HU179788B - Process for preparing new carbopenem derivatives - Google Patents
Process for preparing new carbopenem derivatives Download PDFInfo
- Publication number
- HU179788B HU179788B HU78SA3138A HUSA003138A HU179788B HU 179788 B HU179788 B HU 179788B HU 78SA3138 A HU78SA3138 A HU 78SA3138A HU SA003138 A HUSA003138 A HU SA003138A HU 179788 B HU179788 B HU 179788B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibiotic
- formula
- medium
- priority
- hydrogen
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D477/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring
- C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
- C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
- C07D477/16—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6 with hetero atoms or carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 3
- C07D477/20—Sulfur atoms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Eljárás új karbapeném-számazékok előállítására
A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű új karbapeném-származékok — ahol a képletben R, jelentése metil-csoport vagy hidrogénatom és R2 jelentése —CH2—CH2— vagy —CH=CH— csoport és amennyiben R! jelentése metil-csoport, akkor R2 jelentése —CH2—CH2— csoport és amenynyiben Rj jelentése hidrogénatom, akkor R2 jelentése —CH=CH— csoport és
R3 jelentése hidrogénatom, kisszénatomszámú alkilvagy trifenil-metil-csoport — valamint az (I) általános képletű vegyületek — ahol a képIetbcnR, és R2 jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — alkálifém-, alkáliföldfém-, ammóniumvagy aminsóinak és R3 jelentésének megfelelő észtereinek az előállítására.
Ismertek 3-laktamáz gátló hatással rendelkező antibiotikumok és β-laktamáz gátló szerek. Ezek példáiként a következőket említjük meg: MC696—SY2—A és B, melyeket a Streptomyces nemzetséghez tartozó MC696— SY2-t termelő család tenyésztalajából izoláltak (3 981 788 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás: Derwent CPI 19171X, MM4550 vagy MM13902, melyeket a Streptomyces nemzetséghez tartozó MM4550-t vagy MM13902-t termelő család tenyésztalajából izoláltak) 2 513 855 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat: Derwent CPI 67721W, 2 513 854 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat: Derwent CPT 67720W, klavulánsav, melyet a Streptomyces clavuligerus tenvésztalajá179788 ból izoláltak (2 517 316 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat: Derwent CPI 72840W). A penicillinhez hasonló szerkezetű tienamycin antibiotikum és származékai szintén ismertek (3 950 357 számú 5 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás: Derwent CPI 31696X; 2 652 677 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat: Derwent CPI 40282Y; 848 346 számú belga szabadalmi leírás: Derwent CPI 34505Y; 848 349 számú belga szabadalmi le1C írás: Derwent CPI 34507; 2 652 680 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat: Derwent CPI 40283Y; 2 652 675 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási irat: Derwent CPI 40280Y;
652 674 számú német szövetségi köztársaságbeli közre15 bocsátási irat: Derwent CPI 40281Y).
A találmány szerinti eljárással előállított antibiotikumokhoz hasonló szerkezetű antibiotikumot, a „PS— 5” β-laktám antibiotikumot [(IV) képletű vegyület] írnak le a 35375/77 és a 94651 számú japán szabadalmi beje20 lentések.
Jelen találmány tárgya eljárás új antibiotikumok és származékaik, közelebbről a PS—6 és PS—7 antibiotikumok, valamint származékaik előállítására. Ezek az antibiotikumok erős antibiotikus hatásúak, β-laktamáz 25 gátló hatásuk van és képesek a penicillinek, cefalosporinok β-laktamáz termelőkkel szembeni antibiotikus hatását szinergetikusan növelni. A találmány tárgyát képezik továbbá antibiotikum kompozíciók, melyek ezeket az anyagokat tartalmazzák.
A találmány elsődleges célja az új, erős antibiotikus
-1179788 hatású és β-laktamáz gátló hatással rendelkező PS—6 és PS—7 antibiotikumok előállítása.
A találmány második célja a PS—6 és PS—7 antibiotikumok észtereinek, elsősorban tritil-származékainak előállítása, melyek szintén erős antibiotikus hatásúak és 5 rendelkeznek β-laktamáz gátló hatással.
A találmány célja, továbbá, hogy megmutassuk a PS—6 és PS—7, valamint ezek tritil-származékainak azon képességét, hogy szinergetikusan növelni képesek a penicillinek és cefalosporinok β-laktamáz termelő re- 10 zisztens baktériumokkal szembeni antibiotikus aktivitását.
A találmány célja a PS—6 és PS—7 antibiotikumok fermentációs eljárással történő előállítása is.
A találmány célja ezen kívül eljárás kidolgozása a 15 PS—6 és PS—7 antibiotikumok származékainak, különösen észter-származékainak, mindenekelőtt tritil-származékainak előállítására.
A találmány célja a fentieken túlmenően, hogy preventív és terápiás eljárásokat dolgozzunk ki, valamint a 20 PS—6 és PS—7 antibiotikumokból, illetve ezek tritilésztereíből kompozíciókat állítsunk elő azzal a céllal, hogy ezeket a kompozíciókat, illetve eljárásokat a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok által okozott fertőző betegségek leküzdésére alkalmazzuk. 25 A kompozíciók magukban foglalják a penicillineket, cefalosporinokkal és egyéb β-laktamáz-érzékeny antibiotikumokkal készített szinergetikus kombinációkat is.
A találmány szerinti eljárással előállított PS—6 és PS —7 antibiotikumoknak és ezek származékainak 30 fizikai-kémiai jellemzőit, β-laktamázzal szembeni viselkedésüket, biológiai hatásukat, valamint más antibiotikumokkal együtt kifejtett szinergetikus hatásukat az alábbiakban részletezzük.
1. A PS—6 antibiotikum fizikai-kémiai tulajdonságai
1. Papírkromatográfia
A PS—6 antibiotikum (nátrium-só) Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) papíron végzett leszálló papírkromatográfiás vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek esetén: acetonitril(trisz)EDTA (1. számú megjegyzés: Rf= 45 =0,41, etanol/víz [7/3]: Rf=0,65.
[1. számú megjegyzés: az oldószerelegy 120 ml acetonitrilből, 30 ml 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid pufferból (pH=7,5) és 1 ml 1/10 M vizes 50 etiléndiamintetraecetsav-nátrium-só oldatból (pH=4,5) áll.]
Amennyiben másként nem adjuk meg az oldószerek egymáshoz viszonyított arányait térfogatarányban fejez- 55 zük ki.
2. Vékonyrétegkromatográfia (TLC)
A PS—6 antibiotikum (nátrium-só) Chromatogram 60 Sheet 13254 Cellulose (No. 6065) (Trademark of Eastman Kodak Co., Ltd.) alkalmazásával végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek esetén: n-butanol/etanol/víz [4/1/5] (fedőréteg): Rf=0,67 n-propanol/víz [8/2]: Rf=0,69 n-butanol/i-propanol/víz [7/7/6]: Rf=0,70 acetoiiitril/víz [8/2]: Rf=0,63
3. Nagyfeszültségű papír elektroforézis
A PS—6 antibiotikum (nátrium-só) viselkedését a következő összetételű pufferban vizsgáljuk: 30Ö0 ml víz, 3,3 g dietilbarbitursav és 25,5 g nátriumdietilbarbiturát, a puffer 8,6 pH értékű. A vizsgálatot Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) alkalmazásával nagyfeszültségű papír elektroforézis berendezésben (Savant Instrument Inc., High Voltage Power Supply HV3000A, Fiat Piacé Electrophoresis Chamber FP 18A) végezzük.
Az antibiotikum 30 percen keresztül ható 42 V/cm feszültséggradiensű áram hatására legalább 5 mm, általában 10—40 mm távolságra migrál az anód irányába.
4. β-laktamázzal szembeni viselkedés
A hatást a Bacillus cereus-ból származó β-laktamázzal dezaktiváljuk.
5. Savas, semleges vagy bázisos jelleg
A PS—6 antibiotikum egybázisú sav, a molekulában egy karboxil-csoport van.
6. Ultraibolya (UV) abszorpciós spektrum
A PS—6 antibiotikum (nátrium-só) jellemző ultraibolya abszorpciós maximuma a következő:
λ££=300 nm.
7. Infravörös (IR) abszorpciós spektrum
A PS—6 antibiotikum (nátrium-só) jellemző infravörös abszorpciós maximuma káliumbromid tabletta alkalmazásával történő mérés alapján a következő: 1760 cm-1 (a β-laktám gyűrű —CO— csoportja), 1660 cnv1 (amid —CO— csoportja), 1600 cm 1 (—COO -csoportja).
8. Proton magmágneses rezonancia (Proton NMR) spektrum
A PS—6 antibiotikum (nátrium-só) a következő jellemzőket mutatja a 100 MHz-es proton magmágneses rezonancia spektrumon, melyet nehéz vízben (D2O) mérünk: V (i) két dublett 0,94 és 0,98 ppm-nél, melyek kapcsolódási állandói 7,0 Hz-nél vannak.
<Ή3\
CH~ |ch3Z (ii) éles szingulett 1,92 ppm-nél (CH, -CO -) (iii) multiplett 2,40—3,50 ppm-nél (—CH2—CH—) (iv) multiplett 3,90—4,20 ppm-nél
N
13· h
-2179788
9. Molekulasúly
Körülbelül 312 (a PS—6 antibiotikum metil-észterének tömegspektrumából kapott eredmények alapján számítva).
10. Színreakciók
Ehrlich-reagens reakció: pozitív. Jód-klórplatinasav reakció: pozitív. Ninhidrin reakció: negatív.
11. Oldhatóság
A PS—6 antibiotikum oldódik 6—9 pH értékű vízben, j de teljesen oldhatatlan benzolban, acetonban és etilacetátban.
A fenti fizikai-kémiai jellemzők alapján nyilvánvaló, hogy az (1)—(8) képletü csoportok vannak jelen a PS —6 antibiotikum (nátrium-só)-ban.
A PS—6 antibiotikumnak tienamycin (vesd össze: 3 950 357 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) váza van, mely egy kéntartalmú oldallánccal rendelkezik, mint az a PS—5 antibiotikum esetén is fennáll. Ezt az ultraibolya abszorpciós maximum és az antibiotikum észterezése következtében az ultraibolya abszorpciós maximumnak 300 nm-ről 316 nm-re történő eltolódása alapján állapítottuk meg, melyet a későbbiekben részletezünk. A PS—6 antibiotikum összegképlete a metil-észter tömegspektruma alapján: C14H20N2O4S.
Ezeknek az adatoknak alapján a PS—6 antibiotikum szerkezete az (la) képletnek felel meg.
A PS—6 antibiotikum biológiai tulajdonságai
1. Antibiotikus hatásspektrum
A PS—6 antibiotikum széles antibiotikus hatásspektrummal rendelkezik, nagyon erős hatású több baktériummal szemben, például a Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus, Bacillus nemzetségekhez tartozó Gram-pozitív baktériumokkal, az Alcaligenes, Comamonas nemzetségekhez tartozó Gram-negatív baktériumokkal szemben. Jó hatású a PS—6 antibiotikum például a Klebsiella, Proteus nemzetségekhez tartozó Gram-negatív baktériumokkal szemben is.
* Jellemző a PS—6 antibiotikumra, hogy erős hatású olyan Gram-negatív baktériumokkal szemben is, melyek a β-laktám-gyűrűs szerkezetű antibiotikumokkal szem, ben, melyek például a Citrobacter, Proteus, Klebsiella nemzetségekhez tartoznak, rezisztensek.
2. Más antibiotikumok β-laktamáz-termelő baktériumokkal szembeni antibiotikus hatásának növelése
A PS—6 antibiotikum más, különösen β-laktám antibiotikumok, mint például penicillin, cefalosporin, antibiotikus hatását növelni képes β-laktamáz-termelő baktériumokkal, mint például Proteus vulgáris, Serratia marcescens, szemben.
3. In vivő hatás
Az antibiotikum patogén Gram-pozitív baktériumokkal fertőzött egerek esetén terápiás hatást fejt ki.
4. Toxicitás
Egereknél 500 mg/kg mennyiségben intraperitoneálisan alkalmazva nem toxikus.
II. A PS—7 antibiotikum fizikai-kémiai tulajdonságai
1. Papírkromatográfia
A PS—7 antibiotikum (nátrium-só) Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Co.) papíron végzett leszálló papírkromatográfiás vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek esetén: acetonitril/trisz/EDTA: Rf=0,41, etanol/víz (7/3): Rf=0,68.
2. Vékonyrétegkromatográfia
A PS—7 antibiotikum (nátrium-só) Chromatogram Sheet 13254 Cellulose (No. 6065) (Eastman Kodak Co.) alkalmazásával végzett vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek esetén: n-butanol/etanol/víz (4/1/5) (fedőréteg): Rf=0,60, n-propanol/víz (7/3): Rf=0,81, n-butanol/i-propanol/víz (JllfS): Rf=0,71, acetonitril/víz (8/2): Rf=0,65.
3. Nagyfeszültségű papír elektroforézis
A PS—7 antibiotikum (nátrium-só) viselkedését a következő összetételű pufferban vizsgáljuk: 3000 ml víz, 3,3 g dietilbarbitursav és 25,5 g nátriumdietilbarbiturát, a puffer 8,6 pH értékű. A vizsgálatot Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Co.) alkalmazásával nagyfeszültségű papír elektroforézis berendezésben (Savant Instruments Co., High Voltage Power Supply HV 3000 A, Electrophoresis véssél 18A) végezzük.
Az antibiotikum 30 percen keresztül ható 42 V/cm feszültséggradiensű áram hatására legalább 5 mm, általában 10—40 mm távolságra migrál az anód irányába.
4. β-laktamázzal szembeni viselkedés
A hatást a Bacillus cereus-ból származó β-laktamázzal dezaktiváljuk.
5. Savas, semleges vagy bázisos jelleg
A PS—7 antibiotikum egybázisú sav, a molekulában egy karboxil-csoport van.
6. Ultraibolya (UV) abszorpciós spektrum
A PS—7 antibiotikum (nátrium-só) jellemző ultraibolya abszorpciós maximuma a következő:
λ«£=220 nm és =308 nm.
-3179788
7. Infravörös (IR) abszorpciós spektrum
A PS—7 antibiotikum (nátrium-só) jellemző infravörös abszorpciós maximuma káliumbromid tabletta alkalmazásával történő mérés alapján a következő: 1760 cm1 (a β-laktám gyűrű —CO— csoportja) 1670 cm1 (amid —CO— csoportja) 1620 cm1 (—COO® és —CH CH— csoportja)
8. Proton magmágneses rezonancia (Proton NMR) spektrum
A PS—7 antibiotikum (nátrium-só) a következő jellemzőket mutatja a 100 MHz-es proton magmágneses rezonancia spektrumon, melyet nehéz vízben (D2O) mérünk:
(i) triplett, melynek központja 0,96 ppm-nél van (CH3—CH2—) (ii) muítiplett, melynek központja 1,72 ppm-nél van (~CH2 CH3) (iii) éles szingulett 2,05 ppm-nél (CHj—CO—) (ív) muítiplett 2,96—3,38 ppm-nél (—CH2—CH—) (v) szingulett, melynek központja 3,96 ppm-nél van
(vi) két dup ett, melyek központja 6,02 és 7,10 ppmnél van (J=körülbelül 14 Hz) (—CH=CH—)
9. Molekulasúly
Körülbelül 296 (a PS—7 antibiotikum metil-észterének tömegspektrumából kapott eredmények alapján számítva).
10. Színreakciók
Ehrlich-reagens reakció: pozitív
Jód-klórplatinasav reakció: pozitív
Ninhidrin-reakció: negatív
11. Oldhatóság
A PS—7 antibiotikum oldódik 6—9 pH értékű vízben, gyakorlatilag oldhatatlan benzolban, acetonban és etilacetátban.
A fenti fizikai-kémiai jellemzők alapján nyilvánvaló, hogy a (2), (4), (6)—(10) képletű csoportok vannak jelen a PS—7 antibiotikum (nátrium-só)-ban.
Ezeknek az adatoknak az alapján a PS—7 antibiotikumnak az (Ib) képletnek megfelelő szerkezete van.
A PS—7 antibiotikum biológiai tulajdonságai
1. Antibiotikus hatásspektrum
A PS—7 antibiotikum széles spektrumú mikrobaellenes hatással rendelkezik. Sok mikroorganizmussal szemben fejt ki nagymértékű mikrobaellenes hatást, például a Staphylococcus vagy Diplococcus nemzetségbe tartozó
Gram-pozitív baktériumokkal szemben, valamint például az Alcaligenes nemzetségbe tartozó Gram-negatív baktériumokkal szemben.
A PS—7 antibiotikum különösen a Citrobacter vagy Enterobacter nemzetségekbe tartozó Gram-negatív baktériumokkal szemben mutat fel nagymértékű mikrobaellenes hatást, melyek ellenállóak az ismert β-laktám antibiotikumokkal szemben.
2. Más antibiotikumok β-laktamáz-termelő baktériumokkal szembeni antibiotikus hatásának növelése
A PS—7 antibiotikum más, például β-laktám antibiotikumok, mint például cefalosporinok mikrobaellenes hatását növelni képes β-laktamáz-termelő baktériumokkal, mint például Proteus vulgáris vagy Serratia marcescens, szemben.
3. In vivő hatás
Az antibiotikum patogén Gram-pozitív baktériumokkal fertőzött egerek esetén terápiás hatást fejt ki.
4. Toxicitás
Egereknél 500 mg/kg mennyiségben intraperitoneálisan alkalmazva akut toxicitás nem jelentkezik.
A találmány szerinti eljárással a fenti tulajdonságokkal rendelkező PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumokat ezeknek az antibiotikumoknak termelésére képes mikroorganizmusok tápanyagot tartalmazó táptalajon történő tenyésztésével, majd ebből történő izolálásával állíthatjuk elő.
A találmány szerint alkalmazott, PS—6 és PS—7 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmusok képesek vagy csak az egyik, vagy mindkét antibiotikum termelésére.
A PS—6 és PS—7 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmusok jellegzetes képviselői a Streptomyces nemzetségbe tartoznak. Erre a célra a legmegfelelőbb a Streptomyces nemzetségbe tartozó No. A271 törzs, melyet Japánban, Fukui Prefecture Yoshida megyéjében levő Eiheiji Temple közelében összegyűjtött talajmintából izoláltunk. Ez a törzs mind a PS—6, mind a PS—7 antibiotikum termelésére képes, és a találmány szerinti eljárásban előnyösen ezt alkalmazzuk.
Az A271 törzs taxonómiai tulajdonságai
A Streptomyces A271 törzs taxonómiai tulajdonságai az alábbiak:
1. Morfológiai jellemzők
A spórás aerial mycelium elágazása: egyszerűen elágazott. A spórás aerial mycelium alakja: az aerial mycelium felső részén éles kanyarok, hurkok vagy nem teljes spirálok figyelhetők meg.
Ennek alapján a törzs a Retinaculum-Apertum csoportba tartozik. Ezeket az alakzatokat különösen akkor figyelhetjük meg, ha a törzset zabliszt agar- és glicerin-aszparagin agar táptalajon tenyésztjük. Ezzel szemben adott esetbén' égyenes vagy hajlott alakzat figyelhető meg, amennyiben a törzset élesztő extraktum-maláta' extraktum agar táptalajon tenyésztjük. A spóraláncok alakja és száma: ovális vagy hengeres spórák, melyek 10-nél több spórából (általában 10—-50 spórából) álló láncot alkotnak. A spórák mérete és felületi szerkezete: 0,8—1,0x1,0—1,8 μ, sima felület. Sem flagella, sem sporangíum nem figyelhető meg. Az aerial myceliumon gombafonalak képződnek.
2. Tenyésztés módjától függő jellemzők
Az A271 törzsnek a tenyésztés ntódjától függő jellemzőit az 1. táblázatban foglaljuk össze. Amennyiben más 5 adatot nem adunk meg, a tenyésztés módjától függő jellemzőket 2 hétig, 28 °C hőmérsékleten történő tenyésztés után vizsgáljuk. A színek megítélését H. D. Tresner és E. J. Backus „System of Color Wheels fór Streptomycete Taxonomy” (vesd össze: Appl. Microbiol. 11, 335, 10 1963) és a „Guide to Color Standard” (a japán Color Institute Fcundation kiadása) alapján végeztük.
