-arginiljN^-tozil)-L-prolilglicil-benzhidrilamin-gyanta előállítása g (0,5 mmol) benzhidrilamin gyantát helyezünk egy Beckman Model 990 típusú automata peptid szintetizáló reakció edénybe, melyet a következő műveletek elvégzésére programozunk be: a) metilénklorid; b) metilénkloridban oldott 33 %-os trifluor-ecetsav (2 részletben 1 és 25 percig); c) metilén-klorid; d) etanol; e) kloroform; f) 10%-os tríetil-amin kloroformban(2 részletben mindegyik 3 percig); g) kloroform; h) metilén-klorid.

A gyantát 263 g (1,5 mmol) t-butil-oxikarbonil-glicinnel keverjük metilén-kloridban majd 1,5 mmól diizopropil-karbodiimidct adunk hozzá, az elegyet szobahőmérsékleten 1 óráig keverjük, és az aminosav gyantát metilén-kloriddal, etanollal majd ismét metilén-kloriddal mossuk, (mindegyikkel háromszor). A védett, összekapcsolt aminosavat ezután végigvisszük a b,-től a h, lépéseken a fenti megadott program szerint. A következő aminosavakat (mindegyikből 1,5 mmol-t) kapcsolunk ezután hozzá egymás után az alábbi sorrendben:

í-Boc-L-prolin, t-Boc-L-arginin(N^G-Tos); t-Boc-L-Leucin; i-Boc-D-triptofán, t-Boc-L-tirozin, t-Boc-L-szerin(O-Bzl), :-Boc-D-triptofán, t-Boc-D-p-klórfenil-alanin, t-Boc-Dí'enilalanin. Az N-terminális t-Boc csoporttal befejezett gyantát eltávolítjuk, metanollal mossuk és csökkentett nyomáson szárítjuk. 1,42 g cím szerinti vegyületet kapunk.

185 427

2. példa

N - Acetil -D -fenilalanil - D - p - klór - fenilalanilD - triptofil - L - szerilfO - benzil) - L - tirozil-D- triptofil - L - leucil - L - arginil - (bfi - tozil) - L - prolilglicil-benzidril-amingyanta előállítása

Az 1. példa szerint előállított dekapeptid gyantának egy részét (0,76 g-ot) 30 percig kezelünk olyan 30 mlnyi oldattal, amely 100 ml metilén-kloridban 5 g imidazolt és 3,54 ml ecetsavanhidridet tartalmaz. Az acetilezett peptid gyantát ezután háromszor metilén-kloriddal, majd háromszor metanollal mossuk és vákuumban megszárítjuk. A cím szerinti vegyületet kapjuk meg.

3. példa

D - Fenilalanil -D - p - bróm - fenil - alanil - D - triptofil - L - szerit -(O - benzil) - L - tirozil - D - fenilalanil - Lleucil - L - arginil - (Ν° - tozil) - L - prolii - glicil - benzhidril-amin-gyanta előállítása

A peptid gyantát az 1. példában leírt feltételek mellett és hasonló elrendezésben készítjük el azzal a kivétellel, hogy a t-Boc-D-klórfenil-alanin helyett t-Boc-D-pbróm-fenilaianint használunk és hogy a t-Boc-D-triptofán helyett t-Boc-fenilalanint használunk a lánc 6-os helyzetében. A cím szerinti vegyületnek megfelelő befejezett száraz peptid-gyanta súlya 1,42 g.

4. példa

D - Fenilalanil D -p - klór - fenilalanil - D - triptofilL - szeril - (O - benzil) - L - triptofil -D - fenilalanil - Lleucil - L - arginil - - tozil) - L - prolü - glicil - benzhidril-amin-gyanta előállítása

A peptidet az 1. példában leírt feltételek mellett és hasonló sorrendben készítjük el azzal a kivétellel, hogy a lánc 6-os helyzetében levő t-Boc-D-triptofán helyett t-Boc-fenilalanint használunk. A cím szerinti vegyuletnek megfelelő, befejezett száraz, peptid-gyanta súlya

1,41 g.

