CZ20002056A3 - Konjugáty použitelné v léčbě karcinomu prostaty - Google Patents

Abstract

Konjugáty použitelné pro léčbu karcinomu prostaty obsahující cytotoxické činidlo ze skupiny vinca alkaloidů, navázané na oligopeptid štěpitelný volným prostatickým specifickým antigenem.

Description

Konjugáty použitelné v léčbě karcinomu prostaty

Oblast techniky

Vynález se týká konjugátú použitelných pro léčbu karcinomu prostaty obsahujících cytotoxické činidlo ze skupiny vinca alkaloidů navázané na oligopeptid štěpitelný volným prostatickým specifickým antigenem.

Dosavadní stav techniky

V roce 1996 byl karcinom prostaty diagnostikován u 317000 mužů v USA a 42000 Američanů zemřelo na toto onemocnění (Garnick, M.B. (1994), The Dilemmas of Prostata Cancer, Scientifics American, April: 72-81). Tak je karcinom prostaty nej častěji diagnostikovaným maligním onemocněním (s výjimkou karcinomů kůže) u mužů v USA a je druhou nej častější příčinou úmrtí na nádorové onemocnění (po úmrtí na karcinom plic) v této skupině.

Prostatický specifický antigen (PSA) je jednořetězcový 33 kDa glykoprotein, který se tvoří téměř výlučně v epitelu lidské prostaty a který se vyskytuje v koncentracích od 0,5 do 2,0 mg/ml v lidské semínální kapalině (Nadji, M., Taber, S.Z., Castro, A. et al. (1981) Cancer 48: 1229; Papsidero, L.,

Kuriyama, M., Wang, M., et al., (1981), JNCI 66:37; Qui, S.D., Young, C.Y.F., Bihartz, D.L., et al., (1990), J. Urol. 144:

1550; Wang, M.C., Valenzuela, L.A., Murphy, G.P. et al. (1979), Invest. Urol. 17: 159). Jediná karbohydratová jednotka je navázána na asparaginový zbytek číslo 45 a tvoří 2 až 3 kDa z celkové molekulové hmotnosti. PSA je proteasa se specificitou podobnou chymotrypsinu (Christensson, A., Laurell, C.B., Lilja, H. (1990), Eur. J. Biochem. 194: 755-763). Bylo prokázáno, že PSA je odpovědný zejména za rozpouštění gelové struktury tvořené při ejakulaci proteolýzou hlavních proteinů v gelu • ·

obalujícím spermie, semenogelinu I a semenogelinu II, a fibronektinu (Lilja, H., (1985) J. Clin. Invest. 76: 1899; Lilja, Η., Oldbring, J., Rannevik, G. et al., (1987) J. Clin. Invest 80: 281; McGee, R.S., Herr, J.C. (1988) Biol. Reprod.

39: 499). PSA zprostředkovaná proteolýza proteinů vytvářejících gel vytváří několik rozpustných fragmentů semenogelinu I a semenogelinu II a rozpustné fragmenty fibronektinu, které zkapalňují ejakulát a uvolňují pohyblivá spermatoza (Lilja, H., Laurell, C.B. (1984), Scand. J. Clin. Lab. Invest. 44: 447; McGee, R.S., Herr, J.C. (1988) Biol. Reprod. 39: 499). Kromě toho může PSA proteolyticky degradovat IGFBP-3 (vazebný protein 3 pro inzulínu podobný růstový faktor), což umožňuje specifickou stimulaci růstu buněk secernujících PSA prostřednictvím IGF (Cohen et al., (1992), J. Clin. Endo. and

Meta., 75: 1046-1053).

PSA ve formě komplexu s αΐ-antichymotrypsinem je převládající molekulovu formou sérového PSA a může tvořit až 95% detekovaného sérového PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O. et al. (1993) J. Urol. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625; Stenman, U.H., Leinoven, J., Alfthan, H. et al. (1991) Cancer Res. 51: 222-226) . Předpokládá se, že prostatická tkáň (normální, benigní hyperplastícká nebo maligní) uvolňuje hlavně zralou, enzymaticky aktivní formu PSA, protože tato forma je nutná pro tvorbu komplexů s αΐ-antichymotrypsinem (Mast, A.E., Enghild, J.J., Pizzo, S.V., et al., (1991), Biochemistry 30: 1723-1730; Perlmutter, D.H., Glover, G.I., Rivetna, M., et al., (1990), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3753-3757). Proto se předpokládá, že v mikroprostředí prostatických buněk secernujících PSA je PSA zpracováván a secernován ve své zralé, enzymaticky aktivní formě, bez vazby na jakoukoliv inhibiční molekulu. PSA také vytváří stabilní komplexy s a2makroglobulinem, ale protože tato tvorba vede k obalení PSA a kompletní ztrátě PSA epitopů, zůstává in vivo význam této • · · · · ·

tvorby komplexů nejasný. Volná, nekomplexovaná forma PSA tvoří menšinovou frakci sérového PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O. et al. (1993) J. Urol. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625). Velikost této formy sérového PSA je podobná jako velikost PSA v seminální kapalině (Lilja, HChristensson, A., Dahlén, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625), ale zůstává nejasné, zda může být tato volná forma PSA zymogenem; interně štěpenou, inaktivní formou zralého PSA; nebo PSA s enzymatickou aktivitou. Nicméně, zdá se nepravděpodobné, že by měla tato volná forma sérového PSA enzymatickou aktivitu, protože existuje významný (100- až 1000-násobný) molární nadbytek jak nereagovaného al-antichymotrypsinu, tak a2-makroglobulinu v séru, vzhledem k detekovaným sérovým koncentracím volné 33 kDa formě PSA (Christensson, A., Bjork, T., Nilsson, O. et al.

(1993) J. Urol. 150: 100-105; Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625).

Stanovení koncentrace PSA v séru je užitečné pro monitorování léčby adenokarcinomu prostaty (Duffy, M.S. (1989) Ann. Clin. Biochem. 26: 379-387; Brawer, M.K. and Lange, P.H. (1989) Urol. Suppl. 5: 11-16; Hara, M. and Kimura, H. (1989) J. Lab. Clin. Med. 113: 541-548), ačkoliv vyšší než normální sérové koncentrace PSA byly popsány také u benigní hyperplasie prostaty a po chirurgickém zákroku na prostatě (Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. (1991) Clin. Chem. 37: 1618-1625). Je také známo, že metastasy karcinomu prostaty také secernují imunologicky reaktivní PSA, protože sérový PSA je detekovatelný ve vysokých koncentracích u pacientů po prostatektomii s generalizovaným metastatickým procesem při karcinomu prostaty (Ford, T.F., Butcher, D.N., Masters, R.W. et al., (1985), Brit. J. Urology 57: 50-55). Proto by měly být cytotoxické sloučeniny, které mohou být aktivovány proteolytickou aktivitou

PSA, specifické pro prostatické buňky, stejně jako by měly být specifické pro metastasy karcinomu prostaty secernující PSA.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je proto nový protinádorový prostředek použitelný pro léčbu karcinomu prostaty, který obsahuje oligopeptidy, které jsou specificky proteolyticky štěpeny volným prostatickým specifickým antigenem (PSA), které jsou konjugoványn s cytotoxickým činidlem ze skupiny vinca alkaloidů.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu je způsob léčby karcinomu prostaty, který obsahuje podáni nového protinádorového prostředku.

Vynález popisuje chemické konjugáty, které jsou tvořeny oligopeptidy takové aminokyselinové sekvence, která je selektivně proteolyticky štěpena volným prostatickým specifickým antigenem (PSA) a cytotoxickým činidlem ze skupiny vinca alkaloidů. Konjugáty podle předkládaného vynálezu jsou charakterizovány vazbou štěpitelného oligopeptidu na atom kyslíku ve 4-pozici vinca alkaloidu, který má být desacetylován. Takové konjugáty jsou užitečné v léčbě karcinomu prostaty a benigní hyperplasie prostaty (BPH).

Předkládaný vynález se týká nových protinádorových prostředků použitelných pro léčbu karcinomu prostaty. Takové prostředky obsahují oligopeptid kovalentně navázaný, volitelně prostřednictvím chemické spojovací skupiny, na cytotoxické činidlo ze skupiny vinca alkaloidů. Místem vazby oligopeptidu na cytotoxické činidlo ze skupiny vinca alkaloidů je atom kyslíku ve 4-pozici cytotoxického činidla ze skupiny vinca alkaloidů. Je známo, že cytotoxické činidla ze skupiny vinca alkaloidů mající acetylovou skupinu na atomu kyslíku ve 4pozici musí být nejprve desacetylována před tím, než je vytvořen konjugát podle předkládaného vynálezu. Oligopeptidy jsou vybrány z oligomerů, které jsou specificky rozeznávány volným prostatickým specifickým antigenem (PSA) a které mohou být proteolyticky štěpeny enzymatickou aktivitou volného prostatického specifického antigenů. Takové kombinace oligopeptidu a cytotoxického činidla mohou být označeny jako konjugáty.

Ideálně je cytotoxická aktivita vinca léčiva značně snížená nebo nepřítomná tehdy, je-li oligopeptid obsahující štěpící místo pro štěpení PSA navázán, přímo nebo prostřednictvím chemické spojovací skupiny, na vinca léčivo a je intaktní. Ideálně se také aktivita vinca léčiva význanmě zvýší nebo obnoví na aktivitu nemodifikovaného vinca léčiva po proteolytickém štěpení navázaného oligopeptidu v místě peptidové vazby, ve které je oligopeptid štěpen volným PSA a po jakékoliv následné hydrolýze endogenními aminopeptidasami.

Dále, je výhodné, aby byl oligopeptid vybrán z oligopeptidu, které nejsou štěpeny nebo které jsou štěpeny mnohem menší rychlostí v přítomnosti jiných proteolytických enzymů než je PSA, jako jsou endogenní enzymy lidského séra, před štěpením volným PSA, ve srovnání se štěpením oligopeptidů v přítomnosti volného enzymaticky aktivního PSA.Bylo zjištěno, že výhodně je aminokyselina v místě vazby oligopeptidu na vinca léčivo nebo na volitelnou spojovací skupinu sekundární aminokyselina vybraná ze skupiny zahrnující prolin, 3-hydroxyprolin, 3fluorprolin, kyselinu pipekolínovou, kyselinu 3hydroxypipekolinovou, 2-azetidin, 3-hydroxy-2-azetidin, sarkosin a podobně. Ještě lépe je aminokyselina v místě vazby oligopeptidu na vinca léčivo nebo na volitelnou spojovací skupinu cyklická aminokyselina vybraná ze skupiny zahrnující prolin, 3-hydroxyprolin, 3-fluorprolin, kyselinu pipekolínovou, kyselinu 3-hydroxypipekolinovou, 2-azetidin, 3-hydroxy-2azetidin a podobně.

• ·· · * ·· ·

Z důvodů uvedených výše je vhodné, aby byl olígopeptid tvořen krátkou peptidovou sekvencí, výhodně aby byl kratší než deset aminokyselin. Nejlépe je olígopeptid tvořen sedmi nebo šesti aminokyselinami. Protože konjugát výhodně obsahuje krátkou aminokyselinovou sekvenci, může být rozpustnost konjugátu značně ovlivněna celkovým hydrofobním charakterem cytotoxického činidla. Proto mohou být v oligopeptidové sekvenci obsaženy aminokyseliny s hydrofilními substituenty nebo N-konec blokující skupiny, aby byl vyrušen nebo zmenšeny hydrofobní příspěvek cytotoxického činidla.

Ačkoliv to pro provedení tohoto aspektu předkládaného vynálezu není nutné, je výhodným provedením předkládaného vynálezu konjugát, ve kterém jsou olígopeptid, a volitelně chemická spojovací skupina, poud je přítomna, odděleny od cytotoxického činidla proteolytickou aktivitou volného PSA a jakýchkoliv přirozených proteolytických enzymů přítomných v okolní tkáni, což způsobí uvolnění cytotoxického činidla, nebo cytotoxického činidla s částí oligopeptidu/spojovací skupiny zachovávajícího si cytotoxickou aktivitu, do fyziologického prostředí v místě proteolytického štěpení. Předkládaný vynález také zahrnuje farmaceuticky přijatelné soli konjugátů.

Je třeba si uvědomit, že olígopeptid, který je konjugován na cytotoxické činidlo, ať kovalentní vazbou nebo prostřednictvím chemické spojovací skupiny, nemusí být olígopeptid, který je nejlépe rozpoznáván volným PSA a který je nejlépe proteolyticky štěpen volným PSA. Tak je olígopeptid vybraný pro použití v takovém protinádorovém prostředku vybrán jak podle selektivního, proteolytického štěpení volným PSA, tak podle cytotoxické aktivity kojugátu cytotoxického činidlaproteolytického zbytku (nebo, v ideální situaci, nemodifikovaného cytotoxického činidla), který vznikne po takovém štěpení. Termín selektivní, jak je použit v souvislosti s proteolytickým štěpením PSA, označuje vyšší rychlost štěpení oligopeptidové složky podle předkládaného vynálezu volným PSA ve srovnání se štěpením oligopeptidu tvořeného náhodnou sekvencí aminokyselin. Tak je oligopeptidová složka podle předkládaného vynálezu přednostním substrátem pro volný PSA. Termín selektivní také znamená, že oligopeptid je proteolyticky štěpen volným PSA mezi dvěma specifickými aminokyselinami oligopeptidu.

Oligopeptidové složky podle předkládaného vynálezu jsou selektivně rozpoznávány volným prostatickým specifickým antigenem (PSA) a mohou být proteolyticky štěpeny enzymatickou aktivitou volného prostatického specifického antigenů. Takové oligopeptidy jsou tvořeny oligomery vybranými ze skupiny zahrnuj ící:

a) AsnLysIleSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 1),

b) LysIleSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 2),

c) AsnLysIleSerTyrTyrISer (SEQ.ID.NO.: 3),

d) AsnLysAlaSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 4),

e) SerTyrGlnlSerSer

f) LysTyrGlnlSerSer

g) hArgTyrGlnlSerSer

h) hArgChaGlnlSerSer

i) TyrGlnlSerSer

j) TyrGlnlSerLeu

k) TyrGlnlSerNle

l) ChgGlniSerLeu

m) ChgGlnlSerNle (SEQ.ID.NO.: 5);

(SEQ.ID.NO.: 6);

(SEQ.ID.NO.: 7);

(SEQ.ID.NO.: 8); (SEQ.ID.NO.: 9);

(SEQ.ID.NO.: 10);

(SEQ.ID.NO.: 11);

(SEQ.ID.NO.: 12);

(SEQ.ID.NO.: 13);

n) SerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 14);

o) SerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 15);

p) SerTyrGlnlSerVal (SEQ.ID.NO.: 16);

q) SerChgGlnlSerVal (SEQ.ID.NO.: 17);

r) SerTyrGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 18);

s) SerChgGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.; 19);

t) HaaXaaSerTyrGInISer (SEQ.ID.NO.: 20);

u) HaaXaaLysTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 21);

v) HaaXaahArgTyrGlniSer (SEQ.ID.NO.: 22);

w) HaaXaahArgChaGlniSer (SEQ.ID.NO.: 23);

x) HaaTyrGInISer (SEQ.ID.NO.: 24);

y) HaaXaaSerChgGInISer (SEQ.ID.NO.: 25);

z) HaaChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 26);

kde Haa je cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou, hARg je homoarginin, Xaa je jakákoliv aminokyselina

Cha je cyklohexyialanin a Chg je cyklohexylglycin.