1. táblázat
| Táptalaj | Növekedés | Az aerial mycelium színe | Az alsó mycelium színe | Oldható pigment |
| Szacharóz nitrát | nagymértékű | világos narancssárga (3ea) | világos sárga (2fb) | nincs |
| agar táptalaj | világos narancssárga | |||
| (3ea) | ||||
| Glükóza Szpáragtn | nagymértékű | halvány narancssárga (3ca) | világos sárga (1 2/, fb) | nincs |
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | (2fb) | ||
| Glicerinaszpáragin | nagymértékű | halvány narancssárga (3ca) | világos sárga (2fb) | nirics |
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | sárgás rózsaszín (4gc) | ||
| Keményítő | nagymértékű | halvány narancssárga (3ca) | világos narancssárga | nincs |
| szervetlen só | (3ea) | |||
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | világos sárga (2fb) | ||
| Tyrozin | nagymértékű | halvány narancssárga (3ca) | világos narancssárga | nincs |
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | (3ea) barnás sárga | ||
| Tápanyag | nagymértékű | alig van színe; ha van, | halvány sárga (2db) | nincs |
| agar táptalaj | akkor kicsit sötétes | |||
| Élesztő extraktum | nagymértékű | halvány narancssárga (3ca) | világos narancssárga | nincs |
| maláta extraktum | világos narancssárga (3ea) | (3ea) | ||
| agar táptalaj | halvány barna (4ie) | |||
| Zabliszt | nagymértékű | halvány narancssárga (3ca) | világos sárga (2fb) | nincs |
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) |
3. Fiziológiai jellemzők
1. Növekedési hőmérséklettartomány: 10—40 °C, az optimum 20—30 °C.
2. A zselatin cseppfolyósodása (glükóz-pepton-zselatin táptalajon): cseppfolyósodik (a tenyésztés 20 °C hőmérsékleten történik).
3. A keményítő hidrolízise (keményítő-szervetlen-só agar táptalajon): hidrolizál.
4. A lefölözött tej koagulációja és peptonizációja: peptonizál, de koaguláció nem figyelhető meg.
5. A melanoid pigment kialakulása: tyrozin agar táptalajon, pepton-élesztő-ion agar táptalajon és trypton-élesztő extraktum táptalajon melanoid pigment nem keletkezik.
6. Az alább felsorolt különböző szénforrások hasznosítása (Pridham és Gottlieb agar táptalaj):
L-Arabinóz+
D-Xilóz+
D-Glükóz+
D-Fruktóz—
Szacharóz±
Inozit—
L-Ramnóz+
Raffinöz—
D-Mannit— (+: jól hasznosul, ± : rosszul hasznosul, —: nagyon rosszul hasznosul vagy egyáltalán nem hasznosul).
Ezeknek a tulajdonságoknak az alapján nyilvánvaló, hogy az A271 törzs a Streptomyces nemzetséghez taráé tozik és az RA csoporthoz tartozó mikroorganizmusoknál is megfigyelhető jellemzőket mutatja, mivel a mycelium felületének színe sárga vagy piros, a spóra felülete sima és nem képződik vízoldható pigment, mint például a melanoid pigment. Ilyen taxonómiai tulajdonságokkal 50 rendelkező tenyészeteket kerestünk az alább felsorolt irodalmi források alapján: Waksman: „The Actinomycetes” vol. 2. (1961), E. B. Shirling és D. Gottlieb: International Journal of Systematic Bacteriology vol. 22, page 265—394 (1972), Bargey: Mannual of Determi55 native Bacteriology, 8. kiadás (1974). Az RA csoportba tartozó hasonló tenyészetek az Actinomyces cremeus, Actinomyces flavidovirens, Actinomyces albohelvátus, Actinomyces flave'scens, Streptomyces rutgersensis, Streptomyces chryseus, Streptomyces helvaticüs. Mint 60 hasonló tenyészetet kiválasztottuk a Streptomyces pluricolorescens-t is morfológiai jellemzői alapján, bár ez a tenyészet az RF csoportba tartozik. Éz a nyolc tenyészet az utolsóként említett Streptomyces Pluricolorescens kivételével az irodalmi adatok alapján egyenes 65 vagy hurok alakú aerial myceliumot termel, az alak a
-5179788 tenyésztési körülményektől függ. A fent említett nyolc faj jellemző tenyészeteit tenyésztés után azonos körülmények között összehasonlítottuk a találmány szerinti A271 törzzsel. A vizsgálatok alapján az A271 törzs teljesen különbözik a fenti tenyészetektől növekedésben, az aerial mycelium és az alsó mycelium színében és a szénforrások hasznosításában.
A 2., 3. és 4. táblázat tartalmazza az A271 család és a hozzá leginkább hasonló két tenyészet vizsgálatának 5 eredményeit.
2. táblázat
Az A271 törzs összehasonlítása hasonló tenyészetekkel Az aerial mycelium színe
| Táptalaj | A27Í törzs | Actínomyces cremeus ISP 5147 | Actínomyces fíavidovireas ISP 5150 |
| Szacharóz nitrát agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | alig van színe | színtelen |
| Glükózaszparagin agar táptalaj | halvány narancssárga (3ca) világos narancssárga (3ea) | halvány narancssárga (? :a) | fehér (b) |
| Glicerinaszparagin agar táptalaj | halvány narancssárga (3ca) világos narancssárga (3ea) | halvány narancssárga (3ca) | alig van színe, ha van, akkor fehéres (a) |
| Keményítő szervetlen só agar táptalaj | halvány narancssárga (3ca) világos narancssárga (3ea) | halvány narancssárga ( 3ca) | alig látható fehér (a) halvány sárga (2db) |
| Tápanyag agar táptalaj | alig van színe, ha van, akkor kicsit sötétes | fehér (a) halvány narancssárga (3ca) | fehér (b) |
| Élesztő extraktum maláta extraktum agar táptalaj | halvány narancssárga (3ca) világos narancssárga (3ea) | halvány sárga (2db) | fehér (b) halvány sárgászöld (leb) |
| Zabliszt | halvány narancssárga (3ca) | fehér (b) | fehér (b) |
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | halvány narancssárga (3ca) | halvány sárgászöld (lbd) |
3.táblázat
Az A271 törzs összehasonlítása hasonló tenyészetekkel
Az alsó mycelium színe
| Táptalaj | A271 törzs | Actínomyces cremeus ISP 5147 | Actínomyces flavidovirens ISP 5150 |
| Szacharóz nitrát | világos sárga (2fb) | gyenge növekedés színtelen | gyenge növekedés színtelen |
| agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) | fehér (b) | fehér (a) |
| Glükózaszparagin agar táptalaj | világos sárga (1 2/1 fb—2fb) | világos narancssárga (3ea) | halvány sárga (2db) |
| Glicerinaszparagin agar táptalaj | világos sárga (2fb) kicsit sárgás rózsaszín (4gc) | világos narancssárga (3ea) | szürkés sárga (3ec) |
| Keményítő szervetlen só | világos narancssárga (3ea) világos sárga (2fb) | enyhe sárgás rózsaszín (4ea) | világos sárga (2fb) |
| agar táptalaj | |||
| Tyrozin agar táptalaj | világos narancssárga (3ea) barnás sárga | halvány barna (4ie) | szürkés sárga (3ec) |
| Tápanyag | halvány sárga (2db) | világos narancssárga (3ea) | halvány sárga (2db) |
| agar táptalaj | |||
| Élesztő extraktum maláta extraktum | világos narancssárga (3ea) halvány barna (4ie) | világos narancssárga (3ea) sötét sárga | matt sárga |
| agar táptalaj | |||
| Zabliszt agar táptalaj | világos sárga (2fb) | kissé sárgás rózsaszín (4gc) | halvány sárga (2db) halvány narancssárga (3ca) |
-6179788
4. táblázat
Az A271 törzs összehasonlítása hasonló tenyészetekkel A szénforrások hasznosítása
| Szénforrások | A271 törzs | Actinomyces cremeus ISP5157 | Actinomyces flavidovirens TSP 5150 |
| L-Arabinóz | + | + | + |
| D-Xilóz | + | + | + |
| D-Glükóz | + | + | + |
| D-Fruktóz | — | + | + |
| Szacharóz | ± | — | — |
| Inozit | — | — | + |
| L-Ramnóz | + | — | + |
| Raffinóz | — | — | — |
| D-Mannit | — | — |
A fenti táblázatok eredményeiből az alábbi következtetéseket vonhatjuk le.
Az aerial mycelium színét illetően az Actinomyces flavidovirens általában fehér, amennyiben sárga, akkor zöldessárga. Ez különbség a találmány szerinti A271 törzzsel szemben. Az Actinimyces cremeus általában kevésbé vöröses árnyalatú halvány narancssárga színű, mint az A271 törzs és ezért különbözik az A271 törzstől.
A substrate mycelium színét illetően az Actinomyces flavidovirens halvány sárga, az Actinomyces cremeus világos narancssárga színű a legtöbb esetben, míg az A271 törzs általában világos sárga színű. Ezen túlmenően a különböző táptalajok esetén kapott kísérleti eredmények részletes összehasonlítása azt mutatja, hogy az A271 törzs különbözik a másik két tenyészettől. Az A271 törzs az Actinomyces cremeus-tól a D-fruktóz és L-ramnóz hasznosításában, az Actinomyces flavidovirens-töl a D-fruktóz és inozit hasznosításában különbözik.
Ezek alapján a találmány szerinti A271 törzs világosan különbözik a hozzá legjobban hasonlító két ismert tenyészettől. Ebből következően az A271 törzs különbözik minden Streptomycetes fajtól és új fajnak tekinthetjük, melynek neve Streptomyces sp. A271. Ezt a tenyészetet Japánban az Agency of Industrial Science and Technology Fermentáción Research Institute-nál letétbe helyeztük és itt a FERM—P No. 3984 számot kapta. Szintén letétbe helyeztünk Streptomyces sp. A271 mintát az ATCC-nél, ahol az No. 31358 számot kapta.
A találmány szerinti eljárásban nemcsak magát az A271 törzset, hanem annak természetes és mesterséges mutánsait — melyeket kémiai vagy fizikai kezeléssel hozunk létre — is használhatjuk.
A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmusok a mikroorganizmusok széles körét ölelik fel és nem korlátozzuk azokat egy bizonyos nemzetségre.
A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes mikroorganizmusok kiválasztását az alábbi módszerrel átlagos képzettségű szakember el tudja végezni.
Talajból izolált, mikroorganizmusok tenyésztési táptalajának szűrletét β-laktamáz-érzékeny mikroorganizmussal beoltott biológiai vizsgálat céljára szolgáló agarlemez és egy másik, ugyanazzal a mikroorganizmussal beoltott, β-laktamázt tartalmazó biológiai vizsgálat cél jára szolgáló agar-lemez alkalmazásával analizálunk. A táptalajszűrletből azokat a mikroorganizmusokat választjuk ki a további munka céljára, melyek az utóbbi lemezen kisebb gátló zónát mutatnak, mint az előbb említetten. Ezután a fenti módszerrel kiválasztott mikroorganizmusok tenyésztési táptalajában levő aktív komponenseket aktív szénén adszorbeáljuk, majd eluáíjuk. Az összegyűjtött eluátumot papírkromatográfiával vagy vékonyréteg-kromatográfiával kifejlesztjük, mely után valamely vizsgálati organizmusként szolgáló β-Iaktámérzékeny mikroorganizmussal történő bioautográfia következik. A mikroorganizmusok kiszűrésére szolgáló módszert még közelebbről mutatjuk meg a következő példával.
A β-laktám-érzékeny organizmussal beoltott biológiai vizsgálat céljára alkalmas lemezként Comamonas biovizsgálati lemezt használunk. A lemezről részletes leírást később adunk. A Comamonas CV és Comamonas CM biovizsgálati lemezeket úgy állítjuk elő, hogy a fenti Comamonas biovizsgálati lemezhez hozzáadjuk a Proteus vulgáris P—5, illetve Citrobacter freundii E—9 által termelt β-laktamázt. 8 mm átmérőjű cellulózlemezeket, melyekhez előzőleg hozzáadtuk a talajból izolált mikroorganizmusok tenyésztési táptalajának szűrletét, ráhelyezünk a fenti biovizsgálati lemezekre és 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül inkubáljuk.
Az inkubáció után kiválasztjuk azokat a mikroorganizmusokat, melyek táptalajszűrletei gátló zónát mutatnak a Comamonas lemezen és ennél kisebb gátló zónát adnak a Comamonas CV vagy Comamonas CM lemezeken.
Ezeknek a mikroorganizmusoknak a táptalajához hozzáadunk 2% (súly/térfogat) aktív szenet („Tokusei Shirasagi, Takeda Chemical Industries, Ltd.jés 15 percig tartó keverés után az oldhatatlan anyagot centrifugálással összegyűjtjük. Az oldhatatlan anyagot ugyanolyan mennyiségű desztillált vízzel mossuk, mint amennyi táptalaj szűrletet használtunk, és ismét centrifugáljuk. A mosott oldhatatlan anyagot 30 percig szobahőmérsékleten történő keverés útján a felhasznált táptalajszűrlet mennyiségére vonatkoztatott fele mennyiségű 50%-os (térfogat/térfogat) vizes acetonnal eluáíjuk. Centrifugálás után a felülúszót 30—50 °C hőmérsékleten forgó rendszerű bepárlóberendezésben a táptalaj szűrlethez viszonyított 20-szoros töménységű oldatra pároljuk be. A betöményített oldatot leszálló papírkromatográfiás vizsgálatnak vetjük alá (Toyo Filter Paper, Toyo Roshi Kaisha Ltd.), a kromatogramot 16 órán keresztül 80% acetonitril/trisz/EDTA oldószerben [összetétele 120 ml acetonitril, 30 ml 7,5 pH-jú, 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid puffer, 1 ml vizes etiléndiamintetraecetsav-nátrium-só] fejlesztjük ki. Ezután Comamonas terrigena B—996-tal, mint vizsgáló organizmussal történő bioautográfia következik.
Azokat a talajból izolált mikroorganizmusokat választjuk ki PS—5 antibiotikum termelésére képes mikroorganizmusokként, melyek biológiailag aktív termékei ugyanolyan migrációs távolságban (vagy ugyanolyan Rf értéknél) adnak gátló zónát, mint a PS—5 antibiotikum. Az így kiválasztott mikroorganizmusokat a későbbiekben további vizsgálatnak vetjük alá, hogy igazoljuk PS—5 antibiotikum-termelő képességüket. Ezt a vizsgálatot papír és vékonyréteg-kromatográfiával végezzük.
A fenti módszer felhasználásával átlagos képzettségű
-7179788 szakember ki tud választani az A271 törzsön kívül más PS—6 és PS—7 antibiotikum termelésére képes mikroorganizmust is.
A találmány egy lehetséges kiviteli módja szerint a PS—6 és PS—7 antibiotikumokat az említett antibiotikumok termelésére képes mikroba törzsek, például a Streptomyces sp. A271 micéliuma spóráinak tápanyagot tartalmazó táptalajba történő beoltásával és aerob úton történő tenyésztésével állítjuk elő.
Használhatjuk a Streptomycetes által általában hasznosított tápanyagokat, például szénhidrátokat, nitrogénforrásokat, szervetlen sókat. A szénforrások példáiként a következőket soroljuk fel: szénhidrátok, mint glükóz, glicerin, maltóz, szacharóz, melasz, dextrin és keményítő, olajok és zsírok, mint szójababolaj, földimogyoróolaj és disznózsír. A nitrogénforrás példáiként a következőket soroljuk fel: pepton, hús extraktum, szójababliszt, gyapotmagolaj, szárított élesztő, kukoricafőzet, élesztő extraktum, lefölözött tej, kazein, nátriumnitrát, ammóniumnitrát és ammóniumszulfát. A szervetlen sók példáiként a következőket soroljuk fel: káliumhidrogénfoszfát, nátriumklorid, kalciumkarbonát és magnéziumszulfát. Kívánt esetben fémnyomok, mint például kobalt vagy mangán hozzáadhatok a tápanyaghoz. Használhatók olyan tápanyagok is, melyeket a PS—6 és PS—7 antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok hasznosítanak. A sterilizálás és fermentálás alatti habképződés elkerülése céljából habosodás elleni szereket adagolhatunk, mint például szilikonolajok, növényi olajok.
A fenti tápanyagforrások arányát nem korlátozzuk külön, ez az arány széles határok között változhat. Átlagos képzettségű szakember kisszámú kísérlet alapján meg tudja határozni az optimális összetételű és mennyiségű tápanyagforrást minden PS—6 és PS—7 antibiotikum termelésére képes törzs esetén.
A termelt PS—6 antibiotikum mennyisége nő, amenynyiben a Streptomyces sp. A271 tenyésztését olyan táptalajon végezzük, mely valamely aminosavat vagy szerves savat is tartalmaz. Aminosavként 2—10 szénatomszámú semleges aminosavak, különösen valin és leucin használata célszerű, szerves savakként pedig 2—10 szénatomszámú alifás szerves savakat, különösen n-valeriánsavat használhatunk. Az aminosavak közül mind az L-, mind a D-, mind pedig a DL-aminosavak alkalmazhatók, de legelőnyösebb az L-aminosavak használata. A táptalajhoz adott aminosavak, illetve szerves savak mennyiségének kritikus határértéke nincsen, de általában a tenyésztési táptalajra vonatkoztatva előnyösen 0,01—1% (súly/térfogat), legelőnyösebben 0,1—0,5%, (súly/térfogat)-ban alkalmazzuk azokat. Az adagolás ideje nincs meghatározva. A vegyületeket a tenyésztés során bármikor hozzáadhatjuk a táptalajhoz. Előnyösen a tenyésztés megkezdésekor vagy a tenyésztés megkezdésétől számított 100 órán belül adagoljuk ezeket a vegyületeket. Az aminosavakat vagy szerves vegyületeket adagolhatjuk egyszerre vagy különböző időközönként részletekben.
A táptalajt a tenyésztés megkezdése előtt sterilizálhatjuk. A táptalaj pH-ját a sterilizálás előtt vagy után előnyösen 4—9 értékre, különösen 6—8 értékre állítjuk be.
A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes törzsek tenyésztését úgy végezhetjük, mint az általában szokásos abban az esetben, ha a streptomycetes termel antibiotikumot. Általában előnyös az aerob körülmények közötti tenyésztés. A tenyésztést legtöbb esetben keverés és/vagy levegő átfúvatás közben végezzük. Bár a nem mozgó állapotban történő tenyésztés, a 5 rázás közben történő tenyésztés, a levegővel történő átfúvatást és keverést magában foglaló víz alatti tenyésztés is alkalmazható, előnyösen a víz alatti tenyésztést alkalmazzuk.
A fermentáció hőmérsékletére nincs külön előírás, 10 és olyan hőmérsékleten végezzük, melyen a PS—6 és/vagy
PS—7 antibiotikumok termelésére képes törzsek növekedése nem ütközik akadályba és termelődik PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum. Bár a fermentáció hőmérséklete a termelő törzs minőségétől függően válto15 zik, a hőmérséklethatár általában 20—40 °C, előnyösen 25—35 °C.
A táptalaj pH-ját a fermentáció alatt 4—9, különösen 6—8 értékre állíthatjuk be, hogy a fermentációt megfelelően hajthassuk végre. Nagy mennyiségben végzett 20 fermentáció esetén előnyösen oltó-törzset tenyésztünk, és ezzel a tenyészettel beoltjuk a tápanyagot tartalmazó táptalajt, amikoris a tenyésztést víz alatti tenyésztéssel végezzük.
A fermentációt általában addig folytatjuk, míg meg25 felelő mennyiségű PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum gyűlik össze. A fermentáció ideje rendszerint 30— 90 óra közötti, ez az idő függ a táptalaj összetételétől, a fermentáció hőmérsékletétől és a termelő törzs minőségétől.
A kívánt antibiotikum termelésére képes törzs jellemzőinek figyelem bevételével átlagos képzettségű szakember egyszerű kísérletekkel meg tudja határozni az optimális tenyésztési feltételeket. A fermentációs táptalajban felhalmozódott PS—6 és/vagy PS—7 antibio35 tikum mennyisége az alább leírt biovizsgálati módszerrel és bioautográfiával történhet.
