HU181994B - Process for preparing inactivated peritonitis vaccine - Google Patents
Process for preparing inactivated peritonitis vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU181994B HU181994B HU79WE610A HUWE000610A HU181994B HU 181994 B HU181994 B HU 181994B HU 79WE610 A HU79WE610 A HU 79WE610A HU WE000610 A HUWE000610 A HU WE000610A HU 181994 B HU181994 B HU 181994B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- feline
- vaccine
- inactivated
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás a macskafélék fertőző hashártyagyulladását (feline infectious peritonitis, rövidítve: FIP) okozó vírusok legyengített törzsének előállítására. A találmány kiterjed az említett fertőző hashártyagyulladás ellen a macskafélék fajához tartozó állatoknak immunitást biztosító vakcinának a találmány szerint legyengített vírustörzs fel használásával történő előállítására is.
A macskafélék fertőző hashártya gyulladása mind a házi, mind a vadon élő macskaféle állatok (Felidák) fontos betegsége, amely csaknem minden esetben az állat elhullásához vezet. Ezt a betegséget először 1950 táján ismerték fel és írták le „peritonitis chronica fibrinosa” elnevezéssel [J. Amer. Vet. Med. Assoc. 144, 1409—1420 (1963)]. Azóta ezt a betegséget Észak-Amerikában, Európában, Dél-Afrikában, Ausztrál-Ázsiában és Japánban is észlelték. Újabb időben a kórokozó organizmust is leírták, mégpedig coronavírus-típusú vírusként [Natúré, 266, 682 (1977)].
Az ezzel a betegséggel fertőzött állatok letargiásakká és étvágytalanokká válnak, a hashártya üregében (cavum peritonei) folyadék gyülemlik fel, ami a has megduzzadását eredményezi; az állat végül is sárgaságszerű állapotban pusztul el. Gyógykezelés és ápolás meghoszszabbíthatja a betegség lefolyását, végül azonban az említett klinikai tüneteket mutató valamennyi állat elpusztul [J. Amer. Vet. Med. Assoc. 154, 26—35 (1969)].
Már régóta felismerők, hogy vakcinára van szükség a macskafelck fertőző hashártyagyulladása járványszerű kitöréseinek megelőzésére [J. Amer. Vet. Med. Assoc. 181994
155, 1728—1733 (1969)], eddig azonban a betegség kórokozó vírusának elkülönítésére és tenyésztésére irányuló számos kísérlet eredménytelen maradt. Újabban beszámoltak ugyan arról, hogy sikerült vékonybél-szövet5 kultúrán tenyészteni a macskafélék fertőző hashártyagyulladásának vírusát [The Cornell Veterinarian, 68, 411—417 (1978)], a leírt módszer azonban nem alkalmazható gyakorlati eljárásként vakcina előállítására.
Azt találtuk, hogy egy inaktivált FlP-vakcina állítható 10 elő oly módon, hogy a virulens FlP-vírust elkülönítve macskaféle állatok embrionális sejt-kultúráján passzázsoltatjuk (folyamatosan tenyésztjük sorozatos átoltásokkal) mindaddig, míg a fertőzött kultúrák egy az alábbiakban részletesen ismertetett jellegzetes citopátiás ha15 tást nem mutatnak, ezt követően a vírust inaktiváljuk; az így inaktivált vírust azután egy erre alkalmas gyógyszerészeti hordozóanyaggal kombinálva alakítjuk vakcinává.
A jelen találmány tárgyát tehát elsősorban az említett 20 inaktivált FlP-vakcina előállítása képezi, amely úgy történik, hogy az elkülönített virulens FlP-vírust macskaféle állatok embrionális sejtkultúráján sorozatos ámításokkal (passzázsokkal) tenyésztjük, míg a fertőzött kultúrák a macskafélék fertőző hashártyagyulladására 25 jellemző sejtkárosító (citopátiás) hatást nem mutatnak, majd az inaktivált vírust valamely gyógyszerészeti célra alkalmas hordozóval vakcinává alakítjuk.
