HRP920198A2 - Mutants or variants of bacillus thuringiensis producing high yields of delta toxin - Google Patents

Description

Oblast tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na mutante i varijante Bacillus thuringiensis - a koji proizvode visoki prinos delta endotoksina za biološku kontrolu insekata štetočina zbog čega nalazi primjenu u agronomiji.

Definiran tehnički problem

Predmet ovog pronalaska je da osigura mutante i varijante Bacillus thuringiensis - a koji proizvode visoke prinose delta endotoksine.

Stanje tehnike

Komercijalni preparati Bacillus thuringiensis - a se koriste širom svijeta za biološku kontrolu insekata štetočina. Prednosti ovih bakterioloških insekticida se sastoje u visokoj selektivnosti za ograničeni broj insekata i razlažu se u prirodi.

Komercijalne pripreme Bacillus thuringiensis - a se mogu primijeniti sve do žetve bez štetnih efekata.

Bacillus thuringiensis je štapićasta, aerobična bakterija koja obrazuje spore, karakterizirana proizvodnjom za vrijeme sporulacionog procesa jedne ili više inkluzija koje se nazivaju parasporalni kristali. Ovi kristali se sastoje od visoko molekularnih težinskih proteina, koji se zovu delta endotoksini Delta endotoksini su aktivni sastojci koji su dostupni u komercijalnim preparatima Bacillus thuringiensis – a.

.

Pronađeni su mnogi Bacillus thuringiensis sojevi s različitim insektnim spektrumom. Klasificirani su po različitim podvrstama koji se baziraju na njihovim flagelarnim antigenima. Od naročitog značaja je Bacillus thuringiensis podvrste kurstaki podvrste aizawi koje se koriste za kontrolu lepidopterskih insekata štetočina. Bacillus thuringiensis podvrsta israelensis koja se koristi za kontrolu dipteranskih štetočina i Bacillus thuringiensis podvrsta tenebrionis koja se koristi za kontrolu koleopteranskih insekata štetočina.

Prva izolacija toksičnog koleopterana Bacillus thuringiensis-a prijavljena je 1983 (A. Krieg et al., Z. and Ent. 96, 500-508, European Patent Publication EP 0149162 A2).

Taj izolir nazvan Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis dostavljen je njemačkoj zbirci mikroorganizama (German Collection of Microorganisms), gdje se može naći pod brojem DSM 2803« Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis izoliran je 1982 iz mrtve larve (ličinke) žitnog crva, Tenebrio molitor (Tenebrionidae Coleoptera). Ovaj soj proizvodi u okviru svake stanice jednu sporu i jedan ili više insekticidnih parasporalnih kristala koji imaju ravan tanjurast oblik, a dužina jedne stranice iznosi oko 0.8 µm do 1.5 µm. Ona pripada serotipu H8 a, 8b i patotipu C od Bacillus thuringiensis-a (Krieg et al, System Appl. Microbiol. 9, 138-141, 1987, US patent 4, 766, 203, 1988). On je jedino toksičan za vrstu larve insekta koji jede lišće (Chrysomelidae), ali je bez efekta na gusjenice (Lepidoptera), komarce (Diptera) ili druge insekte.

Bacillus thuringiensis podvrsta tenebrionis pokazao se kao efektan kontrolni agens za larve koloradske krumpirove zlatice. Poslije vađenja kristala i spora iz Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis ili izoliranih kristala larve, a do izvjesne mjere i zrelih insekata koloradskih krumpirovih zlatica (Leptinotarsa decemlineata) prestaje hranjenje. Stadiji larve LI - L3 umiru u roku od 1-3 dana (Schnetter et al., u "Fundamental and applied aspects of invertebrate pathology" eds. R.A. Samson et al., Proceedings of the 4th Int. colloquium of Invertebratae Pathology, p. 555.1986).

Nedavno se pokazalo da Bacillus thuringiensis podvrsta tenebrionis dodatkom koleopteranskog aktivnog kristala također proizvodi i drugi parasporalni kristal koji je vretenast, speroidan ili pločast. (A.M. Huger and A, Krieg, J. Appl. Ent. 108, 490-497, 1989). Aktivnost drugog kristala još nije poznata.

Četiri komercijalna proizvoda Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis pronađeni su za kontrolu koleopteranskih štetočina, N0V0D0R iz Novo Nordisk-a A/S, TRIDENT iz Sandoz-a i DiTerra iz Abbott Laboratories Inc., Foil iz Ecogen-a.

Izolacija drugog soja toksičnog koleopterana Bacillus thuringiensis-a prijavljena je 1986. (Hernstadt et al., Gio/Te-chnology vol. 4, 305-308.1986 US patent 4, 764, 372, 1988). Ovaj soj nazvan Bacillus thuringiensis podvrste san diego M7 dostavljen je Sjevernom regionalnom istraživačkom laboratoriju (the Northern Regional Research Laboratory, USA pod brojem NRRL B-15939- Komercijalni proizvod koji je zasnovan na Bacillus thuringiensis podvrsta san diego otkrila je Mycogen korporacija.

Komparativne analize Bacillus thuringiensis podvrste .tenebrionis DSM 2831 Bacillus thuringiensis podvrste san diego, NRRL-B uključujući fenotipsku osobinu vegetativnih stanica i karakteristike toksičnog parasporalnog kristala i analize plazmidske DNA ipak su pokazale da Bacillus thuringiensis podvrste san diego je očigledno identičan prethodno izoliranom soju DSM 283 Bacillus thuringiensis podvrsta tenebrionis (Krieg et al., : J.Appl.Ent. 104, 417-424.1987). Dapače i nukleotidni nizovi i deducirani aminokiselinski nizovi aktivnih gena kleopteranskog deltaendotoksina identični su kod Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis i Bacillus thuringiensis podvrste san diego.

