HRP990124A2 - Active hedgehog protein conjugate, process for its production and use - Google Patents

Description

Izum se odnosi na konjugat hedgehog proteina s povišenom aktivnošću, na postupak za njegovu proizvodnju i na njegovu terapeutsku upotrebu.

Pod hedgehog (hh) proteinima podrazumijeva se porodicu izlučenih signalnih proteina koji su odgovorni za tvorbu brojnih struktura u embriogenezi (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193-196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517-520, C. Chiang et al. , Nature 83 (1996) 407, M.J. Bitgood et al. , Curr. Bioi. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al. , Science 273 (1996) 613, C.J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Tijekom biosinteze 20 kD N-terminalna domena i 25 kD C-terminalna domena dobiju se nakon odcjepljenje signalne sekvence i autokatalitičkog cijepanja. U proteinu koji nastaje prirodnim putem N-terminalna domena se modificira s kolesterolom na svom C kraju nakon odcjepljenja C-terminalne domene (J.A. Porter et al., Science 274 (1996) 255-259). U višim oblicima života porodica hh sastavljena je od najmanje tri člana tj. sunčanog/ indijskog i pustinjskog hh (Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Razlike u aktivnosti rekombinantno proizvedenih hedgehog proteina opažene su nakon proizvodnje u prokariotima i eukariotima (M. Hynes et al. , Neuron 15 (1995) 35-44 i T. Nakamura et al. , Biochem. Biophys. Res . Comm. 237 (1997) 465-469.

Hynes et al usporedili su aktivnost hh proteina u supernatantu transformiranih humanih embrionskih bubrežnih 293 stanica (eukariotski hh) s hh proteinom kojeg je proizvela E. coli i našli su četverostruko višu aktivnost hh iz supernatanta bubrežne stanične linije. Kao razlog za tu povišenu aktivnost razmatran je mogući dodatni dopunski faktor koji se umnaža samo u eukariotskim stanicama, post-translacijska modifikacija, različit N-kraj, budući da hh izoliran iz E. coli sadrži 50% hh koji nosi dvije dodatne N-terminalne amino kiseline (Gly-Ser) ili je skraćen za 5 -6 amino kiselina, ili više stanje agregacije (npr. vezanjem na nikal agarozna zrnca).

Nakamura et al. usporedili su aktivnost shh u supernatantu transfomiranih fibroplasta iz pilećeg embrija s shh fuzijskim proteinom izoliranim iz E. coli koji još uvijek ima N-terminalni polihistidinski dio. Shh u supernatantu fibroplasta ima sedmerostruko višu aktivnost u usporedbi s očišćenim E. coli proteinom s obzirom na stimulaciju alkalne fosfataze (AP) u C3H10T 1/2 stanicama. Pretpostavilo se je da do povišene aktivnosti dolazi zbog sinergizma hh s molekulama kao što su koštani morfogenetički proteini (BMPs) koji su prisutni samo u supernatantu eukariotskih stanica i u kombinaciji s hh uzrokuju jaču indukciju AP-a.

Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 opisali su da fibroplasti koji izlučuju hh induciraju ektopijsku tvorbu kosti kod i.m. implatacije na koleganu. Medutim, takova aktivnost nije poznata za izolirani hh protein.

Cilj izuma je osigurati hh proteine (polipeptide) koji u usporedbi s poznatim oblicima imaju značajno poboljšanu aktivnost.

Taj cilj postignut je s rekombinantno proizvedenim hedgehog proteinom koji je na umjetni način učinjen lipofilnim. Takova liofilizacija postiže se ponajprije pomoću kemijske modifikacije. Takav hedgehog konjugat sadrži ponajprije dodatni polipeptid koji je kovalentno povezan (prednosno na C kraju i/ili N kraju) i koji je sastavljen od 10 - 30 ponajprije hidrofobnih amino kiselina i/ili onih amino kiselina koje tvore transmembranske helikse. Dodatni polipeptid posebno prednosno sadrži 2-12 lizina i/ili arginina, ali ne sadrži polihistidinski dio koji bi bio prikladan za čišćenje konjugata na stupcu Ni helata. Također je prednosno kovalentno vezati (ponajprije na C kraju i/ili na N kraju) 1-4 alifatska, zasićena ili nezasićena ugljikovodična ostatka s duljinom lanca od 8 -24 C atoma ili steroide s lipofilnim (hidrofobnim) djelovanjem. Prednosno je, nadalje, na hh proteine kovalentno vezati hidrofobne tio spojeve, takove kao što su posebno tiokolesterol i tioalkani, tioalkeni, preko disulfidnog mosta nastalog oksidacijom (posebno na C kraju i/ili N-kraju i u tom slučaju na N-kraju cisteina).

Protein je hidrofobiziran takovim lipofiliziranjem ostataka koji poboljšava njegovu interakciju s lipidnim membranama eukariotskih stanica, posebno stanica sisavaca.

Konačno, kao lipofilizirani protein prema izumu podrazumijeva se hidrofobizirani protein koji u usporedbi s nemodificiranim proteinom ima povećanu površinsku hidrofobnost koja povisuje njegov afinitet prema nepolarnim molekulama ili amfifilima. Porast stupnja lipofilnosti proteina može se izmjeriti pomoću stupnja inegracije u lipidni sloj kako su opisali Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 30 (1982), 481. Metode za hidrofobno (lipofilizirajuće) modificiranje proteina opisali su, na primjer, Haque, Z. et al., u J. Agric. Food Chem. 31 (1983) 1225-1230; Webb, R.J. et al., Biochemistry 37 (1998) 673-679; Hancock, J.F./ Cell 63 (1990) 133-139; A Practicai guide to membrane protein purification, Izd. G.V. Jagow, Hermann Schagger (1994), (poglavlje 16, str. 535-554).

Iznenađujuće se je pokazalo da takovi lipofilizirani proteini (koji se u nastavku također označavaju i kao hedgehog konjugati (hh konjugati)) pokazuju drastično povišenu aktivnost, ponajprije najmanje deseterostruku, posebno prednosno od 103-105-struko u usporedbi s nemodificiranim hedgehog proteinima (npr. nakon citoplazmičke ekspresije u E. coli) posebno u farmaceutskoj formulaciji i in vitro. K tome, posebno je iznenađujuće da se takovi hedgehog konjugati prema izumu mogu upotrijebiti posebno prednosno za lokalnu terapiju ponajprije na kostima, na kralježnici, na nervnim stanicama (kod nervnih lezija ili kod neurodegenerativnih bolesti) ili u mišićnom tkivu.

Od Yang et al., Development 124 (1997) 4393-4404 poznato je da se za farmaceutski učinkovito djelovanje in vivo visoke lokalne koncentracije hedgehog proteina na strani djelovanja u tijelu moraju održavati tijekom perioda od najmanje 16 sati. Sistem nosača za tu svrhu opisali su Yang et al., t.j. kromatografsko sredstvo Affigel CM napunjeno s hedgehog proteinom, Ni-agarozu su opisali Marti et al. u Nature 375 (1995) 322-325 ili Affigel Blue kojeg su upotrijebili Lopez-Martinez et al. u Curr. Biol. 5 (1995) 791-796, ili čestice heparin agaroze, koje su oni upotrijebili, i koje su manje prikladne za farmaceutsku primjenu, jer su one imunogene i mogu uzrokovati upalne reakcije.

Konjugati prema izumu služe kao nove aktivne tvari za proizvodnju farmaceutskih oblika za davanje. Općenito, vezanje ima za posljedicu poboljšani farmakokinetički profil hedgehog proteina. Hidrofobni ugljikovodični ostatak ima za posljedicu lokalizaciju hedgehog proteina na membrani ciljnih stanica/ dodatno za olakšavanje integracije u unutrašnjost stanice, a iznad svega ima za posljedicu bitno dulju prisutnost na površini stanice što je optimalno za farmakološki učinak.

Konjugati prema izumu ne moraju se nužno dodatno vezati na nosač za polagano oslobađanje. Konjugati prema izumu su također visoko aktivni na strani djelovanja u tijelu bez usporenog oslobađanja tijekom dugog perioda uzrokovanog nosačem (nekoliko dana). Unatoč tome, upotreba farmaceutskog sastava prikladna je za lokalnu primjenu hedgehog konjugata prema izumu koji sadrži konjugat prema izumu zajedno s nosećom matricom. Noseća matrica služi uglavnom za olakšavanje lokalne aplikacije, dajući posebno takav farmaceutski sastav s minimalnom viskoznošću prikladnom za iokalnu aplikaciju. Farmaceutski sastav je prednosno puferiran u pH području između pH 4 i 9 i sadrži jedan ili više neionskih detergenata, kao što su detergenti tipa polisorbata ili polioksietilena (npr. Tween® 20, Tween® 80, Triton® X-100), oktilglukozidni ili ionski detergenti, kao natrijev deoksiholat, natrijev holat, natrijev taurodeoksiholat.