A virulens (FIP-vírus az említett betegségben szenve dő macskák peritoneális folyadékából, véréből, vizele 30 téből vagy különböző szerveiből különíthetők el. Peri
-1181994 toneális folyadék vagy vizelet e célra történő alkalmazása esetén ezt a fertőzött folyadékot közvetlenül olthatjuk rá a kiválasztott sejtkultúrákra. A vírusnak az állat véréből történő elkülönítése oly módon történhet, hogy a fertőzött állatot a juguláris vénából vagy bármely más alkalmas vénából véreztetjük, az így kapott vér-mintát megalvadni hagyjuk, majd például mozsárban eldörzsöljük az alvadékot és valamely erre alkalmas közegben, például foszfát-pufferes sóoldatban újra szuszpendáljuk. A szuszpenziót ezután centrifugáljuk a durva szövet-törmelékek eltávolítása céljából, a szupernatáns folyadékot elkülönítjük és ezt használjuk fel a sejt-kultúrák beoltására.
Elkülöníthető a vírus az állatok különféle szerveiből, például a májból, lépből vagy csepleszből (omentum) is ; ilyen esetekben a beoltásra alkalmas vírus előállítása hasonló módon történhet, amint ezt a véralvadék esetében ismertettük, vagyis a fertőzött szervet eldörzsöljük, újból szuszpendáljuk, a szuszpenziót centrifugáljuk, a szupernatáns folyadékot elkülönítjük és ezt használjuk fel a sejt-kultúrák beoltására.
A virulens vírusok sorozatos passzázsának végrehajtására alkalmas macska-embrió sejt-kultúrákat a macskafélék fajához tartozó bármely állat embriójának tüdejéből, veséjéből, szívéből, májából, beléből vagy más alkalmas szervéből vagy ilyen szervek keverékéből vehetjük ; alkalmas szövetek nyerhetők erre a célra a bőrből, izmokból, placentából vagy a nyelvből is. A sejt-kultúráknak a macska-embrió különböző részeiből, vagy akár az egész embrióból történő előállítása olyan módszerekkel történhet, amilyeneket az 1 177 635 és 1 286 250 sz. brit szabadalmi leírások, valamint a J. Hygiene, 67, (1969), 115—124 közlemény ismertetnek. Az idézett szabadalmi leírások a diploid sejt-törzsek előállítására alkalmas eljárást ismertetnek, míg az utóbb idézett közlemény heteroploid sejtvonalak előállítására szolgáló eljárást ír le. A módszerek lényege az, hogy az embriót vagy annak az e célra választott részét mechanikai vagy enzimes úton felaprítjuk, a kapott sejt-szuszpenziót valamely sejt-kultúra tenyésztésére szolgáló közeget magába fogadó edénybe visszük és 32—39 °C hőmérsékleten ínkubáljuk. A szubkultúra-tenyésztés megkönnyítésére célszerű az egybefolyó sejt-lapokat tripszinnel vagy valamely ártalmatlan kelátképző anyaggal kezelni az újabb friss közegbe történő átvitel előtt. Alkalmazhatunk azonban a fertőző macska-hashártyagyulladásvírus tenyésztésére primer macska-sejtkultúrákat is; ezek előállítási módja a szakmabeliek által jól ismert.
Az elkülönített virulens fertőző macska-hashártyagyülladás vírus tenyésztése oly módon történhet, hogy az e célra választott macska-embrió sejtek egysejt-rétegét vagy sejt-lapját beoltjuk a fertőzött állatból származó vírus-készítménnyel, majd a beoltott sejt-kultúrát 35 °C és 39 °C közötti, előnyösen 37 °C hőmérsékleten
3—10 napig, előnyösen 5-—8 napig ínkubáljuk valamely erre alkalmas közeg jelenlétében.
Közegként célszerűen valamely kémiailag definiált anyagot alkalmazunk biológiai adalékok, például szérum hozzáadása nélkül. Ilyen célra alkalmas közegek példáiként az Eagle-féle alap-közeg [Eagle H., Science, 130, 432 (1959)] vagy a „199” fenntartó-közeg [Morgan J. F. és munkatársai, Proc. Soc. Exp. Bioi. (N. Y.), 73, (1950)] említhetők. A közeghez adhatunk valamely baktériumellenes szert, például penicillint és/vagy sztreptomicint is. Az inkubálás befejezése után a vírust me- chanikai módszerekkel, például fogyasztással és felolvasztással különíthetjük el; az így kapott vírus-készítményt azután a szokásos szövetkultúra-módszerekkcí (vö.: A Manual of Basic Virological Techniques, G. C. Rovozzo és C. N. Burk, Prentice- Hall Inc., Eaglewood Cliffs, N. J., USA, 1973) alkalmazzuk a macska-embrió sejtek egysejt-rétegű kultúráinak sorozatos passzázsolására.