Pod istim uvijetima kulture gore naveden tip kristala također je sintetiziran pomoću Bacillus thuringiensis-a podvrste san diego (A.M. Huger and A.Krieg, J. Appl.Ent. 108, 490-497, 1989).

Prema H. de Barjac i Frachon (Entomophaga 35(2), 233.240, 1990) san diego izolat sličan je tenebrionu i ne može se promatrati kao različita podvrsta.

Korisnost Bacillus thuringiensis sojeva za kontrolu koleopteranskih štetočina zavise od efikasne i ekonomične proizvodnje aktivnih koleopteranskih toksina, kao i od jačine takvog proizvoda. Ovo je pak zavisno od količine delta endotoksina koji se može proizvesti fermentacijom koleopteranski aktivnih Bacillus thuringiensis sojeva.

Bacillus thuringiensis već se više godina koristi u proizvodnji insekticida, ali iako bi mutanti B. thuringiensis s povećanim prinosom delta endotoksina bili u prednosti, slični mutanti nisu još opisani. Mutanti koji proizvode veće prinose delta endotoksina dat će efikasniju i ekonomičnu proizvodnju Bacillus thuringiensis toksina i mogućnost za manufakturnu proizvodnju Bacillus thuringiensis s povećanom snagom, a uz jedan trošak. Ovo bi zauzvrat bila prednost za korisnika budući da se smanjeni volumeni pesticidne formulacije moraju čuvati i koristiti za datu površinu. Kao dodatak ovome, korisnici će imati manje materijala za odbacivanje, a tako se smanjuje i loš utjecaj na okolinu.

Poboljšanja proizvoda delta endotoksina uz pomoć Bacillus thuringiensis-a podvrste tenebrionis kroz mutaciju nije prethodno prijavljena.

Jedan problem vezan uz korištenje naročito B. thuringiensi podvrste tenebrionis u kontroli larvi insekata javlja se zbog relativno manje snage ili jačine preparata koji zahtijevaju primjenu relativno velikih količina preparata na površinama koje se zaštićuju, kao što je 5.10 l/ha u usporedbi s 1 do 2 litre/ha mnogih drugih Bacillus thuringiensis proizvoda i mnogih drugih insekticida.

Shodno tome pojavila se potreba za proizvodima poboljšane jačine.

Jedan način da se premosti ovaj problem bio bi u koncentraciji preparata. To bi ipak dosta doprinjelo cijeni proizvodnje u usporedbi s uštedom koja se dobija čuvanjem i transportom.

Mnogo zgodnija varijanta bila bi stvoriti mutante postojećih. Bacillus thuringiensis sojeva koji su u stanju proizvesti bitno veću količinu delta endotoksina po stanici.

Opis rješenja tehničkog problema

Ovaj pronalazak odnosi se u jednom vidu na varijante i na mutante Bacillus thuringiensis sojeva koji mogu proizvoditi bitno veće količine toksina nego njihovi roditeljski sojevi.

U drugom vidu pronalazak se odnosi na tako visoko produktivne varijante ili mutante Bacillus thuringiensis sojeva koji pripadaju podvrsti tenebrionis.

Daljnji aspekti pronalaska odnose se na korištenje takvih varijanata ili mutanata Bacillus tharingiensis sojeva za proizvodnju pesticidnih proizvoda i također za takve pesticidne sastojke (smjese) koji sadržavaju aktivni sastojak delta endotoksina koji se dobij a varijantom ili pomoću mutanta Bacillus thuringiensis sojeva ovog pronalaska.

Pronalazak se također u jednom od svojih aspekata odnosi na način kontroliranja štetočina primjenjujući sastav shodno pronalasku u području gdje se nalaze štetočine osjetljive na aktivnost delta endotoksina o kojem se radi i koje bi trebalo kontrolirati.

U jednom daljnjem vidu ovaj pronalazak odnosi se na metode selekcije ili mutacije i selekcije Bacillus thuringiensis sojeva da bi se dobili takvi sojevi Bacillus thuringiensis-a koji su sposobni da proizvode bitno veće količine delta endotoksina nego njihov roditeljski soj.

DEPONIRANJE MIKROORGANIZAMA

Radi detaljnijeg opisa ovog pronalaska, mutant Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis koji proizvodi visoke količine delta endotoksina podnesen je u "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroderweg Ib, D-3300 Braunschweig, SRNj, u svrhu patentne procedure datuma koje je naznačen ispod.

Budući da je DSM međjunarodna banka za deponiranje prema budimpeštanskom sporazumu, dozvoljen je trajni depozit u skladu sa zakonom br. 9 gore rečenog sporazuma.

Datum depozita: 10. kolovoza 1989

Depozitni ref.: NB 176-I

DSM odrednica: DSM 5480

Mutant DSM 5480 dobiven je mutacijom Bacillus thuringiensis podvrste tenebrionis soja DSM 5526, koji je također poznat u budimpeštanskom sporazumu, kao što se vidi iz slijedećeg:

Datum depozita: 14. rujna 1989

Depozitni ref.: NB 125

DSM odrednica: DSM 5526

Detaljni opis pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se u svom glavnom dijelu na varijante ili mutante Bacillus thuringiensis-a koji proizvodi velike količine aktivnog delta endotoksina u usporedbi s njegovim roditeljskim sojem.

U ovom kontekstu izraz "velike količine" znači barem dvostruko više ili više od toga.