V provedení předkládaného vynálezu obsahuje oligopeptid oligomer vybraný ze skupiny zahrnující:

a)

b)

c)

d)

e)

f)

h)

i)

j)

k)

l)

m)

S erS erT y rGlnl S er Ala

SerSerChgGlnlSerSer

SerSerTyrGlnlSerAla

SerSerChgGlnlSerSer

4-HypSerSerTyrGlnlSer

4-HypSerSerChgGlnlSer

AlaSerTyrGlnlSerSer

AlaSerChgGlnlSerSer

AlaS erT y rGln IS er Ala

AlaSerChgGlnlSerAla

4-Hyp AlaSerTyrGlnlSer

4-Hyp AlaS erChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 27);

(SEQ.ID.NO.: 28);

(SEQ.ID.NO.: 29);

(SEQ.ID.NO.: 30);

(SEQ.ID.NO.: 31);

(SEQ.ID.NO.: 32);

(SEQ.ID.NO.: 33);

(SEQ.ID.NO.: 34);

(SEQ.ID.NO.: 35);

(SEQ.ID.NO.: 36);

(SEQ.ID.NO.: 37);

(SEQ.ID.NO.: 38);

kde 4-Hyp j akákoliv je 4-hydroxyprolin, hARg je homoarginin, Xaa aminokyselina, Cha je cyklohexylalanin a Chg je je cyklohexylglycin.

Ve výhodnějším provedení předkládaného vynálezu obsahuje oligopeptid oligomer vybraný ze skupiny zahrnující:

SerSerChgGlnlSerAlaPro (SEQ.ID.NO.: 39);

SerSerChgGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 40);

SerSerChgGlnlSerAla4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 41);

SerSerChgGlnlSerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 42);

AbuSerSerChgGlnlSerPro (SEQ.ID.NO.: 43);

AbuSerSerChgGlnlSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 44);

SerSerSerChgGlnlSerLeuPro (SEQ.ID.NO.: 45);

SerSerSerChgGlnlSerValPro (SEQ.ID.NO.: 46);

SerAlaSerChgGlnlSerLeu4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 47);

SerAlaSerChgGlnlSerValPro (SEQ.ID.NO.: 48);

(N-methyl-Ser)SerSerChgGlnlSerLeuPip (SEQ.ID.NO.: 49);

(N-methyl-Ser)SerSerChgGlnlSerValPip (SEQ.ID.NO.: 50);

4-HypSerSerTyrGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 51);

4-HypSerSerTyrGlnlSerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 52);

4-HypSerSerTyrGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 53);

4-HypSerSerTyrGlnlSerSerSer (SEQ.ID.NO.: 54);

4-HypSerSerTyrGlnlSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 55);

4-HypSerSerChgGlnlSerPro (SEQ.ID.NO.: 56);

4-HypSerSerChgGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 57);

4-HypSerSerChgGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 58);

4-HypSerSerChgGlnlSerVal (SEQ.ID.NO.: 59);

4-Hyp AlaSerChgGlnlSerValPro (SEQ.ID.NO.: 60);

4-HypAlaSerChgGlnISerSerPip (SEQ.ID.NO.: 61);

4-HypSerSerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 62);

4-HypSerSerChgGlnlSerGly (SEQ.ID.NO.: 63);

SerSerChgGlnlSerGly (SEQ.ID.NO.: 64);

3-PalSerSerTyrGlnlSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 65);

3-PalSerSerChgGlnISerPro (SEQ.ID.NO.: 66);

(3,4-DiHyp)SerSerTyrGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 67); a:

(3,4-DiHyp)SerSerTyrGlnlSerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 68);

kde Abu je kyselina aminomáselná, 4-Hyp je 4-hydroxyprolin, Pip je kyselina pipekolinová, 3,4-DiHyp je 3,4-dihydroxyprolin, 3Pal je 3-pyridylalanin, Sar je sarkosin a Chg je cyklohexylglycin.

Termín oligomery, které obsahují aminokyselinovou sekvenci, jak byl použit výše a jak je použit kdekoliv v podrobném popisu vynálezu, označuje oligomery obsahující od přibližně 3 do přibližně 100 aminokyselinových zbytků, které obsahují ve své aminokyselinové sekvenci specifickou popsanou aminokyselinovou sekvenci a které jsou proto proteolyticky štěpeny v popsané aminokyselinové sekvenci volným PSA. Výhodně je oligomer tvořen 5 až 10 aminokyselinovými zbytky. Například, následující oligomer:

hARgSerAlaChgClh|SerLeu (SEQ ID NO: 69);

obsahuje aminokyselinovou sekvenci:

ChgGln|SerLeu (SEQ ID NO: 12); a proto odpovídá předkládanému vynálezu. Oligomer:

hArgSer4-HypChgGln|SerLeu (SEQ ID NO: 70);

obsahuje aminokyselinovou sekvenci:

4-HypChgGln|SerLeu (SEQ ID NO: 71); a proto odpovídá předkládanému vynálezu. Je třeba si uvědomit, že takové oligomery nezahrnují semenogelin I a semenogelin II.

Odborníkům v oboru peptidove chemie bude jasné, ze nektere aminokyseliny v biologicky aktivních oligopeptidech mohou být nahrazeny jinými homologickými, isosterickými a/nebo isoelektrickými aminokyselinami, za zachování biologické aktivity původního oligopeptidu v modifikovaném oligopeptidu. Některé syntetické a modifikované přirozené aminokyseliny mohou být také použity pro nahrazení příslušných přirozených aminokyselin v oligopeptidech podle předkládaného vynálezu. Například, tyrosin může být nahrazen 3-jodtyrosinem, 2methyltyrosinem, 3-fluortyrosinem, 3-methyltyrosinem a podobně. Dále, například lysin může být nahrazen Ν'-(2imidazolyl)lysinem a podobně aminokyselinových substitucí nikoliv limitující seznam:

Původní aminokyselina

Ala

Arg

Asn

Asp

Glu

Gin

Gly

Následující seznam možných je míněn jako ilustrativní,

Substitující aminokyselina Gly, Abu Lys, Ornitin Gin

Glu

Asp

Asn

Ala • · · · • · · · · · ···«

	i3 . : • ·	• · ·	• · · ·	• · · ·
Ile	Val,	Leu,	Met,	Nle,	Nva
Leu Lys	Ile, Arg,	Val, Met, Ornitin	Nle,	Nva
Met Ornitin Phe	Leu, Lys, Tyr,	Ile, Arg Trp	Nle,	Val
Ser Thr Trp Tyr	Thr, Ser, Phe, Phe,	Abu, Abu, Tyr Trp	Hyp, Hyp	Ala
Val	Leu,	Ile,	Met,	Nle,	Nva

Tak mohou být například technikami dobře známými v oboru syntetizovány následující oligopeptidy, o kterých se předpokládá, že budou proteolyticky štěpeny volným PSA: AsnArglleSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 72)

AsnLysValSerTyrGlniSer (SEQ.ID.NO.: 73)

AsnLysMetSerTyrGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 74) AsnLysLeuSerTyrGln ISerSer (SEQ.ID.NO.: 75) AsnLysIleSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 76) (SEQ.ID.NO.: 77).

(SEQ.ID.NO.: 78) (SEQ.ID.NO.: 79) (SEQ.ID.NO.: 80) (3,4-dihydroxyproline)AlaSerTyrGln ISerSer (SEQ.ID.NO.: 81)

3- hydroxyprolineSerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 82)

4- HypAlaSerChgGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 83).

GlnLysIleSerTyrGlnlSerSer Asn4-HypIleSerTyrGInlSer Asn4-HypValSerTyrGlnlSer 4-Hy p AlaS erT yrGln IS erS er

Symbol | v aminokyselinové sekvenci označuje místo v sekvenci, ve kterém je oligopeptid proteolyticky štěpen volným

PSA.

• ♦ · · • · ·· ·· ··

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou mít centra asymetrie a mohou existovat jako racematy, racemické směsi a jako jednotlivé diastereomery, kde všechny možné izomery, včetně optických izomerů, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, jsou všechny uvedené aminokyseliny ve své přirozené L stereokonfiguraci.

V předkládaném vynálezu jsou uvedené aminokyseliny označovány jak běžnými třípísmennými, tak jednopísmennými

zkratkami, které jsou	uvedeny dále:
Alanin	Ala	A
Arginin	Arg	R
Asparagin	Asn	N
Kyselina asparagová	Asp	D
Asparagin nebo
kyselina asparagová	Asx	B
Cystein	Cys	C
Glutamin	Gin	Q
Kyselina glutamová	Glu	E
Glutamin nebo
kyselina glutamová	Glx	Z
Glycin	Gly	G
Histidin	His	H
Isoleucin	Ile	I
Leucin	Leu	L
Lysin	Lys	K
Methionin	Met	M
Fenylalanin	Phe	F
Prolin	Pro	P
Serin	Ser	s
Threonin	Thr	T
Tryptofan	Trp	w
Tyrosin	Tyr	Y
Valin	Val	v

• · · ·

V předkládaném vynálezu a v připojených obrázcích jsou

použity následující zkratky označující uvedené aminokyseliny
skupiny:
hR nebo hArg:	homoarginin
hY nebo hTyr:	homotyrosin
Cha:	cyklohexylalanin
Amf:	4-aminomethylfenylalanin
DAP:	1,3-diaminopropyl
DPL:	2-(4,6-dimethylpyrimidinyl)lysin
(imidazolyl)K:	N'-(2-imidazolyl)lysin
Me2PO3-Y:	O-dimethylfosfotyrosin
O-Me-Y:	O-methyltyrosin
TIC: kyselina 1,2,3,4-tetrahydro-3-isochinolinkarboxyl·
DAP:	1,3-diaminopropan
TFA:	kyselina trifluoroctová
AA:	kyselina octová
3 PAL:	3-pyridylalanin
4-Hyp:	4-hydroxyprolin
dAc-Vin:	4-des-acetylvinblastin
Pip:	kyselina pipekolinová
Abu:	kyselina 2-aminomáselná
Nva:	norvalin

V oboru je dobře známo, že peptidové terapeutická činidla, jako jsou konjugáty oligopeptid-cytotoxické činidlo podle předkládaného vynálezu, mají terminální amino-skupinu jakéhokoliv oligopeptidového substituentu chráněnou vhodnou chránící skupinou, jako je acetyl-, benzoyl-, pivaloyl-skupina a podobně. Takové chránění terminální amino-skupiny redukuje nebo eliminuje enzymatickou degradaci takových peptidových terapeutických činidel působením exogenních amino-peptidas, které jsou přítomné v krevní plasmě teplokrevných živočichů. Mezi takové chránící skupiny také patří hydrofilní blokovací skupiny, které jsou vybrány na základě přítomnosti hydrofilní • * « « tt »· tttt · · tttt ··· · · · · · ♦ · • · ···· · · · 9 i6 . :

tttt ··· · · ·· · · »· funkce. Mezi blokovací skupiny, které zvyšují hydrofilnost konjugátů a tak zvyšují rozpustnost konjugátů ve vodě, patří bez omezení - hydroxylovaná alkanoyl-skupina, polyhydroxylovaná alkanoyl-skupina, polyethylenglykol, glykosylaty, cukry a korunkové ethery. N-konec syntetických aminokyselinových skupin může také omezovat takovou enzymatickou degradaci exogenními aminopeptidasami.

Výhodně jsou chránící skupiny pro N-konec vybrány ze skupiny zahrnuj ící:

) acetyl;

cr p

kde

R¹ a R² jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující:

(a) vodík;

(b) nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, nesubstituovaný nebo substituovaný heterocyklus, C3-Ciocykloalkyl, C₂-C6alkenyl, C₂-C₆alkynyl, halogen, Ci-Cgperfluoralkyl, R³0-, R³C(O)NR³-, (R³)2NC(O)~, (R³) 2N-C (NR³)R⁴S(O)2NH, cn, no₂, R₃C(O)-, n₃, N(R³)₂, nebo R⁴OC (0) NR³-;

(c) nesubstiuovaný Ci~C6alkyl;

(d) substituovaný Ci-C6alkyl, kde substituent na substiuovaném Ci-C6alkylu je vybrán ze skupiny zahrnující následující skupiny: nesubstituovaný nebo substituovaný aryl, nesubstituovaný nebo substiuovaný heterocyklus, C₃~

Ciocykloalkyl, C₂-C6alkenyl, C₂-C6alkynyl, R³0-, R⁴S(O)₂NH,

R³C (O) NR³(R³)2NC(O)-, (R³) 2N-C (NR³)-, CN, R₃C(O)-, N₃, -N(R)₂ a

ROC(O)NR-; nebo tvoří R¹ a R² dohromady -(CHz)s-, kde jeden z atomů uhlíku je volitelně nahrazen skupinou vybranou z následujících skupin: 0, S(0)_m, -NC(O)-, NH a -N(COR⁴)-;

R³ je vybrán ze skupiny zahrnující následující skupiny: vodík, aryl, substituovaný aryl, heterocyklus, substituovaný heterocyklus, Ci-C6alkyl a C₃-Ciocykloalkyl;

R⁴ je vybrán ze skupiny zahrnující následující skupiny: aryl, substituovaný aryl, heterocyklus, substituovaný heterocyklus, Ci-C6alkyl a C₃-Ciocykloalkyl;

m	je	0,	1 nebo	2;
n	je	1,	2, 3 nebo 4;
P	je	nula nebo	celé číslo mezi	1 a 100; a
q	je	0	nebo 1,	s podmínkou, že	pokud p = 0,
r	je	1,	2 nebo	3;
s	je	3,	4 nebo	5 .

Některé oligopeptidy v konjugátech podle předkládaného vynálezu obsahují cyklickou aminokyselinu substituovanou hydrofílní skupinou, která je výše označována jako Haa a která může být také znázorněna vzorcem:

kde

R⁵ je vybrán ze skupiny zahrnující následující skupiny: HO- a Ci~C6alkoxy;

R⁶ je vybrán ze skupiny zahrnující následující skupiny: vodík, halogen, Ci-Cgalkyl, HO- a Ci-Cgalkoxy; a t je 3 nebo 4.

v « · «

Skupina vzorce

9 · * » · 9 · » * » · 9 9 9 9 ► * » « · « « a · * * 9 9· * · 4 • » ♦ · · · · 9 «9 i · ·· «9 představuje cyklický amin obsahující 5 až 6 atomů v kruhu, kde takový cyklický amin může být volitelně fúsovaný na fenylový nebo cyklohexylový kruh. Mezi příklady takových cyklických aminů patří, například, následující skupiny:

Konjugáty podle předkládaného vynálezu mohou mít centra asymetrie a mohou existovat jako racematy, racemické směsi a jako jednotlivé diastereomery, kde všechny možné izomery, včetně optických izomerů, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Pokud se jakákoliv proměnná (například aryl, heterocyklus, R³ atd.) vyskytuje více než jednou v jakékoliv slžce, tak je definice její přítomnosti nezávislá na jakékoliv jiné její přítomnosti .Například, HO(CR¹CR²⁾2 označuje HOCH₂CH₂-, HOCH₂CH(OH)HOCH(CH₃) CH(OH)- atd. Dále, kombinace substituentů a/nebo proměnných jsou možné pouze tehdy, pokud takové kombinace vedou ke vzniku stabilních sloučenin.