A vírus első néhány, rendszerint körülbelül 5 passzázsa során nem tapasztalható nyilvánvaló citopátiás hatás a sejteken. Ezután azonban az egysejt-rétegű sejtkultúráknak a FlP-vírussal történő további fertőzése a fertőzött sejteken jellegzetes szabálytalan alakok kialakulását idézi elő, amelyek mikroszkóp alatt, nedves készítményekben jól megfigyelhetők, végül azután a sejtek kikerekednek és/vagy leválnak arról a szilárd felületről, amelyen tenyésztettük őket. így végülis a vírus teljesen elpusztítja az egysejt-rétegű kultúrát.
A FlP-vírus elektronmikroszkóp alatt a corona-vírusfélék egyéb képviselőihez hasonló alakot mutat, lényegileg gömbölyű, 80—160 nm átmérőjű alakban, körülbelül 25 nm hosszúságban kiálló nyúlványokkal, amelyek ezeknek a vírusoknak dicsfény- vagy koronaszerű megjelenést kölcsönöznek.
Az egyes passzázsokból kapott vírus titere körülbelül 1O4’° TCIDjo és 1O10'0 TCIDJ0/ml között változik; TCID50 a sejt-kultúrának azt a fertőző adagját jelenti, amely a vírus-fertőzésnek kitett kultúra sejtjeinek 50%-án okoz citopátiás hatást.
Amint a FlP-vírussal fertőzött sejt-kultúrák már citopátiás hatást mutatnak, a sejt-kultúrát összegyűjtjük és a vírust inaktiváljuk, ami például kémiai eszközökkel, mint formaldehiddel, acetil-etilén-iminnel, β-propiolaktonnal, β-etilén-iminnel vagy más ismert vírus-inaktiválószerrel történhet. Ha formaldehidet alkalmazunk inaktiválószerként, akkor a kultúrák összegyűjtése után a vírus-szuszpenziót például 0,08% formaldehid hozzáadásával inkubáltatjuk mindaddig, míg a vírus teljes inaktiválódását el nem érjük; ez rendszerint 72 órát meghaladó inkubációt igényel. Ezután a formaldehidet valamely erre alkalmas szerrel, például nátrium-metabiszulfittal semlegesítjük és a szuszpenziót foszfáttal pufferezett sóoldattal szemben dializáljuk a nátriummetabiszulfit feleslegének eltávolítása céljából, mert a jelenlevő nátrium-metabiszulfit zavarná a következő biztonsági vizsgálatokat. Történhet a vírus inaktiválása fizikai módszerekkel, például ibolyántúli besugárzással is.
Mielőtt a fenti módon inaktivált vírust vakcinává alakítanók, először meg kell vizsgálni a vírus-készítményt élő vírusoktól való mentesség, sterilitás és hatékonyság szempontjából. Az élő vírusoktól való mentesség vizsgálata céljából a készítmény egy mintáját macska embrió-sejt-kultúrán inkubáltatjuk. Ha a sejt-kultúrán nem mutatkozik citopátiás hatás, ez azt mutatja, hogy élő vírus nincsen jelen. A sterilitás vizsgálata céljából táptalajt és húslevet oltunk be a szuszpenzióval. A hatásosság vizsgálata azon alapul, hogy a készítmény macskákon antífps t-titert idéz elő, ha az inaktivált vírus-szuszpenziót ismert hígításokban injekció útján beadjuk az állatoknak.