Mivel a fermentációs termékben felhalmozódott PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikum vízoldható és nagyrészt a mikrobasejteken kívül található, a fermentáció 40 után előnyösen először valamely ismert módszerrel, mint például szűrés, centrifugálás vagy extrakció, elválasztjuk a sejteket, majd a szűrletből, a felülúszóból vagy az extraktumból izoláljuk az antibiotikumokat.
Az antibiotikumok izolálása különböző ismert mód45 szerek szerint történhet. Különösen azok a módszerek alkalmazhatók, melyeket a karbonsav típusú antibiotikumok esetén szoktak alkalmazni. Az alábbi módszerek önmagukban, egymással kombinálva vagy adott esetben többször ismételve alkalmasak a fenti célra. 50 Alacsony pH-érték mellett etilacetáttal vagy n-butanollal történő extrakció, az oldószer-fázisból a vizes-fázisba történő visszaextrahálás magasabb pH-érték mellett; semleges pH-érték mellett metilénkloriddal vagy kloroformmal történő extrakció lipofil kvaterner ammónium55 só, mint például benzalkoniumklorid vagy tetra-n-butil-ammóniumhidrogénszulfát vagy valamely Crownvegyület, mint például NISSO Crown-éter diciklohexil-18-crown-6, NISSO Crown-éter 15-crown-5 (Nippon Soda Co., Ltd.) jelenlétében, majd az oldószer-fázisból 60 semleges vizes fázisba történő visszaextrahálás, mely réteg nátriumjodidot, káliumjodidot tartalmazhat; aktív szénén történő adszorpció, mint például Amberlite XAD (Rohm and Hadd Co.), Diaion HP—20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.), majd vizes metanol- vagy vizes 65 aceton-oldattal történő eluálás; ioncserélő gyantán tör-8179788 ténő adszorpció és eluálás, mint például Dowex 1x2 (Dow Cherriical Co.) vagy QAE-Sephadex A—25 (Pharmacia Fine Chemicals AB); gélszűrés Sephadex G—10-en (Pharmacia Fine Chemicals AB), Bio-Gel P—2-n (Bio-Rad Laboratories), Bio-Beads S—X3-on (Bio-Rad Laboratories) oszlop- vagy vékonyréteg-kromatográfia cellulózon, Avicel SF-n (Atnerican Viscose Corp.), DEAE-Cellulose-on, Whatman DE—32-n (Whatman Ltd.), DEAE—Sephadex A—25-on (Pharmacia Fine Chemicals AB), szilikagélen, alumíniumoxidon acetonnal történő kicsapás.
A A PS—7 antibiotikumnak a hozzá hasonló vegyületektől — melyeknek a kénatomhoz kapcsolódó oldallánca telített szénlánc, mint például a PS—5 és PS—6 antibiotikumok, és melyek együtt gyűlnek össze — történő • elválasztása előnyösen az alábbi módszerrel hajtható végre. A telített szénlánccal rendelkező analóg vegyületeket általában anioncserélő gyanta-kromatográfiával választjuk el, melynek során az aktív komponens adszorbeálódik a polisztirol típusú anioncserélő gyantán, mint például Dowex 1 x 2 (Dow Chemicals Co.), Duolite A—101 (Chemical Process Co.), Amberlite 400 (Rohm and Haas Co.) vagy Diaion PA 306 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) és az analóg vegyületeket valamely szervetlen só vizes oldatával eluáljuk, majd a PS—7 antibiotikumot poláros oldószerrel, mint például metanol vagy aceton, eluáljuk (koncentráció 1—80%, előnyösen 10—75%), mely 0,1—10%, előnyösen 1—5% szervetlen sót, mint például nátriumkloridot, káliumklorid vagy nátriumbromid, tartalmaz.
A tenyésztési feltételektől függően a fermentációs talajban egyidejűleg keletkezhet az (V) képletű vegyület is, melyet PS—4 antibiotikumnak neveztünk. Amennyiben a PS—4 és PS—7 antibiotikumok egyidejűleg keletkeznek, ezek is elválaszthatók a fent leírt módszerek egyikével, azok kombinációinak alkalmazásával, vagy azok ismétlésével. Különösen előnyös az alábbi módszer alkalmazása. A PS—4 és PS—7 antibiotikumokat tartalmazó oldatot valamely adszorbens gyantán adszorbeáljuk, mint például Diaion HP—20AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) és az antibiotikumokat valamely 0—50%, előnyösen 0—10% gradiensű poláros oldószer, mint például aceton vizes oldatával eluáljuk.
A PS—6 és/vagy PS—7 antibiotikumnak az izolálás közbeni viselkedését megállapíthatjuk, ha elvégezzük ezeknek az antibiotikumoknak biovizsgálatát és bioautográfiáját.
így a fentiek alapján kinyerhetjük a megadott tulajdonságokkal rendelkező PS—6 és/vagy PS—7 antibio. tikumot. Mivel a PS—6 és PS—7 antibiotikumok bizonyos mértékig labilisak, így az izolálást nagy gonddal kell elvégezni.
Mivel a PS—6 cs PS—7 antibiotikumok sóik alakjában sokkal stabilabbak, mint a szabad savak formájában, ezért gyógyászati alkalmazás céljára, valamint abban az esetben, ha ezeket az antibiotikumokat további szintézis céljára használjuk fel, vagy ha a fenti tisztítási folyamatokat akarjuk elvégezni, akkor előnyösen a sókat alkalmazzuk.
Ezek a sók lehetnek például alkálifém-sók, mint nátrium-, kálium- vagy lítium-só; alkáliföldfém-sók, mint kalcium- vagy magnézium-sók; egyéb fém-sók, mint alumínium-só; amtnóniurrt-sók; primer, szekunder vagy tercier aminokkal képzett sók, mint monoetilaminnal, dietilaminnal, trietilaminnal, monoetanolaminnal vagy dietanolaminnal képzett sók; valamint szerves bázisokkal, mint benzatinnal vagy prokainnal képzett sók. A sók közül a gyógyászati szempontból megfelelő sók alkalmasak. Különösen alkalmasak az alkálifém-sók, mint a nátrium- és kálium-sók.
Mint már említettük a találmány szerinti PS—6 és PS—7 antibiotikumok egybázisú savak, melyek egy karboxil-csoporttal rendelkeznek. Alkoholokkal, merkaptánokkal vagy ezek származékaival az ismert antibiotikumokhoz, mint klavulánsav vagy tienamycin, hasonlóan előállíthatok a különböző észterek. A találmány magában foglalja ezeknek az észtereknek az előállítását is.
Ezeket az észtereket a (II) általános képlettel jellemezhetjük — ahol a képletben
R31 jelentése kisszénatomszámú alkil-csoport vagy trifenilmetil-csoport és
R| és R2 jelentése a fenti—.
A kisszénatomszámú alkil-csoport lehet egyenes vagy elágazó szénláncú, különösen 6 vagy annál kisebb szénatomszámú, de leginkább 1—4 szénatomszámú. Ezek példáiként a következőket soroljuk fel: metil-, etil-, η-propil-, i-propil-, η-butil-, i-butil-, η-pentil-, i-pentilés n-hexil-csoport.
A (II) általános képletű észtereket — ahol Rp R2 és R3 jelentése a fenti — az (I) általános képletű vegyületekből — ahol Rp R2 és R3 jelentése a fenti — (azaz a PS—6 vagy PS—7 antibiotikumból) vagy ezeknek sójából állíthatjuk elő a (III) általános képletű vegyülettel, ahol a képletben R31 jelentése a fenti és
Y jelentése valamely lehasítható atom vagy csoport.
A (II) általános képletű észtereket — ahol R(, R2 és R3 jelentése a fenti — előállíthatjuk az (I) általános képletű vegyületekből — ahol Rj, R2 és R3 jelentése a fenti — vagy ezek sóiból valamely kisszénatomszámú diazoalkánnal is.
A (III) általános képletű vegyületben Y jelentésében a lehasadásra képes atom vagy csoport, bármely olyan atom vagy csoport lehet, mely lehasad, ha a PS—6 vagy PS—7 antibiotikumokat a (III) általános képletű vegyületekkel reagáltatjuk, mint például klór-, bróm-, jódatom, hidroxil-, tiol-, szulfoniloxi-, —COH-csoport, reakcióképes karboniloxi-csoport, mint —O—CO— —CFj-csoport. Különösen előnyösek a halogénatomok.
A (III) általános képletű vegyületek példáiként a következőket soroljuk fel:
Metilalkohol, metiljodid, dimetilszulfonát, metilmerkaptán, etanol, etilbromid, etiljodid, etilmerkaptán, n-propilklorid, n-propiljodid, propilalkohol, i-propilalkohol, i-prop;lbromid, i-propiljodid, n-butilalkohol, n-butilbromid, n-butiljodid, n-pentilalkohol, n-pentilklorid, n-pentilbromid, n-pentiljodid, n-hexilalkohol, n-hexilbromid, n-hexiljodid, tritilalkohol, tritilmerkaptán, tritilklorid és tritilbromid.
A kisszénatomszámú diazoalkánok példájaként a diazometánt említjük meg.
A PS—6 vagy PS—7 antibiotikumoknak a (III) általános képletű vegyülettel — ahol R31 és Y jelentése a fenti — vagy a kisszénatomszámú diazoalkánnal végbemenő reakcióját az észterezés valamely ismert módszerével hajthatjuk végre. A reakciót lefolytathatjuk külön reakcióközeg alkalmazása nélkül is, bár általában inért folyadékban hajtjuk végre. Az inért folyadék lehet szénhidrogén, mint benzol, toluol, n-hexán vagy ciklohexán,
-9179788 halogénezett szénhidrogén, mint kloroform vagy metilénklorid; amidok, mint dimetilformamid vagy hexametilfoszforsavtriamid; dimetilszulfoxid; éterek, mint dietiléter, diizopropiléter, di-n-butiléter, tetrahidrofurán vagy dioxán; észterek, mint etilacetát, n-butilacetát; ketonok, mint aceton vagy metiletilketon. Ezeket az oldószereket alkalmazhatjuk önmagukban vagy egymással kombinálva.
A reakció hőmérsékleten nem kritikus, a (III) általános képletű vegyület — ahol R,, R2 és R3 jelentése a fenti —, illetve a diazoalkán, valamint az oldószer minőségétől függően változhat. A reakciót azon a hőmérsékleten kell végrehajtani, melyen a PS—6 vagy PS—7 antibiotikum még szemmelláthatóan nem bomlik. Ez a hőmérséklet általában nem magasabb 60 °C-nál, és előnyösen 0—40 °C, legelőnyösebben 5 °C-kal alacsonyabb vagy magasabb a szobahőmérsékletnél. Amennyiben szükséges, adhatunk a reakcióelegyhez promotort, mint trimetilamin, trietilamin, piridin vagy diciklohexilkarbodiimid.
A fenti feltételek mellett a reakció 1—24 órán, általában 3—12 órán belül befejeződik.
A (III) általános képletű vegyülettel — ahol Rb R2 és R3 jelentése a fenti —, illetve a kisszénatomszámú diazoalkánnal reagáló PS—6 vagy PS—7 antibiotikumot nem szükséges feltétlenül izolálni, reakcióba vihetjük a PS—6 vagy PS—7 antibiotikumok termelésére képes törzs tenyésztési táptalaját, vagy a mikrobasejteknek a tenyésztési táptalajtól történő elválasztása után visszamaradó táptalaj szűrletet is. Szintén alkalmazható az előzőekben megadott tisztítási módszerekkel részben tisztított nyers PS—6 vagy PS—7 antibiotikum. Részben tisztított termék például az aktív szénről — mellyel a szűrt táptalajt kezeltük — kapott koncentrált eluátum; a szűrt táptalajnak Diaion HP—20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.)-szal történő kezelése után a Diaion HP—20-ról nyert koncentrált eluátum; valamely eluátumnak aktív szénnel sómentesített koncentrátuma, melyet úgy kapunk, hogy a Diaion HP—20-ról kapott koncentrált eluátumot QAE-Sephadex-en (Pharmacia Fine Chemicals) adszorbeáljuk, majd erről nátriumkloridot tartalmazó foszfát-pufferban végzett gradiens-koncentrációval végezzük az eluálást; metilénkloriddal benzalkóniumklorid jelenlétében kapott koncentrált extraktum; kloroformmal Crown-vegyületek jelenlétében kapott koncentrált extraktum; butanollal 3,5 pH-értékű közegben alacsony hőmérsékleten kapott koncentrált extraktum.
A kapott PS —6 vagy PS—7 antibiotikumot a reakcióelegyből önmagukban ismert módszerekkel izolálhatjuk. A reakció befejeződése után például vizes közegbe öntjük, hogy a vízoldható melléktermékeket eltávolítsuk. Előnyös vizes közegként semleges puffer alkalmazása, hogy a pH érték semleges maradjon. Ebből az elegyből azután valamely kevéssé poláros szerves oldószerrel extraháljuk a PS—6 vagy PS—7 antibiotikum észtereit. A poláros szerves oldószer vízzel nem elegyedő, mint például etilacetát, benzol vagy kloroform. Adagolhatunk az elegyhez valamilyen sót, például nátriumkloridot vagy ammóniumszulfátot, hogy az extrakciót a kisózó hatás révén elősegítsük.
Vízmentes nátriumszulfáton történő szárítás után az észter az oldószeres fázisból önmagában ismert módszerrel izolálható. Ilyen módszer például a gél-szűrés Bio-Beads S—X3 (Bio-Rad Laboratories), vagy Sepha10 dex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals) alkalmazásával; vagy az adszorpciós kromatográfia, melynek során hordozóként szílikagélt, alúmíniumoxidot vagy Florisil-t (Floridin Co.) használhatunk. Ezeket a módszereket alkalmazhatjuk megfelelő kombinációban vagy többször ismételve.
Az így kapott észtert valamely oldószerből, mint például benzol, toluol, xilol, etilacetát, dietiléter, metilénklorid, kloroform, hexán és petroléter, történő átkristályosítással tisztítjuk. Ezeket az oldószereket alkalmazhatjuk önmagukban vagy egymással kombinálva. Az alkalmazott petroléter forráspontja 30—60 °C.
A fenti módszerrel előállított észterek közül elsősorban a PS—6 vagy PS—7 antibiotikum (Ila) általános képletű tritilészterét — ahol a képletben R, és R2 jelentése a fenti — használjuk. Ezek az észterek sokkal stabilabbak, mint az (I) általános képletű PS—6 vagy PS—7 antibiotikum — ahol a képletben Rx, R2 és R3 jelentése a fenti — ennek következtében könnyebben izolálhatok. Az észtereknek szintén erős baktériumellenes és β-laktamáz gátló hatásuk van, míg például a penicillin tritilésztere nem rendelkezik baktériumellenes hatással. Ez valószínűleg annak tulajdonítható, hogy a PS—6 vagy PS—7 antibiotikum tritilészteréből a vizsgálati közegben vagy in vivő a tritil-csoport könnyen lehasítható. A (Ila) általános képletű tritilészter — ahol R| és R2 jelentése a fenti — fontos intermedier más gyógyászati szempontból alkalmas származék előállítására, mivel a tritil-csoport nagyon aktív és könnyen lehasítható.
A PS—6 és PS—7 antibiotikumok tritilésztereinek fizikai-kémiai és biológiai tulajdonságait az alábbiakban részletezzük.
I. PS—6 antibiotikum-tritilészter
A PS—6 antibiotikum-tritilészter fizikai-kémiai tulajdonságai
1. Ultraibolya (UV) abszorpciós spektrum >SOH=315,0 nm
2. Színreakciók
Ehrlich-reagens reakció pozitív
Jód-klórplatinasav reakció pozitív
Ninhidrin reakció negatív
3. Vékonyréteg-kromatográfia
Az alábbi lemezeken a felsorolt oldószerek alkalmazásával a következő Rf értékeket kapjuk: DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (E. Merek Co., Inc.) benzol/aceton (2/1) Rf=O,37 benzol/etilacetát (1/8) Rf=0,34
A PS—6 antibiotikum-tritilészter biológiai tulajdonságai
1. Mikrobaellenes hatásspektrum
A PS—6 antibiotikum-tritilészter szélesspektrumú mikrobaellenes hatással rendelkezik, erős hatású különböző baktériumokkal szemben, például a Staphylococ-10179788 cus, Diplococcus és Streptococcus nemzetségekbe tartozó Gram-pozitív és az Alcaligenes nemzetségbe tartozó Gram-negatív baktériumokkal szemben.
A PS—6 antibiotikum-tritilészter jó hatást mutat fel a Klebsiella és Proteus nemzetségekhez tartozó Gramnegatív baktériumokkal szemben is.
A PS—6 antibiotikum-tritilészter erős hatású olyan Gram-negatív baktériumokkal szemben is, melyek rezisztensek a β-laktám gyűrűt tartalmazó más antibiotikumokkal — például a Citrobacter, Proteus, Klebsiella és Serratia nemzetségekbe tartozó baktériumokkal — szemben.
2. In vivő hatás
A PS—6 antibiotikum-tritilészter patogérr Grampozitív baktériumokkal fertőzött egerek esetén terápiás hatást fejt ki.
3. Toxicitás
Egereknél 500 mg/kg mennyiségben intraperitoneálisan alkalmazva akut toxicitás nem jelentkezik.
II. PS—7 antibiotikum-tiritilészter
A PS—7 antibiotikum-tritilészter fizikai-kémiai tulajdonságai
1. Ultraibolya (UV) abszorpciós spektrum ^SS’°h=321,0 nm és λ^ΟΗ=230,5 nm
2. Színreakciók
Ehrlich-reagens reakció pozitív
Jód-klórplatinasav reakció pozitív Ninhidrin reakció negatív
3. Vékonyréteg-kromatográfia
Az alábbi lemezeken a felsorolt oldószerek alkalmazásával a következő Rf értékeket kapjuk:
DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254 (E. Merek Co., Inc.) benzol/aceton (2/1): Rf=0,51 benzol/etilacetát (1/8): Rf=0,67
A PS—7 antibiotikum-tritilészter biológiai tulajdonságai
1. Mikrobaellenes hatásspektrum
A PS—7 antibiotikum-tritilészter szélesspektrumú mikrobaellenes hatással rendelkezik, erős hatású különböző baktériumokkal szemben, például a Staphylococcus, Diplococcus és Streptococcus nemzetségekbe tartozó Gram-pozitív és az Alcaligenes nemzetségbe tartozó Gram-negatív baktériumokkal szemben.
A PS—7 antibiotikum-tritilészter jó hatást mutat fel a Klebsiella és Proteus nemzetségekhez tartozó Gramnegatív baktériumokkal szemben is.
A PS—7 antibiotikum-tritilészter erős hatású olyan Gram-negatív baktériumokkal szemben is, melyek rezisztensek a β-laktám gyűrűt tartalmazó más antibiotikumokkal — például a Citrobacter, Proteus, Klebsiella és Serratia nemzetségekbe tartozó baktériumokkal — szemben.
2. In vivő hatás ' ' ’
A PS—7 antibiotikum-tritilészter patogén Grampozitív baktériumokkal fertőzött egerek esetén terápiás hatást fejt ki.
3. Toxicitás
Egereknél 500 mg/kg mennyiségben intraperitoncálisan alkalmazva akut toxicitás nem jelentkezik,· _
A PS—6 és PS—7 antibiotikumok és ezek tritilészterei megfelelően erős mikrobaellenes hatással rendelkeznek és eredményesen alkalmazhatók baktériumok okozta fertőzések megelőzésére és terápiás kezelésére nemcsak embereknél, hanem emlősöknél, baromfiaknál és halaknál is.
A fenti antibiotikumok tritilészterei ezen kívül fontos intermedierek más gyógyászati készítmények előállításánál, mivel a tritil-csoport nagyon aktív és könnyen lehasad.
A PS—6 és PS—7 antibiotikumokat és ezek tritilésztereit orálisan, helyileg vagy parenterálisan (intravénásán, intramusculárisan, intraperitoneálisan) alkalmazhatjuk cs felhasználhatók az alkalmazás módjától függően bármelyik szokásos gyógyászati készítmény formájában. Elkészíthetők például valamely gyógyászati szempontból alkalmas hordozóanyaggal vagy hígítószerrel szilárd alakban (például tabletták, kapszulák, porok·, granulátumok, cukorral bevont tabletták, poraíakú spray-ek, kúpok), félszilárd alakban (például kenőcsök, krémek, félszilárd kapszulák), vagy folyékony formában (például oldatok, emulziók, szuszpenziók, szirupok, injekciós oldatok, spray-ek).