U prednosnoj izvedbi umnaža se hh protein koji dodatno sadrži 10 - 30 uglavnom hidrofobnih amino kiselina na N kraju i/ili na C kraju budući da se one također ugrađuju u membrane stanica [Webb et al., Biochemistry 37 (1998) 673-679, Skolnick et al., Biol. Membranes (1996) 536-554; izd.: Merz & Roux]. Kao hidrofobne amino kiseline u smislu izuma podrazumijevaju se amino kiseline koje imaju negativnu slobodnu energiju u prijelazu iz vodene faze u hidrofobno/organsku fazu. Nadalje N-terminalne i/ili C-terminalne sekvence, za koje se zna da tvore transmembranske helikse, kao npr. M28 peptid ili onaj koji ulazi u interakciju kao heliks s površinom membrana, kao npr. maginin 2 (Skolnick et al., 1966), također su prikladni za povišenje aktivnosti hh proteina.

U daljnjoj prednosnoj izvedbi N kraj i/ili C kraj hedgehog proteina modificiran je s polipeptidnim ostatkom koji sadrži 2-12 lizina i/ili arginina. U tom slučaju može se izostaviti modifikaciju s ugljikovodičnim ostatkom.

Alifatski, zasićeni ili nezasićeni ugljikovodični ostatak s hidrofobnim djelovanjem i lancem duljine 8-24, ponajprije 10-24, a najbolje 12-18 C atoma, je prednosno ostatak zasićene ili jednostruko nezasićene do višestruko nezasićene masne kiselina ili ostatak alkilnog alkohola, po potrebi prekinut s atomom kisika ili sumpora ili s karbonilnom skupinom. Posebno prednosne zasićene masne kiseline jesu kaprinska kiselina, laurinska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina, stearinska kiselina, arahidinska kiselina i beheninska kiselina. Prednosne jednostruko nezasićene masne kiseline jesu miristinska kiselina, palmitoleinska kiselina i oleinska kiselina. Posebno prednosne višestruko nezasićene masne kiseline jesu linoleinska kiselina, linolenska kiselina i arahidonska kiselina. Ostaci takovih masnih kiselina vezani su na reaktivne skupine proteina ponajprije preko esterske veze, preko kiselinskog amida, disulfidne ili tioesterske veze.

Brojni hidrofobni ugljikovodični lanci mogu se prikladno kontrolirati po protinskoj molekuli pomoću uvjeta reakcije (npr. razrjeđivanjem) ili odabirom amino kiseline koju će se modificirati. Na primjer shh sadrži tri cisteina čiji N-terminalni cistein je posebno reaktivan. U tom slučaju reakcija može dovesti do N-terminainog cisteina koji je modificiran s jednim ili s više hidrofobnih ugljikovodičnih ianaca. Takoder se mogu statistički modificirati dva ili gotovo sva tri cisteina. lako je pri modificiranju druge amino kiseline prednosno modificirati definirane amino kiseline, za farmaceutski sastav se također mogu upotrijebiti derivatizirani hedgehog proteini u kojima postoji statistička razdioba modifikacija ugljikovodičnog lanca od pribl. 1 do pribl. 4 lanca po molekuli. lako je prikladan veći broj ugljikovodičnih lanaca po molekuli, time opada topivost farmaceutskog sastava i to može dovesti do smetnji u strukturi aktivnog trodimenzionalnog proteina. Kod povezivanja s alkilnim skupinama dugačkog lanca (C14-C24) prednosno je vezati samo 1-2 ugljikova lanca, a kad se povezuju lanci kratkog ugljikovg lanca, tada je međutim prednosno vezati 2-3 alkilne skupine.

U prednosnoj izvedbi derivatizacija također može obuhvatiti povezivanje dvaju hidrofobnih ugljikovodičnih lanaca na jednu amino kiselinu. To se može postići, na primjer, povezivanjem diglicerida masne kiseline na amino kiselinu.

Kako su hedgehog proteini vrlo nestabilni, u prednosnoj izvedbi za povezivanje se upotrebljava hedgehog protein u kojem je zaštićena SH skupina N-terminalnog cisteina. Proizvod SH povezivanja se zatim dobije redukcijom zaštićenih SH skupina neposredno prije ili tijekom postupka povezivanja. SH skupinu spomenutog cisteina prednosno je zaštititi tvorbom homolognog hedgehog disulfida ili miješanog disulfida (npr. s GSH ili β-merkaptoetanola).

Tiolne zaštitne skupine su poznate u struci, i uključuju ali nisu ograničene samo na trifeniimetil (tritil) i s-t-butil, s-p-nitrobenzil i s-p-metoksi-benzii (vidi npr. Green i Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, drugo izdanje, John Wiley & Sons, New York (1991), i Atherton et al., The Peptides, Gross i Meienhofer, izd. Academic Press, New York (1983), svezak 19, 1-38). Takovi tiolno zaštićeni ili homo-dimerizirani hedgehog proteini su dragocjeni intermedijati za proizvodnju SH-modificiranih hedgehog proteina i predstavljaju glavne predmete predloženog izuma.

Izum se nadalje odnosi na upotrebu hedgehog proteina u kojima su SH skupine N-terminalnog cisteina zaštićene ili homo-dimerizirane kao postojanih intermedijata za proizvodnju SH-modificiranih hedgehog proteina. U tom postupku odcjepljuje se zaštitnu skupinu ili se odcjepljuje homologni dimer i reagira s aktiviranim sredstvom za derivatizaciju.

Za povezivanje SH-zaštićenih hedgehog proteina prednosne su slijedeće metode:

I. Redukcija disulfida ili odcjepljenje zaštitne skupine u mješavini za povezivanje ponajprije kad se povezivanje vrši preko imidazolida ili CoA derivata.

II. Redukcija disulfida, izolacija nezaštićenih monomera u kiseloj sredini i izravno povezivanje u neutralnom području upotrebom aktiviranog disulfida (npr. piridil-SS) kao sredstva za povezivanje.

Pokazalo se je da do dvostrukog aciliranja na N-terminalnom cisteinu dolazi uglavnom pri povezivanju preko imidazolida ili CoA derivata (pribl. 60 - 70%) i u tom slučaju povezani hidrofobni spoj prisutan je u jednom slučaju vezan kao kiselins-ki amid, a u drugom slučaju on je povezan kao tioester. Selektivno odcjepljenje hidrofobnog spoja vezanog u obliku tioestera omogućuje sintezu jednostruko hidrofobiziranog hedgehog proteina. Takovo selektivno odcjepljenje provodi se s redukcijskim sredstvom kao što je DTE ili hidroksilamin.

Povezivanje preko aktiviranog disulfida, kao što su na primjer piridil-SS derivati, dovodi do monoalkilacije. Opisani postupak prema izumu omogućuje brojne hidrofobne tvari kao steroide, ugljikove lance (na primjer masnih kiselina) koji sadrže tiolne skupine koji se povezuju na hedgehog proteine.

Slijedeći daljnji predmet izuma je postupak za proizvodnju SH-modificiranog hedgehog proteina ili njegovog N-terminalnog fragmenta, ponajprije fragmenta koji uglavnom sadrži N-terminalnu domenu, koji je naznačen time da je tiolna skupina N-terminalnog cisteina u hedgehog proteinu zaštićena, na taj način proizveden protein se izolira i nakon odcjepljenja zaštitne skupine hedgehog protein se derivatizira na N-terminalnom cisteinu, prednosno kovalentnim povezivanjem hidrofobnog spoja, kao što je masna kiselina ili steroid, na SH skupinu. Takovo povezivanje je prednosno reverzibilno i može se preusmjeriti fiziolškim redukcijskim uvjetima koji postoje u stanicama sisavaca, što in vivo ima za posljedicu tvorbu ne-hidrofobiziranog hedgehog proteina.

Daljnji glavni predmet izuma je postupak za povezivanje hidrofobnih spojeva na hedgehog proteine ili njegovih fragmenata preko SH skupine N-terminalnog cisteina, koji je naznačen time da je tiolna skupina N-terminalnog cisteina u hedgehog proteinu zaštićena, spomenuta SH skupina se reducira i taj hedgehog protein reagira s aktiviranim derivatom hidrofobnog spoja čime nastaje tiolna veza između hedgehog proteina i hidrofobnog spoja. U prednosnoj izvedbi može se dodatnu molekulu hidrofobnog spoja povezati na hedgeehog protein pomoću amidne veze.

Imidazolidni i CoA derivati hidrofobnih spojeva prikladni su, na primjer, kao aktivirani hidrofobni spojevi. Takovi aktivirani spojevi upotrebljavaju se ponajprije po metodi I (vidi gore).

Piridil disulfidni derivati hidrofobnih spojeva prikladni su također kao aktivirani hidrofobni spojevi.

Takovi aktivirani spojevi upotrebljavaju se ponajprije po metodi II (vidi gore).