A fenti módon kapott inaktivált vírus-szuszpenzió vakcinává történő alakítására alkalmas, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyag valamely ilyen célokra alkalmas folyadék, például tápanyagokat és stabi-2181994 lizálószereket tartalmazó vizes oldat, mint a Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldat vagy más hasonló közeg lehet. A folyékony vivőanyagot kívánt esetben valamely lezárt steril edényben, például ampullában vagy üvegcsében tarthatjuk. 5
A találmány további tárgyát oly vakcina képezi, amely immunitást fejleszt ki a macskafélék fajához tartozó állatokban a macskafélék fertőző hashártyagyulladását okozú vírus általi fertőzésekkel szemben; ez a vakcina a fentebb ismertetett módon tenyésztett és inaktivált FIPvírust tartalmazza megfelelően kiszerelt alakban, a kívánt hatás elérésére elegendő vagy ennek többszörösét kitevő adagban. A vakcinálás céljaira elegendő hatásos adag körülbelül IO4,0—IO8,0 TCID50/ml, előnyösen IO5,0—IO7,0 TCID50/ml lehet. A vírus-készítmény TCTD50/ml értékét inaktiválás előtt határozzuk meg.
A fent leírt módon inaktivált FlP-vírust előnyösen valamely oly segédanyaggal kombináljuk, amely elősegíti a vakcinálandó állat immún-reakcióját és ezzel növeli a vakcina hatásosságát. Ilyen segédanyagként például alumínium- vagy kalciumsók, mint foszfát vagy szilikát alkalmazhatók; előnyösen alkalmazható erre a célra alumínium-hidroxid gél is. Alkalmazhatók továbbá az említett célra segédanyagként olyan olaj-víz-lanolin típusú elegyek is, amilyeneket például Freund is- 25 mertetett, vagy olyan típusú ásványi olaj-keverékeket, mint a Bayol F (Esso Ltd.) és Falba (Pfaltz and Bauer Inc. New York) kereskedelmi forgalomban levő készítmények. A vakcinák előállítása oly módon történhet, hogy az e célra vivőanyagként választott olajszerű se- 30 gédanyagot az inaktivált vírus-készítmény egyenlő térfogatnyi mennyiségével homogenizáljuk.
A vakcina elkészítése előtt a vírus-készítményt különféle módszerekkel koncentrálhatjuk is, például diaszűréssel, valamely fehérje-lecsapószer, például erre alkalmas szerves oldószer felhasználásával. Erre a célra jó eredménnyel alkalmazhatók a vízzel elegyedő rövidszénláncú alifás alkoholok és ketonok, különösen a metanol és az aceton.
A vakcinát elkészítése után célszerűen egy steril edénybe töltjük le, amelyet azután lezárunk és 2—8 °C hőmérsékleten tárolunk a vakcina felhasználásáig. Eljárhatunk azonban oly módon is, hogy a vírus-szuszpenziót ampullákban vagy üvegcsékben megfagyasztjuk és cseppfolyós nitrogénben tároljuk. További lehetőségként a szuszpenzióhoz valamely stabilizálószert, például szorbitot és/vagy fehérje-hidrolizátumot, például a „Sol-u-pro” néven ismert készítményt adunk, majd az így stabilizált vírus-szuszpenziót liofilizáljuk.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát a macskafélék fajához tartozó állatoknak kívánt esetben intraperitoneális, szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban, vagy pedig orális, nazális vagy intraokuláris úton adhatunk be. Az adott esetben alkalmazandó adagot vagy egyszerre, egyetlen adagban, vagy pedig időben elosztva, több rész-adagban adjuk be. Előnyös az olyan adagolás, amely szerint a FIP-vírus hatásos adagját két, egyenként 2 ml térfogatú rész-adagban adjuk be, legalább 21 napi időközzel.
A találmány szerinti vakcina a legyengített FlP-vírus mellett tartalmazhat egyéb vakcinákat is; erre a célra olyan antigén-anyagokat alkalmazhatunk, amelyeket más, a macskafélék sorába tartozó állatokon betegségeket előidéző mikroorganizmusokból, például a macskák fertőző bélgyulladását (panleucopenia) okozó parvovírusokból, macska-calicivírusból, macska rabies-vírusból, macska-retrovírusokból, például a macskafélék leukémiáját okozó vírusból vagy macska-herpes-vírusból készítettünk.