Termíny alkyl a alkylová část aralkylu a podobné termíny, jak jsou zde použity, označují nasycené alifatické uhlovodíkové skupiny s přímým a rozvětveným řetězcem, které mají určený počet atomů uhlíku; termín alkoxy označuje alkylovou skupinu obsahující daný počet atomů uhlíku, které jsou vázaný prostřednictvím kyslíkového můstku.

Termín cykloalkyl, jak je zde použit, označuje nearomatické cyklické uhlovodíkové skupiny obsahující daný počet atomů uhlíku. Mezi příklady cykloalkylových skupin patří cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl a podobně.

* · # ·' ·· *· 99 · · *9 «9 » 9 9 • 9 * * * » «999

Termín alkenyl označuje skupiny obsahující daný počet atomů uhlíku a jednu nebo dvě dvojné vazby. Příklady alkenylových skupin jsou vinyl, allyl, isopropenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, cyklopropenyl, cyklobutenyl, cyklopentenyl, cyklohexenyl, 1-propenyl, 2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, isoprenyl, farnesyl, geranyl, geranylgeranyl a podobně.

Termín alkynyl označuje skupiny obsahující daný počet atomů uhlíku a jednu trojnou vazbu. Příklady alkynylových skupin jsou acetylen, 2-butynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl a podobně.

Termín halogen, jak je zde použit, označuje fluor, chlor, brom a jod.

Termín aryl, jak je zde použit, a arylová část aralkylu a aroylu, jak je zde použit, označuje jakýkoliv stabilní monocyklický nebo bicyklický uhlíkový kruh obsahující až sedm členů v každém kruhu, kde alespoň jeden z kruhů je aromatický. Příklady takových arylových skupin jsou fenyl, naftyl, tetrahydronaftyl, indanyl, bifenyl, fenanthryl, anthryl nebo acenaftyl.

Termín heterocyklus nbeo heterocyklický, jak je zde použit, označuje stabilní 5- až 7-členný monocyklický nebo stabilní 8- až 11-členný bicyklický heterocyklický kruh, který je nasycený nebo nenasycený a který se skládá z atomů uhlíku a jednoho až čtař heteroatomů vybraných ze skupiny skládající se z N, 0 a S, a zahrnuje jakoukoliv bicyklickou skupinu, ve které je jakýkoliv z výše uvedených kruhů fušovaný na benzenový kruh. Heterocyklický kruh může být navázán na jakýkoliv heteroatom nebo uhlíkový atom, pokud vzniká v důsledku této vazby stabilní struktura. Příklady takových heterocyklických skupin jsou, například, azepinyl, benzimidazolyl, benzisoxazolyl, benzfurazanyl, benzpyranyl, benzthiopyranyl, benzfuryl,

ΛΑ · I * * ···· .! ······.....

·..·.· · .......

·· ··· ·· ·» .. ·.

benzthiazolyl, benzthienyl, benzoxazolyl, chromanyl, cinnolinyl, dihydrobenzfuryl, dihydrobenzthienyl, dihydrobenzthiopyranyl, dihydrobenzthiopyranylsulfon, furyl, imidazolidinyl, imidazolinyl, imidazolyl, indolinyl, indolyl, isochromanyl, isoindolinyl, isochinolinyl, isothiazolidinyl, isothiazolyl, isothiazolidinyl, morfolinyl, nafthyridinyl, oxadiazolyl, 2-oxoazepinyl, oxazolyl, 2-oxopiperazinyl, 2oxopiperidinyl, 2-oxopyrrolidinyl, piperidyl, piperazinyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl, pyrrolyl, chinazoliny, chinoliny, chinoxalinyl, tetrahydrofuryl, tetrahydroisochinolinyl, tetrahydrochinolinyl, thiamorfoliny, thiamorfolinylsulfoxid, thiazoiyl, thiazolinyl, thienofuryl, thienothienyl a thienyl.

Jak jsou zde použity, označují termíny substituovaný Cisalkyl, substituovaný aryl a substituovaný heterocyklus skupiny obsahující od 1 do 3 substituentů v pozicích jiných než je místo navázání na zbytek sloučeniny. Takové další substituenty jsou vybrané ze skupiny zahrnující následující skupiny: F, Cl, Br, CF₃, NH₂, N (Ci-C₆alkyl) ₂, NO₂, CN, (Ci~ C₆alkyl)O-, -OH, (C₁-C₆alkyl) S (O)_m-, (Ci-C₆alkyl) C (O) NH-, H₂NC(NH)-, (Ci-C₆alkyl) C (O)-, (Ci-C₆alkyl) OC (0)-, N₃, (CiC₆alkyl) OC (0) NH- a Cx-C₂₀alkyl.

Pokud jsou R¹ a R² kombinovány za vzniku -(CH₂)_S-, tak mezi takto definované cyklické skupiny a cyklické skupiny obsahující heteroatom patří například:

ůrí X

Jak je zde použit označuje termín hydroxylovaný substituce hydroxylové skupiny na substituovatelném uhlíku kruhu. Jak je zde použit označuje termín polyhydroxylovaný substituce 2, 3 nebo 4 hydroxylových skupin na dvou nebo více substituovatelných uhlíkových atomech kruhu.

Termín PEG, jak je zde použit, označuje některé polyethylenglykoly obsahující substituenty mající uvedený počet ethylenoxy- podjednotek. Tak termín PEG(2) označuje

a termín PEG(6) označuje

Termín (d)(2,3-dihydroxypropionyl), jak je zde použit, označuje sloučeninu následujícího vzorce:

OH

Termín (2R,3S)2,3,4-trihydroxybutanoyl, jak je zde použit, označuje sloučeninu následujícího vzorce:

Termín chinyl, jak je zde použit, označuje sloučeninu následujícího vzorce:

nebo její diastereomer.

Termín kotininyl, následujícího vzorce:

jak je zde použit, označuje sloučeninu nebo její diastereomer

Termín gallyl, jak následujícího vzorce:

je zde použit, označuje sloučeninu

Termín 4-ethoxyskvarat, jak je zde použit, označuje sloučeninu následujícího vzorce:

_Eta χ o o

Cytotoxická činidla použitá v konjugátech podle předkládaného vynálezu mohou být vybrána z cytotoxických činidel skupiny vinca alkaloidů. Mezi použitelné členy této třídy patří, například, vinca alkaloidy vybrané ze skupiny zahrnující vinblastin, vincristin, leurosidin, vindesin, vinorelbin, navelbin, leurosid a podobně nebo jejich optické isomery. Je třeba si uvědomit, že konjugáty podle předkládaného vynálezu mají oligopeptid navázaný prostřednictvím atomu kyslíku navázaného na C-4 vinca alkaloidu. Proto musí být některé vinca alkaloidy mající acetylovou skupinu na tomto kyslíku nejprve desacetylovány před tím, než mohou být navázány na oligopeptid (nebo volitelně na spojovací skupinu). Dále, odborníci v oboru mohou provést chemické modifikace vybraného cytotoxického činidla, které upravují tuto sloučeninu tak, že je vhodnější pro přípravu konjugátů podle předkládaného vynálezu.

Výhodnou skupinou 4-desacetylovaných vinca alkalodiů pro předkládaný vynález jsou sloučeniny následujícího vzorce:

Léky ze skupiny vinca alkaloidů vzorce I:

R⁸

kde

R⁷ je H, CH₃ nebo CHO; COR¹² když jsou R⁹ a R¹⁰ samostatně, tak R¹⁰ je H a ethyl a druhý je H nebo OH;

když tvoří R⁹ a R¹⁰ dohromady dvojnou vazbu, R¹¹ je vodík;

(1) jeden z R⁸ a R⁹ je tak R⁸ je ethyl;

R¹² je OH, 0-(Ci-C₃alkyl) nebo NH₂.

• · · · ·· · · ·· * • · ···· ···« • · ·· ·· ··· ·· · • · · ···· ···· • · ··· ·· ·· ·· ··

Konjugát oligopeptidu-cytotoxického činidla podle předkládaného vynálezu, kde cytotoxickým činidlem je 4-0desacetylvinblastin, může být popsán obecným vzorcem la:

X_L - oligopeptid - R kde C-konec oligopeptid je oligopeptid, který je specificky rozeznávaný volným prostatickým specifickýžm antigenem (PSA) a může být proteolyticky štěpen enzymatickou aktivitou volného prostatického specifického antigenu,

X_L je vybán ze skupiny zahrnující: vazbu,

-C (O) - (CH₂)u-W- (CHz)u-O- a -C (O) - (CH_Z) _U-W-(CH₂) _U-NH-;

R je vybrán ze skupiny zahrnující:

(f) (g) (a) (b) (c) (d) (e)

kotininyl;

• · • · • · · • · ·

R¹ a R² jsou nezávisle vybrány ze skupiny zahrnující skupiny: vodík, Ci-C6alkyl, Ci-C6alkoxy, Ci-Cgaralkyl a aryl;

R^la je Ci-Cealkyl, hydroxylovaný C3~C₈cykloalkyl, polyhydroxylovaný C3-C8cykloalkyl, hydroxylovaný aryl, polyhydroxylovaný aryl nebo aryl;

R⁹ je vodík, (Ci-C3alkyl)-CO nebo chlorem substitovaný (Ci— C₃alkyl)-CO;

W je vybrán ze skupiny zahrnující skupiny: Ci-Cgalkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl nebo bicyklo[2.2.2]oktanyl ;

n je 1, 2, 3 nebo 4;

p je nula nebo celé číslo od 1 do 100;

q je 0 nebo 1, s podmínkou, že když p = 0, tak q = 1;

r je 1, 2 nebo 3;

t j e 3 nebo 4;

u je 0, 1, 2 nebo 3;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl nebo optický izomer uvedené sloučeniny.

Výhodně je Xl vazba.

V provedení předkládaného vynálezu je oligopeptid -R vybrán z následující skupiny:

Ac-4-ťrans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 84)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 85)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 86)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 87)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal; (SEQ.ID.NO.: 88)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.:

89)

Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 90) hydroxyacetylAbu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 91) acetyl3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 92) Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val; (SEQ.ID.NO.: 93) Ac--4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu; (SEQ.ID.NO.: 94) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 95) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerPro; (SEQ.ID.NO.: 96)

Ac-SerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 98)

Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 99)

Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 100)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerAIa; (SEQ.ID.NO.: 103)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerChg; (SEQ.ID.NO.: 104) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 105) Ac-SerSerChgGInSerSerHyp; (SEQ.ID.NO.: 106)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 107) Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro; (SEQ.ID.NO.: 108) Ac-AbuSerSerChgGInSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 109) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 111) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 114) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro; (SEQ.ID.NO.: 115) Ac-SerChgGln-SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 116) Ac-SerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 117)

Ac—SerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 118) Ac-SerChgGlnSerSerAibPro; (SEQ.ID.NO.: 119) • ·

Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala; (SEQ.ID.NO.: 120)

Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip; (SEQ.ID.NO.: 124) a Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA; (SEQ.ID.NO.: 125) kde Abu je kyselina aminomáselná, 4-trans-4-Hyp je 4-trans-Lhydroxyprolin, Pip je kyselina pipekolinová, 3,4-DiHyp je 3,4 dihydroxyprolin, 3-Pal je 3-pyridylalanin, Sar je sarkosin a Chg je cyklohexylglycin.

Následující sloučeniny jsou konkrétními příklady konjugátu oligopeptid-desacetylvinblastin podle předkládaného vynálezu:

kde X j e

OH '4..>'CH₂CH₃

H ch₃o

OH

O

CO₂CH₃

X h₃c

uhlíkový konec » · · · • · · • · ·

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser (SEQ.ID.NO.: 85) >

uhlíkový konec ch₃ o

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerSer^x f (SEQ.ID.NO.: 86) uhlíkový konec

Ac-4-trans-L.-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-N(SEQ.ID.NO.: 87) , / .

' carbon terminus

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal

Ό.

7(SEQ.ID.NO.: 88) uhlíkový konec

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-N\y

OH (SEQ.ID.NO.: 89) uhlíkový konec

0'

Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-GIn-Ser-N^/ (SEQ.ID.NO.: 90) uhlíkový konec oA

HO.

(SEQ.ID.NO.: 91)

Abu-Ser-Ser-Chg-GIn-Ser-N·^/ uhlíkový konec

Ser-Ser-Chg-GIn-Ser-Ser-N

N

AcHN

O ·.

H

uhlíkový konec (SEQ.ID.NO.: 92)

Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val (SEQ.ID.NO.: 93) uhlíkový konec

O ,0

CH<

O

Ac^-írans-L-Hyp-Ser-Ser-Ohg-GIn-Ser-Leu^^^Y'' Js⁵· / CH₃ (SEQ.ID.NO.: 94) uhlíkový konec nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo optické izomery.

Oligopeptidy, peptidové podjednotky a peptidové deriváty (též označované jako peptidy) podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány z příslušných aminokyselin za použití běžných technik peptidové syntézy, přednostně technikou syntézy na pevné fázi. Peptidy se potom přečistí vysoce-výkonnou kapalinovou chromatografií s reversní fází (HPLC).

Standardní metody peptidové syntézy jsou popsány, například, v následujících pracích: Schroeder et al., The Peptides, svazek I, Academie Press 1965; Bodansky et al., Peptide Synthesis, Interscience Publishers, 1966; McOmie (ed.) Protective Groups in Organic Chemistry, Plenům Press, 1973; Barany et al., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, 2, kapitola 1, Academie Press, 1980; a Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, druhé vydání, Pierce Chemical Company, 1984. Všechny tyto práce jsou zde uvedeny jako odkazy.

Vhodně substituované cyklické aminokyseliny mající hydrofilní substituent, které mohou být vloženy do konjugátů podle předkládaného vynálezu za použití standardních technik peptidové syntézy, jsou sami o sobě komerčně dostupné nebo mohou být snadno syntetizovány technikami dobře známými v oboru nebo popsanými v předkládaném vynálezu. Syntézy vhodně substituovaných prolinů jsou popsány v následující literatuře: J. Ezquerra et al., J. Org. chem. 60: 2925-2930 (1995); P. Gill and W.D. Lubell, J. Org. Chem. 60: 2658-2659 (1995); a M.W. Holladay et al. , J. Med. Chem. 34: 457-461 (1991). Tyto práce jsou zde uvedeny jako odkazy.