Prirodne ili neprirodne zasićene i jednostruko nezasićene ili višestruko nezasićene masne kiseline i posebno zasićene masne kiseline s lancem duljine 4-18, ponajprije 8-18 ugljikovih atoma ili steroidi upotrebljavaju se ponajprije za aciliranje hedgehog proteina imidazolidnim postupkom, pri čemu se dobiju konjugati u kojima ugljikovodični ostaci imaju duljinu lanca od 8-24 C atoma.

Za povezivanje hidrofobnih spojeva s hedgehog proteinima postupkom pomoću piridil disulfida, upotrebljavaju se ponajprije prirodni ili ne-prirodni zasićeni i jednostruko nezasićeni ili višestruko nezasićeni merkaptoalkani, a posebno zasićeni ugljikovi lanci koji sadrže tiolnu skupinu duljine 8-24 C atoma, merkapto steroidi, a posebno tiokolesterol.

Za postupak prema izumu prednosna je upotreba hedgehog proteina pri koncentraciji od 0,01-10 mg/ml, posebno prednosno 3 mg/ml. Koncentracija soli je ponajprije 0-2 mola/l. Upotrebljava se ponajprije natrijev klorid. Molarni omjer reagenta za vezanje na protein prikladno je od 1:2 do 20:1. Prednosni puferi su Hepes pufer, fosfatni pufer i MES pufer. Reakcije povezivanja provode se ponajprije u pH području između 4,5 i 8,5, ponajprije pri pH 6,5-7,5. Vrijeme reakcije ovisi o primijenjenim uvjetima i reakcija pripravljanja dipalmitoiliranog shh traje prikladno od 5 minuta do 5 dana. Reakcija se provodi ponajprije u temperaturnom području između 0 i 40°C. Pri niskim temperaturama, ponajprije pri temperaturama ispod 10°C, npr. pri 4°C nizak je udio sporednih proizvoda.

Za postupak prema izumu posebno je koristan dodatak detergenata. Takovi reagenti mogu biti, na primjer, ionski ili ne-ionski detergenti. Prednosni su amfoterni detergenti. Prednosne su koncentracije od pribl. 0/5-3% (v/v).

Ugljikovodični lanac ili ugljikovodični lanci ili steroidi povezuju se prikladno na reaktivne skupine skupine proteina,- na primjer na slobodne hidroksi, merkapto, karboksi ili amino skupine, preko amidne veze, esterske, disulfidne ili tioesterske veze. Takovi postupci su poznati stručnjaku i opisani su na primjer u Wong, S.S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, Fl., SAD, 1993. Na primjer, masne kiseline mogu se povezati kao tioesteri s koenzimom A (npr. palmitoil koenzim A) preko sukcinamidnog estera ili N-maleimidnim poveivanjem (npr. N-hidroksi sulcinimidni ester palmitinske kiseline) preko anhidrida masne kiseline, imidazolida masne kiseline ili kiselinskog klorida.

Postupke povezivanja za palmitoil-CoA, stearoil-CoA ili miristoil-CoA opisali su, na primjer, Ross et al., J. Neurosci. Res 21 (1988) 35-44, Bizzozero et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 2138-2145, a za tubulin su opisali Ozols, J. et al., Molec. Biol. of the Cell 8 (1997) 637-645. Derivatizacija s anhidridima masnih kiselina opisana je, na primjer, za ovalbumin (Segawa, A., et a., Int. Archs Allergy appl. Immun. 66 (1981) 189-199) ili za peptide (Yadav, S.P. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205 (1994) 1688-1695). Također postoje brojni primjeri za aciliranje sa sukcinimidnim esterima masnih kiselina, npr. za kazein (Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 31 (1983) 1225-1230), (Haque, Z. et al., Agric. Biol. Chem. 46 (1982) 579-599). N-terminalno povezivanje na cistein može se također izvršiti preko aldehidne skupine na partneru fuzije (npr. palmitoil-Cys-CHO) (Lui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6584-6588). N-terminalno povezivanje na serin može se postići pretvorbom u aldehidnu skupinu, reakcijom s hidrazidom (npr. palmitoil-Cys hidrazidom) i stabilizacijom nastalog hidrazona (npr. redukcijom s NaBH3CN) (Gaertner et al., Bioconjugate Chem. 3 (1992) 262-268) .

Hidrofobni ugljikovodični lanac povezuje se ovisno o kemiji povezivanja na primjer u obliku etera, tioetera, estera, tioestera, disulfida ili amida na bočne skupine reaktivnih amino kiselina serina, treonina, glutaminske kiseline, aspartinske kiseline, cisteina, arginina ili lizina. Metode za specifično povezivanje na pojedinačne amino kiseline opisao je Wong, S.S., u Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press Inc., Boca Raton, Fl, SAD (1993) i Lundblad u Techniques in Protein Modification (1995).

U prednosnoj izvedbi izuma, hidrofobni spojevi se solubiliziraju u organskom otapalu ili u mješavini organskog otapala i vode koja sadrži ponajprije više od 10% (v/v) organskog otapala. Takova organska otapala jesu ponajprije dioksan, tetrahidrofuran ili izopropanol. Za povezivanje hidrofobnog spoja i hedgehog proteina takove otopine hidrofobnih spojeva pomiješaju se s otopinom hedgehog proteina koja sadrži detergent, ponajprije u njegovom zaštićenom obliku, na takav način da mješavina sadrži 10% ili manje organskog otapala. Nađeno je da otopine hedgeog proteina koje sadrže više od 10% organskog otapala dovode do taloženja i/ili denaturiranja hedgehog proteina.

U daljnjoj prednosnoj izvedbi tiokolesterol se povezuje na tiolnu skupinu u dotičnom N-terminalnom cisteinu pomoću oksidativno nastalog disulfidnog mosta u prisutnosti detergenta za solubilizaciju, kao što je posebno natrijev deoksiholat, natrijev holat, natrijev taurodeoksiholat, oktil glikozid ili Triton® X-100. Nasuprot N-terminalnom hh fragmentu, koji je modificiran prirodnim putem na C kraju s holesterolom, ovim postupkom dobije se hh oblik koji sadrži tiokolesterol na N kraju. Taj oblik ima sličnu povećanu aktivnost prema prirodnom obliku, ali se može proizvesti mnogo jednostavnije i u većim količinama. Zbog citoplazmične nepostojanosti disulfidnog mosta taj oblik hh nema ili ima samo mali imunogenski utjecaj.

Da se povisi topivost lipofilno modificiranih hh proteina dodatno se prednosno provodi derivatizacija i/ili naknadno čišćenje ili farmaceutska formulacija u prisutnosti topivih anionskih polisaharida kao što su suramin ili heparin.

Kao aktivnost u smislu izuma podrazumijeva se aktivnost alkalne fosfataze koja može inducirati polipeptid u stanicama sisavca (aktivnost u pokusu s alkalnom fosfatazom). Po toj metodi mišja stanična linija fibroplasta uzgaja se u mediju koji sadrži fetalni goveđi serum. Zatim se doda sterilno filtrirani uzorak, stanice liziraju nakon pribl. 5 dana i u staničnom lizatu utvrdi se alkalnu fosfatazu odcjepljenjem kromogenog supstrata (pNP, p-nitrofenol) (J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38-47 i T. Nakamura (1997)).

Prema izumu kao hedgehog protein podrazumijeva se izlučeni signalni protein (19 kD N-terminalna signalna domena) koji je odgovoran za tvorbu brojnih struktura u embriogenezi. Posebno prednosno upotrebljavaju se sunčani, indijski ili pustinjski hh (Fietz M. et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Upotrebljava se ponajprije hh protein sa sekvencom kako je opisana u banci podataka EMBL pod brojem L38518. Proteini hedgehog porodice pokazuju izrazitu homologiju njihovih sekvenci amino kiselina, što je razlog da oni ponajprije umnažaju one nukleinske kiseline koje kodiraju za hedgehog proteine koji su 80% ili više homologni s gore spomenutom sekvencom sunčanog hedgehog proteina (shh). Proteinsku homologiju može se odrediti pomoću računalnog programa Gap ili BestFit (Sveučilište u Wisconsinu; Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970) 443-453; Smith i Watermann, Adv. Appl. Math. 2 (1981) 482-489).