5. példa

N - Szukcinil - D -fenilalanil -D - p - klór - fenilalanilD - triptofil - L - szeril -(O- benzil) - L - tirozil - D - fenilalanil - L - leucil - L - arginil - - tozil) - L - prolilglicil-benzhidril-amin -gyanta előállítása

A 4. példa szerint előállított dekapeptid gyantának 0,76 g-ját 30 ml olyan oldattal reagáltatjuk, amely metilén-kloridban imidazolt és szukcinil-kloridot tartalmaz. A reakciót 30 percig végezzük. Acetilezett peptid gyantát ezután metilén-kloriddal és metanollal mossuk, majd vákuumban megszárítva a cím szerinti vegyületet kapjuk meg.

6. példa

D - Fenilalanil - D -p - klór -fenilalanil - D - triptofilL - sz eril - L - tirozil - D - triptofil - L - leucil - L - arginilL-prolil-glicinamid-fD-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³·^{5 6} )-LHRH acetát sójának előállítása

Az 1. példában leírt gyantáról a dekapeptid lehasítása és a védő-csoportok eltávolítása úgy történik, hogy 0,7 g anyagot 20 ml hidrogén-fluoriddal, 5 ml anizollal és 50 mg 1,4-dithiothreitollal reagáitatunk 1 óráig 0 °C-on. A hidrogén-fluoridot ezután nitrogén atmoszféra alatt eltávolítjuk és a peptidet dietil-éter hozzáadásával kicsapjuk.

A nyers peptidet 50 %-os ecetsawal extraháljuk. Finom eloszlású, kémiailag módosított térhálós szerkezetű dextránt, kereskedelmi néven „Sephadex G-50”-et tartalmazó 2,5 X 95 cm-es oszlopon leszűrjük és 50 %-os ecetsawal eluáljuk. Az UV abszorpciónál 280 nm-es fő csúcsot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk.

A kapott olajat egy szilikagélt tartalmazó 1,5 X 145 cm-es oszlopra öntjük fel, majd 5 rész 1-butanol és 1 rész ecetsav és 1 rész víz elegyével eluáljuk. A fő csúcsot tartalmazó terméket összegyűjtjük, olajjá pároljuk be és hígított ecetsavból liofilizáljuk. 86 mg cím szerinti terméket kapunk fehér, pelyhes por alakjában. A termék vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat során homogénnek bizonyult. A vizsgálatot 20—30 meg anyaggal 4 különböző oldószer rendszerrel szilikagélen végeztük. A foltokat CL-keményítő reagenssel és Ehrlich-féle reagenssel hívtuk elő. Az alábbi Rf értékeket kaptuk: (A) 1-butanol :ecetsav: víz (4:1:5, felső fázis), 0,51; (B) etilacetát: piridin: ecetsav: víz (20:5:13) 0,16; (C) 1butanol: ecetsav: víz: etil-acetát (1:1:1:1), 0,66; (D) 1butano': piridin : ecetsav : víz (15:10: 3:12), 0,65.

Az rminosav analízis eredménye: Ser, 0,82; Pro, 1,09; Gly, 1,00; Lcu, 1,01; Tyr, 1,05; Phe, 1,05; p-Cl-Phe, 0,97; Tp, 1,82; Arg, 1,08.

7. példa

N -Acetil - D - fenilalanil -D -p - klór - fenilalanil - Dtriptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofil -L - leucilL-arginii-L-prolil-glicinamid, (Ac-D-Phe^l, D-p-Cl-Phe², D-Trp³·* )-LH-RH acetát sójának előállítása

A 2. példában leírt gyantáról (0,73 g) a védő csoportokat (az N-acetil-félék kivételével) és a hordozó gyantát (a kötőcsoporttal együtt) a 6. példában leírt feltételek mellett távolítjuk el. A nyers peptidet a 6. példa szerinti oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, azzal a különbséggel, hogy a szilikagélt most l-butanol:ecetsav:víz 6:1:1 arányú elegyével eluáljuk. A liofilizált peptidet, azaz a cím szerinti vegyületet fehér, pelyhes por alakjában kapjuk neg (66 mg). Szilikagélen történt vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatnál a termék homogénnek bizonyult. A vékonyréteg kromatográfiát 4 oldószer rendszerrel a 6. példa szerint végeztük. A következő Rf értékek adódtak: (A) 0,63; (B) 0,28; (C) 0,71; (D) 0,67.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,85; Pro, 1,03; Gly, 0,99; Leu 1,00; Tyr, 1,02; Phe, 1,01; p-Cl-Phe, 0,96, Tip, 1,83; Arg, 0,98.