Mezi farmaceuticky přijatelné soli sloučenin podle předkládaného vynálezu patří běžné netoxické solí sloučenin podle předkládaného vynálezu, jak jsou tvořeny, například, s netoxickými anorganickými nebo organickými kyselinami. Například, mezi takové běžné netoxické soli patří soli odvozené od anorganických kyselin, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, sulfamová, fosforečná, dusičná a podobně; a soli odvozené od organických kyselin, jako je kyselina octová, propionová, jantarová, glykolová, stearová, mléčná, jablečná, vinná, citrónová, askorbová, pamová, maleinová, hydroxymaleinová, fenyloctová, glutamová, benzoová, salicylová, sulfanilinová, 2-acetoxybenzoová, fumarová, toluensulfonová, methansulfonová, ethandisulfonová, šťavelová, isethionová, trifluoroctová a podobně.

Konjugáty podle předkládaného vynálezu, které obsahují olígopeptid obsahující štěpící místo pro PSA a cytotoxické činidlo ze třídy vinca alkaloidů, mohou být syntetizovány za použití technik dobře známých v oboru lékařské chemie. Například, hydroxylová skupina na léčivu ze skupiny vinca alkaloidů může být kovalentně navázána na olígopeptid na karboxylovém konci tak, že se vytvoří esterová vazba. Pro tento účel mohou být použita činidla jako je kombinace HBTU a HOBT, kombinace BOP a imidazolu, kombinace DCC a DMAP a podobně. Karboxylová kyselina může být také aktivována vytvořením nitrofenylového esteru nebo podobné sloučeniny a může reagovat za přítomnosti DBU (1,8-diazobicyklo[5,4,0]undek-7-enu).

Odborníkům v oboru bude jasné, že při syntéze sloučenin podle předkládaného vynálezu může být nutné chránění různých reaktivních funkcí na výchozích sloučeninách a meziproduktech při provádění reakcí na jiných částech molekuly. Po dokončení těchto reakcí, nebo v jakoukoliv vhodnou dobu, jsou obvykle tyto chránící skupiny odstraněny, například hydrolyticky nebo hydrogenolyticky. Takové stupně chránění a odstranění chránících skupin jsou běžné v oboru organické chemie. Pro výčet chránících skupin, které mohou být použity při přípravě sloučenin podle předkládaného vynálezu, viz Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed., Plenům Press, NY, NY (1973); a Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, ed., John Wiley and Sons, NY, NY (1981).

Například, mezi chránící skupiny pro amino-skupinu patří CiCioalkanoylové skupiny, jako je formyl, acetyl, dichloracetyl, propionyl, hexanoyl, 3,3-diethylhexanoyl, γ-chlorbutryl, a podobně; Ci-Cioalkoxykarbonylové skupiny nebo C5Cisaryloxykarbonylové skupiny, jako je terc-butoxykarbonyl, benzyloxykarbonyl, allyloxykarbonyl, 4-nitrobenzyloxykarbonyl, fluorenylmethyloxykarbonyl a cinnamoyloxykarbonyl; halogen-(Ci• · · · · · • · » · » • · · · · ·· «

Cio) alkoxykarbonyl, jako je 2,2,2-trichlorethoxykarbonyl; a CiCisarylalkylové a alkenylové skupiny, jako je benzyl, fenethyl, allyl, trityl a podobně. Jinými běžnými chránícími skupinami pro amino-skupinu jsou ve formě enaminů připravených s β-ketoestery, jako je methyl- nebo ethylacetacetat.

Mezi vhodné chránící skupiny pro karboxylovou skupinu patří, například, Ci-Cioalkylové skupiny, jako je methyl, terc-butyl, decyl; halogen-Ci-Cioalkylové skupiny, jako je 2,2,2trichlorethyl a 2-jodethyl; Cs-Cisarylalkylové skupiny, jako je benzyl, 4-methoxybenzyl, 4-nitrobenzyl, trifenylmethyl, difenylmethyl; Ci-Cioalkanoyloxymethylové skupiny, jako je acetoxymethyl, propionoxymethyl a podobně; a skupiny, jako je fenacyl, 4-halogenfenacyl, allyl, dimethylallyl, tri-(ciC₃) alkyl) silyl, jako je trimethylsilyl, β-ρtoluensulfonylethyl, β-p-nitrofenylthioethyl, 2,4,6trimethylbenzyl, β-methylthioethyl, ftalimidomethyl, 2,4dinitro-fenylsulfenyl, 2-nitrobenzhydryl a příbuzné skupiny.

Podobně, mezi vhodné chránící skupiny pro hydroxylovou skupinu patří, například, formyl, chloracetyl, benzyl, benzhydryl, trityl, 4-nitrobenzyl, trimethylsilyl, fenacyl, terc-butyl, methoxymethyl, tetrahydropyranyl a podobně.

Pro výhodné provedení, ve kterém je oligopeptid kombinován s desacetylvinblastinem, ilustrují následující reakční schémata syntézu konjugátů podle předkládaného vynálezu.

Reakční schéma I ilustruje přípravu konjugátů oligopeptidů podle předkládaného vynálezu a cytotoxického vinca alkaloidu vinblastinu, ve kterém je kyslík na 4-desacetylvinblastinu navázán na C-konec oligopeptidu. Ačkoliv při výrobě takového konjugátu mohou být použity jiné sekvence reakcí, bylo zjištěno, že výhodnou metodou je nejprve navázání jedné aminokyseliny na 4-kyslík a potom navázání zbývající aminokyselinové sekvence. Také bylo zjištěno, že 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazin (ODHBT) může být použit místo HOAt v konečném stupni kopulační reakce.

Reakční schéma II ilustruje přípravu konjugátů oligopeptidů podle předkládaného vynálezu, ve kterých je kyselina hydroxyalkanolylová použita jako spojovací skupina mezi vinca alkaloidem a oligopeptidem.

Reakční schéma I

OH

vinblastin CO₂CH₃

OH

CO₂CH₃ des acetylvinblastin • · · · • ·

Reakční schéma I (pokračování)

OH

CO₂CH₃

OH

CO₂CH₃ dusíkový konec • · » · • · »· * · » «

Reakční schéma II

N-chráněná aminokyselina

DMAP/

DCC

HO- (CH₂)_uW(CH₂)_u - CO^enzyl

N-chráněná aminokyselina - O- (CH₂)_UW(CH₂)_U - CO^enzyl

CH₃O'

• ·

Reakční schéma II (pokračování)

^x uhlíkový konec

uhlíkový konec

Hodina

dusíkový konec • · · · ♦ · ·· »· »· • » * · · · · ♦ * *·· · « · ·

Konjugáty oligopeptid-cytotoxické činidlo podle předkládaného vynálezu jsou užitečné v léčbě onemocnění, která jsou charakterizována abnormálními buňkami nebo abnormální proliferací buněk, ať benigní, nebo maligní, kde tyto buňky jsou charakterizovány sekrecí enzymaticky aktivního PSA. Mezi taková onemocnění patří, například, karcinom prostaty, benigní prostatická hyperplasie, metastazující karcinom prostaty, karcinom prsu a podobně.

Konjugáty oligopeptid-cytotoxické činidlo podle předkládaného vynálezu jsou podávány pacientovi ve formě farmaceutického prostředku, který obsahuje konjugát podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, přísadu nebo ředidlo. Jak je zde použit, označuje termín farmaceuticky přijatelný ta činidla, která jsou použitelná v léčbě nebo při diagnostice u teplokrevných zvířat, včetně, například, člověka, koní, prasat, skotu, myší, psů, koček nebo jiných savců, stejně jako ptáků a jiných etplokrevných zvířat. Výhodným způsobem podání je parenetrální podání, zejména intravenosní, intramuskulární, subkutání, intraperitoneální nebo intralymfatické podání. Takové prostředky mohou být připraveny za použití nosičů, ředidel nebo přísad dobře známých odborníkům v oboru. Viz Remington's Pharmaceutical Sciences,

16. vydání, 1980, Mack Publishing Company, vydaná Osol et al.. Takové prostředky mohou obsahovat proteiny, jako jsou sérové proteiny, například lidský sérový albumin, pufry nebo pufrovací substance, jako jsou fosfáty, jiné soli nebo elektrolyty a podobně. Mezi vhodná ředidla patří, například, sterilní voda, izotonický salinický roztok, vodný roztok dextrosy, polyhydrický alkohol nebo směsi takových alkoholů, například glycerin, propylenglykol, polyethylenglykol a podobně. Prostředky mohou obsahovat konzervační činidla, jako je fenethylalkohol, methyl a propylparabeny, thiomerosal a podobně. Pokud je to vhodné, mohou prostředky obsahovat 0,05 až ·*·*

4 9 >

• · tlf ·* ·· • r » • 9· • f · • · · ·* 4 9

0,20% hmotnostních antioxidačního činidla, jako je metahydrogensiřičitan sodný nebo kyselý siřičitan sodný.

Termín prostředek, jak je zde použit, zahrnuje výrobky obsahující specifické složky ve specifických množstvích, stejně jakékoliv jiné výrobky které vznikají, přímo nebo nepřímo, z kombinování specifických složek ve specifických množstvích.

Farmaceutický prostředek může být ve formě sterilního injekčního vodného roztoku. Mezi vhodná vehikula a rozpouštědla, která mohou být použita, patří voda, Ringerův roztok a izotonický roztok chloridu sodného.

Sterilní injekční prostředky mohou být také sterilní injekční mikroemulse olej ve vodě, ve kterých je aktivní složka rozpuštěna v olejové fázi. Například, aktivní složka může být nejprve rozpuštěna ve směsi sojového oleje a lecitinu. Olejový roztok s epotom vnese do směsi vody a glycerolu a zpracuje se za vzniku mikroemulse.

Injekční roztoky nebo mikroemulse mohou být podány do krevního řečiště lokální bolusovou injekcí. Alternativně, může být výhodné podat roztok nebo mikroemulsy takovým způsobem, aby byla udržována konstantní koncentrace podané sloučeniny v cirkulaci. Pro udržování takové konstantní koncentrace může být použito zařízení pro kontinuální intravenosní podávání. Příkladem takového zařízení je intravenosní pumpa Deltec CADDPLUS^(tm) model 54 00.

Farmaceutické prostředky mohou být ve formě sterilních injekčních vodných nebo olejových suspenzí pro intramuskulární a subkutání podání. Tyto suspenze mohou být připraveny běžnými způsoby za použití vhodných disperzních nebo smáčivých činidel a suspendačních činidel, která byla zmíněna výše. Sterilní injekční prostředky mohou být také sterilní injekční roztoky nebo suspenze v netoxickém, parenterálně přijatelném ředidlu nebo rozpouštědlu, jako je například roztok v 1,3-butandiolu. Dále, jako rozpouštědlo nebo suspendační medium jsou často používány sterilní, netěkavé oleje. Pro tento účel může být použit jakýkoliv netěkavý olej, včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Dále mohou být při přípravě injekčních prostředků použity mastné kyseliny jako je kyselina olejová.

Pro intravenosní podání bude prostředek výhodně připraven tak, aby množství konjugátu podané pacientovi bylo v rozmezí od přibližně 0,01 do přibližně 1 g. Výhodně bude podané množství konjugátu v rozmezí od přibližně 0,2 g do přibližně 1 g. Konjugáty podle předkládaného vynálezu jsou účinné v širokém rozmezí dávek, v závislosti na faktorech jako je léčené onemocnění nebo modifikovaný biologický efekt, způsob podání konjugátu, věk, hmotnost a celkový stav pacienta a další faktory, které jsou určeny ošetřujícím lékařem. Proto musí být dávka pro každého pacienta stanovena individuálně.

Odborníkům v oboru bude jasné, že ačkoliv jsou v následujících příkladech uvedena specifická činidla a reakční podmínky, spadají možné modifikace do rozsahu předkládaného vynálezu. Následující způsoby přípravy a příklady jsou proto ilustrativní a nijak neomezují předkládaný vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: des-Acetylvinblastin-4-O-(N-acetyl-4-trans-L-HypSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro), ester

Stupeň A: Příprava 4-des-acetylvinblastinu

Vzorek 2,40 g (2,63 mmol) vinblastinsulfatu (Sigma V-1377) se rozpustí pod N₂ ve 135 ml absolutního methanolu a reaguje s ml bezvodého hydrazinu a roztok se mísí při 20-25 °C po dobu hodin. Reakční směs se zahustí odpařením na hustou pastu, která se rozdělí mezi 300 ml CH2CI2 a 150 ml nasyceného roztoku NaHCCh. Vodná vrstva se promyje 2x 100 ml Ch2Cl2 a každá ze 3 CH2CI2 vrstev se potom promyje 100 ml H₂0 (2x) a nasyceným roztokem NaCl (lx). Kombinované organické vrstvy se suší přes bezvodý Na₂SO4 a rozpouštědlo se odstraní za redukovaného tlaku za zisku titulní sloučeniny ve formě špinavě bílého krystalického materiálu. Tento materiál se uskladní při -20 °C do použití.

Stupeň B: Příprava 4-des-acetylvinblastin-4-O-(prolyl) esteru

Vzorek 804 mg (1,047 mmol) 4-des-acetylvinblastinu, rozpuštěný ve 3 ml CH2CI2 a 18 ml bezvodého pyridinu pod dusíkem, reaguje s 1,39 g Fmoc-prolin-chloridem (Fmoc-Pro-Cl, Advanced Chemtech) a směs se mísí po dobu 20 hodin při 25 °C. Pokud ukáže analýza HPLC přítomnost nezreagovaného výchozího des-acetylvinblastinu, přidá se dalších 0,5 g Fmoc-Pro-Cl a míšení pokračuje dalších 20 hodin pro dokončení reakce. Přidá se voda (asi 3 ml) pro reakci s nadbytkem chloridu kyseliny a roztok se potom odpaří do sucha a rozdělí se mezi 300 ml EtOAc a 150 ml nasyceného roztoku NaHCO3, a potom se provede dvakrát promytí nasyceným roztokem NaCl. Po sušení (Na₂SO4) se rozpouštědlo odstraní za redukovaného tlaku za zisku oranžověhnědého zbytku, do kterého se přidá 30 ml DMF a 14 ml piperidinu, a po 5 minutách se roztok odpaří za redukovaného tlaku za zisku oranžově-žlutého semi-solidního zbytku. Po sušení ve vakuu po dobu přibližně 1 hodiny se do tohoto materiálu přidá přibližně 200 ml H2O a 100 ml etheru a potom se po kapkách přidá ledový HOAc za třepání a sonikace pro dosažení úplného rozpuštění, za dosažení stabilního pH vodné vrstvy 4,55,0 (pH 4-6 při stanovení navlhčeným papírem). Vodná vrstva se potom promyje lx 100 ml etheru a každá etherová vrstva se potom promyje 50 ml H₂O. Kombinované vodné vrstvy se zpracují preparativní HPLC ve 2 dílech na Waters C4 Delta-Pak koloně 15 • · • · μΜ 300 A (A = 0,1% TFA/H₂O; B = 0,1% TFA/CH3CN) , při gradientově elucí 95 —> 70% A/70 minut. Po koncentrování a lyofilizaci odebraných frakcí se získá titulní sloučenina.