Kako u ovom glavnom aspektu, tako i u specifičnijim aspektima pronalaska - dolje naznačenim - delta endotoksini imat će aktivnost uperenu prema istim insektima štetočinama, kao i prema njegovom roditeljskom soju, B. thuringiensis delta endotoksina, kao što su oni koji se upotrebljavaju protiv lepidopterana (mutanti iz Bacillus thuringiensis podvrste kurstaki i podvrste aizawai), dipterani i (mutanti iz Bacillus thuringiensis podvrsta israelensis) ili koleopterani (mutanti iz B. thuringiensis podvrst. tenebrionis).

U jednom specifičnom ostvarenju ovog aspekta pronalaska B. thuringiensis pripada podvrsti tenebrionis, a proizvedeni delta endotoksin postaje aktivan protiv kleopterana.

Imajući ovo u vidu, traženo ostvarenje pronalaska varijantni ili mutantni B. thuringiensis podvrste tenebrionis sposobno je proizvesti tri puta više delta endotoksina.

Daljnja ostvarenja ovog pronalaska sadrže varijante i mutante B. thuringiensis-a, podvrste tenebrionis - sojeve koji su sposobni proizvesti parasporalni kristal koji ima srednju dužinu ivice od oko 2 µm ili više.

Daljnje ostvarenje ovog pronalaska sadrži varijante ili mutante B. thuringiensis podvrste tenebrionis - sojeve koji pokazuju učestalost sporulacije od 10 - 100 ili čak 106 puta niže od sporulacije njegovog roditeljskog soja, ili soja DSM 2803.

Još specifičnije je ostvarenje ovog pronalaska depozitnog mutanta B. thuringiensis podvrste tenebrionis DSM 5430.

Za vrijeme rada na pronalasku izoliran je mutant B. thuringiensis podvr. tenebrionis (DSM 5480) s više od dvostrukog povećanja proizvodnje delta endotoksina u usporedbi s njegovim roditeljskim sojem (DSM 5526). Fazno kontrastna mikroskopija, elektronska mikroskopija i transmisiona elektronska mikroskopija ovog mutanta pokazuju da se visoka produktivnost ovog mutanta može pripisati promjenama u regulaciji proizvoda delta endotoksina u odnosu na sporulaciju koja rezultira proizvodnjom proteinskih kristala koji su skoro pet puta veći nego kristali proizvedeni od postojećih aktivnih koleopteranskih B. thuringiensis sojeva. Bliska veza između kristalne formacije i sporulacije izgleda da je uklonjena, a mutant proizvodi velike količine delta endotoksina prije sporulacije.

U jednom od svojih aspekata pronalazak se odnosi na upotrebu varijantnih ili mutantnih sojeva pronalaska u postupku za dobijanje insekticidnog B. thuringiensis proizvoda čijom se metodom varijanta ili mutant bacilusa B. thuringiensis soja proizvodi u pogodnoj sredini kulture koja ima izvore karbona, nitrogena i drugih komponenti poznatih upućenima za odgovarajući vremenski period poslije kojeg se delta endotoksini oporavljaju.

U daljnjem aspektu pronalaska B. thuringiensis delta endotoksični proizvodi dobijeni na gore spomenuti način koriste se u pesticidnim mješavinama kao aktivna komponenta.

U ovakvim mješavinama delta endotoksini ovog pronalaska mogu se koristiti ili samostalno ili u kombinaciji s drugim biocidalnim aktivnim proizvodima.

Pronalazak se također odnosi i na takve pesticidne mješavine ili preparature koje sadrže B. thuringiensis delta endotoksični proizvod pronalaska u zajedničkom djelovanju s poljoprivredno prihvatljivim razrjeđivačima ili nosačima.

Pronalazak se također odnosi na takve pesticidalne mješavine ili preparature koje sadrže B. thuringiensis koje sadrže proizvod B. thuringiensis delta endotoksin čija pesticidalna mješavina u tekućini ima snagu najmanje 15.000 BTTU/G, koja odgovara najmanje 3% w/w koleopteranskom insekticidnom kristalnom proteinu ili pesticidna mješavina u suhom obliku koja ima snagu najmanje 50.000 BTTU/g, koja odgovara najmanje 10% w/w koleopteranskom insekticidnom kristalnom proteinu.

U specifičnom ostvarenju pronalazak se odnosi na pesticidne .mješavine proizvedene od DSM 5480 koje imaju barem dvostruku snagu u odnosu na pesticidne mješavine koje su proizvedene od DSM 2803 ili na druge koleopteranski aktivne Btt sojeve.

Mješavine ovog pronalaska mogu poprimiti bilo koji poznati oblik u umjetnosti formulacija poljoprivrednih kemikalija, kao što su suspenzija, raspršivač, vodenasta emulzija, prašak za posipanje, prašak koji se raspršuje, emulzioni koncentrat ili granule. Osim toga, može se naći u odgovarajućem obliku za direktnu upotrebu ili kao koncentrat ili kao prvobitna mješavina, koja zahtijeva miješanje s odgovarajućom količinom vode ili drugih rastvarača prije upotrebe.

Koncentracija insekticidno aktivnog B. thuringiensis delta endotoksina u mješavinama ovog sadašnjeg pronalaska, kada se koristi sam ili u kombinaciji s drugim pesticidom, kao što se primjenjuje kod biljaka, iznosi od 0.5 do oko 25% težine, a naročito od 1 do 15% težine.

U daljnjem aspektu pronalazak se odnosi na način kontroliranja štetočina, gdje se pesticidni sastavi (mješavine) prema prethodnom aspektu primjenjuju na oblast napadnutu već spomenutim štetočinama.

U specifičnom ostvarenju štetočina koje treba kontrolirati pripada grupi koja sadrži lepidopterane, dipterane i koleopterane, naročito koleopterane kao što je koloradska krumpirova zlatica.

U specifičnom ostvarenju, štetočina se može kontrolirati upotrebom 1 kvartala tekuće pesticidne mješavine po jutru, ili primjenom suhe pesticidne mješavine po jutru.

