HK1237800B - 可用於被动流感免疫的抗体及其组合物、组合和使用方法 - Google Patents

Description

可用于被动流感免疫的抗体及其组合物、组合和使用方法

相关申请的交叉引用

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文件名称	创建日期	大小(字节)
			9079004_1.txt	2015年2月4日	285.473

技术领域

提供了用于治疗和预防流感病毒的抗体、组合物和方法。提供了在HA₀成熟裂解位点附近结合流感血凝素A的共有序列的抗体和抗原结合片段。还提供了用于跨甲型流感和乙型流感病毒株的有效被动免疫的抗体组合物、组合和方法。

背景

流感是死亡和疾病的主要原因，影响上和下呼吸道。存在三种类型的流感病毒，甲型、乙型和丙型流感病毒。人甲型流感和乙型流感病毒引发疾病的季节性流行。丙型流感感染引起轻微的呼吸道疾病，并且被认为不会造成流行病。基于病毒表面上的两种蛋白：血凝素(H)和神经氨酸酶(N)将甲型流感病毒分为亚型。存在17种不同的血凝素亚型和10种不同的神经氨酸酶亚型。甲型流感病毒可被进一步细分为不同的株。通常在人中发现的甲型流感病毒的目前亚型是甲型流感(H1N1)病毒和甲型流感(H3N2)病毒。乙型流感病毒不被分为亚型，而是被分为两个不同的谱系：B/Victoria/2/87样和B/Yamagata/16/88-样。甲型流感病毒(例如H1N1)、甲型流感病毒(例如H3N2)和乙型流感病毒都被包含在每年的流感疫苗中。

目前五种类型的临床上相关的流感病毒(三种甲型流感以及还有两种乙型流感)以变化的频率在人群中流行，甲型流感病毒被分成两个不同的系统发育组1和组2。组1包括血凝素亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H13和H16。组2包括H3、H4、H7、H10、H15和H14。组1的目前相关的流行甲型流感病毒是H1亚型，其被进一步分成人和猪来源的亚型，组2相关流行病毒目前是H3亚型。甲型流感病毒负责大部分季节性疾病，H3病毒主导美国过去12流感季节中的8个流感季节(CDC季节性流感；美国监测数据)。在1968年，H3病毒引发20世纪的3次大流感流行之一，并且自那时起H3病毒一直保持为人疾病的重要物质。除了人以外，H3流感病毒通常还感染鸟类、猪和马。乙型流感病毒已在人中循环100多年，目前的株被分为两个谱系Yamagata谱系和Victoria谱系。最近三价流感疫苗已被扩展至覆盖乙型流感的两个谱系以及H1病毒和H3病毒的四价含抗原疫苗。

目前流感的预防和治疗是不充分的，并且可以是无效的。尽管普遍接种疫苗，但对流感的易患性仍然存在。促成易感性的因素包括：(1)不完全的疫苗接种覆盖，诸如对于2009年的H1N1流感大流行，当时疫苗短缺非常普遍，(2)当疫苗制剂不能很好地代表流行的株的年份，诸如2008年，(3)老年人中降低的接种疫苗的功效，如65岁时平均功效在40-50％的范围内，70岁以后仅为15-30％，和(4)在季节性疫苗中未被代表的大流行株的出现，H5N1病毒受到特别关注。此外，针对目前可用于治疗流感的抗病毒疗法的耐药性已经成为严重的问题。对金刚烷(金刚烷胺和金刚乙胺)(作用于M2蛋白并抑制病毒整合的药物)的抗性，从2004年中的1.9％增加至2004-2005年流感季节的头6个月间的14.5％，目前已超过90％(Sheu,T.G.等(2011)J Infect Dis 203:13-17)。对磷酸奥司他韦(抑制流感神经氨酸酶蛋白的抗病毒药物)的抗性，从2006-2007流感季节期间的1-2％的H1N1病毒急剧增加至2007-2008年的12％，并且在2009年超过99％的季节性H1N1病毒。幸运的是，2009年的大流行H1N1株对Tamiflu敏感，其可能导致较少死亡。因此，存在对新的流感预防/治疗方法的压倒性需要。

不幸的是，确定流感病毒株的诊断通常需要12-24小时的出报告时间，如果需要确定株来选择适当的疗法，这导致不利的治疗延迟。因此，仍然需要结合多个进化枝并显示增强的对其的亲和力的抗体。特别地，包含有效地针对甲型流感和乙型流感的抗体并且具有与多个株的广泛反应性的被动疫苗是期望的，以避免对在施用抗体或抗体混合物之前详尽地表征感染性病毒的需要。有效地针对甲型和乙型流感的所有株的广泛反应性抗体和组合物是期望的，特别地因为在先株诊断在治疗之前不是必需的。高效力是进一步期望的，以有助于试剂的生产和施用。

概述

在一些实施方案中，提供了具有与主要乙型流感谱系-Yamagata和Victoria进化枝的反应性的重组人抗体或其抗原结合片段。

在一些实施方案中，提供了以高亲和力结合代表乙型流感的三聚体的单克隆抗体。

在一些实施方案中，提供了抗体，所述抗体，在发生例如由先前未鉴定的乙型流感病毒株或季节性疫苗(所述季节性疫苗未包括约每2-3年一次的循环中的实际株)未赋予针对其的保护的株引起的感染的情况下，能够赋予被动免疫的抗体：Monto,A.A.，等，Vaccine(2009)27:5043–5053。

在一些实施方案中，还提供了结合许多株(表明靶向必需部位)，因而可能结合甚至先前未遭遇的株的抗体。此类抗体也用于改善或预防受试者的感染或减轻其在受试者中的毒性，对于所述受试者接种疫苗不能产生完全保护性反应或所述受试者因潜在受损的支气管功能而处于高风险中，如在慢性阻塞性肺疾病患者或弱免疫系统患者(例如，非常年幼的患者、老年患者、移植患者以及癌症-或HIV-化学疗法-治疗的患者)中。

在一些实施方案中，提供了包含赋予广泛的被动免疫的mAb的混合物的组合物。

在一些实施方案中，提供了包含如下部分的组合物：(1)一种或多种结合部分、单克隆抗体或其免疫反应性片段，其具有与两个主要乙型流感谱系的反应性，和(2)一种或多种结合部分、单克隆抗体或其免疫反应性片段，其具有与组1(包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H13、H16)和/或组2(包括H3和H7作为模式样本)的甲型流感病毒的反应性，包括显示组交叉反应性的那些结合部分、单克隆抗体或其免疫反应性片段。在一些实施方案中，本文中提供的抗体特异性结合HA₀蛋白中包含的表位，并且识别HA的天然三聚体形式，以及蛋白水解活化的形式。

在另一个实施方案中，提供了选自能够扩大可被特异性结合的病毒类型和进化枝的范围的双特异性和多特异性抗体及其片段的结合部分，以及含有与具有甲型流感和乙型流感的特征的多个株反应的两个或更多个部分的组合物。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其表现出与乙型流感Yamagata和乙型流感Victoria进化枝的每一种的一个或多个株的10nM或更紧密或3nM或更紧密的结合亲和力(KD)。在一些实施方案中，所述抗体或片段是重组抗体或其片段。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是工程化单特异性抗体或多特异性人单克隆抗体。

在一些实施方案中，提供了中和乙型流感Yamagata和乙型流感Victoria进化枝的一个或多个株对细胞的感染的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含(a)重链互补决定区1(HCDR1)、(b)重链互补决定区2(HCDR2)和(c)重链互补决定区3(HCDR3)的氨基酸序列，HCDR1/HCDR2/HCDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含(a)轻链互补决定区1(LCDR1)、(b)轻链互补决定区2(LCDR2)和(c)轻链互补决定区3(LCDR3)，LCDR1/LCDR2/LCDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:34/35/36；44/45/46；54/55/56；64/65/66；74/75/76；84/85/86；104/105/106；114/115/16；124/125/126；134/135/136；144/145/146；154/155/156；164/165/166；174/175/176；184/185/186；194/195/196；204/205/206；214/215/216；224/225/226；234/235/236；244/245/246；254/255/256；264/265/266；274/275/276和284/285/286，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的重链和轻链CDR序列HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3：SEQ ID NO:31/32/33/34/35/36；41/42/43/44/45/46；51/52/53/54/55/56；61/62/63/64/65/66；71/72/73/74/75/76；81/82/83/84/85/86；91/92/93/94/95/96；101/102/103/104/105/106；111/112/113/114/115/116；121/122/123/124/125/126；131/132/133/134/135/136；141/142/143/144/145/146；151/152/153/154/155/156；161/162/163/164/165/166；171/172/173/174/175/176；181/182/183/184/185/186；191/192/193/194/195/196；201/202/203/204/205/206；211/212/213/214/215/216；221/222/223/224/225/226；231/232/233/234/235/236；241/242/243/244/245/246；251/252/253/254/255/256；261/262/263/264/265/266；271/272/273/274/275/276；和281/282/283/284/285/286；或在一个或多个CDR结构域序列中具有1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供子分离的人抗体或其抗原结合片段，其特异性结合乙型流感Yamagata和乙型流感Victoria进化枝的每一种的一个或多个株，并且包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)：SEQ ID NO:39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279和289，或与所述HCVR具有至少80％序列同一性的其同源变体；所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含含有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变序列(LCVR)：SEQ ID NO:40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280和290，或与所述LCVR具有至少80％序列同一性的其同源变体，所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR序列对：39/40、49/50、59/60、69/70、79/80、89/90、99/100、109/110、119/120、129/130、139/140、149/150、159/160、169/170、179/180、189/190、199/200、209/210、219/220、229/230、239/240、249/250、259/260、269/270、279/280和289/290，或与所述HCVR和/或LCVR具有至少80％序列同一性的其同源变体；所述变体和所述抗体具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR对：SEQ ID NO:79/80、129/130、219/220、229/230、239/240、249/250和269/270，或与所述HCVR和/或LCVR具有至少80％序列同一性的其同源变体；所述变体和所述抗体具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其结合选自由SEQID NO:307、308、309、310、311、312和313组成的组的一个或多个表位，或其不连续表位。

在一些实施方案中，提供了分离的人抗体或其抗原结合片段，其与如本公开的抗体或片段竞争对乙型流感Yamagata和乙型流感Victoria进化枝的每一种的一个或多个株的结合，当以低于100倍过量存在时，置换至少50％的后者。

在一些实施方案中，提供了编码本公开的抗体或片段的分离的密码子优化的核酸分子。在一些实施方案中，提供了包含编码本公开的抗体或片段的核酸分子的表达载体。

在一些实施方案中，提供了包含含有编码本公开抗体或片段的核酸分子的表达载体的用于表达重组多肽的宿主细胞。

在一些实施方案中，提供了产生抗乙型流感抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许抗体或其片段产生的条件下生长宿主细胞，和回收所产生的抗体或其片段。

在一些实施方案中，提供了包含抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物，所述抗体或抗原结合片段表现出对乙型流感Yamagata和乙型流感Victoria进化枝的每一种的一个或多个株的10nM或更紧密的或3nM或更紧密的结合亲和力(KD)。

在一些实施方案中，提供了包含抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物，所述抗体或抗原结合片段包含选自以下序列的HCDR1/HCDR2/HCDR3的氨基酸序列：SEQ ID NO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质，其中所述抗体或片段表现出如在PBS中测量的大于或等于55℃的第一解链温度(Tm1)。

在一些实施方案中，提供了包含一种或多种具有对甲型流感的至少一个株的结合特异性的人抗体或抗原结合片段的组合物。在一些方面，具有对甲型流感的特异性的抗体或抗原结合片段包括对对组1和组2的一个或多个株的特异性。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，所述药物组合物包含(a)第一抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)；和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:14、15、16的LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体能够结合和/或抑制流感病毒；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:21、22、23的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:24、25、26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体能够结合和/或抑制流感病毒；和(c)第三抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有轻链CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3分别选自:

(i)SEQ ID NO:71、72、73，和SEQ ID NO:74、75、76；

(ii)SEQ ID NO:91、92、93，和SEQ ID NO:94、95、96；

(iii)SEQ ID NO:101、102、103，和SEQ ID NO:104、105、106；

(iv)SEQ ID NO:121、122、123，和SEQ ID NO:124、125、126；

(v)SEQ ID NO:181、182、183，和SEQ ID NO:184、185、186；

(vi)SEQ ID NO:191、192、193，和SEQ ID NO:194、195、196；

(vii)SEQ ID NO:201、202、203，和SEQ ID NO:204、205、206；

(viii)SEQ ID NO:211、212、213，和SEQ ID NO:214、215、216；

(ix)SEQ ID NO:221、222、223，和SEQ ID NO:224、225、226；

(x)SEQ ID NO:231、232、233，和SEQ ID NO:234、235、236；

(xi)SEQ ID NO:241、242、243，和SEQ ID NO:244、245、246；

(xii)SEQ ID NO:261；262、263，和SEQ ID NO:264、265、266；或

(xiii)SEQ ID NO:271、272、273，和SEQ ID NO:274、275、276，

或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段能够结合和/或抑制流感病毒。

在一些实施方案中，所述第一抗体或片段包含SEQ ID NO:19/20的HCVR/LCVR对，或在HCVR或LCVR结构域序列中的一个或两个中包含至少80％序列同一性的其高度同源变体；所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，所述第二抗体或片段包含SEQ ID NO:29/30的HCVR/LCVR对，或在HCVR或LCVR结构域序列中的一个或两个中包含至少80％序列同一性的其高度同源变体；所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，所述第三抗体或片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR对：SEQ ID NO:79/80、99/100、109/110、129/130、189/190、199/200、209/210、219/220、229/230、239/240、249/250、269/270和279/280，或在HCVR或LCVR结构域序列中的一个或两个中包含至少80％序列同一性的其高度同源变体；所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，所述第三抗体或片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR对：SEQ ID NO:79/80、129/130、219/220、229/230、239/240、249/250和269/270，或在HCVR或LCVR结构域序列中的一个或两个中包含至少80％序列同一性的其高度同源变体，并且所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。在一些实施方案中，提供了包含所述第一、第二和第三抗体或片段的组合物，所述抗体或片段表现出均在2pI点范围内的等电点(pI)。

在具体实施方案中，提供了包含第一抗体、第二抗体和第三抗体的组合物，所述第一抗体为含有SEQ ID NO:17/18的HC/LC氨基酸序列的TRL053/Mab53、所述第一抗体为包含SEQ ID NO:27/28的HC/LC氨基酸序列的抗体TRL579/Mab579，所述第三抗体选自由以下组成的组：分别包含选自由227/228、207/208、247/248、237/238、217/218、267/268、77/78和127/128组成的组的HC/LC氨基酸序列的TRL847、TRL845、TRL849、TRL848、TRL846、TRL854、TRL809和TRL832，或在HC或LC结构域序列中的一个或两个中包含至少80％序列同一性的其高度同源变体；所述变体和所述抗体或片段具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在具体实施方案中，提供了包含本公开的所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种的组合物，以对于治疗或预防有此需要的受试者的甲型流感和乙型流感感染或疾病是有效的量将所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种配制在单个剂量中。

在具体实施方案中，提供了以每剂量100mg/kg或更少的所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种的量；以每剂量10mg/kg或更少的所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种的量；或以每剂量1mg/kg或或更少的所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种的量包含本公开的第一、第二和第三抗体或片段的组合物。在一些实施方案中，所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种各自以每剂量10mg/kg或更少的总的抗体或抗体片段的量存在于组合物中。

在具体实施方案中，提供了用于经鼻或肺部递送的包含载体、稀释剂和/或赋形剂的组合物。

在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物包含本公开的抗体或片段并且还包含抗病毒治疗剂、病毒复制抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、血凝素抑制剂、支气管扩张药或吸入皮质类固醇的一种或多种。在一些实施方案中，所述可免疫调节剂是干扰素β1a；所述抗病毒治疗剂是选自由奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉尼米韦组成的组的神经氨酸酶抑制剂；所述抗病毒治疗剂是选自由法维拉韦(T-705)和VX 787组成的组的RNA聚合酶抑制剂；所述抗病毒治疗剂是选自由流感酶(Das181)和AB-103(p2TA)组成的组的宿主细胞靶向治疗剂；所述抗病毒治疗剂是选自由金刚乙胺和金刚烷胺组成的组的离子通道抑制剂；以及所述支气管扩张药选自沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇或法美特罗。

在一些实施方案中，提供了组合物，所述组合物以对于治疗或预防有此需要的受试者的甲型流感和乙型流感感染或疾病是有效的量包含本公开的所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段的一种或多种是选自Fab、Fab’和F(ab’)₂、scFv、dAb或多特异性抗体的抗体片段，包含选自由以下组成的组的HCDR1/HCDR2/HCDR3氨基酸序列：11/12/13、21/22/23、71/72/73、74/75/76、91/92/93、101/102/103、121/122/123、181/182/183、191/192/193、201/202/203、211/212/213、221/222/223、231/232/233、241/242/243、261/262/263和271/272/273，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体具有结合和/或抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了用于治疗或预防受试者的流感感染的方法，所述方法包括向受试者施用(a)第一抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:14、15、16的LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段能够结合和/或抑制流感病毒；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:21、22、23的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)的，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:24、25、26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段能够结合和/或抑制流感病毒；和(c)第三抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有轻链CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3分别选自由以下组成的组：(i)SEQ ID NO:71、72、73，和SEQ ID NO:74、75、76；(ii)SEQ ID NO:91、92、93，和SEQ IDNO:94、95、96；(iii)SEQ ID NO:101、102、103，和SEQ ID NO:104、105、106；(iv)SEQ ID NO:121、122、123，和SEQ ID NO:124、125、126；(v)SEQ ID NO:181、182、183，和SEQ ID NO:184、185、186；(vi)SEQ ID NO:191、192、193，和SEQ ID NO:194、195、196；(vii)SEQ ID NO:201、202、203，和SEQ ID NO:204、205、206；(viii)SEQ ID NO:211、212、213，和SEQ ID NO:214、215、216；(ix)SEQ ID NO:221、222、223，和SEQ ID NO:224、225、226；(x)SEQ ID NO:231、232、233，和SEQ ID NO:234、235、236；(xi)SEQ ID NO:241、242、243，和SEQ ID NO:244、245、246；(xii)SEQ ID NO:261；262、263，和SEQ ID NO:264、265、266或(xiii)SEQ ID NO:271、272、273，和SEQ ID NO:274、275、276，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体或片段能够结合并抑制流感病毒。在一些实施方案中，同时或依序施用所述第一、第二和第三抗体或片段的每一种。

在一些实施方案中，向受试者施用本公开的抗流感组合物，其中确定所述受试者的流感感染状态而无需详尽的病毒株确定。

在一些实施方案中，向受试者施用本公开的抗流感组合物，其中保护受试者免受流感感染或疾病。

如在本领域中是相当清楚的，基于非免疫球蛋白的蛋白可具有与抗体相似的表位识别性质，并且也可提供合适的实施方案，包括基于纤连蛋白、转铁蛋白和脂质运载蛋白的结合剂。基于核酸的部分，诸如适体也具有这些结合性质。

在其它实施方案中，本发明涉及包含本发明的结合部分的药物组合物和制剂，具体地涉及其中结合部分以促进从血至肺内分配的方式与红细胞共价或非共价地缔合的那些组合物和制剂，涉及使用本发明的结合部分被动抑制受试者的病毒感染(在正常群体中或在可能已暴露于病毒的受试者中作为预防剂，或在已被感染的受试者中作为治疗剂)的方法。本发明还涉及产生抗体或片段的重组材料和方法，包括这些重组材料和方法用于在受试者中原位产生抗体或片段的用途。

在一些实施方案中，提供了结合流感病毒并有效地针对流感病毒的结合分子(特别是人单克隆抗体或其片段)的组合，其中所述组合有效地针对组1甲型流感病毒、组2甲型流感病毒和乙型流感病毒。抗体的组合在治疗或预防甲型和乙型流感病毒中是有效的，从而在单个组合物或剂量中提供了针对所有相关和循环流感病毒的有效试剂。

在一些实施方案中，提供了包含单克隆抗体的组合物，每一种单克隆抗体以低的nM或亚-nM亲和力结合流感病毒。提供了组合组合物，其包含特别地针对组1甲型流感病毒的抗体或抗体片段、特别地针对组2甲型流感病毒的抗体或结合片段和特别地针对乙型流感病毒(包括Yamagata和Victoria B谱系)的抗体或结合片段。

在一些实施方案中，提供了抗体的组合，其包含针对组1甲型流感，在更具体的实施方案中特别地至少H1流感病毒的第一抗体，针对组2甲型流感，在更具体的实施方案中特别地针对至少H3流感病毒的第二抗体，以及针对乙型流感病毒，在更具体的实施方案中特别地针对Yamagata和Victoria谱系的第三抗体。

在一些实施方案中，提供了组合物，其包含流感单克隆抗体或其片段的组合或由所述组合组成，所述组合物在用于甲型流感和乙型流感的治疗或预防的组合中是有效的。

在一个实施方案中，本发明包含含有选自由以下组成的组的重链可变区(HCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段：SEQ ID NO:39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279和289，或具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其同源序列。在另一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO:79、99、109、129、189、199、209、219、229、239、249、269和279组成的组的氨基酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:209、229、239、249或269的HCVR。

在一个实施方案中，本发明包含含有选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)抗体或抗体的抗原结合片段：SEQ ID NO:40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280和290，或具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上同源的序列。在另一个实施方案中，抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自由SEQ ID NO:80、100、110、130、190、200、210、220、230、240、250、270或280组成的组的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:210、230、240、250或270的LCVR。

在一个实施方案中，本发明包含组合物，所述组合物包含含有选自由以下的一个或多个组成的组的重链可变区(HCVR)的抗体或抗原结合片段：SEQ ID NO:39、49、59、69、79、89、99、109、119、129、139、149、159、169、179、189、199、209、219、229、239、249、259、269、279和289、或具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其同源序列。在另一个实施方案中，所述组合物包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自由SEQ ID NO:79、99、109、129、189、199、209、219、229、239、249、269和279组成的组的氨基酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，所述组合物包含抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:209、229、239、249或269的HCVR。

在一个实施方案中，本发明包含组合物，所述组合物包含含有选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段：SEQ ID NO:40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280和290，或具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其同源序列。在另一个实施方案中，所述组合物包含抗体或抗体的抗原结合部分，所述抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自由SEQ ID NO:80、100、110、130、190、200、210、220、230、240、250、270或280组成的组的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，所述组合物包含抗体或其片段，所述抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:210、230、240、250或270的LCVR。

在一个实施方案中，本发明包含组合物，所述组合物包含如本文中提供的B抗体(抗B型)或片段和包含选自由SEQ ID NO:19和29的一个或多个组成的组的重链可变区(HCVR)或具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其同源序列的抗体或抗原结合片段。

在一个实施方案中，本发明包含组合物，所述组合物包含如本文中提供的B抗体或片段和包含选自由SEQ ID NO:20和30组成的组的轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段或具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其同源序列。

在更具体的实施方案中，组合物包含至少一种B抗体和至少一种或至少两种A抗体。

在一些实施方案中，提供了包含HC和LC可变区氨基酸序列的抗体或抗原结合片段，其中所述HCVR包含选自如下序列的任一个的HCDR1/HCDR2/HCDR3氨基酸序列：SEQ IDNO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，并且所述LCVR包含选自如下序列的任一个的LCDR1/LCDR2/LCDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:34/35/36；44/45/46；54/55/56；64/65/66；74/75/76；84/85/86；104/105/106；114/115/16；124/125/126；134/135/136；144/145/146；154/155/156；164/165/166；174/175/176；184/185/186；194/195/196；204/205/206；214/215/216；224/225/226；234/235/236；244/245/246；254/255/256；264/265/266；274/275/276和284/285/286，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体。

在一些实施方案中，提供了包含Fc修饰以延长血清半衰期的抗体或抗原结合片段。此类修饰公开于Xencor Xtend^TM抗体工程技术(Xencor,Melbourne,AU)中。在一些方面，包含Fc修饰的抗体或片段显示与SEQ ID NO:297、17、2737、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277或287具有大于80％、大于90％、大于95％或大于99％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，不受理论束缚，因为在吸入制剂中应用模式Fab，所以提供了为scFv的抗原结合片段。此类工程化抗体不存在于自然界中。在一些实施方案中，提供了包含选自如下序列的任一个的HCDR1/HCDR2/HCDR3氨基酸序列的工程化抗体或结合片段：SEQID NO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体。

在一些实施方案中，提供了用于表达本文提供的抗体和片段的密码子优化的核酸。在一些实施方案中，此类非天然存在的核酸被用于产生较高表达水平。在一些实施方案中，将密码子优化的核酸用于产生本文提供的重组抗体或片段。

在一些实施方案中，提供了包含HC和LC可变区氨基酸序列的抗体或抗原结合片段，其中所述HCVR包含选自以下序列的任一序列的HCDR1/HCDR2/HCDR3氨基酸序列：SEQ IDNO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，并且所述LCVR包含选自以下序列的任一个的LCDR1/LCDR2/LCDR3氨基酸序列：SEQ ID NO:34/35/36；44/45/46；54/55/56；64/65/66；74/75/76；84/85/86；104/105/106；114/115/16；124/125/126；134/135/136；144/145/146；154/155/156；164/165/166；174/175/176；184/185/186；194/195/196；204/205/206；214/215/216；224/225/226；234/235/236；244/245/246；254/255/256；264/265/266；274/275/276和284/285/286，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体。

在一些实施方案中，提供了包含Fc修饰以延长血清半衰期的抗体或抗原结合片段。此类修饰公开于Xencor Xtend^TM抗体工程技术(Xencor,Melbourne,AU)中。在一些方面，包含Fc修饰的抗体或片段显示出与SEQ ID NO:297、17、27、37、47、57、67、77、87、97、107、117、127、137、147、157、167、177、187、197、207、217、227、237、247、257、267、277或287具有大于80％、大于90％、大于95％或大于99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供了包含选自以下序列的任一个的HCDR1/HCDR2/HCDR3氨基酸序列的工程化抗体或结合片段：SEQID NO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体。

在一些实施方案中，提供了用于表达本文中提供的抗体和片段的密码子优化的核酸。在一些实施方案中，将此类非天然存在的核酸用于产生较高表达水平。在一些实施方案中，将密码子优化的核酸分子用于产生本文中提供的重组抗体和片段。

附图简述

图1显示从Suzuki,Y.等，Mol.Biol.Evol.(2002)19:501–509改进的本领域中已知的甲型和乙型流感病毒至重要进化枝的组的分类。

图2显示来自Dreyfus,C.等，Science(2012)337:1343–1348的两个乙型流感进化枝Yamagata和Victoria内的代表性株。代表性Yamagata进化枝包括Mississippi/04/2008；Florida/4/2006；Jilin/20/2003；Houston/B60/1997；Harbin/7/1994和Nashville/45/1991。代表性Victoria进化枝包括Malaysia/2506/2004；Mississippi/07/2008；Brisbane/60/2008和Ohio/01/2005。