Humani sunčani hedgehog prekurzorski protein sastavljen je od sekvence amino kiselina 1 - 462 opisane u banci podataka EMBL pod brojem L38518. Amino kiseline 1 -23 predstavljaju signalni peptid, amino kiseline 24 - 197 predstavljaju zrelu signalnu domenu, amino kiseline 32 -197 predstavljaju signalnu domenu skraćenu za osam amino kiselina i amino kiseline 198 - 462 predstavljaju samo-preradivačku C-terminalnu domenu nakon autoproteolitskog odcjepljenja. Kao prve amino kiseline (N kraj) ili zadnje amino kiseline (C kraj) N-terminalne signalne domene 24-197 podrazumijevaju se prema izumu prema N kraju ili C kraju hh proteina, na kojem se prednosno odvija povezivanje. Prednosno je povezivanje na jednu ili na nekoliko amino kiselina od prvih ili posljednjih 10 amino kiselina. Posebno prednosno je povezivanje na prvu ili drugu amino kiselinu N-kraja N-terminalne domene (AA 24 ili 25) ili na posljednju ili na pretposljednju amino kiselinu C kraja N-terminalne domene (AA 196 ili 197) . U hedgehog konjugatima prema izumu lipofilne skupine ili ugljikovodični lanac (lanci) posebno prednosno su povezani na N-terminalnu domenu hh proteina, a proizvod povezivanja je posebno tioester ili amid N-terminalnog cisteina na položaju 24 s laurinskom, miristinskom, palmitinskom, stearinskom ili oleinskom kiselinom ili steroid ili je to hh protein na koji je tiokolesterol ili merkaptoalkan/-alken povezan preko disulfidnog mosta. Proizvodnja nemodificiranog hh proteina provodi se prednosno rekombinantno primjenom metoda koje su poznate stručnjacima, ponajprije u prokariotskom (npr. E. coli) sistemu ekspresije. Hedgehog protein se proizvodi prednosno rekombinantno kao fuzijski protein u topivom obliku, izolira se iz supernatanta stanične kulture ili se nakon lize stanica domaćina (ponajprije N kraj) fuzijski dio (npr. poliHys, streptavidin, itd.) odcijepi pomoću sekvencno specifične proteaze kao što je enterokinaza, a slobodna tiolna skupina N-terminalnog cisteina se zaštiti reakcijom s tiolnim zaštitnim reagentom ili dimerizacijom hedgehog proteina disulfidnim premoštavanja na spomenutom cisteinu.

Farmaceutski sastav prema izumu sadrži farmakološki učinkovitu dozu hh konjugata i prednosno se može dati lokalno. Prednosna upotreba konjugata prema izumu je u kombinaciji s drugim hedgehog protinima iz porodice hedgehog ili faktora rasta kostiju, kao što su koštani morfogenetički proteini (BMPs) (Wozney et a., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131-167) ili paratiroidni hormoni (Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277-289) ili inzulinu slični faktori rasta (IGF-I ili II) ili tranformirajući faktori rasta (TGF-β).

U daljnjoj prednosnoj izvedbi, prednost se daje farmaceutskom sastavu hedgehog konjugata prema izumu koji sadrži suramin i on se može korisno upotrijebiti.

U prednosnoj izvedbi farmaceutski sastav hedgehog konjugat koncentracijom od 0,01-10 mg/ml, ponajprije 0/01 do 1 mg/ml.

U prednosnoj izvedbi farmaceutski sastav dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer koje je biološki kompatibilan prednosno u području između pH 4 i pH 10, posebno prednosno u području između pH 6 i 9, a naročito pri pH vrijednosti pribl. 7. Da se spriječi denaturiranje složene strukture i otkidanje cinkovog kompleksa u hedgehog proteinu pH vrijednost farmaceutskog sastava mora biti prikladno viša od pH 4. Koncentracija pufera je ponajprije 1-500 mmolova/1, ponajprije 10-100 mmolova/1. Stoga se dakle u prikladnoj izvedbi kao pufer upotrebljava 20 mmolova/1 kalijevog fosfatnog pufera pH 7,2.

Za proizvodnju farmaceutskog sastava prednosno se nadalje dodaju pomoćne tvari kao šećer (manitol, saharoza, laktoza, glukoza, trehaloza, ponajprije 20-100 mg/ml) ili amino kiselina kao glicin ili arginin kao i antioksidanti kao EDTA, citrat, polietilen glikol (1 - 10% mas. %) , askorbinska kiselina, tokofenol, detergenti, ponajprije neionski detergenti (ponajprije 0,005 - 1 mas. %) kao polisorbati ili detergenti polioskietilenskog tipa (npr. Tween® 20, Tween® 80) ili polioksietilenski ili ionski detergenti kao natrijev holat, natrijev deoksiholat ili natrijev taurodeoksiholat, anti-upalna sredstva, lokalni anestetici, antibiotici i/ili stabilizatori kao lipidi, masne kiseline i glicerol.

Konjugati prema izumu mogu se korisno upotrijebiti za induciranje ili za stimulaciju kondrocita ili osteocita u osteoinduktivnom farmaceutskom sastavu ili također za induciranje mišićnih i nervnih stanica. Osteoinduktivni farmaceutski sastavi poznati su, na primjer, iz US patenta 5,364,839, WO 97/35607 i WO 95/16035.

Aktivnost hedgehog konjugata prema izumu može se ocijeniti in vivo u skladu s Glansbeek, H.L., et al., Laboratory Investigation 78 (1998) 133-142; US patent br. 5,270,300; Toriumi, D.M., et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 117 (1991) 1101-1112; Cook, S.D., et al., J. Bone and Joint Surgery 76-A (1994) 827-837; i Riley, E.H., et al., Clin. Orthopaed. and Realted Research 324 (1996) 39-46.

Kad se konjugat prema izumu daje lokalno prednosno ga je upotrijebiti u kombinaciji s prikladnom matricom kao nosačen i/ili s sekvestracijskim sredstvom. Takova matrica prikladna je za polagano oslobađanje proteina in vivo u aktivnom obliku, posebno u blizini kostiju ili tkiva kralježnice. Sekvestracijsko sredstvo je tvar koja olakšava davanje, na primjer, injekcijom i/ili sprečava ili barem usporava migraciju proteina prema izumu od strane davanje.

Farmaceutski sastav prema izumu sadrži ponajprije polimer (strukturna tvar) koji ima funkciju adhezije na stanice. Takova strukturna tvar je primjerice kolagen.

Biološki kompatibilni/ razgradljivi materijali/ na primjer na osnovi kolagena ili drugih polimera na osnovi poli-mliječne kiseline, poliglikolne kiseline ili kopolimera mliječne kiseline i glikolne kiseline, posebno su prikladni kao matrični materijali. Takove polimerne matrice opisane su, na primjer, u W0 93/00050.

Sekvestracijska sredstva jesu, na primjer, celuloza i materijali slični celulozi i, na primjer, alkil celuloza/ karboksimetil celuloza, hijaluronska kiselina, natrijev alginat, polietilen glikol i polivinil alkohol, od kojih je posebno prednosna hijaluronska kiselina, naročito u farmaceutskom sastavu također i bez noseće matrice.

Slijedeći primjeri, publikacije, protokol sekvenci i slike dalje objašnjavaju izum, čiji smisao zaštite proizlazi iz patentnih zahtjeva. Opisane metode treba podrazumijevati kao primjere koji čak i nakon modifikacija samo opisuju glavni predmet izuma.

Opis slika

Slika 1 prikazuje aktivnost rekombinantnog humanog shh nakon derivatizacije s palmitoil CoA.

Slika 2 prikazuje aktivnost rekombinantnog humanog shh nakon derivatizacije s tiokolesterolom.

Primjer 1

a) Kloniranje humanog sunčanog hedgehog proteina koji je pričvršćen za sidro His-6 kao i za stranu odcjepljenja enterokinaze; ekspresija u E. coli

Za pojačanje zrelog N-terminalnog dijela humanog sunčanog hedgehog proteina (aa 24 - Cys do 197 Gly) iz bilo kojeg željenog plazmida ili odgovarajućih cDNA koje sadrže sunčani hedgehog može se primijeniti slijedeći postupak:

Komadić shh gena koji se širi od unutarnje RsrII strane odcjepljenja pa sve do sekvence koja kodira za amino kiselinu 198 pojačava se pomoću dva prajmera (344 i 345), a istovremeno nekoliko zaustavnih kodona kao i PstI strana odcjepljenja može biti učvršćena na C kraju.

[image]

Fragment DNA pojačan na taj način može se ponovno odcijepiti s RsrII i Pstl, a potreban je u slijedećim stupnjevima (fragment 344/345).

Linker je konstruiran aneliranjem dvaju daljnjih prajmera (346 1 347) pomoću kojih se na N kraju ugrađuje 6 histidinskih ostataka i strana odcjepljenja enterokinaze (EK) :

[image]

Za ekspresiju, PCR fragment 344/345 klonira se zajedno s adapterom 346/347 u vektor odcijepljen s EcoRI/PstI. To se može provesti izravno ili nakon intermedijarnog kloniranja fragmenta 344/345 u drugi vektor. Vektor odcijepljen s EcoRI/PstI mora sadržavati prikladan promotor za ekspresiju u E. coli na kraju EcoRI, ponajprije T5, tac, lac itd. shh ekspresijski plazmidi transfektiraju se u vrstu E. coli prikladnu za ekspresiju. Sistem ekspresije sadrži nadalje nukleinske kiseline koje kodiraju arginin-tRNA^GA/AGG sadržan u prokariotskim stanicama (Brinkmann et al.,Gene 85 (1989) 109-114).

b) Fermentacija

10 1 fermentacija E. coli ekspresijskog klona za hedgehog:

Predkultura pripravljena je iz tipova kultura (premazana ploča ili ampule pohranjene pri -20°) koje se inkubiraju pri 30 - 37°C uz mućkanje. Inokulacijski volumen u slijedećoj višoj dimenziji je u svakom slučaju 1-10 volumnih %. U predkulturu dodan je ampicilin (50 - 100 mg/l), a glavna kultura je odabrana prema gubitku plazmida.