Aktivna B. thuringiensis preparatura ili mješavine pronalaska mogu se primijeniti direktno na biljku, na primjer tako što se ona zaprašuje ili se po njoj raspršuje, i to u vrijeme kad se štetočina pojavljuje na biljci. Najviše se primjenjuje metoda prskanja. Vrlo je važno dobiti dobru kontrolu nad štetočinama u prvim stadijima ličinke, jer je to vrijeme kada će i biljka trpjeti najmanje štete.

U postupku mijenjanja B. thuringiensis sojeva selektirajući takve mutante koji su sposobni proizvesti bitno veće količine delta endotoksina nego njihovi roditeljski sojevi, roditeljski soj je:

1) tretiran s mutagenom

2) tako tretirani mutanti se razvijaju u sredini pogodnoj za selekciju asporogenus ili/i oligo-sporogenusnih sojeva

3) prozirne kolonije se biraju i uzgajaju u sredini koja se ne pretvara u tekućinu uslijed zagrijavanja, a pravi asporogenusni sojevi nestaju zagrijavanjem kolonija.

Prema željenom ostvarenju ove metode, ovako izabrane kolonije se uzgajaju u normalnoj sredini i krajnja selekcija za sojeve sposobne za povećanu proizvodnju delta endotoksina je izvedena.

U dijelu (1) gore rečenog postupka, mutagen može biti bilo koji konvencionalni kemijski mutagen, kao što je N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine ili ethyl methaneusulfonate ili roditeljski soj može biti tretiran elektromagnetskom radijacijom, kao što su y ili x zrake ili ultravioletno zračenje.

U dijelu (2) pogodna sredina može biti modificirana hranjiva sporulaciona sredina, uključivo fosfate (NSHP sredina) kako ju je opisao Johnson et al. u "Spores IV", eds. P. Gerhardt et al., pp. 248-254, 1975.

U dijelu (3) gore rečenog postupka pogodna sredina bila bi NSMP dopunjena s MgC12 i Gelrite, Kelco.

Drugi postupci za dobijanje visoko produktivnih varijanti ili mutanata ovog pronalaska mogu se zamisliti kao uzgajanje roditeljskog soja u tekućoj sredini, birajući tako spontane mutante ili varijante nakon prekrivanja kulturne sredine na želatinsku podlogu (sredinu), koja je pogodna za selekciju asporogenoznih i/ili oligosporogenoznih mutanata.

Drugi postupci pronalaženja visoko produktivnih mutanata ili varijanti pronalaska mogu se zamisliti tako što bi se upotrijebila masa ovih mutanata direktno kroz centrifugiranje ili upotrebom drugih načina za obradu mase.

Primjer 1

Mutant B. thuringiensis podvr. tenebrionis s više od dva puta povećane proizvodnje delta endotoksina je izoliran. Fazno kontrastna mikroskopija, radarsko elektronska mikroskopija ovog mutanta pokazuje da je visoka produktivnost ovog mutanta posljedica promjena u regulaciji proizvodnje delta endotoksina, koji odgovara sporulaciji, što rezultira u proizvodnji proteinskih kristala koji su više od pet puta veći nego kristali proizvedeni od postojećih koleopteranski aktivnih B. thuringiensis sojeva. Bliska korelacija između kristalnih formacija i sporulacija izgleda da je uklonjena i mutant proizvodi visoke količine delta endotoksina prije sporulacije.

Proizvodnja mutanta visoke produktivnosti

Spore B. thuringiensis podvrste tenebrionis, soj DSM 5526 ozračene su y zrakama da daju dozu od 7 kGy. Ozračene spore raširene su na HSMP agarne (želatinske) pločice (modificirana hranjiva sporulaciona sredina koja ima fosfat kao što je opisao Johnson et al., u "Spores IV", eds. P. Gerhardt et al., pp. 248-254, 1975)« Sredina pogodna za selekciju asporogenusnih i/ili oligosporugenusnih mutanata.

NSMP - agar tanjurići inkubirano 2 do 3 dana na temperaturi od 30°. Prozračne kolonije su izvađene i prenesene na NSMP gerlitne tanjuriće (sredina NSMP kojoj je dodat MgC12" (0.57 g/l) i Gerlite, Kelco (20 g/l)). NSMP gerlitni tanjurići su inkubirani jedan sat na , a zatim još dan-dva na temperaturi od .

Mutanti koji su dobro porasli na NSMP gerlitnim tanjurićima su se izdvojili. Na ovaj način su svi asporogenusni mutanti bili izbačeni budući da nisu rasli poslije temperaturnog tretmana

.

Izabrani mutanti su se uzgajali u labor. bocama za mućenje koje su sadržavale komercijalnu sredinu. Količine delta endotoksina koji je tako proizveden determinirane su imunološkim metodama dolje navedenim.

Izdvojili su se samo mutanti koji su u stanju proizvesti veće, t.j. značajno veće količine delta endotoksina nego njihov roditeljski soj.

Morfologija izabranih mutanata na čvrstoj sredini i u tekućoj sredini ispitivana je fazno kontrastnom mikroskopijom (X 2500) i pregledom (screeningom), kao i elektronskim mikroskopom.

Između dobijenih mutanata jedan DSM 5480 je izabran radi njegove sposobnosti da proizvodi delta endotoksin.