Különösen előnyös az olyan kombinált vakcina, amely valamely steril edényben az inaktivált FlP-vírust tartalmazza nedves készítményként, mellette egy külön edényben egy vagy többféle más macska-vakcinát liofi10 lizált alakban, úgy, hogy a két készítményt felhasználás előtt egyesíteni lehessen. Tartalmazhat azonban az ilyen kombinált készítmény inaktivált FlP-vírust liofilizált alakban is az említett más vírus-vakcinákkal kombinálva ; az ilyen készítmény mellé egy steril vizet tartamazó 15 edényt is adunk, amellyel a liofilizált vakcina-kombináció felhasználás előtt folyékony állapotba hozható. Az ilyen, két edényt tartalmazó kombinált készítményeket egy dobozban vagy más tartányban helyezhetjük el, a használati utasítással együtt, amelyben leírjuk a liofili20 zált készítménynek a folyékony készítménnyel vagy steril vízzel történő egyesítését, közvetlenül felhasználható vakcina előállítása céljából.
A találmány szerinti vakcina alkalmas arra, hogy a macskafélék fajához tartozó állatokban immunitást fejlesszen ki a fertőző hashártyagyulladással (FIP) szemben ; a találmány körébe tartozik a leírt módon előállított vakcinák ilyen immunitás előidézése céljából történő alkalmazása is, amelynek lényege az, hogy az állatnak a leírt módon elkészített vakcina hatásos adagját adjuk be intraperitoneális, szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban, vagy pedig orális, nazális vagy intraokuláris úton.
A találmány további részleteit az alábbi példák szemléltetik közelebbről, megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre semmilyen szempontból nincsen e konkrét példák tartalmára korlátozva.
1. példa
Az inaktivált vírus előállítása
a) A vírus tenyésztése
Egy fertőző hashártyagyulladásban (pyrexia és állapot-leromlás alapján felismerve) szenvedő 6 hónapos macskából vért veszünk a juguláris vénából. A vért 20 50 percig állni hagyjuk megalvadás céljából. A szérumot és a plazmát eltávolítjuk az alvadékból, majd az alvadékot erre alkalmas készülékben, például Stomacher-féle „Colworth” készülékben foszfáttal pufferezett sóoldattal 60 másodpercig trituráljuk. A szuszpenziót azután 55 1108 g-vel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot dekantáljuk és ezzel oltjuk be diploid macska-embrió tüdő-sejtjeiből készített egybefolyó egyréteges, szérum-mentes „199” közegben készített sejt-kultúrát, amelyet azutári 37 °C hőmérsékleten körülbelül 7 napig in60 kubáltatunk. Az inkubálás után a sejteket megfagyasztjuk majd újra felengedjük. Az így kapott szétroncsolt fertőzött sejteket tartalmazó közeg egy alikvot-részét átoltjuk egy diploid macska-embrió tüdő-sejtjeiből „199” közegben készített friss egyréteges sejt-kultúrára 65 és ezt is inkubáltatjuk 37 °C hőmérsékleten.
-3181994
A vírust azután hasonló módon 9 passzázson visszük keresztül, amikoris már kezdenek megjelenni kis felületeken a citopátiás hatás jellegzetes tünetei, vagyis a megfertőzött sejtek szabálytalan alakokat mutatnak, majd végül kikerekednek, ami a nedves készítmények mikroszkópos vizsgálata útján állapítható meg. Az ötödik passzázstól kezdődően a citopátiás hatás igen feltűnő már és igen gyorsan, 48—72 órán beiül a sejtréteg szétroncsolódására vezet.
b) Inaktiválás
A 6. passzázs után a fertőzött sejteket megfagyasztjuk és újból felengedjük; az így kapott szuszpenzió vírustitere 1O9,0 TCID50/ml. Az így kapott szuszpenzió alikvot-részéhez (100 ml) hozzáadunk 0,4 ml 40%-os formaldehidet, majd mágneses keverővei 4 °C hőmérsékleten 96 óra hosszat keverjük az elegyet; ez alatt a vírus teljesen inaktiválódik. Az inaktivált-virus készítményhez egy 32%-os nátrium-metabiszulfittörzsoldat 1 : 16 arányú hígításának 2 ml mennyiségét adjuk a formaldehid semlegesítése céljából. Ezután a vírus-készítményt éjjelen át dializáljuk Sörensen-féle foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldatban, hogy a biztonsági vizsgálat céljaira eltávolítsuk a készítményből a nátrium-metabiszulfitot.
c) Ellenőrző vizsgálat
1. Sterilitási próba
Az inaktivált vírus-készítmény 5 ml-es alikvot-részeit 300 ml tápanyag-főzethez, illetőleg 300 ml húsfőzethez adtuk és 32 °C hőmérsékleten 7 napig inkubáltattuk, majd további 7 napig 18—20 °C hőmérsékleten folytattuk az inkubálást. Ez idő alatt egyik tápközegen sem tapasztaltunk mikroorganizmus-fejlődést, ami azt mutatta, hogy a készítmény mentes volt mikrobiológiai szennyezésektől.