A szilárd, félszilárd vagy folyékony készítmények adagolási egységenként 0,1—99 súly%, előnyösen 10— 60 súly% hatóanyagot tartalmaznak.
A készítmények előállítását és az alkalmazható hordozó- és kötőanyagokat, valamint hígítószereket az alábbiakban részletezzük.
Az orálisan alkalmazásra kerülő tabletták és kapszulák tartalmazhatnak kötőanyagokat, mint például szirup, akác, zselatin, szorbit, tragakant vagy polivinilpirrolidon; egyéb kötőanyagokat, mint például laktóz, szacharóz, keményítő, kalciumfoszfát, szorbit vagy glicin; kenőanyagokat, mint például magnéziumsztearát, talkum, polietilénglikol vagy szilíciumoxid; diszintegránsokat, mint például burgonyakeményítő; nedvesítőszereket, mint például nátriumlaurilszulfát. A tablettákat általánosan ismert módszerekkel vonhatjuk be.
Az orálisan alkalmazásra kerülő folyékony készítmények olajos vagy vizes szuszpenziók, oldatok, emulziók, szirupok formájában állíthatók elő, elkészíthetők szilárd termékek alakjában is, melyeket azután vízzel vagy más alkalmas hordozóanyaggal keverünk össze. Az orálisan alkalmazásra kerülő folyékony készítmények gyógyászati szempontból megfelelő adalékanyagokat tartalmazhatnak, mint például szuszpendálószerek (például metilcellulóz, szorbit-szirup, cukor-szirup, hidro11
-11179788 xietilcellulóz, zselatin, karboximetilcellulóz, alumíniumsztearát-gél, hidrogénezett ehető zsírok és olajok); emulgeátorokat (például akác, lecitin, szorbitmonooleát), nem-vizes hordozóanyagokat (például etilalkohol, propilénglikol, olajos észterek, frakcionált kókuszdióolaj, mandulaolaj); tartósítószereket (például metil-p-hidroxibenzoát, propil-p-hidroxi-benzoát, szorbinsav).
A kúpok a szokásos adalékanyagokat, mint például kakaóvaj és különböző gliceridek, tartalmazhatják.
Az injekciós készítmények adagolási egységeit ampullák tartalmazhatják, nagyobb adagok esetén tartósítószert is adagolunk. Az injekciós készítmények lehetnek szuszpenziók, oldatok vagy emulziók olajos vagy vizes hordozóanyagban. Amennyiben szükséges adagolhatunk szuszpendálószereket, diszpergátorokat és stabilizálószereket. A találmány szerinti antibiotikumok előállíthatok poralakban is melyeket használat előtt pirogénmentes, steril vízzel keverünk össze.
A találmány szerinti PS—6 vagy PS—7 antibiotikumok és/vagy ezek tritilészterei elkészíthetők különböző, . az orr, torok és a légcső nyálkahártyája számára hozzáférhető alakban is. Ilyen célra megfelelőek például a poralakú vagy folyékony spray-ek, inhalálószerek, pasztillák, torokecsetelők. A fül és a szem kezelésére a találmány szerinti antibiotikumok folyékony vagy félfolyékony kapszulák, cseppek formájában készíthetők el.
Helyi alkalmazás esetén a találmány szerinti antibiotikumok hidrofil vagy hidrofób anyagokban alkalmazhatók, porok, oldatok, krémek vagy kenőcsök alakjában.
Amennyiben szükséges a fenti kompozíciók a hordozóanyagokon kívül más adalékanyagokat is, mint például tartósítószereket, antioxidánsokat, kenőanyagokat, folyósítóanyagokat, ízesítőanyagokat, szuszpendálószereket, kötőanyagokat és stabilizátorokat tartalmazhatnak.
•Ha a PS—6 vagy PS—7 antibiotikumot és/vagy ezek észtereit állatorvosi célra alkalmazzuk, például sertések, tehenek, birkák, csirkék fertőződése esetén, úgy hoszszanható vagy gyorsan felszabaduló intramammáris készítmények alakjában, mint például tápanyagkoncentrátumok, készíthetők el.
A fenti gyógyászati készítmények tartalmazhatják egyedüli hatóanyagként a találmány szerinti PS—6 vagy PS—7 antibiotikumot és/vagy ezek észtereit vagy tartalmazhatják ezeket más gyógyászati szempontból hatásos adalékanyagokkal kombinálva.
Mint már említettük, a találmány szerinti PS—6 vagy PS—7 antibiotikum és ezek tritilészterei β-laktám vegyületekkel kombinálva szinergetikus hatást fejtenek ki a különböző β-laktamáz termelő baktériumokkal szemben, és ezért előnyös ha azokat a gyógyászati készítményekben β-laktám vegyületekkel kombináljuk. A β-laktám vegyületek példáiként a következőket soroljuk fel: penicillin-származékok, mint benzilpenicillin, fenoximetilpenicillin, karbenicillin, ampicillin, amoxicillin; cefalosporin-származékok, mint cefaloridin, cefalotin, cefazolin, cefalexin, cefoxitin, cefacetril, cefamandol, cefapirin, cefradin és cefaloglicin.
A PS—6 vagy PS—7 antibiotikumnak vagy ezek trítilésztereinek a fent felsorolt β-laktám vegyületek egyikével vagy közülük többel történő kombinációja esetén a találmány szerinti antibiotikumoknak a β-laktám vegyülethez viszonyított aránya nem kritikus és széles határok között változhat. Gyakorlati szempontból cél12 szerű a következő mennyiségi arány betartása: találmány szerinti antibiotikum: ismert β-laktám vegyület= =20: 1 és 1 : 150 között, előnyösen 10 : 1 és 1 : 100 között.
Emberek baktériumokkal történő fertőződése esetén a PS—6 vagy PS—7 antibiotikum vagy ezek tritilésztereinek adagolása a kezelt egyéntől függően változik. A következő szempontokat figyelembe venni: testsúly, a fertőzés fajtája, erőssége és tünetei, az adagolás módja és száma. Orális vagy parenterális alkalmazás esetén a napi adag általában 0,05 mg/kg és 500 mg/kg közötti, előnyösen 0,5 mg/kg és 200 mg/kg közötti, és ezt több részletben adagoljuk. A fenti határokon belüli adagot az orvos a kezelt beteg egyéniségének megfelelően ki tudja választani.
Állatok kezelésénél a PS—6 vagy PS—-7 antibiotikum vagy ezek tritilészterei a szokásos gyógyászati készítmények alakjában adagolhatok, vagy hozzáadhatok közvetlenül a tápanyaghoz. Ezen túlmenően alkalmazhatók tápanyagok tartósítására és fertőtlenítésére.
A kiviteli példákban megadott kvantitatív és kvalitatív mikrobaellenes hatást az alábbi vizsgálatok alapján végezzük.
1. A mikrobaellenes hatás biovizsgálata
Tápanyagot tartalmazó ferde agaron egy éjszakán át tenyésztett Comamonas terrigena B—996 tenyészetet tápanyagot tartalmazó táptalajban szuszpendálunk és így kapjuk a 610 nm-nél 0,040 optikai sejtsűrűséget mutató oltótenyészetet. Az oltószuszpenziót 1% mennyiségben hozzáadjuk 0,8% Kyokuto Nutrient Broth Powder-t (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) és 1,0% Bacto-Agar-t (Difco Laboratories) tartalmazó megolvasztott agar táptalajhoz. A beoltott, megolvasztott agar táptalajt 7 ml-enként Petri-csészékbe (9 cm átmérőjű) osztjuk szét és megszilárdítjuk. Az így kapott lemezt nevezzük Comamonas vizsgálati lemeznek.
Staphylococcus aureus FDA 209P-t egy éjszakán keresztül rázás közben tápanyagot tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd tápanyagot tartalmazó táptalajban 50-szeresre hígítjuk és így kapjuk az oltószuszpenziót. Az 1% Kyokuto Nutrient Broth Powder-t (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) és 1% Bacto-Agar-t (Difco Laboratories) tartalmazó megolvasztott agar táptalajt a fenti szuszpenzió 1%-nyi (térfogat/térfogat) mennyiségével oltjuk be. A beoltott, megolvasztott agar táptalajt 7 ml-enként Petri-csészékbe (9 cm átmérőjű) öntjük és megszilárdítjuk. Az így kapott lemezt nevezzük Staphylococcus vizsgálati lemeznek.
A fentiekhez hasonlóan Alcaligenes vizsgálati lemezt is készítünk. Az Alcaligenes faecalis B—326 egy éjszakán át tápanyagot tartalmazó ferde agaron tenyésztett tenyészetét tápanyagot tartalmazó táptalajban szuszpendáljuk és így kapjuk az oltószuszpenziót. Az oltószuszpenzió sejtkoncentrációját 610 nm-nél 0,020 optikai sűrűségre állítjuk be. 0,5% Kyokuto Nutrient Broth Powder-t (Kyokuto Pharmaceutical Industries Co.) és 1,0% Bacto Agar-t (Difco Laboratories) tartalmazó agar táptalajt megolvasztunk és beoltjuk a fenti szuszpenzió 1%-nyi mennyiségével, majd 7 ml-enként szétosztjuk Petri-csészékbe és hagyjuk megszilárdulni. Az így kapott lemezt Alcaligenes vizsgálati lemeznek nevezzük.
mm átmérőjű cellulózlemezt átitatunk a vizsgálandó minta oldatával, tiszta szűrőpapírra helyezzük annyi
-12179788 időre, hogy az oldat feleslegét eltávolítsuk, majd vizsgálati lemezre helyezzük és 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül inkubáljuk. Mérjük a gátló zóna átmérőjét és összehasonlítjuk a standard cefaloridin-oldat esetén kapott értékkel. A PS—6 és a többi antibiotikum mikrobaellenes hatását cefaloridin ekvivalens egység/mlben fejezzük ki.
Közelebbről, az a PS—6 vagy más találmány szerinti antibiotikum-oldat, mely ugyanolyan késleltető zónát mutat, mint 100 μg/ml cefaloridin, megfelel 100 cefaloridin egység/ml értéknek. Ugyanígy, ha a PS—6 vagy más találmány szerinti szilárd antibiotikum minta 1 mg/ml koncentrációban ugyanolyan átmérővel rendelkezik, mint 1 μg/ml cefaloridin, a szilárd minta fajlagos hatása 1 cefaloridin egység/mg értékkel jellemezhető. Átlagos képzettségű szakember előtt ismeretes, hogy a standard görbe a vizsgált mikroorganizmus fajtától függően bizonyos mértékben változhat. A vizsgált mikrobák fajtáinak jelölésére a következő kifejezéseket vezetjük be: Comamonas-cefaloridin egység (rövidítése CCU), Staphylococcus-cefaloridin egység (rövidítése SCU), Alcaligenes-cefaloridin egység (rövidítése ACU).
2. Bioautográfia
Az 1. pontban leírtakkal analóg módon nagyméretű vizsgálati lemezt készítünk, azzal az eltéréssel, hogy 100 ml beoltott, megolvasztott agar táptalajt 9 cm átmérőjű Petri-csésze helyett 32 x 24 cm-es téglalap alakú edénybe öntünk.
A vizsgálandó papírkromatogramot 15 percre a fent leírt nagyméretű vizsgálati lemezre helyezzük. A papír eltávolítása után a vizsgálati lemezt 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül inkubáljuk és így gátló zónát kapunk. Ebből nemcsak az Rf értékek (kvalitatív vizsgálat) számíthatók, hanem meghatározható a mikrobaellenes hatás (fél-kvantitatív vizsgálat) is.
Vékonyréteg-kromatográfiás lemez használata esetén a vékonyréteg-kromatográfiás lemez és a vizsgálati lemez felülete közé vékony papírt helyezünk. A fentiekhez hasonlóan végezzük a kvalitatív és fél-kvantitatív vizsgálatot.
1. példa
500 ml-es Erlenmeyer lombikot, mely az alábbi oltótenyészet táptalajt tartalmazza (SE—4) 120 °C hőmérsékleten 15 percen keresztül sterilizálunk. Jól szaporodó Streptomyces sp. A271 ferde tenyészethez hozzáöntünk 10 ml 0,02%-os Tween—80 (felületaktív anyag, Trademark of Atlas Powder Corp.) oldatot és enyhén keverjük, így spóraszuszpenziót kapunk. Ennek a spóra szuszpenziónak 1 ml-ét beleoltjuk az 500 ml-es Erlenmeyer lombikba és forgórendszerű rázógépen (200 ford/perc, a kör sugara 3,5 cm) rázás közben 28 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül tenyésztjük. Ezután az oltótenyészet 2 ml-ét beleoltjuk egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikba, mely az alább felsorolt termelési táptalajokat tartalmazza és forgórendszerű rázógépen rázás közben 28 C hőmérsékleten 48—96 órán keresztül tenyésztjük.
Bizonyos időközönként minden edényben levő tenyésztési táptalajból kis mennyiségű mintát veszünk. A mintákból extraháljuk az aktív komponenseket és koncentráljuk. A PS—6 és PS—7 antibiotikumok jelenlétét papírkromatográfiával és bioautográfiával mutatjuk ki, az alább leírt módon.
Oltó tenyészet táptalaj (SE—4)
Marhahús extraktum (Difco Laboratories)
Bacto-tryptone (Difco Laboratories) Glükóz
Oldható keményítő
Élesztő extraktum Kalcium-karbonát Zsírtalanított szójababliszt a sterilitás előtt a pH=7,5
0,3% (súly/tér fogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,1% (súly/térfogat)
2,4% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,4% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
Termelési táptalaj (1) AG—1 táptalaj Glükóz Kukoricakeményítő Kukoricafőzet Száraz élesztő
D,L-metionin Kobaltklorid a sterilitás előtt a pH= (2) AGA—2 táptalaj Glükóz
Burgonyakeményítő Kukoricafőzet Száraz élesztő Kobaltklorid a sterilizálás előtt a pH= (3) AGB-táptalaj Maltóz Kukoricafőzet Száraz élesztő Kobaltklorid a sterilizálás előtt a pH= (4) AGB—41 táptalaj Maltóz
Oldható keményítő Glicerin
Száraz élesztő Nátriumklorid Kálium-hidrogénfoszfát Magnézium-szulfát Kalcium-karbonát
Kobaltklorid a sterilizálás előtt a pH= (5) ML—19 táptalaj Glicerin
Pepton
Glükóz Burgonyakeményítő Zsírtalanított szójababliszt
Száraz élesztő
Nátriumklorid Kalcium-karbonát a sterilizálás előtt a pH= (6) AGO—1 táptalaj Szójabab olaj
Száraz élesztő
1,5% (súly/térfogat)
2,5% (súly/térfogat)
2,0% (súly/térfogat)
1,0% (súly/térfogat)
0,1% (súly/térfogat) 0,00013% (súly/térfogat) ,2
1,5% (súly/térfogat)
2,5% (súly/térfogat)
2,0% (súly/térfogat)
1,0% (súly/térfogat) 0,00013% (súly/térfogat) 6,5
3,0% (súly/térfogat)
1,0% (súly/térfogat)
1,0% (súly/térfogat) 0,0001 (súly/térfogat) 6,5
5,0% (súly/térfogat)
1,0% (súly/térfogat)
0,3% (súly/térfogat)
2,5% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
0,3% (súly/térfogat) 0,00013% (súly/térfogat) 7,0
4,0% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,2% (súly/térfogat)
0,2% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,2% (súly/térfogat)
6,4
3,0% (súly/térfogat)
2,0% (súly/térfogat)
-13179788
0,5% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
0,3% (súly/térfogat)
0,00013% (súly/térfogat) a sterilizálás előtt a pH=7,0
A PS—6 antibiotikum kimutatása
Nátriumklorid
Kálium-hidrogénfoszfát
Magnéziumszulfát Kalcium-karbonát Kobaltklorid
1,5 ml Diaion HP—20-t (ioncserélő, Mitsubishi Chemical Industries Co.) tartalmazó mini-oszlopon eluáljuk a centrifugálást tenyésztési táptalaj felülúszójának 10 ml-ét. Az aktív komponensek abszorpciója után az elúciót vizes aceton-oldattal (50%-os, térfogat/térfogat) végezzük. Az első 0,5 ml eluátumot félretesszük és az ezt követő 2 ml eluátumot összegyűjtjük. Az eluátumot koncentráljuk, majd a koncentrált eluátum 20 μΐnyi mennyiségével szűrőpapíton (Toyo Roshi No. 50, Toyo Roshi Kaisha) leszálló papírkromatográfiás vizsgálatot végzünk. A kromatogramot 5 °C hőmérsékleten 7—20 órán keresztül fejlesztjük ki különböző oldószerekben. A kromatogram kifejlesztése után a még nedves szűrőpapírt különböző mikroorganizmusokat tartalmazó bioautográfiai vizsgálati lemezre tesszük 15—30 percre. A szűrőpapírt ezután elvesszük és a vizsgálati lemezen történő tenyésztést 30 °C hőmérsékleten mintegy 18 órán keresztül végezzük. A PS—6 antibiotikumot tartalmazó minta a PS—6 antibiotikumnak megfelelő Rf értéknél ad gátló zónát. Ezzel a módszerrel a PS—6 antibiotikum a fenti 6 táptalaj tenyésztési táptalajában kimutatható.
A PS 7 antibiotikum kimutatása
1,5 ml Diaion PA—306-t (Mitsubishi Chemical Industries Co.) tartalmazó mini-oszlopra felvisszük a tenyésztési táptalaj centrifugálása után kapott felülúszó 10 ml-ét. Az oszlopot 0,5 ml 5%-os (súly/térfogat) nátriumklorid-oldattal mossuk, majd 50%-os (súly/térfogat), 3% (súly/térfogat) nátriumkloridot tartalmazó metanolos oldattal eluáljuk. Az eluátum első 1,0 ml-ét félretesszük és az ezt követő 5,0 ml eluátumot összegyűjtjük. Az eluátumot a metanolnak csökkentett nyomáson történő eltávolítása után 1,5 ml Diaion HP—20-t (Mitsubishi Chemical Industries Co.) tartalmazó minioszlopra visszük. A gyantán adszorbeálódott aktív komponenst 50%-os (térfoga t/térfogat) aceton-oldattal eluáljuk. Az első 0,5 ml eluátumot félretesszük és az ezt követő 2,0 ml eluátumot összegyűjtjük. Az eluátumot koncentráljuk és a kapott koncentrátum 20 μΙ-ét rávisszük Toyo Filter Paper No. 50-re (Toyo Roshi Co.). A leszálló papírkromatográfiás vizsgálatot különböző oldószerekkel végezzük 5 °C hőmérsékleten 7—20 órán keresztül. A kromatogram kifejlesztése után a félig száraz kromatogramot 15—20 percig különböző mikroorganizmusokat tartalmazó bioautográfiai vizsgálati lemez agar-felületével hozzuk érintkezésbe. A vizsgálati lemezeket 35 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül inkubáljuk. A PS—7 antibiotikumot tartalmazó minta gátló zónája a PS—7 antibiotikum Rf értékének megfelelő helyen fejlődik ki.
A fentiek szerint elvégzett vizsgálat alapján mind a négyféle táptalaj alkalmazása esetén kimutatható a táptalajszűrletben PS—7 antibiotikum. Az összegyűlt antibiotikum mennyisége a táptalajtól függően különböző.
2. példa
A Streptomyces sp. A271 törzset az 1. példában leírtakkal analóg módon tenyésztjük, azzal az eltéréssel, 5 hogy az alább megadott összetételű AGB—42 táptalajt használjuk. A tenyésztés megkezdése előtt vagy 24 órával utána, hozzáadunk a táptalajhoz 0,2% DL-valint vagy L-valint. A tenyészetet 72 órán keresztül rázzuk. Az összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége négy10 szerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk valint.
AGB—42 táptalaj összetétele
Maltóz
Oldható keményítő Glicerin
Száraz élesztő Nátriumklorid
Kálium-hidrogénfoszfát Magnézium-szulfát Kalcium-karbonát Kobaltklorid
3. példa
5,0% (súly/térfogat)
1,0% (súly/térfogat)
0,3% (súly/térfogat)
3,0% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
0,3% (súly/térfogat) 0,00013% (súly/térfogat)
A Streptomyces sp. A271 törzset az 1. példában leírtakkal analóg módon tenyésztjük, azzal az eltéréssel, 30 hogy a fenti összetételű ML—19 táptalajt használjuk.