Količina delta endotoksina koju proizvodi mutant DSM 5480 uspoređena je s DSM 2803 originalnim izolirom B. thuringiensis podvr. tenebrionis, soj NB176, izoliran od Sandoz, B. thuringiens: tenebrionis proizvod TRIDENT-a iz 1989, soj NB 198, izoliran iz Sandoz-a, B. thuringiensis podvr. tenebrionis proizvod TIRDENT-a iz 1990, B. thuringiensis podvr. san diego, proizvod M-one iz 1990.Kao što je prikazano na tablici L, primjera 2, mutant poboljšane proizvodnje ovog pronalaska proizvodi 2 do 3.5 puta isto toliko delta endotoksina, kao i kleopteranski aktivni sojevi B. thuringiensis-a koji se danas mogu naći.

Primjer 2.

U ovom primjeru delta endotoksin proizvodnja B. thuringiensis podvrsta tenebrionis, mutant DSM 5480 je uspoređen s delta endotoksinskom proizvodnjom B. thuringiensis sojeva DSM 2803 (originalni izolir B. thuringiensis pod. tenebrionis), DSM 5526 (proizvodni sojevi iz Novo-Nordisk-a) i NB 178 i NB 198 (proizvodni sojevi Sandoz-a) i B. thuringiensis podvr. san diego, soj NRRL-B15939 i NB 197 (proizvodni soj Mycogen-a) u komercijalnoj sredini. Svaki od sojeva uzgajan je 17 sati na temp. od 30° na agarnim padinama, slijedeće mješavine izražene kao gram na litru destilirane vode.

Pepton, Difco

Goveđi ekstrakt, Difco

Agar, Difco

pH 7.0

5 ml suspenzije stanica od svakog soja preneseno je zatim u 500 ml Erlenmeyerske boce. Proizvodna sredina se sastojala od slijedećih komponenti u količinama naznačenim (izraženo u gramima na litru obične vode).

Sojino brašno

Hidrolizirani škrob

KH2PO4

K2HPO4

pH 7.0

Boce s ovim supstancama inkubirane su na uz trešnju (250 puta u minuti). Poslije 96 sati inkubacije kulturna mješavina ispitivana je imunološkim metodama na delta endotoksične prinose.

Količina endotoksina proizvedena individualnim sojevima determinirana je od strane rocket immuno electrophoresis (RIE) i fotometričnim imunim probama (PIA) koristeći antitijela uzgojena za upotrebu na očišćenim proteinskim kristalima iz grupe B. thuringiensis podvrste tenebrionis.

400 mg svake kulturne mješavine izmjereno je. 7 ml trisođiumski fosfatni bufer (, pH 12) dodan je svakom uzorku. Suspenzije su protrešene jedan sat da bi rastvorile delta endotoksinske proteine.

Uzorci su se zatim centrifugirali – 3.500 puta u minuti oko 15 minuta i ono što se izdvojilo je testirano na delta endotoksin raketno imunom elektroforezom na antiserumu uzgojenom na pročišćenim proteinskim kristalima iz B. thuringiensis podvr. tenebrionis. Količine delta endotoksina proizvedene individualnim sojevima bile su relativno određene do standarda s poznatim sadržajem kristal proteina.

Koncentracija kristalnih proteina također je određena fotometričnom imuno probom. Kristalni proteini rastvoreni su u alkalni rastvor. Rastopljeni proteini precipitirani su njihovim antitijelima. Odnos ove reakcije određen je turbo-dimetrično. Količina delta endotoksina relativno je određena do standarda s poznatim sadržajem kristalnog proteina.

Dobijeni rezultati prikazani su na slijedećim tablicama la i lb. Delta endotoksinska proizvodna polja izražena su kao BTTU/g (jedinice na g kulturne mješavine, određene od strane rocker immuno electrophoresis, RIE, ili od strane photometric immuno assay, PIA). Vrijednost upotrijebljena za čisti B. thuringiensis kristalni protein je 500000 BTTU/g. Vrijednosti naznačene na tablici la su prosjeci od 6-7 nezavisnih fermentacija, a one na tablici lb su prosjeci tri nezavisne fermentacije.

Tablica la

Proizvodnja delta endotoksina od sojeva B. thuringiensis podvr. tenebrionis u bocama za mućenje

[image]

Tablica 1b

Proizvodnja delta endotoksina od sojeva B. thuringiensis podvr. teneterionis u bocama za mućenje

[image]

Iz tablica 1a i 1b izgleda da DSM 5480 proizvodi više od tri puta delta endotoksina nego originalni soj B. thuringiensis pod. tenebrionis, DSM 2803 i B. thuringiensis podv. san diego, soj NRRL B15939 i više od dva puta količine delta endotoksina nego sojevi koji se danas koriste za proizvodnju komercijalnih proizvoda B. thuringiensis podv. tenebrionis.

Fazno kontrastna mikroskopija, skening elektronska mikroskopija i transmisiona elektronska mikroskopija B. thuringiensis pod. tenebrionis, mutanta DSM 5480 otkrili su da su proteinski kristali proizvedeni od ovog mutanta mnogo veći nego odgovarajući proteinski kristali proizvedeni od B. thuringiensis podvr. tenebrionis, sojeva DSM 2803, DSM 5526, NB 178 i NB 198 i B. thuringiensis podv. san diego, sojeva NRRL-B 15939 i NB 197.

Kulturna mješavina B. thuringiensis pod. tenebrionis mutant DSM 5430 testiran je na aktivnost protiv larve koloradske krumpirove zlatice. Povećana količina delta endotoksina proizvedena od mutanta DSM 5480, determinirana imunološkim postupcima ogledala se u biološkoj aktivnosti protiv larve koloradske krumpirove zlatice.

Primjer 3

U ovom primjeru sporulacija i parasporalna kristalna formacija u B. thuringiensis pod. tenebrionis, sojevi DSM 2803, DSM 5526, NB 178 i NB 198 i mutant DSM 5480, i B. thuringiensis podvr. san diego, sojevi NRRL-B 15939 i NB 197 upoređeni su u tekućoj i čvrstoj sredini.