2. Biztonsági próba
Diploid macska-embrió-tüdősejteket a vírus-készítménnyel fertőztünk és 37 °C hőmérsékleten inkubáltattuk a fertőzött sejt-készítményt. 7 nap múlva a sejteket verzenizáltuk és átoltottunk, majd további 7 napig ismét 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. 72, illetőleg 96 óra elteltével vizsgálva a készítményt, nem tapasztaltunk citopátiás hatást, ami azt bizonyítja, hogy a vírus nem szaporodott.
2. példa
3—4 hónapos, fertőző hashártyagyulladásban elhullott macskák peritoneális folyadékát pipettával, aszeptikus körülmények között eltávolítjuk és átoltjuk egy olyan sejtkészítményre, amely teljes diploid macskaembrió-sejtek összefolyó egysejt-rétegeit tartalmazza, szérummentes „199” közegben; a beoltott készítményt 37 °C hőmérsékleten 7 napig inkubáltatjuk. Ezután a vírust összegyűjtjük és az 1. példában leírt módon sorozatos passzázsokon visszük át és inaktiváljuk a készítményt.
3. példa
Egy fertőző hashártyagyulladásban elhullott 11 hónapos macska máját kivesszük és a máj-szövetet egy „Stomacher 80 (Colworth)” szövet-dezintegrátorban 60 másodpercig trituráljuk foszfáttal pufferezett nátrium-klorid-oldattal. A kapott szuszpenziót ezután 1108 g-vel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot dekantáljuk és ráoltjuk egy heteroploid macskaembrió-tüdősejtek összefolyó egysejt-rétegét szérummentes „199 közegben tartalmazó sejt-készítményre. A készítményt egy 37 °C hőmérsékleten 7 napig inkubáltatjuk. (A heteroploid sejtek olyan sejtek, amelyeket 70-nél többször vittünk át sorozatos passzázsokon egy primer kultúrából és amelyek ezáltal egy meghatározott sejtvonallá alakultak.)
A vírust ezután összegyűjtjük és az 1. példában leírt módon sorozatos passzázsokon visszük keresztül és inaktiváljuk.
4. példa
A macskák fertőző hashártyagyulladása elleni vakcina előállítása
Az 1. példában leírt eljárással egy olyan inaktivált vírus-készítményt állítunk elő, amelynek az inaktiválás előtti titer-értéke 1O9,0 TCID50/ml. Az 1. példában leírt vizsgálatok végrehajtása után a vírus-készítmény egyenlő térfogatú mintáihoz alumínium-hidroxid-gélt és foszfáttal pufferezett sóoldatot keverünk, majd az elegyet mágneses keverővei, a legnagyobb fordulatszámmal 1 óra hosszat keverjük.
5. példa
A 4. példában leírt eljárással előállított vakcinát olyan 12 hetes macskáknak adjuk be, amelyek az előzetes vizsgálat során a fertőző hashártyagyulladás antitestjeitől menteseknek bizonyultak. A beadást intraperitoneális injekcióval végezzük, 2 ml-es adagokban. 21 nap múlva a vakcina további 2—2 ml adagját adjuk be intraperitoneális úton a macskáknak, ez alkalommal a macskáktól vért is veszünk és a vérszérumot megvizsgáljuk, hogy nem tartalmaz-e semlegesítő FlP-antitesteket. További 21 nap múlva ismét vérmintát veszünk a macskák-’ tói; ez alkalommal azt tapasztaljuk, hogy' szignifikáns mennyiségben vannak jelen semlegesítő antitestek. E kísérletek eredményeit az alábbi számértékek szemléltetik :
vakcinálás előtti antitest-titer: kisebb mint 10, antítest-titer 21 nappal az első injekció után: 40, antitesttiter 21 nappal a 2. injekció után: 80.