-7185 427

8. példa

D - Fenilalanil - D - p - bróm - fenilalanil - D - triptofil - L - szeril - L - tirozil - D - fenilalanil - L - leucil - Largiml-L-prolü-glicinamid, (D-Phe¹, D-p-Br-Phe², DTrp³, D-Phe⁶ fLHRH előállítása

A 3. példában leírt peptid gyantáról (1,42 g) a védőcsoportok és a hordozó gyanta eltávolítása a kötőcsoportokkal együtt, a 6. példában leírt feltételek mellett történik. A nyers peptidet a 6. példa szerinti oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk és a tiszta, liofilizált, pelyhes por alakjában megkapott peptid súlya 203 mg. A termék, azaz a cím szerinti vegyület vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat során homogénnek bizonyult. Ezt a vizsgálatot szilikagélen végeztük négy oldószer rendszer felhasználásával a ó. példában leírt módon. A következő Rf értékeket kaptuk: (A) 0,48, (B), 0,54; (C), 0,79; (D), 0,59.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,79; Pro, 0,94; Gly, 1,00; Leu, 1,02; Tyr, 0,94; Phe, i,84; Trp, 0,93; Arg és p-Br-Phe, 1,84.

\A) 0,52; (D) 0,71, 2-propanol:l mól ecetsav (2:1); 0,70; etil-acetát:piridin:ecelsav:víz (5:5:1:3), 0,94.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,86;Pro, 0,98; Gly, 1,00; Leu, 1,09; Tyr, 1,06; Phe, 1,98, p-alfa-Phe, 9,97; Trp, 0,94; Arg, 1,01.

11. példa

N - A cetil -D-p - klór - fenilalanil -D -p - klór - fenilalanil - D - triptofil - L - szeril - (O - benzil) -L - tirozilD - triptofil - L - leucil - L - arginil(N^G - tozií) - L - prolilglicil-benzhidríl-amin-gyanta előállítása

A peptid-gyantát az 1. példában leírt sorrendben és feltételek mellett állítjuk elő azzal a különbséggel, hogy a t-Boc-D-fenilalanil helyett t-Boc-D-p-klórfenilalanint használunk, majd a dekapeptid-gyantát a 2. példában leírt feltételek mellett acilezzük. A kész, acetilezett száraz peptid-gyanta (azaz a cím szerinti vegyület) súlya 1,58 g.

9. példa

D - Fenilalanil - D -p - klór - fenilalanil - D - triptofilL - szeril - L - tirozil - D - fenilalanil - L - leucil -L - arginil-L-pro lil-glicinamidjD-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Trp³, D-Phe⁶ )-LH-RH előállítása.

A 4. példa szerint előállított peptid gyantáról (0,76 g) a védő-csoportokat és a hordozó gyantát a 6. példában leírt feltételek mellett távolítjuk el a kötő csoporttal együtt. A nyers peptidet a 6. példában leírt oszlop kromatográfiával tisztítjuk, azzal a kivétellel, hogy most 5:1:1 arányú 1-butanol:ecetsav:víz elegyét használjuk eluáláshoz. A tiszta cím szerinti vegyületet pelyhes fehér por formájában kapjuk meg, liofilizálás után (94 mg). Ez a termék a vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat során homogénnek bizonyult. A vizsgálatot sziiikagél lemezek felhasználásával végeztük a 6. példában leírt oldószer rendszer alkalmazásával. A következő Rf értékeket kaptuk. (A) 0,42; (B) 0,46; (C) 0,72; (D) 0,60.

Az aminosav analízis eredménye: Ser 0,83;Pro, 0,94; Gly, 1,00; Leu, 1,01; Tyr, 0,93; Phe, 1,93; p-Cl-Phe, 0,95; Trp, 0,85; Arg, 0,98.