图3显示具有举例说明几种抗乙型流感mAb和两种抗甲型流感mAb与甲型和乙型流感病毒株的反应性的重组HA ELISA数据的表7。以一式三份重复进行重组HA ELISA，并且显示了相对于背景的平均倍数反应性(相对荧光单位)。图3显示了抗B mAb TRL809、TRL812、TRL813；TRL832、TRL841、TRL842、TRL845、TRL846、TRL847、TRL848、TRL849、TRL854和TRL856的每一种具有针对乙型流感病毒的两个谱系(包括Yamagata进化枝的B/Florida/06、B/Mass/12和B/Wisconsin/10和Victoria进化枝的B/Brisbane/08、B/Malaysia/04和B/Victoria/87)的广泛交叉反应性。抗甲型流感mAb CF401(mAb 53)和CF402(mAb 579)具有与甲型流感H1(A/California/09)和H3(A/Sydney/97)亚型的成员但非与乙型流感病毒株的反应性。

图4显示具有针对代表性株B/Yamagata/16/1988和B/Victoria/2/1987的抗乙型流感抗体TRL845、TRL848、TRL849、TRL854、TRL832和TRL809的中和IC50数据的表8。

图5A显示在于用10xLD50的B/Florida(Yamagata谱系)感染的小鼠中鼻内(IN)对比腹膜内(IP)施用5A7后，表示为百分比体重的抗乙型流感抗体5A7在小鼠中的体内活性。通过IN或IP途径用mAb在感染后24小时(24hpi)处理小鼠，每日记录体重作为疾病严重度的指征，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，并将相对于初始第0天的体重的百分比体重用于绘制曲线。对体重减轻>30％的小鼠施以无痛致死。1mg/kg IN提供免于体重减轻的完全保护，然而通过IP途径的1mg/kg具有一定的体重减轻。显示了IN施用途径相对于IP施用途径的增强的功效。

图5B显示在5A7的IN对比IP施用后，表示为百分比体重的抗乙型流感抗体5A7在用10xLD50的B/Malaysia(Victoria谱系)感染的小鼠中的体内活性。通过IN或IP途径在24hpi用mAb处理小鼠，每日测量体重作为疾病严重度的指示。对体重减轻>30％的小鼠施以无痛致死。1mg/kg IN提供免于体重减轻的完全保护，然而通过IP途径的1mg/kg具有一定的体重减轻。显示了IN施用途径相对于IP施用途径的增强的功效。

图6A-D显示在通过IN途径施用1mg/kg后，在鼠模型中感染后1天本发明的抗乙型流感mAb针对10xLD50(引起50％致死率的剂量)病毒的体内活性，评估小鼠体重直至感染后14天，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，并将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。

图6A显示通过IN途径施用的1mg/kg的mAb TRL845、TRL847、TRL 848、TRL849和5A7在用代表Victoria进化枝的B/Malaysia/2506/04感染小鼠中提供了免患疾病的保护。

图6B显示通过IN途径施用的1mg/kg的mAb TRL845、TRL847、TRL 848、TRL849和5A7在用代表Yamagata进化枝的B/Florida/04/2006感染的小鼠中提供了免患疾病的保护。

图6C显示通过IN途径施用的1mg/kg的mAb TRL849、TRL846、TRL854、TRL 856、TRL847和5A7在用代表Victoria进化枝的B/Malaysia/2506/04感染的小鼠中提供免患疾病的保护。

图6D显示通过IN途径施用的1mg/kg的TRL849、TRL846、TRL854、TRL 856、TRL847和5A7在用代表Yamagata进化枝的B/Florida/04/2006感染的小鼠中提供免患疾病的保护。

图7A-7D显示3种抗流感mAb的共施用不干扰抗B mAb效率。用10xLD50病毒感染小鼠，并在24hpi用3mg/kg由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理小鼠，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，并将点初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。

图7A-7D一起显示了所述混合物将提供预期水平的保护而不干扰混合物中的其它mab针对来自所有季节性流感亚型(H1N1、H3N2以及B的两个谱系)的代表性株。

图7A显示用10xLD50H1N1感染的并在24hpi用3mg/kg由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7B显示用10xLD50H3N2感染的并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7C显示用10xLD50B/Yamagata谱系感染的并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7D显示用10xLD50B/Victoria谱系感染的并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图8显示由PEPSCAN Inc.制造的B/Lee/1940/HA蛋白(SEQ ID NO:291)的CLIPS^TM肽阵列(上图)。B/Lee/1940/HA蛋白的阴影区域对应于用于从aa_15-65(SEQ ID NO:292)、aa_300-359(SEQ ID NO:293)和aa_362-481(SEQ ID NO:294)产生肽阵列的残基。表9(下图)显示mAb 5A7表位1-aa_333-338(SEQ ID NO:304)、表位2-aa_342-346(SEQ ID NO:305)和表位3-aa_457-463(SEQ ID NO:306)；mAb TRL845表位-aa_455-463(SEQ ID NO:307)；TRL848表位1-aa_64-71(SEQ ID NO:308)；表位2-aa_336-348(SEQ ID NO:309)；表位3-aa_424-428(SEQ ID NO:310)；mAb 849表位1-aa_317-323(SEQ ID NO:311)、表位2-aa_344-349312)、表位3-aa_378-383(SEQ ID NO:313)；mAb 854表位1-aa_457-463(SEQ ID NO:314)。右下方的附图显示以深灰色显示的解析至HA的茎上的区域。

图9举例说明通过PEPSCAN^TM分析沿着HA蛋白的茎定位的表位。阴影区域描绘了每一种mAb所结合的表位。mAb TRL848、TRL845、TRL854和TRL849识别沿着HA的茎部分重叠的不表位。来源于公布的序列的对照mAb 5A7产生的类似但唯一的表位。

图10A-10F显示mAb TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的解链曲线测定。每一种mAb表现出高的热稳定性。

图10A显示TRL845的解链曲线，其分别显示在58.3℃和68.7℃的两个解链温度(Tm1,Tm2)。

图10B显示具有mAb TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的解链温度(Tm)的表10，如分别在图10A和10C-10F中显示的。

图10C显示TRL847的解链曲线，其显示70.3℃的解链温度(Tm1)。

图10D显示TRL848的解链曲线，其显示70.1℃的解链温度(Tm1)。

图10E显示TRL849的解链曲线，其显示分别在70℃和81.8℃的2个解链温度(Tm1,Tm2)。

图10F显示TRL854的解链曲线，其显示分别在59.7℃和68.9℃的2个解链温度(Tm1,Tm2)。

图11A显示以可比较的剂量进行的IN和IP施用，以及显示MabIN的效力为通过IP施用的同一Mab的效力的10至100倍。用10XLD50和H1流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)接种动物，并在24hpi通过IN或IP，用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和CA6261Mab处理所述动物，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。数据显示中和抗体的IN递送相较于全身性递送显著增强它们的治疗功效。

图11B显示抗体MAb53(TRL053)的IN和IP施用在针对H1病毒的治疗功效上的评价。用10XLD50的H1甲型流感病毒/Puerto Rico/8/1934(PR8)接种动物，并在24hpi利用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和抗体TRL053(MAb53)(通过IN或IP施用的)处理动物，以PBS处理和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，并将点初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。IN施用的TRL053显示比IP给药更大的功效。TRL053仅在10mg/kg的IP剂量上在一定程度上有效。IN剂量在10mg/kg和1mg/kg上有效。

图12A显示在IN与IP可比较的剂量上的比较，以及显示Mab CA8020IN的效力为通过IP施用的同一Mab的效力的10至100倍。用10XLD50的H3流感病毒接种动物，并在IN或IP24hpi通过IN或IP用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和CA8020Mab处理动物，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。

图12B显示抗体MAb579(TRL579)的IN和IP施用在针对H3病毒的治疗功效上的评价。用10XLD50的Vic/11H3病毒接种动物，并在24hpi利用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和抗体TRL579(通过IN或IP施用的)处理动物。每日监测动物的体重，持续感染后14天。TRL579对于IP或IN是有效的，然而IN施用的TRL579显示比IP给药更大的功效。TRL579仅在10mg/kg的IP剂量上在一定程度上有效。在本研究中IN剂量在10mg/kg和1mg/kg上是有效的。

图13显示在用病毒感染之前3或4天进行的预防性IN和IP施用。在用3XLD50的H1流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(表示为PR8)攻击之前3或4天，通过IN或IP施用抗体CA6261。在感染之前3天(-3dpi)或在感染之前4天(-4dpi)，通过IN(0.1mg/kg)或IP(0.1mg/kg和1mg/kg)施用CA6261抗体，并用H1流感病毒进行攻击。对照是无病毒和无处理。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。图13显示在感染之前长达4天(-4dpi)的IN施用(在0.1mg/kg上评估的)保护小鼠免受病毒攻击。以相同剂量(0.1mg/kg)在感染之前3或4天进行的IP施用完全无效。感染前3或4天的IP施用在1mg/kg上是有效的。通过在-3dpi和-4dpi比较IN(0.1mg/kg)与IP(1mg/kg)施用，在两个情况下，低为1/10的IN剂量比IP有效。

图14显示在用病毒感染前5、6或7天进行的预防性IN和IP施用。在用3XLD50的H1流感病毒PR8攻击前5、6或7天通过IP(以1mg/kg)或IN(以1mg/kg)施用抗体CA6261。对照为Tamiflu(口服给予的10mg/kg，每日2次，持续5天)、无处理和无病毒。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。在所有情况下，抗体比Tamiflu更有效。

图15显示在用病毒感染(以10XLD50的较高剂量进行病毒攻击)前5、6或7天进行的预防性IN和IP施用。在用10XLD50的H1流感病毒PR8攻击之前5、6或7天，通过IP(以1mg/kg)或IN(以1mg/kg)施用抗体CA6261。对照为Tamiflu(口服给予的10mg/kg，每日2次，持续5天)、无处理和无病毒。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。在本研究中，只有向气道施用(通过鼻内施用)抗体的动物才在病毒攻击时完全存活下来。通过在病毒攻击之前5、6或7天施用1mg/kg的抗体处理的小鼠未获得完全保护，并且小鼠死于感染。Tamiflu在保护上完全无效。在病毒感染之前5或6天通过鼻内施用0.1mg/kg抗体处理的小鼠在病毒攻击时存活下来，几乎与未被感染的对照动物一样好。

图16显示具有单克隆抗乙型流感抗体在血凝抑制、B/Victoria和B/Yamagata谱系体外中和、预测的结合部位(头、茎)和体内功效中的评估的表11。体内结果被提供为在每一种情况下，评价用10xLD50的病毒接种并在24hpi被施用1mg/kg的指定的TRL抗体的动物的相对于初始体重的百分比的3个不同研究的概括。观测动物体重，持续14天，标明观测到的最低体重。显示了抗体TRL 809、TRL832、TRL846、TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的每一个的结果，所述抗体对于在整个体内功效评价中维持至少95％的初始动物体重是有效的。TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的每一种对于在整个体内功效评价中维持至少96％的初始动物体重是有效的。虽然TRL846在常规体外测定中未表现出中和，但其确实表现出外出抑制，从而被认为具有中和作用。

图17显示具有B抗体的等电点以及B/Florida(Yamagata谱系)和B/Malaysia(Victoria谱系)流感病毒株的亲和对力(以nM表示的K_D)的表征的表12。评价B抗体对于流感病毒的亲和力以用作相关功效的指标方面。TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的每一种对于B/Malaysia的亲和力在每一种情况下(数据未显示)是亚-nM(<1.0nM)的。

图18显示利用B/Florida(Yamagata谱系)病毒，针对在24hpi施用的各种乙型流感抗体进行的动物功效研究。对于10XLD50病毒在24hpi以1mg/kg通过IN施用所有抗体。所测试的抗体为TRL845、TRL847、TRL848、TRL849、5A7和CA8033。PBS和无病毒为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。IN施用的抗乙型流感抗体显示针对利用10XLD50剂量的Yamagata谱系病毒的感染的功效，几种抗体显示抗体处理的被感染的动物保持100％的体重。

图19显示利用B/Florida(Yamagata谱系)病毒，针对在24hpi施用的各种乙型流感抗体进行的动物功效研究。对于10XLD50的病毒，在24hpi以1mg/kg通过IN施用所有抗体。所测试的抗体为TRL849、TRL846、TRL854、TRL856、TRL847、5A7、TRL809和TRL848。PBS和无病毒为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。IN施用的抗乙型流感抗体显示针对利用10XLD50剂量的Yamagata谱系病毒的感染的功效，几种抗体显示抗体处理的被感染的动物保持100％的体重。

图20显示利用B/Malaysia(Victoria谱系)病毒，针对在24hpi施用的各种乙型流感抗体进行的动物功效研究。对于10XLD50的病毒，在24hpi以1mg/kg通过IN施用所有抗体。所测试的抗体为TRL845、TRL847、TRL848、TRL849、5A7和CA8033。PBS和无病毒为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。IN施用的抗乙型流感抗体显示针对利用10XLD50剂量的Y Victoria谱系病毒的感染的功效，几种抗体显示抗体处理的被感染的动物保持100％的体重。

图21显示利用B/Malaysia(Victoria谱系)病毒，针对在24hpi施用的各种乙型流感抗体进行的动物功效研究。对于10XLD50的病毒，在24hpi以1mg/kg通过IN施用所有抗体。所测试的抗体为TRL849、TRL846、TRL854、TRL856、TRL847、5A7、TRL809和TRL848。PBS和无病毒为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。IN施用的抗乙型流感抗体显示针对利用10XLD50剂量的Victoria谱系病毒的感染的功效，几种抗体显示抗体处理的被感染的动物保持100％的体重。

图22A和22B显示在利用(图22A)Victoria谱系病毒B/Malaysia和(图22B)Yamagata谱系病毒B/Florida的动物研究中进行的抗乙型流感抗体的功效评估。用10xLD50的病毒感染小鼠，并在IN 24hpi用1mg/kg剂量的抗体通过IN处理小鼠。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。所测试的抗体为如所指定的TRL809、TRL832、抗体5A7和TRL579。TRL579是抗H3抗体并用作阴性对照。TRL809和TRL832通过阻断病毒结合来中和乙型流感。IN施用的抗乙型流感抗体TRL809、TRL832和5A7表现出针对利用10XLD50剂量的Victoria谱系病毒的感染的功效，从而显示抗体处理的被感染的动物保持～100％的体重。

图23显示使用抗体TRL053、TRL579和5A7的组合的IN施用评价针对甲型流感或乙型流感病毒的抗病毒功效的动物研究。利用H1病毒PR8、H3病毒Victoria/11、乙型流感病毒B/Malaysia或乙型流感病毒B/Florida感染动物，随后不处理动物或用所述3种抗体的混合物处理动物。以1mg/kg的剂量包含每一种抗体，从而提供3mg/kg的总抗体剂量。对于混合物处理的动物，对于10XLD50的如所指定的病毒，在24hpi施用组合抗体。无病毒被描述为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。图23提供了在利用10xLD50的病毒感染后24小时作为单一混合剂量施用的抗体混合物表现出针对利用H1病毒、H3病毒、B/Yamagata谱系病毒和B/Victoria谱系病毒的每一种或任一种的感染的功效。

图24显示其中当在感染后4天通过单次施用1mg/kg的CF-401时，100％的小鼠在来自致死剂量的H1N1攻击时存活下来的动物研究。护理标准Tamiflu的施用不具保护作用，此外CF-401mAb疗法还提供额外的免受体重减轻的保护。在第4-8天每日二次口服施用10mg/kg Tamiflu。数据显示当在晚期时间点施用时，护理标准(Tamiflu)加上mAb疗法是有效的。

图25提供了在针对H1病毒的治疗功效上比较CA6261抗体的模式抗体片段Fab的IN对比IP施用的结果。用10XLD50的H1流感病毒接种动物，并在24hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的通过IN或IP施用的中和CA6261Fab处理动物，将PBS处理和无病毒用作对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。通过IN施用的所有剂量的Fab CA6261抗体显示比任何IP剂量更大的功效。中和Fab IP的施用甚至在最高剂量10mg/kg上未显示可检测的功效。

详述

危胁生命的季节性和大流行性流感的感染仍然是在美国单独杀死40,000人的严重疾病。季节性疫苗的可用性未能消除作为重大临床问题的流感。只存在一种在实践中使用的用于流感的批准的药物然而，流感已表现出发展对和其它神经氨酸酶抑制剂的抗性的强烈倾向。此外，已知如果在症状发作48小时后给予，基本上失去功效。

靶向流感的抗体提供了针对疫苗的另一选择方案，并且可在治疗或预防感染中迅速见效，而疫苗通常需要数周时间来诱导有效的抗病毒活动。特别有吸引力的是与流感病毒表面上的主要蛋白血凝素在被称为血凝素茎的区域中反应的单克隆抗体，所述血凝素在遗传上是稳定的并且在季节间不会显著变化或根本不会变化。

众多抗体已被表征并正被开发为用于流感的治疗性抗体，包括基于病毒的保守表位。一些交叉反应性抗体靶向血凝素(HA)糖蛋白，所述糖蛋白在接种或天然感染过程中诱发最强劲的中和抗体。HA包含在病毒感染中为至关重要的组分的两个亚单位HA1和HA2。MAbCR6261是良好表征的抗体，其被认为结合H1病毒和组1内的其它亚型(H5)，并且在HA2亚单位上结合(Throsby M等(2008)PL0S ONE3:e3942；Eckert DC等(2009)Science 324:246-251；Friesen RHE等(2010)PLoS ONE 5(2):e1906；美国专利8,192,927)。MAb CR8020被认为结合H3和为组2病毒的另一种亚型(H7)病毒上的HA2的近膜区(Eckert DC等(2011)Science 333:843-850)。来自瑞士的研究者的抗体FI6v3被认为具有结合至存在于组1(H1)和2(H3)病毒上的表位的能力，然而FI6在小鼠中已显示有限的功效(Corti D等(2011)Science333:850-856)。Palese及同事已报道了利用不同血凝素在小鼠中进行依序免疫产生的针对H3流感病毒的广泛保护性单克隆抗体(Wang TT等(2010)PLoS Pathog 6(2):e1000796；美国申请20110027270)。通过使用该方法，分离了被认为具有广泛反应性的H1抗体(Tan GS等(2012)J Virol 86(11):6179-6188)。

利用针对HA的单克隆抗体对流感的治疗性治疗是剂量依赖性，并且如果在感染后较晚时间施用也需要较高剂量。具有广泛反应性的HA特异性抗体的IP或IV给予的常见治疗性剂量需要在2mg/kg至50mg/kg的范围内的剂量，以看到免受致死性攻击的保护。在感染后较晚时间，相同的效应需要在高于>10mg/kg的范围内的给药。在北美平均成人为约80.7kg，如果以10mg/kg给予，将需要807mg的抗体。由Crucell Holland BV进行的流感单克隆抗体CR6261和CR8020的两个目前I期研究正在评估从1mg/kg逐步升高至50mg/kg的单个剂量的安全性和耐受性(分别为试验NCT01406418和NCT01756950；clinical trials.gov)。在小鼠中，这些抗体需要15mg/kg来保护小鼠免于死亡(Friesen,RHE等(2010)PLoS ONE 5(2):e1906)；Ekiert DC等(2011)Science 333:843-850)。基于这些IP或IV给药量，基于人体重(约70kg)将需要每患者接近克量或为克量的单一抗体。这因在针对多个流感亚型的任何疗法中需要不止一种抗体来治疗存在于循环中的3个不同亚型的流感(甲型流感H3、甲型流感H1和乙型流感)而加码，从而可能需要总共约3克抗体(假定每种抗体约1克)。该大量的抗体变得成本高昂，难以施用，并在用于流感的治疗性抗体的开发中设置了主要障碍。

我们已鉴定了使抗体的量显著减少超过10倍同时显著地保持，甚至提高功效的解决方案。我们已发现，抗体的鼻内递送或更常见地通过吸入的递送提供了相较于IV或IP途径的功效的显著和明显提高。流感单克隆抗体的有效气道施用在USSN 61/782,661和PCT/US2014/27939(通过引用并入本文)中进行了描述。

引人注目地的是，通过使用可公认的和已知的流感小鼠模型，中和抗体的鼻内(IN)递送相较于腹膜内(IP)或静脉内(IV)递送途径使治疗功效大幅升高至超过10倍。当通过IN途径而霏通过IV或IP途径给予时，可使用少于1/10的相同剂量来实现可比较的功效。用于治疗流感的目前的治疗设计利用静脉内递送作为标准(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT01390025、NCT01756950、NCT01406418)。该递送方法是本领域中的标准，因为利用抗体的中和特征的能力是未知的。绝大部分关于抗体治疗剂的研究利用IV或IP递送，并且未能意识到，针对流感的中和抗体的IN递送相较于IV或IP递送将提高功效。

IN递送的先前报道已评估了多克隆血清γ球蛋白IVIG或IgA种类的抗体(IgA抗体对于肺固有地是共同的)(Akerfeldt S等(1973)Biochem Pharmacol 22:2911-2917；Ramisse F等(1998)Clin Exp Immmunol 111:583-587；Ye J等(2010)Clin VaccineImmunol17(9):1363)。一个研究小组通过IN途径测试了抗体(C179)的腹水制剂，并且描述保护性IN递送(攻击前)可与IP相比较(Sakabe S等(2010)Antiviral Res 88(3):249-255)。C179表现出低的针对2009年大流行H1N1病毒的中和活性，但据报道保护小鼠免受感染。

与此相反，本发明人已发现重要的是，增强的功效并非简单地伴随任何交叉反应性针对流感抗体而无论施用模式如何。一般地，当给定IN时不中和的抗体不表现出抗流感功效。据我们所知，较早期的研究未能认识到，该效应可被更广泛地应用于表现出体外中和活性的抗体而不论它们的病毒表位或蛋白质靶。此外，抗体不必具有针对HA的交叉反应性，因为当通过IN给予时，中和的株特异性抗体将表现增强的功效。我们已发现，中和抗体(而非简单地交叉反应性抗HA抗体)是取决于施用途径，显著减少实现可比较的功效所需的抗体的量所必需的。实际上，我们已经发现，当使用不具中和能力的交叉反应性抗HA抗体时，发生相反的情况。当鼻内治疗小鼠时，这些交叉反应性非中抗HA抗体的治疗性使用导致治疗功效的显著降低；然而，当通过IP或IV途径施用时，这些抗体表现出显着的功效。

不希望受理论束缚，该现象背后的可能机制存在于这样的事实中：即鼻内递送在可利用抗体抗原组合部位的中和能力的气道粘膜中获得一定水平的IgG抗体，然而抗体的IV或IP递送是Fc依赖性的。在气道中，抑制性机制依赖于抗体的中和特征并且Fc依赖性效应受到严重限制。当通过IP或IV给予IgG抗体时，到达气道中该空间的抗体的量太低以至于不能利用抗体的中和效应。例如，当通过IP或IV施用中和抗体时，主要观测到的疗效来自抗体效应子功能。当通过IP或IV而非通过IN给予时，我们已发现可比较的中和或非中和抗体的功效水平。为了进一步说明该效应取依赖于中和，针对M2蛋白的抗体不表现体外中和，并且只能够表现Fc介导的效应。使用针对M2离子通道(比HA更加遗传保守的分子)的抗体的先前工作已在临床前模型中显示前景，并且已完成I期研究(TCN-032来自Theraclone；NCT01390025、NCT01719874；Grandea AG等(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107(28):12658-12663)。针对M2蛋白的抗体不能中和病毒，但可具有通过效应子功能介导的证据充分的治疗功效(Wang,R.等(2008)Antiviral research 80:168-177；Grandea,A.G.，第3版等(2010)Proc Natl Acad Sci USA 107(28):12658-12663)。我们相信当通过IP或IV给予时中和和非中和抗体主要通过与M2靶向抗体类似的效应子功能起作用。所述M2蛋白远不如HA丰富，并且也不从表面突出。针对HA的抗体可中和病毒，从而提供了进行进一步提高功效的潜力。这样，针对HA的抗体通常在治疗上比抗M2抗体更有效。然而，不是中和剂但仍然靶向HA的抗体当通过IP给予时表现出可与中和抗体相比较的功效水平，这表明该递送途径不能利用当通过IN给予时可被利用的强效效应。此外，通过IN但非IP的中和Fab的递送导致治疗功效。通过IN给予的非中和Fab未表现出治疗功效。总之，只有通过IN给出的中和抗体表现出该增强的功效。通过扩展该观察，对于靶向其它流感蛋白(例如，神经氨酸酶)的中和抗体和针对其它呼吸道病原体的中和抗体(用于RSV的帕利珠单抗)，通过肺部递送增强功效的该现象可发生。该增强的功效，或增强的功效的水平可取决于该亚组的呼吸道病原体的顶端复制生命周期，其中在顶端空间中，这些病毒易于遭受这些抗体的中和能力。由于通过IN和IP/IV途径的抗体递送可自身通过不同的方式实现有效性，因此两种途径的组合使用将利用中和抗体的最大治疗潜能。该方法将通过利用增强的中和活性(通过IN途径)和增强的Fc依赖性活性(通过IP/IV途径)来允许产生最大功效。

本实例表明中和抗体(包括已知抗体和新分离的抗体)在低剂量上的鼻内功效。提供了许多不同的和已知的抗体(作为示例性抗体，包括CR6261、CR8020、CR9114、5A7、mAb53(TRL053)、mAb579(TRL579)、TRL845、TRL846、TRL847、TRL848、TRL849、TRL854、TRL809和TRL832)的鼻内功效。此类活性和功效先前一直未被证明，这不论例如CR6261和CR8020的许多研究，包括临床前试验。在本文中评估许多不同的抗体，包括已知的和新分离的抗体，所述抗体对于气道施用是有效的。

本发明涉及抗体的新型和独特组合，所述组合有效地针对甲型和乙型流感病毒，并且可被一起生产和施用而无不利的相互作用和具有显著的配制效率。根据本发明的组合的抗体针对不同的但均在临床上相关的亚型，包括甲型流感病毒的亚型H1、H3、H5以及乙型流感Yamagata和Victoria谱系。因此，本发明提供了可普遍适用的抗体组合和混合物，其中抗体的独特组合或混合物能够中和相关循环流感病毒，可通过经由气道(诸如鼻内或至肺或反气管粘膜的递送)施用本发明的抗体组合或混合物，用于气道施用的方法和组合物以及治疗或预防流感病毒、流感感染和/或传播。由于本发明的抗体组合或混合物的独特和有用的效应，因此在施用或使用之前，流感病毒或亚型的临床评价或特异性诊断不是必需的或不需要。设想了抗体片段、衍生物或变体。根据本公开，抗体片段，包括Fab在本文中被证明是有效的。在目前公开的实施方案的一个方面，抗体Fab片段，当经由气道途径(例如，鼻内或经由吸入)施用时，是有活性的并且有效的，当通过IP或IV施用时是无效的。模式Fab在吸收制剂中在体内是有效的，如图25中所示的。在一些实施方案中，提供了为scFv的抗原结合片段。