Svaki od sojeva uzgajan je dva dana na temperaturi od na agarnim tanjurima slijedeće mješavine koja je izražena kao gram na litru destilirane vode.

Pepton, Difco 5g

Goveđi ekstrakt, Difco 3g

Agar, Difco 20g

pH 7.0

Svaki od sojeva također je uzgajan u tekućoj sredini. Svi sojevi uzgajani su 17 sati na temperaturi od na agarnim padinama. 5 ml suspenzije stanica iz svakog soja su se potom prenijele u 500 ml Erlenmeyerove boce i svaka je sadržavala 100 ml sredine.

Sredina se sastojala od slijedećih komponenti u količinama naznačenim (izraženim u gramima na litru obične vode)

Tekuća sredina:

Ekstrakt kvasca 5g

Tripton 5g

Glukoza lg

KH2PO4 0, 6g

pH 7, 0

Boce sa smjesama inkubirane su na uz protresanje (250 puta u minuti) 96 sati.

Morfologija sojeva u čvrstoj i tekućoj sredini ispitivana je svakog dana fazno kontrastnim mikroskopom (x 2500). Broj spora i kristala izbrojan je, a veličina parasporalnih kristala je determinirana. Nekoliko izabranih primjeraka je također proučeno skeningom i transmisionim elektronskim mikroskopom.

B. thuidngiensis podvrsta tenebrionis, sojevi DSM 2803, DSM 5526, NB 178 i B. thuringiensis pod. san diego, sojevi NRRL-B 15939 i NB 197 imali su dobru sporulaciju u obe sredine. Prije lizije, svaka stanica je sadržavala sporalni i parasporalni kristal. Veličina kristala je bila od 0, 4 do 0, 9-H /µm po dužini, do lizije. Prosječna veličina proteinskih kristala bila je 0, 6-0, 7 µim po dužini.

Mutant DSM 5430 proizveo je samo nekoliko spora (<106 spora/ml) na čvrstoj sredini i u određenoj tekućoj sredini. Prije lizije stanica mnoge stanice su sadržavale veliki proteinski kristal, ali ni jednu sporu. Veličina proteinskih kristala je varirala od 0.4 do 0.7/im do 5-0, µm, a prosječna veličina proteinskog kristala bila je 2.2 do 2.3 µm po dužini.

Ultrastrukturalna analiza stanica iz ovih sredina transmisionim elektronskim mikroskopom je otkrila da je sporulacioni proces u mutantu započeo, ali nije bio dovršen do vremena lizije. Sporulacioni proces je dostigao različite stupnjeve u različitim stanicama. U stanicama gdje je sporulacioni proces dostigao drugi stupanj (forespore septum formation), proteinski kristali su popunili cijele stanice.

U proizvodnoj sredini (primjer 2), mutant je proizveo veći broj spora ( 107'-l08spora/ml). U ovoj sredini frekvencija sporulacija mutanta bila je 10- 100 puta niža nego u roditeljskom soju.

Tako je mutant zadržao svoju sposobnost da proizvodi normalne spore. Ipak, frekvencija sporulacije mutanta vrlo ovisi o sredini.

Veličina proteinskih kristala proizvedena od individualnih sojeva prikazana je u tablicama IIa i IIb.

Tablica IIa

Veličina proteinskih kristala proizvedenog od koleopteranski aktivnih B. thuringiensis sojeva koji se danas mogu naći.

[image]

Tablica Ilb

Veličina proteinskih kristala proizvedenih od koleopteranski aktivnih B. thuringiensis sojeva koji se danas mogu naći.

[image]

Iz tablica IIa i IIb jasno je da mutant DSM 5480 proizvodi mnogo veće proteinske kristale nego bilo koji od koleopteranskih aktivnih sojeva koji se danas mogu naći.

Na osnovu dobijenih podataka izgleda da je regulacija proizvodnje delta endotoksina u odnosu na sporulaciju promijenjena u mutantu.

Mutant izgleda proizvodi proteinske kristale prije razvitka spora, tako dajući stanicama duži period za proizvodnju delta endotoksina, što rezultira proizvodnjom mnogo većih proteinskih kristala do vremena stanične lizije nego u roditeljskom soju.

U ovisnosti o dostupnim hranjivim sastojcima i veličini proteinskih kristala u stanicama do sporulacije razvit će se normalna spora prije vremena stanične lizije.

Primjer 4

U ovom primjeru, visoko produktivni Btt mutant DSM 5480 upotrijebljen je da proizvede veću snagu proizvoda za kontrolu larve koloradske krumpirove zlatice.

DSM 5480 fermentiran je na produkcionoj fermentacionoj sredini opisanoj u primjeru 2, u zračnom (koji sadrži zrak) rezervoaru za proizvodnju fermentacije. Poslije 96 sati, mješavina se povratila poslije kontinuiranog centrifugiranja.

Koncentrirana krema koja sadrži aktivne proteinske kristale stabilizirana je dodatkom mikrobialnih prezervativa i pH je bio podešen do 5.0.

Jedna porcija koncentrirane kreme osušena je sprejom i kasnije upotrijebljena za formuliranje vlažnog praška Ostatak koncentrirane kreme upotrijebljen je direktno za formulaciju tekuće plutajućih koncentrata (FC).

Vlažni prašak je formuliran kao u tablici III. Formulacija dva FC-a opisana je u tablici IV.

[image]

Tablica IV NOVODOR PC formulacije

[image]

Kada se koristi vrijednost 500, 000 BTTU/g čistog kristalnog proteina, sadržaj aktivnog kristalnog proteina u slijedećim formulacijama je:

Btt kristalni protein

[image]

Deterdženti su izabrani među širokim izborom (selekcijom) suspenzijskih dodataka i vlažećih agenasa koji se obično koriste kao pesticidni proizvodi u agrikulturi.