10. példa

N - Szűkeiről - D - fenilalanil -D - p - klór - fenilalanilD - triptofil - L - szeri! - L - tirozil - D - fenilalanil - Lleucil-L-arginil-L-prolil-glicinamid, (Succ-D-Phe¹, D-p-ClPhe² , D-Trp³, D-Phe⁶ )-LH-RH előállítása

Az 5. példában leírt 0,75 g peptid-gyantáról a védőcsoportok (N-szukcinil csoportok kivételével) és a hordozógyanta eltávolítása a kötőcsoportokkal együtt, a 6. példában leírt feltételek mellett történik. A nyers peptid tisztítását a 6. példa szerinti kromatográfiás oszlop felhasználásával és az ott leírt feltételek mellett végezzük. A tisztított cím szerinti vegyületet liofilizálás után fehér, pelyhes por alakjában kaptuk meg (78 mg). A termék vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat alapján homogénnek bizonyult. A vizsgálatot a 6. példában leírt oldószer rendszerrel végeztük. A következő Rf értékeket kaptuk:

12. példa

N - Acetil - D - triptofil - D-p - klór - fenilalanil - Dtriptofil - L - szeril -(O- benzil) - L - tirozil - D - triptofilL - leucil - L - arginil - (ifi - tozi!) - L - prolii - glicilbenzhidril-amin-gyanta előállítása

A peptid gyantát ugyanolyan sorrendben és feltételek között állítjuk elő mint ahogy az 1. példában leírtuk, azzal a kivétellel, hogy t-Boc-D-triptofánt viszünk be az 1-es pozícióba a t-Boc-D-fenilalanin helyett. A kész, acilezett, szárított peptidgyanta (azaz a címbeli vegyület) súlya 1,62 g.

13. példa

N - Acetil - D - fenilalanil - D- p · klór - fenilalanilD - triptofil - L - szeril - (0 - benzil) - L - tirozil - Dtriptofiü L - leucil - L - arginil - (ifi - tozií) -L -prolilD-alanil-benzhidril-amin-gyanta előállítása

A peptid-gyantát ugyanolyan sorrendben és feltételek mellett állítjuk elő, mint ahogy azt az 1. példában leírtuk, azzal a kivétellel, hogy í-Boc-D-alanint viszünk be a molekulába a t-Boc-glicin helyett, majd a kapott dekapeptid-gyantát a 2. példában leírt feltételek mellett acilczzük. A kész, acilezett, szárított peptid-gyantát (azaz a cím szerinti vegyületet) lemérve 1,61 g-ot kapunk.

14. példa

N - Acetil -D - p - klór - fenilalanil -D-p - klór -fenilalanil - D - triptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofitlL - leucil - L - arginil - L - prolii - glicin - amid,(N - ac - D p-Cl-Phe¹²D-Trp³⁶ )-LH-RH előállítása

All. példában leírt gyantáról a 6. példában leírt feltételek mellett eltávolítjuk a védő-csoportokat (az Nacetil típusúak kivételével) és a hordozógyantát a kötőcsoporttal együtt. A kivétel az, hogy most a sziiikagél eluálásához 17:5:1:3 arányú etilacetát:piridin:ecetsav:víz elegyet használunk. A liofilizált peptid, azaz a cím szerinti vegyület fehér, pehelyszerű por, (118 mg)

185 427 amely a szilikagélen négy oldószer rendszerben végzett vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat során homogénnek bizonyult. A következő Rf értékeket kaptuk: (A) 1butanol:ecetsav:víz (4:1:5, felső fázis), 0,51; (B) 1butanol:ecetsav:víz:etilacetát (1:1:1:1) 0,83; (C) etilacetát: piridin: ecetsav: víz (5:5:1:3) 0,95; és izopropanol: 2 mólos ecetsav (2:1) 0,72.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,86; Pro, 1,00; Gly 1,00; Leu, 1,02; Tyr, 0,93; p-Cl-Phe, 2,02; Trp, 1,40; Arg, 0,99.

15. példa

N - Acetil - D - triptofil -D-p- klór -fenilalanil - Dtriptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofil - L - leucilL - arginil - L -prolii - glicinamidJN -Ac-D - Trp^³'⁶ ,Dp-Cl-Phe² )-LH-RH előállítása

A 12. példa szerint előállított gyantáról eltávolítjuk a védőcsoportokat és a hordozógyantát a kötőcsoporttal együtt. A szabad pepiidet a 14, példában leírt feltételek mellett tisztítjuk. A liofilizált peptid, azaz a cím szerinti vegyület fehér, pehelyszerű por (88 mg), amely szilikagélen négy' oldószer rendszerben végzett vékonyréteg kromatográfiás vizsgálat alapján homogénnek bizonyult. Az alábbi Rf értékeket kaptuk: (A) 1-butanol :ecetsav:víz (4:1:5) felső fázis), 0,52; (B) 1-butanol:ecetsav :víz-etilacetát (1:1:1:1) 0,78; (C) etilacetát:piridin: :ecetsav:víz (20: 5:1:3), 0,22; (D) izopropanol: 2 mólos ecetsav (2 : 1) 0,70.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,81;Pro, 0,97; Gly, 1,02; Leu, 1,03; Tyr, 1,03; p-Cl-Phe, 0,97; Trp, 3,06; Arg, 0,99.