A tenyésztés megkezdése előtt vagy 24 órával utána, hozzáadunk a táptalajhoz 0,2% DL-valint vagy L-valint. A tenyészetet 72 órán keresztül rázzuk. A táptalajban összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége négysze35 rese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk valint.
4. példa
A Streptomyces sp. A271 törzs tenyésztését a 3. példában leírtakkal analóg módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy DL- vagy L-valin helyett DL- vagy L-leucint adunk a táptalajhoz. A tenyészetet 72 órán keresz45 tűi rázzuk. Az összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége kétszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk leucint.
5. példa
A Streptomyces sp. A271 törzs tenyésztését az 1. példában leírtakkal analóg módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy az alábbi összetételű AGB—3 táptalajt 55 használjuk. A tenyésztés előtt 0,1% L-valint és 0,3% L-leucint adunk a táptalajhoz. A tenyészetet 72 órán keresztül rázzuk. A táptalajban jelentős mennyiségű PS—6 antibiotikum gyűlik össze.
Az AGB—3 táptalaj összetétele
Maltóz
Száraz élesztő
Nátriumklorid
Kálium-hidrogénfoszfát
3,0% (súly/térfogat)
2,0% (súly/térfogat)
0,5% (súly/térfogat)
0,05% (súly/térfogat)
-14179788
Magnézium-szulfát 0,05% (súly/térfogat)
Kalcium-karbonát 0,3% (súly/térfogat)
Kobaltklorid 0,00013% (súly/térfogat) a sterilizálás előtt a pH=7,0
6. példa
A 2. példában leírtakkal analóg módon végezzük a tenyésztést, azzal az eltéréssel, hogy DL- vagy L-valin helyett n-valeriánsavat adunk a táptalajhoz. A tenyészetet 72 órán keresztül rázzuk. A táptalajban összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége négyszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk n-valeriánsavat.
7. példa
A tenyésztést a 3. példában leírtakkal analóg módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy DL- vagy L-valin helyett n-valeriánsavat adunk a táptalajhoz. Az összegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége kétszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk n-valeriánsavat.
8. példa
A tenyésztést az 5. példában leírtakkal analóg módon végezzük, azzal az eltéréssel, hogy L-valin helyett n-valeriánsavat adunk a táptalajhoz. A táptalajban öszszegyűlt PS—6 antibiotikum mennyisége négyszerese annak a mennyiségnek, mely akkor gyűlik össze, ha a táptalajhoz nem adunk n-valeriánsavat. 35
9. példa
Az 1. példában leírtak szerint készített oltótenyészet 0,01 ml-ét 15 1 fent említett összetételű SE—4 táptalajt tartalmazó 301-es fermentátorba töltjük. Kényszer levegőátfúvatás közben 28 °C hőmérsékleten, 24 órán keresztül, 200 ford/perc fordulatszám mellett végezzük a tenyésztést. A steril levegőt 7,5 1/perc sebességgel táplál- 45 juk be. 200 1 űrtartalmú rozsdamentes fermentátorban 100 I, fenti összetételű AGB—42 táptalajba (a beoltás előtt 0,5% L-valint adunk a táptalajhoz) beoltjuk az így kapott táptalajt, és kényszer levegőátfúvatás közben 28 °C hőmérsékleten, 72 órán keresztül, 100 ford/perc fordulatszám mellett végezzük a tenyésztést. A táptalajból centrifugált felülúszó antibiotikus hatása 450 CCU/ml. A táptalajhoz a szűrés megkönnyítése céljából hozzáadunk 3%-os (súly/térfogat) perlit-oldatot Topco Perlite, Topco No. 34, Toko Perlite Kogyo K. K.) és szűrőprésen szűrjük. így 60 1 szűrletet kapunk (összes antibiotikus hatása 25,5 x 106 CCU).
Az alábbi műveleteket 6 °C hőmérséklet alatt végezzük. A szűrletet 6 1 Diaion PA—306 ioncserélő gyantát (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) tartalmazó oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot 20 1 5%-os (súly/térfogat) nátriumklorid-oldattal eluáljuk és így a PS—5 és PS—6 antibiotikumokat tartalmazó (A) aktív frakciót kapjuk (összes antibiotikus hatás 4,2 x 106 CCU). Erről az oszlopról izoláljuk később a PS—7 antibiotikumot.
Az (A) aktív frakciót rávisszük Diaion HP—20 gyanta (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) (3 x70 cm) oszlopra és 10%-os vizes aceton-oldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson az aceton ledesztillálásáig bepároijuk és előzőleg 1/100 foszfát-pufferral 8,0 pH értékre beállított QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals Co.) (2,4 x 22 cm) oszlopon vezetjük át, majd lineáris nátriumklorid koncentráció gradiensű 1 és 0,4 M közötti nátriumkloridot tartalmazó M/100 foszfát-puffer-oldat10 tál eluáljuk és az eluátumot 10 g-os frakciókban összegyűjíjük. Az összegyűjtött frakciókat 100-szorosra hígítjuk, majd az ultraibolya abszorpciós spektrum vizsgálata és a biovizsgálat elvégzése után az aktív frakciókat összegyűjtjük. Az aktív frakciót a PS—5 antibiotikum 15 el távolítása, céljából Daioin HP—20 AG (1,2x40 cm) oszlopra visszük és 300 ml, lineáris metanol koncentráció gradiensű 10 és 75% közötti koncentrációjú vizes metanol-oldattal eluáljuk. A frakciók súlya 4 g. Minden frakcióval leszálló papírkromatográfiás vizsgá20 latot végzünk [a kromatogramőt a következő oldószerelegy'oen fejlesztjük ki: 120 ml acetonitril, 30 ml 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid puffer (pH=7,5) és 1 ml 1/10 M vizes etiléndiamintetraecétsav-nátriumsó-oldat (pH=7,5)J és elvégezzük a 25 bioautográfiai vizsgálatot. A No. 25—30, PS—5 antibiotikumot és a No. 33—40, PS—6 antibiotikumot tartalmazó aktív frakciókat összegyűjtjük. A PS—6 antibiotikumot tartalmazó aktív frakciót a metanol ledesztillálásával koncentráljuk, majd fagyasztva szárít30 juk. Az így kapott liofilizált készítményt feloldjuk 1 ml
M/100 foszfát-puffer-oldatban (pH=8,0), majd Sephadex G—10 (Pharmacia Fine Chemicals Co.) oszlopon (1,2x80 cm) vezetjük át tisztítás céljából és a kromatogramot ugyanezzel a pufferral fejlesztjük ki. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és híg vizes nátriumhidroxid-oldattal a pH-t 8,3 értékre állítjuk be, majd a frakciókat Diaion PH—20 gyanta (Mitsubishi Chemicals Industries Ltd.) oszlopra (1,2x20 cm) visszük. Az elúciót kisózás céljából 10%-os vizes aceton-oldattal végez40 zük. Az aktív frakciót összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk, így 2,4 mg fehér liofilizált készítményt kapunk, mely a PS—6 antibiotikum nátrium-sója. A nátriumklorid-oldattal eluált Diaion PA—-306 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopot, melyet a PS—7 antibiotikum izolálása céljából tettünk félre, 50%-os (térfogat/térfogat), 3% (súly/térfogat) nátriumkloridot tartalmazó vizes metanol-oldattal eluáljuk, így kapjuk a (B) aktív frakciót (összes mikrobaellenes hatása 1,1 x x 106 CCU, 4,3%-os kitermelés).
A (B) aktív frakció eluátuinát a metanol eltávolítása céljából csökkentett nyomáson bepároljuk, majd Diaion HP—20 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopon (3 cm 0 x 70 cm) adszorbeáljuk és 10%-os (térfogat/térfogat) vizes aceton-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 55 25 g-os adagokra osztjuk.
Az aktív frakciókat egyesítjük és az aceton eltávolítása céljából csökkentett nyomáson bepároljuk. Akoncentrátumot előzőleg M/1000 foszfát-pufferrel 8,0 pH értékre beállított QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals 60 AB) oszlopon (2,5 cm 0 x 30 cm) adszorbeáljuk és lineáris nátriumklorid koncentráció gradiensű 0,1 és 0,7 M közötti nátriumkloridot tartalmazó M/100 foszfát-pufferral eluáljuk. Az eluátumot 17 g-os frakciókra osztjuk. Minden frakciót biovizsgálatnak és papírkromatográ65 fiás vizsgálatnak vetünk alá, melyet bioautográfiai vizs15
-15179788 gálát követ. A No. 25—33 frakciókat összegyűjtjük, ezek tartalmazzák a PS—7 antibiotikumot.
A fenti aktív frakciót Diaion HP—20 AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopon (1,1 cm 0 x x20 cm) adszorbeáljuk, majd 400 ml, lineáris gradiensű 0 és 10% közötti koncentrációjú aceton oldattal eluáljuk. Az eluátumot 5 g-os frakciókra osztjuk. Minden frakciót 50-szeresére hígítunk és elvégezzük az ultraibolya abszorpciós spektrum vizsgálatát. A PS—7 antibiotikumot tartalmazó No. 15—20 frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk, így a nyers PS—7 antibiotikumot kapjuk.
Az igy kapott PS—7 antibiotikumot tartalmazó liofilizált nyers készítményt a PS—7 antibiotikum további tisztítása céljából feloldjuk 8,0 pH-értékű M/100 foszfát-puffer-oldatban, majd Sephadex G—10 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2 cm 0 x80 cm) viszszük és a kromatogramot az előbb említett foszfátpuffer-oldattaí fejlesztjük ki. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és előzőleg M/100 foszfát-pufferral 8,0 pHértékre beállított QAE-Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopon adszorbeáljuk és 200 ml lineáris nátriumklorid koncentráció gradiensű 0 és 0,4 M közötti koncentrációjú nátriumklorid-oldattal eluáljuk. Az így kapott aktív frakcióhoz hozzáadunk 3% (súly/térfogat) nátriumkloridot. Az oldatot Diaion HP—20 AG (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) oszlopon (1,1 cm 0 x 20 cm) adszorbeáljuk, majd az aktív komponenst 10%-os (térfogat/térfogat) vizes aceton-oldattal eluáljuk és kisózzuk. Az aktív frakciót liofilizáljuk és így kapunk 1,5 mg fehér liofilizált készítményt, mely a PS—7 antibiotikum nátrium-sója.
Hasonló eljárások ismétlésével megkapjuk a készítményeket.
A fentiek szerint előállított PS—6 és PS—7 antibiotikumok nátrium-sói az alábbi fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek.
I. PS—6 antibiotikum
1. Szín
Színtelen
2. Oldhatóság
Oldható vízben, teljesen oldhatatlan acetonban.
3. Bomláspont
A készítményt Kofler-típusú BY—1 mikro-olvadáspontmérő berendezésben (YAZAWA Scientific Mfg, Co., Ltd.) vizsgáljuk. A hőmérsékletet percenként 1 °Ckal emeljük. A minta nem egy meghatározott hőmérsékleten olvad. 143 °C hőmérsékleten lágyulni kezd, fokozatosan barna színű lesz és 165 °C hőmérsékleten térfogata csökkenni kezd. 220 °C hőmérséklet körül barna gyantát kapunk.
4. Ultraibolya abszorpciós spektrum ug PS—6 antibiotikum-nátrium-sót feloldunk 3,0 ml vízben és 200—20 típusú Hitaci Double-beam
Spectrophotometer (Hitaci, Ltd.) berendezésben vizsgáljuk. A felvett diagram az 1. ábrán látható.
A jellemző értékek az alábbiak:
Xh.o=243,0 nm X«?°=300,0nm
A készítmény desztillált vízben készített oldatához hozzáadunk hidroxilamin-oldatot (pH=7,5). Az így kapott oldatban a PS—6 antibiotikum koncentrációja 20 Fg/ml, a hidroxilamin koncentrációja 10 mM. 30 percen keresztül 22 C hőmérsékleten történő állás után az oldat 300,0 nm-nél mért optikai sűrűsége az eredeti értéknek mintegy 95%-ával csökken.
5. Infravörös abszorpciós spektrum
A PS—6 antibiotikum nátrium-sójának káliumbromidban Hitaci Infrared Spectrophotometer Model 215 berendezésen (Hitaci, Ltd.) felvett infravörös spektrumát a 2. ábra mutatja. A megadott hullámszámoknál az alábbi jellemző abszorpciós maximumok találhatók:
(i) 1760 cm”1 (8-laktám gyűrű —CO— csoportja) (ii) 1660 cm-1 (amid kötés —CO— csoportja) (iii) 1600 cm”1 (—COO® csoport) (iv) 1555 cm 1 (amid kötés —CO—NH— csoportja)
6. Proton magmágneses rezonancia spektrum
A PS—6 antibiotikum-nátrium-sójának proton magmágneses rezonancia spektrumát 100 MHz-en nehéz vízben JEOL NMR spectrometer JNM PS—100 berendezésen (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) vizsgáljuk (3. ábra). A görbe alapján jellemzők a következők :
(i) két dublett, melynek központja 0,94 és 0,98 ppmnél van
ÍCH’\ Ϊ (J = 7,0Hz)CH— \ch3/ (ii) éles szingulett 1,92 ppm (CH3—CO—)| (iii) multiplett 2,42—3,50 ppm-nél (—CH2—,—CH—) (iv) multiplett 3,90—4,20 ppm-nélN
I (—CH—)
7. Színreakció
Ehrlich-reagens reakció: pozitív
Jód-klórplatinasav reakció: pozitív Ninhidrin reakció: negatív
8. Papirkromatográfia
A PS—6 antibiotikum Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Kaisha Ltd.) papíron végzett leszálló papírkromatográfiás vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek alkalmazása esetén:
acetonitril/trisz-puffer/EDTA Rf = 0,41 (1. számú megjegyzés) etanol/víz (7/3) Rf 0,65 [(1. számú megjegyzés: az oldószerelegy a következő összetételű: 120 ml acetonitril, 30 ml 1/10 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-hidroklorid-puffer-oldat (pH=7,5) és 1 ml 1/10 M etiléndiamintetraecetsav-nátrium-só (pH = 7,5)].
-16179788
9. Vékonyréteg-kromatográfia
A PS—6 antibiotikum vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatát Chromatogram Sheet 13254 cellulose (Eastman Kodak Co.) alkalmazásával végezzük. Az antibio- 5 tikum a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek esetén:
foglaljuk össze. A PS—6 antibiotikumon kívül megadjuk az összehasonlítás céljául szolgáló cefazorin és cefoxitin minimális gátló koncentrációit is.
| n-butanol/etanol/víz (4/1/5) fedőréteg | Rf=0,67 |
| n-propanol/víz (8/2) | Rf=0,69 |
| n-butanol/i-propanol/víz (7/7/6) | Rf=0,70 10 |
| acetonitril/víz (8/2) | Rf=0,68 |
| 10. Nagyfeszültségű papír elektroforézis | |
| A PS—6 antibiotikum nagyfeszültségű papír elektro- 15 forézis vizsgálatát az előzőekben megadottak szerint végezzük. A berendezés a Savant Instruments Inc. terméke |
(High Voltage Power Supply, Model No. HV 3000A és Fiat Plate Electrophoresis, Model No. EP 18A). Az alkalmazott szűrőpapír Toyo Filter Paper No. 50. 20
Az eredmények az alábbiak:
A vizsgálatot 30 percig végezzük hűtés közben (4 °C hőmérséklet alatt) 3,3 g dietilbarbitursavat és 25,5 g nátriumdietilbarbiturátot és 3000 ml vizet tartalmazó puffer-oldatban (pH=8,6), a feszültség 42 V/cm. Ilyen 25 feltételek mellett a PS—6 antibiotikum 28 mm-re mozdul el az anód irányába.
A fentiekben leírt fizikai-kémiai vizsgálatok alapján a PS—6 antibiotikum szerkezete az (la) képletnek felel meg. 30
A PS—6 antibiotikum-nátrium-sója biológiai tulajdonságainak vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük.
1. Mikrobaellenes spektrum
A PS—6 antibiotikum nátrium-sójának különböző rezisztens törzseket magukban foglaló patogén mikroorganizmusokkal szemben mutatott minimális gátló koncentráció értékeit BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” (EIKEN CHEMICAL CO., LTD) 40 táptalaj alkalmazásával táptalajhigítási módszerrel határozzuk meg.
A PS—6 antibiotikum-nátrium-sóját 5—100 μg/ml koncentrációban feloldjuk BRAIN HEART INFUSIÓN BROTH „Eiken” táptalajban, melyből ugyanebben 45 a folyékony táptalajban megfelelően hígított sorozatot készítünk. Az 5. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokat 28 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül tenyésztjük BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” táptalajban, majd beoltjuk a fentiek szerint elkészített meg- 50 felelően hígított sorozatba. A beoltás után az oltóanyag mennyisége 1 x 105 sejt/ml. A tenyészetet 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül állni hagyjuk, majd a PS—6 antibiotikum minden hígításában megvizsgáljuk a mikroorganizmus növekedését. A minimális gátló koncent- 55 ráció (MIC) a PS—6 antibiotikum nátrium-sójának az a legkisebb koncentrációja, melynél a kérdéses mikroorganizmus nem szaporodik. Kontrollvizsgálat céljára két ismert β-laktám antibiotikumot, a cefazorint és cefoxítint 1—100 ;J.g/ml koncentrációban 7,0 pH érték mellett 60 feloldunk BRAIN HEART INFUSION BROTH táptalajban, az említett folyékony táptalajban különböző hígítású sorozatot készítünk és a minimális gátló koncentráció meghatározására a fentiek szerint kezeljük a hígításokat. A kapott eredményeket az 5. táblázatban 65
5. táblázat
| Mikroorganizmus | Minimális gátló koncentráció (gg/ml) | ||
| PS—6 antibiotikumok | Cefazorin | Cefoxitin | |
| Staphylococcus aureus FDA · 209P | 0,33 | 0,25 | 2,50 |
| Staphylococcus aureus Bx—1633 | 0,33 | 0,50 | 2,50 |
| Staphylococcus aureus Rassell | 1,34 | 1,0 | 5,0 |
| Diplococcus pneumoniae Type III4+ | 0,17 | 0,125 | 2,50 |
| Streptococcus pyogenes NY—54+ | 0,33 | 0,25 | 1,25 |
| Bacillus subtitis ATCC 6633 | 1,34 | 0,50 | 1,25 |
| Alcaligenes faecalis B—326 | 1,56 | 6,25 | 1,56 |
| Citrobacter freundii E—9+ | 12,5 | >100 | >100 |
| Serratia marcescens S—18+ | 50,0 | >100 | 50,0 |
| Klebsiella pneumoniae K—2+ | 12,5 | 6,25 | 6,25 |
| Enterobacter sp. E—8+ | 12,5 | 3,13 | 12,5 |
| Enterobacter cloacae E—16+ | 25,0 | >100 | >100 |
| Enterobacter aerogenes E—19+ | 25,0 | >100 | >100 |
| Proteus vulgáris P—5 | 25,0 | >100 | |
| Proteus rettgeri P—73+ | 6,25 | 25,0 | |
| Proteus mirabilis P—62+ | 12,5 | 6,25 | |
| Proteus sp. P—22 | 12,5 | >100 | |
| Providencia sp. P—82+ | 12,5 | 50,0 |
+ β-laktamáz termelő.
2+ Rezisztens kanamycinnel, gentamycinneí és tobramycinnel szemben.
3+ Rezisztens gentamycinneí és tobramycinnel szemben.
4+ 10% lóvért adunk a táptalajhoz.