在一些实施方案中，提供了用于针对流感的被动免疫的抗体、抗原结合片段、组合物和方法。在一些实施方案中，提供了用于流感病毒的治疗或预防的抗体组合、组合物和方法。在一些方面中，提供了包含针对甲型和乙型流感的单克隆抗体的组合物，其适合于全身性施用或至呼吸道的直接施用，包括通过气道施用，诸如通过鼻内或吸入施用。提供了用于经由抗体的气道施用或组合抗体的鼻内或吸入施用与腹膜内或静脉内施用来进行治疗或预防的组合物和方法。

血凝素(HA)分子内的保守表位最近已被发现。存在关于能够识别并中和许多甲型流感病毒亚型的人单克隆抗体(MAb)的分离和表征的若干报道。这些抗体中的许多抗体靶向血凝素(HA)糖蛋白，所述糖蛋白可在接种或天然感染期间引发最强劲的中和抗体。HA包含在病毒感染中是至关重要的组分的两个亚单位HA1和HA2。HA1参与至宿主细胞受体唾液酸的附着，HA2介导病毒与内体膜的融合。

目前的抗体疗法剂量，基于迄今利用许多重组抗体，包括超过20种在美国已被批准用于临床的单克隆抗体(Newsome BW和Ernstoff MS(2008)Br J Clin Pharmacol 66(1):6-19)的研究和临床经验，被良好地确立为每剂量多个mg/kg。例如，每2周一次以6mg/kg在1-11/2小时内静脉内施用帕木单抗，一种被批准用于结直肠癌的抗EGFR完全人抗体。通过使用70kg的平均人体重，该量为每剂量420mg的抗体。

迄今还没有单克隆抗体在临床上被批准用于流感。在动物中利用流感抗体的研究的报道表明，当通过静脉内或腹膜内给予时用于治疗或预防目的的这些抗体的有效剂量范围为在1mg/kg直至100mg/kg的范围内。在美国进行的利用这些抗体中的一些抗体(CR6261、CR8020、TCN-032)的I期临床试验在安全性和耐受性研究中使用从2mg/kg直至50mg/kg的剂量递增(clinicaltrials.gov；NCT01390025、NCT01406418、NCT01756950)。以最高的I期剂量(例如30mg/kg或50mg/kg)进行利用这些抗体的随后IIa期研究。该大量的材料在该新路线的治疗剂的开发中设置了主要障碍。具体地，在该范围内的全身性剂量导致大量的材料成本，还带来了与输注相关的时间、空间和人员成本。因此，存在对增强功效和/或减少使针对流感的抗体治疗或预防成为可行的替代方案所需的材料的量的迫切需要。

虽然乙型流感稍不如甲型流感常见，但其仍然是个严重的健康问题。一般地，乙型流感病毒被分成两个谱系：B/Victoria/2/87-样和B/Yamagata/16/88-样。乙型流感病毒与甲型流感病毒不同，因为它们不存在称为碱性1-F2(PB1-F2)的蛋白，但具有在甲型流感中不存在的另外的蛋白，诸如糖蛋白B(NB)。还存在另外的差异。然而，乙型流感病毒株的HA蛋白与一些甲型流感HA的同源性与它们彼此之间的同源性相同。

流感病毒的血凝素蛋白(HA)具有球状头部分结构域(其在流感病毒株之间高度异质)和含有进入细胞所需的融合部位的茎区。HA在病毒包膜上呈三聚体。血凝素蛋白(HA₀)的未裂解形式通过经由胰蛋白酶裂解成HA₁和HA₂部分(以允许融合部位实现毒力)来激活。所述两个裂解的部分使用二硫键来保持偶联，但在宿主细胞的内体区室的低pH环境中经历构象变化，这导致病毒与宿主细胞膜的融合。

所述裂解位点含有为甲型和乙型流感的不同株所共有的共有序列。未裂解的血凝素蛋白三聚体(HA₀)被称为无活性形式，然而当裂解成HA₁和HA₂部分时，血凝素蛋白被称为呈激活形式。

Bianchi,E.等，J.Virol.(2005)79:7380-7388描述了基于该裂解位点的共有序列的“通用”乙型流感疫苗，其中包含该位点的肽，当缀合于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)的外膜蛋白复合体时，能够在小鼠中产生抗体。还描述了显示结合所述共有序列的单克隆抗体(mAb)。另外，在小鼠中观察到抗血清的成功被动转移。其它现有技术疫苗，诸如WO2004/080403中描述的包含来源于流感的M2和/或HA蛋白的肽的那些疫苗，包括具有弱的功效或在株间无效的抗体。

本领域中描述的结合HA茎区的抗体包括由Crucell开发的那些抗体，诸如在WO2008/028946(‘946)中；Throsby,M.等，PLoS One(2008)3:e3942中；Ekiert,D.C.等，Science(2011)333:843-850中；和Sui,J.等，Nat.Struct.Mol.Biol.(2009)16:265-273中描述的CR6261和CR8020。根据上述PCT公开‘946，这些抗体不仅结合于H5N1而且还结合于H2、H6、H9和H1。还已开发了针对保守的M2E抗原的mAb，如由Grandea,A.G.等，PNAS USA(2010)107:12658-12663描述的。M2E是出现在感染细胞表面上并且也是金刚烷胺和金刚乙胺的靶的病毒编码的蛋白。针对这些抗病毒剂，抗药性已变得广泛存在，这暗示着该靶不能行使基本功能。

另外的现有技术抗体已由Lanzavecchia小组：Corti,D.等，Science(2011)333:850-856描述，所述抗体结合并中和甲型流感的组1和组2株，但效力不如本文中描述的那些抗体高。另外，具有针对甲型和乙型流感的茎区的免疫反应性的mAb在Dreyfus,C.等，Science(2012)337:1343-1348中进行了描述，但其不具有可检测的中和效力。同一作者描述了结合HA的头部基团的两种mAb，其中的一种mAb在对于来自乙型流感的两个进化枝的株的亲和力和效力上具有高度可变性，其中的另一种具有～1nM的亲和力。这些结果确认了用于乙型流感的广泛中和mAb难以获得。

PCT申请公开No.WO2011/160083(通过引用并入本文)描述了来源于人细胞并且用于被疫苗的单克隆抗体。所述抗体显示对存在于组1中的流感病毒进化枝H1的高结合亲和力，所述抗体的一些抗体还显示对也存在于组1中的H9和/或存在于组2中的H7和/或存在于组1中的H2的高亲和力。所公开的抗体中的一些抗体只结合无活性三聚体形式(推测在共有裂解区上)，然而其它抗体能够结合已被裂解的激活的血凝素蛋白。

PCT公开No.WO2013/086052(通过引用并入本文)公开了一组抗体，包括双特异性抗体，其在该共有区域中结合于表位并且结合于组1和组2的大量甲型流感病毒，包括组1中的H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H13和H16以及组2中的H3和H7。另外，由Yasugi,M.等，PLoSPathogens(2013)9:以e1003150在线公布的，第1-12页提供的最近公开，描述了中和乙型流感病毒的人mAb，具体地，被认为甚至当在感染后72小时施用其时仍具有治疗功效的称为5A7的mAb。5A7针对唯一测试的株的K_D据报道为5nM，表位被鉴定为在高度保守的C末端茎区；所报道的效力在乙型流感的所有株中是可比较的。该结果确立了mAb针对乙型流感的高亲和力(亚-nM)难以实现。

在一些实施方案中，提供了用于预防和治疗的抗体或类似的结合部分。因此，它们可用于保护受试者免受病毒感染以及用于治疗已暴露于或感染了乙型流感的受试者。最终目标受试者是人受试者，并且对于人受试者中的使用，作为常规天然抗体或其免疫反应性片段的结合部分的人形式或人源化形式是优选的。然而，含有如由互补决定区(CDR)决定的适当的结合特征的抗体，当用于实验室动物的研究中时，可保留非人特征。下面实施例的研究中使用的抗体，尽管在小鼠中进行所述研究，然而含有为人的可变和恒定区。

定义

根据本公开，可使用在本领域技术人员能力之内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中已作了详尽解释。参见，例如，Sambrook等，"MolecularCloning:A Laboratory Manual"(1989)；"Current Protocols in Molecular Biology"第I-III卷[Ausubel,R.M.，编辑(1994)]；"Cell Biology:A Laboratory Handbook"第I-III卷[J.E.Celis，编辑(1994))]；"Current Protocols in Immunology"第I-III卷[Coligan,J.E.，编辑(1994)]；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait编辑1984)；"Nucleic AcidHybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；"Transcription AndTranslation"[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)]；"Animal Cell Culture"[R.I.Freshney，编辑(1986)]；"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)。

因此，如果在本文中出现，除非上下文另外明确地要求，否则以下术语将具有下文中给出的定义。

如本文中所用，术语“抗体”或“结合部分”是指抗体、共免疫反应性片段或抗原结合片段，以及单特异性单克隆抗体、多特异性抗体诸如双特异性单克隆抗体或三特异性单克隆抗体、分离的单克隆抗体、重组单克隆抗体以及分离的人或人源化单克隆抗体，或其抗原结合片段。包含两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的分子，并且还包括常规抗体的免疫反应性片段或或抗原结合片段，即使有时“片段”被冗余地提及。所述抗体，从而包括Fab片段、基本上只含有可变区的F_v单链抗体、双特异或三特异性抗体和它们的各种仍然保留免疫原性的片段化形式，以及通常地通过包含接近更常规的天然存在的抗体的可变区的活性的氨基酸序列或经修饰的氨基酸序列(即，假肽)来模拟“天然”抗体的活性的蛋白。因此，该术语涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的，诸如重组的或以其它方式工程化的。因此包括包含融合于另一种多肽的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023以及美国专利No.4,816,397和4,816,567进行了描述。

术语“抗体”还包括免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或完全合成产生的。术语还涵盖了具有为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质。该术语还包括CDR移植抗体。“抗体”是结合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体，在美国专利No.4,816,397和4,816,567中描述了提及的最后一种抗体。术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，其通常包含4条全长多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链，或其等效Ig同源物(例如，骆驼纳米抗体，其只包含重链)；包括其全长功能性突变体、变体或衍生物，所述突变体、变体或衍生物保留Ig分子的基本表位结合特性，并且包括双重特异性、双特异性、多特异性和双重可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可以是任何种类(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。优选抗体是IgG种类。

“抗体组合部位”是由特异性结合抗原的重链和轻链可变及高变区组成的抗体分子的结构部分。

如本文中所用，以其各种语法形式存在的短语“抗体分子”设想了完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。

如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体的群体(即，包含单一抗体)的抗体，除可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备过程中产生的，此类变体通常以少量存在)外，所述群体是完全相同的和/或结合相同的表位(或多个表位)。单克隆抗体是具有一个种类的能够与特定抗原免疫反应的抗体组合部位的抗体。单克隆抗体从而通常表现出对于与其免疫反应的任何抗原的单一结合亲和力。与通常包括针对不同的决定簇(表位)的多种抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每一种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。然而，如果单克隆抗体含有具有多个抗体组合部位(每一个部位对不同的抗原具有免疫特异性)的抗体分子，则其可以是多特异性的；例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。修饰词“单克隆”表示抗体获自基本上均一的抗体群体的特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可通过多种技术来制造，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文是描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其它示例性方法。

与“免疫反应性片段”、“结合片段”和“抗体片段”同义地使用的术语“抗原结合片段”，是指特异性结合抗原以形成复合物的可酶促获得的、合成的或重组的“工程化”多肽或糖蛋白。“抗体片段”是指除完整抗体外的分子，所述分子包含结合完整抗体所结合的抗原的完整抗体的部分。“工程化”抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。另外，抗体片段包含具有VH结构域的特征(即能够与VL结构域一起组装成功能性抗原结合部位，从而提供全长抗体的抗原结合性质)或VL结构域的特征(即能够与VH结构域一起组装成功能性抗原结合部位，从而提供全长抗体的抗原结合性质)的单链多肽。“抗体片段”包括包含至少一个不为全长的多肽的分子，包括(i)Fab片段，其为由可变轻(VL)结构域、可变重(VH)结构域、恒定轻(CL)结构域和恒定重1(CH1)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含通过铰链区中的二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fab(Fd)片段的重链部分，其由VH和CH1结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)结构域抗体(dAb)片段，其包含单个可变结构域(Ward,E.S.等，Nature 341,544-546(1989))；(vi)骆驼抗体；(vii)分离的互补决定区(CDR)；(viii)单链Fv片段，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合部位(Bird等，Science,242,423-426,1988；Huston等，PNAS USA,85,5879-5883,1988)；(ix)双链抗体，其为双价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短以至于不允许同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合部位的接头(WO94/13804；P.Holliger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448,(1993))；和(x)线性抗体，其包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xi)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson,J Immunol.Methods 242:193-204 9(2000))；(xii)微型抗体，其为由与恒定免疫球蛋白结构域CH3或CH4融合的scFv组成的双价分子，其中所述恒定CH3或CH4结构域用作二聚化结构域(Olafsen T等(2004)Prot Eng Des Sel 17(4):315-323；Hollinger P和Hudson PJ(2005)Nature Biotech 23(9):1126-1136)；和(xiii)重和/或轻链的其它非全长部分、或其突变体、变体或衍生物(单独的或以任何组合的)。单链Fab(scFAb)是已知的，并且在US20070274985中进行了描述。

抗原结合片段包括Fab片段；F(ab')₂片段；Fd片段；Fv片段；单链Fv(scFv)分子；dAb片段；和由氨基酸残基组成的模拟抗体的高变区(CDR)的最小识别单元。其它工程化分子，诸如双链抗体、三链抗体、四链抗体和微型抗体也包括在表达“抗原结合片段”内，如本文中所用的。

本文中组合使用和提及的抗体，除本文中最早描述的和构成新的多肽实体的抗体外，可包括具有如所报道的和公众已知的氨基酸序列的那些抗体，包括具有对已知的或公开的氨基酸序列的修饰并且保留或表现出基本上相等的活性(包括靶中和或识别和结合活性)的抗体、蛋白质、多肽。因此，同样地设想了表现出基本上等同的或改变的活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如，诸如通过定点诱变获得的修饰，或可以是意外的，诸如通过为所述复合物或其命名的亚单位的生产者的宿主中的突变获得的那些修饰。所述抗体意欲在它们的范围内包括本文中明确引述的抗体以及所有基本上同源的类似物和等位变型，诸如与明确公开或公共报道的抗体具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列。

本文所述的氨基酸残基优选以“L”型异构形式存在。然而“D”型异构形式中的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要免疫球蛋白结合的所需功能性质被多肽保留。NH₂是指存在于多肽的氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽的羧基末端的游离羧基。与标准多肽命名法(J.Biol.Chem.,243:355259(1969))一致，氨基酸残基的缩写示于对应的下表1中：

对应氨基酸符号的表1

应当指出的是，所有氨基酸残基序列在本文中通过其左和右取向以氨基端至羧基端的常规方向显示的式来表示。提供表1来使可在本文中交替出现的三字母与一字母符号相关联。

以下是氨基酸的各种分组的实例：具有非极性R基团的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；具有不带电荷的极性R基团的氨基 酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；具有带电荷的极性R基 团(在pH6.0时带负电荷)的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸(正pH6.0时带正电荷)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH6.0时)；另一种分组可以是具有苯基的那些氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。

另一种分组可根据分子量(即，R基团的大小):

特别优选的保守氨基酸取代是：

-Lys对Arg的取代和反之亦然，以便可维持正电荷；

-Glu对Asp的取代和反之亦然，以便可维持负电荷；

-Ser对Thr的取代，以便可维持游离-OH；和

-Gln对Asn的取代，以便可维持游离NH₂。

还可引入氨基酸取代来以取代具有特别优选的性质的氨基酸。例如，可将Cys引入用于与另一个Cys形成二硫桥的潜在位点。可将His作为特别地“催化的”位点引入(即，His可用作酸或碱并且是生物化学催化中最常用的氨基酸)。可因其特别平的结构而引入Pro，其在蛋白质的结构中诱导β转角。

当至少约70％的氨基酸序列(优选地至少约80％，在更优选实施方案中，至少约90或95％，至少约98％或至少约99％序列同一性)是相同的，或代表保守取代，则两个氨基酸序列是“基本上同源的”。在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的基本上同源的序列。

编码按照本公开使用的抗体的核酸可用于制备和/或产生用于目前公开的实施方案的抗体或其活性片段。包含此类核酸的载体可用于表达或分离如本文中提供或使用的抗体。

“复制子”是作为体内DNA复制的自主单元(即能够在它自身控制下复制)的任何遗传元件(例如，质粒、染色体、病毒)。

“载体”是可将另一个DNA区段附接于其以使得所附接的区段能够复制的复制子，诸如质粒、噬菌体或粘粒。

“DNA分子”是指以其单链形式或双链螺旋形式存在的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合物形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，并且不将其限制于任何特定的三级形式。因此，该术语包括除其它以外在线性DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。在论述特定双链DNA分子的结构中，可根据仅以5'至3'方向沿DNA的非转录链(即具有与mRNA同源的序列的链)给出序列的正常惯例在本文中描述序列。

“复制起始点”是指参与DNA合成的那些DNA序列。

DNA“编码序列”是当置于适当的调控序列的控制下时在体内被转录并被翻译成蛋白质的双链DNA序列。编码序列的边界通过5'(氨基)末端上的起始密码子和3'(羧基)末端上的翻译终止密码子来确定。编码序列可包括，但不限于，原核生物序列、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。多腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3'。

转录和翻译控制序列是在宿主细胞中提供编码序列的表达的DNA调控序列，诸如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子等。

“启动子序列”或“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并起始下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调控区。为了定义目前公开的实施方案的目的，启动子序列在其3'末端以转录起始位点为界并向上游(5'方向)延伸以包括以高于本底的可检测的水平起始转录所必需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内，发现转录起始位点(通过利用核酸酶S1的定位方便地界定的)以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。真核生物启动子通常，但非总是含有“TATA”框和“CAT”框。原核生物启动子除了-10和-35共有序列以外还含有Shine-Dalgarno序列。

“表达控制序列”是调控序列的形式，并且是控制和调节另一个DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA(其随后被翻译成由所述编码序列编码的蛋白质)时，所述编码序列在细胞中处于转录和翻译控制序列的“控制之下”。

当已将此类DNA引入细胞内时，细胞已被外源或异源DNA“转化”。转化DNA可被或可以不被整合(共价连接)进染色体DNA，从而构成细胞的基因组。在例如原核生物细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞中，可将所述转化DNA维持在附加型元件诸如质粒上。关于真核生物细胞，稳定转化的细胞是其中转化DNA已被整合进染色体内，以使得其能够通过染色体复制由子细胞遗传的转化细胞。该稳定性通过真核细胞建立由含有转化DNA的子细胞的群体组成的细胞系或克隆的能力来证明。“克隆”是通过有丝分裂来源于单个细胞或共同祖先的细胞的群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。

当至少约75％(优选至少约80％，更优选至少约90或95％)的核苷酸在DNA序列的确定长度上匹配时，则两个DNA序列是“基本上同源的”。基本上同源的序列可通过使用可在序列数据库中获得的标准软件比较序列来鉴定，或在Southern杂交实验中在例如严格条件(如针对该特定系统定义的)下鉴定。定义适当的杂交条件在本领域技术人员的能力内。参见，例如，Maniatis等，同上；DNA Cloning，第I和II卷，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。

应当理解的是，也在本公开的范围内的是编码本公开的抗体或用于本公开的抗体的DNA序列，其编码具有相同氨基酸序列的抗体、多肽或其活性片段，但被简并成原始或已知的编码序列。“简并成”意指将不同的三字母密码子用于指定特定的氨基酸。本领域中公知的是，以下密码子可互换地用于编码每一个特定的氨基酸：

应理解的是，上述指定的密码子是针对RNA序列的。针对DNA的对应密码子用T取代U。

可在抗体或活性片段编码序列中产生突变，以使得特定的密码子被改变成编码不同氨基酸的密码子。这样的突变通常通过尽可能产生最少的核苷酸变化来产生。这种类型的取代突变可被产生来以“非保守”的方式(即，通过将密码子从属于具有特定尺寸或特征的氨基酸的不同分组的氨基酸改变成属于另一个分组的氨基酸)或以“保守的”方式(即，通过将密码子从属于具有特定尺寸或特征的氨基酸的分组的氨基酸改变成属于同一分组的氨基酸)改变所得蛋白中的氨基酸。此类保守变化通常在所得蛋白的结构和功能方面导致较小的变化。非保守变化更加可能改变所得蛋白的结构、活性或功能。某些实施方案被认为包括在氨基酸序列中在1、2、3、4、5、6或7个氨基酸残基上含有保守变化或取代的序列，所述保守变化或取代不会显著改变所得蛋白的活性或结合特征。

如上文中提及的，可通过合成而非克隆来制备编码抗体、多肽或其活性片段的DNA序列。可利用适当的密码子来设计抗体或片段氨基酸序列的DNA序列。一般地，如果将序列用于表达，人们会选择对于预期的宿主是优选的密码子。从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配完全序列，所述序列被装配成完全编码序列。参见，例如，Edge,Nature,292:756(1981)；Nambair等，Science,223:1299(1984)；Jay等，J.Biol.Chem.,259:6311(1984)。合成DNA序列允许方便地构建将表达类似物或或“突变蛋白”的基因。或者，可通过天然基因或cDNA的定点诱变来产生编码突变蛋白的DNA，以及可使用常规多肽合成来直接产生突变蛋白。

DNA构建体的“异源”区是在自然界中未被发现与较大的分子连接的较大的DNA分子内的DNA的可鉴定的区段。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，所述基因通常侧连有不侧连来源生物的基因组中的哺乳动物基因组DNA的DNA。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身在自然中不存在的构建体(例如，其中基因组编码序列含有内含子的cDNA，或具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。等位变异或天然存在的突变事件不产生如本文中定义的DNA的异源区域。

当表达控制序列控制和调节DNA序列的转录和翻译时，该DNA序列被“可操作地连接”至表达控制序列。术语“可操作地连接”包括在待表达的DNA序列之前具有适当的起始信号(例如，ATG)和维持正确的阅读框架以允许在表达控制序列的控制下表达所述DNA序列，和产生由所述DNA序列编码的所需产生。如果期望插入重组DNA分子的基因不含适当的起始信号，则可在所述基因之前插入起始信号。

术语“标准杂交条件”是指基本上等效于用于杂交和洗涤的5xSSC和65℃的盐和温度条件。然而，本领域技术人员将理解，此类“标准杂交条件”取决于特定条件，包括缓冲液中的钠和镁的浓度、核苷酸序列长度和浓度、百分比错配、百分比甲酰胺等。在“标准杂交条件”的确定中也很重要的是两个序列杂交是RNA-RNA、DNA-DNA还是RNA-DNA。此类标准杂交条件可由本领域技术人员根据熟知的公式来容易地确定，其中杂交通常比预测的或测定的T_m低10-20℃，如果需要，洗涤使用较高的严格度。

术语对于抗体和片段的“结合亲和力”在本文中被描述为KD(抗体与其抗原之间的平衡解离常数)，其可通过本领域中已知的各种方法来测定。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段表现出以下对于甲型流感病毒、乙型流感病毒或来源于其的HA蛋白诸如重组HA蛋白的结合亲和力。在一个实施方案中，所述结合亲和力在约5x10^-8M与约5x10^-12M之间，在一些实施方案中，所述结合亲和力在约5x10^-9M与5x10^-11M之间，在一些实施方案中，所述结合亲和力在约3x10^-9M与约5x10^-11M之间，在一些实施方案中，所述结合亲和力在约5x10^-10M与约5x10^-11M之间。在一些实施方案中，提供了表现出小于10nM、小于3nM或小于1nM或紧密的对于重组HA蛋白的KD的抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，提供了表现出在10nM与0.1pM之间的KD的抗体和片段。在一些实施方案中，提供了表现出在3nM与1pM之间的KD的抗体和片段。如本文中所用，术语“紧密的”表示提及的KD值或更小(较低的KD值)，因为亲和力的强度或紧密程度越高，KD值越低。在一些实施方案中，KD通过测定斜入射反射率差(OI-RD)(例如通过使用微阵列或流体系统，例如利用(参见Landry等，2012,Assayand Drug Dev Technol 10(3),250-259)，或利用(即，表面等离子体共振)或竞争性结合测定)来进行测量。

抗体介导的病毒的中和在本文中如在领域中所定义或接受的那样被定义，并且如在本文中提及和使用的，可在各种常规或公认的中和测定中对其进行测试。中和测定的实例包括基于对培养中的细胞的病毒致细胞病变效应(CPE)的抑制的常规中和测定。例如，流感中和可通过在被流感感染的MDCK细胞中减少或阻断CPE的形成来进行测试。可将病毒和中和试剂预先混合，随后添加至细胞，然后测量病毒进入的阻断。可体外测试血凝素抑制(HI)，并且所述血凝素抑制可检测病毒结合红细胞的能力的阻断。在WHO Manual onAnimal Influenza(who/cds/csr/ncs/2002.5，第48-54页)中提供了示例性已知的和接受的中和测定。阻断唾液酸受体结合部位的抗体可中和病毒对细胞的结合，从而阻断感染。反过来，中和测定可检测病毒排出的阻断，如在神经氨酸酶抑制剂如的情况下。最近，已鉴定了通过阻止病毒排出以类似的方式起作用的中和抗体，该中和的实例包括乙型流感病毒上的CR9114抗体(Dreyfus等(2012)Science 337:1343-1348)。同样地，利用其中使用与ELISA组成的微量滴定板在感染的细胞中检测到病毒核蛋白(NP)的微量中和测定。定量PCR测定已被描述来测量病毒蛋白质(Dreyfus C等(2012)Emerging Inf Diseases19(10:1685-1687)。在一些实施方案中，提供了在另一个常规体外中和测定中不显示为中和抗体，但确实表现出外出抑制中和，从而通过IN施用是有效的抗体或片段。因此，如本文中定义的“中和”抗体将指在常规体外中和测定中表现出中和的抗体，和/或抑制外出抑制的抗体。因此，在术语的一个意义上，排出抑制剂具有中和作用，因为其抑制流感感染的传播。