16. példa

N -Acetil - D - fenilalanil -D -p - klór - fenilalanil - Dtriptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofil - L - leucilL - arginil -L - prolii -D -alaninamid,(N -Ac-D -Phe¹ ,D-p-Cl-Phe² £>-Trp³⁶ f)-Ala^l° )-LH-RH előállítása

A 13. példa szerint előállított gyantáról eltávolítjuk a védőcsoportokat és a hordozógyantát a kötőcsoporttal együtt. A szabad pepiidet a 14. példában leírt feltételek mellett tisztítjuk. A liofilizált peptid fehér, pelyhes por, (159 mg), amely a 15, példában leírt négy oldószeres rendszerben homogénnek bizonyult. (A) 0,56; (B), 0,83; (C), 0,24, (D), 0,68.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,88; Pro, 1,00; Alá, 1,06; Leu, 1,00; Tyr, 0,97; Phe, 0,95; p-Cl-Phe, 0,96; Trp, 2,08; Arg, 0,93.

7. példa

D -Fenilalanil -D -p - fluor - fenilalanil - D - triptofilL - szeril - (0 - benzil) - L - tirozil - D - fenilalanil - Lleucil - L arginil - (ifi - tozil) - L - prolii - glicil - benzhidril-amin-gyanta előállítása,

A peptid gyantát az 1. példában leírt sorrendben és feltételek mellett állítjuk össze azzal a kivétellel, hogy t-Roc-D-fluorfenilalanint viszünk be a t-Boc-D-klórfenilalanin helyett és hogy t-Boc-fenilalanint viszünk be a lánc 6-os helyzetébe a t-Boc-D-triptofán helyett. A kész, száraz, peptid-gyanta, azaz a cím szerinti vegyület súlya L41 g.

18. példa

D - Fenilalanil -D -p - fluor - fenilalanil - D - triptofilL - szeril - L - tirozil - D - fenilalanil - L - leucil - L - arginil - L - prolii - glicinatnid,(D - Phe¹ ,D - p - F - Phe² ,DTrp³ ,D-Phe⁶ )-LÍÍ-RH előállítása

A 17. példa szerint előállított peptid-gyanta 1,41 gjárol eltávolítjuk a védőesoportokat és a hordozógyantát a kötőcsoporttal együtt a 6. példában leírt feltételek mellett. A nyers pepiidet a 6. példában leírt oszlopon kromatográfiásan tisztítjuk, majd a tiszta, liofilizált pelyhes fehér port lemérve 153 mg-ot kapunk. A tennék, azaz a cím szerinti vegyület, szilikagélen végzett vékonyréteg kromatográfia szerint homogénnek bizonyult. A kromatográfiánál a 15. példában leírt három oldószer rendszert használtuk, melynek Rf értékei a következők:

(A) 0,48; (B) 0,81;(C) 0,53.

Az aminosav analízis eredménye: Ser, 0,88; Pro, 1,03; Gly. 1,10; Leu, 1,00; Tyr, 0,98; Phe, 1,95; p-F-Phe, 0,98, Trp, 0,93; Arg, 1,02.