2. Ismert β-laktám vegyületek β-laktamáz-rezisztens mikroorganizmusokkal szembeni mikrobaellenes hatásának növelése és az ezekkel együtt kifejtett szinergetikus hatás ml 2,5-szeresre hígított tápanyagot tartalmazó agart (pH=7,0), mely 50 μg/ml penicillin G-t vagy cefaloridint tartalmaz, beoltunk β-laktamáz termelő és β-laktamáz-rezisztens mikroorganizmusokkal, majd az így kapott anyagot 9 cm átmérőjű Petri-csészébe öntjük, így állítjuk elő a biovizsgálati agar lemezt. Erre a vizsgá-17179788 lati lemezre 8 mm átmérőjű cellulóz lemezeket helyezünk, melyeknek mindegyik 20 μΐ, 240 μg/ml koncentrációjú PS—6 antibiotikum-oldatot tartalmaz és 35 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül inkubáljuk, majd leolvassuk a gátló zóna nagyságát. Ugyanilyen úton készítjük a kontroll céljára szolgáló vizsgálati lemezt, azzal az eltéréssel, hogy az agar nem tartalmaz penicillin G-t, illetve cefaloridint. A fenti feltételek mellett elvégezzük 20 μΐ, 10 000 Kg/ml koncentrációjú penicillin G, illetve cefalo ridin lemezvizsgálatát is. Az eredményeket a 6. táblázat mutatja.
A 6. táblázat adatai szerint a PS—6 antibiotikumnak nem kimutatható mennyiségben a penicillin G-hez vagy 5 a cefaloridinhez való adagolása egyértelműen szinergetikus hatást eredményez β-laktám-rezisztens mikroorganizmusokkal szemben. Ha a PS—6 antibiotikum helyett penicillin G-t cefaloridint adagolunk, szinergetikus hatás nem mutatkozik.
6. táblázat
| β-Iaktám-rezisztens mikroorganizmus | Gátlózóna, mm | |||
| lemez | kontroll | penicillin G-vel | cefaloridinnel | |
| Proteus vulgáris P—5 | PS—6 | 14,0 | 30,0 | 28,5 |
| penicillin G | 15,0 | 15,0 | 15,0 | |
| cefaloridin | 12,0 | 12,0 | 12,0 | |
| Citrobactcr freundii | PS—6 | 22,0 | 23,0 | 25,0 |
| E-9 | penicillin G | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
| cefaloridin | 12,0 | 12,0 | 12,0 | |
| Serratia marcescens | PS—6 | 20,0 | 22,0 | 26,0 |
| penicillin G | 0,0 | 0,0 | 0,0 | |
| cefaloridin | 11,0 | 11,0 | 11,0 |
3. In vivő hatás
A PS—6 antibiotikum-nátrium-só terápiás hatását egereken vizsgáljuk, melyeket 5 x 103 sejt/egér mennyiségű Staphylococcus aureus Smith baktériummal fertőztünk meg intraperitoneálisan. A fertőzés után rövid idővel a PS—6 antibiotikum-nátrium-só vizes oldatát adagoljuk szubkután. DDY hím egerek (Shizuoka) esetén a készítmény 50%-os hatásos adagja 5,2 mg/kg.
4. Toxicitás
DDY hím egereknek (Shizuoka) intraperitoneálisan PS—6 antibiotikum-nátrium-só készítményt adagolunk vizes oldat formájában injekcióban 500 mg/kg mennyiségben. Akut toxicitás nem lép fel.
5. Ismert β-laktamázokkal szembeni érzékenység (a PS—6 antibiotikumnak, mint enzim szubsztrátumnak a tulajdonságai)
A PS—6 antibiotikum-nátrium-sójának, mint enzim szubsztrátumnak β-laktamázzal szembeni érzékenységét Bacillus licheniformis 749/C exo-penicillinase-zal (ATCC 25972) és Bacillus cereus 569 inducible penicillinase-zal (ATCC 27348) szemben vizsgáljuk az alábbi feltételek mellett:
(A) Reagens (1) Szu'osztrátum
A PS—6 antibiotikum-nátrium-só készítményt megfelelő koncentrációban feloldjuk 25 nM foszfát-pufferban (pH=6,8).
(2) β-laktamáz (a) Bacillus licheniformis 749/C exo-penicillinase-t (ATCC 25972) Cephalexin-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopon oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Az enzimkészítmény hatása 16 600 egység/ml, melyet a penicillin G-kálium-só hidrolízise után 30 °C hőmérsékleten M/10, 6,8 pH-jú foszfát-pufferban jodometriával határozunk meg. Egy egység penicillinase azt az enzimmenyiséget jelenti, mely 60 perc alatt 30 °C hőmérsékleten 6,8 pH érték mellett 1 mikromól penicillin G-t képes hidrolizálni.
(b) Bacillus cereus 569 inducible penicillinase (ATCC 27348). Ezt a β-laktamázt az ampicillin termeli, CMcellulóz oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Hatása 26 900 penicillin G-kálium-só egység/ml.
(B) Reakció és vizsgálati feltételek cm-es kvarc küvettában levő 3 ml, pufferban készített PS—6 antibiotikum-nátrium-só-oldathoz 30 °C hőmérsékleten megfelelő mennyiségű β-laktamázt adunk és a reakció megindítása céljából azonnal keverni kezdjük. A hidrolízis időbeni lefutását 30 °C hőmérsékleten a 301 nm-nél mért optikai sűrűség csökkenésével követjük nyomon, mely megfelel a PS—6 antibiotikum koncentrációjának. A 94651 számú japán szabadalmi leírás szerint a PS—5 antíbiotikum-nátrium-só E^° értéke 301 nm Amax-nál 267,5. Ha a készítmény nem tartalmazna kristályvizet epszilon értéke 8560 lenne.
Mivel a PS—5 antibiotikum optikai sűrűsége 301 nmnél az eredeti érték 5%-ára csökken, még a hidroxilaminnal vagy β-laktamázzal történő teljes lebomlás után is, így ennek a szubsztrátumnak optikai sűrűség különbségét 301 nm-nél Δε=8132 értéknek vettük. Ezt vesszük alapul a PS—6 antibiotikum vizsgálatánál is. Az eredmények ennek megfelelően az alábbiak.
(C) Eredmény (a) Bacillus licheniformis 749/C exo-penicillinase. Fél milliliter fenti enzimkészítményt és 30 m μπιόΐ PS—6 antibiotikumot tartalmazó szubsztrátum-oldatot összekeverünk (a PS—6 antibiotikum végső koncentrációja 10 pmól/ml=3,3 pg/ml; kezdeti optikai sűrűség
-18179788
301 nm-nél 0,086), majd 15 percig a fent megadott feltételek mellett inkubáljuk, anélkül, hogy a PS—6 antibiotikum lényeges mértékben hidrolizálna.
(b) Bacillus cereus 569 inducible penicillinase. A PS—6 antibiotikumnak ezzel a β-laktamázzal történő hidrolízisét a fent leírt feltételek mellett vizsgáljuk 301 nm-nél a reakcióelegy optikai sűrűségének meghatározásával. A reakcióelegy 3 ml-c 7,5 pmól fenti enzimkészítményt és 77,5 pmól PS—6 antibiotikum szubsztrátumot tartalmaz (a PS—6 antibiotikum végső koncentrációja 25,8 pmól/ml=8,63 [ag/ml; optikai sűrűsége 301 nm-nél 10,366).
Ezekből az adatokból Shyun-Long Yun és Clarence H, Seulter módszerével (Biochemica et Biophysica Acta, Vol 480, pp. 1—13, 1977) határozzuk meg a Km-értéket, mely ebben az esetben 17,7 μΜ.
II. PS—7 antibiotikum
1. Szín
Színtelen
2. Oldhatóság
Oldható vízben, de gyakorlatilag oldhatatlan acetonban.
3. Bomláspont
Az anyag nem egy meghatározott hőmérsékleten olvad. 145—150 °C hőmérsékleten fokozatosan lágyul, térfogata csökken, 220 °C hőmérsékleten szilárdul és már nem színtelen. A mérést Kofler módszerével végezzük BY—1 típusú Micro Melting Point Apparátus berendezésben (Yazawa Kagaku Kikaikogyo Co.)a hőmérsékletnek percenként 1 °C-kal történő emelése közben.
4. Ultraibolya abszorpciós spektrum μg PS—7 antibiotikum-nátrium-sót feloldunk 3 ml M/100 foszfát-pufferban (pH=7,0) (és Shimadzu Digital Double Beám Spectrophotometer UV 210A berendezésben vizsgáljuk (4. ábra). A jellemző értékek az alábbiak :
X«£=220,0nm, AS2ax=308,0 nm.
A termék deionizált vízben készített oldatához hozzáadunk 7,5 pH-értékű vizes hidroxilamin-oldatot. Az így kapott oldatban a PS—7 antibiotikum koncentrációja 20 μg/ml, a hidroxilamin koncentrációja 10 mM. 30 percig 22 °C hőmérsékleten történő inkubáció után az oldat 308,0 nm-nél mért abszorpciója az eredeti értéknek mintegy 95%-ával csökken.
5. Infravörös abszorpciós spektrum
A káliumbromid tablettával Hitachi Infrared Spectrophotometer Type 215 berendezésben mért infravörös abszorpciós spektrumot az 5. ábra mutatja. A megadott hullámszámoknál az alábbi jellemző abszorpciós maximumok találhatók:
(i) 1760 cm-1 (β-laktám gyűrű —CO— csoportja) (ii) 1670 cm-1 (amid —CO— csoportja) (iii) 1620 cm-1 (—COO® és —CII—CH— csoport)
6. Proton magmágneses rezonancia spektrum
A 6. ábra mutatja a 100 MHz-en nehéz vízben Nihon JNM Type PS—100 berendezésben vizsgált proton magmágneses rezonancia spektrumot. A jellemzők a következők:
(i) triplett, melynek központja 0,96 ppm-nél van (ch3-CH2 -) (ii) multiplett, melynek központja 1,72 ppm-nél van ( CH2-CH3) (iii) éles szingulett 2,05 ppm-nél (CH3—CO—) (iv) multiplett 2,96—3,38 ppm-nél (—CH2—, —CH—) (v) szingulett, melynek központja 3,96 ppm-nél van
N / —CH— (vi) két dublett, melynek központja 6,06 és 7,16 ppmnél van (J = 14 Hz) (—CH=CH—)
7. Színreakció
Ehrlich-reagens reakció: pozitív
Jód-klórplatinasav reakció: pozitív Ninhidrin reakció: negatív
8. Papírkromatografia
A PS—7 antibiotikums Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Co.) papíron végzett leszálló papírkromatográfiás vizsgálat során a következő Rf értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek alkalmazása esetén:
acetonitril/trisz/EDT A1: Rf = 0,41 etanol/viz (7/3): Rf=0,68
9. Vékonyréteg-kromatográfia
Chromatogram Sheet 13254 cellulose (No. 6065) (Eastman Kodak Co.) alkalmazásával a PS—7 antibiotikum a következő R. értékeket mutatja az alább felsorolt oldószerek esetén:
n-butanol/etanol/víz (4/1/5): fedőréteg Rf=0,65 n-propanol/víz (7/3): Rf=0,81 n-butanol/i-propanol/víz (7/7/6): Rf=0,71 acetonitril/víz (8/2): Rf=0,65
10. Nagy feszültségű papír elektroforézis
A PS—7 antibiotikum nagyfeszültségű papír elektroforézis vizsgálatát Toyo Filter Paper No. 50 (Toyo Roshi Co.) alkalmazásával 3,3 g dietilbarbitursavat, 25,5 g nátriumdietilbarbiturátot és 3000 ml vizet tartalmazó 8,6 pH értékű puffer-oldatban High-Voltage-PaperElectrophoresis Apparátus (Savant Instruments Co., High voltage power supply HV 3000A, Electrophoresis véssél FP 18A) berendezésben vizsgáljuk. A PS—7 antibiotikum 30 perc alatt, 42 V/cm feszültség mellett 28 mm távolságba migrál az anód irányába.
A fentiekben leírt fizikai-kémiai tulajdonságok alapján a PS—7 antibiotikum szerkezete az (Ib) képletnek felel meg.
A PS—7 antibiotikum-nátrium-sója biológiai tulajdonságainak vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük.
-19179788
1. Mikrobaellenes spektrum
A PS—7 antibiotikum nátrium-sójának különböző rezjsztens törzseket magukban foglaló patogén mikroorganizmusokkal szemben mutatott minimális gátló koncentráció értékeit BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” (Eiken Kagaku Co.) alkalmazásával táptalajhígttási módszerrel határozzuk meg.
A PS—7 antibiotikum-nátrium-sót BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” táptalajban oldjuk fel és ezzel hígítjuk. Az így kapott oldat koncentrációja 5— 100 μg/ml közötti. Ezt az oldatot ugyanezzel a táptalajjal tovább hígítjuk és így különböző koncentrációjú oldatokat kapunk. A hígított oldatokhoz hozzáadjuk az oltótenyészetet, melyet úgy készítünk, hogy az 5. táblázat szerinti különböző mikroorganizmusokat rázás közben BRAIN HEART INFUSION BROTH táptalajban tenyésztjük 28 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül. Az oltóanyag végső koncentrációja 1 x 105 sejt/ml. A sejtek növekedését 35 °C hőmérsékleten .20 órán keresztül végzett inkubáció után vizsgáljuk. A PS—7 antibiotikumnak a megfelelő mikroorganizmusokkal szembeni minimális gátló koncentrációja az a legkisebb koncentráció, melynél a sejtek növekedése még nem figyelhető meg. Kontroll vizsgálat céljára az ismert antibiotikumokat, a cefazolint és a cefoxitint feloldjuk 1—100 pg/ml koncentrációban 7,0 pH-érték mellett BRAIN HEART INFUSION BROTH táptalajban, ugyanezzel a táptalajjal különböző hígítású sorozatot készítünk. A különböző mikroorganizmusokkal szemben mutatott minimális gátló koncentráció értékeket a fent leírtak szerint végezzük. Az eredményeket a 7. táblázat tartalmazza. Ugyanitt megadjuk az összehasonlítás céljául szolgáló cefazolin és cefoxitin antibiotikumok minimális gátló koncentráció értékeit is.
7. táblázat
Minimális gátló koncentráció, μ/ml
| Mikroorganizmus | PS—7 antibiotikum | Cefazolin | Cefoxitin |
| Staphylococcus aureus FDA 209P | <0,19 | 0,25 | 2,50 |
| Diplococcus pneumoniae Type III** | <0,19 | 0,125 | 2,50 |
| Alcaligenes faecalis B—326 | 0,78 | 6,25 | 1,56 |
| Citrobacter freund ii E—9* | 3,13 | >100 | >100 |
| Enterobacter Cloacae E—16* | 6,25 | >100 | >100 |
* β-laktamáz-termelő törzs.
** A táptalaj 10% lószérumot tartalmaz.
2. Ismert β-laktám vegyületek β-laktamáz-rezisztens mikroorganizmusokkal szembeni mikrobaellenes hatásának növelése és az ezekkel együtt kifejtett szinergetikus hatás
2,5-szcresre hígított tápanyagot tartalmazó agárhoz (pH=7,0) hozzáadunk cefaloridint, majd a táptalajt beoltjuk β-laktám termelő törzzsel, mely β-laktamázt ter20 mel. A táptalaj 10 ml-ét 9 cm átmérőjű Petri-csészébe öntjük és hagyjuk megszilárdulni. így kapjuk a vizsgálati lemezt. A PS—7 antibiotikumot 50, illetve 29 μg/mI koncentrációban feloldjuk, majd 20 μΐ fenti koncentrációjú oldattal és ennek 2- és 4-szeres hígítású oldataival átitatunk .8 mm átmérőjű cellulózle.mezt. A cellulózlemezt a fentiek szerint elkészített tápanyagot tartalmazó agarra helyezzük és 35 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül végzett inkubájás után vizsgáljuk a lemez körül a gátló zóna növekedésének mértékét. Kontroll vizsgálat céljából cefalorodin nélkül hasonlóan elkészített táptalajt vizsgálunk. Ezen kívül szintén összehasonlítás céljából készítünk PS—7 antibiotikum helyett 20 μΐ, 10 000 μg/ml koncentrációjú penicillin G, illetve cefaloridin-oldattal is cellulózlemezt. Az eredményeket a 8. táblázat tartalmazza.
8. táblázat
| p-laktám-rezisztens törzs | Lemez | Gátló zóna átmérője, mm | |
| önmagában | cefaloridinnel | ||
| PS—7 antibiotikum fxl | 0,0 | 19,0 | |
| Proteus vulgáris | Jx2 | 0,0 | 15,0 |
| P—5 | 1x4 | 0,0 | 11,0 |
| Penicillin G | 15,0 | 15,0 | |
| Cefaloridin | 12,0 | 12,0 | |
| PS—7 antibiotikum pl | 12,5 | 13,5 | |
| Citrobacter | 1x2 | 0,0 | 0,0 |
| freundii E—9 | 1x4 | 0,0 | 0,0 |
| Penicillin G | 0,0 | 0,0 | |
| Cefaloridin | 12,0 | 12,0 | |
| PS—7 antibiotikum íxl | 11,0 | 18,0 | |
| Serratia | 1x2 | 0,0 | 14,0 |
| marcescens | 1x4 | 0,0 | 0,0 |
| Penicillin G | 0,0 | 0,0 | |
| Cefaloridin | 11,0 | 11,0 |
Az eredmények alapján látható, hogy penicillin G, illetve a cefaloridin β-laktám-rezisztens törzsekkel szembeni mikrobaellenes hatása nyilvánvalóan megnő a PS—7 antibiotikum adagolásának hatására olyan esetekben, amikor a PS—7 antibiotikum adagolása nélkül nincsen mikrobaellenes hatás. Ha PS—7 antibiotikum helyett penicillin G-t vagy cefaloridint adagolunk nem nő meg a mikrobaellenes hatás.
3. In vivő hatás
A PS—7 antibiotikum fenti hatását egereken vizsgáljuk, melyeket intraperitoneálisan 5 x 105 sejt/egér menynyiségű Staphylococcus aureus Smith baktériummal fertőztünk. A PS—7 antibiotikum-nátrium-sóját a fertőzést követően azonnal szubkután adagoljuk az egerekbe. A vegyület 50%-os hatásos adagja DDY hím egerek esetén (Shizuoka) 7,5 mg/kg.
-20179788
4. Toxicitás
A PS—7 antibiotikum-nátrium-sóját intraperitoneálisan alkalmazzuk DDY hím egereken (Shizuoka). Akut toxicitás nem lép fel.
5. Ismert β-laktamázokkal szembeni érzékenység (a PS—7 antibiotikumnak, mint enzim szubsztrátumnak a tulajdonságai)
A PS—Ί antibiotikum nátrium-sójának, mint szubsztrátumnak a viselkedését Bacillus cereus 569 inducible penicillinase-zal (ATCC 27348) szemben vizsgáljuk az alábbiak szerint:
(A) Reagens (1) Szubsztrátum
A PS—7 antibiotikum nátrium-sóját megfelelő koncentrációban feloldjuk 100 mM foszfát-puffer-oldatban (pH=6,8).
(2) β-laktamáz
Az ampicillin által termelt Bacillus cereus 569 inducible penicillinase-t (ATCC 27348) CM-cellulóz (Brown Co.) oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Az enzimkészítmény penicillin G-vel mért hatása 14 800 egység/ml.
(B) fReakció és vizsgálati feltételek
A szubsztrátumként szolgáló PS—7 antibiotikumoldatot 30 °C hőmérsékleten melegítjük. Az oldatból 3,0 ml-t optikai kvarc küvettába öntünk, majd az enzim adagolásával és az oldat keverésével beindítjuk a reakciót. A reakciót 30 °C hőmérsékleten hajtjuk végre és vizsgáljuk 308 nm-en a PS—7 antibiotikum szubsztrátum abszorpciójának csökkenését.
308 nm-nél az ε értéke 9720. Ennek az értéknek a meghatározásánál abból a feltételből indulunk ki, hogy a PS—7 antibiotikumnak a fenti enzimmel történő teljes lebomlása esetén mért abszorpciócsökkenés 10 800.
(C) Eredmény ml, 10 μΐ penicillinase készítményt és 102 m μιηόΐ PS—7 antibiotikumot (végső koncentrációja 34 m μπιοί/πύ) tartalmazó reakcióelegyet a fent megadott körülmények között inkubálunk, és mérjük a PS—7 antibiotikum koncentrációcsökkenésének változását az inkubációs idő függvényében.
Az eredmények alapján Shyun-Long Yun és Clarence H. Suelter módszerével (Biochemica et Biophysica Acta 480, 1—13, 1977) meghatározott KM érték 13,0 μΜ.