Hranjive tvari koje se mogu upotrijebiti su enzimski probavljiv protein i/ili gljivični ekstrakt kao izvor dušika i ugljika, kao i glicerol i/ili glukoza kao dodatni izvor ugljika. Medij je puferiran na pH 7, a za stabilizaciju procesa fermentacije mogu se dodati metalne soli u fiziološki podnošljivim koncentracijama. Temperatura fermentacije je 25-37°C. Rast se određuje mjerenjem optičke gustoće pri 528 nm. Po isteku perioda fermentacije od pribl. 30 sati biomasu se skupi centrifugiranjem pri zastoju optičke gustoće.

Primjer2

a) Pripravljanje dimernog humanog shh

55 g biomase proizvedene u primjeru 1b lizirano je pomoću visokotlačne preše, centrifugirano i supernatant je apliciran u 50 ml helatinirajuće Sepharose (Pharmacia Biotech) koja je prethodno bila opterećena sa cinkom. shh fuzijski protein je ispran s gradijentom od 0 do 200 mM imidazola u 50 mM Hepesa; 250 mM NaCl; pH 7,4. Frakcije koje su sadržavale shh identificirane su pomoću SDS-PAGE, skupljene i razrijeđene s jednim volumenom 50 mM Hepesa; pH 7,4. Talozi nastali tijekom razrjeđivanja su centrifugirani i supernatant je dijaliziran pri 4°C nasuprot 50 mM Hepesa; pH 7,4. K 500 mg na taj način dobivenog shh fuzijskog proteina dodana je enterokinaza (1:500; masa/masa; Boehinger Mannheim GmbH) i P-ME (do 10 mM) i inkubirano je 16 sati u vodenoj kupelji pri 35°C. Zatim je dodan kruti DTT do koncentracije od 10 mM. Uzorak je apliciran u 166 ml SP-Sepharose (Pharmacia Biotech) i ispran s gradijentom od 0-800 mM NaCl u 20 mM HEPES-u, pH 7,4. Nakon analize vrsnih frakcija pomoću SDS-PAGE skupljene su glavne frakcije, podijeljene u alikvote i do daljnje upotrebe pohranjene su pri -80°C. Te glavne frakcije sadrže shh pod nereducirajućim uvjetima kao dimer, umrežen preko disulfidnog mosta, koji se može reducirati i ima prividnu molekulsku masu od pribl. 38 kDa.

b) Modificiranje inkubacijom pod redukcijskim uvjetima

Dimerni shh (c = 1 mg/ml) reduciran je s 10 ml mM DTE (30 minuta, 25°C) i dijaliziriran je preko noći nasuprot PBS-u koji je sadržavao 0,5 mM DTT-a. Nakon odsoljavanja preko RP-HPLC maseni spektar dijalizata pokazao je da glavnina monomeriziranog shh pokazuje između ostalog (tj . dodatno uz ostale modifikacije koje dovode do proširenja pika u masenom spektru i koje dalje nisu specificirane) adukte od 32±4 Da (dvostruka oksidacija N-terminalnog cisteina) i 47±4 Da. Oblici shh modificirani na taj način ne mogu se ponovno dimerizirati ponovnom oksidacijom. To je pokazalo da je SH skupina N-terminalnog cisteina bila modificirana na postojan način. Posljedica toga je da ta SH skupina nije više sposobna za daljnje reakcije, npr. za tvorbu tioestera i iskorištenje derivatizacije s hidrofobnim spojevima je stoga jako reducirano. Zbog toga se kod aciliranja N-terminalnog cisteina in vitro periodi u kojima je u otopini prisutan reducirani shh moraju držati što je moguće kraćim ili u siučaju prikladne kemije povezivanja, reakcija se mora provoditi u prisutnosti Tris(2-karboksietil) fosfin hidroklorida (TCEP • HC1) jer se tada napadaju samo disuifodni spojeve, ali ne i (aktivirani) tioesteri.

c) Kinetika ponovne oksidacije shh za tvorbu dimera u odnosu prema pH vrijednosti otapala

0,5 ml shh dimera (c = 2,7 mg/ml) monomerizirano je redukcijom intermolekularnog disulfidnog mosta dodatkom 2 mM TCEP-a (Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorid) tijekom 15 minuta pri 25°C. Zatim je uzorak ponovno puferiran pomoću stupca PD-10 (Pharmacia) u PBS-u, pH 7/0 ili PBS-u pH 5,0 i spontana dimerizacija (pri 25°C) analizirana je, nakon odstranjivanja redukcijskog sredstva, ovisno o periodu inkubacije pomoću RP-HPLC.

Rezultati su zbirno prikazani u tablici 2:

Tablica 2

[image]

Može se vidjeti da shh monomer spontano dimerizira. Dimerizacija je vrlo brza pri pH 7,0, dok se pri pH 5,0 ona odvija sa sporijom kinetikom.

Primjer 3

a) Pripravljanje reagenata povezivanje za selektivno aciliranje SH skupina u cisteinima

(I) Imidazolidni postupak

Polazni materijali (imidazolidi) proizvedeni su općim postupkom A, B ili C analogno postupcima opisanim u literaturi (Leksyszyn, J. et al., Synthesis (1978) 478-479; Staab H.A., Angew. Chem. 74 (1962) 407-423; Fahrenholtz, K.E. et al., J. Med. Chem. 17 (1974) 337-342.

Ia) Opći postupak A

10 mmolova odgovarajuće karboksilne kiseline i 10 mmolova 1,l'-karbonildiimidazola otopi se u apsolutnom tetrahidrofuranu i miješa se od 30 minuta do 24 sata pri sobnoj temperaturi. Smjesu se ispari u vakuumu i upotrebljava se bez daljnjeg čišćenja.

Ib) Opći postupak B

10 mmolova odgovarajućeg kiselinskog klorida i 20 mmolova imidazola grije se od 1 do 24 sata pod refluksom u apsolutnom toluenu uz isključenje vlage. Imidazolni hidroklorid, koji tako nastane, se odfiltrira i filtrat se ispari u vakuumu. Ostatak se očisti kromatografijom na silika gelu upotrebom etil acetat/heptana ili prekristalizacijom.

Ic) Opći postupak C

10 mmolova odgovarajuće karboksilne kiseline miješa se od 1 do 48 sati pri sobnoj temperaturi s 10 mmolova dicikloheksilkarbodiimida i 10 ml imidazola u diklormetanu. Kad se ohladi na 0°C tako nastalu ureu se odstrani filtracijom i filtrat se ekstrahira s vodom, osuši preko natrijevog sulfata, ispari u vakuumu i prekristalizira.

Dobiveni su slijedeći imidazolidni derivati masnih kiselina:

1-imidazol-l-il-heksan-l-on (bezbojno ulje; iskorištenje 66%),

1-imidazol-1-il-oktan-1-on (bezbojni kristali; iskorištenje 59%),

1-imidazol-1-il-dekan-1-on (bezbojni kristali; iskorištenje 79%) ,

1-imidazol-1-il-dodekan-1-on (bezbojni kristali; iskorištenje 86%),

1-imidazol-1-il-tetradekan-1-on (bezbojni kristali; iskorištenje 52%) ,

1-imidazol-1-il-heksadekan-1-on (bezbojni kristali; iskorištenje 70%) ,

17-(4-imidazol-1-il-metil-4-okso-butil)-10,13-dimetil-dodekahidro-ciklopenta[a]fenantren-3,7,12-trion), (bezbojni kristali; iskorištenje 56%),

4-(10,13-dimetil-heksadekahidro-ciklopenta[a]fenantren-17-il)-1-imidazol-l-il-pentan, (bezbojni kristali; iskorištenje 71%).

(II) Piridil sulfidni postupak

Polazni materijali (piridil disulfidi) proizvedeni su općim postupkom A u skladu s opisom iz literature (Lee, S. et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 64 (1991) 2019-2021). 10 mmolova odgovarajućeg merkaptana i 10 mmolova 2,2 ́-ditio-piridina otopi se u 30 ml apsolutnog diklormetana i miješa se 6 do 24 sata pri sobnoj temperaturi. Otapalo se odstrani u vakuumu i k ostatku se doda dietil eter i profiltrira se. Filtrat se ispari u vakuumu i očisti kromatografijom na silika gelu upotrebom etil acetat/heptana.