A megfelelő Rf értékeket a következő összetételű eluálószerek alkalmazásával határoztuk meg:

(A) 1-butanol:ecetsav:víz: etil-acetát (1:1:1:1) (B) etil-acetát:piridin:ecetsav:víz (5:5:1:3) (C) izopropanol: 1 mól ecetsav (2:1) (D) l-butanol:ecetsav:víz(4:l:l)

a) N - acetil - D - p - klór - fenilalanil - D - p - klórfeni'alanii - D - triptofil - L - szeril - L - tirozil - D - fenilalanil - L - leucil - L - arginil - L - prolii - D - alaninamid, (N-ac-D-p-Cl-Phe¹·², D-Trp³, D-Phe⁶, D-Ala’°) LH-RH Rfé'tékek:

(A) 0,66; (B) 0,94; (C) 0,71; (D) 0,53

b) N - acetil - D - triptofil - D - p - klór - fenilalanilD - triptofil - L - szeri! - L - tirozil - D - fenilalanil - Lleucil-L-arginil-prolil-D-alaninamid, (N-Ae-D-Trp¹, D-pCl-Plie², D-Trp³, D-Phe⁶, D-Ala¹⁰) LH-RH

Rf éitékek:

(A) 0,76; (B) 0,96; (C) 0,70; (D) 0,54

c) N - acetil - D - p - fluor - fenilalanil - D - p - klórfenihdanil - D - triptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofilL - leucil - L - arginil - L - prolii - D - alaninamid, (N Ac-D-p-F-Phe¹, D-p-Cl-Phe², D-Ala¹⁰)LH-RH

Rf értékek:

(A) C ,77; (B) 0,95; (C) 0,73; (D) 0,57

d) N - acetil - alanii - D - p - klór - fenilalanil - D triptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofil - L - leucilL-argin'd-L-prolil-D-alanamid, (N-Ac-Ala^J, D-p-Cl-Phe², D-Trp^3,6, D-Ala¹⁰)LH-RH

Rf ér'ékek:

(A) 0,64; (B) 0,89; (C) 0,67; (D) 0,47

e) N - acetil - D - alanii - D - p - klór - fenilalanil - Dtriptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofil - L - leucilL-arginil-L-prolil-D-alaninamid, (N-Ac-D-Ala¹, D-p-ClPhe² , D-Trp³·⁶, D-Ala¹⁰) LH-RH

-9185 427

Rf értékek:

(A) 0,70; (C) 0,62; (D) 0,54

f) N - acetil - glicil - D - p - klór - fenilalanil - Dtriptofil - L - szeril - L - tirozil - D - triptofil - L - leucilL-arginil-L-prolil-D-alaninamid, (M-Ac-Gly¹, D-p-Ci-Phe², ⁵D-Trp^{3 6}, D-Ala¹⁰) LH-RH

Rf értékek:

(A) 0,65; (B) 0,88; (C) 0,69; (D) 0,46

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az (I) általános képletü vegyületek, valamint azok gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, amelyben ¹6

X jelentése hidrogénatom, 1—4 szénatomszámú alkanoilcsoport, vagy HOOC—(CH₂)_n— CO— csoport, amelyben n értéke 2—6-ig terjedő egész szám;

R¹ jelentése Gly, L-AIa, D-Ala, D-Trp, D-Phe vagy D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben halogénatomot tartalmaz;

R² jelentése D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben halogénatomot tartalmaz;

R³ jelentése D-Trp;

R⁴ jelentése D-Trp vagy D-Phe és ^5

R^s jelentése Gly vagy D-Ala azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletü adott esetben védett N-terminális aminocsoportot tartalmazó pepiidről - álról a képletben X, R¹, R², R³, R⁴,

R⁵ jelentése a tárgyi körben megadott, R⁶, R⁷ és R⁸jelentései hidrogénatom vagy valamely védőcsoport, és Y jelentése aminocsoport vagy' gyantához kötött amin rész, azzal a feltétellel, ha Y jelentése aminocsoport, akkor az R⁶, R⁷ és R⁸ csoportok közül legalább egy védőcsoport vagy az N-terminális aminocsoport védett eltávolítjuk a védőcsopcrto(ka)t és/vagy a gyantát, ezután a kapott olyan (I) általános képletü peptidet, amelyben X jelentése hidrogénatom kívánt esetben acilezzük, ily módon olyan (í) általános képletü peptidet kapunk, amelyben X jelentése a tárgyi körben megadott acücsoporí és/vagy a kapott peptidet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1981.06.01.)
2. Eljárás az (I) általános képletü vegyületek, valamint azok gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, amelyben

X jelentése hidrogénatom, 1—4 szénatomszámú alkanoilcsoport, vagy HOOC-(CH₂)_n-CO- csoport, amelyben n értéke 2—6-ig terjedő egész szám; 50

R¹ jelentése D-Trp, D-Phe vagy D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben halogénatomot tartalmaz;