10. példa
PS—6 antibiotikum-tritil-észter
25,9 g, 9. példa szerint előállított fehér, fagyasztva szárított PS—6 antibiotikum-nátrium-sót feloldunk 5 ml dimetilformamidban és 20 μΐ trietilaminban, majd ezt követően hozzáadunk a reakcióelegyhez 50 mg tritilkloridot. Szobahőmérsékleten 3 órán át keverés után hozzáadunk a reakcióelegyhez 200 ml benzolt és 3x70 ml 0,1 M foszfát-puffer-oldattal (pH=6,8) mossuk. Az így kapott reakcióelegyet 3 ml telített vizes nátriumkloridoldattal dehidratáljuk, majd a benzolos oldatot vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk. A benzolt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és így mintegy 0,5 ml benzolos oldatot kapunk, melyet Bio-Beads S—X3 (Bio-Rad Laboratories) oszlopon (1,2x96,0 cm) engedünk át. A kromatogramot benzollal fejlesztjük ki. Az így kapott aktív frakciót összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot feloldjuk 0,5 ml acetonban, majd Sephadex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2x96,0 cm) visszük, melyet előzőleg acetonnal kezeltünk, és acetonnal kifejlesztjük a kromatogramot. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így 23,7 mg fehér port kapunk. Ezt az anyagot benzoln-hexán elegyéből átkristályosítjuk. így 17,5 mg színtelen fehér kristályt kapunk, mely a PS—6 antibiotikum tritil-észtere.
Az anyagon a következő fizikai-kémiai vizsgálatokat végezzük el:
1. Szín
Színtelen
2. Ultraibolya abszorpciós spektrum
A PS—6 antibiotikum tritil-észterének ultraibolya abszorpciós spektrumát 100 μg/3 ml metanol koncentrációban Hitachi Double Beám Spectrophotometer Model 200—20 berendezésben (Hitachi, Ltd.) vizsgáljuk.
λ^θΗ=315 nm
3. Infravörös abszorpciós spektrum
200 μg PS—6 antibiotikum-tritil-észtert feloldunk 0,3 ml kloroformban és káliumbromid alkalmazásával Hitachi Infrared Spectrophotometer berendezésben (Model 260—30, Hitachi Ltd.) vizsgáljuk az infravörös abszorpciós spektrumot. Az infravörös abszorpciós spektrumot a 7. ábrán tüntetjük fel.
A megadott hullámszámoknál a következő jellemző abszorpciós maximumot találjuk:
(i) 1780 cm-1 (β-laktám gyűrű —CO— csoportja) (íi) 1700 cm-1 (amid kötés —CO— csoportja) (iii) 1700 cm (az észter kötés—COO®—csoportja)
4. Oldhatóság
A PS—6 antibiotikum-tritil-észter oldhatóságát úgy vizsgáljuk, hogy 5 mg PS—6 antibiotikum-tritil-észtert 20 °C hőmérsékleten feloldunk az alább felsorolt oldószerek 0,1 ml-ében. Az eredmények a következők:
Teljesen oldhatatlan vízben és n-hexánban.
Kissé oldódik benzolban, etilacetátban, kloroformban, metanolban, etanolban, acetonban, dimetilformamidban és dimetilszulfoxidban.
-21170788
9.táblázat
5. Színreakció
Ehrlich-reagéns reakció pozitív
Jód-klorplátinásáv reakció pozitív Ninhidriri reakció negatív
6. Vékoilyréteg-kromátográfia
A PS—6 aritibiotikúm-tritil-észter a következő Rf értékeket mutatja a megadott feltételek mellett. A migráció helyét Comamonas terrigena B—996-on végzett bioaütögráfiSvál fejlesztjük ki.
Szilikagél vékonyréteg-kromatográfiai lemezt (Merek, DC-Fertigplatteri Kieséigel 60 F254) használunk. Mielőtt a vizsgálandó anyagot fel visszük a lemezre, 2,5 μΐ 10% dimetilformamidot tartalmazó aceton-oldaiot viszünk fel a lemezre. Az Rf értékek az alábbiak:
Oldószerrendszer:
benzol/aceton (2/1): Rf=O,37 benzol/etilacetát (1/8): Rf=O,34
A PS—6 antibiotikum szerkezete és a fenti fizikaikémiai tulajdonságok alapján a PS—6 antibiotikum-tritil-észter szerkezete a (TIb) képletnek felel meg.
A PS—6 antibiotikum-tritil-észter biológiai tulajdonságait a következőkben mutatjuk meg.
1. Mikrobaellenes spektrum
A PS—6 aniitíiotikum-tritílészter különböző rezisztens töréseket ‘magukban foglaló pátogéri mikroorganizmusokkal széniben mutatott minimális !gitló, koncentráció értékeit BRAIN HEARTINFUSION BROTH „Eiken” (EIKEN CHEMICAL CO., Ltd.) táptalajon táptalajhígítási módszerrel határozzuk meg.
A PS—6 antibiotikum-tritij-észtert kis mennyiségű piétarioítiari oldjuk és azzá! hígítjuk 6RAÍN. HÉART WüSIÖN ÉR'ŐTH „Elken” ‘(EjkÉSl tUfeMlCAL CÖ., lúd.) táptalajjal (píi=^,0). Az így kapott oldátt/án a PS—6 árttibiöliküm-tritil-észte'r koncentrációja 3Ö— 20 p.g/ml és a metanol koncentrációja 'jférti haladja niég a 10%-ot. Ezt az oldatot kétszeresére hígítjuk. Á 7. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokat 18 órán keresztül 28 °C hőmérsékleten BRAIN HEáRt INkÚSÍON BROTH „Eiken” táptalajban tehyésztjük, majd heleoltjuk azokat a fentiek szerint hígított sorozatba. Az oltóanyag végső koncentrációja 1 x 105 sejt/ml. Az eredményeket 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül végzett inkubáció után olvassuk le. A minimális gátló koncentráció a PS—6 antibiotikum tritil-észterének azt a legkisebb koncentrációját jelenti, melynél a fenti feltételek mellett a megfelelő mikroorganizmusok növekedése nem figyelhető meg. Kontroll antibiotikumként ampicillin és cefaloridin BRÁIN TIEART INFUSÍON BROTH „Eiken” (pH=7,0) táptalajban készített 100 [ig/ml koncentrációjú oldatát állítjuk elő és az így kapott oldatot a találmány szerinti végyületekkel készített oldatokkal analóg módon kezeljük. A PS—6 antibiotikum-tritil-észter, Valamint a cefaloridin vizsgálata során kapott minimális gátló koncentráció értékeket a
9. táblázat tarmazza.
| Mikroorganizmus | Minimális gátló koncentráció, μβ/ml | |
| PS—6 antibiotikum-tritil-észter | cefaloridin | |
| Staphylococcus aureus FDA · 209P | 0,33 | 0,04 |
| Diplococcus pneumoniae Type III** | 0,33 | 0,01 |
| Streptococcus pyogenes NY—5** | 0,33 | 0,01 |
| Alcaligenes faecalis B—326 | 1,34 | 3,13 |
| Klebsiella pneumoniae K—2* | 20,0 | 20,0 |
| Citrobacter freundii E—9* | 12,5 | >100 |
| Proteus vulgáris P—5* | 25,0 | >100 |
| Enterobacter cloacae E—16* | 25,0 | >100 |
* β-laktamáz termelő organizmus. ** 10% ló vért adunk a táptalajhoz.
A táblázat adataiból kitűnik, hogy a PS—6 aritibiotikum-tritil-észter széles spektrumú mikrobaellenes hatással rendelkezik és különösen erős antibiotikus hatású különböző β-Taktárh-rézisztens (β-laktám termelő) mikroorganizmus törzsekkel szemben.
2. In vivő hatás
A PS—6 antibiotiküm-tritil-észtér in vivő hatását egereken vizsgáljuk, melyeket intraperitoneálisan 5 x x jő5 sejt/egér mennyiségű Stáphylocóccus aureus Smith baktériummal fertőztünk. A PS—6 ántibiotikum-tritil-észtert á fertőzést követően áiöhri'ál sZubkután adagoljuk az égerekbe. Á vegyület 50%-ós Hatásos ádagjá DDY hím églrek esetén (Shizüöká) 5,5 rftg/fcg.
3. Toxicitás , A PS—δ a'rilibi'o’tikum-intii'-é'sztert íhiraperitó'néáli^h alkálmáizzuk DbY hím egereken (Shizüoká). 500 mg/kg mennyiségben alkalmazva aktit toxicitás né‘m íép fel.
11. példa
PS—7 antibíotikum-trítil-észtér
24,5 g, 9. példa szerint előállított fehér, fágyHsztva szárított PS—7 ántibiotikum-hátríúm-sói feloldunk 5 ml dimetilformámídban és 50 [11 trietilafninbáö, majd ezt követően hozzáadunk a réákcióelégyhez 5Ó mg tritilkloridot. Szpbahőmértékletén 3 órán keresetül történő keverés úfán hozzáadunk a reakcíóeíegyfiez 200 ml behzólt és 3 x 70 ml 0,1 Nf foszfát2puffer-óldattár(pH= 6,8) mossuk. Az így kapott reakcióelegyet 3 ml telített vizes nátriumklorid-oldattal dehidratáljuk, majd a benzolos oldatot vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk.
A benzolt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és így mintegy 0,5 ml benzolos oldatót kapunk, melyet BioBeads S—X3 (Bio-Rad Laboratories) oszlopon (1,2 x x96,0 cm) engedjük át. A kromatogramót benzollal fejlesztjük ki. Az így kapott aktív frakciót összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A vissza-22179788 maradó anyagot feloldjuk 0,5 ml acetonban, majd Sephadex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2x96,0 cm) visszük, melyet előzőleg acetonnal kezeltünk, és acetonnal kifejlesztjük a kromatogramot. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így 20,5 mg fehér port kapunk. Ezt az anyagot benzol—n-hexán elegyéből átkristályositjuk. így 15,5 mg színtelen fehér kristályt kapunk, mely a PS—7 antibiotikum tritil-észtere.
Az anyagon a következő fizikai-kémiai vizsgálatokat végezzük el:
v 1. Szín
Színtelen
2. Ultraibolya abszorpciós spektrum
A PS—7 antibiotikum tritil-észterének ultraibolya abszorpciós spektrumát 100 μg/3 ml metanol koncentrációban Hitachi Double Beám Spectrophotometer Model 200—20 berendezésben (Hitachi, Ltd.) vizsgáljuk. λ“'°Η=230,5 nm, 321 nm.
3. Oldhatóság
A PS—7 antibiotikum-tritil-észter oldhatóságát úgy vizsgáljuk, hogy 5 mg PS—7 antibiotikum-tritil-észtert 20 °C hőmérsékleten feloldunk az alább felsorolt oldószerek 0,1 ml-ében. Az eredmények a következők:
Teljesen oldhatatlan vízben és n-hexánban.
Kissé oldódik benzolban, etilacetátban, kloroformban, metanolban, etanolban, acetonban, dimetilformamidban és dimetilszulfoxidban.
4. Színreakció
Ehrlich-reagens reakció Jód-klórplatinasav reakció Ninhidrin reakció pozitív pozitív negatív
5. Vékonyréteg-kromatográfia
A PS—7 antibiotikum-tritil-észter a következő Rf értékeket mutatja a megadott feltételek mellett. A migráció helyét Comamonas terrigena B—996-on végzett bioj autográfiával fejlesztjük ki.
Szilikagél vékonyréteg-kromatográfiai lemezt (Merek, DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254) használunk. Mielőtt a vizsgálandó anyagot felvisszük a lemezre, 2,5 μΐ ' 10% dimetilformamidot tartalmazó aceton-oldatot viszünk fel a lemezre. Az Rf értékek az alábbiak:
Oldószerrendszer:
benzől/aceton (2/1): Rf=0,51 benzol/aceton (1/1): Rf=O,67
A PS—7 antibiotikum szerkezete és a fenti fizikaikémiai tulajdonságok alapján a PS—7 antibiotikum-tritil-észter szerkezete a (IIc) képletnek felel meg.
A PS—7 antibiotikum-tritil-észter biológiai tulajdonságait a következőkben mutatjuk meg.
1. Mikrobaellenes spektrum
A PS—7 antibiotikum-tritil-észter különböző rezisztens törzseket magukban foglaló patogén mikroorganiz musokkal szemben mutatott minimális gátló koncentráció értékeit BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” (EIKEN CHEMICAL CO., Ltd.) táptalajon táptalajhígítási módszerrel határozzuk meg.
A PS—7 antibiotikum-tritil-észtert kis mennyiségű metanolban oldjuk és azonnal hígítjuk BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” (EIKEN CHEMICAL CO., Ltd.) táptalajjal (pH=7,0). Az így kapott oldatban a PS—7 antibiotikum-tritil-észter koncentrációja 40— 10 20 μg/ml és a metanol koncentrációja nem haladja meg a 10%-ot. Ezt az oldatot kétszeresére hígítjuk. A 7. táblázatban felsorolt mikroorganizmusokat 18 órán keresztül 28 °C hőmérsékleten BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” táptalajban tenyésztjük, majd beleolt15 juk azokat a fentiek szerint hígított sorozatba. Az oltóanyag végső koncentrációja 1 x 105 sejt/ml. Az eredményeket 35 °C hőmérsékleten 20 órán keresztül végzett inkubáció után olvassuk le. A minimális gátló koncentráció a PS—7 antibiotikum tritil-észterének azt a 20 legkisebb koncentrációját jelenti, melynél a fenti feltételek mellett a megfelelő mikroorganizmusok növekedése nem figyelhető meg. Kontroll antibiotikumokként ampicillin és cefaloridin BRAIN HEART INFUSION BROTH „Eiken” (pH=7,0) táptalajban készített 100 25 μg/ml koncentrációjú oldatát állítjuk elő és az igy kapott oldatot a találmány szerinti vegyületekkel készített oldatokkal analóg módon kezeljük. A PS—7 antibiotikum-tritil-észter, valamint a cefaloridin vizsgálata során kapott minimális gátló koncentráció értékeket 30 a 10. táblázat tartalmazza.
10. táblázat
| Mikroorganizmus | Minimális gátló koncentráció, gg/ml | |
| PS—7 antíbiotikum-trítil-észter | cefaloridin | |
| Staphylococcus aureus FDA · 209P | 0,16 | 0,04 |
| Diplococcus pneumoniae Type III** | 0,16 | 0,01 |
| Streptococcus pyogenes NY—5 * * | 0,16 | 0,01 |
| Alcaligenes faecalis B—326 | 1,34 | 3,13 |
| Klebsiella pneumoniae K—2* | 10,0 | 20,0 |
| Citrobacter freundii E—9* | 6,25 | >100 |
| Proteus vulgáris P—5* | 25,0 | >100 |
| Enterobacter cloacae E—16* | 25,0 | >100 |
* β-laktamáz termelő organizmus. ** 10% ló vért adunk a táptalajhoz.
A táblázat adataiból kitűnik, hogy a PS—7 antibio55 tikum-tritil-észter széles spektrumú mikrobaellenes hatással rendelkezik és különösen erős antibiotikus hatása különböző β-laktám-rezisztens ( β-laktám termelő) mikroorganizmus törzsekkel szemben.
2. In vivő hatás
A PS—7 antibiotikum-tritil-észter in vivő hatását egereken vizsgáljuk, melyeket intraperitoneálisan 5 x 105 sejt/egér mennyiségű Staphylococcus aureus Smith 65 baktériummal fertőzünk. A PS—Ί antibiotikum-tritil23
-23179788
-észtert a fertőzést követően azonnal szubkután adagoljuk az egerekbe. A vegyület 50%-os hatásos adagja DDY hím egerek esetén (Shizuoka) 4,5 mg/kg.
3. Toxicitás 5
A PS—6 antibiotikum-tritil-észtert intraperitoneálisan alkalmazzuk DDY hím egereken (Shizuoka). 500 mg/kg mennyiségben alkalmazva akut toxicitás nem lép fel.
12. példa
PS—6 antibiotikum-metil-észter
2,0 mg, 9. példa szerint előállított PS—6 antibiotikum-nátrium-só készítményt 1 ml száraz dimetilformamidban szuszpendálunk, majd hozzáadunk a reakcióelegyhez 20 μ.1 trietilamint és 50 u! metiljodidot. A reakcióelegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd az 20 így kapott reakcióelegyből 20 μΐ-t feloldunk metanolban. Ezt a mintát Hitachi Recording Spectrophotometer Model EPS—3T (Hitachi Ltd.) berendezésben vizsgáljuk. Mérjük 315 nm-nél az abszorpció növekedését, melyből megállapítható, hogy a reakció mennyire halad 25 előre. A reakció befejeződése után az egész reakcióelegyet beleöntjük 20 ml benzolba, majd ezt követően azonnal kétszer mossuk 10 ml 0,1 M foszfát-puffer-oldattal (pH=7,0). A benzolos oldatot vízmentes nátriumszulfáton dehidratáljuk, majd 35 °C hőmérsékleten csökken- 30 tett nyomáson 1 ml mennyiségre pároljuk be. A betöményített oldatot Bio-Beads S—X3 (Bio-Rad Laboratories) oszlopra (1,2x85 cm) visszük és a kromatogramot benzollal kifejlesztjük. A kapott eluátumot vékonyréteg-kromatográfiával fejlesztjük ki [Kieselgel 60 F254; 35 benzol(aceton=l: 1)]. Az eluátumokat összegyűjtjük és ultraibolya abszorpciós vizsgálattal azonosítjuk a PS—6 antibiotikum-metil-észtert. A frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és így színtelen olajos terméket kapunk, melyet feloldunk 1 ml acetonban. Az ace- 40 tonos oldatot Sephadex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2x85 cm) visszük, melyet előzőleg acetonnal kezeltünk és a kromatogramot acetonnal kifejlesztjük. A fenti módszerrel megállapítjuk, hogy mely frakció tartalmaz PS—6 antibiotikum-metil- 45 -észtert és ezeket a frakciókat összegyűjtjük. Az összegyűjtött frakciókat szárazra pároljuk és így 1,0 mg fehér olajos anyagot kapunk, mely a PS—6 antibiotikum-metil-észter.
(1) Vékonyréteg-kromatográfia 50
Rf=0,45 (Kieselgel 60 F254 lemez; benzol: aceton=l : 1) (2) Ultraibolya abszorpciós maximum metanolban
316,6 nm (3) Molekulasúly (Tömegspektrográfia) 55
C15H22N2O4S összegképletre számított: 326, 130 000 kapott: 326, 128 683 (4) Proton magmágneses rezonancia
A PS—6 antibiotikum-metil-észter proton magmág- 60 neses rezonancia spektrumát JEOL NMR spectrometer JNM PS—100 berendezésben (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) vizsgáljuk. A vizsgálathoz 2 mg PS—6 antibiotikum-metil-észtert 0,5 ml deuterokloroformban oldunk. A PS—6 antibiotikum-metil-észter 65 proton magmágneses rezonancia spektrumát a 8. ábra mutatja. A jellemző jelek az alábbiak:
(i) triplett*, melynek központja 1,06 ppm-nél van (CH3—CH—)
I ch3 (ii) éles szingulett 2,0 ppm-nél (CH3—CO—) (iii) multiplett 2,6—3,6 ppm között (—CH2— ,—CH—) (iv) éles szingulett 3,83 ppm-nél /—COCHjV 11 l θ J * Két dublett, melyek átlapolják egymást és így adnak egy triplettet, melynek hat protonja van.
A PS—6 antibiotikum szerkezete és a fenti fizikaikémiai tulajdonságok alapján a PS—6 antibiotikum-metil-észter szerkezete a (Ild) képletnek felel meg.
A 12. példában leírt eljárást megismételjük metiljodid helyett ekvivalens mennyiségű etiljodid, i-propiljodid, i-butiljodid, n-pentiljodid és n-hexil-jodid alkalmazásával, és így az alábbi termékeket kapjuk:
PS—6 antibiotikum-etil-észter
PS—6 antibiotikum-i-propil-észter
PS—6 antibiotikum-i-butil-észter
PS—6 antibiotikum-n-pentil-észter
PS—6 antibiotikum-n-pentil-észter PS—6 antibiotikum-n-hexil-észter
A fenti észterek all. példában leírtakkal analóg módon történő előállítását vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat, infravörös abszorpciós spektrum, proton magmágneses rezonancia spektrum és tömegspektrográfiai vizsgálat bizonyítja.