Dobiveni su slijedeći spojevi:

2-decildisulfanil piridin (bezbojno ulje; iskorištenje 76%),

2-heksadecildisulfanil piridin (bezbojni kristali; iskorištenje 76%),

2-{17-(1,5-dimetil-heksil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]-enantren-3-il-disulfanil)-piridin} (bezbojni kristali; iskorištenje 56%).

b) Pripravlajnje palmitoiliranog rekombinantnog humanog shh upotrebom palmitoil imidazolida

Kao edukt upotrijebljen je dimerni nemodificirani rekombinantni humani shh u skladu s primjerom 2. Protein je bio u PBS puferu (10 mM pufera natrijevog fosfata, 150 mM NaCl, pH 7,4) pri koncentraciji i od 3 mg/ml. U 2 ml tog uzorka dodan je detergent, prednosno 200 μl 10%-tne otopine Zwittergenta 3-14. Zatim je dodan tri (2-karboksietil)fosfin (TCEP) do koncentracije od 2mM. Nakon 15 minuta inkubacije pri sobnoj temperaturi dodano je 50 μl 60 mM otopine palmitoil imidazolida (1-imidazol-l-il-heksadekan-l-on) u dioksanu. Otopina je inkubirana 1-3 dana prednosno pri 4°C uz mućkanje.

Pod tim uvjetima nastao je dipalmitoilirani shh kao glavni proizvod (70 - 75%), koji je identificiran kao uzorak 6 pomoću RP-HPLC i masenom spektrometrijom. shh modificiran na taj način pokazao je mnogo višu biološku aktivnost nego nemodificirani shh u pokusu ispitivanja aktivnosti opisanom u primjeru 7. Polu-maksimalna aktivnost dobivena je pri 70 ng/ml.

Tip upotrijebljenog detergenta ima glavni utjecaj na dobitak dipalmitoiliranog shh i razinu biološke aktivnosti(tablica 1).

Tablica1 Utjecaj upotrijebljenog detergenta na udio dipalmitoiliranog shh u reakcijskoj smjesi (provedeno pri sobnoj temperaturi). Metoda za brojčano utvrđivanje data je u primjeru 6.

[image]

c) Pripravljanje alkiliranog rekombinantnog humanog shh upotrebom 2-heksadecildisulfanilpiridina

Kao edukt je upotrijebljen dimerni nemodificirani rekombinantni humani shh u skladu s primjerom 2a. Protein je bio u PBS puferu (pufer 10 mM natrijevog fosfata, 150 mM NaCl, pH 7,4) pri koncentraciji od 3 mg/ml. Da bi se dobio mnomer nakon dodatka 2 mM TCEP-a inkubirano je 15 minuta. Zatim je TCEP odstranjen pomoću stupca PD-10 uravnoteženog u puferu 5 mM kalijevog fosfata, 150 mM NaCl, pH 5,0. Alikvoti od 200 μl shh, proizvedenog na taj način, upotrijebljeni su za provedbu reakcije s 2-heksadecil-disulfanil-piridinom primjenom dviju različitih metoda.

A) K shh monomeru doda se 20 μl 10%-tne otopine Zwittergenta 3-14; 20 μl 0,5 M HEPES-a, pH 7,0, i jednostruki do dvadeseterostruki molarni suvišak reagenta za povezivanje (otopljen u dioksanu, 60 mM) .

B) K shh monomeru doda se 2 μl 10%-tnog natrijevog deoksiholata, 20 μl pufera 1M kalijevog fosfata, pH 7,6, i dvostruki do dvadeseterostruki molarni suvišak reagenta za povezivanje (otopljenog u metanolu, 60 mM).

U obje inačice reakcija je bila gotova za 15 minuta.

Deseterostruki molarni suvišak reagenta za povezivanje u inačici A) imao je za posljedicu udio od 43%, a u inačici B) udio od 47% mono-alkiliranog shh u reakcijskoj smjesi. U inačici A biološka aktivnost bila je jako povišena u usporedbi s nemodificiranim shh, a polu-maksimalna aktivnost bila je 200 ng/ml shh. Jednostruki molarni suvišak 2-heksadecildisulfanilpiridina dao je samo malo niža iskorištenja. Inačica B također je dovela do povišenja aktivnosti u usporedbi s nemodificiranim shh, ali i do manjeg dometa: s jednakom količinom proteina postignuto je samo 30% biološke aktivnosti. Stoga se prednost daje inačici A.

d) Čišćenje alkiliranih shh derivata

Proizvod povezivanja razrijeđen je 1:4 u 50 mM HEPES-u, 0,1% Tweena® 80, pH 7,4 i zatim je ispran pomoću SP-Sepharose HP (Pharmacia).

Ravnotežni pufer: 50 mM HEPES, 0,2% Tweena® 80, pH 7,4; pufer za ispiranje: 50 mM HEPES, 0,2% Tweena® 80, pH 7,4 koji je sadržavao 0,8 M NaCl gradijent za ispiranje (volumen stupca 2 x 6) i diskontinuirano ispiranje.

U slučaju dipalmitoiliranog shh bilo je moguće odvojiti suvišak palmitoil-imidazolida i djelomično odvojiti nemodificirani shh. U slučaju modifikacije s 2-heksadeksildisulfanilpiridinom dobiveno je značajno obogaćenje monopalmitiliranog shh od 75%. Modificirani shh mogao se je, na primjer, dalje očistiti pomoću heparin Sepharose.

Primjer 4

a) Pripravljanje palmitoiliranog rekombinantnog humanog shh upotrebom plamitoil-CoA:

2 ml očišćenog dimernog shh uzorka s koncentracijom shh od 0,35 mg/ml pomiješano je s DTE na krajnju koncentraciju od 20 mM, inkubirano je 2 sata pri 37°C i zatim je dijalozirano nasuprot

a) 50 mM Tris/HCl, 1 mM DTE, 0,1 mM ZnCl;,, 0,5% Triton® X-100, pH 8,5,

b) 100 mM MOPS, 1 mM DTE, 0,1% Triton® X-100, 0,1 mg/ml suramin, pH 7,4,

c) 100 mM MOPS, 1 mM DTE, 0,1% Triton® X-100, pH 7,4.

Zatim su u alikvote od 0,5 ml uzorka dodani različiti volumeni otopine palmitoil-CoA (10 mg/ml u 100 mM MOPS/ 1

mM DTT, 0,2% Triton®X-100, pH 7,6), čime su u mješavini dobivene koncentracije palmitoil-CoA od

1) 0 μM,

2) 5 0 μM,

3) 500 μm,

nakon čega su inkubirani 1 sat pri 37°C. Za stanično ispitivanje, prije filtracije i razrjeđivanja 1/200, uzorci su pomiješani s BSA (krajnja koncentracija 1 mg/ml) i suraminom (krajnja koncentracija 0,1 mg/ml). S gornjim uzorcima ispitivanje aktivnosti, kako je opisano u primjeru 7 za shh, pokazalo je da uzorci shh inkubirani u puferima b) i c) , koji sadrže 500 μM palmitoil-CoA, pokazuju značajno povišenje biološke aktivnosti (usporedi sliku 1) u usporedbi s mješavinama bez palmitoil-CoA. Na taj način palmitoilirani shh može se očistiti metodama koje su bile opisane za membranske proteine, npr. u ``A practical Guide to Membrane Protein Purification" (1994; izd. Jagow & Schlager; Academic Press) ili u Europskoj patentnoj prijavi br. 98 102 095.1.

b) Ovisnost acilacije o shh koncentraciji i molarnom omjeru između shh i palmitoil-CoA (Pal-CoA)

Dimerni shh (u PBS-u) razrijeđen je s PBS-om na c = 150 μM ili na 37,5 μM i dodan je Tween® 80 (krajnja koncentracija 0,05%), DTE (3 mM krajnja koncentracija) i TCEP (krajnja koncentracija 1mM). Zatim su dodane utvrdene količine Pal-CoA (20 mM u vodi) i smjesa je inkubirana preko noći pri 25°C. Uzorci su analizirani pomoću RP-HPLC ili različitih razrjeđenja u staničnom ispitivanju nakon razrjeđivanja u PBS-u, 1 mg/ml BSA, 0,05% Tveen® 80 pH 7,3 i sterilne filtracije. Rezultati su zbirno prikazani u tablici 3:

Tablica 3

[image]

*EC50 je koncentracija shh koja se mora upotrijebiti da bi se u staničnom ispitivanju postiglo poli-maksimalnu indukciju alkalne fosfataze. Zbog razlika u broju prolaza stanica, i stoga promjena u staničnoj fiziologiji, ova vrijednost može biti malo različita između pokusa provedenih u različita vremena. ;Umjereni suvišak reagenta za povezivanje (< od pedeseterostrukog) uglavnom dovodi do tvorbe shh derivata dvostruko aciliranog na N-terminalnom cisteinu. S povećanjem omjera Pal-CoA prema shh, u povišenom opsegu nastao je shh koji je bio palmitiliran više nego dvostruko. Palmitiliranje s više od dva ostatka masne kiseline takoder povisuje aktivnost. S koncentracijom shh od 37,5 μM, što se tiče aktivnosti optimlan je pribl. deseterostruki suvišak Pal-CoA. Pri shh koncentracij i od 150 p,M trostruki suviša Pal-CoA već dosiže visoko iskorištenje dvostruko palmitiliranog shh i visoku aktivnost. ;c) Ovisnost aciliranja o tipu i koncentraciji detergenta. ;Dimerni shh u PBS-u pri pH 7,4 bio je namješten na koncentraciju od 0,75 mg/ml i pomiješan u utvrđenim količinama dotičnih detergenata, te u svakom slučaju s 500 ;pM Pal-CoA i 3 mM DTE-a ili 3 mM TCEP-a (krajnja koncentracija). Smjese za povezivanje inkubirane su preko noći pri 25°C i zatim su analizirane pomoću RP-HPLC ili staničnim pokusom upotrebom različitih razređenja, nakon razređenja u PBS-u, 1 mg/ml BSA, 0,05% Tween® 80, pH 7,3 i nakon sterilne filtracije. ;Rezultati su zbirno prikazani u tablici 4: ;Tablica 4 ;[image] ;pal. = palmitilirano ;*Reduciran s 3 mM TCEP-om umjesto s 3 mM DTE-om.