R² jelentése D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben halogénatomot tartalmaz; 55

R³ jelentése D-Trp,

R⁴ jelentése D-Trp vagy D-Phe és R^s jelentése Gly vagy D-Ala azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletü adott esetben védett N-terminális aminocsoportot tártál- 60 mező pepiidről - ahol a képletben X, R¹, R², R³, R* és R^s jelentése a tárgyi körben megadott R⁶, R⁷ és R⁸jelentései hidrogénatom vagy valamely védőcsoport és Y jelentése aminocsoport vagy gyantához kötött amin rész, azzal a feltétellel, ha Y jelentése aminocsoport, akkor az R⁶, R⁷ és R⁸ és n csoportok közül legalább egy védőcsoport vagy az N-terminális aminocsoport védett — el ávolítjuk a védőcsoporto(ka)t és/vagy a gyantát, ezután a kapott olyan(I) általános képletü peptidet, amelyben X jelentése hidrogénatom kívánt esetben acilezzük, ily módon olyan (I) általános képletü peptidet kapunk, amelyben X jelentése a tárgyi körben megadott acilcsoport és/vagy a kapott peptidet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1980. 06. 02.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy olyan, az N terminálison védőcsoporttól mentes (II) általános képletü kiindulási anyagot használunk, amelyben R¹, R², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, X és Y jelentése az 1. igénypontban megadott. (Elsőbbsége: 1981.06.01.)
4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy olyan, az N terminálison védőcsoporttól mentes (II) általános képletü kiindulási anyagot használunk, amelyben R¹, R², R³, R⁴, R⁸, R⁷, P.⁸, X és Y jelentése a 2. igénypontban megadott, (elsőbbsége: 1980.06.02.)
5. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a szintézisnél olyan (II) általános képletü kiindulási anyagot használunk, amelyben R¹ jelentése D-Trp,D-Phe vagy D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben klóratomot tartalmaz, R²jelentése D-Phe, amely szubsztituensként para helyzetben fluor-, klór-, brómatomot tartalmaz, R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁸, X és Y jelentése a 2. igénypontban megadott. (Elsőbbsége: 1980.06. 02.)
6. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítás módja íz N-acetil-D-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-L-Ser-L-Tyr-D-Trp-LLeu-L-Arg-L-Pro-D-AIa-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy N-acetil-D-Phe-D-p-Cl-P’ne-D-Trp-L-Ser(R⁶)L-Tyr(R⁷)-D-Trp-L-Leu-L-Arg(N^G-R⁸ l-LPro-D-Ala-Y általános képletü kiindulási anyagot használunk, amelyben R⁶, R⁷, R⁸ és Y jelentése a 2. igénypontban megadott. (Elsőbbsége. 1980.06.02.)
7. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja az N-aceíil-D-p-Cl-Phe-D-p-Cl-Phe-D-Trp-L-Ser-LTyr-D-Phe-L-Leu-L-Arg-L-PTo-L-Ala-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy N-acetil-D-p-Cl-Phe-D-p-Ci-Phe-DTrp-L-Ser(R⁶ )-L-Ty r(R⁷ )-D-Phe-L-Leu-L-Arg(N^G-R⁸ >LPro-L-Ala-Y általános képletü kiindulási anyagot használunk, amelyben R⁶, R⁷, R⁸ és Y jelentése a 2. igénypontban megadott.

(Elsőbbsége: 1980. 06. 02.)
8. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletü vegyületet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját, a képletben X, R¹, R², R³, R⁴ és R⁵ jelentése az 1. igénypontban megadott, gyógyszerészeti célra alkalmas vivőanyaggal és/vagy gyógyászati

-10185 427 segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1981.06. 01.)
9. Eljárás- gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletü vegyületet vagy annak gyógyászatilag elfogadható sóját, a képletben X, R^!, R³, R³, R⁴ és R^s a 2. igénypontban megadott jelentésű, gyógyszerészet: célra alkalmas vivőanyaggal és/vagy gyógyászati segédanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.

(Elsőbbsége: 1980. 06. 02.)

1 db ábra

Kiadja az Országos Találmányi Ilivalal A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető Megjelent: a Műszaki Könyvkiadó gondozásában COPYLUX Nyomdaipari és Sokszorosító Kisszövetkezet