Stupeň C: N-acetyl-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-WANG pryskyřice

Z 0,5 mmol (0,61 g) Fmoc-Ser(t-Bu)-WANG pryskyřice použité v konc. 0,82 mmol/g se chráěnný peptid syntetizuje na peptidovém syntezátoru ABI model 430A upraveném pro Fmoc/tbutyl syntézu. Protokol využívá 2-násobný nadbytek (1,0 mmol) každé z následujících chráněných aminokyselin: Fmoc-Ser-(t-Bu)OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Chg-OH, Fmoc-4-trans-L-Hyp-OH; a kyseliny octové (dvojité navázání). Během každého vazebného cyklu se Fmoc chránící skupina odstraní za použití 20% piperidinu v Nmethyl-2-pyrrolidinonu (NMP), po kterém následuje promytí NMP. Navázání se provede za použití DCC a HOBt aktivace v NMP. Po dokončení syntézy se peptidová pryskyřice suší za zisku titulní sloučeniny.

Stupeň D: N-acetyl-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-OH

Jeden 0,5 mmol výtěžek výše uvedené peptidové pryskyřice se suspenduje ve 25 ml TFA a potom se přidá 0,625 ml H₂O a 0,625 ml triisopropylsilanu a směs se mísí při 25 °C po dobu 2,0 hodin. Štěpící směs se filtruje, pevný materiál se promyje TFA, rozpouštědla se odstraní z filtrátu za redukovaného tlaku a zbytek se trituruje s etherem za zisku světle žlutého pevného materiálu, který se izoluje filtrací a sušením ve vakuu za zisku titulní sloučeniny.

Podmínky HPLC, systém A:

Kolona... Vydac 15 cm, č. 218TP5415, C18

Gradient (95% A—>50% A) během 45 minut

A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1%

Eluens...

TFA/acetonitril

Průtok... 1,5 ml/min.

ES/FT-MS s vysokým rozlišením: 789,3.

Stupeň E: des-Acetylvinblastin-4-0-(N-acetyl-4-trans-L-Hyp-SerSer-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro), ester

Vzorky 522 mg (0,66 mmol) peptidu ze stupně D a 555 mg (asi 0,6 mmol) 4-des-acetylvinblastin-4-O-(prolyl)esteru ze stupně B, připravené výše, se rozpustí v 17 ml DMF pod N₂. Potom se přidá 163 mg (1,13 mmol) l-hydroxy-7-azabenztriazolu (HOAt) a pH se upraví na 6,5-7 (podle papírku s rozmezím 5-10) pomocí 2,4, β-kollidinu a potom se provede ochlazení na 0 °C a přidá se 155 mg (0,81 mmol) 1-(3-dimethylaminopropyl)-3ethylkarbodiimidu, hydrochloridu (EDC). Míšení pokračuje při 05 °C do dokončení kopulační vazby, jak je stanoveno analytickou HPLC (A = 0,1% TFA/H₂O, B = 0,1% TFA/CH₃CN) , za udržování pH 6,5-7 periodickým přidáváním 2,4,6-kollidinu. Po 12 hodinách se přidají přibližně 4 ml H₂O a po míšení po dobu 1 hodiny se reakční směs koncentruje na malý objem ve vakuu a rozpustí se v přibližně 150 ml 5% HOAc a provede se preparativní HPLC ve dvou dílech na Waters C18 Delta-Pak koloně 15 μΜ 300 A (A =

0,1% TFA/H₂O; B = 0,1% TFA/CH3CN) , při gradientově eluci 95 --> 65% A/70 minut). Homogení frakce obsahující později eluující materiál (jak je stanoveno HPLC systémem A, 95—>65%A/30 minut) z obou běhů se odebere a koncentruje se na objem přibližně 50 ml a nechá se projít přes přibližně 40 ml AG4X4 iontoměničové pryskyřice (acetatový cyklus) a potom se provede lyofilizace za zisku titulní sloučeniny ve formě lyofilizovaného prášku.

ES/FT-MS s vysokým rozlišením: 1637,0

Příklad IA: des-Acetylvinblastin-4-0-(N-acetyl-4-trans-L-HypSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro) , ester acetat • ·

Vzorek 4,50 g (3,7 mmol) soli 4-0(prolyl)desacetylvinblastinu s TFA, připraveného v příkladu 1, stupni B, se rozpustí ve 300 ml DMF pod N₂ a roztok se ochladí na 0 °C. Potom se přidá 1,72 g (10,5 mmol) 3,4-dihydro-3hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazinu (ODHBT) a pH se upraví na 7,0 (podle papírku pro určování pH se stupnicí od 5 do 10) za použití N-methylmorfolinu (NMM), a potom se přidá 4,95 g (5,23 mmol) N-acetyl-heptapeptidu z příkladu 1, stupně D, po částech, aby se dosáhlo úplného rozpuštění po každém přidání. pH se opět upraví na 7,0 pomocí NMM a přidá se 1,88 g (9,8 mmol) l-(3dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu, hydrochloridu (EDC) a potom se roztok mísí při 0-5 °C do dokončení kopulační reakce, jak je sledováno analytickou HPLC (systém A), za udržování pH přibližně 7 periodickým přidáváním NMM. Analýza ukázala hlavní složku s retenčním časem 26,3 minuty, před kterou předcházela vedlejší složka (asi 10%) s časem 26,1 minut, která byla identifikovaná jako D-Ser izomer titulní sloučeniny. Po 20 hodinách byla reakce dokončena přidáním 30 ml H₂0 a po míšení po dobu 1 hodiny byla reakční směs koncentrována na malý objem ve vakuu a byla rozpuštěna v přibližně 500 ml 20% HOAc a bylo provedeno zpracování preparativní HPLC ve 12 dílech na Waters C18 Delta-Pak koloně 15 mM 300 A (A = 0,1% TFA/H₂O; B = 0,1% TFA/CH₃CN) , při gradientově eluci 85 —> 65% A/90 minut), při průtoku 80 ml/min.

Homogení frakce (vyhodnocené HPLC, systém C) představující přibližně 1/4 celkového objemu byly odebrány a koncentrovaly se na objem přibližně 150 ml a nechaly se projít přes přibližně 200 ml BioRad AG4X4 iontoměničové pryskyřice (acetatový cyklus) a potom se provedla lyofilizace eluátu za zisku acetatové soli titulní sloučeniny ve formě lyofilizovaného prášku; retenční čas (systém A) 26,7 minuty, 98,7% čistota; ES/FT-MS s vysokým rozlišením: 1636,82; analýza aminokyselinového složení, 20 hod., 100 °C, 6N HCI (teoretická hodnota/zjištěná hodnota): ser » ·

4/3,91 (korig.) Glu 1/0,92 (Gin konvertovaný na Glu), Chg 1/1,11, Hyp 1/1,07, Pro 1/0,99, peptidový obsah 0,516 mmol/mg.

Dalším kombinováním homogenních frakcí a přečištěného materiálu z vedlejších frakcí, při zpracování uvedeném výše přes přibližně 500 ml iontoměničové pryskyřice, se získala další množství titulní sloučeniny.

Podmínky HPLC, systém A:

Kolona... Vydac 15 cm, č. 218TP5415, C18

Eluens... Gradient (95% A-->50% A) během 45 minut

A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1%

TFA/acetonitrii

Průtok... 1,5 ml/min.

Vlnová délka... 214 nm, 280 nm

Podmínky HPLC, systém C:

Kolona... Vydac 15 cm, č. 218TP5415, C18

Eluens... Gradient (85% A-->65% A) během 30 minut

A = 0,1% TFA/H2O, B = 0,1%

TFA/acetonitrii

Průtok... 1,5 ml/min.

Vlnová délka... 214 nm, 280 nm

Tabulka 1 ukazuje jiné konjugáty peptidu-vinca alkaloidu, které byly připraveyn postupem pospaným v příkladu 1 a 1A, za použití vhodných aminokyselinových zbytků a blokování acylace skupin. Pokud není uvedeno jinak, byla připravena a testována acetatová sůl konjugátu.

Tabulka 1

SEQ. ID.NO	Konjugát peptid-vin	Čas do ště. ;ní 50% substrátu působením p3A (min''
95	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-SS-4-trans-L-Hyp)- dAc-VIN	13
96	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-S-P)-dAc-VIN	) Hodina ; = 8%
90	4-O-(Ac-Abu-SSChgQ-SP)-dAc-VIN	80
91 ·	4-0-( (2-OH)Ac-Abu-SSChgQ-S-P)-dAc-VIN	110
92	4-O-(Ac-3-Pal-SSChgQS-P)-dAc-VIN	80
97	4-O-(Ac-3-Pal-SSChgQ(dS)- P)-dAc-VIN	3 F Hodina = 0%
93	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSL-lactyi)-dAc-VIN	10 . , . (mírná degardace))
94	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSV-lactyl)-dAc-VIN	7 ( (stabilní))
88	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSV-glycolyl)-VIN	8
85	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQS -Glycine)-(dAc)-VIN	30
86	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSS-Sar)-(dAc)-VIN	32
84	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSSPro)-(dAc)-VIN	17
87	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSS-(d)-Pro)-(dAc)-VIN	1 . . Hodina = 34%
98	4-O-(Ac-SSChgQS-Gly)-(dAc)-VIN	55
99	4-O-(Ac-SSChgQ-SS-4-trans-L-Hyp)-dAc-VIN	22
100	4-O-(Ac-SSChgQ-SS-P)-dAc-VIN	15
101	4-0-{Αο4-ίΓ3η5-υ·^ρ85(^0-8(ά3)-4-ίΓ3η5-1_-Η^ρ)- dAc-VIN	1 Hodina = 12%

4-trans-L-Hyp je trans-4-hydroxy-L-prolin, pokud n > 1; hodnota je průměrná • · · · • ·

Čas do štěpení

SEQ. ID.NO.	Konjugát peptid-vin	50% substrátu ; působením pSA . (min))
1 02	(4-O)-Ac-(4-trans-L-Hyp)SSChgQ-SL- (dAc)-VIN	35
1 03	Ac-4-trans-L-HypSSChgQS-(4-O-Ala)- (dAc)-VIN	23 ( P r<(prod. konvertuje na ) 4-O-A-dAc-VIN)
1 04	Ac-4-trans-L-HypSSChgQSChg-(4-O- glycoiyl)-VIN	12
105	Ac-4-trans-L-HypSSChgQSS-(4-O-Sar)- (dAc)-VJN	15
102	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSL-lactyl)- (dAc)-VIN	10
1 06	Ac-SSChgQ-SS-(4-O-4-trans-L-Hyp)-dAc- VIN	22
' 1071	Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-SS(4-O-P)- Vindesine	12
108	Ac-AbuSSChgQ-S(dS)-(4-O-P)-dAc-VIN	60
109	Ac-AbuSSChgQ-SS-(4-O-P)-dAc-VIN	7
•110	Ac-AbuSSChgQ-(dS)-(4-O-P)-dAc-VIN	1 (Hodina = 0%
104	Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-SChg-(4-O- lactyl)-dAc-VIN	14
1 1 1	Ac-SSChgQ-SS-(4-O-P)-Vindesine	22
112	4-O-[Ac-SSChgQ-S(dS)- 4-trans-L-Hyp]- dAc-VIN	1 . Hodina — 14%
113	4-O-[Ac-4-trans-L-HypSSCbgQ-(dS)SP]- dAc-VIN	6 , JURS (10 X ENZ)
114	4-O-[Ac-4-trans-L-HypSSChg(dQ)SSP]- dAc-VIN	10X ENZo/n = 0%
115	4-O-[Ac-4-trans-L-HypSSChg(dQ)(dS)SP]- dAc-VIN	10X ENZo/n = 0%
116	4-O-(Ac-SChgQ-SSP)-dAc-VIN	15
1 171	4-O-[Ac-SChgQSS4-trans-l-Hyp]-dAc-VIN	15
1 1 8	4-O-[Ac--SChgQSS-Sar]-dAc-VIN	39 n = 2
11 9	4-O-[Ac-SChgQSS-Aib-P]-dAc-VIN	15, 23
120	4-O-[Ac-SChgQSS(N-Me-Ala)]-dAc-VIN	30
121	4-O-[Ac-SChgQS-Aib-P]-dAc-VIN	1 , Hodina { = 8%
122	4-O-[(2-OH)Ac-SChgQSS-Sar]-dAc-VIN	1 . Hodina 1 = 4%
123	4-O-[Ac-SChgQSS-Pip]-dAc-VIN	15
124	4-O-[Ac-4-trans-L-HypSSChgQSS-Pip]- dAc-VIN	13
125	4-O-[Ac-SChgQSS-(N-Me-dA)]-dAc-VIN	1 ' Hodina! — 26%

• · ·

Příklad 4: Hodnocení rozpoznávání konjugátů oligopeptid-vinca alkaloid volným PSA

Konjugáty připravené v příkladu 3 se jednotlivě rozpustí v PSA trávicím pufru (50 mM tris(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7,4, 140 mM NaCl) a roztok s epřidá k PSA v molárním poměru 100:1. Alternativně je použitým PSA trávicím pufrem 50 mM tris(hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7,4, 140 mM NaCl. Reakce se utlumí po různých reakčních dobách přidáním kyseliny trifluoroctové (TFA) v konečném objemu 1% (obj./obj.) .

Alternativně se reakce utlumí 10 mM ZnCl2. Utlumená reakční směs se analyzuje HPLC na C18 koloně s reverzní fází za použití gradientu 0,l%TFA/acetonitril. Potom se vypočítá čas (v minutách) nutný pro 50% štěpení uvedených konjugátů oligopeptidu-cytotoxického činidla enzymaticky aktivním volným PSA. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Příklad 5: In vitro test cytotoxicity peptidových derivátů vinca alkaloidů

Cytotoxicita štěpitelných konjugátů oligopeptid-vinca alkaloid, které byly připraveny způsobem popsaným v příkladu 3, proti různým buňkám, o kterých je známo, že jsou zabíjeny nemodifikovaným vinca alkaloidem, byla hodnocena Alamar Blue testem. Konkrétně, buněčné kultury LNCap prostatických nádorových buněk, Colo320DM buněk (označených C320) nebo T47D buněk v 96-jamkových plotnách byly ředěny mediem obsahujícím různé koncentrace daného konjugátu (konečný objem jamky byl 200 μΐ). Colo320DM buňky, které neexprimují volný PSA, byly použity jako kontrolní buněčná linie pro stanovení toxicity založené na jiném mechanismu. Buňky byly inkubovány po dobu 3 dnů při 37 °C a potom bylo do každé testované jamky přidáno 20 μΐ Alamar Blue. Buňky byly dále inkubovány a testovací plotny byly odečítány na EL-310 ELISA čtečce ploten při vlnových délkách 570 a 600 nm ve 4. a 7. hodině po adici Alamar Blue. Potom bylo • * · ·

vypočítáno relativní procento životaschopnosti při různých koncentracích testovaného konjugátu vůči kontrolním kulturám (bez konjugátu) a byla stanovena hodnota EC50. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2. Pokud není uvedeno jinak, byla testována acetatová sůl konjugátu.