6. példa
A macskaféle állatok fertőző hashártyagyulladás és fertőző bélgyulladás elleni immunizálására alkalmas vakcina-készítmény a következő alkotórészekből áll:
egy ampulla élő legyengített fertőző bélgyulladás elleni vakcina liofilizált állapotban, egy második ampulla, amely a 4. példában leírt módon készített inaktivált
FlP-vírus-szuszpcnziót tartalmaz, továbbá használati utasítás a liofilizált vakcinának a folyékony készítmény felhasználásával történő rekonstituálására, beadásra kész készítmény előállítása céljából.
7. példa
Egy a macskaféle állatok fertőző hashártyagyulladás, fertőző bélgyulladás és vírusos rhinotracheitis elleni immunizálására alkalmas vakcina-készítmény a következő alkotórészekből áll: egy ampulla, amely liofilizált élő legyengített, fertőző bélgyulladás elleni vakcinát és élő módosított, vírusos rhinotracheitis elleni vakcinát tartalmaz, továbbá egy második ampulla, amely a 4. példa szerint előállított inaktivált FlP-vírus-szuszpenziót tartalmaz, továbbá használati utasítás beadásra kész készítménynek a liofilizált vakcinából, a folyékony készítmény felhasználásával történő előállítására.
Szabadalmi igénypontok
Claims (6)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás macskafélék fertőző hashártyagyulladása elleni inaktivált vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az elkülönített virulens kórokozó vírust, előnyö sen feline infectionis peritonitis (ATCC VR—867) vírust, macskaféle állatok embrionális sejt-kultúráin sorozatos átoltásokkal tenyésztjük mindaddig, míg a fertőzött kultúrák citopátiás állapotot, azaz a nedves ké5 szítményben mikroszkóposán vizsgált sejtek szabálytalan alakot mutatnak, majd az így termelt vírust kémiai reagensekkel vagy fizikai módszerrel inaktiváljuk és valamely gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozó és/vagy vivőanyaggal összekeverjük.10
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy embrionális sejt-kultúraként diploid macskaembrió-tüdősejteket alkalmazunk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy macska-embrionális sejt kul-15 túraként heteroploid macskaembrió-tüdősejteket alkalmazunk.
- 4. Az 1—3. igénypontok szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy kémiai reagensként formaldehidet, acetil-etilénimint, β-propiolaktont vagy β-eti-20 lénimint használunk.
- 5. Az 1—4. igénypontok szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy fizikai módszerként UVbesugárzást használunk.
- 6. Az 1—5. igénypontok szerinti eljárás foganatosítási 25 módja, azzal jellemezve, hogy a hatásos adag titerét1O4,0—108’° TCID50/ml értékben választjuk meg.Λ kiadásért Felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB7846666 | 1978-11-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU181994B true HU181994B (en) | 1983-11-28 |
Family
ID=10501438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU79WE610A HU181994B (en) | 1978-11-30 | 1979-11-29 | Process for preparing inactivated peritonitis vaccine |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0011865B1 (hu) |
JP (1) | JPS5576820A (hu) |
AT (1) | ATE1044T1 (hu) |
AU (1) | AU5329179A (hu) |
DE (1) | DE2962921D1 (hu) |
DK (1) | DK506979A (hu) |
ES (1) | ES486441A0 (hu) |
HU (1) | HU181994B (hu) |
NZ (1) | NZ192271A (hu) |
ZA (1) | ZA796477B (hu) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4303644A (en) * | 1979-10-16 | 1981-12-01 | Norden Laboratories, Inc. | Feline infectious peritonitis virus vaccines |
CA1303500C (en) * | 1986-02-06 | 1992-06-16 | Charles A. Baldwin | Feline infectious peritonitis vaccine |
CA2005291C (en) * | 1988-12-30 | 1999-01-26 | Beverly Dale | Feline infectious peritonitis virus diagnostic tools |