“非-中和”抗体或非中和抗体可结合病毒但在识别中和测定中或常规评价性评估中不抑制病毒或病毒复制。对病毒的结合可通过阻止其与细胞、细胞受体或细胞靶的有效相互作用来抑制病毒。非中和抗体可结合于病毒中的保守蛋白或蛋白上的表位。例如，临床试验中M2抗体TCN-032可结合广泛的甲型流感病毒，但在常规中和测定并不表现出中和。类似地，可鉴定不中和但结合HA的抗体。

如本文中所用，“Fab片段”是指这样的抗体片段，其包含含有轻链(CL)的VL结构域和恒定结构域的轻链片段，和重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。抗体分子的Fab和F(ab')₂部分可通过利用公知的方法分别对基本上完整的抗体分子进行木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应来制备，或可合成或重组地制备。Fab'抗体分子部分也是公知的，并且可通过如利用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，随后用试剂诸如碘乙酰胺烷基化所得的蛋白质硫醇来从F(ab')₂部分产生。

术语“Fc结构域”在本文中用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-末端区域。例如在天然抗体中，Fc结构域由来源于IgG、IgA和IgD同种型中的抗体的两个重链的第二和第三恒定结构域的两个相同的蛋白质片段组成；IgM和IgE Fc结构域在每一条多肽链中含有3个重链恒定结构域(C_H结构域2-4)。

示例性抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和含有互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域中已知的那些部分如Fab、Fab'、F(ab')₂和F(v)，所述部分对于在本文所述的治疗方法中的使用是优选的。

在某些情况下，如本公开中所教导的，对于使用，特别是对于鼻内或吸入施用，需要一定水平或量的抗体的中和活性和必要特性。因此，用于根据本公开的鼻内使用的任何片段、变体、衍生物、合成抗体或抗体部分需要保留针对靶病毒或病原体(在一个方面流感病毒)的中和能力及活性。另一方面，将经由可选择的全身性途径(包括腹膜内或静脉内)施用的抗体必须结合或识别靶病毒或病原体(在一个方面流感病毒)，然而，不需要中和。因此，作为实例，可鼻内使用保留中和的抗体的Fab片段(多个片段)。经由Fc介导的效应子功能对于鼻内功效和中和来说是不需要的。相反地，全身性递送的抗体将明显地通过效应子功能来介导其功效。

术语“抗原结合结构域”是指包含特异性结合抗原的部分或全部并与其互补的区域的抗原结合分子的部分。当抗原较大时，抗原结合分子可以只与抗原的特定部分结合，所述部分被称为表位。抗原结合结构域可由例如一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与将抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每一个结构域包含4个保守框架区(FR)和3个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补VL或VH结构域的文库来进行分离。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352:624-628(1991)。

术语“抗体的抗原结合部分”，当在本文中使用时，是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除如本文中定义的高变区残基外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N末端至C末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大和决定抗体的性质的区域。抗体可根据它们的重链和轻链CDR在氨基酸序列上进行充分定义，并且可特别地根据它们的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列和它们的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列来进行描述和表征。抗体可被定义或表征为包含重链和轻链的抗体或片段，其中所述重链可变区包含特定的CDR1、CDR2和CDR3序列并且所述轻链可变区包含特定的CDR1、CDR2和CDR3序列。可根据本领域技术人员可获得的和已知的标准方法和分析确定抗体的CDR和FR。因此，可根据Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)的标准定义或根据国际免疫遗传学信息系统(IMGT)(imgt.org；LeFranc,M-P(1999)Nucl Acids Res27:209-212；LeFranc,M-P(2005)Nucl Acids Res 33:D539-D579)确定CDR和FR区域。

所谓“基本上如所列出的”，其意指本公开的抗体的可变区序列，和/或特别地CDR序列将与本文中所附的序列表中提供的指定的序列同一的或高度同源。其中Xaa出现在序列表中，其代表任何天然存在的氨基酸残基。

所谓“高度同源”，设想了可在可变区序列中和/或CDR序列中仅产生少数取代，优选1至8个，优选1至5个，优选1至4个，或1至3个或1个或2个取代。术语基本上如所列出的包括不实质上或显著地影响本抗体的特异性和/或活性的特别保守的氨基酸取代。设想了保守氨基酸取代用于CDR区序列。在本文中设想和提供了示例性CDR取代和变体。在一些方面，可在CDR外的可变区序列中产生取代，以保留CDR序列。因此，可在可变区序列或可选择的非同源或镶嵌可变区序列中引入或利用变化，以使得CDR序列得以维持并且可变区的其余部分可被取代。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面聚集，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是被抗体结合的抗原的区域。

用于通过杂交瘤或其它方式和方法产生单克隆抗体的方法和方法学是公知的。可筛选针对病原体、病毒或流感肽产生的单克隆抗体的小组的各种性质；即，中和、同种型、表位、亲和力等。特别吸引人的是中和病毒或其亚单位的活性的单克隆抗体。可在中和活性测定中容易地鉴定此类单克隆。高亲和力抗体也用于有效结合和/或中和，或当期望免疫亲和纯化天然或重组病毒或对所述纯化感兴趣时高亲和力抗体也是有用的。

可通过起始包含含有分泌具有适当的抗原特异性的抗体分子的杂交瘤的营养培养基的单克隆杂交瘤培养物，来产生用于实践目前公开的实施方案的单克隆抗体。在足以使杂交瘤将抗体分子分泌至培养基中的条件下维持培养物，持续一段足以使抗体分子分泌至培养基中的时间。随后收集含抗体的培养基。随后可通过公知的技术进一步分离抗体分子。

用于制备这些组合物的介质在本领域中是公知的和商购可得的，包括合成培养基、近交系小鼠等。示例性合成培养基是补充有4.5gm/l葡萄糖、20mm谷氨酰胺和20％胎牛血清的达尔伯克最低必需培养基(DMEM；Dulbecco等，Virol.8:396(1959))。示例性近交系小鼠品系为Balb/c。

用于产生单克隆抗病毒抗体的方法在本领域中也是公知的。参见Niman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4949-4953(1983)。通常地，单独使用病毒、病毒蛋白或肽类似物，或将其缀合于免疫原性载体，如用于产生单克隆抗体的免疫原。筛选杂交瘤的产生与所述病毒、蛋白或肽类似物免疫反应的抗体的能力。

抗体还可以是双特异性或多特异性的，例如其中抗体的一个结合结构域是用于本发明的病毒中和抗体，并且另一个结合结构域具有不同的特异性，例如结合细胞的顶端表面或与其缔合，结合气道上皮细胞等。本发明的双特异性抗体包括其中抗体的一个结合结构域是用于本发明的中和剂，包括其片段，并且另一个结合结构域是不同的抗体或其片段，包括不同的抗病毒特异性抗体(包括可选择的中和抗体或非中和抗体)的片段。另一个结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如在肺上皮、肺泡巨噬细胞中，神经或神经胶质细胞特异性抗体。在本发明的双特异性抗体中，可将本发明的抗体的一个结合结构域与其它结合结构域或分子组合，所述其它结合结构域或分子识别特定细胞受体和/或以特定方式调节细胞，如例如免疫调节剂(例如，白细胞介素)、生长调节剂或细胞因子或毒素(例如，篦麻毒素)或抗有丝分裂或细胞凋亡试剂或因子。因此，本发明的抗体可用于将试剂、标记导向或靶向适应症诸如感染、炎症等中的其它分子或化合物或抗体。

用于本发明的双特性抗体可包含至少2个Fab片段，在一个实例中，其中交换第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区。由于可变或恒定区的交换，所述第二Fab片段也被称为“交叉-Fab片段”或“xFab片段”或“交叉Fab片段”。此类双特异性在US2013006011中进行了描述。

在具体的和进一步的方面，通过IN进行的中和抗体的组合或连续施用连同通过IP或IV进行的抗体的施用一起提供了用于治疗和/预防病毒感染的有效且增强的协同方法。全身性施用(包括IP或IV)的抗体可以是中和的或非中和的，从而可以是与通过IN施用的抗体相同的抗体，或可以是经修饰的抗体或不同的抗体。因此，用于鼻内递送的抗体，中和抗体可以是与与其组合使用(用于通过另一种方法的递送，特别地全身性递送，包括IP或IV递送)的抗体相异或不同的抗体。

本公开表明，中和抗体的Fc功能和Fc部分，从而效应子功能不是鼻内增强的功效所需的。因此，抗体和片段诸如Fab片段，或不存在Fc或不存在效应子功能的抗体在鼻内施用中是有效的。相反地，抗体(中和或非中和的)的Fab片段或不存在Fc或不存在效应子功能的抗体在IP或IV施用中是无效的。

在一些实施方案中，提供了免疫缀合物或抗体融合蛋白，其中将用于本发明的抗体、抗体分子或其片段缀合或附接于其它分子或试剂，所述免疫缀合物或抗体融合蛋白还包括，但不限于缀合于化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂、抗病毒剂、抗微生物剂或肽、细胞壁和/或细胞膜破裂剂或药物的此类抗体、分子或片段。在一个方面，所述免疫调节剂或抗体融合物可包括缀合于抗病毒剂，特别地抗流感剂的抗体、分子或片段。抗流感剂可以是神经氨酸酶抑制剂。抗流感剂可选自Tamiflu和Relenza。抗流感剂可以是M2抑制剂，诸如金刚烷胺或金刚乙胺。抗流感剂可以是病毒复制抑制剂。

抗体、其片段和组合物(包括本发明的抗体)用于治疗和预防其的“多个受试者”或“受试者”，除了人以外，还包括对流感感染易感的任何受试者。因此，各种哺乳动物，诸如牛、猪、绵羊和其它哺乳动物受试者，包括马和家庭宠物，以及海豹，将受益于这些结合部分的预防性和治疗性使用。在一些情况下，使用适于受试者物种的抗体。另外，已知流感感染禽类物种，所述禽类物种也将受益于含有本发明的抗体的组合物，再次地可能适于受试者物种。

抗体或片段的“治疗有效量”或“有效量”是以适用于任何医学治疗的合理的效益/风险比赋予治疗的受试者以疗效的预定量。疗效可以是客观的(即，可通过一些测试或标志物测量的)或主观的(即，受试者给出效应的指征或感染效应，或医生观察变化)。组合物中每一种抗体的有效量可在约0.001mg/kg至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/Kg至约1mg/kg的范围内。本文中设想的效应，视情况而定，包括医学治疗性和/或预防性治疗。根据本公开施用以获得治疗和/或预防效应的抗体或片段的具体剂量将当然地根据病例周围的具体情况来确定，包括，例如，所施用的化合物、施用途径、其它活性成分的共施用、待治疗的病况、所使用的具体组合物、患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所使用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率和治疗的持续时间。施用的有效量可由医生根据前述相关情况和合理的医学判断的运用来确定。‘治疗有效量’意指会引起由医学博士或其它临床医生正在寻求的受试者的生物或医学反应的药物、化合物、抗微生物剂、抗体或药物试剂的量。具体地，关于病毒感染和病毒增殖，术语“有效量”旨在包括将带来受试者中病毒复制或发病机制的量或程度的生物学上有意义的减少，和/或疾病(发热、关节疼痛、不适)的持续时间的减少，或被感染的个体的体重减轻的减少的化合物或试剂的有效量。短语“治疗有效量”在本文中用于意指足以减少，优选地阻止病毒载入、病毒复制、病毒传播或病理学的其它特性诸如例如，发热或增加的白细胞计数(这可伴随其病毒的存在和活性)的量。

在某些实施方案中，在向受试者施用疗法的上下文中，“有效量”是指足以实现以下效应的1个、2个、3个、4个或更多个效应的疗法的量：(i)流感病毒感染、流感病毒性疾病或与其相关的症状的严重度的减轻或改善；(ii)流感病毒感染、流感病毒性疾病或与其相关的症状的持续时间的减少；(iii)流感病毒感染、流感病毒性疾病或与其相关的症状的进展的阻止；(iv)流感病毒感染、流感病毒性疾病或与其相关的症状的消退；(v)流感病毒感染、流感病毒性疾病或与其相关的症状的发展或发作的阻止；(vi)流感病毒感染、流感病毒性疾病或与其相关的症状的复发的阻止；(vii)流感病毒从一个细胞至另一个细胞、从一个组织至另一个组织或从一个器官至另一个器官的扩散的减少或阻止；(viii)流感病毒从一个受试者至另一个受试者的扩散/传播的阻止或减少；(ix)与流感病毒感染或流感病毒性疾病相关器官衰竭的减少；(x)受试者的住院的减少；(xi)住院时间长度的减少；(xii)流感病毒感染或与其相关的疾病的受试者的存活率的增加；(xiii)流感病毒感染或与其相关的疾病的消除；(xiv)流感病毒复制的抑制或减少；(xv)流感病毒与宿主细胞的结合或融合的抑制或减少；(xvi)流感病毒进入宿主细胞的抑制或减少；(xvii)流感病毒基因组的复制的抑制或减少；(xviii)流感病毒蛋白的合成的抑制或减少；(xix)流感病毒颗粒的装配的抑制或减少；(xx)流感病毒颗粒从宿主细胞的释放的抑制或减少；(xxi)流感病毒滴度的减少；(xxii)与流感病毒感染或流感病毒性疾病相关的症状的数目的减少；(xxiii)另一种疗法的预防性或治疗性效应的增强、改善、补充或提高；(xxiv)与流感病毒感染相关的继发感染的发作或进展的阻止；(xxv)继发于流感病毒感染的细菌性肺炎的发作的阻止或疾病严重度的降低；和/或(xxvi)对流感的免疫应答包括细胞因子、趋化因子、补体、细胞反应等的改变。在一些实施方案中，疗法的“有效量”具有有益的效应，但不治愈流感病毒感染或与其相关的疾病。在某些实施方案中，疗法的“有效量”可包括以一定的频率施用多个剂量的疗法，以获得一定量的具有预防性和/或治疗性效应的疗法。在其它情况下，疗法的“有效量”可包括以特定量施用单个剂量的疗法。

与病毒感染(包括具体地流感感染)、病毒性疾病或病毒暴露相关的“症状”或“多个症状”可包括，但不限于100℉或更高的发热、感觉发热、咳嗽和/或喉咙痛、流鼻涕或鼻塞、头痛和/或全身酸痛、畏寒、乏力、全身乏力、恶心、呕吐和/或腹泻、关节和肌肉中和/或眼周的痛和疼痛。

术语‘预防’或‘防止’是指可被暴露于致病剂或在疾病发作之前对疾病易感的受试者中获得或发展疾病或病症的风险的降低(即，使疾病的临床症状的至少一个症状不发展)。

术语“预防”涉及术语‘防止’并包含在其中，并且是指其目的是防止而非治疗或治愈疾病的措施或方法。术语任何疾病或感染的‘治疗(treating/treatment)’在一个实施方案中是指改善疾病或感染(即，阻止疾病或感染剂或病毒的增长或降低其临床症状的至少一个的表现、程度或严重度)。在另一个实施方案中，‘治疗’是指改善至少一个受试者可能不能辨别的身体参数。在另一个实施方案中，‘治疗’是指物理地(例如，可辨别的症状的稳定)、生理地(例如，身体参数的稳定)或通过这两种方式调节疾病或感染。在其它实施方案中，‘治疗’涉及减缓疾病的进展、疾病的传播或减少感染。

如本文中所用，“pg”意指皮克，“ng”意指纳克，“ug”或“μg”意指微克，“mg”意指毫克，“ul”或“μl”意指微升，“ml”意指毫升，“l”意指升。

用于预防和治疗的方法是常规的并且通常是公知的。抗体或其它结合部分通常通过注射提供，但口服疫苗也已知是有效的。剂量水平和施用时间容易优化，并在本领域技术人员的能力之内。在一个替代方案中，可施用用于原位产生抗体的重组材料。技术现在可用于在动物受试者的细胞，包括例如淋巴细胞或肌细胞中表达抗体基因(参见，例如，Johnson,P.R.等，Nature Medicine(2009)15:901-907)。此类抗体的原位产生可减少制造药剂的成本，并简化了管理。通过此类方法进行的本发明的抗体的施用是本发明的另一个方面。

分泌有用抗体的人细胞(或来自任何指定物种的细胞)可使用特别地美国专利7,413,868(其内容通过引用并入本文)中描述的CellSpot^TM方法来鉴定。简言之，该方法能够在利用标记(利用微粒标记物)和显微镜观察的高通量测定中筛选获自人(或其它物种)受试者的单个细胞。在一个举例说明性实施方案中，甚至可通过使分泌的抗体吸附在表面上或偶联于表面，随后用所需的试剂(其各自偶联于独特的微粒标记物)处理所述表面，来分析单个细胞的其分泌的抗体。因此可借助于显微镜鉴定细胞的足迹。通过使用该技术，可筛选数百万的细胞的所需的抗体分泌，甚至可回收稀有抗体，诸如本文中希望用来跨株被动流感免疫的那些抗体。由于人受试者具有针对至少一些流感株的现存抗体，以及由于通过本发明的方法获得的抗体结合保守的序列，因此这些抗体用于寻址新株以及已与人群遭遇的株的目的。

获得合适的抗体的方法不限于CellSpot^TM技术，它们也不限于人受试者。产生合适的抗体的细胞可通过各种方式来鉴定，并且细胞可以是实验室动物诸如小鼠或其它啮齿类动物的细胞。可分离编码这些抗体的核酸序列和产生的多种抗体形式，包括由非人细胞产生的抗体的嵌合和人源化形式。另外，重组产生的抗体或片段包括单链抗体或它们的Fab或Fab₂区。还可使用宿主诸如具有人源化免疫系统的获得人抗体。用于产生用于筛选合适的结合特征的抗体的方法在本领域中是公知的。

类似地，用于构建具有所需结合模式的RNA适体的方式在本领域中也是已知的。

如上文中指出的，抗体或其它结合部分可结合血凝素蛋白的激活形式、无活性形式或这两种形式。在某些情况下有利的是，所述表位存在于该蛋白的裂解位点，因为其在株间相对保守，但优选结合部分结合三聚体和激活形式。

甲型流感和乙型流感的各种株的裂解位点是已知的。例如，上面引用的Bianchi等的论文在表2中显示了几个此类株的裂解位点周围的序列：

表2.甲型和乙型流感病毒成熟裂解位点的暴露于溶剂的区域的共有序列。

^a HA₁与HA₂之间的裂解的位置由箭头标示。

^b对于Victoria和Yamagata谱系共有序列是相同的。

正如所指出的，严格的共有序列始于裂解位点上游的精氨酸残基，因而本发明的测试肽中包含的优选的共有序列具有序列RGI/L/FFGAIAGFLE(SEQ ID NO:57)。有可能只在测试肽中仅使用此序列的一部分。

如上所指出的，一旦已鉴定分泌所需抗体的细胞，就可直接检索编码它们的核苷酸序列，和大规模重组地产生所需抗体。这也使得能够操作抗体，以使得它们可被产生例如为单链抗体或为仅它们的可变区，或为双特异性抗体。

所检索的核酸可被物理存储和被回收用于以后的重组生产，和/或可检索关于抗体的编码序列的序列信息并将其存储，以允许随后合成适当的核酸。编码序列中包含的信息的可得性以及快速合成和克隆技术连同已知的重组生产方法，允许在发生大流行或其它紧急情况时迅速生产所需的抗体。

以供参考，两条重链和轻链的人恒定区的序列已进行了描述并在本文示于SEQ IDNO:33-35。在上文引用的WO2011/16008和WO2013/086052中，已回收了以不同程度的亲和力与流感的各种株的HA蛋白结合的，具有确定的氨基酸序列和对应的核苷酸编码序列的可变区的各种单克隆抗体。这些抗体包括mAb53和mAb579。mAb53以特定的亲和力结合H1；此外，mAb53紧密结合H5、H7和H9。mAb579结合H3和H7。亲和力低至亚纳摩尔范围。使用在HEK293细胞表面上表达的HA验证与HA的天然三聚体的反应性。通过流式细胞术测量抗体结合。编码HA的质粒由Emory University的S.Galloway和D.Steinhauer提供，并且，在各种进化枝的细胞表面上展示的三聚体被本发明的单克隆抗体识别。

目前存在用于产生整合来自两个单独的抗体的抗原特异性结构域的单一抗体样分子(双特异性抗体)的多种技术。因此，具有非常广泛的株反应性的单一抗体可使用具有分别与组1和组2的广泛反应性的单一抗体，或与结合乙型流感组合的结合这些组之一的抗体的Fab结构域来构建。合适的技术已由Macrogenics(Rockville,MD)、Micromet(Bethesda,MD)和Merrimac(Cambridge,MA)描述。(参见，例如，Orcutt,K.D.等，“A modularIgG-scFv bispecific antibody topology,”Protein Eng Des Sel.(2010)23:221-228；Fitzgerald,J.等，“Rational engineering of antibody therapeutics targetingmultiple oncogene pathways,”MAbs.(2011)1:3(3)；和Baeuerle,P.A.等，“BispecificT-cell engaging antibodies for cancer therapy,”Cancer Res.(2009)69:4941-4944.)

因此，特别有用的是通过构建双特异性抗体来提供结合多个类型的血凝素蛋白的抗体或其它结合部分。特别有用的组合是组合mAb53(H1、H5和H9)与mAb579(H3和H7)的结合特异性的那些组合。

虽然mAb53以高亲和力与HA₀结合，但其不结合HA₁，这暗示着对互补HA₂片段的结合，所述结合已被确认。由于当通过免疫印迹测试时mAb53不结合HA₀，因此假定显性表位是至少部分构象的。

表3和表4提供了由单抗53和579显示的对于甲型流感的各种株的血凝素蛋白的KD和IC₅₀。

表3.mAb 53和579对于各种流感病毒株单体和三聚体HA的KD值。

表4.mAb 53和579对于各种流感病毒株的IC₅₀值

在MDCK单层微量中和测定中获得这些值。

本发明提供了多种具有互补上面引用的那些mAb(例如，mAb53和mAb579)的特异性的新的mAb，其包括识别乙型流感的mAb。这些另外的mAb的可用性提供了制备被动疫苗的机会，所述被动疫苗在宽范围的流感株中是有效，从而减缓治疗前对感染剂株的准确确定或诊断的需要。

对于确实是mAb的本公开的那些结合部分，正如众所周知的，特异性基本上由存在于轻链和重链的可变区中的互补决定区(CDR)决定。重链CDR的影响被理解为更加重要，而轻链的身份更加灵活。因此，mAb或片段的整体特异性通常由重链的CDR的性质决定，而存在于轻链中的CDR进行更多的变异，同时使抗体的特异性基本上相同。

除了双特异性抗体本身以外，本公开设想了在用于中和病毒感染的构建体中仅使用重链；此类抗体也可以是双特异性的。因为在本领域中应理解特异性主要由重链可变区赋予，在一些情况下，重链单独地已成功地和在本文中成功地作为疫苗中的活性成分。或者，可将具有适当的特异性的重链与各种轻链形式缔合，以增强对病毒的亲和力或中和病毒的能力。

如上文中所指出的，本发明的结合部分的特异性结合由CDR，主要是重链的那些CDR决定，但也被轻链的那些CDR互补。因此，本发明的结合部分可含有重链的3个CDR和任选地匹配其的轻链的3个CDR。本发明还包括结合与实际上含有这些CDR的结合部分所结合的表位相同的表位的结合部分。因此，例如，还包括的是具有相同结合特异性─即结合与实际上含有所述CDR的结合部分所结合的表位相同的表位的适体。因为结合亲和力也由其中将CDR排列在框架上的方式决定，因此本发明的结合部分可含有包含3个相关的CDR的重链的完整可变区以及，任选地包含与互补所述重链的轻链相关的3个CDR的完整轻链可变区。对于对单个表位具有免疫特异性的结合部分以及对于能够结合两个单独的表位的双特异性抗体或结合实体，情况亦如此。

因此，对于来源于具有合适的亲和力的抗体的可变区的结合部分，重要的氨基酸序列是排列在框架上的CDR序列，所述框架可变化而无需影响特异性或使亲和力减小至不可接受的水平。这些CDR的界定可通过本领域已知的方法来实现。具体地，用于鉴定相关CDR的最常用方法是如Wu,T.T.等，J.Exp.Med.(1970)132:211-250中和书(Kabat,E.A.,等(1983)Sequence of Proteins of Immunological Interest,Bethesda NationalInstitute of Health，第323页)中公开的Kabat的方法。另一个类似和常用的方法是在Chothia,C.等，J.Mol.Biol.(1987)196:901-917中和Chothia,C.等，Nature(1989)342:877-883中公开的Chothia的方法。另外的修饰已由Abhinandan,K.R.等，Mol.Immunol.(2008)45:3832-3839建议。本发明包括如通过这些系统的任一个系统界定的CDR。

一些批评在两个系统上已被不同工作人员平息；因此，应当理解的是，如本文中和权利要求中指定的CDR可能略有不同。只要所得的可变区保留它们的结合能力，CDR的精确位置是不重要的，并且权利要求中指定的那些区域被认为包括由任何接受的系统鉴定的CDR。

可使用标准方法和制剂将本发明的本抗体的或其它结合部分作为被动疫苗施用。通常地，通过注射(通常是肌内或皮下)施用此类疫苗，但其它施用模式决不排除，包括静脉内施用。通过适当的设计，还可口服施用疫苗。如上所指出的，正在开发的技术有望允许在人肌肉或淋巴细胞中原位生产mAb，例如，本发明的抗体也适于该生产方法。

关于制剂，使用常用的被动抗体疫苗制剂赋形剂，或可载体诸如脂质体、胶束、纳米颗粒等中施用结合部分。包括在本发明的范围内的特别有趣的方法是通过从mAb制备的纳米颗粒的吸附将结合部分附着于红细胞，如Anselmo,A.C.等，在ACS Nano.中描述的和在2013年作为10.1021/NN404853Z在线公布的。根据该技术，通过将载体颗粒或药剂或两者吸附至红血细胞上，获得至肺的优先递送，从而防止通过肝和脾中的加工造成的缩短的半衰期，并在肺中提供较高的浓度。对于流感被动疫苗这是特别合适的，可使用将结合部分附着于红细胞的各种方法。然而，根据该论文，所需的全部仅是吸附。用于增强单克隆抗体至肺的分配的其它方法也可用于增强被动疫苗的效力，诸如通过吸入递送的雾化产品。

在一些实施方案中，本发明提供了通过针对组1和组2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗体的同时施用或组合施用，有效地治疗和预防流感病毒和流感病毒感染的方法和装置。按照本发明，施用广泛中和抗体的组合，其包含广泛地针对组1甲型流感病毒的抗体或活性片段、广泛地针对组2甲型流感病毒的抗体或活性片段，和广泛地针对乙型流感病毒的抗体或活性片段。