Pokazalo se je da se upotrebom Tweena®80 ili 0,5%-tnog oktil glikozida mogu dobiti visoki omjeri palmitiliranja; također je i palmitiliranje u 0,05%-tnom Zwittergentu dovelo do visokog povećanja aktivnosti. Istovremena redukcija s TCEP-om dovela je do sličnih rezultata kao redukcija s DTE-om.

d) Aciliranje reduciranog, monomernog shh u odnosu prema pH vrijednosti smjese za povezivanje

Dimerni shh (c = 0,7 mg/ml) reduciran je s 10 mM DTE i

dijaliziran preko noći nasuprot PBS-u, 0,05 %-tnom Tweenu® 80, 0,5 mM DTE-u. Dijalizat je namješten na krajnju koncentraciju c = 0,25 mg/ml i na dotičnu pH vrijednost s PBS-om, 0,05%-tnim Tweenom® 80, 0,5 mM DTE i dodano je 125

μl Pal-CoA. Smjesa je inkubirana 2 sata pri 37°C i zatim je analizirana u razređenju od 1:500 u staničnom pokusu. Aktivnost uzoraka zbirno je prikazana u tablici 5 kao stimulacija AP aktivnosti u odnosu prema bazalnoj aktivnosti nestimuliranog C3H10T1/2 stanica (= 100%):

Tablica 5

[image]

Maksimalna aktivacija događa se prema tome pri neutralnoj do slabo lužnatoj pH vrijednosti.

e) Povezivanje acil-CoA derivata koji sadrže acilne skupine koje imaju različite duljine ugljikovog lanca Dimerni shh namješten je na koncentraciju od 0,75 mg/ml u PBS-u, 0,05% Tweenu® 80, pH 7,4, 3 mM DTE i dodano je 0,5 mM dotičnog acil-CoA derivata i inkubirano preko noći pri 25°C. Uzorci su analizirani pomoću RP-HPLC ili primjenom staničnog ispitivanja pri različitim razređenjima, nakon razređenja u PBS-u, 1 mg/ml BSA, 0,05%-tnom Tweenu® 80 pH 7,3 i nakon sterilne filtracije. Pomak u zadržavanju na RP-HPLC kao i dobitak diaciliranog shh i aktivnost u staničnom ispitivanju zbirno su prikazani u tablici 6.

Tablica 6.

[image]

To pokazuje da se acilne skupine s različitim duljinama lanca mogu učinkovito prenijeti primjenom metode u kojoj se upotrebljavaju derivati Pal-CoA. Koncentracija detergenta, kao i tip upotrijebljenog detergenta zahtjeva fino optimiranje ovisno o duljini lanca prenesenog acilnog ostatka. Smanjenje duljine lanca acilnog ostatka ili smanjenje broja nezasićenih ugljikovih veza dovodi do smanjenja specifične aktivnosti aciliranih shh derivata.

Primjer 5

a) Derivatizacija rekombinantnog humanog shh s tiokolesterolom

Da bi se shh modificirao pomoću tiokolesterola povezanog na aminoterminalni cistein preko disulfidnog mosta, reducirani monomerni shh pri koncentraciji od 0,66 mg/ml u 0,5 mM DTT oH 7,0 razrijeđen je u omjeru 1:3 u slijedećem reakcijskom puferu:

100 mM etanolamina

100 mM NaCl

50 μM CuCl2

pH 9,5

0,8 %-tni (masa/volumen) natrijev deoksiholat ili 0,4%-tni (masa/volumen) natrijev holat ili l,3%-tni (masa/volumen) n-oktil glikozid ili 0,3%-tni Triton®X-100.

Reakcija je započeta dodatkom (krajnje koncentracije): 5% (v/v) acetona ili 100 μM tiokolesterola (iz 10 mM otopine u acetonu) ili 500 μM tiokolesterola (iz 10 mM otopine u acetonu) i smjesa je mućkana 30 minuta pri sobnoj temperaturi.

Neposredno prije sterilne filtracije uzorci su razrijedeni s devet volumena 20 nM natrijevog fosfata, 0,9% NaCl, 0,05% Tveena® 80, 1 mg/ml suramina, pH 7,2 i analizirani su u staničnom pokusu u dodatnom razređenju 1/20.

Kako je prikazano na slici 2, povećanje aktivnosti koje ovisi o koncentraciji tiokoleserola, koja je bila najučinkovitija, dobivena je ili stabilizirana u uzorcima koji su sadržavali anionske detergente.

b) Derivatizacija rekombinantnog humanog shh s tiokolesterol piridil disulfodom

Da bi se shh modificirao s tiokolesterolom povezanim na aminoterminalni cistein preko disulfodnog mosta, shh dimer koji je bio kovalentno povezan između N-terminalnih cisteina preko disulfidne veze reduciran je pomoću 2 mN TCEP-a tijekom 15 minuta pri sobnoj temperaturi i zatim je ponovno puferiran da se odvoji redukcijsko sredstvo pomoću stupca PDIO (Pharmacia). Za povezivanje koncentracija shh namještena je na c = 1 mg/ml s PBS-om, pH 5. pH je bio namješten na neutralno do slabo lužnate pH vrijednosti (npr. pH 7,6) dodatkom koncentrirane otopine pufera (npr. 40 volumnih postotaka 0,4 M Na fosfata, pH 9,2) i neposredno zatim najprije je dodan detergent i zatim je dodan reagent za povezivanje (5 mM tiokoiesterol piridil disulfid) otopljen u organskom otapalu (npr. u metanolu, 40°C). Reakcijska smjesa je inkubirana nekoliko sati pri sobnoj temperaturi i zatim je analizirana pomoću HPLC i masenom spektrometrijom ili su različita razređenja bila upotrijebljena u staničnom pokusu nakon razređenja u PBS-u, 1 mg/ml PBS-a, 1 mg/ml BSA, 0,05% Tween® 80 pH 7,3 i nakon sterilne filtracije.

Rezultati za neke uzorke smjesa za povezivanje zbirno su prikazani u tablici 7.

Tablica 7

[image]

Kako se vidi u tablici 7, pod prikladnim uvjetima i s iskorištenjem većim od 50% može se proizvesti disulfidno povezan tiokolesterolni derivat shh koji u staničnom pokusu ima najmanje 10% specifične aktivnosti dipalmitiliranog shh.

Primjer 6

Karakterizacija pripravka povezivanja shh s tiokoiesterol piridil disulfidom pomoću RP-HPLC i masenom spektrometrijom

100 μl pripravka povezivanja dijaliziranog nasuprot PBS-u, 0,05%-tnom Tweenu 80, koji sadrži 0,7 mg/ml shh, 1% natrijevog holata, 250 μM tiokolesterol piridil disulfida, pH 7,6 stavljeno je na butilni stupac 1 x 150 mm (VydacTM 214TP5115) koji je bio uravnotežen u 18%-tnom acetonitrilu, 0,1% trifluoroctenoj kiselini (TFA). Razrijeđen je pri 25°C u gradijentu 18-19% acetonitrila u 0,1% TFA. Eluat je podijeljen i analiziran s jedne strane kontinuiranom detektcijom apsorbancije pri 220 nm i s druge strane kontinuiranom elektrosprejnom masenom spetrometrijom (API100, Sciex; namještani parametri: polazna masa (m/z) 900 jedinica atomske mase (amu), zaustavna masa (m/z) 1500 amu, stupanj 0,3 amu, vrijeme zadržavanja 0,5 ms, ulazni napon 30 V) . Reducirani monomerni shh i ponovno oksidirani dimerni shh s masom od 19560 Da i 39120 Da isprani su pri 18 min (42-44% acetonitrii) , disulfidno umreženi shh, koji sadrži tiokolesterol, s masom od 19962,7 Da ispran je pri 24,5 min (48,5% acetonitril).