Antikoagulacioni agens hjdrophilic silica i interni punjač izabrani su od opće korištenih inertnih filtera, kao što su bentoniti, anorganske soli ili vrste ilovače.

Prezervativi korišteni u PC-u su izabrani iz grupe prezervativa za hranu i kozmetiku. pH regulator je anorganska kiselina.

Primjer 5

Izvršena je proba na jednom polju da bi se dokazao biološki efekat visoko produktivnog Btt mutanta DSM 5480 na ciljanu štetočinu, larvu koloradske krumpirove zlatice, u usporedbi s dva komercijalna proizvoda Tridentom i M-one-om. Usjev je bio paradajz.

Usjev je bio prskan tri puta: 20. srpnja, 27- srpnja i 3-kolovoza (druga generacija larvi).

Proizvodi i upotrebljene doze koje su korištene:

[image]

Srednja % kontrola CPB larvi usporedbena s netretiranom kontrolom prikazana je u tablici V. Pritisak koloradske krumpirove zlatice bio je veliki u kontrolnoj grupi koja nije tretirana pronalaskom: 370 larvi na 20 biljaka prvog kolovoza i 904 larvi na 20 biljaka osmog kolovoza.

Tablica V

[image]

Ovi rezultati jasno pokazuju da su proizvodi, stvoreni pomoću visoko proizvodnog mutanta DSM 5480, vrlo efikasni u kontroli larvi koloradske krumpirove zlatice na njivi. Kristalni protein proizveden pomoću visoko proizvodnog soja je potpuno aktivan kao i 1.5 NOVODOR FC, daje isto tako dobre rezultate kao i Trident na 4 qts i isto je tako dobar kao M-one na 2 qts.

Claims (39)

1. Mutant ili varijanta B. thuringiensis naznačen time što je sposoban proizvesti velike količine insekticidnog delta endotoksina u usporedbi sa svojim roditeljskim sojem.

2. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 1, naznačen time što mutant ili varijanta B. thuringiensis može proizvesti isto toliko ili više insekticidnog delta endotoksina u usporedbi sa svojim roditeljskim sojem.

3. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 1 ili 2, naznačen time što mutant ili varijanta B. thuringiensis pripada patotipu C od B. thuringiensis.

4. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 1, 2 ili 3, naznačen time što će mutant ili varijanta B. thuringiensis imati aktivnost usmjerenu prema istoj vrsti insekata štetočina kao i njegovi roditeljski B. thuringiensis delta endotoksini, kao što je protiv lepidopterana (mutanti od B. thuringiensis podvrste kurstaki i/ili podvrste aizawai), dipterana (mutanti B. thuringiensis podvrsta israelensis) ili koleopterana (mutanti B. thuringiensis podvrsta tenebrionis) .

5. Mutant ili varijanta prema zahtjevima 1, 2, 3 ili 4, naznačen time što B. thuringiensis pripada podvrsti tenebrionis, a proizvedeni delta endotoksin je aktivan protiv koleopterana.

6. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 5, naznačen time što je mutantni ili varijantni B. thuringiensis podvrste tenebrionis sposoban proizvesti više od tri puta delta endotoksina nego soj DSM 2803.

7. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 5 ili 6, naznačen time što mutirani ili varijantni B. thuringiensis podvrste tenebrionis može proizvesti parasporalni kristal koji ima srednju dužinu ivice dva puta veću nego njegov roditeljski soj.

8. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 7, naznačen time što mutirani ili varijantni B. thuringiensis podvrste tenebrionis soj može proizvesti parasporalni kristal koji ima srednju dužinu ivice 2 /µm ili vise.

9. Mutant ili varijanta prema bilo kojem zahtjevu od 4 do 8, naznačen time što mutirani ili varijantni B. tharingiensis podvrste tenebrionis soj pokazuje frekvenciju sporulacije od 10 do 100 ili čak 106 puta niže od frekvencije sporulacije roditeljskog soja.

10. Mutant ili varijanta prema zahtjevu 9, naznačen time što mutirani B. thuringiensis podvrste tenebrionis soj pokazuje frekvenciju sporulacije od 10 do 100 ili čak 10 puta nižu od frekvencije sporulacije soja DSM 2803.

11. Mutant prema zahtjevu 1, naznačen time što je mutant depozitni mutant B. thurigniensis podvr. tenebrionis DSM 5480.

12. Upotreba mutiranog ili varijantnog soja prema zahtjevu od 1 do 11, naznačen time što je proizvod insekticidnog B. thuringiensis namijenjen za proizvodnju, gdje se mutant ili varijanta B. thuringiensis soja uzgaja u pogodnoj kulturnoj sredini koja sadrži izvore karbona, nitrogena i drugih komponenti za odgovarajući vremenski period, poslije čega se insekticidni proizvod koji sadrži delta endotoksine oporavlja sam ili u kombinaciji sa stanicama i/ili sporama iz kulturne sredine, a ovaj proizvod je prihvatljiv u poljoprivredi.

13. Pesticidalna mješavina prema zahtjevu 12, naznačena time što sadrži B. thuringiensis endotoksinski proizvod kao aktivnu komponentu.

14. Mješavina prema zahtjevu 13, naznačena time što je delta endotoksinski proizvod upotrebijen ili samostalno ili u kombinaciji s drugim biocidalnim aktivnim proizvodima.

15. Pesticidalna mješavina ili preparat prema zahtjevu 13 ili 14, naznačen time što obuhvaća B. thuringiensis delta endotoksinski proizvod u mješavini s nekim dostupnim rastvorom ili nosiocem koji se koristi u agrikulturi.