在一些实施方案中，提供了被动疫苗、抗体组合物或抗体组合，其包含有效地针对甲型流感和乙型流感的抗体，并具有与多个株的广泛反应性。这将提供在单一剂量中有效的抗流感剂，并且可在初始症状发展时，或在暴露于流感后施用。同样地，这将绕过在施用抗体或抗体混合物之前详尽地表征感染性病毒的需要。确定流感株的诊断需要临床实验室设施，并且通常需要12-24小时的最短出报告时间，如果在选择适当的定向疗法之前需要确定流感病毒株时，则这导致治疗的不利延迟。通过利用针对甲型和乙型流感病毒株的广泛反应性组合物，治疗之前的事先株诊断不是必需的。

在一些实施方案中，提供了通过直接向呼吸道或气道施用(包括鼻内或吸入施用)抗体的组合或组合抗体组合物，有效地治疗和预防流感病毒的新型方法和方式。本发明表明中和抗体或抗体的组合至呼吸道的直接递送，包括气道递送，诸如通过吸入(IH)和/或鼻内(IN)递送和施用在较低的剂量上比相同量的相同抗体或抗体的组合的全身性施用(IV或IP)优越，更显效和更有效的。在病毒暴露或感染之前或甚至之后利用IN或IH递送的抗体进行的治疗或预防是有效的。

在一些实施方案中，提供了对于哺乳动物的流感病毒感染的治疗或预防是有效的用于气道施用的组合物，特别是吸入或鼻内组合物，特别是抗体联合组合物，所述组合物包含广泛地针对组1甲型流感病毒的抗体或活性片段、广泛地针对组2甲型流感病毒的抗体或活性片段和广泛地针对乙型流感病毒的抗体或活性片段。在第一方面，本发明提供提供了对于哺乳动物的流感病毒感染的治疗或预防是有效的吸入或鼻内组合物，其在单一单位剂量中包含病毒中和单克隆抗体的组合，其中以1mg/kg或更少的施用量将每一种抗体被包含剂量中。本发明提供了对于哺乳动物的流感病毒感染的治疗或预防是有效的吸入或鼻内组合物，其在单一单位剂量包含中和单克隆抗体的组合，其中以10mg/kg或更少的有效量施用每一种抗体。本发明提供了对于哺乳动物的流感病毒的治疗或预防是有效的吸入或鼻内组合物，其在单一单位剂量中包含流感中和单克隆抗体的组合(每一种抗体少于1mg/kg)。本发明提供了对于哺乳动物的流感病毒的治疗或预防是有效的吸入或鼻内组合物，其在单一单位剂量包含流感中和单克隆抗体的组合(每一种抗体少于0.5mg/kg)。本发明提供了对于哺乳动物的流感病毒的治疗或预防是有效的吸入或鼻内组合物，其包含抗体的组合，其中以少于0.1mg/kg的剂量施用每一种抗体。

在其它方面，本发明提供对于哺乳动物的流感病毒的治疗、预防或传播的减少是有效的吸入或鼻内组合物，其包含针对循环流感病毒株的流感中和抗体的组合。在一个方面，本发明提供了用于鼻内施用的组合物，其由针对循环流感病毒株的流感中和抗体的组合组成，特别地由甲型流感抗H1抗体、甲型流感抗H3抗体和抗乙型流感抗体组成。在一个方面，所述组合物包括有效地针对或进一步有效地针对其它流感株，包括但不限于H2、H5和H7株的甲型流感抗体。

所述组合物是适合用于和适用于流感病毒的治疗或预防。在具体的方面，所述组合物适用于减少的流感病毒传播。

在具体实施方案中，提供了包含抗体的组合的组合物，所述抗体的组合包含抗体Mab53(TRL053)、抗体Mab579(TRL579)、其抗体片段或基于其的双特异性抗体以及选自TRL847、TRL845、TRL849、TRL848、TRL846、TRL854、TRL809和TRL832的一种或多种针对乙型流感病毒的流感抗体。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含(a)第一抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQID NO:14、15、16的LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:21、22、23的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQID NO:24、25、26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；和(c)一种或多种针对乙型流感，特别地针对的Yamagata谱系和/或Victoria谱系的流感病毒中和抗体，其中所述抗体或其片段选自包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体或其片段，所述轻链氨基酸序列包含重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)(HCDR1/HCDR2/HCDR3)，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3选自由以下组成的组：SEQ IDNO:31/32/33；41/42/43；51/52/53；61/62/63；71/72/73；81/82/83；91/92/93；101/102/103；111/112/113；121/122/123；131/132/133；141/142/143；151/152/153；161/162/163；171/172/173；181/182/183；191/192/193；201/202/203；211/212/213；221/222/223；231/232/233；241/242/243；251/252/253；261/262/263；271/272/273和281/282/283，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体和所述抗体具有结合并抑制流感病毒的性质。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含(a)第一抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQID NO:14、15、16的LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:21、22、23的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)的，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:24、25、26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；和(c)一种或多种针对乙型流感，特别地针对Yamagata谱系和/或Victoria谱系的流感病毒中和抗体，其中所述抗体或其片段选自包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体或其片段，所述轻链氨基酸序列包含轻链互补决定区3(LCDR3)(LCDR1/LCDR2/LCDR3)，所述LCDR1/LCDR2/LCDR3选自由以下组成的组：SEQ ID NO:34/35/36；44/45/46；54/55/56；64/65/66；74/75/76；84/85/86；104/105/106；114/115/16；124/125/126；134/135/136；144/145/146；154/155/156；164/165/166；174/175/176；184/185/186；194/195/196；204/205/206；214/215/216；224/225/226；234/235/236；244/245/246；254/255/256；264/265/266；274/275/276和284/285/286，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体能够结合并抑制流感病毒。

在一些实施方案中，提供了组合物，其包含(a)第一抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(H CVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ IDNO:14、15、16的LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:21、22、23的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQID NO:24、25、26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；和(c)一种或多种针对乙型流感，特别地针对Yamagata谱系和/或Victoria谱系的流感病毒中和抗体或片段，其中所述抗体或其片段选自包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体或其片段，所述轻链氨基酸序列包含重链和轻链CDR序列HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO:31/32/33/34/35/36；41/42/43/44/45/46；51/52/53/54/55/56；61/62/63/64/65/66；71/72/73/74/75/76；81/82/83/84/85/86；91/92/93/94/95/96；101/102/103/104/105/106；111/112/113/114/115/116；121/122/123/124/125/126；131/132/133/134/135/136；141/142/143/144/145/146；151/152/153/154/155/156；161/162/163/164/165/166；171/172/173/174/175/176；181/182/183/184/185/186；191/192/193/194/195/196；201/202/203/204/205/206；211/212/213/214/215/216；221/222/223/224/225/226；231/232/233/234/235/236；241/242/243/244/245/246；251/252/253/254/255/256；261/262/263/264/265/266；271/272/273/274/275/276和281/282/283/284/285/286，或在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体能够结合并抑制流感病毒。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含(a)第一抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的抗体或其片段的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:14、15、16的LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；(b)第二抗体或其抗原结合片段，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:21、22、23的HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链可变区(HCVR)，和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有SEQ ID NO:24、25、26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链可变区(LCVR)；和(c)一种或多种针对乙型流感，特别地针对Yamagata谱系和/或Victoria谱系的流感病毒中和抗体或片段，其中所述抗体或其片段选自包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列的抗体或其片段，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR序列对：39/40、49/50、59/60、69/70、79/80、89/90、99/100、109/110、119/120、129/130、139/140、149/150、159/160、169/170、179/180、189/190、199/200、209/210、219/220、229/230、239/240、249/250、259/260、269/270、279/280和289/290。

在一些实施方案中，可将用于气道(诸如IN递送和施用)的中和抗体与非中和抗体组合。本申请表明，可将IN施用与其它可选择的施用途径(包括IP或IV施用)组合，以给予总体和组合增强的功效。如本文中所提供的，抗体的组合的IN和IP施用对比单独的IN或IP施用给出了增强的协同活性和功效。除了提供替换或替代施用或治疗方法以外，本发明还提供为抗体介导的疗法和预防提供了增强的组合方法，其中将肺部施用与全身性施用组合以获得最高功效。

在一些实施方案中，抗体通过肺部施用的抗体给药的替代方式允许较低的给药、较低的剂量制剂，和有效的广谱抗流感抗体联合组合物。

在一些实施方案中，中和流感病毒并且有效地针对流感病毒的结合分子，特别是人单克隆抗体或其片段的组合，其中所述组合有效地针对组1甲型流感病毒、组2甲型流感病毒和乙型流感病毒。抗体的组合在针对甲型和乙型流感病的治疗或预防中是有效的，从而在单一组合物或剂量中提供了针对所有相关和循环流感病毒的有效试剂。

本发明提供了组合物，其包含流感单克隆抗体或其片段的组合或由所述组合组成，所述组合物在组合地治疗或预防甲型流感和乙型流感中是有效的。

该联合组合物可被施用来有效地针对未表征和未定义的流感感染。在本发明的具体方面，将所述联合组合物直接施用于呼吸道，包括通过鼻内或吸入施用。具体地，以单个剂量施用该抗体组合或混合物，或可在多轮给药中，或在每一种抗体的依序施用中施用所述抗体组合或混合物。因此，所述抗体混合物与单一特别所定的抗体针对确定的目标流感一样有效地针对任何未知的或未确定的循环流感病毒。例如，混合物的施用与单一特异性抗H1病毒抗体一样有效地抗任何给定的组1H1病毒。

在一些实施方案中，组合的抗体具有使它们在组合中有效以及特别适用和有用的某些特性和方面。在具体的方面，本组合的抗体各自和全部显示显著的对流感病毒的结合和亲和力。

在一些实施方案中，可将组合的抗体与其它抗体共配制、混合，或施用依序施用，以治疗范围广泛的流感样疾病，包括病原体诸如RSV、PAIV或MPV。

在一些实施方案中，有效组合中的每一种抗体显示对多种流感株的纳摩尔或亚纳摩尔的亲和力。这是对比其它已知或现有抗体为不同的和特别有用的以及适用的方面。例如Mab53和Mab579显示分别对各种H1(还有H5)或H3(还有H7)株的纳摩尔或亚纳摩尔的亲和力，显示出相对于CR6261和CR8020显著更大的结合亲和力(WO2013/086052)。本组合的抗乙型流感抗体类似地显示对Yamagata和Victoria进化枝的乙型流感病毒株的纳摩尔或亚纳摩尔的结合亲和力。

在一些实施方案中，本公开的组合方面的抗体被设计和选择来具有相似的生物物理性质，包括等电点(pI)。在一些实施方案中，被选择用于组合成组合物的抗体各自表现出在彼此的±2pI点内、彼此的±1.5pI点内、彼此的±1.0pI点内或彼此的±0.5pI点内的pI。

在一些实施方案中，本公开的组合方面的抗体被设计和选择来具有相似的生物物理性质，诸如强劲的热稳定性。在一些方面，提供了当在≥50℃、≥55℃、≥60℃、≥65℃或≥70℃的PBS中进行时在解链曲线测定中显示第一解链温度(Tm1)的抗体。

在一些实施方案中，优选地设计和表达具有相似或可比较的恒定区序列的抗体，并且所述抗体优选地为选自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3或IgG4的相同IgG。在循环中提供较长的半衰期的经修饰的Fc序列在本领域中也是已知的。

在一些实施方案中，提供了包含人IgG1恒定区氨基酸序列的抗乙型流感抗体。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:297的人IgG1恒定区氨基酸序列抗乙型流感抗体。在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:295的人轻链κ恒定区或SEQ ID NO:296的人轻链λ恒定区的抗乙型流感抗体。

在一些实施方案中，提供了包含含有SEQ ID NO:297的人IgG1恒定区的抗乙型流感抗体的抗体组合物。在一些实施方案中，提供了包含含有SEQ ID NO:295的人轻链κ恒定区或SEQ ID NO:296的人轻链λ恒定区的抗乙型流感抗体的抗体组合物。

在一些实施方案中，提供了包含一种或多种抗甲型流感抗体和一种或多种抗乙型流感抗体的组合的组合物。在一些方面，组合中的抗体表现出选自低至无抗体聚集、不存在分子间缔合和/或不存在竞争结合的一个或多个性质。这些方面在本组合的抗体中得以证明和举例说明。

本发明涉及用于通过以下方式有效地治疗和预防流感病毒感染的新型方法、方案和方式：向气道或呼吸道施用本抗体混合物(诸如通过一种或多种中和抗体的鼻内或吸入施用)。流感病毒中和抗体的鼻内或吸入施用比可选择的施用方式诸如IP施用更有效地治疗性或预防性治疗或阻断病毒。吸入和/或鼻内递送和施用在较低的剂量上比以相同量的相同抗体或抗体的组合的全身性施用(IV或IP)优越，更显效和更有效。在病毒暴露或感染之前或甚至之后利用IN递送的一种或多种抗体的治疗或预防是有效的。

将抗体的肺剂量与抗体的全身性剂量组合的方法或方案特别有效地治疗性或预防性地针对流感病毒。此类方法或方案包括其中将一个或多个抗体的鼻内或吸入剂量与一个或多个抗体的IP或IV剂量组合。可在IP或IV剂量之前、之后、与其同时或与其依序地施用鼻内或吸入剂量。可施用一个或更多鼻内、吸入、IP或IV剂量或多个剂量。鼻内施用的抗体可以是不存在Fc或效应子功能的抗体片段，诸如Fab，然而IP施用的抗体可具有效应子功能或增强的效应子功能。

根据本公开，向气道或呼吸道施用中和抗体以增强针对病毒(特别是流感病毒)的功效。向气道或呼吸道的施用可以是通过任何公认的或已知的方法，并且可包括吸入施用或鼻内施用。为了增强功效，将抗体递送至上呼吸道和下呼吸道的一个或多个，并且所述呼吸道可包括鼻腔、鼻、窦、喉咙、咽、喉、气管、支气管和肺。

“吸入”是指摄取，特别是在摄取或施用/被施用试剂或化合物，包括抗体或其活性片段物，或包含此类抗体或其活性片段的组合物的上下文中，其中将试剂、化合物、抗体、片段(包括如组合物中包含的)递送至呼吸道的全部或部分。呼吸道可包括上和/或下呼吸道。上呼吸道包括鼻、鼻腔、窦、喉、气管。下呼吸道包括肺、气道(支气管和细支气管)和气囊(肺泡)。吸入可经由鼻或口，或经由至下呼吸道的直接递送(如在气管内施用中)发生。因此，吸入可仅或主要包括鼻、鼻内、经由口的吸入、口腔吸入、气管内吸入、气管内滴注。因此吸入提供和设想了籍以使药物、试剂、组合物、抗体、片段专门地、特异性地或优先地到达或沉积在呼吸道(包括上和/或下呼吸道)上或其中的任何施用方式。

如本文中所用，术语“鼻内”包括，但不限于，在鼻或鼻结构或气道内或经由鼻或鼻结构或气道递送(例如通过吸入)的给药、施用或发生。如本文中所用的和如在实施例中作为实施方案举例的术语鼻内不旨在限于或暗示限于直接或专门地或仅仅经由鼻或鼻腔的施用，特别地用来排除籍以将药物、试剂、抗体、片段、组合物递送至或另外地提供至呼吸道、沉积在呼吸道中或其上或以其它方式分配至呼吸道的其它施用方式。

用于向呼吸道或气道施用或递送的装置在本领域技术人员中以及临床或医学实践中是已知的和被承认的，并且可适用于本发明的方法、方案和组合物。装置包括计量剂量吸入器、计量喷雾泵、手工灯泡雾化器、小或大体积喷雾器、超声喷雾器和干粉吸入器。

本文公开的实施方案例已应用和用于特别地治疗或预防靶向、感染或影响呼吸道的因子或病原体。这些病毒可表现出顶端复制，从而允许易感性被肺部递送的mAb或其片段中和，这随后可导致相较于全身性递送提高的功效。因此，本实施方案已应用和用于治疗或预防呼吸道感染，特别是呼吸道病毒，和与呼吸系统疾病相关或与其因果相关的因子。常见病毒性呼吸道疾病是由多种具有相似性状和影响上呼吸道的病毒引起的疾病。所涉及的病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和呼吸道腺病毒。副流感病毒是幼儿的哮吼的主要原因，其可引起支气管炎、肺炎和毛细支气管炎。腺病毒主要侵入呼吸道和胃肠道以及眼睛的结膜。腺病毒可引起从咽炎至肺炎、结膜炎、腹泻的多种疾病。症状可在暴露于病毒后1-10天出现。

用于治疗或缓解病况(癌症、炎性病况、抗病毒、抗感染)的抗体的临床施用已专门使用全身性施用，通常IV施用，这需要大量和昂贵的抗体，医务人员的协助以及用于施用的大量时间(常用IV剂量持续2小时)。然而可提及其它施用方式，诸如鼻内，特别是在涵盖这些抗体的专利或申请，鼻内施用充其量被视为等效替代方案，被完全忽略，或未被追寻，可能是因为其不太被理解，被认为缺乏吸引力或不太有效，并被认为间接地或不如IP或IV施用途径直接地激活免疫系统。然而，本文中提供的本发明和不寻常的研究表明，鼻内施用确实是优选的，更有效的替代方案，特别是对于中和抗体。具体地，可在初始病原体损伤或暴露的部位或位置上作用的中和抗体比替代施用模式更有效。因此，出当通过肺途径施用时相较于全身性途径，靶向流感的中和抗体表现出部分地通过不同的作用机制带来的功效的显著差异。

气道施用为递送有效的低剂量和低成本的疗法提供了独特的机会，所述疗法从而不需要通过诊断测定来确认。流感流行季节期间的症状表现将足以使医生施用该低剂量的混合物，例如作为干粉吸入器或作为雾化器或经由其它气道递送方法。该无诊断护理标准是Tamiflu和Relenza的目前实践，但不可能用于昂贵的静脉抗体疗法，所述疗法是不实际的并且成本过高。在随防诊断后，可通过全身性，诸如静脉内途径或通过气道施用高剂量抗体的施用，可将所述高剂量抗体的施用组成混合物或组成对于流感类型是特异的独立的特异性抗体。

因此，根据本发明，抗体的肺部递送相较于全身性途径诸如IV或IP途径提供了惊人和显著的功效提高。此外，增强的鼻内功效通过具有中和作用的抗体来证明。非中和抗体，特别是通过使用接受的或已知的中和测定或病毒阻断，不显示对流感病毒的直接抑制或阻断的抗体，当被鼻内对比全身性或IP施用时，表现出受损的功效。本研究表明，通过使用公认的和已知的流感小鼠模型，中和抗体的鼻内(IN)递送可相较于腹膜内(IP)或静脉内(IV)施用途径使治疗和预防功效增强至超过10倍。当通过IN而非通过IV或IP途径给予时，可使用少于1/10的相同剂量获得可比较的功效。向气道施用(诸如鼻内)的中和抗体可按数据级使治疗功效增强10至100倍或至少10至100倍。相较在相似的条件下相同抗体的腹膜内(IP)施用，鼻内施用的中和抗体可使治疗功效显著增强至少10倍，至少50倍，超过10倍，超过50倍，超过100倍，高达100倍。中和抗体的鼻内施用提供了预防和治疗感染，特别地包括流感感染的新型和意料之外的方法。IN施用现可用其它施用形式来有效地补充和组合，以提供更有效的和成本更低的方法来进行治疗和预防。气道施用，包括IN施用，使得单个剂量中的抗体的组合或混合物能够具有针对任何预期的流感病毒的功效。

组合物

根据本公开，提供了具有针对流感的用途和有效性的抗体联合组合物。当直接向气道施用(诸如鼻内)时，所述抗体联合组合物在低剂量上是有效的。所述组合物特别地包含了抗体，特别是中和抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段，特别是抗病毒抗体，特别是流感抗体的组合。将可中和不止一种类型或亚型的流感的一种或多种中和抗体与中和不同类型或组的流感的抗体组合。本发明的组合物特别地包含针对循环流感病毒株的流感中和抗体的组合。组合物特别地包含针对循环流感病毒株的流感中和抗体，特别是抗甲型流感和抗乙型流感抗体的组合。组合物特别地包含流感中和抗体的组合，所述组合共同针对适当和相关的循环流感病毒株，特别地共同针对甲型流感H1和H3亚型和针对Yamagata和Victoria谱系的乙型流感。所述一种或多种组合物可包含3种或更多种中和抗体，只要甲型和乙型流感病毒被所述组合或抗体中和。

组合物特别地可包含针对循环流感病毒株流感的中和抗体，特别是甲型流感抗H1抗体、甲型流感抗H3抗体和抗乙型流感抗体的组合。组合物可包含有效地针对或进一步有效地针对流感H5和H7病毒株的甲型流感抗体。所述流感抗体可以是株特异性或非特异性的，并且可中和甲型流感，包括H1亚型和/或H3亚型和/或H5和/或H7或其它甲型流感病毒株或亚型，和/或可中和乙型流感，包括Yamagata和/或Victoria谱系。所述组合物可具有相同的组分或不同组分或添加剂组分作为抗体的替代施用组合物(诸如IV或IP)。

在一些实施方案中，提供了包含中和抗体或其片段，包括Fab片段的组合物。本发明的组合物可包含流感病毒中和抗体，特别是组1抗体TRL053/Mab53、组2抗体TRL579/Mab579和选自TRL847、TRL845、TRL849、TRL848、TRL846、TRL854、TRL809和TRL832的B抗体、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合形式以及具有其重链和轻链CDR的抗体的组合。

所述病毒中和抗体可以特别地是能够中和的抗体片段。在一个方面，所述抗体片段不存在Fc和/或不存在或具有降低的效应子功能。所述抗体片段可选自Fab、Fab'和F(ab’)₂。所述病毒中和抗体或片段可来源于重组蛋白，可被重组表达(包括作为活性片段)，或可通过其它方式或方法衍生或产生，包括在气道或呼吸道内提供中和抗体或片段的方式或方法，包括通过遗传物质或DNA或DNA载体的表达，诸如通过递送编码其中和抗体或片段的DNA或RNA。

本发明的组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。所述组合物可包含适于或适合用于鼻或肺部递送和用于鼻内或吸入施用的赋形剂、载体、稀释剂或添加剂。所述组合物可包含适于或适合用于刺激或增强免疫应答和/或抗体介导的细胞或全身性效应的赋形剂、载体、稀释剂或添加剂。所述组合物可包含免疫应答的免疫学介质或刺激剂。

本发明提供了用于治疗、预防或减少或抑制病毒尤其是流感病毒的传播的方法。本发明提供了用于治疗或预防暴露于流感病毒，已接触流感病毒或遭受流感病毒的哺乳动物的病毒感染的方法，所述方法包括向哺乳动物的气道施用(诸如鼻内(IN)或经由吸入至所述哺乳动物)如本发明中提供的抗体的组合。在特定的方面，所述组合包含组1抗体TRL053/Mab53、组2抗体TRL579/Mab579和选自TRL847、TRL845、TRL849、TRL848、TRL846、TRL854、TRL809和TRL832的B抗体、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合形式以及具有其重链和轻链CDR的抗体。

在该方法的一个方面，组合物组合中的单克隆抗体都是相同的IgG亚型，并且具有相同或几乎相同的恒定区序列。在具体的方面，组合中的所有抗体均为IgG1抗体。

根据本方法，可在感染后或假定的感染、暴露后或临床症状表现后施用所述抗体组合。在其一个方面，可在达感染后8小时的时期中施用所述抗体结组合。或者，在达感染后24小时的时期中施用所述抗体组合。在另外的替代方案中，在达感染后48小时的时期中施用所述抗体组合。在另外的替代方案中，在达感染后72小时的时期中施用所述抗体组合。可将抗体组合，包括作为单个剂量，或在多个依序的剂量中，在达感染后8小时(8hpi)、12hpi、18hpi、24hpi、36hpi、48hpi、72hpi、感染后1天、感染后2天、感染后3天、感染后4天、感染后5天、感染后6天、感染后7天、感染后1周、感染后10天、感染后2周、感染后3周、感染后4周、感染后1个月、感染后数月进行施用。

以单个剂量施用或以3个单独的剂量同时或几乎同时施用所述抗体组合，以确保如所述组合中必需的任一种抗体在施用时是有效的。

在一些实施方案中，提供了以任何比例包含2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种抗体的组合的组合物。在一些实施方案中，提供了组合物，其以按重量计每组合物中的总抗体或片段重量约10-80wt％、20-50wt％、25-40wt％的每一种抗体或片段，包含2-10种或3-5种抗体或片段。在具体实施方案中，提供了组合物，其以每组合物中的抗体或片段的总重量约33wt％±3wt％的第一、第二和第三抗体或片段的每一种，包含基本上等剂量或比例的第一、第二和第三抗体或片段。在特别优选方面，以基本上相等的剂量比，以相同的剂量量或以1:1:1的重量比或等比例施用组合中的抗体。

在一些实施方案中，提供了包含2-20种抗体的组合物，其中组合中的每一种抗体的单个剂量有效量可少于10mg/kg体重、少于5mg/kg体重、少于2mg/kg体重、少于1mg/kg体重或更少。组合中的每一种抗体的单个剂量量可少于1mg/kg体重、少于0.5mg/kg、少于0.1mg/kg、少于0.05mg/kg。可施用多个剂量或抗体组合。每一个组合可相同或剂量可不同，诸如初始较高的剂量，随后较低的剂量，或初始较低的剂量，随后较高的剂量。单个剂量或多个剂量或任何剂量可少于1mg/kg体重、少于0.5mg/kg、少于0.1mg/kg、少于0.05mg/kg。初始剂量可大于1mg/kg，并且进一步或随后的剂量可较低或可少于1mg/kg。

可以以多个剂量将抗体施用(诸如鼻内或经由吸入)至呼吸道，其中每一个单个组合剂量中的每一种抗体少于1mg/kg/剂量。在这样的方面，可以以至少2小时的间隔和在假定的感染、暴露或临床症状表现后达72时或更晚施用多个剂量。因此，可以以数分钟或数小时或数天的间隔施用抗体剂量。可感染后或假定的感染或暴露后，以数小时或数天的间隔施用抗体剂量。可在感染后或假定的感染或暴露后和达2、4、6、8、12、24、36、48或72小时后施用抗体剂量。