SEQ. ID NO.	konjugát peptid-vin (cytotoxické činidlo)	LNCaP buňky usmrcené v 72 hodině (48 hodině) (EC50 M-M) κ-' '
	VINBLASTINE	0.5 (Colo320DM = 0.5)
	(4-O-4-trans-L-Hyp)-dAc-VIN	0.6 (Colo320DM = 1.1) n =2
	4-O-glycine-(dAc)-VIN	0.3 (Colo320DM = 1.8)
	4-O-sarcosyl-(dAc)-VIN	1.3 (Colo320DM = 1.8)
95	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-SS-4-trans- L-Hyp)-dAc-VIN	16.3 (Colo320DM = 13.1)
96	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-S-P)-dAc-VIN	47.9 (Colo320DM = 83.9)
96	4-0-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQS-Pro)-(dAc)VIN	> 16 (Colo320DM = 26) in 5% FBS
90	4-O-(Ac-Abu-SSChgQ-S-P)-dAc-VIN	9.7 (Coio320DM = 14.5) n=2
90	li	> 5 (Colo320DM = 23.8) in 0.5% FBS
91	4-0-( (2-0H)Ac-Abu-SSChgQ-S-P)-dAc-VIN	11.9 (Coio320DM = 52.5)
92	4-O-(Ac-3-Pal-SSChgQS-P)-dAc-VIN	5.8 (Colo320DM = 8.0) PS
93	4-O-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSL-lactyl)dAc-VIN	1.1 (Coío320DM = 13.3)
94	4-O-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSV-lactyl)dAc-VIN	3.1 (Colo320DM = 8.1)
88	4-O-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSV-giycolyl)VIN	4.1 (COIO320DM = 8.1)
86	4-O-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSS-Sar)(dAc)-VIN	4.1 (Colo320DM = 13.0)
84	4-O-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSSPro)(dAc)-VIN	3.0 (Colo320DM = 12) n=3
87	4-0-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSS-(d)-Pro)(dAc)-VlN	4.1 (Colo320DM = 8.1)
85	4-O-(Ac-4-trans-L-Hyp SSChgQSGIy)-(dAc)VIN	9.3 (Colo320DM = 13.5) n = 2
98	4-0-(Ac-SSChgQS-Gly)-(dAc)-VIN	16.3 (Coio320DM = 16.3)
100	4-0-(Ac-SSChgQ-SS-4-trans-L-Hyp)-dAc- VIN	6.8 (Colo320DM = 8.1) n=2

Tabulka 2

SEQ.ID. NO.	konjugát peptid-vin (cytotoxické činidlo)	LNCaP buňky usmrcené v 72 ' □. hodině (48 hodině) (EC5o μΜ)
	4-O-ieucyl-(dAc)-VIN	4.5 (Colo320DM = 4.5)
	4-O-Abu-(dAc)-VIN, racemic mixture	3.8 (Colo320DM = 5.5)
	4-O-Abu-(dAc)-VIN, I isoform	3.9 (Colo320DM = 2.3)
102	(4-O)-Ac-(4-trans-L-Hyp)SSChgQ-SL-(dAc)- VIN	40 (Colo320DM = 86.7)SF; 50 (97) 0.5% FBS
	4-O-(prolyl)-dAc-VIN	0.7 (Colo320DM = 4.1) n=2
	(4-O-Phe)-(dAc)-VIN	3.8 (Colo320DM = 2.2)
	(4-O-Ala)-(dAc)-VIN	0.6 (Colo320DM = 4.2)
103	Ac-4-trans-L-HypSSChgQS-(4-O-Ala)- (dAc)-VIN	12.5 (Colo320DM = 32.5)
	4-hydroxyacetyl-VIN = 4-O-glycolyi-dAc-VIN	1.3 (Colo320DM = 3.3)
104	Ac-4-trans-L-HypSSChgQSChg-(4-O- glycolyl)-VIN	4.1 (Colo320DM = 4.1)
	4-O-(d)-prolyl-(dAc)-VIN ester	2.0 (Colo320DM = 4.1)
	Chg-(4-O-Glycolyl)-VIN
105	Ac-4-trans-L-HypSSChgQSS-(4-O-Sar)- (dAc)-VIN	12 (Colo320DM = 12)
102	4-0-(Αο4-ϋΉΠ3-Ι_-Ηγρ850Ι^03Ι_-ΐ3<^Ι)- (dAc)-VIN	1.1 (Colo320DM = 13.3)
	4-O-(V-lactyl)-dAc-VIN	1.3 (Colo320DM = 2.6)
	4-O-(L-lactyl)-dAc-VIN	0.7 (Colo320DM = 2.0)
	4-O-(Chg-lactyl)-dAc-VIN	4.1 (Colo320DM = 8.4)
104	4-O-(Ac-4-trans-L-HypSSChgQSChg- lactyl)-dAc-VIN	8.1 (Colo320DM = 27.9) PS
106	Ac-SSChgQ-SS-(4-O-Hyp)-dAc-VIN	6.8 (Colo320DM = 8.1) n = 2
107	Ac-4-trans-L-HypSSChgQ-SS(4-O-P)- Vindesin	12.5 (Colo320DM > 73)

• « · ·

SEQ.ID. NO.	konjugát peptid-vin (cytotoxické činidlo)	LNCaP buňky usmrcené v 72 * hodině (48 hodině) (EC50 μΜ)
108	Ac-AbuSSChgQ-SS-(4-O-P)-dAc-VlN	12.8 (Colo320DM = 28.4)
	Prolyl-Vindesine	0.3 (Colo320DM = 6.9)
111	Ac-SSChgQ-SS-(4-O-P)-Vindesine	32.5 (Coio320DM > 73)
	4-O-(SP)-dAc-VIN	0.1 (Colo320DM = 0.3)
	4-O-(SSP)-dAc-VIN	2.0 (Colo320DM = 14.5)
114	4-0-[Αο4-ΐΓ3η5-1*Ι^ρ330ίΊς^0)33Ρ]- dAc-VIN	12.2 (Colo320DM = 43.7)
115	4-O-[Ac-4-trans-L-HypSSChg(dQ)(dS)SP]- dAc-VIN	16.3 (Colo320DM = 47.7)
116	4-O-(Ac-SChgQ-SSP)-dAc-VIN	15 (Colo320DM = 20)
•	4-O-pipecolyl-dAc-VIN	0.7 (Colo320DM = 0.7)
117	4-O-[Ac-SChgQSS4-trans-L-Hyp]-dAc-VIN	5.6 (Golo320DM = 5.6)
	4-O-N-methylalanyl-dAc-VIN	2.9 (Colo320DM = 2.9)
118	4-O-[Ac~SChgQSS-Sar]-dAc-VIN	0.8 (Colo = 3.0)
119	4-O-[Ac-SChgQSS-Aib-P]-dAc-VIN	> 25 (Coio320DM > 25)
120	4-O-[Ac-SChgQSS(N-Me-Ala)]-dAc-VIN	2.3 (Colo320DM = 3.1)
123	4-O-[Ac-SChgQSS-Pip]-dAc-VIN	80 (Colo320DM > 75)
124	4-O-[Ac-4-trans-L-HypSSChgQSS-Pip]-dAc- VIN	7.5(Colo320DM= 60)
	4-O-[N-Me-dA]-dAc-VIN	1.0(Colo320DM= 1-7)

Píp je kyselina pipekolinová; Sar je sarkosin; Chg je cyklohexylglycin; Abu je kyselina 2-aminomáselná; Aib je kyselina 2-aminoisomáselná.

Příklad 6: In vivo účinnost konjugátů peptid-cytotoxické činidlo

LNCaP.FGC nebo DuPRO-1 buňky byly trypsinizovány, resuspendovány v kultivačním mediu a centrifugovány po dobu 6 minut při 200 x g. Buňky byly resuspendovány v bezsérovém aMEM a byly spočítány. Vhodný objem tohoto roztoku obsahující požadovaný počet buněk byl potom přenesen do konické centrifugační zkumavky, byla provedena centrifugace způsobem pospaným výše a resuspendování ve vhodném objemu chladné 1:1 směsi α-MEM-Matrigel. Suspence byla uchovávána na ledu před inokulaci zvířat.

Samci Harlan Sprague Dawley holých myší (stáří 10-12 týdnů) byly izolováni bez anestesie a byly inokulováni 0,5 ml buněčné suspenze na levém boku za použití podkožní injekce 22G jehlou. Myším bylo aplikováno buď přibližně 5 χ 10⁵ DuPRO buněk, nebo 1,5 χ 10⁷ LNCaP.FGC buněk.

Po inokulaci nádorovými buňkami byly myši léčeny podle jednoho ze dvou protokolů:

Protokol A:

Jeden den po inokulaci byla zvířatům podána dávka 0,1-0,5 ml testovaného konjugátu, vinca alkaloidu nebo kontrolního vehikula (sterilní vody). Dávky konjugátu a vinca alkaloidu byly nejprve maximální neletální množství, ale později mohly být sníženy. Stejné dávky byly podávány ve 24 hodinových intervalech po dobu 5 dnů. Po 10 dnech byly myším odebrány vzorky krve a stanovily se sérové koncentrace PSA. Dále byly sérové koncentrace PSA stanovovány v 5-10 denních intervalech. Na konci 5,5 týdne byly myši utraceny a byly zváženy jakékoliv přítomné nádory a opět byla stanovena sérová hodnota PSA.

« *

· · · » · · ·· ··€ tl ··

Hmotnosti zvířat byly také stanoveny na počátku a na konci testu.

Protokol B:

dnů po inokulaci byly zvířatům odebrány vzorky krve a byly stanoveny sérové koncentrace PSA. Zvířata byla potom rozdělena do skupin podle sérových koncentrací PSA. 14-15 dnů po inokulaci byla zvířatům podána dávka 0,1-0,5 ml testovaného konjugátu, vinca alkaloidu nebo kontrolního vehikula (sterilní vody). Dávky konjugátu a vinca alkaloidu byly nejprve maximální neletální množství, ale později mohly být sníženy. Stejné dávky byly podávány ve 24 hodinových intervalech po dobu 5 dnů.

Sérové koncentrace byly PSA stanovovány v 5-10 denních intervalech. Na konci 5,5 týdne byly myši utraceny a byly zváženy jakékoliv přítomné nádory a opět byla stanovena sérová hodnota PSA. Hmotnosti zvířat byly také stanoveny na počátku a na konci testu.

Příklad 7: In vivo stanovení proteolytického štěpení konjugátů endogenními non-PSA proteasami

Stupeň A: Příprava proteolytických tkáňových extraktů

Všechny procedury byly provedeny při 4 °C. Vhodná zvířata byla utracena a příslušné tkáně byly izolovány a byly uskladněny v kapalném dusíku. Zmrazená tkáň byla rozdrcena na prášek pomocí tlouku a moždíře a rozdrcená tkáň byla přenesena do Potter-Elvejeh homogenizátoru a byly přidány 2 objemy pufru A (50 mM Tris obsahující 1,15% KCI, pH 7,5). Tkáň byla potom rozrušena 20 údery pro hrubé rozrušení a potom byla byla jemně romělněna pomocí tlouku. Homogenát byl centrifugován při 10000 x g na centrifuze (HB4-5), peleta byla odstraněna a supernatant byl odstředěn při 100000 x g (Ti 70). Supernatant (cytosol) byl uskladněn.

Peleta byla resuspendována v pufru B (10 mM EDTA obsahující 1,15% KC1, pH 7,5) za použití stejného objemu jako byl použit výše pro pufr A. Suspenze byla homogenizována v dounce homogenizačním přístroji a roztok byl potom odstředěn při 100000 x g. Supernatant byl potom odstraněn a peleta byla resuspendována v pufru C (10 mM pufr (fosforečnan draselný) obsahující 0,25 M sacharosu, pH 7,4), za použití 1/2 objemu použitého výše a provedla se homogenizace v dounce homogenizačním přístroji.

Obsah proteinů ve dvou roztocích (cytosolovém a membránovém) se stanovil pomocí Bradfordova testu. Testované alikvoty byly potom odstraněny a zmrazený v kapalném N₂. Alikvoty byly uskladněny při -70 °C.

Stupeň B: Test proteolytického štěpení

V každém testovaném čase se 20 μς konjugátu peptid-vinca alkaloid a 150 μg tkáňového proteinu, připraveného ve stupni A a analyzovaného podél Bradforda, v reakčním pufru vnelo do roztoku pufru o konečném objemu 200 μΐ (50 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,2). Testovací reakce se provedly pro 0, 30, 60, 120 a 180 minutu a utlumily se 9 μΐ 0,1 M ZnCl₂ a okamžitým umístěním do vroucí vody na dobu 90 sekund. Reakční produkty se analyzovaly HPLC za použití VYDAC C18 15 cm kolony ve vodě/acetonitrilu (5% až 50% acetonítrilu během 30 minut).

Seznam sekvencí <110> Merck and Co., Inc.

Brady, Stephen F.

Feng, Dong-Mei Garsky, Victor M.