16. Pesticidalna mješavina prema zahtjevima 13, 14, ili 15, naznačena time što ima dvostruko veću snagu od pesticidalnih mješavina roditeljskog soja.

17. Tekuća pesticidalna mješavina, naznačena time, što ima snagu najmanje 15.000 BTTU/g u odnosu na najmanje 3% w/w koleopteranskog insekticidalnog kristalnog proteina.

18. Suha pesticidna mješavina, naznačena time, što ima snagu najmanje 50.000 BTTU/g u odnosu na najmanje 3% w/w koleopteranskog insekticidalnog kristalnog proteina.

19. Pesticidna kompozicija, naznačena time, što proizvedena od DSM 5480 ima najmanje dvostruko veću snagu pesticidalnih mješavina proizvedenih od DSM 2803 ili drugih koleopteranski aktivnih Btt sojeva.

20. Mješavina prema bilo kojem zahtjevu od 13 do 19, naznačena time što je razrjeđivač ili nosač u mješavini tvrd ili tekuć u ovisnosti o površinski aktivnom agensu.

21. Metoda kontroliranja štetočina prema zahtjevima od 13 do 20, naznačena time, to se pesticidalna mješavina primjenjuje na jednu oblast zaraženu spomenutom štetočinom.

22. Metoda prema zahtjevu 21, naznačena time što štetočina pripada grupi koja obuhvaća lepidopterane, dipterane i koleopterane.

23. Metoda prema zahtjevu 22, naznačena time što je štetočina koleopteran, naročito koloradska krumpirova zlatica.

24. Metoda prema zahtjevima 22 ili 23, naznačena time što se štetočina može kontrolirati upotrebom 1 kvartala na jedno jutro tekuće pesticidne mješavine.

25. Metoda prema zahtjevu 22 ili 23, naznačena time što se štetočina može kontrolirati primjenom 0- po jutru suhog pesticidnog sastava.

26. Metoda mutiranih B. thuringiensis sojeva, naznačena time što ovaj postupak selekcionira takve mutante koji su sposobni proizvesti veće količine delta endotoksina nego njegovi roditeljski sojevi, a roditeljski soj je: i) tretiran mutagenom, ii) ovako tretirani mutanti se uzgajaju u sredini pogodnoj za selekciju asporogenoznih i/ili oligosporogenoznih sojeva, iii) prozračne kolonije su selekcionirane i uzgajane u sredini koja se ne pretvara u tekućinu pri zagrijavanju, a sasvim asporogenozni sojevi se izbacuju tako što se kolonije izlažu toplotnom tretmanu.

27. Metoda prema zahtjevu 26, naznačena time što su ovako izabrane kolonije uzgajane u normalnoj produkcionoj sredini i krajnja selekcija za sojeve sposobne za povećanu proizvodnju delta endotoksina je izvršena.

28. Metoda prema zahtjevu 26 ili 27, naznačena time što u dijelu i) mutagen je bilo koji pogodan kemijski mutagen, kao što je N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine ili etilmethanesulfonate.

29. Metoda prema zahtjevu 26 ili 27, naznačena time što je roditeljski soj u dijelu i) tretiran s odgovarajućom elektromagnetnom radijacijom (zračenjem), kao što su y ili x zračenja ili ultra-violetna zračenja.

30. Metoda prema zahtjevima od 25 do 29, naznačena time što je u dijelu ii) spomenuti medij modificirani hranjivi medij (sredina) koja uključuje fosfat (NSMP sredina).

31. Metoda prema zahtjevima od 26 do 30, gdje se u dijelu (iv) vidi da je spomenuta sredina NSMP sredina kojoj je dodan MgCl 2 i Gerlite, Kelco.

32. Metoda prema zahtjevu 26-31, naznačena time, što spomenuti roditeljski soj pripada grupi koja obuhvaća B. thuringiensis podvrste kurstaki, B. thuringiensis podvr. aizawai. B. thuringiensis podvr. israelensis i B. thuringiensis pod. tenebrionis.

33. Metoda prema zahtjevu 32, naznačena time što je spomenuti roditeljski soj B. thuringiensis podvr. tenebrionis soj.

34. Metoda prema zahtjevu 33, naznačena time što je spomenuti roditeljski soj B. thuringiensis podvrste tenebrionis soj DSM 5526.

35. Metoda, naznačena time, što selekcionira varijante ili prirodne mutante B. thuringiens soja koji je sposoban proizvesti bitno veće količine delta endotoksina nego njegovi roditeljski sojevi, a roditeljski soj je: i) u kulturi tekuće sredine, ii) kulturna mješavina od i) stavljena je u sredinu pogodnu za selekciju asporogenoznih i/ili oligosporogenoznih sojeva, iii) potpuno asporogenusni sojevi se gube tako što se kolonije izlože toplotnom tretmanu.

36. Metoda prema zahtjevu 35 naznačena time što se tako selekcionirane kolonije uzgajaju u normalno produkcionoj sredini, a postiže se finalna selekcija za sojeve sposobne za povećanu proizvodnju delta endotoksina.

37. Metoda prema zahtjevu od 35 do 36, naznačena time, što je u dijelu ii) spomenuta sredina modificirana sporulaciona sredina koja sadrži fosfat (NSMP sredina).

38. Metoda prema zahtjevu 35 - 37 naznačena time, što u dijelu iv) spomenuta sredina je NSMP sredina dopunjena s MgCl 2 i Gerlite, Kelco.

39. Metoda prema zahtjevima od 35 do 38, naznačena time što spomenuti roditeljski soj pripada grupi koja obuhvaća B. thuringiensis podvrst. kurstaki, B. thuringiensis podvrsta aizawai, B. thuringiensis podvrst. israelensis i B. thuringiensis podvr. tenebrionis.