本发明的施用方案或方法可特别地包括与第二或一个或多个另外的施用(所述施用不通过吸入或鼻内途径，例如全身性施用，诸如IP或IV施用)组合的抗体至气道或呼吸道的第一施用(特别地通过抗体的吸入或鼻内施用)，或在所述第一施用之后进行所述第二或一个或多个另外的施用。因此所述方法可包括病毒特异性单克隆抗体的另外的IP或IV施用，其中另外施用的所述抗体是中和或非中和抗体。在该情况下，可利用发明的抗体的组合作为初始剂量，随后施用针对感染的病毒亚型(包括如通过临床或诊断分析测定的)的单一抗体的剂量。因此，抗体的组合的第一次剂量是初步有效的，而不论流感病毒的类型。一旦病毒类型被确定，就可施用第二或另外剂量的组合、改变了比率的组合、单一定向抗体。可向气道施用(诸如IH或IN)所述第二或另外的剂量，或可全身性施用所述第二或另外的剂量。全身性(诸如IP或IV)另外施用的抗体可以是与通过IN或经由吸入施用的抗体相同的或改变的抗体。可与IN或吸入施用的抗体同时地、依序地或在其之后施用附加施用(例如经由IP或IV)的抗体。任何此类随后施用可以是数小时后，可以是2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或长达24小时后。随后施用可是数天后，可以是1天、2天或3天后。随后施用可以是数天后，可以是长达7天、1周后或数周后。随后施用可以是以单个剂量或多个剂量在数小时和/或数天和/或数周后进行。

在其它方面，本发明提供了用于施用针对甲型流感和乙型流感病毒的抗体的组合的方案，其包括施用第一气道剂量(诸如鼻内或吸入剂量)的本发明中提供的抗体的组合，随后或同时施用第二剂量，或一个或多个附加剂量的抗体(所述抗体不被施用至气道或呼吸道，并且可通过腹膜内或静脉内施用)，其中所述第二剂量或附加剂量的抗体是与所述第一剂量的组合中的抗体相同或不同的抗体。所述第二剂量或附加剂的抗体可以是被改变或修饰来成为更有效或更显效的IV或IP的改变的或经修饰的抗体。在一个方面，所述第一剂量抗体可以不存在效应子功能，诸如Fab抗体，并且所述第二剂量的抗体可具有效应子功能，具有Fc，或可被修饰来具有增强的效应子功能。

所述方案可包括经由吸入或鼻内途径的多个剂量的本发明的抗体组合，并且可包括经由IP或IV途径的多个剂量的相同组合、所述组合的一种或多种抗体，或替代抗体。在方案的一个方面，可监测被施用抗体的受试者或患者的诸如疾病或病毒感染的临床表现，并且可根据患者或受试者以及感染或疾病的状态，改变、减少或增加剂量或多个剂量，或以更密或更疏的间隔施用所述剂量。

在所述方案的一个方面，所述流感病毒可以是甲型流感病毒或乙型流感病毒或未知的或未确定的流感病毒。不向呼吸道施用的所述第二剂量的抗体可以是中和或非中和抗体，并且可具有效应子功能或增强的效应子功能。

在所述方案的一个方面，第一鼻内或吸入剂量可包含各自少于1mg/kg、少于0.5mg/kg、少于0.1mg/kg的本发明的组合抗体。特别地以比所述第一鼻内或吸入剂量高的剂量施用所述第二或另外的IP或IV剂量。特别地以为所述第一鼻内或吸入剂量至少10倍的每一种或任一种抗体的量的剂量施用所述第二或另外的IP或IV剂量。所述第二或另外的IP或IV剂量可以是至少1mg/kg，至少5mg/kg，至少10mg/kg，至少15mg/kg，或大于10mg/kg，或大于20mg/kg或大于50mg/kg。

在所述方案的其它方面，所述第一鼻内或吸入剂量可少于1mg/kg的组合中的每一种抗体，并且所述第二IP或IV剂量按mg/kg计为所述第一鼻内剂量的至少10倍。在所述方案的其它方面，所述第一鼻内或吸入剂量可少于1mg/kg的组合中的每一种抗体，并且所述第二IP或IV剂量按mg/kg计为所述第一鼻内剂量的至少50倍。在另外的方面，所述第一鼻内或吸入剂量可少于0.5mg/kg的组合中的每一种抗体，并且所述第二IP或IV剂量为至少5mg/kg。

所述第一鼻内或吸入剂量中的组合中的每一种抗体的剂量可以是10mg/kg或少于10mg/kg，并且在假定的感染、暴露或临床症状表现后24小时内进行施用。所述第一鼻内或吸入剂量中的组合中的每一种抗体的剂量可以是10mg/kg或少于10mg/kg，并且在假定的感染、暴露或临床症状表现后48小时内进行施用。所述第一鼻内或吸入剂量中的组合中的每一种抗体的剂量可以是10mg/kg或少于10mg/kg，并且在假定的感染、暴露或临床症状表现后72小时内进行施用。

本发明的另一个方面是用于抑制呼吸道病毒传播的方法，所述方法包括向呼吸道(诸如鼻内或经由吸入)施用本发明的抗体的组合，向暴露于流感病毒感染，处于对所述流感病毒感染的暴露的风险中或显示所述流感病毒感染的临床体征的受试者施用本抗体的组合，其中以1mg/kg或更少的单位剂量施用每一种抗体。组合中的每一种抗体的单位剂量可少于10mg/kg或少于1mg/kg。所述方法的单位剂量可少于0.5mg/kg或少于0.1mg/kg或少于0.05mg/kg。

本发明提供了适于或被选择用于肺部施用的抗体联合组合物，或抗体(特别是流感抗体，尤其是单克隆流感抗体)的组合的组合物，其中所述抗体的组合包含，包括针对由季节性和大流行亚型组成的株的抗体，或由所述抗体组成。例如，因为季节性流感循环病毒株目前为乙型流感(Yamagata谱系)、乙型流感(Victoria谱系)、甲型流感H1亚型和甲型流感H3亚型，因此提供了具有或包含针对乙型流感(Yamagata)、乙型流感(Victoria)、甲型流感H1亚型和甲型流感H3亚型的每一种的一种或多种抗体的本发明的联合组合物。本发明包括将其它抗体掺入混合物来提供对其它亚型例如H7亚型的额外特异性覆盖。

在一些实施方案中，提供了组合物，其包含组1抗体TRL053/Mab53、组2抗体TRL579/Mab579和选自TRL784、TRL794、TRL798、TRL799、TRL809、TRL811、TRL812、TRL813、TRL823、TRL832、TRL833、TRL834、TRL835、TRL837、TRL839、TRL841、TRL842、TRL845、TRL846、TRL847、TRL848、TRL849、TRL851、TRL854、TRL856和TRL858的一种或多种抗乙型流感抗体、其免疫反应性片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合形式以及具有其重链和轻链CDR的抗体的组合。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含组1抗体TRL053/Mab53、组2抗体TRL579/Mab579和选自TRL845、TRL846、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的B抗体或其免疫反应性片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合形式以及具有其重链和轻链CDR的抗体的组合。

在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含组1抗体TRL053/Mab53、组2抗体TRL579/Mab579和选自TRL845、TRL847和TRL849的B抗体或或其免疫反应性片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合形式以及具有其重链和轻链CDR的抗体的组合。在一些实施方案中，提供了抗流感组合物，其包含流感单克隆抗体或其结合片段的组合，所述抗体或其片段包含：(a)抗体或其片段，其包含含有SEQ ID NO:11、12、13的HCDR1/HCDR2/HCDR3的CDR结构域序列的重链氨基酸序列，和包含SEQ ID NO:14、15、16的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链氨基酸序列；(b)抗体或其片段，其包含含有SEQ ID NO:21、22、23的CDR结构域序列HCDR1/HCDR2/HCDR3的重链氨基酸序列，和包含SEQ ID NO:24,25,26的CDR结构域序列LCDR1/LCDR2/LCDR3的轻链氨基酸序列；和(c)抗体或其片段，其包含分别含有重链和轻链CDR结构域序列HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3分别选自：

(i)SEQ ID NO:71、72、73，和SEQ ID NO:74、75、76；

(ii)SEQ ID NO:91、92、93，和SEQ ID NO:94、95、96；

(iii)SEQ ID NO:101、102、103，和SEQ ID NO:104、105、106；

(iv)SEQ ID NO:121、122、123，和SEQ ID NO:124、125、126；

(v)SEQ ID NO:181、182、183，和SEQ ID NO:184、185、186；

(vi)SEQ ID NO:191、192、193，和SEQ ID NO:194、195、196；

(vii)SEQ ID NO:201、202、203，和SEQ ID NO:204、205、206；

(viii)SEQ ID NO:211、212、213，和SEQ ID NO:214、215、216；

(ix)SEQ ID NO:221、222、223，和SEQ ID NO:224、225、226；

(x)SEQ ID NO:231、232、233，和SEQ ID NO:234、235、236；

(xi)SEQ ID NO:241、242、243，和SEQ ID NO:244、245、246；

(xii)SEQ ID NO:261；262、263，和SEQ ID NO:264、265、266；和

(xiii)SEQ ID NO:271、272、273，和SEQ ID NO:274、275、276。

本发明设想和例举了在一个或多个CDR结构域序列中包含1至3个氨基酸取代的其高度同源变体，所述变体能够结合并抑制流感病毒，其中所述组合物有效地针对组1和2甲型流感病毒以及乙型流感病毒。

在具体实施方案中，提供了组合物，其包含选自以下抗体的抗体的组合：(a)包含分别为SEQ ID NO:11、12、13和SEQ ID NO:14、15、16的重链和轻链CDR序列，HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；包含分别为SEQ ID NO:21、22、23和SEQ IDNO:24、25、26的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段，和包含分别为SEQ ID NO:201、202、203和SEQ ID NO:204、205、206的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；(b)包含分别为SEQ ID NO:11、12、13和SEQ ID NO:14、15、16的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；包含分别为SEQ ID NO:21、22、23和SEQ ID NO:24、25、26的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段，和包含分别为SEQ ID NO:221、222、223和SEQ ID NO:224、225、226的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的体或其片段；(c)包含分别为SEQ ID NO:11、12、13和SEQ ID NO:14、15、16的重链和轻链CDR序列，HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；包含分别为SEQ ID NO:21、22、23和SEQ ID NO:24、25、26的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段，和包含分别为SEQ ID NO:231、232、233和SEQ ID NO:234、235、236的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；(d)包含分别为SEQID NO:11、12、13和SEQ ID NO:14、15、16的重链和轻链CDR序列，HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；包含分别为SEQ ID NO:21、22、23和SEQ ID NO:24、25、26的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段，和包含分别为SEQ IDNO:241、242、243和SEQ ID NO:244、245、246的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；或(e)包含分别为SEQ ID NO:11、12、13和SEQ ID NO:14、15、16的重链和轻链CDR序列，HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段；包含分别为SEQ IDNO:21、22、23和SEQ ID NO:24、25、26的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段，和包含分别为SEQ ID NO:261、262、263和SEQ ID NO:264、265、266的HCDR1/HCDR2/HCDR3和LCDR1/LCDR2/LCDR3的抗体或其片段。

在一些实施方案中，组合中的抗体可针对不止一种流感株或亚型，诸如图3中指示的和本文中显示的。抗体Mab53有效地针对组1和2的甲型流感H1、H9、H7和H5亚型。抗体Mab579有效地针对H3和H7亚型。因此，虽然目前循环流感株是H1、H3和B亚型，但可产生以及在本文中提供具有针对另外的株和亚型，包括可在新的或单流个感季节发生和出现的亚型的功效的组合。

所述组合物可被特别地配制或含有比任何替代剂量或施用形式诸如IP或IV低的剂量或量的抗体。因此，用于本发明的组合物可包含对比或相较于用于替代施用特别地IP或IV施用的其组合物，减少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、大于10倍、大于100倍的量的中和抗体。

在一些实施方案中，提供了组合物，其以按哺乳动物的体重计少于1mg/kg的量包含一定剂量的意欲用于肺部施用，特别地鼻内施用的每一种抗体。在一些实施方案中，提供了组合物，其包含总计达按人的体重计少于10mg/kg、少于5mg/kg或少于1mg/kg的施用的抗体。本发明的组合物可特别地以按哺乳动物(包括临床相关哺乳动物，诸如猪、狗、马、猫或人)的重量计少于1mg/kg、少于0.5mg/kg、少于0.1mg/kg、少于0.05mg/kg、少于0.01mg/kg、少于0.005mg/kg、少于0.0025mg/kg、少于0.001mg/kg的量包含一定剂量的旨在用于施用(特别地鼻内)的抗体。在一些实施方案中，治疗有效剂量选自约100mg/kg、50mg/kg、10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg或1mg/kg。在一些方面，有效预防剂量或暴露后预防剂量选自约1mg/kg/0.1mg/kg或约0.01mg/kg。

本领域技术人员可包括基于动物模型中的功效以及考虑到临床和生理反应，在哺乳动物(包括人)中测定病毒载量和病毒传播速度、适当的和有效的剂量。因此，本发明和给药参数不受限于本文提供的实例或所例举的特定剂量。本发明表明吸入或鼻内给药就功效而言和在减少、限制或阻断病毒感染(包括流感病毒感染)的临床表现的效应中是优选替代方案。中和抗体的吸入或鼻内施用提供了对比其它施用途径，包括IP或IV，未曾被预期或预测的提高和增强的功效。通过肺部递送产生的增强的功效允许将多种mAb掺入混合物，使得能够开发用于所有流感类型/亚型的混合物的可行性。通过IN或吸入途径的给药的量和时间安排可由本领域技术人员进一步评估和确定。本文中提供的研究表明IN或吸入施用在较低的剂量上对比IP或IV更有效，以及施用可在感染后数天进行，并且仍然保持功效。

本文中应用和显示的剂量和剂量范围可视情况而定，由本领域技术人员或临床或医学专业人员使用本领域中已知的参数进行转换或应用。因此，小鼠中的mg/kg给药可被外推至对人或其它动物的可比较或合理地等效的给药。例如，实验室小鼠的平均重量为20g，然而人的平均重量为70kg。

临床研究中的例行做法是将动物剂量转换成人剂量，以及本领域技术人员会强烈期望此类转换的剂量在人中可成功。已描述了种间缩放和预测人中的药代动力学参数(例如，Mahmood等(2003)J Clin Pharmacol 43:692-697；Mordenti(1986)Journal ofPharmaceutical Sciences,75:1028-1040)。例如，治疗水平通常被假定与毒性平行，因此用于将动物毒性转换成人毒性的转换系数通常用于将动物中的最小有效剂量转换成人中的最小有效剂量。另外，FDA提供了“行业指南”，其为在临床试验中评估治疗剂的最大安全起始剂量提供了转换系数，包括用于将动物(小鼠)剂量转换成人剂量的系数(诸如在一个情况下将小鼠剂量乘以0.08)。

短语“药学上可接受的”是指是当向人施用时，生理上可耐受的并且通常不产生过敏或类似的不良反应，诸如胃难受(gastric upset)、眩晕等的分子实体和组合物。

本发明还设想了用于实施本发明的治疗方法的治疗性组合物。主题治疗性组合物在混合物中包括药学上可接受的赋形剂(载体)和作为活性成分的一种或多种抗体或其活性片段，特别是中和抗体、其肽类似物或其片段(如本文中描述)。在优选实施方案中，所述组合物包含能够在靶细胞内或在受试者或患者中中和病毒，特别是流感病毒的抗体或片段。

含有抗体、多肽、类似物或活性片段作为活性成分的治疗性组合物的制备在本领域中是公知的。通常地，制备作为液体溶液或悬浮液用于施用的此类组合物，然而还可制备适合在施用之前于液体中形成溶液或悬浮液的固体形式。还可乳化制剂。通常将活性治疗成分与药学上可接受的并与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或其组合。另外，如果需要，所述组合物可含有少量的辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，其增强活性成分的功效。

可将抗体、多肽、类似物或活性片段作为中和药学上可接受的盐形式配制成治疗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽或抗体分子的游离氨基形成的)，其可用无机酸诸如，例如盐酸或磷酸或这样的有机酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等来形成。由游离羧基形成的盐还可由无机碱诸如，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生。

常规地施用(如例如通过单位剂量的施用)所述含治疗性抗体、多肽、类似物或活性片段的组合物。术语“单位剂量”，当用于指本发明的治疗性组合物时，是指适合作为用于人的单位剂量的物理上分离的单位，每个单位含有经计算产生与所需稀释剂即载体或媒介物相关联的所需治疗功效的预定量的活性物质。

在一些实施方案中，载体选自本领域中已知的适于肺部施用的任何载体。在一些实施方案中，载体是被选择用于鼻内施用的合适的载体，例如，如在Csaba等，Adv DrugDeliv Rev.2009,61(2):140-157(其通过引用并入本文)中公开的。在一些实施方案中，载体是纳米或微颗粒系统。在一些实施方案中，载体选自，或包含以下物质的一种或多种：可降解的淀粉、可溶性淀粉、聚苯乙烯、葡聚糖、壳聚糖、微晶纤维素(MCC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、卡波姆、974P、麦芽糖糊精蜡样玉米淀粉、藻酸盐、聚(乙烯醇)、明胶聚合物、涂覆有亲水性聚乙二醇包衣的聚乳酸纳米颗粒(PEG-PLA纳米颗粒)(Vila等，J Aerosol Med 2004；17(2):174-185)；低分子量壳聚糖纳米颗粒(Vila等，Eur J Pharm Biopharm 2004年1月；67(1):123-131)；基于聚丙烯酸酯聚合物的颗粒(Zaman等，Curr Drug Deliv 2010年4月；7(2):118-124)。在一些实施方案中，载体是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。鼻内递送系统在Ozsoy等，Molecules 2009,14,3754-3779(通过引用并入本文)中得以描述。

在一些实施方案中，所述纳米颗粒被递送至肺，同时通过Anselmo等，ACSNano2013，在线公开的10.1021/nn404853z的技术吸附在红细胞上而避开肝和脾。在该方法中，通过以高达100/1的不同的颗粒/RBC比率孵育，将纳米颗粒(例如球状纳米颗粒，例如，直径200nm或500nm)例如附着于RBC。

在一些实施方案中，将所述抗体或片段的效力和活性配制在溶液、粉剂或悬浮液中，所述溶液、粉剂或悬浮液可被稳定而无需赋予形剂，或利用不影响活性成分的效力并且对肺无毒性的赋形剂来稳定。可使抗体变性成氧化或水解状态。在一些实施方案中，提供了用于通过鼻腔喷雾或通过注射递送抗体的含水制剂，其具有螯合试剂，或络合剂，诸如咖啡因、葡聚糖或环糊精，或如本文中提供的其它物质，以在溶液中稳定抗体或片段。此类赋形剂和雾化或喷雾组合物的进一步细节可见于例如WO2005/025506；Maillet,A.等2008Phar,Res.25(6):1318-1326；Hatcha,J等，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.201247(5):709-717(全部通过引用并入)中。

一些稳定剂与肺部递送不相容，因为此类稳定剂引起局部炎症或有急性毒性。在一些实施方案中，为了进一步抑制活性成分溶液的降解，将所述抗体或片段的制剂密封在必须用专门的开瓶器打开的暗玻璃小瓶中，在即将使用前，将其过滤以除去玻璃碎片，随后转移至注射器或喷涂器。

在其它实施方案中，在即将使用前，通过将活性成分粉剂与注射液诸如以双相自动注射器形式形式(将粉剂部分与液体在玻璃小瓶、注射器或泡罩包装(诸如Pozen MT300)内混合)混合来制备活性成分溶液。可尝试此类临时配制法来产生用于通过喷射或超声雾化进行肺部递送的溶液中。然而，用于从水溶液产生吸入气溶胶的任何已知的雾化工艺将活性活性成分暴露于足够的热和氧气浓度，以引起效力和活性的立即的可变的变化。由于在获得或雾化稳定的制剂中的这些固有困难，因此活性成分一直不适于通过肺吸入来递送。气溶胶递送的另一种方法使用加压计量剂量吸入器(pMDI)，其中卤代烃喷射剂迫使抗体或片段的溶液或悬浮液通过小孔，从而产生由喷射剂液滴内的抗体或片段组成的微细的可吸入雾。为了产生稳定的pMDI制剂，所述抗体或片段必须能够形成在喷射剂和pMDI阀装置中稳定并且在物理化学上与其相容的溶液或微粒悬浮液。上文中针对鼻或注射溶液所描述的溶液稳定性和肺毒性问题也同样适用于的pMDI制剂，并且喷射剂兼容性的附加要求禁止使用接受的肺相容性试剂诸如水或酒精。对于悬浮液，需要小于约5.8微米(进行深处肺渗透所必需的质量中位气动直径)的微粒，并且微粒在悬浮液中必须是稳定的。通过磨耗法诸如磨碎、微粉化、研磨，或通过多相沉淀法诸如喷雾干燥、溶液沉淀或冷冻干燥，以产生可分散在喷射剂中的粉剂来从大批抗体或片段产生此类颗粒。这些方法直接通过热或化学相互作用改变抗体或片段的物理化学性质。由于一些活性成分可能是不稳定的，因此这些方法并未被证明适于产生可在喷射剂中再分散的粉剂，或如果所述粉剂最初是可分散的，则所述颗粒随时间过去尺寸增长，或在暴露于制剂时随时间过去改变它们的化学组成。该不稳定性引起效力、活动的变化，或使颗粒增加大于3.0微米，从而使pMDI悬浮配制法不适用于活性成分的气溶胶递送。产生可吸入气溶胶的另外方法是使用干粉吸入器，其中将所述抗体或片段的粉剂制剂分散在使用者的呼气中，随后吸入肺。上述针对pMDI悬浮配制描述的困难同样适用于产生稳定的干粉制剂。显然，在本领域缺乏用于活性成分的吸入递送的合适制剂。本公开描述了用于通过肺气溶胶或鼻腔喷雾吸入施用干粉和喷射剂悬浮液的活性成分或其药学上可接受的盐的新型稳定的制剂。此类制剂可用于治疗各种疾病状态和病况，包括，但不限于，偏头痛。另外，还描述了产生活性成分或其药学上可接受的盐的新型制剂的方法。

通过吸入施用的活性成分必须深深渗入肺部，以显示局部，或可选择地，全身性作用。为了达到该目的，活性抗体或片段的颗粒必须具有不超过约0.5-5.8μm的质量平均空气动力学直径(MMAD)的直径。该最佳尺寸范围的颗粒在结晶步骤中很少产生，因而需要二次处理来产生在0.5-5.8μm范围内的颗粒。此类二次处理包括，但不限于，磨耗法(通过喷射研磨、微粉化和机械研磨)、多相沉淀(诸如溶液沉淀、喷雾干燥、冷冻干燥或冻干)。此类二次处理包括大的热和机械梯度，这可直接降低活性抗体或片段的效力和活性，或导致在进一步处理或贮存时改变颗粒的尺寸、形状或化学组成的拓扑缺陷或该化学不稳定性。这些二次处理也赋予颗粒显著量的自由能，其通常贮存在颗粒的表面上。由颗粒贮存的该自由能产生引起颗粒聚集以减少该贮存的自由能的凝聚力。

凝聚过程可以是如此广泛，以致于可吸入活性抗体或片段颗粒不再存在于微粒制剂中，或可因高强度的凝聚相互作用而不再从颗粒制剂产生。该方法在吸入递送的情况下加剧，因为所述颗粒必须以适于通过吸入装置递送的形式贮存。由于颗粒被贮存相对长的时期，因此聚集过程可在贮存过程中增加。颗粒的聚集干扰颗粒通过吸入器装置进行的再分散，从而使得进行肺部递送和鼻递送所需的可吸入颗粒不能产生。另外，大多数的用于克服聚集效应的制药常规方法，诸如载体和/或赋形剂的使用，不能以药物形式用于吸入，因为这些物质的肺毒理学特征是不想要的。