<120> Konjugáty použitelné v léčbě karcinomu prostaty <130> 20120Y <150> 60/067110 <151> 1997-12-02 <160> 125 <170> FastSEQ pro Windows Verze 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <400> 1

Asn Lys Ile Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <400> 2

Lys Ile Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická

Asn Lys Ile Ser Tyr Tyr Ser 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Asn Lys Ala Ser Tyr Gin Ser 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Ser Tyr Gin Ser Ser

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Lys Tyr Gin Ser Ser 1 5

PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> homoarginin <400> 7

Xaa Tyr Gin Ser Ser 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> homoarginin <221> Varianta <222> (2). . .(2) <223> cyklohexylalanin <400> 8

Xaa Xaa Gin Ser Ser 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <400> 9

Tyr Gin Ser Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

• c · · · · · ··· ·· «·· ·· ·· ·· ·· zcela syntetická

Tyr Gin Ser Leu 1

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická MOD_RES (4). . .(4)

Nle

Tyr Gin Ser Leu 1

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická Varianta (1). · .(1) cyklohexylglycin 12

Xaa Gin Ser Leu 1

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Varianta (1). . .(1) cyklohexylglycin * · · · <221> MOD_RES <222> (4) . . . (4) <223> Nle <400> 13

Xaa Gin Ser Leu 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <400> 14

Ser Tyr Gin Ser <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (2). . .(2) <223> cyklohexylglycin <400> 15

Ser Xaa· Gin Ser 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <400> 16

Ser Tyr Gin Ser Val 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <400> 17

Ser Xaa Gin Ser Val 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <400> 18

Ser Tyr Gin Ser Leu 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (2). . .(2) <223> cyklohexylglycin <400> 19

Ser Xaa Gin Ser Leu 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou <400> 20

Xaa Xaa Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou <400> 21

Xaa Xaa Lys Tyr Gin Ser 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> homoarginin <400> 22

Xaa Xaa Xaa Tyr Gin Ser 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> homoarginin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylalanin <400> 23

Xaa Xaa Xaa Xaa Gin Ser 1 5 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou <400> 24

Xaa Tyr Gin Ser 1 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 25

Xaa Xaa Ser Xaa Gin Ser 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Varianta (1). . .(1) cyklická aminokyselina substituovaná hydrofilní skupinou Varianta (2) . . . (2) cyklohexylglycin 26

Xaa Xaa Gin Ser

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Ser Ser Tyr Gin Ser Ala 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická Varianta (3). . .(3) cyklohexylglycin 28

Ser Ser Xaa Gin Ser Ser 1 5

<210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <400> 29

Ser Ser Tyr Gin Ser Ala <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <400> 30

Ser Ser Xaa Gin Ser Ser 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1) . . . (1) <223> 4Hyp <400> 31

Pro Ser Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1) . . . (1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 32

Pro Ser Ser Xaa Gin Ser 1 ⁵ <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <400> 33

Ala Ser Tyr Gin Ser Ser 1 · 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (3). . .(3) <223> cyklohexylglycin <400> 34

Ala Ser Xaa Gin Ser Ser 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <400> 35

Ala Ser Tyr Gin Ser Ala 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <400> 36

Ala Ser Xaa Gin Ser Ala 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1) . . . (1) <223> 4Hyp <400> 37

Pro Ala Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp • ·

<221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 38

Pro Ala Ser Xaa Gin Ser 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <400> 39 * Ser Ser Xaa Gin Ser Ala Pro

5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <400> 40

Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 · 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta • 4 4 · <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (7) . . . (7) <223> 4Hyp <400> 41

Ser Ser Xaa Gin Ser Ala Pro 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (3). . .(3) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (7) . . . (7) <223> 4Hyp <400> 42

Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 ' 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> Abu <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 43

Ala Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 5 <210> 44 <211> 7 • » 4 » <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> Abu <221> Varianta <22-2> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (7) . . . (7) <223> 4Hyp <400> 44

Ala Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 45

Ser Ser Ser Xaa Gin Ser Leu Pro 1 5 <210> 46 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 46

Ser Ser Ser Xaa Gin Ser Val Pro 1 5 <210> 47 • 9 · · <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (8) . . . (8) <223> 4Hyp <400> 47

Ser Ala Ser Xaa Gin Ser - 5

Leu Pro <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 48

Ser Ala Ser Xaa Gin Ser Val Pro ¹ ' 5 <210> 49 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Methylace <222> (1). . .(1) <223> N-methyl-serin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (8) . . . (8) <223> Kyselina pipekolinová

9> *9 »9 99 « » · 9 · · · • 9 « 9 * · 9 ** · 9 « « 9 9 • · * « · «9 ·

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Leu Xaa 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Methylace (1). · .(1)

N-methyl-serin

Varianta (4). . .(4) cyklohexylglycin Varianta (8) . . . (8) pipekolin

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Val Xaa 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

MOD_RES (1). · .(1)

Hyp

Pro Ser Ser Tyr Gin Ser Ser Pro 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická • · · · · ·· ·· ·· ·· <221> MOD_RES <222> (1) . . . (1) <223> 4Hyp <221> MOD_RES <222> (8) . . . (8) <223> 4Hyp <400> 52

Pro Ser Ser Tyr Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <400> 53

Pro Ser Ser Tyr Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <400> 54

Pro Ser Ser Tyr Gin Ser Ser Ser 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) ·· ··· ·· ·· ·· ·· <223> 4Hyp <221> MOD_RES <222> (8) . . . (8) <223> 4Hyp <400> 55

Pro Ser Ser Tyr Gin Ser Pro 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 56

Pro Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 57

Pro Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 58

Pro Ser Ser Xaa Gin Ser Leu <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 59

Pro Ser Ser Xaa Gin Ser Val 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 60

Pro Ala Ser Xaa Gin Ser Val Pro 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

MOD_RES (1) . · .(1)

Hyp

Varianta (4). . .(4) cyklohexylglycin Varianta (8) . . . (8) kyselina pipekolinová 61

Pro Ala Ser Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

MOD_RES (1). . .(1)

Hyp

Varianta (4) . . . (4) cyklohexylglycin 62

Pro Ser Ser Xaa Gin Ser 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

<221>	MOD_RES
<222>	(1). . .(i)
<223>	4Hyp
<221>	Varianta
<222>	(4) . . . (4)
<223>	cyklohexylglycin
<4 00>	63 Pro Ser Ser Xaa Gin Ser Gly 1 5
<210>	64
<211>	6
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<22 3>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(3). . .(3)
<223>	cyklohexylglycin
<400>	64 Ser Ser Xaa Gin Ser Gly 1 5
<210>	65
<211>	7
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<223>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(1) · · .(i)
<223>	pyridylalanin
<221>	MOD_RES
<222>	(7). . .(7)
<223>	4Hyp
<4 00>	65
*	Xaa Ser Ser Tyr Gin Ser Pro 1 - 5
<210>	66
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Arteficiální sekvence

zcela syntetická Varianta (1). · .(i) pyridylalanin Varianta (4) . . . (4) cyklohexylglycin 66

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Varianta (1). · .(1)

3,4-dihydroxyprolin

Xaa Ser Ser Tyr Gin Ser Ser Pro 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Varianta (1). . .(1)

3,4-dihydroxyprolin

MOD_RES (8) . . . (8)

4Hyp

Xaa Ser Ser Tyr Gin Ser Ser Pro 1 5 • · · ·

<212>	PRT
<213>	Arteficiální sekvence
<22 0>
<223>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(1) . . .(1)
<223>	homoarginin
<221>	Varianta
<222>	(4) . . . (4)
<22 3>	cyklohexylglycin
<400>	69
Xaa Ser Ala Xaa Gin Ser Leu
1	5
<210>	70
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Arteficiální sekvence
<220>
<223>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(1). . .(i)
<223>	homoarginin
<221>	MOD_RES
<222>	(3) . . . (3)
<223>	4Hyp
<221>	Varianta
<222>	(4) . . . (4)
<223>	cyklohexylglycin
<400>	70
Xaa Ser Pro Xaa Gin Ser Leu
1	5
<210>	71
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Arteficiální sekvence
<22 0>
<223>	zcela syntetická
<221>	MOD_RES
<222>	(i). . .(i)
<223>	4Hyp
<221>	Varianta
<222>	(2). . .(2)

cyklohexylglycin

Pro Xaa Gin Ser Leu 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Asn Arg Ile Ser Tyr Gin Ser 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Asn Lys Val Ser Tyr Gin Ser 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Asn Lys Met Glu Thr Ser Tyr Gin Ser Ser 1 5 10

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Asn Lys Leu Ser Tyr Gin Ser Ser 1 5 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <400> 76

Asn Lys Ile Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <400> 77

Gin Lys Ile Ser Tyr Gin Ser Ser 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (2). . .(2) <223> 4Hyp <400> 78

Asn Pro Ile Ser Tyr Gin Ser 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (2). . .(2) <223> 4Hyp <400> 79

Asn Pro Val Ser Tyr Gin Ser 1 ' 5 •·Ί .

<210>	80
<211>	7
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<22 3>	zcela syntetická
<221>	MOD_RES
<222>	(2). . .(2)
<223>	4Hyp
<4 00>	80 Pro Ala Ser Tyr Gin Ser 1 . 5
<210>	81
<211>	7
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<223>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(1). . .(i)
<223>	3,4-dihydroxyprolin
<400>	81 Xaa Ala Ser Tyr Gin Se 1 5
<210>	82
<211>	5
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<223>	zcela syntetická
<221>	MOD_RES
<222>	(1) . . · (1)
<223>	3Hyp
<221>	Varianta
<222>	(3). . .(3)
<223>	cyklohexylglycin
<4 00>	82

Pro Ser Xaa Gin Ser 1 5

...j <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> MOD_RES <222> (1). . .(1) <223> 4Hyp <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 83

Pro Ala Ser Xaa Gin Ser Ser 1 . 5 <210> 84 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Acetylace <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 84

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin • · •••ι

<221> Varianta <222> (4) . . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 85

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Gly 1 5 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (8) . . . (8) <223> MeGly <400> 86

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Gly 1 5 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 87

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro

5 <210> 88 • · • ·

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Varianta (1). · .(1)

N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin Varianta (4) . . . (4) cyklohexylglycin 88

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Val 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Varianta (1). . .(1)

N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin Varianta (4) . . . (4) cyklohexylglycin Varianta (8) . . . (8)

4-trans-L-hydroxyprolin

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5

PRT

Arteficiální sekvence zcela syntetická

Acetylace (1) - . .(1) • · · » • · »· · · <223> kyselina N-acetyl-2-aminomáselná <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 90

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> kyselina N-hydroxyacetyl-2-aminomáselná <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 91

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 · 5 <210> 92 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-3-pyridilalanin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 92

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro

5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT • · • · <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 93

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Val 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 94

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Leu 1 5 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (8) . . . (8) <223> 4-trans-L-hydroxyprolin <400> 95

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 96

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Pro 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-3-pyridilalanin <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6). . .(6) <223> d-serin <400> 97

Xaa Ser Ser Xaa Gin Xaa Pro

5 <210> 98 <211> 6 <212> PRT

<213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Acetylace <222> (1). . .(1) <223> N-methylserin <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <400> 98

Xaa Ser Xaa Gin Ser Gly 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Acetylace <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (3). . .(3) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (7) . . . (7) <223> 4-trans-L-hydroxyprolin <400> 99

Xaa Ser Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Acetylace <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin

<400> 100

Xaa Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (7) . . . (7) <223> d-serin <221> Varianta <222> (8) . . . (8) <223> 4-trans-L-hydroxyprolin <400> 101

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Xaa Xaa .

5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 102

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Leu

5 <210> 103 <211> 7 • · • · <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . -(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <400> 103

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ala 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (7). . .(7) <223> cyklohexylglycin <400> 104

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Xaa 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (8). . .(8) <223> MeGly <400> 105

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Gly 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Acetylace <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (3) . . . (3) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (8) . . . (8) <223> 4-trans-L-hydroxyprolin <400> 106

Xaa Ser Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 107 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiálni sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <400> 107

Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5

<210>	108
<211>	8
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<223>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(1). . .(1)
<22 3>	kyselina N-acetyl-aminomáselná
<221>	Varianta
<222>	(4) . . . (4)
<223>	cyklohexylglycin
<221>	Varianta
<222>	(7). . .(7)
<223>	d-serin
<400>	108
	Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Xaa Pro 1 5
<210>	109
<211>	8
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<223>	zcela syntetická
<221>	Varianta
<222>	(1) . . .(1)
<223>	kyselina N-acetyl-aminomáselná
<221>	Varianta
<222>	(4). . .(4)
<223>	cyklohexylglycin
<400>	109 Xaa Ser Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5
<210>	110
<211>	7
<212>	PRT
<213> <220>	Arteficiální sekvence
<223>	zcela syntetická

• · · · »· ·» »· *· ···· · 9 « · » · « · · ►> * ·

<221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> kyselina N-acetyl-aminomáselná <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6). . .(6) <223> d-serin <400> 110

Xaa Ser Ser Xaa Gin Xaa Pro 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Acetylace <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (3). . .(3) <223> cyklohexylglycin <400> 111

Xaa Ser Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (3). . .(3) <223> cyklohexylglycin <221> Konflikt <222> (6). . .(6) <223> d-serin « » · · • · ·

• · » ·« • · · « » » * * · f » • · · · ·» <221> Varianta <222> (7) . . . (7) <223> 4-trans-L-hydroxyprolin <400> 112

Xaa Ser Xaa Gin Ser Xaa Pro 1 5 <210> 113 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6) . . .(6) <223> d-serin <400> 113

Xaa Ser Ser Xaa Gin Xaa Ser Pro 1 5 <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (5) . . . (5) <223> d-glutamin <400> 114

Xaa Ser Ser Xaa Xaa Ser Ser Pro 1 5

• ··· ·	·»	Φ ·	• »	··
«	• ·	t	e	• «	• 4	•	*
*	k	•	*	• fc	•	*	«
t	•	« t	»	» ·	• * ►		*
* ·	•	•		• ·	r *	♦	•

<210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4) . . . (4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (5) . . . (5) <223> d-glutamin <400> 115

Xaa Ser Ser Xaa Xaa Xaa Ser Pro 1 ' 5 <210> 116 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <400> 116

Xaa Xaa Gin Ser Ser Pro 1 5 <210> 117 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence ···· · *· ·· ·· tttt • · · · ·> tt · «« t · • · · « · * · -·» « ^€ · · · · · ··· « fl «.

·· * · · · » « » < « ·· ··« ·· ·· ·· ·· <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6) . . .(6) <223> 4-trans-L-hydroxyprolin <400> 117

Xaa Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (6). . .(6) <223> MeGly <400> 118

Xaa Xaa Gin Ser Ser Gly 1 5 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) • · » « • · <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2). . .(2) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (6) . . .(6) <223> AiB <400> 119

Xaa Xaa Gin Ser Ser Ala Pro 1 5 <210> 120 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . .(2) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6). . .(6) <223> N-methyl-alanin <400> 120

Xaa Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 121 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <22 0>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2). . .(2) <223> cyklohexylglycin <221> MOD RES • * <222> (5). . .(5) <223> AiB <400> 121

Xaa Xaa Gin Ser Ala Pro 1 5 <210> 122 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-hydroxyacetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <221> MOD_RES <222> (6) . . . (6) <223> MeGly <400> 122

Xaa Xaa Gin Ser Ser Gly 1 5 <210> 123 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6). . .(6) <223> kyselina pipekolinová <400> 123

Xaa Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 124 <211> 8 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1). . .(1) <223> N-acetyl-4-trans-L-hydroxyprolin <221> Varianta <222> (4). . .(4) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (8). . .(8) <223> kyselina pipekolinová <400> 124

Xaa Ser Ser .Xaa Gin Ser Ser Xaa 1 5 <210> 125 <211> 6 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> zcela syntetická <221> Varianta <222> (1) . . . (1) <223> N-acetyl-serin <221> Varianta <222> (2) . . . (2) <223> cyklohexylglycin <221> Varianta <222> (6). . .(6) <223> N-methyl-d-alanin <400> 125

Claims (23)

1. Patentové nároky

   1. Konjugát použitelný pro léčbu karcinomu prostaty obsahující cytotoxické činidlo ze skupiny vinca alkaloidů navázané na oligopeptid, kde oligopeptid obsahuje sekvenci aminokyselin, která je selektivně proteolyticky štěpena volným prostatickým specifickým antigenem, kde uvedené navázání je volitelně zprostředkováno chemickou spojovací skupinou, a kde místo navázání oligopeptidu je kyslík ve 4-pozici cytotoxického činidla ze skupiny vinca alkaloidů, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl
2. 2. Konjugát podle nároku 1, ve kterém je cytotoxické činidlo vybráno z následujících cytotxických činidel:

   a) vinblastin;

   b) 4-desacetylvinblastin;

   c) vincristin;

   d) leurosidin; a

   e) vindesin;

   nebo jeho optický izomer.
3. 3. Konjugát podle nároku 2 ve kterém je cytotoxickým činidlem 4-desacetylvinblastin.
4. 4. Konjugát podle nároku 1, ve kterém oligopeptid obsahuje oligomer vybraný z:

   a) AsnLysIleSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 1),

   b) LysIleSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 2),

   c) AsnLysIleSerTyrTyrISer (SEQ.ID.NO.: 3),

   d) AsnLysAlaSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 4),

   100

   e)

   f)

   g)

   h)

   i)

   j)

   k)

   l)

   m)

   n)

   o)