Primjer 7

Indukcija alkalne fosfataze u staničnom pokusu (određivanje aktivnosti alkalne fosfataze)

5000 stanica mišje mezenhimalne pluripotentne linije C3H10T1/2 (ATCC CCl-226) zasijano je u svaku jamicu

mikrotitarske ploče s 96 jamica. Stanice su bile u 100 μl DMEM-a, 2 mM glutamina, 100 IU/ml penicilina, 100 μg/ml streptomicina i 10% fetalnog telećeg seruma, FCS. Slijedećeg dana dodane su ispitne aktivne tvari u prikladnim koncentracijama u volumenu od 100 μl, nakon razređvanja u mediju za kulturu. Ispitivanje je zaustavljeno nakon 5 dana. U tu svrhu supernatant je odbačen i stanice su isprane jednom s PBS-om. Stanice su lizirale u 50 μl 0,1% Tritona® X-100 i zamrznute pri -20°C. Nakon otapanja 25 μl je upotrijebljeno za određivanje proteina, a 25 μl je upotrijebljeno za određivanje aktivnosti alkalne fosfataze.

Određivanje proteina prema uputama proizvodača Pierce:

75 μl redestilirane vode doda se k mješavini, zatim se doda 100 μl BCA proteinskog reagenta (Pierce Micro BCA, br. 23225). Nakon 60 minuta izmjeri se optičku gustoću (OD, e. optical density) pri 550 nm.

Aktivnost alkalne fosfataze prema uputama proizvodača Sigma:

100 μl reakcijskog pufera (Sigma 221) doda se k pripravku. Kapsulu supstrata (Sigma 104-40) otopi se u 10 ml redestilirane vode i zatim se s pipetom u mješavinu doda 100 μl . OD se izmjeri pri 405 nm nakon žutog obojenja. U reakciji alkalna fosfataza pretvara p-nitrofenil fosfat u p-nitrofenol.

Svaka optička gustoća bila je preračunata pomoću standardnih krivulja u nmol ili u μg. Ocjena aktivnosti data je u skladu s formulom:

nmol PNP po (izmjerenoj) minuti po mg (staničnog) proteina.

Literatura:

A Practical guide to membrane protein purification, Ed. G. v. Jagow, Hermann Schagger

(1994), Chapter 16, pp. 535 - 554

Asahina, J., Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38 - 47

Atherton et al., The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York (1983), Vol. 19,1-38

Bitgood, MJ. et al, Curr. Biol. 6 (1996) 296

Bizzozero et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 2138 - 2145

Brinkmann et al., Gene 85 (1989) 109-114

Chiang, C. et al., Nature 83 (1996) 407

Cook, S.D., et al., J. Bone and Joint Surgery 76-A (1994) 827-837

European Patent Application No. 98 102 095.1

Fahrenholtz, K.E. et al, J. Med. Chem. 17 (1974) 337-342

Fietz, M. et al, Development (Suppl.) (1994) 43-51

Gaertner et al., Bioconjugate Chem. 3 (1992) 262-268

Glansbeek, H.L, et al, Laboratory Investigation 78 (1998) 133-142

Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, second edition, John Wiley & Sons, NewYork(1991) Hancock, J.R, Cell 63 (1990) 133 - 139

Haque, Z. et al, Agric. Biol. Chem. 46 (1982) 597 - 599

Haque, Z. et al, J. Agric. Food Chem. 30 (1982) 481

Haque, Z. et al., J. Agric. Food Chem. 31 (1983) 1225 - 1230

Hynes, M. et al, Neuron 15 (1995) 35 - 44

Karablis et al, Genes and Development 8 (1994) 277 - 289

Kinto et al, FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323

Lai, C.J. et al, Development 121 (1995) 2349

Lee, S. et al, Bull Chem.Soc. Jpn. 64 (1991) 2019-2021

Leksyszyn, J. et al., Synthesis (1978) 478-479

Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6584 - 6588

Lopez-Martinez et al. in Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796

Lundblad, Techniques in Protein Modification, CRC Press, Boca Raton, FL, USA (1995)

Marti et al, Nature 375 (1995) 322 - 325

Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469

Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970) 443-453

Ozols, J. et al, Molec. Biol. Of the Cell 8 (1997) 637 - 645

Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517 - 520

Porter, J.A. et al., Science 274 (1996) 255 - 259

Riley, E.H., et al., Clin. Orthopaed. and Related Research 324 (1996) 39-46

Ross et al, J. Neurosci. Res. 21 (1988) 35 - 44

Segawa, A. et al., Int. Archs Allergy appl Immun. 66 (1981) 189 - 199

Skolnick et aL, Biol. Membranes (1996) 536 - 554; ed.: Merz and Roux

Smith, J.C, Cell 76 (1994) 193 - 196

Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981) 482-489

Staab H.A., Angew. Chem. 74 (1962) 407-423

Toriumi, D.M., et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 117(1991) 1101-1112

US-Patent No. 5,270,300

US-Patent 5,364,839

Vortkamp, A. et al., Science 273 (1996) 613

Webb, RJ. et al., Biochemistr/ 37 (1998) 673 - 679

WO 93/00050

WO 95/16035

WO 97/35607

Wong, S.S.,Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, USA, 1993

Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993), Academic Press Inc., 131 - 167

Yadav, S.P. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205 (1994) 1688 - 1695

Yang et al., Development 124 (1997) 4393 - 4404

[image]

[image]

Claims (13)

1. Hedgehog konjugat, naznačen time, da sadrži: a) polipeptid sastavljen od 10 do 30 hidrofobnih amino kiselina i/ili amino kiselina koje tvore transmembranske helikse i imaju pozitivan naboj, b) 1 do 4 alifatska, zasićena ili nezasićena ugljikovodična ostatka s duljinom lanca od 8 do 24 C atoma i s hidrofobnim djelovanjem, ili c) hidrofobni tio spoj kovalentno povezan na hedgehog protein.

2. Hedgehog konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da polipeptid sadrži 2 do 12 lizina i/ili arginina.

3. Hedgehog konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da ugljikovodični ostatak je ostatak masne kiseline ili ostatak alkil alkohola koji je povezan kao ester, tioester, kiselinski amid ili disulfid.

4. Hedgehog konjugat prema zahtjevu 3, naznačen time, da masna kiselina je laurinska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina, stearinska kiselina, arahidinska kiselina, beheninska kiseiina^ palmitoleinska kiselina, oleinska kiselina, linoleinska kiselina, linolenska kiselina ili arahidonska kiselina.

5. Hedgehog konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da hidrofobni tio spoj je tiokolesterol.

6. Hedgehog konjugat prema zahtjevima 1 do 5/ naznačen time, da je ugljikovodični ostatak, polipeptid ili tio spoj povezan na C kraj i/ili na N kraj hedgehog proteina.

7. Postupak za proizvodnju hedgehog konjugata prema zahtjevima 3 ili 4 i 6, naznačen time, da je ugljikovodični ostatak povezan kovalentno na slobodnu hidroksi, merkapto, karboksi ili amino skupinu hedgehog proteina.

8. Postupak za proizvodnju hedgehog konjugata prema zahtjevima 1 do 6 kovalentnim povezivanjem ugljikovodičnog ostatka ili hidrofobnog tio spoja na hedgehog protein, naznačen time, da se kovalentno povezivanje ugljikovodičnog ostatka, polipeptida ili hidrofobnog tio spoja i/ili izolacija provode u prisutnosti suramina, heparina, anionskog polisaharida ili detergenta.

9. Postupak za proizvodnju hedgehog konjugata prema zahtjevima 1 do 6 kovalentnim povezivanjem ostatka masne kiseline ili hidrofobnog tio spoja na hedgehog protein, naznačen time, da se palmitoil-CoA ili palmitoilimidazolid upotrebljava kao reagent za povezivanje masne kiseline, a kao hidrofobni tio spoj upotrebljava se tiokolesterol ili ugljikovi lanci koji sadrže tiolnu skupinu.

10. Farmaceutski sastav, naznačen time, da sadrži hedgehog konjugat prema zahtjevima 1 do 6 u farmaceutski učinkovitoj količini kao i farmaceutske pomoćne tvari, detergente, stabilizatore, matrične materijale, suramin, heparin, anionske polisaharide i/ili sekvesticijska sredstva.

11. Postupak za proizvodnju farmaceutskog sastava, naznačen time, da se hedgehog konjugat prema zahtjevima 1 do 6 upotrebljava kao glavni sastojak tog sastava.

12. Hedgehog protein, naznačen time, da je tiolna skupina N-terminalnog cisteina povezana na tiolnu zaštitnu skupinu ili je spomenuti hedgehog protein homodimer pri čemu su N-terminalni cisteini umreženi preko disulfidnog mosta.

13. Upotreba hedgehog proteina prema zahtjevu 12, naznačena time, da se on koristi za proizvodnju hedgehog konjugata koji sadrži a) polipeptid sastavljen od 10 do 30 hidrofobnih amino kiselina i/ili amino kiselina koje tvore transmembranske helikse i imaju pozitivan naboj, b) 1 do 4 alifatska, zasićena ili nezasićena ugljikovodična ostatka s duljinom lanca od 8 do 24 C atoma i s hidrofobnim djelovanjem, ili c) hidrofobni tio spoj kovalentno povezan na hedgehog protein.