本公开描述了用于通过肺部气溶胶吸入或鼻腔喷雾吸入施用干粉和喷射剂悬浮液来进行施用的活性成分或其药学上可接受的盐(在本文中称为DHE)的新型稳定的制剂。在一个实施方案中，DHE用作甲磺酸盐。使用超临界流体法产生DHE粉剂。超临界流体法在生产用于吸入递送的DHE颗粒中提供显著的有利方面。重要的是，超临界流体法在单一步骤中产生具有所需尺寸的可吸入颗粒，消除了对二次处理以减小颗粒尺寸的需要。因此，使用超临界流体法产生的可吸入颗粒具有降低的表面自由能，这导致减小的凝聚力，从而减少凝聚。所产生的颗粒也显示出均一的粒径分布。此外，所产生的颗粒具有光滑的表面和可重现的晶体结构，所述结果也趋向于减少聚集。此类超临界流体法可包括快速扩张(RES)、溶液增强型扩散(SEDS)、气体反溶剂(GAS)、超临界反溶剂(SAS)、气体饱和溶液沉淀(PGSS)、压缩反溶剂沉淀(PCA)、气溶胶溶剂萃取系统(ASES)或上述方法的任何组合。在这些超临界流体法的每一个的基础技术在本领域中是公知的，并且将不会在本公开中重复。在一个具体的实施方案中，所使用的超临界流体法是由Palakodaty等在美国申请20030109421中描述的SEDS方法。超临界流体法产生干燥颗粒，可通过预计量至干粉吸入器(DPI)形式中来直接使用所述干燥颗粒，或可将颗粒在计量剂量吸入器(MDI)形式中直接悬浮/分散在悬浮悬浮介质中，诸如药学上可接受的喷射剂中。所产生的颗粒可以是晶状的或可以是无定形的，这取决于所使用的超临界流体法和所采用的条件(例如，SEDS方法能够生产无定形颗粒)。如上所论述的，所产生的颗粒相较于通过常规方法产生的颗粒具有更优的性质，包括但不限于光滑、均匀的表面、低能量、均一的粒径分布和高纯度。这些特征提高了颗粒的物理化学稳定性，并且当用于DPI形式或MDI形式时促进颗粒的分散。粒度应当诸如允许在气溶胶颗粒施用后DHE颗粒被吸入肺部。在一个实施方案中，粒径分布小于20微米。在一个替代实施方案中，粒径分布在约0.050微米至10.000微米MMAD范围内，如通过级联撞击器测量的；在另一个替代实施方案中，粒径分布范围为从约0.400至3.000微米MMAD，优选在0.400与3.000微米MMAD之间，如通过级联撞击器测量的。上文论述的超临界流体法产生在这些范围的下端的粒径。在DPI形式中，可通过静电、低温测定或常规方式将DHE颗粒计量地添加至剂型中，这在本领域中是已知的。可单独(纯净的)使用DHE颗粒，或将其与一种或多种药学上可接受的赋形剂，诸如载体或分散粉剂(包括但不限于，乳糖、甘露糖、麦芽糖等，或表面活性剂涂层)一起使用。在一种优选制剂中，使用DHE颗粒而无需额外的赋形剂。本领域中通常使用的一种方便的剂型是箔泡罩包装。在本实施方案中，将DHE颗粒计量加入箔泡罩包装，而无需将额外的赋形剂以与DPI一起使用。常用计量剂量的范围可为约0.050毫克至2.000毫克，或约0.250毫克至0.500毫克。将所述泡罩包装裂开，其可通过静电力、空气动力或机械力或其任何分散至吸入空气中，这在本领域中是已知的。在一个实施方案中，超过25％的预计量剂量在吸入后将被递送至肺部；在一个替代实施例中，超过50％的预计量剂量在吸入后被递送至肺部；在另一个替代实施方案中，超过80％的预计量剂量在吸入后被递送至肺部。在DPI形式中由递送产生的DHE颗粒的可吸入分数(如根据美国药典第601章测定的)的范围为25％至90％，泡罩包装中的残留颗粒的范围为预计量剂量的5％至预计量剂量的55％。在MDI形式中可将颗粒直接悬浮/分散至悬浮介质，诸如药学上可接受的喷射剂中。在具体的实施方案中，所述悬浮介质是喷射剂。理想的是，喷射剂不用作溶剂DHE颗粒的溶剂。合适的喷射剂包括单独的或以任何组合存在的Cι_4氢氟烷，诸如，但不限于资1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟-正-丙烷(HFA 227)。二氧化碳和烷烃，诸如戊烷、异戊烷、丁烷、异丁烷、丙烷和乙烷，也可用作喷射剂或与上文论述的C\羟氟烷喷射剂混合。在共混物的情况下，喷射剂可含有0-25％的此类二氧化碳和0-50％的烷烃。在一个实施方案中，可实现DHE颗粒分散而无需表面活性剂。在一个替代实施方案中，如果需要，DHE颗粒可含有表面活性剂，表面活性剂以在0.001至10的范围内的对DHE的质量比存在。常用表面活性剂包括油酸酯、硬脂酸酯、肉豆蔻酸酯、烷基醚、烷芳基醚、山梨酸盐和由本领域技术人员配制用于通过吸入递送的抗体或片段所使用的其它表面活性剂，或前述表面活性剂的任何组合。具体的表面活性剂包括，但不限于，山梨糖醇单油酸酯(SPAN-80)和肉豆蔻酸异丙酯。当使用时，DHE微粒分散体还可含有少量极性溶剂来帮助表面活性剂增溶。合适的极性溶剂包括C2-6醇和多元醇，诸如乙醇、异丙醇、聚丙二醇及前述溶剂的任何组合。可以以在0.0001％至4％的范围内的对喷射剂的质量比添加极性抗体或片段。超过4％的极性溶剂的量可与DHE反应或溶解DHE。在一个具体实施方案中，极性抗体或片段是以0.0001％至1％的对喷射剂的质量比使用的乙醇。除用药学上可接受的喷射剂和表面活性剂平衡外，不向DHE颗粒中添加额外的水或含羟基抗体或片段。可在它们使用之前，将所述喷射剂和表面活性剂(如果使用的话)暴露于水或含羟基抗体或片段，以使得水和含羟基抗体或片段处于它们的平衡点。可利用标准计量阀(诸如来自Neotechnics,Valois或Bespak)和罐(诸如来自PressPart或Gemi)，这对于喷射剂/表面活性组合物也是适用的。可将2.0毫升至17毫升的罐填充体积用于实现从一(1)至数百次致动的剂量计数。可任选地提供具有锁定机构的剂量计数器来限制特定的剂量计数，而不论填充体积是多少。喷射剂悬浮液中的DHE的总质量通常在每100毫升喷射剂0.100毫克至2.000毫克DHE的范围内。通过使用在50至100毫升的范围内的标准MDI计量阀，给药将导致在每致动0.050微克至1.000微克的范围内的计量剂量。具有呼吸致动的致动器可优选用于最大化吸入协调，但不强制用来获得治疗功效。此类MDI的可呼吸分数在25％至75％的计量剂量范围内(如根据美国药典第601章测定的)。

如本文中所提供的，对于病毒特别是流感病毒的治疗或预防是有效的和有用的用于鼻内施用的中和抗体的单位剂量，相较于针对替代施用所指定或所需的所述单位剂量，诸如对于IP或IV施用所需的所述单位剂量，相对减少。因此，在其一个方面，提供了用于施用，特别地鼻内施用的抗体组合物，其中所述单位剂量对比针对替代施用所指定的或所需的所述单位剂量，诸如针对IP或IV施用所需的所述单位剂量按数量级减少，特别地减少了数个或多个数量。因此在其一个方面，提供了用于施用，特别地鼻内施用的抗体组合物，其中所述单位剂量减少至少10倍、10倍、20倍、25倍、50倍、至少100倍、100倍、500倍、多达1000倍。具体地，所述组合物从而相较于针对IP或IV施用，特别地针对相同或可比较的指征或效应和/或活性的等效单位剂量，得以减少。可将IN单位剂量与IP或IV剂量组合以用于提高的功效。

以可与剂型相容的方式和以治疗有效量施用所述组合物。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者的免疫系统利用活性成分的能力和期望的病毒的抑制或中和的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于医生的判断，并且对于每一个体是特有的。然而，对于鼻内施用，合适的剂量可在每剂量每千克个体的体重约0.001毫克至10毫克，优选约0.005毫克至约1毫克的范围内，少于1毫克，少于0.5毫克，少于0.1毫克，少于0.05毫克，少于0.01毫克，更优选低于1毫克，低于0.5毫克，低于0.1毫克。用于初始施用和随后施用的适合方案也是可变的。在一个方案中，在初始施用之后，通过随后注射或其它施用，以1小时或多小时的间隔进行重复的随后剂量，单个或多个随后剂量。

可在初始IN施用后，通过IP或IV或通过其它合适的途径施用较高剂量的抗体。在本公开的一个方面，提供了新型给药方法或参数，其中向患者或受试者鼻内施用中和抗体，和与之同时，随后或在更后通过IP或IV施用来施用中和或非中和抗体。

另外的组合

在本实施方案的方面，可将病毒结合抗体或其结合片段(特别地其中所述抗体或片段是中和的)与试剂或药物组合，以形成用于呼吸道或气道施用(包括吸入或鼻内施用)的抗体-药物或抗体-试剂缀合物，以用于本文中公开的实施方案。与所述抗体或片段组合或缀合于所述抗体或片段的药物或试剂可以是病毒中和药物或试剂。

或者，可将所述抗体或组合与抗病毒剂、抗病毒治疗剂、抗流感药物或试剂(特别地包括口服抗流感药物)一起施用。抗流感试剂可以是神经氨酸酶抑制剂。所述抗流感试剂可选自Tamiflu和Relenza。抗流感试剂可以是M2抑制剂，诸如金刚烷胺或金刚乙胺。用于组合的另外的试剂可选自抗病毒治疗剂、病毒复制抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、血凝素抑制剂、支气管扩张药(例如，沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、沙美特罗)，或吸入糖皮质激素。抗病毒剂可以是病毒结合剂或病毒结合抑制剂。在其一个方面，病毒结合抑制剂可以是能够结合流感病毒并通过结合而非更常规的中和方式抑制流感的抗体。TRL809和TRL832代表可适于或有效地与混合物组合以提供增强的功效或协同作用(特别地通过气道施用)的示例性结合抗体。通过气道施用是有效的，特别地与本文所公开的抗体混合物组合的其它试剂，可包括表面活性剂或气道衬调节剂，诸如表面活性剂纳米-乳剂和阳离子气道衬调节剂。能调节或缓解气道炎症的试剂与本发明抗体的混合物组合也可以是有效的或有用的。

在一些实施方案中，所述治疗性组合物，特别地肺部组合物，还可包含有效量的中和抗体或其片段，和以下活性成分的一种或多种：抗生素、抗病毒剂、甾类、抗炎剂。在特定的方面，所述组合物还包含抗病毒治疗剂。所述组合物可包含抗流感试剂。在一些实施方案中，提供了用于提高功效的方法和组合物，通过将本发明的mAb疗法与其它抗病毒治疗，诸如抗病毒治疗剂诸如神经氨酸酶抑制剂(例如奥司他韦[Tamiflu^TM]、扎那米韦[Relenza^TM])、RNA聚合酶抑制剂(例如法维拉韦，VX-787)、免疫调节剂(例如吸入的干扰素β1a)、宿主细胞靶向剂(例如Fludase^TM,Radavirsen^TM)、离子通道抑制剂(例如金刚胺)或其它抗病毒剂组合。

还可将任何此类抗流感试剂作为本文中提供的组合物的部分复合或组合，或与所述抗体或其活性片段结合或单独地施用。可经由与所述抗体或其片段或本发明的吸入或鼻内组合物相同的或替代的方式(诸如经由吸入或经由口服(例如丸剂)方式)施用所述抗流感试剂。因此，本公开的抗体组合和本发明的吸入或鼻内组合物还可包含抗流感试剂或抗病毒剂，诸如例如神经氨酸酶抑制剂(包括选自Tamiflu和Relenza的试剂)，或可将所述抗体组合和所述组合物与所述抗流感试剂或抗病毒剂组合施用，或在所述抗流感试剂或抗病毒剂之后或之前依序施用。

如本文中所用，“pg”意指皮克，“ng”意指纳克，“ug”或“μg”意指微克，“mg”意指毫克，“ul”或“μl”意指微升，“ml”意指毫升，“l”意指升。

可使用本领域中以及医学领域和临床实践中已知的和可接受的方法在鼻腔喷雾或吸入溶液或悬浮液中配制组合物。FDA提供了关于此类喷雾剂、溶液和悬浮液以及喷雾药品的准则和指南，包括可在fda.gov获得的行业指南文件。标题为鼻腔喷雾和吸入溶液、悬浮液和喷雾药品-化学、制造和控制文件的示例性2002年7月的行业指南文件包括关于制剂组分和组成、其规格(specifications therefore)、制造和密闭容器系统的详细内容。

鼻腔喷雾剂是含有溶解或悬浮于制剂(通常水基的)中活性成分的药品，其可含有其它赋形剂，并且旨在通过鼻吸入使用。用于鼻腔喷雾的容器密闭系统包括容器和负责制剂的计量、雾化和至患者的递送的所有组件。鼻腔喷雾药品含有溶解或悬浮于未加压分配器中的溶液或赋形剂(例如，防腐剂、粘度调节剂、乳化剂、缓冲剂)的混合物中的治疗活性成分(药物物质)，所述未加压分配器递送含有计量剂量的活性成分的喷雾剂。可通过喷雾泵计量剂量，或已在制造过程中计量了剂量。鼻腔喷雾单位可被设计来用于单位给药或可释放许多含有药物物质的制剂的计量喷雾剂。将鼻腔喷雾剂施加至鼻腔以获得局部和/或全身性效应。

吸入溶液和悬浮药品通常是水基制剂，其含有治疗活性成分，并且还含有另外的赋形剂。水基口腔吸入溶液和悬浮液必须是无菌的(21CFR 200.51)。吸入溶液和悬浮液旨在通过口腔吸入递送至肺部以获得局部和/或全身性效应，并将与指定的喷雾器一起使用。吸入喷雾药品由制剂和容器密闭系统组成。制剂通常是水基的，并且不任何喷射剂。

目前用于吸入喷雾药品的容器密闭系统设计包括使用机械或电力辅助和/或来自患者吸气的能量进行的预计量和装置计量的呈递，以产生喷雾羽流。预计量的呈递在一些类型的单位(例如，单个或多个泡罩或其它空腔)中含有先前测量的剂量或剂量级分，所述单位随后在制造过程中被插入装置或在使用前被患者插入装置。常用装置计量的单位具有含有足以用于多个剂量的制剂的储器，当被患者启动后，所述制剂被装置本身作为计量的喷雾剂递送。

在鼻腔中延长的停留时间也可以通过使用生物粘附聚合物、微球、壳聚糖或通过增加制剂的粘度来实现。还可利用药物、赋形剂、防腐剂和/或吸收促进剂刺激或抑制鼻腔粘膜纤毛清除，从而实现药物至吸收部位的递送。

微球技术是被用于设计鼻产品的专门系统之一。微球可提供更长时间的与鼻粘膜的接触，从而增强吸收或功效。用于鼻腔应用的微球一直使用生物相容性材料，诸如淀粉、白蛋白、葡聚糖和明胶来制备(Bjork E,Edman P(1990)Int J Pharm 62:187-192)。

药物的水溶解度可以是用于溶液中经鼻药物递送的相关参数限制。常规溶剂或共溶剂诸如二醇，少量的醇、Transcutol(二甘醇单乙醚)、中链甘油酯和癸酸甘油酯(饱和多糖分解的C₈-C₁₀甘油酯)可用于提高药物的溶解度。其它选项包括使用表面活性剂或环糊精诸如HP-β-环糊精，其用作生物相容性增溶剂和与亲脂吸收促进剂组合的稳定剂。在该情况下，它们对鼻刺激物的影响应当予以考虑。

大多数鼻制剂是水基的，并且需要防腐剂来防止微生物生长。对羟基苯甲酸酯、苯扎氯铵、苯乙醇、EDTA和苯甲酰醇是一些在鼻制剂中常用的防腐剂。含汞防腐剂对纤毛运动具有快速和不可逆的作用，并且不被推荐用于鼻系统。

可能需要少量抗氧化剂来防止药物氧化。常用抗氧化剂为焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、丁基羟基甲苯和生育酚。通常地，抗氧化剂不影响药物吸收或引起鼻腔刺激。抗氧化剂和防腐剂与药物、赋形剂、制造设备和包装成分的化学/物理相互作用应被视为制剂开发计划的一部分。

许多过敏性和慢性疾病往往与结壳和粘膜的干燥相关联。除赋形剂外，某些防腐剂/抗氧化剂也可能引起鼻腔刺激，尤其当以较高的量使用时。充足的鼻内水分是防止脱水所必需的。因此，可以尤其在基于凝胶的鼻产品中添加湿润剂。湿润剂避免鼻腔刺激，并且不太可能影响药物的吸收。常见实例包括甘油、山梨醇和甘露糖醇。

递送系统的选择取决于待使用的药物、提出的指示、患者群体和最后但并非最不重要的，市场偏好。这些递送系统的一些包括滴鼻剂、鼻腔喷雾剂、鼻凝胶剂和鼻粉剂。

在一些实施方案中，提供了用于通过喷雾器施用以进行鼻内和吸入递送的组合物。喷雾器是用于施用被吸入呼吸道的呈雾的形式的药剂的药物递送装置。喷雾器可用于通过口和鼻道进行mAb的鼻内和吸入递送，并且是用于将mAb递送至上和/或呼吸道的有效装置。喷雾器使用氧气、压缩空气或超声功率来将药物溶液和悬浮液分离成能够从该装置的吹嘴直接吸入的小的气溶胶微滴。气溶胶是气体和液体颗粒的混合物，天然存在的气雾剂的最佳实例是当与热的环境空气混合的小的蒸发水颗粒被冷却并凝结成可见空气水滴的细云时，形成的雾。计量剂量吸入器(MDI)是以通常由患者通过吸入自我施用的雾化药物的短脉冲形式，将特定量的药剂递送至肺的装置。干粉吸入器包含通常以单个剂量的量包装在泡罩或凝胶胶囊(含有通过使用者自已的呼吸被吸入肺的粉末状药物)的微粉化粉末。一个新的重大创新是在喷雾器市场上创立了超声波振动网技术(VMT)。通过该技术，具有1000-7000个激光钻孔的网/膜在液体储器的顶端振动，从而将非常细小的微滴的雾压出通过孔。该技术比在液体储器的底部具有振动压电元件更高效，从而也实现较短的处理时间。可用VMT喷雾器包括Pari eFlow Respironics i-Neb、Omron MicroAir、Beurer NebulizerIH50和Aerogen Aeroneb。

在另一个实施方案中，所述组合物被制备为用于重建的冻干粉剂，或用于通过粘膜雾化装置(MAD)鼻内施用的保存的或非保存的无菌液体组合物。粘膜雾化装置(MAD)经由鲁尔锁附连至包含含抗病毒组合物的注射器。轻快地压缩注射器柱塞以产生每剂量约0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL或1mL的快速鼻内雾沫喷雾。在一些情况下，将整个剂量施用于单个鼻孔，或以每剂量一次或多次喷雾将剂量分入两个鼻孔。

鼻制剂的pH对于抗体的稳定性和避免鼻粘膜的刺激，允许抗体可以最佳形式用于吸收，阻止致病细菌在鼻道内生长，维持赋形剂诸如防腐剂的功能性，和支持正常生理纤毛动力是非常重要的。在一些实施方案中，制备具有在4.5-8.2、5.2-7.9或4.5至6.5内的pH的组合物，记住抗体混合物、药物或活性成分的理化性质。通常以在25至200μL的范围内的小体积(100μL是最常用的剂量体积)施用鼻制剂。

施用

再次指出的是，正常和合理预期的抗体疗法剂量被良好地确立为在mg范围内的IV或IP剂量。这基于迄今利用众多重组抗体获得的研究和临床经验。迄今为止，超过二十种(20)单克隆抗体在美国已获得临床批准(参见例如Newsome BW和Ernstoff MS(2008)Br JClinPharmacol 66(1):6-19)。目前使用的临床批准的抗体均在使用中并且以mg/kg的范围通过IP或IV施用。

迄今还没有流感单克隆抗体被临床批准。进行中或报道的所有试验目前利用静脉内递送作为标准。具体地，以在1-40mg/kg范围内的单个剂量递增评估TheraCloneSciences抗体TCN-032(NCT01390025,clinical trails.gov)。所述TCN-032抗体是结合流感基质蛋白(M2)的氨基末端细胞外结构域(M2e)的保守表位的人抗体(Grandea AG等(2010)PNAS USA 107(28):12658-12663；2010年7月1日电子版)。使用在2小时内通过IV施用的2mg/kg至50mg/kg的递增剂量在安全性和耐受性研究中类似地评估抗体CR6261和CR8020(分别为Crucell Holland BV临床试验NCT01406418和NCT01756950)。

通过注射施用流感疫苗。流感疫苗中的一个例外是通过鼻内施用的FluMist活流感疫苗(MedImmune)。FluMist是3个活流感病毒株–A/H1N1株、A/H3N2株和B株的组合，并使用在单个剂量预充满的鼻内喷雾器中提供的悬浮液以0.2ml剂量来进行施用。除了病毒株以外，每一个剂量还含有谷氨酸钠、水解猪明胶、精氨酸、蔗糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、无防腐剂(FluMist Highlights of Prescribing Information,2012-2013Formula,MedImmune,RAL-FLUV12,Component No.:11294)。

本公开提供了用于治疗和预防病毒感染，特别地通过呼吸途径感染或传播的病毒，包括特别地流感病毒的新型有效的抗体组合的施用模式以及抗体施用方案。因此，本公开通过肺部施用能够中和任何相关或循环流感病毒的抗体组合，提供了病毒感染，特别流感病毒的治疗、预防或缓解。可通过单IN剂量施用抗体组合，或可同时或基本上同时以多个单一剂量给予抗体组合。可随后施用另外的组合或单一剂量，每一次施用间隔数分钟、数小时或数天。

在特定的方面，本公开提供了通过针对流感的循环病毒株的抗体的组合的肺部施用进行的病毒感染，特别地流感病毒的治疗、预防或缓解。因此，根据本公开，通过针对乙型流感和循环甲型流感病毒的抗体的组合(特别地在其一个方面抗乙型流感抗体、抗组1甲型流感抗体诸如抗H1抗体和抗组2甲型流感抗体诸如抗H3抗体的组合)的肺部施用，提供和实现了感染(特别地流感病毒)的治疗、预防或缓解。根据本公开，抗乙型流感抗体、抗组1甲型流感抗体诸如抗H1抗体和抗组2甲型流感抗体诸如抗H3抗体的组合的鼻内施用，在预防感染或治疗由乙型流感或甲型流感病毒造成的流感感染中是有效的。在一定程度上，抗体是可用的，并且在本文中经测试和证明有效地针对不止一种病毒的亚型或株，本文中提供和设想的组合用作有效地针对病毒，特别是流感病毒的许多株和/或亚型(包括已知的和循环的株或亚型、新出现的株或亚型以及未知的、未曾预料的和变异的株或亚型)的通用混合物或组合。

可鼻内或通过吸入施用用于本文中公开的实施方案的抗体，随后或与其一起(包括同时、组合地或依序地或单独地)进行另一种抗体或同一抗体的全身性施用，特别地IP或IV施用。因此，在本文中设想和提供了组合施用或方法，其中组合鼻内和IP(或IV)施用以获得增强的针对因子，特别地病毒，特别地流感病毒的功效。事实上，本文中提供的研究表明，通过使用鼻内施用与替代施用(IP或IV)的组合给药，组合功效是协同的，并且可利用低剂量的IN和IP(作为实例)。

气道施用提供了递送有效的低剂量和低成本疗法的独特机会，所述机会从而可不需要通过诊断测定来确认。流感季节期间症状的出现足以让医生例如以干粉吸入器或以喷雾器或其它气道递送方法施用该低剂量混合物。该无诊断护理标准是用于Tamiflu和Relenza的当前实践，但对于昂贵的静脉内抗体疗法是不可能，所述静脉内抗体疗法是不实用的并且成本昂贵。在随访诊断后，可通过静脉内途径或通过气道施用高剂量抗体的施用，可将所述高剂量抗体的施用组成混合物或组成对于流感类型是特异的独立的特异性抗体。

本公开提供了用于治疗或预防暴露于呼吸道病毒，处于对所述病毒的暴露的风险中，与所述病毒接触，临床上呈现症状或遭受所述病毒的哺乳动物的病毒感染的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用(通过鼻内(IN)或经由吸入)如本文中提供的抗体的组合或混合物。抗体的混合物或组合可特别地均为IgG抗体。

可在感染后或在假定的感染后施用抗体组合。在其一个方面，在达到感染后8小时(hpi)，包括2hpi、4hpi、6hpi、8hpi的时期中施用抗体组合。或者，在达到感染后24小时，包括4hpi、8hpi、12hpi、18hpi、24hpi的时期中施用抗体组合。在其它替代方案中，在达到感染后48小时，包括12hpi、24hpi、36hpi、48hpi的时期中施用抗体。在其它替代方案中，在达到感染后72小时，包括24hpi、36hpi、48hpi、60hpi、72hpi的时期中施用抗体。可在感染后，或假定的感染后，或在呈现临床症状诸如发热、疼痛、关节痛、嗜睡后数天施用抗体。可在感染后1天、感染后2天、感染后3天、感染后4天、感染后5天、感染后6天、感染后7天、感染后10天、感染后12天、感染后14天施用抗体。可在感染或假定的感染后数周，包括1周后、2周后、3周后、4周后、1个月后施用抗体。

可在感染之前或为了减少或阻止传播，或在病患、疾病或感染的任何临床适应症之前施用抗体组合。在其一个方面，可在感染前或可能的或假定的暴露或暴露的风险之前数天在一段时期内将抗体作为预防剂施用。可在1天前或之前1天，2天前或之前2天，3天前或之前3，4天前或之前4天，5天前或之前5天，6天前或之前6天，7天前或之前7天，1周前或之前1周，超过7天前或之前超过7天，超过1周前或之前超过1周，达到9天前或之前9天，达到10天前或之前10天施用抗体组合。可在一个或多个剂量前或之前以数小时、数天或数周的间隔施用抗体一次或多次。

可以以一个单个剂量或以重复的多个组合剂量施用抗体组合。在任何优选方面，以相同的相对量施用组合或混合物中的每一种抗体。每一个剂量以单位或mg/kg量上是相同的，或在量上可以是不同的。例如，初始剂量可以是较高的相对剂量，诸如例如但不限于约1mg/kg，大于1mg/kg，少于1mg/kg或约最大或接近最大耐受的剂量，或一半最大耐受的剂量(对于待施用的哺乳动物)。随后剂量可与初始剂量相同或可少于或大于初始剂量，并且可取决于受试者或患者中的反应或响应或临床症状的缓解或程序。

可间隔数小时、数分钟、数天或数周施用每一个或任一个剂量具有相同或不同量的多个剂量。时间安排可变化，取决于反应和症状可被缩短或延长。剂量，例如但无限制，可以间隔至少2小时，间隔至少4小时，间隔至少6小时，间隔至少8小时，间隔至少24小时，间隔至少48小时，间隔至少72小时。可在感染后或假定的感染后并达2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时后，施用一个或多个抗体剂量，进行达1天、2天、3天、4天、5天、6天后，7天、1周、2周、3周、4周、1个月或更长时间。

所述方法可包括病毒特异性单克隆抗体的另外IP或IV施用，其中另外施用的抗体是中和或非中和抗体。通过IP或IV另外施用的抗体可以是与通过IN或经由吸入施用的抗体相同的抗体。与通过IN或吸入施用的抗体同时地，依序地或在其之后施用通过IP或IV另外施用的抗体。任何此类随后施用可以是数小时后，可以是2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或更多小时后。随后施用可是数天后，可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天后。随后施用可以是数周后，可以是1周、2周、3周、4周或5周后。

吸入或鼻内剂量可用于在特别地生病的或在初始IN或IP或IV或组合剂量后继续显示感染或疾病的症状的患者或受试者中增强反应或功效。

在其它方面，本公开提供了用于施用针对流感病毒的单克隆抗体混合物或组合的方案，所述方案包括施用第一鼻内或吸入剂量的抗体组合，随后或同时腹膜内或静脉内，或再次地鼻内或通过吸入施用第二剂量的抗体，其中第二剂量的抗体组合是与第一剂量的抗体组合相同或不同的抗体组合。第二剂量或任何另外的剂量的抗体可以是中和或非中和抗体。

本文中公开的实施方案可通过以下非限制性实施例来更好地理解，所述实施例被提供为本发明的示例。为了更全面地举例说明优选或特定的实施方案提供以下实施例，然而所述实施例绝不应当被解释为限制本发明的范围。

抗体结构

在下文中和所附序列表中提供了本发明的mAb的某些重链和轻链氨基酸序列。

TRL 784

实施例

以下材料和方法用于本文中提供的实施例。

抗体：在一些情况下，使用如下所述的噬菌体展示分离Mab。Mab CR8020和CR6261是分别针对组2和组1病毒的良好表征的广泛反应性抗体(Throsby M等(2008)PL0S ONE 3:e3942；Eckert DC等(2009)Science 324:246-251；Friesen RHE等(2010)PLoS ONE5(2):e1906；美国专利8,192,927；Eckert DC等(2011)Science333:843-850)。抗体CR9114结合HA茎中的保守表位，并且当IV施用时保护免受甲型和乙型流感病毒的致死攻击(Dreyfus C等(2012)Science Express 2011年8月9日10.1126/science.1222908)。通过合成可变区在我们的手中克隆了这些中和抗体，并将其亚克隆至小鼠IgG2a表达载体中。使用公开的重链GI：339779688和轻链GI：339832448克隆CR8020的可变区。使用公开的重链GI：313742594和轻链GI：313742595克隆CR6261的可变区。使用基因库序列重链登录号JX213639和轻链登录号JX213640克隆了CR9114的可变区。将用于这些研究的CR6261、CR8020和CR9114抗体克隆至含有融合至小鼠IgG2a的人可变区的IgG表达载体中。小鼠抗体CR6261、CR8020和CR9114的嵌合抗体在本文中分别被称为CA6261、CA8020和CA9114。Mab 5A7结合B病毒HA上的共同表位并中和病毒，以及当通过IP给予时保护小鼠免受致死攻击(Yasugi M等(2013)PLoSPathog 9(2)：e1003150,doi：10.1371/journal.ppat.1003150)。