13. példa
PS—7 antibiotikum-metil-észter
2,0 mg, 9. példa szerint előállított PS—7 antibiotikum-nátrium-só készítményt 1 ml száraz dimetilformamidban szuszpendálunk, majd hozzáadunk a reakcióelegyhez 20 μ! trietilamint és 50 ij.1 metiljodidot. A reakcióelegyet 2 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd az így kapott reakcióelegyből 20 μΐ-t feloldunk metanolban. Ezt a mintát Hitachi Recording Spectrophotometer Model EPS—3T (Hitachi Ltd.) berendezésben vizsgáljuk. Mérjük 321,5 nm-nél az abszorpció növekedését, melyből megállapítható, hogy a reakció mennyire halad előre. A reakció befejeződése után az egész reakcióelegyet beleöntjük 20 ml benzolba, majd ezt követően azonnal kétszer mossuk 10 ml 0,1 M foszfát-puffer-oldattal (pH=7,0). A benzolos oldatot vízmentes nátriumszulfáton dehidratáljuk, majd 35 °C hőmérsékleten csökkentett nyomáson 1 ml mennyiségre pároljuk be. A betöményített oldatot Bio-Beads S—X3 (Bio-Rad Laboratories) oszlopra (1,2x85 cm) visszük és a kromatogramot benzollal kifejlesztjük. A kapott eluátumot vékonyréteg-kromatográfiával fejlesztjük ki [Kieselgel 60 F254; benzol(aceton=2 : 1)]. Az eluátumokat összegyűjtjük és ultraibolya abszorpciós vizsgálattal azonosítjuk a PS—6 antibiotikum-metil-észtert. A frakciókat csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és így színtelen olajos terméket kapunk, melyet feloldunk 1 ml acetonban. Az acetonos oldatot Sephadex LH—20 (Pharmacia
-24179788
Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2 x 85 cm) visszük, melyet előzőleg acetonnal kezeltünk és a kromatogramot acetonnal kifejlesztjük. A fenti módszerrel megállapítjuk, hogy mely frakció tartalmaz PS—7 antibiotikum-metil-észtert és ezeket a frakciókat összegyűjtjük. Az összegyűjtött frakciókat szárazra pároljuk és így 1,0 mg fehér olajos anyagot kapunk, mely a PS—7 antibiotikum-metil-észter.
(1) Vékonyréteg-kromatográfia
Rf=0,44 (Kieselgel 60 F254 lemez; benzol: aceton=2 : 1) (2) Ultraibolya abszorpciós maximum metanolban 230,5 nm, 321,5 nm (3) Molekulasúly (tömegspektrográfia)
C]4H18N2O4S összegképletre számított: 310, 375 760 kapott: 310,37 443
A PS—7 antibiotikum szerkezete és a fenti fizikaikémiai tulajdonságok alapján a PS—7 antibiotikum-metil-észter szerkezete a (Ile) képletnek felel meg.
A 13. példában leírt eljárást megismételjük metiljodid helyett ekvivalens mennyiségű etiljodid, i-propiljodid, i-butiljodid, n-pentiljodid és n-hexil-jodid alkalmazásával, és így az alábbi termékeket kapjuk:
PS—7 antibiotikum-etil-észter
PS—7 antibiotikum-i-propil-észter
PS—7 antibiotikum-i-butil-észter
PS—7 antibiotikum-n-pentil-észter
PS—7 antibiotikum-n-hexil-észter
A fenti észtereknek all. példában leírtakkal analóg módon történő előállítását vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat, infravörös abszorpciós spektrum, proton magmágneses rezonancia spektrum és tömegspektrográfiai vizsgálat bizonyítja.
Mint már fent kifejtettük, valamely PS—6 vagy PS—7 antibiotikumot vagy ezek tritil-észtereit tartalmazó készítményt adagolhatunk szilárd vagy folyékony készítmény alakjában orálisan. Az ilyen szilárd vagy folyékony készítmények adagolási egységei 0,1—99%, előnyösen 10—60% hatóanyagot tartalmaznak. A hatóanyag menynyisége az adagolási formától és a készítmény összsúlyától függően változik, és általában 10—1000 mg, előnyösen 100—1000 mg.
Parenterális alkalmazás esetén az adagolási egység a tiszta, illetve nagytisztaságú PS—6 vagy PS—7 antibiotikum, illetve ezek tritil-észtereinek steril vízben készített oldatai vagy oldható porok, melyekből később készítünk oldatot.
A PS—6 vagy PS—7 antibiotikum nátrium-sóját, illetve tritil-észterét tartalmazó készítményeket az alábbi kiviteli példákkal mutatjuk be közelebbről.
A) példa
Kapszulák
Komponens Mennyiség/kapszula
PS—6 vagy PS—7 antibiotikum (nátrium-só) 100 mg
Laktóz (J. P.) amennyi szükséges
Magnéziumsztearát 1 mg
A hatóanyagot és a hígftószereket mozsárban mozsártörővei jól elkeverjük, így egyenletes eloszlású blendet kapunk. Ebből a blendből 0,02 mg-ot No. 3 kemény zselatin kapszulába töltünk, melyeket bélben oldódó bevonattal vonunk be.
B) példa
Tabletták
Komponens Mennyiség/tabletta
PS—6 vagy PS—7 antibiotikum (nátrium-só) 200 mg
Laktóz (J. P.) 120 mg
Búzakeményítő 175 mg
Magnéziumsztearát 5 mg
500 mg
A hatóanyagból, a laktózból és a fele mennyiségű búzakeményítőből blendet készítünk. A keveréket 10% keményítőt tartalmazó pasztával granuláljuk, majd szitáljuk. Ehhez az anyaghoz hozzáadjuk a búzakeményítő fenn maradó mennyiségét és a magnéziumsztearátot. Az így kapott keverékből tablettákat sajtolunk. A tabletták átmérője körülbelül 1 cm, súlyuk 500 mg. Az így kapott tablettákat először bélben oldódó bevonattal, majd cukorral vonjuk be.
C) példa
Liofilizált készítmények injekciós adagolás céljára
Komponens Mennyiség/ampulla
PS—6 vagy PS—7 antibiotikum 25 mg
Steril desztillált víz (J. P.) 2 ml
A hatóanyagot feloldjuk steril desztillált vízben, a kapott oldatot szűrjük és sterilizáljuk. Az így kapott oldatot steril ampullákba öntjük és a vizet steril körülmények közötti liofilizálással eltávolítjuk.
Parenterális adagolás céljából 2 ml steril fiziológiai konyhasó-oldatot (J. P.) adagolunk az ampullákba.
D) példa
Tabletták
Komponens Mennyiség/tabletta
PS—6 vagy PS—7 antibiotikum
| (nátrium-só) | 20 mg |
| Cefaloridin | 180 mg |
| Laktóz (J. P.) | 120 mg |
| Búzakeményítő | 175 mg |
| Magnéziumsztearát | 5 mg 500 mg |
A PS 6 vagy PS 7 antibiotikumot, a cefaloridint és az adalékanyagokat jól elkeverjük és a B példában leírtakkal analóg módon tablettákat sajtolunk. A tablettákat először bélben oldódó bevonattal, majd cukorral vonjuk be.
-25179788
E) példa
Tabletták
| Komponens | Mennyiség/tabletta 5 | |
| PS—6 vagy PS—7 antibiotikum | ||
| (nátrium-só) | 10 mg | |
| Aminobenzilpenicillin | 190 mg | |
| Laktóz (J. P.) | 120 mg | IC |
| Búzakeményítő | 175 mg | |
| Magnéziumsztearát | 5 mg | |
| 500 mg |
A hatóanyagot feloldjuk steril desztillált vízben és szűréssel sterilizáljuk. Az oldatot ampullákba osztjuk szét és steril körülmények között fagyasztva szárítjuk. A steril szilárd anyagot tartalmazó ampullákat lezárjuk.
Az injekciós adagoláskor 2 ml steril 70%-os Ν(β. -hidroxietil)-Iaktamidot adunk az ampulla tartalmához.
I) példa
Tabletták
A B) példában leírtakkal analóg módon készítjük a
PS—6 vagy PS—7 antibiotikumot és aminobenzilpeni- 15 cillint tartalmazó tablettákat.
F) példa
Kapszulák
| Komponens | Mennyiség/tabletta | * |
| PS—6 vagy PS—7 | ||
| antibiotikum-trietil-észter | 20 mg | |
| Cefaloridin | 180 mg | - |
| Laktóz (J. P.) | 120 mg | |
| Búzakeményítő | 175 mg | |
| Magnéziumsztearát | 5 mg 500 mg |
| Komponens | Mennyiség/kapszula |
| PS—6 vagy PS—7 | |
| antibiotikum-tritil-észter | 100 mg |
| Laktóz | amennyi szükséges |
| Magnéziumsztearát | 1 mg |
A hatóanyagot és a hígítószereket jól elkeverjük, így egyenletes eloszlású keveréket kapunk. A kapott keverékből körülbelül 200 mg-ot No. 3 kemény kapszulába töltünk, melyeket ezután bélben oldódó bevonattal vonunk be.
G) példa
Tabletták
Komponens
Mennyiség/tabletta
PS—6 vagy PS—-7 antibiotikum-tritil-észter 200mg
Laktóz (J. P.) 120mg
Búza keményítő 175mg
Magnéziumsztearát 5mg
500 mg
A hatóanyagból, a laktózból és a fele mennyiségű búzakeményítőből keveréket készítünk. A kapott keveréket 10% keményítőt tartalmazó pasztával granuláljuk, majd szitáljuk. Az így kapott anyaghoz hozzáadjuk a magnéziumsztearátot és a búzakeményítő fennmaradó menynyiségét és a keverékből 1 cm átmérőjű, 500 mg súlyú tablettákat sajtolunk. A tablettákat először bélben oldódó bevonattal, majd cukorral vonjuk be.
H) példa
Liofilizált készítmények injekciós adagolás céljára
Komponens
PS—6 vagy PS—7 antibiotikum-tritil-észter
Steril desztillált víz (J. P.)
Mennyiség/ampulla mg ml
A PS—6 vagy PS—7 antibiotikum-tritil-észterből és a cefaloridinből a G példában leírtakkal analóg módon 25 készítünk tablettát.
J) példa
| 3θ Tabletták Komponens | Mennyiség/tabletta |
| PS—6 vagy PS—7 | |
| antibiotikum-tritil-észter | 20 mg |
| Aminobenzilpenicillin | 180 mg |
| 35 Laktóz (J. P.) | 120 mg |
| Búzakeményítő | 175 mg |
| Magnéziumsztearát | 5 mg |
500 mg
A PS—6 vagy PS—7 antibiotikumból és az arninobenzilpenicillinből az I) példában leírtakkal analóg módon készítünk tablettát.
Claims (11)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás az új (I) általános képletű vegyületek — ahol a képletbenRí jelentése metil-csoport ésR2 jelentése —CH2—CH2-csoport és50 R3 jelentése hidrogénatom, kisszénatomszámú alkilvagy trifenilmetil-csoport — valamint az (I) általános képletű vegyületek — ahol a képletben Rj és R2jelentése a fenti és R3jelentése hidrogénatom — alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium55 vagy aminsóinak az előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces A 271 mikrobatörzset (ATCC 31358), aerob körülmények között tápanyagot tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a tenyésztési talajból a kapott (I) általános képletű vegyületeket — ahol a képletben Rt és 60 R2 jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — izoláljuk, és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületet — ahol a képletben Rt és R2 jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — alkálifém-, alkáliföldfém-, ammó65 nium- vagy amin-sójává alakítjuk át és-26179788 kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületet —- ahol a képletben R, és R2 jelentése a fenti és Rj jelentése hidrogénatom — vagy ennek alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium- vagy aminsóját valamely R3 jelentésének megfelelő észterré alakítjuk át. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)
- 2. Eljárás az új (I) általános képletű vegyületek — ahol a képletbenR| jelentése hidrogénatom,R2 jelentése —CH=CH-csoport ésR3 jelentése hidrogénatom, kisszénatomszámú alkilvagy trifenilmetil-csoport —, valamint az (I) általános képletű vegyületek — ahol a képletben Rj és R2jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium- vagy aminsóinak az előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces A271 mikrobatörzset ATCC 31358 aerob körülmények között tápanyagot tartalmazó táptalajon tenyésztjük, a tenyésztési talajból a kapott (I) általános képletű vegyületeket — ahol a képletben Rj és R2 jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — izoláljuk és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületet — ahol a képletben Rj és R2 jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium- vagy amin-sójává alakítjuk át és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületet — ahol a képletben Rj és R2 jelentése a fenti és R3 jelentése hidrogénatom — vagy ennek alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium- vagy aminsóját valamely Rs jelentésének megfelelő észterré alakítjuk át. (Elsőbbsége: 1977. XII. 29.)
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 4—9 pH értékű közegben 20—40 °C hőmérsékleten végezzük. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)
- 4. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 4—9 pH értékű közegben 20—40 °C hőmérsékleten végezzük. (Elsőbbsége: 1977. XII. 29.)
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusokat vala mely aminosavat vagy szerves savat is tartalmazó táptalajban tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy aminosavként semleges, 2—5 10 szénatomszámú aminosavat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)
- 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy aminosavként valint vagy leucint alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)10
- 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szerves savként 2—10 szénatomos alifás karbonsavat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)
- 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szerves savként n-valeriánsavat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1977. X. 13.)15
- 10. Eljárás baktériumellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (I) általános képletű vegyületből — ahol a képletben Rj, R2és R3 jelentése az 1. igénypontban megadott — vagy valamely (I) általános képletű vegyület — ahol a képlet20 ben R1( R2 és R3 jelentése az 1. igénypontban megadott — sójából, és adott esetben valamely S-laktamáz érzékeny antibiotikumból a gyógyszergyártásban szokásos hordozó és segédanyagokkal kombinálva ismert módon gyógyszerkészítményeket, előnyösen tablettákat,25 szuppozitóriumokat, oldatokat készítünk. (Elsőbbsége: 1977.X. 13.)
- 11. Eljárás baktériumellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 30 (I) általános képletű vegyületből — ahol a képletben Rj, R2és R3 jelentése a 2. igénypontban megadott — vagy valamely (I) általános képletű vegyület — ahol a képletben R(, R2 és R3 jelentése a fenti — sójából, és adott esetben valamely β-laktamáz érzékeny antibio35 tikumból a gyógyszergyártásban szokásos hordozó és segédanyagokkal kombinálva ismert módon gyógyszerkészítményeket, előnyösen tablettákat, szuppozitóriumokat, oldatokat készítünk. (Elsőbbsége: 1977. XI I. 29.)11 db ábraoldal
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12185777A JPS5459295A (en) | 1977-10-13 | 1977-10-13 | Antibiotic ps-6, its derivative and their preparation |
| JP16042477A JPS5492983A (en) | 1977-12-29 | 1977-12-29 | Antibiotics ps-4 and ps-7 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU179788B true HU179788B (en) | 1982-12-28 |
Family
ID=26459119
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU78SA3138A HU179788B (en) | 1977-10-13 | 1978-10-12 | Process for preparing new carbopenem derivatives |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4368203A (hu) |
| EP (1) | EP0001567B1 (hu) |
| CA (1) | CA1113872A (hu) |
| DE (1) | DE2861413D1 (hu) |
| DK (1) | DK145382C (hu) |
| HU (1) | HU179788B (hu) |
| IT (1) | IT1099738B (hu) |
| SU (1) | SU1039446A3 (hu) |
| YU (1) | YU42049B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0005349A1 (en) * | 1978-05-06 | 1979-11-14 | Beecham Group Plc | Alkylcarbapenems, their preparation, use in pharmaceutical compositions and intermediates |
| EP0055990B1 (en) * | 1979-08-10 | 1986-06-11 | Beecham Group Plc | Beta-lactam antibiotics, their preparation and use |
| US5213974A (en) * | 1986-05-20 | 1993-05-25 | Sankyo Company, Limited | Fermentation process for preparing antibiotics mureidomycins A, B, C and D |
| GB8928373D0 (en) * | 1989-12-15 | 1990-02-21 | Erba Carlo Spa | Beta-lactam derivatives |
| ATE429210T1 (de) * | 1998-01-20 | 2009-05-15 | Applied Analytical Ind Inc | Orale flüssige zusammensetzungen |
| US20100069827A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Barry Neil Silberg | Pre-Surgical Prophylactic Administration of Antibiotics and Therapeutic Agents |
| US9446227B2 (en) | 2008-09-12 | 2016-09-20 | Sonescence, Inc. | Ultrasonic dispersion of compositions in tissue |
| WO2015187968A1 (en) | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Sonescence, Inc. | Systems and methods for therapeutic agent delivery |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235922A (en) * | 1979-06-15 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | 3-(2-Aminoethylthio)-6-ethyl-7-oxo-1-azabicyclo [3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid |
-
1978
- 1978-09-26 DE DE7878100993T patent/DE2861413D1/de not_active Expired
- 1978-09-26 EP EP78100993A patent/EP0001567B1/en not_active Expired
- 1978-10-10 US US05/949,854 patent/US4368203A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-10-12 SU SU782673547A patent/SU1039446A3/ru active
- 1978-10-12 DK DK454378A patent/DK145382C/da active
- 1978-10-12 HU HU78SA3138A patent/HU179788B/hu unknown
- 1978-10-12 CA CA313,287A patent/CA1113872A/en not_active Expired
- 1978-10-13 IT IT28782/78A patent/IT1099738B/it active
-
1982
- 1982-09-27 YU YU2151/82A patent/YU42049B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0001567B1 (en) | 1981-12-02 |
| SU1039446A3 (ru) | 1983-08-30 |
| DK145382B (da) | 1982-11-08 |
| DE2861413D1 (en) | 1982-01-28 |
| IT7828782A0 (it) | 1978-10-13 |
| IT1099738B (it) | 1985-09-28 |
| YU215182A (en) | 1983-01-21 |
| CA1113872A (en) | 1981-12-08 |
| DK454378A (da) | 1979-04-14 |
| DK145382C (da) | 1983-04-05 |
| YU42049B (en) | 1988-04-30 |
| EP0001567A1 (en) | 1979-05-02 |
| US4368203A (en) | 1983-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4556559A (en) | Antibiotics | |
| US4110165A (en) | Process for the production of clavulanic acid | |
| US6051703A (en) | Purified clavulanic acid and salts thereof | |
| US4529720A (en) | Antibiotic from Streptomyces clavulicerus | |
| US6218380B1 (en) | Pharmaceutical compositions | |
| US4337199A (en) | Antibiotic β-lactam compounds, production thereof, and their use as antimicrobial agent | |
| US4141986A (en) | Antibiotics 890A2 and 890A5 | |
| HU179788B (en) | Process for preparing new carbopenem derivatives | |
| US4318916A (en) | Antibiotic PS-5 and derivatives having β-lactamase inhibitory activity and production thereof | |
| EP0017246B1 (en) | Antibiotic pa-31088-iv, its salts with bases, a process for its manufacture, pharmaceutical compositions containing this antibiotic, streptomyces tokunonensis pa-31088 and its mutants | |
| US4525353A (en) | Antibiotics | |
| US4426390A (en) | Novel β-lactam compounds, process for producing thereof, and use thereof as medicines | |
| US4451401A (en) | Antibiotics and process for production thereof | |
| EP0002058B1 (en) | 3-(2-aminoethylthio-6-ethyl-7-oxo-1-azabicylo-(3.2.0)-hept-2-en-2-carboxylic acid, process for preparing it and compositions comprising it | |
| US4205068A (en) | β-Lactamase inhibitor EM4615 | |
| SU738517A3 (ru) | Способ получени антибиотика | |
| EP0253413A2 (en) | New antibiotics called "mureidomycins A, B, C and D" A process for their preparation and their therapeutic use | |
| CA1220746A (en) | Luzopeptin e.sub.2 | |
| KR820000513B1 (ko) | β-락타마제 저지활성을 갖는 항생물질 유도체의 제조방법 | |
| CA1076120A (en) | Clavulanic acid esters | |
| JPS6332792B2 (hu) | ||
| JPS6215556B2 (hu) | ||
| JPS6330915B2 (hu) | ||
| JPS6334156B2 (hu) | ||
| JPS60110294A (ja) | β−ラクタマ−ゼ阻害活性を有する抗生物質ＰＳ−５ |