   P)

   q)

   r)

   s)

   t)

   u)

   V)

   SerTyrGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 5); LysTyrGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 6); hArgTyrGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 7); hArgChaGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 8); TyrGlnlSerSer (SEQ.ID.NO.: 9); TyrGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 10); TyrGlnlSerNle (SEQ.ID.NO.: 11); ChgGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 12); ChgGlnlSerNle (SEQ.ID.NO.: 13); SerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 14); SerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 15); SerTyrGlnlSerVal (SEQ.ID.NO.: 16); SerChgGlnlSerV al (SEQ.ID.NO.: 17); SerTyrGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 18); SerChgGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 19); HaaXaaSerTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 20); HaaXaaLysTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 21); HaaXaahArgTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 22)

   • · • ·

   101

   w) HaaXaahArgChaGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 23);

   x) HaaTyrGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 24);

   y) HaaXaaSerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 25);

   z) HaaChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 26);

   kde Haa je cyklická aminokyselina substituovaná hydrofílní skupinou, hArg je homoarginin, Xaa je jakákoliv aminokyselina, Cha je cyklohexylalanin a Chg je cyklohexylglycin.
5. 5. Konjugát podle nároku 1, ve kterém oligopeptid obsahuje oligomer vybraný z:

   SerSerChgGlnlSerAlaPro (SEQ.ID.NO.: 39); * SerSerChgGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 40); S erS erChgGlnl S er Ala4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 41); SerSerChgGlnlSerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 42); AbuSerSerChgGlnlSerPro (SEQ.ID.NO.: 43); AbuSerSerChgGlnlSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 44); SerSerSerChgGlnlSerLeuPro (SEQ.ID.NO.: 45); SerSerSerChgGlnlSerValPro (SEQ.ID.NO.: 46); SerAlaSerChgGlnlSerLeu4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 47); SerAlaSerChgGlnlSerValPro (SEQ.ID.NO.: 48);

   (N-methyl-Ser)SerSerChgGlnlSerLeuPip (SEQ.ID.NO.: 49);

   I · ·

   102 (N-methyl-Ser)SerSerChgGlnlSerVálPip (SEQ.ID.NO.: 50);

   4-HypSerSerTyrGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 51);

   4-HypSerSerTyrGlnlSerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 52);

   4-HypSerSerTyrGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 53);

   4-HypSerSerTyrGlnlSerSerSar (SEQ.ID.NO.: 54);

   4-HypSerSerTyrGlnlSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 55);

   4-HypSerSerChgGlnlSerPro (SEQ.ID.NO.: 56);

   4-HypSerSerChgGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 57);

   4-HypSerSerChgGlnlSerLeu (SEQ.ID.NO.: 58);

   4-HypSerSerChgGlnlSerVal (SEQ.ID.NO.: 59);

   4-HypAlaSerChgGlnlSerValPro (SEQ.ID.NO.: 60);

   4-HypAIaSerChgGlnlSerSerPip (SEQ.ID.NO.: 61);

   4-HypSerSerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 62);

   4-HypSerSerChgGlnlSerGly (SEQ.ID.NO.: 63);

   SerSerChgGlnlSerGly (SEQ.ID.NO.: 64);

   103

   3-PalSerSerTyrGlnlSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 65);

   3-PalSerSerChgGlniSerPro (SEQ.ID.NO.: 66); (3,4-DiHyp)SerSerTyrGlnlSerSerPro (SEQ.ID.NO.: 67); a (3,4-DiHyp)SerSerTyrGlnlSerSer4-Hyp (SEQ.ID.NO.: 68);

   kde Abu je kyselina aminomáselná, 4-Hyp je 4-hydroxyprolin, Pip je kyselina pipekolinová, 3,4-DiHyp je 3,4-dihydroxyprolin, 3Pal je 3-pyridilalanin, Sar je sarkosin a Chg je cyklohexylglycin.
6. 6. Konjugát podle nároku 1, ve kterém oligopeptid obsahuje oligomer vybraný z:

   Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 84)

   Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 85)

   Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 86)

   Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 87)

   Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal; (SEQ.ID.NO.: 88)

   Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 89) • · • ·

   Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 90) hydroxyacetylAbu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 91) acetyl3-PALSer-Ser-Chg-GIn-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 92)

   Ac—4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val; (SEQ.ID.NO.: 93)

   Ac—4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu; (SEQ.ID.NO.: 94)

   Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 95)

   Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerPro; (SEQ.ID.NO.: 96) Ac-SerSerChgGlnSerGIy; (SEQ.ID.NO.: 98) Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 99) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 100) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerAla; (SEQ.ID.NO.: 103) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerChg; (SEQ.ID.NO.: 104) AC'4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 105) Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp; (SEQ.ID.NO.: 106) AC'4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 107) Ac--AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro; (SEQ.ID.NO.: 108) Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 109) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 111) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 114) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro; (SEQ.ID.NO.: 115)

   105

   Ac-SerChgGln-SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 116)

   Ac-SerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 117)

   Ac—SerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 118) Ac-SerChgGlnSerSerAibPro; (SEQ.ID.NO.: 119) Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala; (SEQ.ID.NO.: 120) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip; (SEQ.ID.NO.: 124) a: Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA; (SEQ.ID.NO.: 125) kde Abu je kyselina aminomáselná, 4-trans-L-Hyp je 4-trans-Lhydroxyprolin, Pip je kyselina pipekolinová, 3,4-DiHyp je 3,4dihydroxyprolin, 3-Pal je 3-pyridilalanin, Sar je sarkosin a Chg je cyklohexylglycin.
7. 7. Konjugát vzorce I

   OH

   H₃CO₂C ^XL yligopeptid -R

   C-konec kde:

   oligopeptid je oligopeptid, který je specificky rozpoznáván volným prostatickým specifickým antigenem (PSA) a může být proteolyticky štěpen enzymatickou aktivitou volného prostatického specifického antigenů;

   ί

   106

   X_L je vybrán ze skupiny zahrnující následující skupiny: vazba, -C (O) - (CH₂) _U ^-W- (CH2) U-O- a -C (O) - (CH2) U^-W- (CH2) _U-NH-;

   R je vybrán z následujících skupin:

   a) vodík;

   b) ~(C=O)R^la;

   C)

   d)

   e)

   f) ethoxyskvarat;

   g) kotyninyl;

   R¹ a R² jsou nezávisle vybrány z následujících skupin: vodík, Ci-C6alkyl, Ci-C₆alkoxy, Ci-C6aralkyl a aryl;

   R^la je Ci-Cealkyl, hydroxylovaný Cs-Cgcykloalkyl, polyhydroxylovaný Cs-Cscykloalkyl, hydroxylovaný aryl, polyhadroxylovaný aryl nebo aryl;

   R⁹ je vodík, (Ci-C3alkyl) -CO nebo (Ci-C3alkyl)-CO substituovaný chlorem;

   W je vybrán z následujících skupin: přímý nebo rozvětvený

   Cx-C₆alkyl, cyklopentyl, cyklohexyl, cykloheptyl nebo bicyklo[2.2.2]oktanyl;

   • · • ·

   107 n je 1, 2, 3 nebo 4;

   p je 0 nebo celé číslo mezi 1 až 100;

   q je 0 nebo 1, s podmínkou, že když p - 0, tak q = 1; r je 1, 2 nebo 3; t je 3 nebo 4; u je 0, 1, 2 nebo 3;

   nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl nebo optický izomer.

   AsnLysIleSerTyrGlnlSer

   LysIleSerTyrGlnlSer

   AsnLysIleSerTyrTyrISer

   AsnLysAlaSerTyrGlnlSer

   S erTy rGin 1S erS er ve kterém je oligopeptid oligomer sekvenci vybranou z:

   (SEQ.ID.NO.: 1), (SEQ.ID.NO.: 2), (SEQ.ID.NO.: 3), (SEQ.ID.NO.: 4).

   (SEQ.ID.NO.: 5);

   (SEQ.ID.NO.: 6);

   (SEQ.ID.NO.: 7);

   (SEQ.ID.NO.: 8);

   (SEQ.ID.NO.: 9);

   (SEQ.ID.NO.: 10);

   (SEQ.ID.NO.: 11);

   (SEQ.ID.NO.: 12);

   (SEQ.ID.NO.: 13);
8. 8. Konjugát podle nároku 7, obsahující aminokyselinovou

   a)

   b)

   c)

   d) . e)

   f) LysTyrGlnlSerSer

   g) hArgTyrGlnlSerSer

   h) hArgChaGInISerSer

   i) TyrGlnlSerSer

   j) TyrGlnlSerLeu

   k) TyrGlnlSerNle

   l) ChgGlnlSerLeu

   m) ChgGlnlSerNle

   108 • ·

   n) SerTyrGlnlSer

   ο) SerChgGlnlSer

   ρ) SerTyrGlnlSerVal

   q) SerChgGlnlSerVal

   r) SerTyrGlnlSerLeu

   s) SerChgGlnlSerLeu

   t) HaaXaaSerTyrGlnlSer

   u) HaaXaaLysTyrGlnlSer

   v) HaaXaahArgTyrGlnlSer

   w) HaaXaahArgChaGlnlSer

   x) HaaTyrGlnlSer

   y) HaaXaaSerChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 14);

   (SEQ.ID.NO.: 15);

   (SEQ.ID.NO.: 16);

   (SEQ.ID.NO.: 17);

   (SEQ.ID.NO.: 18);

   (SEQ.ID.NO.: 19);

   (SEQ.ID.NO.: 20);

   (SEQ.ID.NO.: 21);

   (SEQ.ID.NO.: 22);

   (SEQ.ID.NO.: 23);

   (SEQ.ID.NO.: 24);

   (SEQ.ID.NO.: 25);

   z) HaaChgGlnlSer (SEQ.ID.NO.: 26);

   109 kde Haa je cyklická aminokyselina substituovaná hydrofílní skupinou, hArg je homoarginin, Xaa je jakákoliv aminokyselina, Cha je cyklohexylalanin a Chg je cyklohexylglycin, nebo jeho optický izomer.
9. 9. Konjugát podle nároku 8, ve kterém Haa je trans-4-hydroxy-Lprolin, nebo jeho optický izomer.
10. 10. Konjugát podle nároku 7, ve kterém je oligopeptid -R vybrán ze skupiny zahrnující:

    Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGInSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 84)

    Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 85)

    Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 86)

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 87)

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal; (SEQ.ID.NO.: 88)

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 89)

    Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 90) hydroxyacetylAbu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 91) acety!3-PALSer-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-Pro; (SEQ.ID.NO.: 92)

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Val; (SEQ.ID.NO.: 93)

    Ac—4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu; (SEQ.ID.NO.: 94)

    Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSer4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 95)

    110 · · * ·······

    Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerPro; (SEQ.ID.NO.: 96) Ac-SerSerChgGlnSerGly; (SEQ.ID.NO.: 98) Ac-SerSerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 99) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 100) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerAIa; (SEQ.ID.NO.: 103) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerChg; (SEQ.ID.NO.: 104) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 105) Ac-SerSerChgGlnSerSerHyp; (SEQ.ID.NO.: 106) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 107) Ac-AbuSerSerChgGlnSer(dSer)Pro; (SEQ.ID.NO.: 108) Ac-AbuSerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 109) Ac-SerSerChgGlnSerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 111) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 114) Ac-4-trans-L-HypSerSerChg(dGln)(dSer)SerPro; (SEQ.ID.NO.: 115) Ac-SerChgGln-SerSerPro; (SEQ.ID.NO.: 116) Ac-SerChgGlnSerSer-4-trans-L-Hyp; (SEQ.ID.NO.: 117)

    Ac—SerChgGlnSerSerSar; (SEQ.ID.NO.: 118) Ac-SerChgGlnSerSerAibPro; (SEQ.ID.NO.: 119) Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-Ala; (SEQ.ID.NO.: 120) Ac-4-trans-L-HypSerSerChgGlnSerSerPip; (SEQ.ID.NO.: 124) a: Ac-SerChgGlnSerSerN-Me-dA; (SEQ.ID.NO.: 125)

    111 kde Abu je kyselina aminomáselná, 4-trans-L-Hyp je 4-trans-Lhydroxyprolin, Pip je kyselina pipekolinová, 3,4-DiHyp je 3,4dihydroxyprolin, 3-Pal je 3-pyridilalanin, Sar je sarkosin a Chg je cyklohexylglycin.
11. 11. Konjugát podle nároku 7 vybraný z následující skupiny:

    kde X je

    -Λ

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-N^y (SEQ.ID.NO.; 84)

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser (SEQ.ID.NO.: 85) uhlíkový konec ch₃ o i ^{4 11} ,N

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerSer (SEQ.ID.NO.: 86) uhlíkový konec

    112

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-N (SEQ.ID.NO.: 87) uhlíkový konec

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-SerVal .0(SEQ.ID.NO.: 88) klikový konec

    ΗΊ /—OH

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Ser-N-^y (SEQ.ID.NO.: 89) uhlíkový konec

    H*| >

    Ac-Abu-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-N\/ (SEQ.ID.NO.: 90) uhlíkový konec

    HO.

    η^ΓΛ

    Abu-Ser-Ser-Chg-GIn-Ser-N^y (SEQ.ID.NO.: 91) uhlíkový konec • ·

    AcHN

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-G!n-Ser-Val / / CH, (SEQ.ID.NO.: 93 _llb, - , , ' uhlíkový konec „O.

    Ac-4-trans-L-Hyp-Ser-Ser-Chg-Gln-Ser-Leu·^ γ i⁵/ CH₃ (SEQ.ID.NO.: 94) uhlíkový konec nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl nebo optický izomer.
12. 12. Konjugát podle nároku 7, kterým je

    OH nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl nebo optický izomer.

    114 • » ’· »·
13. 13. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje farmaceutický nosič, ve kterém je dispergováno terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
14. 14. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje farmaceutický nosič, ve kterém je dispergováno terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 7.
15. 15. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje farmaceutický nosič, ve kterém je dispergováno terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 11.
16. 16. Způsob léčby karcinomu prostaty vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 13 savci, který potřebuje takovou léčbu.
17. 17. Způsob léčby karcinomu prostaty vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 14 savci, který potřebuje takovou léčbu.
18. 18. Způsob léčby karcinomu prostaty vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 15 savci, který potřebuje takovou léčbu.
19. 19. Způsob léčby benigní hyperplasie prostaty vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 13 savci, který potřebuje takovou léčbu.
20. 20. Způsob léčby benigní hyperplasie prostaty ···· «·

    115 vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 14 savci, který potřebuje takovou léčbu.
21. 21. Způsob léčby benigní hyperplasie prostaty vyznačující se tím, že obsahuje podání terapeuticky účinného množství prostředku podle nároku 15 savci, který potřebuje takovou léčbu.
22. 22. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že je vyrobený kombinováním sloučeniny podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelného nosiče.
23. 23. Způsob výroby farmaceutického prostředku vyznačující se tím, že obsahuje kombinováním sloučeniny podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelného nosiče.