CA2011025A1 (en) * | 1989-03-01 | 1990-09-01 | Terry R. Beardsley | Feline infectious peritonitis vaccine |
NZ240558A (en) | 1990-11-14 | 1994-11-25 | Smithkline Beecham Corp | Recombinant feline coronavirus s proteins useful in diagnosis and vaccination against feline peritonitis virus disease |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1177635A (en) * | 1966-02-18 | 1970-01-14 | Wellcome Found | Cell Stains. |
GB1286250A (en) * | 1968-10-08 | 1972-08-23 | Wellcome Found | Heteroploid cell lines |
GB1471262A (en) * | 1974-03-25 | 1977-04-21 | C Vet Ltd | Virus growth |
GB1492930A (en) * | 1974-10-31 | 1977-11-23 | Afg Ltd | Virus growth |
-
1979
- 1979-11-29 HU HU79WE610A patent/HU181994B/hu unknown
- 1979-11-29 ZA ZA00796477A patent/ZA796477B/xx unknown
- 1979-11-29 DK DK506979A patent/DK506979A/da not_active Application Discontinuation
- 1979-11-29 AU AU53291/79A patent/AU5329179A/en not_active Abandoned
- 1979-11-29 DE DE7979104764T patent/DE2962921D1/de not_active Expired
- 1979-11-29 ES ES486441A patent/ES486441A0/es active Granted
- 1979-11-29 JP JP15497379A patent/JPS5576820A/ja active Pending
- 1979-11-29 AT AT79104764T patent/ATE1044T1/de not_active IP Right Cessation
- 1979-11-29 NZ NZ19227179A patent/NZ192271A/xx unknown
- 1979-11-29 EP EP19790104764 patent/EP0011865B1/en not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ192271A (en) | 1983-03-15 |
DE2962921D1 (en) | 1982-07-08 |
EP0011865A1 (en) | 1980-06-11 |
ATE1044T1 (de) | 1982-06-15 |
AU5329179A (en) | 1980-06-05 |
JPS5576820A (en) | 1980-06-10 |
DK506979A (da) | 1980-05-31 |
ZA796477B (en) | 1981-07-29 |
ES8107024A1 (es) | 1980-12-16 |
EP0011865B1 (en) | 1982-05-19 |
ES486441A0 (es) | 1980-12-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0189958B1 (en) | Canine parvovirus vaccines | |
US4086134A (en) | Method for preparation of vaccine against feline leukemia | |
Pye | Vaccination of sheep with cell culture grown orf virus | |
US4571386A (en) | Feline infectious peritonitis vaccine | |
AU659490B2 (en) | Chicken anaemia agent vaccine | |
EP0027347A1 (en) | Feline infectious peritonitis virus, its preparation and vaccines containing it | |
US3080291A (en) | Serial passage of distemper virus in tissue cultures of chick embryo and canine tissue and vaccine therefrom | |
NO159782B (no) | Anordning ved fjaersystem, foerst og fremst paa kjoeretoeyer. | |
US4034081A (en) | Vaccines against feline leukemia | |
US3966907A (en) | Vaccines against feline leukemia | |
EP0030063A2 (en) | Infectious-bronchitis vaccines for poultry, combined infectious-bronchitis vaccines, process for preparing such vaccines, process for preventing infectious bronchitis and infectious-bronchitis virus strains | |
HU183765B (en) | Process for producing lyophilized vaccine against duck hepatitis | |
US2912361A (en) | Canine distemper vaccine and its preparation | |
HU181994B (en) | Process for preparing inactivated peritonitis vaccine | |
US4386065A (en) | Vaccine against EAE | |
US3562387A (en) | Mink virus enteritis vaccine and method for the production thereof | |
CA2178553A1 (en) | Marek's disease vaccine | |
US4312947A (en) | Process for the preparation of a vaccine against panleucopenia of the cat | |
JP2892767B2 (ja) | イヌコロナウイルスワクチン | |
PT1387693E (pt) | Vacina de micoplasma inactivado por saponina | |
JPH0341034A (ja) | ネコ科動物感染性腹膜炎ワクチン | |
RU2204599C1 (ru) | Штамм № 1734 "приморский-2000" вируса ящура типа о для изготовления диагностических и вакцинных препаратов | |
RU2395299C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и лептоспироза крупного рогатого скота | |
RU2162340C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней | |
RU2395297C1 (ru) | Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота |