HRP20000367A2

HRP20000367A2 - Conjugates useful in the treatment of prostate cancer

Info

Publication number: HRP20000367A2
Application number: HR20000367A
Authority: HR
Inventors: F Stephen Brady; Dong-Mei Feng; Victor M Garsky
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1997-12-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2000-12-31
Also published as: CN1181092C; US20060148718A1; NO20002804L; HUP0100350A2; BG104563A; CA2311615A1; BR9815116A; JP2001525337A; NO20002804D0; CN1284086A; KR100580137B1; PL197006B1; HUP0100350A3; TR200002260T2; WO1999028345A1; AR016427A1; TW577897B; AU1612399A; US20070021350A1; KR20010032687A

Description

Pozadina izuma

U 1996. godini očekivani broj raka žlijezde prostate dijagnosticiran kod muškaraca u S.A.D.-u je 317,000, a očekuje se da 42,000 muškaraca umre od ove bolesti (Garnick, M.B. (1994). ('The Dilemmas of Prostate Cancer", Scientific American, April: 72-81). Stoga je rak prostate najčešće dijagnosticirana maligna bolest (pored raka kože) kod američkih muškaraca i drugi vodeći uzrok smrti uzrokovanih rakom (iza raka pluća) kod te grupe.

Prostata-specifičan Antigen (PSA) je jednostruki lanac 33 kDa glikoproteina koji se producira gotovo isključivo u epitelu ljudske prostate i javlja se u razinama od 0.5 do 2.0 mg/ml u ljudskoj sjemenoj tekućini (Nadji, M., Taber, S.Z., Castro, A., i dr. (1981) Cancer 48:1229; Papsidero, L., Kuriyama, M., Wang, M., i dr. (1981). JNCI 66:37; Qui, S.D., Young, C.Y.F., Bihartz, D.L., i dr. (1990), J. Urol. 144:1550; Wang, M.C., Valenzuela, L.A., Murfy, G.P., i dr. (1979). Invest. Urol. 17:159). Pojedinačna jedinica ugljikohidrata vezuje se na ostatak asparagina broj 45 i predstavlja 2 do 3 kDa ukupne molekularne mase. PSA je proteaza sa svojstvima sličnim kimotripsinu (Christensson, A., Laurell, C.B., Lilja, H. (1990). Eur. J. Biochem. 194:755-763). Dokazano je daje PSA uglavnom odgovorna za otapanje gel strukture formirane pri ejakulaciji proteolizom glavnih proteina u gelu koji sadrži spermu, Semenogelin 1 i Semenogelin II, i fibronectin (Lilja, H. (1985). J. Clin. Invest. 76:1899; Lilja, H., Oldbring, J., Rannevik, G., i dr. (1987). J. Clin. Invest. 80:281; McGee, R.S., Herr, J.C. (1988). Biol Reprod. 39:499). PSA pospješena proteoliza proteina koji formiraju gel stvara nekoliko topivih Semenogelin 1 i Semenogelin II fragmenta i topivih fragmenata fibronectina s likvifacijom ejakulata i puštanjem progresivno mobilnih spermatozoida (Lilja, H., Laurell, C.B. (1984). Scand. J. Clin. Lab. Invest. 44:447; McGee, R.S., Herr, J.C. (1987). Biol. Reprod. 37:431). Nadalje, PSA može proteolitički razgraditi IGFBP-3 (inzulinu sličan faktor rasta koji vezuje protein 3) dozvoljavajući IGF-u da stimulira specifično rast stanica koje luče PSA (Cohen i dr., (1992) J. Clin. Endo. & Meta. 75:1046-1053).

PSA komplekisiran na alfa 1 – antikimotripsin je dominantna molekulama forma seruma PSA i predstavlja do 95% detektiranog serumskog PSA (Christensson, A., Bjčrk, T., Nilsson, 0.5 i dr. (1993). J.Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625; Stenman, U.H., Leinoven, J., Alfthan, H., i dr. (1991). Cancer Res. 51:222-226). Tkivo prostate (normalno, benigna hyperplazija, ili maligno tkivo) je implicirano u dominantnom otpuštanju zrele, enzimski aktivne forme PSA, kako je ta forma potrebna za kompleksnu formaciju sa alfa 1 - antikimotripsinom (Mast, A.E., Enghild, J.J., Pizzo, S.V., i dr. (1991). Biochemistry 30: 1723-1730; Perlmutter, D.H., Glover, G.L, Rivetna, M., i dr. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3753-3757). Stoga, u mikrookružju prostatskih stanica koje luče PSA, ovaj je procesiran i izlučen u zreloj enzimski aktivnoj formi, ne kompleksiranoj na bilo koju inhibitornu molekulu. PSA također formira stabilne komplekse sa alfa 2 -makroglobulinom, ali kako ovo rezultira enkapsulacijom PSA i potpunim gubitkom PSA epitopa, in vivo značaj ove kompleksne formacije nije jasan. Slobodna, nekompleksirana forma PSA predstavlja manju frakciju serumskog PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., i dr. (1993). J. Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625). Veličina ove forme serumskog PSA je slična onoj PSA u sjemenoj tekućini (Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625) ali je još nepoznato da H slobodna forma serumskog PSA može biti zimogen; interno cijepana, neaktivna forma zrelog PSA; ili PSA koji manifestira enzimsku aktivnost. Međutim, čini se nevjerojatnim da slobodna forma serumskog PSA pokazuje enzimsku aktivnost, jer postoji znatan (100 do 1000 -struki) molarni suvišak kako nereagiranog alfa 1 - antikimotripsina i alfa 2 -makroglobulina u serumu, u odnosu na detektirane razine seruma slobodne 33 kDa forme PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O., i dr. (1993). J.Urol. 150:100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin.Chem. 37:1618-1625).

Serumska mjerenja PSA su korisna za promatranje liječenja adenokarcinoma prostate (Duffy, M.S. (1989). Ann. Clin. Biochem. 26:379-387; Brawer, M.K. i Lange, P.H. (1989). Urol. Suppl. 5:11-16; Hara, M. i Kimura, H. (1989). J. Lab. Clin. Med. 113:541-548), iako su koncentracije serumskog PSA iznad normalnih također zapažene u benigne hiperplazije prostate i nakon kirurških trauma prostate (Lilja, H., Christensson, A., Dahlen, U. (1991). Clin. Chem. 37:1618-1625). Poznato je da metastaze prostate također luče imunološki reaktivni PSA, pošto je serumski PSA detektiran u visokim razinama kod pacijenata s prostatektomijom, pokazujući rašireni metatstazirani rak prostate (Ford, T.F., Butcher, D.N., Masters, R.W., i dr. (1985). Brit. J. Urology 57:50-55). Stoga, citotoksični spoj koji bi mogao biti aktiviran proteolitičkom aktivnošću PSA, treba biti specifičan za prostatne stanice kao i specifičan za prostatne metastaze koje luče PSA.

Cilj je ovog izuma da pruži novi anti-kancerogeni sastav koristan za liječenje raka prostate, koji sadrži oligopeptide, koji su selektivno proteolitički cijepani slobodnim prostata-specifičnim antigenom (PSA), u konjukciji sa vinca alkaloid citotoksičnim agensom.

Drugi cilj ovog izuma je da pruži metodu liječenja raka prostate, koja se sastoji od davanja novog anti-kancerogenog sastava.

Kratki pregled izuma

Opisani su kemijski konjugati koji sadrže oligopeptide, sa sekvencijama aminokiselina koje su selektivno proteolitički cijepane, pomoću slobodnog prostata specifičnog antigena (PSA), i sadrže vinca alkaloid citotoksični agens. Konjugati izuma su karakterizirani vezivanjem cijepanih oligopeptida na atom kisika na 4-poziciji vinca lijeka koji je deacetiliran. Takvi konjugati su korisni u liječenju raka prostate i benigne hiperplazije prostate (BPH).

Detaljan opis izuma

Predmetni izum odnosi se na novi anti-kancerogeni sastav koristan za liječenje raka prostate. Takvi sastavi sadrže kovalentno vezan oligopeptid, opciono kroz kemijski linker na vinca alkaloid citotoksični agens. Točka vezivanja oligopeptida na vinca alkaloid citotoksični agens je na kisikovom atomu na 4-poziciji vinca alkaloid citotoksičnog agensa. Podrazumijeva se da oni vinca alkaloid citotoksični agensi koji imaju acetil dio na kisikovom atomu na 4-poziciji moraju prvo biti deacetilirani prije formiranja predmetnih konjugata. Oligopeptidi su odabrani od oligomera koji su selektivno prepoznati od slobodnog prostata specifičnog antigena (PSA) i sposobni su biti proteolitički cijepani enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena. Takva kombinacija oligopeptida i citotoksičnog agensa može biti nazvana konjugat.

Idealno, citotoksična aktivnost vinca lijeka je znatno oslabljena ili nepostojeća kada je oligopeptid sa lokacijom PSA proteolitičkog cijepanja dodan, ili direktno ili kroz kemijski linker, vinca lijeku i kada je oligopeptid cjelovit. Također idealno, citotoksična aktivnost vinca lijeka se znatno povećava ili vraća na aktivnost nemodificiranog vinca lijeka, nakon proteolitičkog cijepanja vezanog oligopeptida na vezi peptida, gdje je oligopeptid cijepan slobodnim PSA i uz hidrolizu endogenih amino peptidaza.

Nadalje, poželjno je daje oligopeptid odabran od oligopeptida koji nisu cijepani ili su cijepani pri mnogo manjim brzinama u nazočnosti ne-PSA proteolitičkih enzima, kao što su oni enzimi endogeni ljudskom serumu, prije cijepanja slobodnog PSA, kada se usporedi s cijepanjem oligopeptida u nazočnosti slobodnog enzimski aktivnog PSA. Otkriveno je daje poželjna aminokiselina na točki vezivanja oligopeptida na vinca lijek, ilije opcionalni linker sekundama aminokiselina, odabrana od grupe koju čine prolin, 3-hidroksiprolin, 3-fluoroprolin, pipekolna kiselina, 3-hidroksipipekolna kiselina, 2-azetidin, 3-hidroksi-2-azetidin, sarkozin i slično. Još poželjnije, aminokiselina na mjestu vezivanja oligopeptida na vinca lijek je opcioni linker ciklična aminokiselina, odabrana od grupe koju čine prolin, 3-hidroksiprolin, 3-fluoroprolin., pipekolna kiselina, 3-hidroksipipekolna kiselina, 2-azetidin, 3-hidroksi-2-azetidin i slično.

Zbog navedenih razloga, poželjno je za oligopeptide da sadrže kratku peptidnu sekvenciju, poželjno manju od deset aminokiselina. Najpoželjnije je da oligopeptid sadrži sedam ili šest aminokiselina. Zato što konjugat poželjno sadrži kratku sekvenciju aminokiselina, na topljivost konjugata može utjecati u većoj mjeri općenito hidrofobni karakter komponente citotoksičnog agensa. Stoga., aminokiseline sa hidrofilnim supstituentima mogu biti inkorporirane u oligopeptidnu sekvenciju ili N-terminus blokirajuće grupe, mogu biti odabrane tako da odgode ili smanje takve hidrofobne utjecaje citotoksičnih agensa.

Dok nije potrebno za prakticiranje ovog aspekta izuma, poželjna implementacija ovog izuma je konjugat gdje su oligopeptid i opcionalni kemijski linker, ukoliko je nazočan, odvojeni od citotoksičnog agensa proteolitičkom aktivnošću slobodnog PSA i bilo kojeg drugog urođenog proteolitičkog enzima nazočnog u blizini tkiva, čime predstavlja citotoksični agens, ili citotoksični agens koji zadržava dio oligopeptid/linkerjedimcu., ali ostaje citotoksičan, u fiziološko okružje na mjestu proteolitičkog cijepanja. Farmaceutski prihvatlJive soli konjugata također su uključene.

Razumije se da oligopeptid koji je konjugiran u citotoksični agens, bilo kroz direktnu kovalentnu vezu ili kroz kemijski linker, ne treba biti oligopeptid koji ima najveću prepoznatljivost od slobodnog PSA i najlakše se proteolitički cijepa slobodnim PSA. Stoga, oligopeptid odabran za uključivanje u takav anti-kancerogeni sastav biti će odabran kako zbog selektivnog, proteolitičkog cijepanja slobodnim PSA tako i zbog citotoksične aktivnosti konjugata citotoksičnog agensa-proteolitičkog ostatka (ili, kod idealne situacije, nemodificiranog citotoksičnog agensa) koji rezultira takvim cijepanjem. Izraz "selektivan" kako je korišten glede proteolitičkih PSA cijepanja, znači veću učestalost cijepanja oligopeptidne komponente predmetnog izuma slobodnim PSA u odnosu na cijepanje oligopeptida koji čini slučajnu sekvenciju aminokiseline. Stoga, oligopeptidna komponenta predmetnog izuma je poželjan supstrat slobodnog PSA. Izraz "selektivan" također označava da je oligopeptid proteolitički cijepan slobodnim PSA između dvije specifične aminokiseline u oligopeptidu.

Komponente oligopeptida predmetnog izuma su selektivno prepoznate od slobodnih prostata specifičnih antigena (PSA) i sposobni su za proteolitičko cijepanje enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena. Takvi oligopeptidi čine oligomer odabran od:

a) AsnLysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 1),

b) LysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 2),

c) AsnLysIleSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.: 3),

d) AsnLysAlaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 4),

e) SerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 5);

f) LysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 6);

g) hArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 7);

h) hArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 8);

i) TyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 9);

j) TyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 10);

k) TyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.: 11);

1) ChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 12);

m) ChgGlnjSerNle (SEQ.ID.NO.: 13);

n) SerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 14);

o) SerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 15);

p) SerTyrGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 16);

q) SerChgGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 17);

r) SerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 18);

s) SerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 19);

t) HaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 20);

u) HaaXaaLysTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 21);

v) HaaXaahArgTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 22);

w) HaaXaahArgChaGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 23);

x) HaaTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 24);

y) HaaXaaSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 25);

z) HaaChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 26);

gdje je Haa ciklička aminokiselina supstituirana s hidrofilnim dijelom, hArg je homoarginin, Xaa je bilo koja aminokiselina, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin.

U jednoj implementaciji predmetnog izuma, oligopeptid sadrži oligomer odabran od:

a) SerSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.: 27);

b) SerSerChgGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 28);

c) SerSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.: 29);

d) SerSerChgGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 30);

e) 4-HypSerSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 31);

f) 4-HypSerSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 32);

h) AlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 33);

i) AlaSerChgGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 34);

j) AlaSerTyrGln|SerAla (SEQ.ID.NO.: 35);

k) AlaSerChgGln|SerAla (SEQ.ID.NO.: 36);

1) 4-HypAlaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 37);

m) 4-HypAlaSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 38);

gdje je 4-Hyp 4-hidroksiprolin, Xaa je bilo koja aminokiselina, hArg je homoarginin, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin.

U još poželjnijoj implementaciji predmetnog izuma, oligopeptid sadrži oligomer odabran od:

SerSerChgGln|SerAlaPro (SEQ.ID.NO.: 39);

SerSerChgGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 40);

SerSerChgGln|SerAla4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 41);

SerSerChgGln|SerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 42);

AbuSerSerChgGln|SerPro (SEQ.ID.NO.: 43);

AbuSerSerChgGln|Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 44);

SerSerSerChgGln|SerLeuPro (SEQ.ID.NO.: 45);

SerSerSerChgGln|SerValPro (SEQ.ID.NO.: 46);

SerAlaSerChgGln|SerLeu4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 47);

SerAlaSerChgGln|SerValPro (SEQ.ID.NO.: 48);

(N-metil-Ser)SerSerChgGln|SerLeuPip (SEQ.ID.NO.: 49);

(N-metil-Ser)SerSerChgGln|SerValPip (SEQ.ID.NO.: 50);

4-HypSerSerTyrGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 51);

4-HypSerSerTyrGln|SerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 52);

4-HypSerSerTyrGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 53);

4-HypSerSerTyrGln|SerSerSer (SEQ.ID.NO.: 54);

4-HypSerSerTyrGln|Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 55);

4-HypSerSerChgGln|SerPro (SEQ.ID.NO.: 56);

4-HypSerSerChgGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 57);

4-HypSerSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 58);

4-HypSerSerChgGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 59);

4-HypAlaSerChgGln|SerValPro (SEQ.ID.NO.: 60);

4-HypAlaSerChgGln|SerSerPip (SEQ.ID.NO.: 61);

4-HypSerSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 62);

4-HypSerSerChgGln|SerGly (SEQ.ID.NO.: 63);

SerSerChgGln|SerGly (SEQ.ID.NO.: 64);

3-PalSerSerTyrGln|Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 65);

3-PalSerSerChgGln|SerPro (SEQ.ID.NO.: 66);

(3,4-DiHyp)SerSerTyrGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 67); i

(3,4-DiHyp)SerSerTyrGln|SerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 68);

gdje je Abu je aminomaslačna kiselina, 4-Hyp je 4-hidroksiprolin, Pip je pipekolinska kiselina, 3,4-DiHyp je 3,4-dihidroksiprolin, 3-Pal je 3-piridilalanin, Sar je sarkozin i Chg je cikloheksilglicin.

Fraze "oligomeri koji sadrže sekvenciju aminokiselina" kako je gore korišteno, i drugdje u detaljnom opisu izuma, opisuju oligomere od oko 3 do oko 100 rezidua aminokiselina, koji uključuju u svojim sekvencijama aminokiselina, opisanu specifičnu sekvenciju aminokiselina i koji su stoga proteolitički cijepani sa sekvencijom aminokiseline opisanom slobodnim PSA. Poželjan je oligomer od 5 do 10 rezidua aminokiselina. Stoga, na primjer, sljedeći oligomer:

hArgSerAlaChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 69);

sadrži sekvenciju aminokiselina:

ChgGln| SerLeu (SEQ.ID.NO.: 12); i stoga bi potpalo pod predmetni izum. 1 oligomer:

hArgSer4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 70);

sadrži sekvenciju aminokiselina:

4-HypChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 71); i stoga bi potpalo pod predmetni izum. Razumije se da takvi oligomeri ne uključuju semenogelin 1 i semenogelin II.

Osoba stručna u kemiji peptida mogla bi shvatiti da izvjesne aminokiseline u biološki aktivnom oligopeptidu mogu biti zamijenjene drugim homolognim, izosteričkim i/ili izoelektronskim aminokiselinama, gdje je biološka aktivnost originalnog oligopeptida očuvana u modificiranom oligopeptidu. Izvjesne neprirodne modificirane prirodne aminokiseline mogu također biti korištene da zamjene odgovarajuće prirodne aminokiselina kod oligopeptida predmetnog izuma. Stoga, na primjer, tirozin može biti zamijenjen s S-jodotirozin, 2-metiltirozin, 3-fluorotirozin, 3-metiltirozin i slično. Nadalje, na primjer, lizin može biti zamijenjen sa N'-imidazolil)lizinom i slično. Sljedeća lista zamjena aminokiselina treba biti ilustrativna i nije ograničavajuća:

[image]

Stoga, na primjer, sljedeći oligopeptidi mogu biti sintetizirani tehnikama dobro poznatim stručnim osobama i očekivalo bi se da se proteolitički cijepaju slobodnim PSA:

AsnArgIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 72)

AsnLysValSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 73)

AsnLysMetSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 74)

AsnLysLeuSerTyrGln |SerSer (SEQ.ID.NO.: 75)

AsnLysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 76)

GlnLysIleSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 77).

Asn4-HypIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 78)

Asn4-HypValSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 79)

4-HypAlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 80)

(3,4-dihidroksiprolin)AlaSerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 81)

3-hidroksiprolinSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 82)

4-HypAlaSerChgGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 83).

Korištenje simbola "|" unutar sekvencije aminokiselina 3 označava mjesto u toj sekvenciji gdje je oligopeptid proteolitički cijepan slobodnim PSA.

Spojevi predmetnog izuma mogu imati asimetrične centre i javljati se kao racemati, racematne smjese, i kao pojedinačni diastereomeri, sa svim mogućim izomerima, uključujući optičke izomere, uključene u ovaj izum. Ukoliko nije drukčije specificirano, podrazumijeva se da imenovane aminokiseline imaju prirodne "L" stereokonfiguracije.

U ovom izumu, aminokiseline koje su opisane su identificirane kako s konvencionalna 3 slova i kraticom s jednim slovom kako je dolje naznačeno:

[image]

Sljedeće kratice su korištene u specifikaciji i slikama da označe indicirane aminokiseline i dijelove:

hr ili hArg: homoarginin

hY ili hTyr: homotirozin

Cha: cikloheksilalanin

Amf: 4-aminometilfemlalanin

DAP: 1,3-diaminopropil

DPL: 2-(4,6-dimetilpirimidmil)hzm

(imidazolil)K: N’-imidazoliolizin

Me2PO3-Y: O-dimetilfosfotirozin

O-Me-Y: O-metiltirozin

TIC: 1,2,3,4-tetrahidro-3-izoquinolin karboksilna

kiselina

DAP: 1,3-diaminopropan

TFA: trifluorooctena kiselina

AA: octena kiselina

3PAL: 3-piridilalanin

4-Hyp: 4-hidroksiprolin

dAc-Vin: 4-des-acetilvinblastin

Pip: pipekolinska kiselina

Abu: 2-aminomaslačna kiselina

Nva: norvalin

Poznato je u struci i razumije se u predmetnom izumu, da peptidil terapijski agensi, kao što su predmetni konjugati oligopeptid-citotoksičnih agensa poželjno imaju završni amino dio bilo kojeg oligopeptid supstituenta, zaštićen sa odgovarajućom zaštitnom grupom, kao što je acetil, benzoil, pivaloil i slično. Takva zaštita terminalne amino grupe smanjuje ili eliminira enzimsku degradaciju takvih peptidil terapijskih agensa djelovanjem egzogenih amino peptidaza koji su nazočni u krvnoj plazmi toplokrvnih životinja. Takve zaštitne grupe također uključuju hidrofilne grupe blokatora, koje su odabrane na osnovu nazočnosti hidrofilnih funkcionalnosti. Grupe blokatora koje povećavaju hidrofilnost konjugata i stoga povećavaju vodenu topljivost konjugata, uključuju, ali nisu ograničeni na hidrolirani alkanoil, polihidroksilirani alkanoil, polietilen glikol, glikosilate, šećere i crown etere. N-Terminalni dijelovi neprirodnih aminokiselina mogu također pospješiti takvu enzimsku degradaciju egzogenim amino peptidazama.

Poželjno je daje N-terminalna zaštitna grupa odabrana od:

a) acetil;

[image]

gdje su:

Rl i R2 neovisno odabrani od:

a) vodika,

b) nesupstituiranog ili supstituiranog aril, nesupstituiranog ili supstituiranog heterocikla, C3-10 cikloalkil, C2-C6 alkenil, C2-C6 alkinil, halogen, C1-C6 perfluoroalkil, R3O-, R3C(O)NR3-, (R3)2NC(O)-, R32N-C(NR3)-, R4S(O)2NH, CN, NO2, R3C(O)-, N3, -N(R3)2, ili R4OC(O)NR3-,

c) nesupstituiranog C1-C6 alkila

d) supstituiranog C1-C6 alkila gdje je supstituent na supstituiranom C1-C6 alkilu odabran od nesupstituiranog ili supstituiranog arila, nesupstituiranog ili supstituiranog heterociklika, C3-C10 cikloalkila, C2-C6 alkenila, C2-C6 alkinila, R3O-, R4S(O)2NH, R3C(O)NR3-, (R3)2NC(O)-, R32N-C(NR3)-, CN, R3C(O)-, N3, -N(R3)2, i R4O)C(O)-NR3-; ili

Rl i R2 su kombinirani u formu -(CH2)s- gdje je jedan od ugljikovih atoma opcionalno zamjenjen dijelom odabranim od:

O, S(O)m, -NC(O)-, NH i -N(COR4)-;

R3 odabran od: vodik, aril, supstituirani aril, heterocikl, supstituirani heterocikl, C1-C6 alkil i C3-C10 cikloalkil;

R4 odabran od: aril, supstituirani aril, heterocikl, supstituirani heterocikl, C1-C6 alkil i C3-C10 cikloalkil;

m je 0, 1 ili2;

n je 1, 2, 3 ili 4;

p je 0 ili cijeli broj između 1 i 100; i

q je 0 ili 1, pod uvjetom da akoje p 0, q je 1; i

r je l, 2 ili 3;

s je 3, 4 ili 5.

Izvjesni oligopeptidi ovih konjugata sadrže cikličku aminokiselinu supstituiranu sa hidrofilnim dijelom, prethodno predstavljenim izrazom "Haa", koji može također bti predstavljen formulom:

[image]

gdje je:

R5 odabran od HO- i C1-C6 alkoksi;

R6 odabran od vodika, halogena, C1-C6 alkil, HO-i C1-C6alkoksi;i

T je3 ili4. struktura

[image]

predstavlja ciklički amino dio, s 5 ili 6 članova u prstenu, takvi ciklički amini koji mogu biti opcionalno kondenzirani u fenil ili cikloheksil prsten. Primjeri takvih cikličkih amino dijelova uključuju, ali nisu ograničeni na, sljedeće specifične strukture:

[image]

Konjugati predmetnog izuma mogu imati asimetrične centre i javljaju se kao racemati, racematne smjese, i kao pojedinačni diastereomeri, sa svim mogućim izomerima, uključujući optičke izomere, uključene u predmetni izum. Kada se bilo koja varijabla (npr. aril, heterocikl, R3 itd.) javlja više odjednom u bilo kojem obliku, njegova je definicija pri svakom javljanju neovisna od bilo kojeg drugog javljanja. Na primjer, HO(CR1R2)2- predstavlja HOCH2CH2-, HOCH2CH(OH)- HOCH(CH3)CH(OH)-, itd. Također, kombinacije supstituentata i/ili variabli su dopustive samo ako takve kombinacije rezultiraju stabilnim spojevima.

Kako je ovdje korišten, "alkil" i alkil dio aralkila i slični izrazi, uključuju kako razgranate tako i ravno-lančane zasićene alifatske hidrokarbonske grupe sa specifičnim brojem ugljikovih atoma; "alkoksi" predstavlja alkil grupe s indiciranim brojem ugljikovih atoma vezanih preko kisikovog mosta.

Kako se ovdje koristi, "cikloalkil" uključije ne-aromatske cikličke hidrokarbon grupe sa specifičnim brojem ugljikovih atoma. Primjeri cikloalkil grupe uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i slično.

"Alkenil" grupe uključuju grupe sa specifičnim brojem ugljikovih atoma i sa jednom ili više dvostrukih veza. Primjeri alkenil grupe uključuju vinil, alil, izopropenil, pentenil, heksenil, heptenil, ciklopropenil, ciklobutenil, ciklopentenil, cikloheksenil, l-propenil, 2-butenil, 2-metil-2-butenil, izoprenil, famesil, geranil, geranilgeranil i slično.

"Alkinil" grupe uključuju grupe sa specifičnim brojem ugljikovih atoma i jednom trostrukom vezom. Primjeri alkinil grupa uključuju acetilen, 2-butinil, 2-pentinil., 3-pentinil i slično.

"Halogen" ili "halo" kako se ovdje koristi, znači fluoro, kloro, bromo i jodo.

Kako se ovdje koristi, "aril" i aril dio aralkila i aroila, znači bilo koji stabilan monociklički ili biciklički ugljikov prsten do 7 članova u svakom prstenu, gdje je najmanje jedan prsten aromatski. Primjeri takvih aril elemenata uključuju fenil, naftil, tetrahidro-naftil, indanil., bifenil, fenantril, antril ili acenaftil.

Izraz heterocikl ili heterociklički, kako se ovdje koristi, predstavlja stabilne 5- do 7-člane monocikličke ili stabilne 8- do 11-člane bicikličke heterocikličke prstene koji su ili zasićeni ili nezasićeni, i koji se sastoji od ugljikovih atoma i jedan do četiri heteroatoma odabranih od grupe koju čine N, O i S, i uključujući bilo koje bicikličke grupe, gdje je bilo koji od gore-definiranih heterocikličkih prstenova kondenziran u benzenski prsten. Heterociklički prsten može biti vezan za bilo koji heteroatom ili ugljikov atom koji rezultira u stvaranju stabilne strukture. Primjeri takvih heterocikličkih elemenata uključuju, ali nisu ograničeni na, azepinil, benzimidazolil, benzizoksazolil, benzofurazanil, benzopiranil, benzotiopiranil, benzofuril, benzotiazolil, benzotienil, benzoksazolil, kromanil, kinolinil, dihidrobenzofuril, dihidrobenzotienil, dihidrobenzotiopiranil, dihidrobenzotiopiranil sulfon, furil, imidazolidinil, imidazolinil, imidazolil, indolinil, indolil, izokromanil, izoindolinil, izoquinolinil, izotiazolidinil, izotiazolil, izotiazolidinil, morfolinil, nafthyridinil, oksadiazolil, 2-oksoazepinil, oksazolil, 2-oksopiperazinil, 2-oksopiperdinil, 2-oksopirrolidinil, piperidil, piperazinil, piridil, pirazinil, pirazolidinil, pirazolil, piridazinil, pirimidinil., pirrolidinil, pirrolil, quinazolinil, quinolinil, qumoksalinil5 tetrahidrofuril, tetrahidroizoquinolinil, tetrahidroquinolinil, tiamorfolinil, tiamorfolinil sulfoksid, tiazolil, tiazolinil, thienofuril, tienotienil, i tienil.

Kako se ovdje koristi izraz "supstituirani C1-8 alkil" "supstituirani aril" i "supstituirani heterocikl" uključuju dijelove koji sadrže od 1 do 3 supstituenata uz mjesto vezivanja za ostatak spoja. Takvi dodatni supstituenti su odabrani od F, Cl, Br, CF3, NH2, N(C1-C6 alkil)2, NO2, CN, (C1-C6 alkil)O-, -OH, (C1-C6 alkil)S(O)m-, (C1-C6 alkil)C(O)NH-, H2N-C(NH)-, (C1-C6 alkil)C(O)-, (C1-C6 alkil)OC(O)-, N3, (C1-C6 alkil)OC(O)NH- i C1-C20 alkil.

Kada su R1 i R2 kombinirani u formu - (CH2)s -9 ciklički dijelovi i ciklički dijelove koji sadrže heteroatom, tako su defmirani da uključuju, ali nisu ograničeni na:

[image]

Kako se ovdje koristi, izraz "hidroksiliran" predstavlja supstituciju na zamjenjivom ugljiku prstena, opisanom kao hidroksilni dio. Kako se ovdje koristi, izraz "poluhidroksiliran" predstavlja supstituciju na dva ili više zamjenjivih ugljika na prstenu, opisanom s 2, 3 ili 4 hidroksilnih dijelova.

Kako se ovdje koristi, izraz "PEG" predstavlja izvjestan polietilen glikol koji sadrže supstituent s odredenim brojem etilenoksi poddjelova. Stoga izraz PEG(2) predstavlja

[image]

i izraz PEG(6) predstavlja

[image]

Kako se ovdje koristi, izraz "(d)(2,3-dihidroksipropionil)" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

Kako se ovdje koristi, izraz "(2R, 3S) 2,3,4-trihidroksibutanoil" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

Kako se ovdje koristi, izraz "guinil" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

ili njezin diastereomer.

Kako se ovdje koristi, izraz "cotininil" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

ili njegov diastereomer.

Kako se ovdje koristi, izraz "galil" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

Kako se ovdje koristi, izraz "4-etoksisquarat" predstavlja sljedeću strukturu:

[image]

Citotoksični agens korišten u konjugatu predmetnog izuma može biti odabran od vinca alkaloid citotoksičnih agensa. Naročito korisni članovi ove skupine uključuju, na primjer, vinca alkaloid odabran od vinblastin, vincristin, leurosidin, vindesin, vinorelbin, navelbin, leurosin i slično ili njihovi optički izomeri. Razumije se da konjugati predmetnog izuma imaju vezu oligopeptida preko kisikovog atoma vezanog na C-4 vinca alkaloid.

Stoga, izvjesni vinca alkaloidi imaju acetil dio na tom kisiku i moraju prvo biti deacetilirani, prije spajanja na oligopeptid (ili opcionalni linker). Nadalje, stručna osoba može raditi kemijske modifikacije na željenom citotoksičnom agensu radi prilagođavanja reakcija tog spoja u svrhu priprave konjugata ovog izuma.

Poželjne grupe 4-desacetil-vinca alkaloid citotoksičnih agensa za predmetni izum uključuju lijekove sljedeće formule:

SKUPINA LIJEKOVA VINCA ALKALOIDA FORMULE I:

[image]

gdje je

R7 H, CH3 ili CHO;

gdje se R9 i Rl0 uzimaju pojedinačno, R10 je H, i jedan od R8 i

R9 je etil, a drugi je H ili OH;

gdje se R9 i R10 uzimaju zajedno radi stvaranja dvostruke veze,

R8 je etil;

R11 je vodik;

R12 je OH, O-(C1-C3 alkil), ili NH2.

Konjugat oligopeptid-citotoksični agens iz predmetnog izuma gdje je citotoksični agens poželjno citotoksični agens 4-O-dezacetilvinblastin, može se opisati općom formulom Ia dolje:

[image]

gdje:

oligopeptid je oligopeptid koji je specifično prepoznat od slobodnog prostata specifičnog antigena (PSA) i sposoban je za proteolitičko cijepanje enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena,

XL odabran od: veza, - C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-O-

i - C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-NH-;

R odabran od

a) vodik,

b) -(C=O)R1a

[image]

c) etoksisquarat; i

d) cotininil;

R1 i R2 su neovisno odabrani od: vodik, OH, C1-C6 alkil, C1-C6 alkoksi, C1-C6 aralkil i aril;

R1a je C1-C6-alkil, hidroksilani C3-C8-cikloalkil, polihidroksilirani C3-C8-cikloalkil, hidroksilirani aril, polihidroksilirani aril ili aril,

R9 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorosupstitutuiran (C1-C3alkil)-CO;

W je odabran od razgranatih ili ravnih lanaca C1-C6-alkil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil ili biciklo[2.2.2]octanil;

n je 1, 2, 3 ili 4;

p je 0 ili cijeli broj između 1 i 100;

q je 0 ili 1, s tim da akoje p 0, q je 1;

r je l,2 ili 3;

t je 3 ili 4;

u je 0, 1,2 ili 3,

ili farmaceutski prihvatljiva sol ili njegov optički izomer.

Poželjno, XL veza.

U implementacijama predmetne prijave, dio oligopeptida - R odabran je od:

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 84)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 85)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 86)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 87)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal; (SEQ.ID.NO.: 88)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 89)

Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 90)

hidroksiacetilAbu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 91)

acetil3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 92)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val; (SEQ.ID.NO.: 93)

Ac--4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu; (SEQ.ID.NO.: 94)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 95)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerPro; (SEQ.ID.NO.: 96)

Ac-SerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 98)

Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 99)

Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 100)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerAla; (SEQ.ID.NO.: 103)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerChg; (SEQ.ID.NO.: 104)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 105)

Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp; (SEQ.ID.NO.: 106)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 107)

Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro; (SEQ.ID.NO.: 108)

Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 109)

Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 111)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 114)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro; (SEQ.ID.NO.: 115)

Ac-SerChgGln-SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 116)

Ac-SerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 117)

Ac-SerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 118)

Ac-SerChgGlnSerSerAibPro; (SEQ.ID.NO.: 119)

Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala; (SEQ.ID.NO.: 120)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip; (SEQ.ID.NO.: 124)

i Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA; (SEQ.ID.NO.: 125)

gdje je Abu aminomaslačna kiselina, 4-trans-L-Hyp je 4-trans-L-hidroksiprolin, Pip je pipekolinska kiselina, 3,4-DiHyp je 3,4-dihidroksiprolin, 3-PAL je 3-piridilalanin, Sar je sarkozin i Chg je cikloheksilglicin.

Sljedeći spojevi su specifični primjeri oligopeptid-dezacetilvinblastin konjugata predmetnog izuma:

[image]

gdje je X

[image]

ili njihova farmaceutski prihvatljiva sol ili optički izomer.

Oligopeptidi, peptidni poddjelovi i peptidni derivati (također zvani "peptidi") predmetnog izuma mogu biti sintetizirani od njihovih sastavnih aminokiselina konvencionalnim tehnikama sinteze peptida, poželjno tehnologijom čvrste faze. Peptidi su zatim pročišćeni pomoću reverzne faze tekućinskom kromatografijom visoke performanse (HPLC).

Standardne metode sinteze peptida su opisane, na primjer, u sljedećim radovima: Schroeder ; dr., "Peptides", Vol. I, Academic Press 1965; Bodansky ; dr,, "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966; McOmie (ed.) "Protective Groups in Organic Chemistrv", Plenum Press., 1973; Barany ; dr.," Peptides: Analysis, Svnthesis, Biology" 2, Chapter 1, Academic Press, 1980, i Stewart ; dr., "SolidPhase Peptide Synthesis", Second Edition, Pierce Chemical Company, 1984. učenja ovih radova su ovim inkorporirana referencom.

Prikladno supstituirana ciklička aminokiselina s hidrofilnim supstituentom, koji može biti inkorporiran u predmetni konjugat standardnim tehnikama sinteze peptida, je po sebi ili komercijalno raspoloživ ili je lako sintetiziran tehnikama dobro znanim u struci ili ovdje opisanim. Stoga je sinteza prikladno supstituiranih prolina opisana u sljedećim člancima i referencama u njima navedenim: J. Ezquerra i dr., J, Org. Chem. 60: 2925-2930 (1995); P. Gill i W. D. Lubell, J Org. Chem., 60:2658-2659 (1995); i M. W. Holladay i dr., J Med. Chem., 34:457-461 (1991). Učenja ovih radova su ovim inkorporirana referencom.

Farmaceutski prihvatljive soli spojeva ovog izuma uključuju konvencionalne netoksične soli spojeva ovog izuma onako kako su formirane, npr., od netoksične anorganske ili organske kiseline. Na primjer, takve konvencionalne netoksične soli uključuju one izvedene od neorganskih kiselina kao što su klorovodična, hidrobromna, sumpoma, sulfaminska, fosfoma, dušična i slično: i soli pripravljene od organskih kiselina kao što su octena, propionska, sukcinatna, glikolna, stearinska, mliječna, maleinska, vinska, limunska, askorbinska, pamoinska, maleinska, hidroksimaleinska., feniloctena, glutaminska, benzoinska, salicilna, sulfanilna, 2-acetoksibenzoinska, mravlja, toluenesulfonska, metansulfonska, etan disulfonska, oksalna, izetionska, trifluoroctena i slično.

Konjugati predmetnog izuma koji sadrže oligopeptide, a oni se sastoje od PSA mjesta cijepanja i vinca alkaloid citotoksičnog agensa, mogu biti sintetizirani tehnikama dobro znanim u medicinskoj kemiji. Na primjer, hidroksil dio vinca lijeka može biti kovalentno vezan na oligopeptid na karboksilnom kraju, tako da se formira esterska veza. Za ovu svrhu mogu biti korišteni reagensi kao što je kombinacija HBTU i HOBT, kombinacija BOP i imidazola, kombinacija DCC i DMAP, i slično. Karboksilna kiselina može također biti aktivirana formiranjem nitrofenil estera ili slično i reagira u nazočnosti DBU (l,8-diazabiciklo[5,4,0]undek-7-en).

Stručne osobe razumiju da u sintezi spojeva ovog izuma, treba štititi razne reaktivne funkcije na početnim spojevima i međuproduktima, dok se željena reakcija izvrši na drugim dijelovima molekule. Nakon što su željene reakcije završene, ili u bilo koje željeno vrijeme, takve se zaštitne grupe uklanjaju, na primjer, hidrolitičkim sredstvima. Takvi zaštitni koraci su konvencionalni u organskoj kemiji.

Stručnjacima je referentna Protective Groups in Organic Chemistrv. McOmie, ed., Plenum Press, NY, NY (1973); i, Protective Groups in Organic Svnthesis. Greene, ed., John Wiley & Sons, NY, NY (1981) da se upoznaju sa zaštitnim grupama koje mogu biti korisne u pripravi spojeva predmetnog izuma.

Kao primjer, korisne amino-zaštitne grupe mogu uključivati, na primjer, C1-C10 alkanoil grupe, kao što su formil, acetil, dikloroacetil, propionil, heksanoil, 3,3-dietilheksanoil, 7-klorobutril., i slično; C1-C10 alkoksikarbonil i C5-C15 ariloksikarbonil grupe kao što su terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, aliloksikarbonil, 4-nitrobenziloksikarbonil, fluorenilmetiloksikarbonil i cinamoiloksikarbonil; halo-(C1-C10)-alkoksikarbonil kao što su 2,2,2-trikloroethoksikarbonil; i C1-Cl5 arilalkil i alkenil grupe kao što su benzil, fenetil, alil, tritil, i slično. Druge korištene amino-zaštitne grupe su one u formi enamina pripravljeni sa (β-keto-esterima kao što su metil ili etil acetoacetat.

Korisne karboksi-zaštitne grupe mogu uključivati, na primjer, C1-C10 alkil grupe kao što su metil, terc-butil, decil; halo-C1-C10 alkil kao što su 2,2,2-trikloroetil, i 2-iodoetil;

C5-C15 arilalkil kao što su benzil, 4-metoksibenzil, 4-nitrobenzil, trifenilmetil, difenilmetil; C1-C10 alkanoiloksimetil kao što su acetoksimetil., propionoksimetil i slično; i grupe kao što su fenacil, 4-halofenacil, alil, dimetilalil, tri-(C1-C3 alkil) silil, kao što su trimetilsilil, β-p-toluenesulfoniletil, β-p-nitrofenilthioetil, 2,4,6-trimetilbenzil, β-metiltioetil, ftalimidometil, 2,4-dinitro-fenilsulfenil, 2-nitrobenzhidril i srodne grupe.

Slično, korisne hidroksi zaštitne grupe mogu uključivati, na primjer, formil grupe, kloroacetil grupe, benzil grupe, benzhidril grupe, tritil grupe, 4-nitrobenzil grupe, trimetilsilil grupe, fenacil grupe, terc-butil grupe, metoksimetil grupe, tetrahidropiranil grupe, i slično.

Kao poželjna implementacija oligopeptida kombiniranog sa dezacetilvinblastinom, sljedeća Reakcijska Shema ilustrira sintezu konjugata predmetnog izuma.

Reakcijska Shema 1 ilustrira pripravu konjugata oligopeptida predmetnog izuma i vinca alkaloida s citotoksičnim agensom vinblastinom, gdje je veza kisika 4-dezacetilvinblastina na C-kraju oligopeptida. Dok druge sekvencije reakcije mogu biti korištene u formiranju takvih konjugata, nađeno je daje početna veza jedne aminokiseline na 4-kisiku i kasnije vezivanje preostale sekvencije oligopeptida, na tu aminokiselinu, predstavlja poželjnu metodu. Također je nađeno da 3,4dihidro-3-hidroksi-4-okso-1,2,3-benzotriazin (ODHBT) može biti korišten na mjestu HOAt u zadnjem koraku kupliranja.

Reakcijska Shema II ilustrira pripravu konjugata oligopeptida predmetnog izuma, gdje je hidroksi alkanolil kiselina korištena kao linker između vinca lijeka i oligopeptida.

[image]

Konjugati oligopeptid-citotoksičnog agensa ovog izuma korisni su u liječenju bolesti karakteriziranih abnormalnim stanicama ili abnormalnom proliferacijom stanica., bilo maligno ili benigno, gdje su te stanice karakterizirane svojom sekrecijom enzimski aktivnog PSA. Takve bolesti uključuju, ali nisu ograničene na, rak prostate, benignu hiperplaziju prostate, metastazirani rak prostate, rak dojke i slično.

Konjugati oligopeptid-citotoksični agens ovog izuma daju se pacijentu u obliku farmaceutskog sastava, kojeg čini konjugat predmetnog izuma i farmaceutski prihvatljivi nosač, ili njegov ekscipijent ili diluent.

Kako se ovdje koristi, "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na one agense koji su korisni u liječenju ili dijagnozi kod toplokrvne životinje uključujući, na primjer, ljude, konje, svinje, krave, ovce, pse, mačke, ili druge sisavce, kao i ptica ili druge toplokrvne životinje. Poželjan način davanja je parenteralno, naročito intravenozno, intramuskularno, supkutano, intraperitonealno, ili intralimfatičkim putem. Takve formulacije mogu biti pripravljene korištenjem nosača, otapala ili ekscipijenata poznatih stručnjacima. U ovom pogledu, vidi. npr. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Companv, edited by Osol i dr. Takvi sastavi mogu uključivati proteine, kao što su serumski proteini, na primjer, ljudski serumski albumin, puferi ili puferirajuće supstance kao što su fosfati, druge soli, ili elektroliti, i slično. Pogodna otapala mogu uključivati, na primjer, sterilnu vodu, izotonične soli, razrijeđenu vodenu dekstrozu, polihidrični alkohol ili smjese takvih alkohola, na primjer, glicerin, propilen glikol, polietilen glikol i slično. Sastavi mogu sadržavati konzervanse kao što su fenetil alkohol, metil i propil paraben, timerosal, i slično. Po želji, sastav može uključivati oko 0.05 do oko 0.20 težinskih postotaka antioksidansa, kao što su natrij metabisulfit ili natrij bisulfit.

Kako se ovdje koristi, izraz "sastav" treba obuhvatiti produkt koji čine specificirani sastojci u specificiranim količinama, kao i bilo koji produkt koji rezultira, direktno ili indirektno, od kombinacije specificiranih sastojaka u specificiranim količinama.

Farmaceutski sastavi mogu biti u obliku sterilne injektabilne vodene otopine. Među prihvatljiva sredstva i otapala koja mogu biti korištena spada voda, Ringerova otopina i izotonične otopine natrij klorida.

Sterilna injektabilna priprava može također biti sterilna injektablna mikroemulzija ulja u vodi, gdje je aktivni sastojak otopljen u uljnoj fazi. Na primjer, aktivni sastojak može biti prvo otopljen u smjesi sojinog ulja i lecitina. Uljna otopinaje zatim uvedena u smjesu vode i glicerola i procesirana da formira mikroemulziju.

Injektabilne otopine ili mikroemulzije mogu biti uvedene u krvotok bolesnika lokalnom injekcijom. Alternativno, može biti od koristi davanje otopine ili mikroemulzije na takav način tako da se održava stalna koncentracija u cirkulaciji predmetnog spoja. Da bi se održavala takva stalna koncentracija, može se koristiti sredstvo za kontinuirano intravenozno davanje. Primjer takvog sredstva je Deltec CADD-PLUS™ model 5400 intravenozna pumpa.

Farmaceutski sastavi mogu biti u obliku sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije za intramuskulamo i supkutano davanje. Ove suspenzije mogu biti formulirane prema metodama poznatim u struci, koristeći pogodne dispergirajuće agense ili ovlaživače i suspendirajuće agense koji su gore spomenuti. Sterilna injektabilna priprava može također biti sterilna injektabilna otopina ili suspenzija u netoksičnom parenteralno-prihvatljivom otapalu ili razrjeđivaču, na primjer kao otopina u 1,3-butan diolu. Dodatno, sterilna, stabilna ulja se uobičajeno koriste kao otapala ili suspendirajući medij. Za tu svrhu bilo koje blago stabilno ulje može biti korišteno, uključujući sintetske mono-ili digliceride. Dodatno, masne kiseline kao što su oleinska kiselina se koriste kod priprave injekcija.

Za intravenoznu primjenu, poželjno je da se sastav pripravlja tako da količina davana pacijentu bude od oko 0.01 do oko 1 g konjugata. Poželjno, davana količina je u razini od oko 0.2 g do oko 1 g konjugata. Konjugati ovog izuma su djelotvorni preko širokog opsega doziranja, ovisno o faktorima kao što su stanje bolesti koja se liječi ili biološki učinak kojeg se želi modificirati, način na koji je konjugat davan, starosti, težine i stanja bolesnika kao i drugih faktora koje određuje liječnik. Stoga, količina koja se daje bilo kojem bolesniku mora biti određena na individualnoj osnovi.

Stručna osoba će shvatiti da iako su prikazani specifični reagensi i uvjeti reakcija u sljedećim primjerima, mogu se činiti modifikacije koje su obuhvaćene duhom i opsegom ovog izuma. Sljedeći postupci i primjeri, stoga, su dani radi daljnje ilustracije ovog izuma, i nisu ograničavajući.

PRIMJERI

Primjer 1

des-acetilvinblastin-4-O-(N-Acetil-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-SerPro)ester

Korak A: Priprava 4-des- acetilvinblastina

Uzorak od 2.40 g (2.63 mmol) vinblastin sulfata (Sigma V-1377) je otopljen pod N2 u 135 ml apsolutnog metanola i tretiran sa 45 ml anhidriranog hidrazina, i otopina je miješana na 20-25°C 18 sati. Reakcija je uparavana do guste paste, koja je podijeljena između 300 ml CH2C12 i 150 ml zasićenog NaHCO3. Vodeni sloj je ispran sa 2 100-ml obroka CH2C12 , i svaki od 3 sloja CH2C12 je ispran sa 100 ml H2O (2X) svaki, i zasićenim NaCl (1X). Kombinirani organski slojevi su sušeni iznad bezvodnog Na2SO4, i otapalo je uklonjeno pod sniženim tlakom, da se dobije naslovni spoj, kao bjeličasti kristal. Ovaj materijal se skladišti na -20°C do uporabe.

Korak B: Priprava 4-des- acetilvinblastin 4-O-(Prolil) estera

Uzorak 804 mg (1.047 mmol) 4'des- acetilvinblastina, otopljen u 3 ml CH2Cl2 i 18 ml bezvodnog piridina pod dušikom, je tretiran sa 1.39 g Fmoc-prolin kiselinskog klorida (Fmoc-Pro-Cl, Advanced Chemtech), i smjesa je miješana 20 sati na 25°C. Kada je analiza HPLC pokazala nazočnost nereagiranog početnog des-acetilvinblastin, dodano je još 0.50 g Fmoc-Pro-Cl, uz mješanje još 20 sati do kraja reakcije. Voda (ca. 3 ml)je dodana da reagira sa viškom kiselinskog klorida, i otopina je zatim uparena do suha i podijeljena između 300 ml EtOAc i 150 ml zasićenog NaHCO3, uz ispiranje dvaput sa zasićenim NaCl. Nakon sušenja (Na2SO4), otapalo je uklonjeno pod sniženim tlakom da se dobije narančasto-smeđi ostatak, u koji je dodano 30 ml DMF i 14 ml piperidina, a nakon 5 min otopina je uparena pod sniženim tlakom da se dobije narančasto-žuti polukruti ostatak. Nakon sušenja in vacuo oko 1 sat, pribl. 200 ml H2O i 100 ml etera je dodano u ovaj materijal, uz dodavanje ledenog HOAc u kapima, uz miješanje i sonikaciju do potpunog otapanja, a vodeni sloj je postigao stabilan pH 4.5-5.0 (vlažni pH opseg 4-6 papir). Vodeni sloj je zatim ispran sa jednom 100-ml porcijom etera, i svaki eterski sloj je ispran sa 50 ml H2O. Kombinirani vodeni slojevi su izloženi preparativnoj HPLC u 2 obroka na Waters C4 Delta-Pak koloni 15 μM 300A (A == 0.1% TFA/H2O; B = 0.1% TFA/CH3CN), gradient eluacije 95 -> 70% A/70 min. Frakcije su dale, nakon koncentracije i liofilizacije, naslovni spoj.

Korak C: N-acetil-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-WANG smola

Počevši sa 0.5 mmol (0.61 g) Fmoc-Ser(t-Bu)-WANG smole na 0.82 mmol/g, zaštićeni peptid je sintetizirani na ABI način 1 430A peptid sintetizator adaptiran za Fmoc/t-butil-baziranu sintezu. Protokol je koristio 2-struki suvišak (1.0 mmol) svake od sljedećih zaštićenih aminokiselina: Fmoc-Ser (t-Bu)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Chg-OH, Fmoc-4-trans-L-Hyp-OH; i octene kiseline (dvostruko kuplirane). Za vrijeme svakog ciklusa kupliranja Fmoc zaštita je uklonjena koristeći 20% piperidina u N-metil-2-pirolidinonu (NMP), praćeno ispiranjem sa NMP. Kupliranje je postignuto koristeći DCC i HOBt aktivaciju u NMP. Na završetku sinteze, peptidna smola je sušena da se dobije naslovni spoj.

Korak D: N-acetil-4-trans-L-Hvp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-OH

0.5-mmol peptid-smole je suspendirano u25 ml TFA, uz dodavanje po 0.625 ml H20 i triizopropilsilana, a zatim miješano na 25° 2 sata. Odvojena smjesa je filtrirana, krutine su isprane sa TFA, otapala su uklonjena iz filtrata pod sniženim tlakom, i ostatak je samljeven sa eterom da se dobije blijedo žuta krutina, koja je izolirana filtriranjem i sušenjem in vacuo, da se dobije naslovni spoj.

HPLC uvjeti, sistem A:

Kolona... Vydac 15 cm #218TP5415, C18

Eluent... Gradijent (95%A -> 50%A) iznad 45 min.

A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1%

TFA/acetonitril

Protok 1.5 ml/min.

Visina rezolucije ES/FT-MS: 789.3

Korak E: des- acetilvinblastin-4-O-(N-Acetil-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro) ester

Uzorci od 522 mg (0.66 mmol) peptida iz koraka D i 555 mg (ca. 0.6 mmol) 4-des- Acetilvinblastin 4-O-(Prolil) estera iz koraka B, pripravljeni kako je gore opisano, su otopljeni u 17 ml DMF pod N2. Zatim je dodano 163 mg (1.13 mmol) l-hidroksi-7-azabenzotriazola (HOAt), i pH je naravnan na 6.5-7 (vlažan 5-10 rang pH papir) sa 2.,4,6-kolidinom., uz hlađenje do 0°C i dodavanje 155 mg (0.81 mmol) 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorida (EDC). Miješanje je nastavljeno na 0-5° C do kraja kupliranja praćeno pomoću analitičke HPLC (A = 0.1% TFA/H2O; B = 0.1% TFA/CH3CN), održavajući pH na 6.5-7 periodičnim dodavanjem 2,4,6-kolidina. Nakon 12 sati reakcija je nastavljena dodatkom -4 ml H2O i, nakon miješanja od 1 sata, koncentrirana do malog volumena invacuo i otopljena u ca. 150ml5% HOAc. Preparativna HPLC u dva obroka na Waters C18 Delta-Pak koloni 15 μM 300A (A = 0.1% TFA/H2O; B = 0.1% TFA/CH3CN), gradient eluacije 95 —> 65% A / 70 min). Homogene frakcije koje sadrže kasnije-eluirani produkt (procjenjen s HPLC, sistem A, 95 —> 65% A / 30 min) iz oba obroka su skupljeni i koncentrirani na volumen od ~50 ml i propušteni kroz pribl. 40 ml AG4X4 ion izmjenjivačke smole (acetatni ciklus), praćen hladnim-sušenjem da se dobije naslovni spoj kao liofilizirani prah.

Visina rezolucije ES/FT-MS: 1637.0

Primjer 1A

des-acetilvinblastin-4-O-(N-Acetil-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerSer-Pro)ester acetat

Uzorak od 4.50 g (3.7 mmol) 4-O-(prolil) des-acetilvinblastin TFA soli, pripravljeni kako je opisano u primjeru 1, Korak B, je otopljen u 300 ml DMF pod N2, i otopina je ohlađena do 0°. Zatim je dodano 1.72 g (10.5 mmol) 3,4-dihidro-3-hidroksi-4-okso-1,2,3-benzotriazina (ODHBT), i pH je naravnan do 7.0 (vlažan 5-10 rang pH papir) sa N-metilmorfolinom (NMM), praćen dodavanjem 4.95 g (5.23 mmol) N-acetil-heptapeptida iz primjera 1, Korak D, u obrocima dopuštajući otapanje između svakog dodavanja. PH je ponovno naravnan do 7.0 sa NMM, i dodano je 1.88 g (9.8 mmol) l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimid hidroklorida (EDC), uz miješanje otopine na 0-5 °C do završetka kupliranja, praćeno analitičkim HPLC (sistem A), održavajući pH na ca. 7 periodičnim dodavanjem NMM. Analiza je pokazala glavne komponente na 26.3 min vremena retencije, a ranije manje komponente (ca. 10 %) na 26.1 min, identificirane kao D-Ser izomer naslovnog spoja. Nakon 20 sati reakcija je nastavljena dodavanjem 30 ml H2O i, nakon miješanja od 1 sata, ukoncentrirana do malog volumena in vacuo i otapanjem u ca. 500 ml 20% HOAc. Preparativna HPLC u 12 obroka na Waters C18 Delta-Pak koloni 15mM 300A (A = 0.1% TFA/H2O; B = 0.1% TFA/CH3CN), gradient eluacije 85 —> 65% A / 90 min) pri brzini protoka od 80 ml/min.

Homogene frakcije (evaluirane sa HPLC, sistem C) koje predstavljaju pribl. jednu četvrtinu ukupne šarže su skupljene i koncentrirane do volumena od -150 ml i puštene kroz pribl. 200 ml Bio-Rad AG4X4 ion izmjenjivačke smole (acetatni ciklus), praćeno hladnim sušenjem eluenta, dalo je acetatnu sol naslovnog spoja kao liofilizirani prah: vrijeme retencije (sistem A) 26.7 min, 98.9% čistoća; visina rezolucije ES/FT-MS m/e 1636.82; analiza sastava aminokiselina 20 sati, 100°C, 6NHC1 (teoretski/nađeno), Ser4/3.91 (ispravljeno), Glu 1/0.92

(Gln konvertiran u Glu), Chg 1/1.11, Hyp 1/1.07, Pro 1/0.99, sadržaj peptida 0.516 mmol/mg.

Daljnja kombinacija homogenih frakcija i pročišćavanje od drugih frakcija, procesirano kako je gore opisano kroz pribl. 500 ml ion izmjenjivačkih smola, dalo je male količine naslovnog spoja.

HPLC uvjeti, sistem A:

Kolona... Vydac 15 cm #218TP5415, C18

Protok... 1.5 ml/min.

Eluent... Gradijent (95%A -> 50%A) iznad 45 min.

A = 0.1% TFA/H2O, B = 0.1% TFA/acetonitril

Valna duljina... 214nm, 280 nm

HPLC uvjeti, sistem C:

Kolona... Vydac 15 cm #218TP5415,

C18 Protok... 1.5 ml/min.

Eluent... Gradijent (85%A -> 65%A) iznad 30 min.

A = 0.1% TFA/H20, B = 0.1% TFA/acetonitril

Valna duljina 214nm, 280 nm

Tabela 1 pokazuje druge konjugate peptid-vinca lijeka koji su pripravljeni prema postupcima opisanim u Primjerima 1 i 1A, ali koristeći odgovarajuće aminokiselinske ostatke i blokirajuće acilirajuće grupe. Ukoliko nije drukčije navedeno, acetatna sol konjugata je pripravljena i testirana.

TABLICA 1

[image]

4-trans-L-Hyp je trans-4-hidroksi-L-prolin kada je n > 1; vrijednost je prosječna

[image]

Primjer 4

Zaključak o prepoznavanju konjugata oligopeptid-Vinca lijeka pomoću slobodnog PSA

Konjugati pripravljeni kako je opisano u primjeru 3 su pojedinačno otopljeni u PSA digestivnom puferu (50 mM tris(hidroksimetil)-aminometan pH 7.4, 140 mM NaCl) i otopina je dodana u PSA pri molarnom omjeru 100 do 1. Altenativno, PSA digestivni pufer korišten jest 50 mM tris(hidroksimetil)-ammometan pH 7.4, 140 mM NaCl. Reakcija je gašena nakon raznih vremena reakcije dodavanjem trifluorooctene kiseline (TFA) u konačnih 1% (volumen/volumen). Altenativno reakcija je gašena sa 10mM ZnCl2. Gašena reakcija je analizirana HPLC u reverznoj-fazi C18 kolone, koristeći vodeni 0.1%TFA/acetonitril gradijent. Duljina vremena (u minutama) potrebna za 50% cijepanja primijećenih konjugata oligopeptid-citotoksičnog agensa sa enzimski aktivnim slobodnim PSA je zatim izračunata. Rezultati su prikazani u TABLICI 1.

Primjer 5

In vitro test citotoksičnosti peptidil derivata Vinca lijekova

Citotoksičnost konjugata, koji se mogu cijepati, oligopeptid-vinca lijeka, pripravljeni kako je opisano u primjeru 3, protiv linije stanica za koje je znano da ih ubija nemodificirani vinca lijek, je testiran s Alamar Blue testom. Specifično, stanice kulture LNCap prostatnog tumora, Colo320DM stanice (označene C320) ili T47D stanice u pločici sa 96 jažica je razrijeđen sa medijem koji sadrži različite koncentracije datog konjugata (ukupni volumen jažica 200 μl). Colo320DM stanice, koje ne sadrže slobodan PSA, se koriste kao kontrola stanične linije, da odrede toksičnost baziranu van mehanizma. Stanice su inkubirane 3 dana na 37°C, 20 μl Alamar Blue je dodan na test pločice. Stanice su nadalje inkubirane i test pločice su očitane na EL-310 ELISA čitaču na dvije valne duljine od 570 i 600 nm, i to 4 i 7 sati nakon dodavanja Alamar Blue. Relativni postotak pogodnosti pri različitim koncentracijama testiranog konjugata je zatim izračunat u odnosu na kontrolnu (bez konjugata) kulturu i EC50 je određen. Rezultati su prikazani u TABLICI 2. Ukoliko nije drukčije naznačeno, testirana je acetatna sol konjugata.

TABLICA 2

[image] [image]

Pip je pipekolinska kiselina; Sar je sarkozin; Chg je cikloheksilglicin; Abu je 2-aminomaslačna kiselina; Aib je 2-aminoizomaslačna kiselina.

Primjer 6

In vivo efikasnost konjugata peptidil -citotoksični agens

LNCaP.FGC ili DuPRO-1 stanice su tripsinizirane, ponovno otopljene u mediju za rast i centifugirane 6 min. na 200 x g. Stanice su resuspendirane u a-MEM bez seruma i izbrojane. Odgovarajući volumen ove otopine koji sadrži željeni broj stanica je zatim prenesen u konusnu kivetu za centrifugu, centrifugiran kao ranije, te resuspendiran u odgovarajući volumen hladne 1:1 smjese a-MEM-Matrigel. Suspenzija je čuvana na ledu do inokulacije životinja.

Harlan Sprague Dawley muški goli miševi (10-12 tjedana stari) su držani bez anestezije i inokulirani sa 0.5 mL stanica suspenzije na lijevom boku, supkutanom injekcijom koristeći 22G iglu. Miševima je dato približno 5x105 DuPRO stanica ili 1.5xl07 LNCaP.FGC stanica.

Sljedeći inokulaciju sa tumornim stanicama, miševi su tretirani pod jednim od dva protokola:

Protokol A:

Jedan dan nakon inokulacije životinje su dozirane sa 0.1-0.5 mL volumena test konjugata, vinca lijeka ili kontrolnog sredstva (sterilne vode). Doze konjugata i vinca lijeka su inicijalno u maksimalnim ne-letalnim dozama, ali mogu biti kasnije nižih titracija. Identične doze su davane u 24-satnim intervalima 5 dana. Nakon 10 dana, uzorci krvi su uzeti od miševa i određena je razina serumskog PSA. Slične razine serumskog PSA su određene u 5-10 dnevnim intervalima. Na kraju 5.5 tjedana miševi su žrtvovani i težine svih nazočnih tumora su mjerene i ponovnoje određivan serumski PSA. Težine životinja su određene na početku i kraju testa.

Protokol B:

Deset dana nakon inokulacije stanicama, uzorci krvi su uzimani od životinja i određivane su serumske razine PSA. Životinje su zatim grupirane po razinama serumskog PSA. Na 14-15 dana nakon inokulacije stanicama, životinje su dozirane sa 0.1-0.5 mL volumena test konjugata, vinca lijeka ili kontrolne tvari (sterilne vode). Doze konjugata i vinca lijeka su u početku maksimalna ne-letalna doza, ali mogu naknadno biti nižih titracija. Identične doze su davane u 24-satnim intervalima 5 dana. Razine serumskog PSA su određene u intervalima 5-10 dana. Na kraju 5.5 tjedana miševi su žrtvovani, težine svih nazočnih tumora su mjerene i ponovno je određen serumski PSA. Težine životinja su određene na početku i kraju testa.

Primjer 7

In vitro određivanje proteolitičkog cijepanja konjugata endogenim ne-PSA proteazama

Korak A: Priprava proteolitičkih ekstrakata tkiva

Svi postupci su izvršeni na 4°C. Odgovarajuće životinje su žrtvovane i relevantno tkivo izolirano i pohranjeno u tekućem dušiku. Smrznuto je tkivo usitnjeno koristeći tučak, a smrvljeno tkivo je prebačeno u Potter-Elvejeh homogenizator i 2 volumena pufera A (50 mM Tris koji sadrže 1.15% KCl, pH 7.5) su dodani. Tkivo je zatim miješano sa 20 poteza koristeći prvo laganiju stranu tučka, a zatim jaču. Homogenat je centrifugiran na 10,000 x g u rotaciji (HB4-5), pelet je izvučen i re-supernatant centrifugiran na 100,000 x g (Ti 70). Supernatant (citosol) je sačuvan.

Pelet je resuspendiran u puferu B (10 mM EDTA koji sadrži 1.15% KCl, pH 7.5) koristeći isti volumen kao u gore opisanom koraku sa puferom A. Suspenzija je homogenizirana u homogenizatoru i otopina centrifugirana na 100,000 x g. Supematant je odijeljen i pelet resuspendiran u puferu C (10 mM kalij fosfatni pufer koji sadrži 0.25 M sukroze, pH 7.4), koristeći 1/2 volumena korištenog gore i homogeniziran u homogenizatoru.

Proteinski sastav dvije otopine (citosol i membrane)je određen koristeći Bradford test. Testni alikvoti su zatim uklonjeni i smrznuti u tekućem N2. Alikvoti su uskladišteni na -70°C.

Korak B: Test proteolitičkog cijepanja

Za svaku točku, 20 mikrograma konjugata peptid-vinca lijeka i 150 mikrograma tkivnih proteina, pripravljeni su kao što je opisano u koraku A i kako je određeno pomoću Bradforda, u reakcijski pufer stavljeni su u otopinu konačnog volumena od 200 mikrolitara u puferu (50 mM TRIS, 140 mM NaCl, pH 7.2). Test reakcije su izvršene za 0, 30, 60, 120, i 180 minuta i zatim su gašene sa 9 mikrolitara 0.1 M ZnCl2 i odmah prenešene u ključalu vodu 90 sekundi. Produkti dobiveni ovom reakcijom su analizirani na HPLC koristeći VYDAC C18 15 cm kolonu u voda / acetonitril (5% do 50% acetonitrila, iznad 30 minuta).

Claims

1. Konjugat koji je koristan za liječenje raka prostate, naznačen time, da se sastoji od vinca alkaloida citotoksičnog agensa vezanog za oligopeptid, gdje oligopeptid sadrži sekvenciju aminokiselina koje su selektivno proteolitički cijepane slobodnim prostata specifičnim antigenom, gdje je način vezivanja po izboru kroz kemijski linker, a točka vezivanja oligopeptida je na kisiku na 4-poziciji vinca alkaloid citotoksičnog agensa, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

2. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da je citotoksični agens odabran od sljedećih citotoksičnih agensa: a) vinblastina, b) 4-desacetilvinblastina, c) vinkristina, d) leurosidina, i e) vindesina, ili njihovih optičkih izomera.

3. Konjugat prema zahtjevu 2, naznačen time, da je citotoksični agens 4-desacetilvinblastin.

4. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da se oligopeptid sastoji od oligomera odabranih od: a) AsnLysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 1), b) LysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 2), c) AsnLysIleSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.: 3), d) AsnLysAlaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 4), e) SerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 5); f) LysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 6); g) hArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 7); h) hArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 8); i) TyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 9); j) TyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 10); k) TyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.: 11); l) ChgGlnjSerLeu (SEQ.ID.NO.: 12); m) ChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.: 13); n) SerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 14); o) SerChgGlnjSer (SEQ.ID.NO.: 15); p) SerTyrGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 16); q) SerChgGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 17); r) SerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 18); s) SerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 19); t) HaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 20); u) HaaXaaLysTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 21); v) HaaXaahArgTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 22); w) HaaXaahArgChaGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 23); x) HaaTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 24); y) HaaXaaSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 25); z) HaaChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 26); gdje je Haa ciklička aminokiselina supstituirana sa hidrofilnim djelom, hArg je homoarginin, Xaa je bilo koja amino kiselina, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin.

5. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da se oligopeptid sastoji od oligomera odabranih od: SerSerChgGln|SerAlaPro (SEQ.ID.NO.: 39); SerSerChgGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 40); SerSerChgGln|SerAla4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 41); SerSerChgGln|SerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 42); AbuSerSerChgGln|SerPro (SEQ.ID.NO.: 43); AbuSerSerChgGln|Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 44); SerSerSerChgGln|SerLeuPro (SEQ.ID.NO.: 45); SerSerSerChgGlnjSerValPro (SEQ.ID.NO.: 46); SerAlaSerChgGln|SerLeu4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 47); SerAlaSerChgGln|SerValPro (SEQ.ID.NO.: 48); (N-metil-Ser)SerSerChgGln|SerLeuPip (SEQ.ID.NO.: 49); (N-metil-Ser)SerSerChgGln|SerValPip (SEQ.ID.NO.: 50); 4-HypSerSerTyrGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 51); 4-HypSerSerTyrGln|SerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 52); 4-HypSerSerTyrGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 53); 4-HypSerSerTyrGln|SerSerSar (SEQ.ID.NO.: 54); 4-HypSerSerTyrGln|Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 55); 4-HypSerSerChgGln|SerPro (SEQ.ID.NO.: 56); 4-HypSerSerChgGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 57); 4-HypSerSerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 58); 4-HypSerSerChgGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 59); 4-HypAlaSerChgGln|SerValPro (SEQ.ID.NO.: 60); 4-HypAlaSerChgGln|SerSerPip (SEQ.ID.NO.: 61); 4-HypSerSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 62); 4-HypSerSerChgGln|SerGly (SEQ.ID.NO.: 63); SerSerChgGln|SerGly (SEQ.ID.NO.: 64); 3-PalSerSerTyrGln|Ser4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 65); 3-PalSerSerChgGln|SerPro (SEQ.ID.NO.: 66); (3,4-DiHyp)SerSerTyrGln|SerSerPro (SEQ.ID.NO.: 67); i (3,4-DiHyp)SerSerTyrGln|SerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 68); gdje je Abu je aminomaslačna kiselina, 4-Hyp je 4-hidroksiprolin, Pip je pipekolinska kiselina, 3,4-DiHyp je 3,4-dihidroksiprolin, 3-Pal je 3-piridilalanin, Sar je sarkozin i Chg je cikloheksilglicin.

6. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time, da se oligopeptid sastoji od oligomera odabranih od: Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 84) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 85) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 86) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 87) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal; (SEQ.ID.NO.: 88) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 89) Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 90) hidroksiacetilAbu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 91) acetiB-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 92) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val; (SEQ.ID.NO.: 93) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu; (SEQ.ID.NO.: 94) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 95) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerPro; (SEQ.ID.NO.: 96) Ac-SerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 98) Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 99) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 100) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerAla; (SEQ.ID.NO.: 103) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerChg; (SEQ.ID.NO.: 104) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 105) Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp; (SEQ.ID.NO.: 106) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 107) Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro; (SEQ.ID.NO.: 108) Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 109) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 111) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 114) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro; (SEQ.ID.NO.: 115) Ac-SerChgGln-SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 116) Ac-SerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 117) Ac-SerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 118) Ac-SerChgGlnSerSerAibPro; (SEQ.ID.NO.: 119) Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala; (SEQ.ID.NO.: 120) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip; (SEQ.ID.NO.: 124) i Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA; (SEQ.ID.NO.: 125) Gdje je Abu je aminomaslačna kiselina, 4-trans-L-Hyp je 4-trans-L-hidroksiprolin, Pip je pipekolinska kiselina, 3,4-DiHyp je 3,4-dihidroksiprolin, 3-PAL je 3-piridilalanin, Sar je sarkozin i Chg je cikloheksilglicin.

7. Konjugat formule I: [image] naznačena time, da je: oligopeptid takav oligopeptid kojeg specifično prepoznaje slobodni prostata specifični antigen (PSA) i moguće ga je proteolitički cijepati enzimskom aktivnošću slobodnog prostata specifičnog antigena, XL odabran je od: veza, - C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-O - i - C(O)-(CH2)u-W-(CH2)u-NH -; R je odabran od: a) vodika, b) -(C=O)Rla, c) … [image] d) … [image] e) … [image] f) etoksisquarata; i g) cotininila; Rl i R2 su neovisno odabrani od: vodika, OH, C1-C6 alkil, C1-C6 alkoksi, C1-C6 aralkil i aril; R1a je C1-C6-alkil, hidroksilirani C3-C8-cikloalkil, polihidroksilirani C3-C8-cikloalkil, hidroksilirani aril, polihidroksilirani aril ili aril, R9 je vodik, (C1-C3 alkil)-CO, ili klorosupstituirani (C1-C3alkil)-CO; W je odabran od razgranatog ili ravnolančanog: C1-C6-alkil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil ili biciklo[2.2.2]oktanil; n je 1, 2, 3 ili 4; p je nula ili cijeli broj između 1 i 100; q je 0 ili 1, pod uvjetom da je p= nula, q je 1; r je 1,2 ili 3; t je 3 ili 4; u je 0, 1,2 ili 3, ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili optički izomer.

8. Konjugat prema zahtjevu 7, naznačen time, da je: oligopeptid takav oligomer da se sastoji od sekvencije aminokiselina odabrane od: a) AsnLysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 1), b) LysIleSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 2), c) AsnLysIleSerTyrTyr|Ser (SEQ.ID.NO.: 3), d) AsnLysAlaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 4), e) SerTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 5); f) LysTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 6); g) hArgTyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 7); h) hArgChaGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 8); i) TyrGln|SerSer (SEQ.ID.NO.: 9); j) TyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 10); k) TyrGln|SerNle (SEQ.ID.NO.: 11); l) ChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 12); m) ChgGln|SerNle (SEQ.ID.NO.: 13); n) SerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 14); o) SerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 15); p) SerTyrGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 16); q) SerChgGln|SerVal (SEQ.ID.NO.: 17); r) SerTyrGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 18); s) SerChgGln|SerLeu (SEQ.ID.NO.: 19); t) HaaXaaSerTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 20); u) HaaXaaLysTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 21); v) HaaXaahArgTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 22); w) HaaXaahArgChaGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 23); x) HaaTyrGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 24); y) HaaXaaSerChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 25); z) HaaChgGln|Ser (SEQ.ID.NO.: 26); gdje je Haa ciklička aminokiselina supstituirana sa hidrofilnim djelom, hArg je homoarginin, Xaa je bilo koja aminokiselina, Cha je cikloheksilalanin i Chg je cikloheksilglicin; ili njihovi optički izomeri.

9. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time, da je: Haa je trans-4-hidroksi-L-prolin; ili njegov optički izomer.

10. Konjugat prema zahtjevu 7, naznačen time, da je oligopeptid - R odabran od: Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 84) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 85) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 86) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 87) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal; (SEQ.ID.NO.: 88) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 89) Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 90) hidroksiacetilAbu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 91) acetil3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 92) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val; (SEQ.ID.NO.: 93) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu; (SEQ.ID.NO.: 94) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 95) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerPro; (SEQ.ID.NO.: 96) Ac-SerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 98) Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 99) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 100) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerAla; (SEQ.ID.NO.: 103) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerChg; (SEQ.ID.NO.: 104) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 105) Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp; (SEQ.ID.NO.: 106) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 107) Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro; (SEQ.ID.NO.: 108) Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 109) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 111) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 114) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro; (SEQ.ID.NO.: 115) Ac-SerChgGln-SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 116) Ac-SerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 117) Ac-SerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 118) Ac-SerChgGlnSerSerAibPro; (SEQ.ID.NO.: 119) Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala; (SEQ.ID.NO.: 120) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip; (SEQ.ID.NO.: 124) i Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA; (SEQ.ID.NO.: 125) gdje je Abu aminomaslačna kiselina,4-trans-L-Hyp je 4-trans-L-hidroksiprolin, Pip je pipekolinska kiselina, 3,4-DiHyp je 3,4-dihidroksiprolin, 3-PAL je 3-piridilalanin, Sar je sarkosin i Chg je cikloheksilglicin.

11. Konjugat prema zahtjevu 7, naznačen time, da je odabran od: [image] gdje je X [image] [image] [image] ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili optički izomeri.

12. Konjugat prema zahtjevu 7, naznačen time, da je formule: [image] ili njegova farmaceutski prihvatljiva sol ili optički izomer.

13. Farmaceutski sastav, naznačen time, da se sastoji od farmaceutskog nosača, i u njemu raspršene terapijski efikasne količine spoja iz zahtjeva 1.

14. Farmaceutski sastav, naznačen time, da se sastoji od farmaceutskog nosača, i u njemu raspršene terapijski efikasne količine spoja iz zahtjeva 7.

15. Farmaceutski sastav, naznačen time, da se sastoji od farmaceutskog nosača, i u njemu raspršene terapijski efikasne količine spoja iz zahtjeva 11.

16. Metoda za liječenje raka prostate, naznačena time, da se sastoji od davanja sisavcima kojima je liječenje potrebno, terapijski efikasne količine sastava iz zahtjeva 13.

17. Metoda za liječenje raka prostate, naznačena time, da se sastoji od davanja sisavcima kojima je liječenje potrebno, terapijski efikasne količine sastava iz zahtjeva 14.

18. Metoda za liječenje raka prostate, naznačena time, da se sastoji od davanja sisavcima kojima je liječenje potrebno, terapijski efikasne količine sastava iz zahtjeva 15.

19. Metoda za liječenje benigne hiperplazije prostate, naznačena time, da se sastoji od davanja sisavcima kojima je liječenje potrebno, terapijski efikasne količine sastava iz zahtjeva 13.

20. Metoda za liječenje benigne hiperplazije prostate, naznačena time, da se sastoji od davanja sisavcima kojima je liječenje potrebno, terapijski efikasne količine sastava iz zahtjeva 14.

21. Metoda za liječenje benigne hiperplazije prostate, naznačena time, da se sastoji od davanja sisavcima kojima je liječenje potrebno, terapijski efikasne količine sastava iz zahtjeva 15.

22. Farmaceutski sastav, naznačen time, da je pripravljen kombinacijom spoja iz zahtjeva 1 i farmaceutski prihvatljivog nosača.

23. Postupak za pripravljanje farmaceutskog sastava, naznačen time, da se sastoji od kombinacije spoja iz zahtjeva 1 i farmaceutski prihvatljivog nosača.