人抗体Mab53(也表示为TRL053)描述于US2012/0020971和WO2011/160083(所述专利和专利申请的每一篇通过引用并入本文)中，并且在中和组1和2H1、H9、H7和H5亚型中是有效的。

抗体Mab579(也表示为TRL579)描述于WO2013/086052(其通过引用并入本文)，并且在中和H3和H7上是有效的。

包括抗体重链和轻链可变区序列，特别地本文中的上文所述和例举的抗体(特别地包括CR6261、CR8020、CR9114、5A7、Mab53和Mab579)的重链和轻链CDR结构域(CDR1、CDR2和CDR3)序列的公开的序列是已知的并且可包括在上述的并通过引用并入本文的参考文献中公开获得。

Fab的验证：通过针对重组HA的ELISA筛选编码Fab的噬菌体裂解。将挑拣至含有2XYT/Cam/Glc培养基的384孔板中的单个集落在30℃下生长过夜。使用Qpix将384孔板中的TG1细胞复制至含有具有低葡萄糖的2XYT/Cam的384孔表达板中。将板在30℃和400rpm下生长2-4小时。用0.5mM IPTG诱导Fab表达，并在22℃和400rpm生长过夜。用含有Benzonase的BEL缓冲液在22℃和400rpm裂解含有Fab的细胞，进行1小时。用12.5％MPBST在400rmp和22℃下封闭含有Fab的裂解物，持续30分钟。将裂解物添加至涂覆有HA的ELISA板在RT下持续1小时。用PBST洗涤板5次，随后在RT下用缀合于碱性磷酸酶的抗Fab IgG孵育1小时。用TBST洗涤板5次，随后用AutoPhos(Roche,New Jersey)进行显色使用。Infinite Pro F200读取板。对阳性噬菌体裂解物进行测序，将独特的Fab亚克隆至含有c-myc和his标签的Fab表达载体中，以进行进一步表征。

Fab的表达：将Fab表达质粒电穿孔至TG1F细胞中，将所述细胞涂铺在LB/Cam琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜。用单个集落接种5ml的2XYT/Cam/Glc，并在30℃和350rpm下生长过夜。用2ml的过夜培养物接种500ml的2XYT/Cam/低Glc，并在30℃和180rpm摇动，直至达到0.5的OD600nm。通过添加0.75mM的终浓度的IPTG诱导Fab表达。将培养物在30℃和160rpm下摇动过夜。在4℃下以5,000g将培养物离心30分钟。将细菌沉淀于-80℃下冷冻至少2小时。裂解细胞，并将其在0.22um过滤器上过夜，随后经历IMAC纯化和尺寸排阻步骤。

抗体的克隆和表达：对编码Fab的噬菌体进行测序，并亚克隆至各自重链和轻链的IgG表达质粒中。在摇瓶中于Invitrogen 293F或Invitrogen 293Expi细胞中产生IgG。用重链和轻链的表达质粒转染细胞。转染后6天收集培养物上清液，使用蛋白A亲和层析和缓冲液交换步骤进行纯化。

小鼠中的治疗功效研究：将6-7周龄雌性BALB/c小鼠用于实验。在开始实验之前使所有小鼠适应和维持至少3天的时间。在病毒攻击当天和随后每日对小鼠称重，持续2周。临床评分系统用作临床终点和从研究中排除的标准。如下对临床体重评分：驼背姿势＝3，毛发竖立＝3，无进食或饮水＝2，体重减轻≥30％＝10，神经症状＝10。当达到16或更多的评分时，将小鼠从研究中排除，并无痛致死。按照批准的动物护理和使用委员会的协议进行动物研究。在感染后指定的天进行小鼠的治疗性治疗。在以每小鼠50ul体积鼻内施用病毒、Mab或Fab之前，首先用氯胺酮/赛拉嗪混合物麻醉小鼠。以100ul体积给予Mab或Fab的腹膜内施用。在14天的研究过程中每天测定平均体重，并相对于第0天的平均体重显示所述平均体重。

病毒：根据Cottey,Rowe和Bender(Current Protocols in Immunology,2001)，流感病毒的株(包括A/California/7/09、A/Victoria/11、B/Malaysia/2506/2004、B/Florida/04/2006)是小鼠适应性的。进行3轮小鼠适应，随后在鸡胚中进行一轮病毒繁殖。简言之，将3只6-8周龄小鼠麻醉，并用20ul病毒进行鼻内感染。感染后3天，将小鼠无痛致死，取出肺。将肺机械匀浆，过滤，离心以除去大块碎片。将20ul的肺匀浆物在首次接受实验的小鼠中进行的另外传代，进行3轮。

参考文献

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Feng J，Mozdzanowska K，Gerhard W：Complement component Clq enhancesthebiological sctivity of influenza virus hemagglutinin-specific antibodiesdepending on their fine antigen specificity and heavy chain isotype.J Virol2002，76：1369-1378.

Mozdzanowska K，Feng J，Eid M，Zharikova D，Gerhard W：Enhancement ofneutralizing activity of influenza virus-specific antibodies by serumcomponents.Virology 2006，352：418-426.

以下实施例被提供来举例说明本发明但不限制本发明。

实施例1.单克隆抗体的亲和力。

使用CellSpot^TM技术的初步筛选固有地偏向于发现高亲和力mAb，因为如果抗原-抗体相互作用太弱，则抗原结合至在洗涤过程中未被保留的珠粒。用于测量克隆的mAb的亲和力的传感器仪器为FortéBio^TM Octet。当解离速率变得非常低时，将亲和力测量为结合速率与解离速率的比率不太精确。为了获得更好的评估，将不同浓度的抗体流过固定至传感器表面的抗原。表5显示了一组乙型流感mAb连同以该方式测定的它们的KD。

表5.mAb针对乙型流感的KD。

由Yasugi等，(第0008段)描述的5A7对于HA的生物传感器(Biacore^TM)测定的亲和力(KD)为～5nM。本发明的mAb TRL 835竞争与5A7的结合，但在0.6nM具有显著更紧密的KD，如所显示的。

实施例2.mAb对重组乙型流感HA的结合。

通过ELISA测定抗体结合。用20ng/孔的DPBS,pH 7.4中的蛋白rHA涂覆384孔ELISA板。在于4℃下对板进行过夜涂覆后，用PBS和0.01％Tween 20(PBS-T)洗涤板2次。随后用5％的PBS-T中的脱脂牛奶(M-PBS-T)封闭板，持续1小时，然后将板在PBS-T中洗涤2次。在PBS中稀释纯化的抗体，随后以20ng/孔针对每一种抗原进行探测。用PBS-T洗涤板5次，随后用缀合于碱性磷酸酶的第二抗体进行探测。随后用PBS-T洗涤板5次，并用AttoPhos AP荧光底物(Promega S1000)进行显色。连续读取板，直至来自阴性对照孔的本底信号开始提供荧光信号。

某些ELISA测定的结果示于图3中。重组HA ELISA数据举例说明几种抗乙型流感mAb和两种抗甲型流感mAb与甲型和乙型流感病毒株的反应性。以一式三份进行重组HAELISA，显示相对于本底的平均倍数反应性。图3显示抗B mAb TRL809、TRL812、TRL813；TRL832、TRL841、TRL842、TRL845、TRL846、TRL847、TRL848、TRL849、TRL854和TRL856的每一种具有针对乙型流感病毒的两个谱系(包括Yamagata进化枝的B/Florida/06、B/Mass/12和B/Wisconsin/10以及Victoria进化枝的B/Brisbane/08、B/Malaysia/04和B/Victoria/87)的广泛交叉反应性。抗甲型流感mAb CF401(＝mAb 53,TRL053)和CF402(＝mAb 579,TRL579)具有与甲型流感H1(A/California/09)和H3(A/Sydney/97)亚型的反应性，但无与乙型流感病毒株的反应性。

实施例3.mAb对乙型流感病毒的中和。

将抗体与200PFU的病毒一起在37℃孵育1小时。随后，在37℃用混合物吸附MDCK细胞持续1小时。用含Avicel培养基覆盖在MDCK细胞上以进行空斑测定显影。在孵育2天后测定空斑。经鉴定的具有广泛反应性的乙型流感mAb能够以高效力中和Yamagata和Victoria谱系。在孵育12小时后，固定细胞，并将其经历免疫荧光以检测感染的细胞。对照抗B mAb5A7显示对Yamagata和Malaysia谱系株的中和，数据未显示。然而，本发明的mAb表现出较大的效力，如图4的表8中显示的。

关于选定的抗乙型流感抗体(抗乙型流感抗体TRL845、TRL848、TRL849、TRL854、TRL832和TRL809)的中和测定的结果示于图4中。IC50是在该特定的中和测定中抑制病毒的浓度。所述mAb各自中和Yamagata谱系和Victoria谱系的每一个的代表性成员。将这些谱系的确定的株用于本实验，但mAb也中和测试的所有B病毒。

实施例4.在小鼠流感模型中的体内功效。

一般地，除在另外指出的情况下，在肺部递送模型中评价mAb的增强的功效。用10xLD50感染小鼠，在24hpi通过经由鼻内途径的肺部递送以1mg/kg进行施用来处理小鼠。监测体重和存活率以评估相对功效。

图6A-D显示在以1mg/kg通过IN途径施用后，本发明的抗乙型流感mAb在鼠模型中在感染后1天针对10xLD50的病毒的体内活性，评估小鼠体重直至感染后14天，以PBS和无病毒作为对照。每天监测动物的体重，持续感染后14天，并将相对于初台第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。

图6A显示通过IN途径的1mg/kg的mAb TRL845、TRL847、TRL 848、TRL849和5A7在用代表Victoria进化枝的B/Malaysia/2506/04感染的小鼠提供了免受疾病的保护。

图6B显示通过IN的1mg/kg的mAb TRL845、TRL847、TRL 848、TRL849和5A7在用代表Yamagata进化枝的B/Florida/04/2006感染的小鼠中提供免受疾病的保护。

图6C显示通过IN途径的1mg/kg的mAb TRL849、TRL846、TRL854、TRL 856、TRL847和5A7在用代表Victoria进化枝的B/Malaysia/2506/04感染的小鼠中提供免受疾病的保护。

图6D显示通过IN途径的1mg/kg的mAb TRL849、TRL846、TRL854、TRL 856、TRL847和5A7在用代表Yamagata进化枝的B/Florida/04/2006感染的小鼠中提供免受疾病的保护。

实施例5.通过肺部递送产生的体内功效增强。

为了评估通过替代递送法产生的功效增强的潜能，测试mAb的体内功效。用10xLD50感染小鼠，在24hpi以10、1和0.1mg/kg使用经由腹膜内施用的常规全身性递送，相较于通过经由鼻内途径的肺部递送施用的1.0和0.1mg/kg的mAb，以10、1和0.1mg/kg使用经由腹膜内施用的常规全身性递送处理小鼠。比较存活率和体重。将存活率和体重减轻(感染的严重度的量度)用于评估相对活性。图5A和5B显示mAb 5A7经显示为举例说明通过肺部递送产生增强的功效的实例。

图5A显示以用10xLD50的B/Florida(Yamagata谱系)感染的小鼠，在用5A7的鼻内(IN)对比腹膜内(IP)施用后的百分比体重表示的抗乙型流感抗体5A7在小鼠中的体内活性。在24hpi通过IN或IN途径利用mAb处理小鼠，每日将体重测量为疾病严重度的指征，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。将体重减轻>30％的小鼠无痛致死。1mg/kg IN提供免于体重减轻的保护，然而通过IP途径的1mg/kg具有一定的体重减轻。IN施用途径相对IP施用途径的增强的功效得以证明。

图5B显示以用10xLD50的B/Malaysia(Victoria谱系)感染的小鼠，在5A7的IN对比IP施用后的百分比体重表示的抗乙型流感抗体5A7在小鼠中的体内活性。在24hpi通过IN或IP途径用mAb处理小鼠，每日将体重测量为疾病严重度的指征。将体重减轻>30％的小鼠无痛致死。1mg/kg IN提供免于体重减轻的完全保护，然而通过IP途径的1mg/kg具有一定的体重减轻。IN施用途径相对于IP施用途径的增强的功效得以证明。

实施例6.体内功效不受抗流感组A mAb的存在影响。

利用另外替代流感抗体评估使用鼻内施用向气道进行施用的功效。先前已分离了针对组1和组2甲型流感病毒中和并具有针对所述病毒的功效的单克隆抗体。人抗体Mab53(也表示为TRL053)描述于US2012/0020971和WO2011/160083，并且在中和组1和2H1、H9、H7和H5亚型中是有效的。抗体Mab579(也表示为TRL579)描述于WO2013/086052中，并且在中和H3和H7中是有效的。如本文中提供的，制备这些mAb，将其优化以提供用于本研究的抗H1CF-401(＝mAb 53,TRL053)、抗H3CF-402(＝mAb 579,TRL579)。

在小鼠模型中测试Mab579和Mab53抗体的针对甲型流感病毒感染的治疗功效。针对H3流感测试Mab579，以及针对H1流感测试Mab53。比较IN与IP给药，以1mg/kg进行IN给药，并以高至10倍的10mg/kg进行IP给药。在感染后24小时(24hpi)施用抗体Mab579以获得针对10XLD50的H3流感病毒Vic11的治疗功效(数据示显示和图12B)。在感染后24小时(24hpi)施用抗体Mab53，以获得针对10XLD50的H1流感病毒Cal09和PR8的治疗功效(数据未显示和图11B)。IN施用比IP施用更有效，即使在同一实验中以高至10倍的剂量使用IP施用亦如此。

对于两个单个的抗B mAb和相同mAb与以混合物形式存在的抗H1和抗H3mAb的混合物均获得可比较的存活率和体重减轻数据，确立了所述mAb不干扰彼此的活性。

图7A-7D显示3种抗流感mAb的共施用不干扰抗B mAb的功效。用10xLD50的病毒感染小鼠，在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401(＝mAb 53,TRL053)、抗H3CF-402(＝mAb 579,TRL579)和抗BTRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理小鼠，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，将相对初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。

图7A-7D一起表明所述混合物将提供预期水平的保护而不干扰针对来自所有季节性流感亚型的代表性株(H1N1、H3N2和B的两个谱系)的混合物中的另一mab。

图7A显示利用10xLD50H1N1感染的，并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗BTRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7B显示用10xLD50H3N2感染的，并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗BTRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三无mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7C显示用10xLD50B/Yamagata谱系感染的，并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三无mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7D显示用10xLD50B/Victoria谱系感染的，并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

实施例7.使用PepScan^TM进行的抗B mAb表位作图。

使用Pepscan CLIPS^TM技术对抗B mAb的表位进行作图，其中对对应于乙型流感血凝素的茎区的区段的各种固定的线性和约束肽对不同抗B mAb的结合进行评分。选择乙型流感病毒株B Lee的茎序列，因为其为Victoria和Yamagata谱系的祖先。结合mAb的肽被认为是表位。对于每一种测试的mAb，描绘不连续表位的独特模式。结果概括于图8和9中。图8显示通过PEPSCAN^TM产生的B/Lee/1940/HA蛋白(SEQ ID NO：291)的肽阵列(上图)。B/Lee/1940/HA蛋白的阴影区对应于用于从aa_15-65(SEQ ID NO：292)、aa_300-359(SEQ ID NO:293)和aa_362-481(SEQ ID NO：294)产生肽阵列的残基。表(下图)显示mAb 5A7表位1-aa_333-338(SEQ IDNO：304)、表位2-aa_342-346(SEQ ID NO：305)和表位3-aa_457-463(SEQID NO:306)；mAb TRL845表位-aa_455-463(SEQ ID NO:307)；TRL848表位1-aa_64-71(SEQID NO：308)；表位2-aa_336-348(SEQ ID NO：309)；表位3-aa_424-428(SEQ ID NO：310)；mAb 849表位1-aa_317-323(SEQ ID NO：311)、表位2-aa_344-349312)、表位3-aa_378-383(SEQ ID NO：313)；mAb 854表位1-aa_457-463(SEQ ID NO：314)。右下的图显示以深灰色显示的解析至HA的茎部的区域。

图9举例说明通过PEPSCAN^TM分析沿HA蛋白的茎进行的表位作图。随影区域描绘了各mAb所结合的表位。mAb TRL848、TRL845、TRL854和TRL849识别沿HA的茎部分重叠的不连续表位。来源公开的序列的对照mAb 5A7产生相似但独特的表位。

实施例8.mAb的体内表达。

在一些实施方案中，本发明的mAb被靶向以进行体内表达。已描述了用于将mAb的遗传信息转移至宿主细胞中以原位产生mAb的几个递送系统。在一个实施方案中，将编码DNA封装进慢病毒颗粒中，该颗粒在其表面上含有与组织靶向抗体组合的促融合蛋白，如由David Baltimore’s laboratory：Proc.Nat’l Acad.Sci.USA103(31):11479–11484(2006)描述的。所述靶向抗体可结合CD20，例如，从而实现载体至B细胞的优先递送，以最佳地产生抗体。或者，如由Johnson,P.R.等，Nature Medicine(2009)15:901-906所述，使用AAV载体(腺相关病毒)。其它方法包括将编码mRNA封装至脂质体或脂质颗粒中以有利于细胞摄取。

实施例9.解链曲线测定。

通过在PBS中以2ug/mL的浓度，利用PCR StepOne Plus^TM仪，以1.58℃/分钟从15℃加热至99℃，连续测量荧光来进行解链曲线测定。图10A-10F显示mAb TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的解链曲线测定。每一种mAb表现出高度热稳定性。图10A显示TRL845的解链曲线，其显示分别在58.3℃和68.7℃的两个解链温度(Tm1,Tm2)。图10B显示mAb TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的解链温度(Tm)(分别如图10A和10C-10F中显示的)的表。两个解链温度(Tm1,Tm2)的显示可能归因于这些mAb的Fc和Fab结构域单独变性。图10C显示TRL847的解链曲线，其显示70.3℃的解链温度(Tm1)。图10D显示TRL848的解链曲线，其显示70.1℃的解链温度(Tm1)。图10E显示TRL849的解链曲线，其显示分别在70℃和81.8℃的两个解链温度(Tm1,Tm2)。图10F显示TRL854的解链曲线，其显示在59.7℃和68.9℃的两个解链温度(Tm1,Tm2)。包含SEQ ID NO：17/18的HC/LC氨基酸序列的抗体TRL053和包含SEQ ID NO：27/28的HC/LC氨基酸序列的TRL597，各自显示如表6中显示的解链温度。

表6.mAb的解链温度。

mAb	Tm1	Tm2
			TRL053	70.1	76.5
TRL579	70.5

来自一些抗体的两个解链温度(Tm1,Tm2)的显示可能归因于这些体的Fc和Fab结构域单独变性。因此用于本文部提供的特定组合和组合物的抗体是稳定的，并且显示大于55℃，或在一些情况下大于65℃的解链温度。

实施例10.当通过肺部途径递送时抗流感mAb提供保护。

为了研究组合CF-401(mAb 053)与神经氨酸酶抑制剂奥司他韦用于治疗H1N1感染的效应，用3xLD50的H1N1病毒攻击小鼠，在第4天用单个1mg/kg mAb CF-401的鼻内剂量、10mg/kg每日二次的口服奥司他韦处理(进行4天)或两个处理的组合处理小鼠。如图24中所示，当用1mg/kg的CF-401的单次施用处理时，100％的小鼠在攻击时存活下来。当在这些感染后晚时间点施用时，护理标准奥司他韦不具有保护作用(0％的存活率)，但当与CF-401mAb疗法组合时，其提供相较于单独的mAb疗法免受体重减轻的额外保护。结果示于图24中，其中当在感染后4天用1mg/kg的CF-401的单次施用处理时，100％的小鼠在来自致死剂量的H1N1攻击时存活下来。护理标准Tamiflu的施用不具有保护作用，但加上CF-401mAb疗法，提供了免受体重减轻的额外保护。在第4-8天每日二次口服施用10mg/kg Tamiflu。数据显示当在晚时间点施用时，护理标准(Tamiflu)加上mAb疗法是有效的。

当通过肺部途径递送时，抗流感mAb提供保护。在一些实施方案中，可通过组合本发明的mAb疗法与其它抗病毒治疗，诸如神经氨酸酶抑制剂(例如奥司他韦[Tamiflu^TM]、扎那米韦[Relenza^TM])、RNA聚合酶抑制剂(例如法维拉韦，VX-787)、免疫调节剂(例如吸入的干扰素β1a)、宿主细胞靶向剂(例如Fludase^TM,Radavirsen^TM)、离子通道抑制剂(例如金刚胺)或其它抗病毒剂组合来提高功效。

实施例11.中和抗体是鼻内有效的。

全身性递送的抗体的治疗功效不仅仅依赖于中和能力，因为通过IP途径给予的中和和非中和抗体在治疗和预防致命感染中表现出相似的效应。当通过IP施用时，中和和非中和抗体具有相似的有效性。这带来了问题：在全身性递送中中和是否对治疗功效做出重大贡献。通过IV或IP途径的非中和抗体的递送未导致显著的功效差异(数据未显示)。

相反地，中和抗体的IN递送相较于全身性递送显著增强它们的治疗功效(图11A)。该治疗功效上的增强对于中和抗体是特异的，因为建立的非中和抗体未展现出相似的增强的治疗功效。与IP递送不同，中和抗体的IN递送相较于非中和抗体提供了显著的治疗益处。IN递送的该增强的功效与抗体中和的能力相关，因为通过IN递送的非中和抗体未表现出提高治疗功效。IN增强的功效通过针对H1病毒CA6261的广泛识别抗体(结合HA2亚单位的短α螺旋的IgG2a抗体)来证明(图11A)。为了进一步确认IN功效的效应，我们已评价了另一种交叉保护性抗体CR9114，并且显示其为高度有效的IN(数据未显示，和图24)。CR9114结合HA的茎中的表位，并且当IV施用时保护免受利用甲型和乙型流感病毒的致死性攻击(Dreyfus C等(2012)Science Express 2012年8月9日10.1126/science.1222908)。

对于具有不同抗体同种型的抗体，我们未曾观察到IN功效的显著差异。已在IP给药中观察到同种型差异，这暗示着效应子功能可以是相关的。同样地，单一中和抗体在阻断针对它们的靶H1或H3病毒的多个株的感染中是有效的，这表明功效不是株特异性的或有限的。因此，IN施用为针对流感病毒的中和抗体提供了可行的和事实上更有效的替代方案。

实施例12.中和Fab是鼻内有效的

进行研究以评价Fc的去除是否会消除IP或IN施用的中和和非中和Fab的治疗功效。如图25中看到的，模式Fab(CA6261抗体Fab)的IP施用在10mg/kg或更低下不提供针对H1病毒的治疗功效。用Fab IP处理的小鼠与PBS处理的小鼠类似均受感染而死。相反地，以10mg/kg和1mg/kg的剂量利用中和Fab通过IN处理的小鼠能够在致死感染时活下来(图25)。所有通过IN施用的剂量(甚至至0.1mg/kg)均显示比施用的任何IP剂量更大的功效。通过在同一实验中比较CA6261Fab IN对比IP或IV，观察到可比较的结果，其中当通过IP或IV施用时，Fab CA6261不具有保护作用或有效性，但当通过IN施用相同的剂量(5mg/kg)时，显示显著的功效(动物保留和95％或更大的体重)(数据未显示)。这引起数据表明，对于中和抗体，Fab通过鼻内途径有效地阻断或治疗病毒感染。数据进一步表明全身性Mab递送系统需要Fc效应子功能来获得治疗功效，因为Fab是无效的。

当通过IN或IP途径施用时，来自非中和抗体的模式Fab不保留治疗功效。通过示例性现有技术抗体CA8020(中和)和非中和抗体(数据未显示)的纯化的Fab的IN递送处理利用H3病毒感染的小鼠。虽然中和Fab能够显示治疗功效，但非中和Fab不能保护小鼠免受致死攻击。来自非中和抗体的抗体片段，特别是Fab，当通过IN施用时，未表现出治疗功效。

实施例13.IN递送的效力为IP递送的10-100倍

中和抗体的鼻内(IN)递送的效力为腹膜内(IP)递送的10-100倍。用10xLD50的PR8病毒(H1病毒)感染小鼠，并在24hpi用抗体处理小鼠(图11A)。将中和抗体CA6261进行10倍系列稀释，通过IN或IP途径施用所述抗体(图11A)。通过IN途径处理的小鼠表现出较轻的疾病严重度，如通过体重减轻所指示的，并且在所有稀释度上得到保护而免受致死感染。相比较地，通过IP处理的小鼠只在最高剂量(10mg/kg)上表现出短暂的体重减轻和免受致死感染的保护。当通过IP施用时，所有较低的稀释度不保护小鼠。相反地，利用0.1mg/kg的剂量的IN处理导致短暂的体重减轻，并且所有小鼠存活。通过IN递送利用10mg/kg和1mg/kg的剂量处理的小鼠在感染后所有时间点上获得保护而免于可检测的体重减轻。通过IP给予的抗体在所有剂量上表现出一定程度的体重减轻，并且只有以10mg/kg的最高剂量处理的小鼠才在感染时存活下来。

我们确认中和抗体的鼻内递送类似地导致增强的针对H3病毒的治疗功效。利用H3病毒感染小鼠，在24hpi处理小鼠(图12A)。将中和抗体CA8020进行10倍系列稀释，通过IN或IP施用所述抗体。如在我们的研究对于H1病毒所观察到的，通过IN途径施用的抗体在所有稀释度上提供了100％的针对H3病毒的存活率，并且相较于通过IP途径施用的抗体表现出较少的体重减轻。

这些数据一起表明，中和是当通过IN递送时获得增强的治疗功效所必需的。此外，全身性递送的抗体的治疗功效不依赖于中和，因为对于中和和非中各抗体均观察到相似水平的功效。支持该观察，当通过IP施用时，中和Fab的治疗性功效被消除，但当通过IN递送时中和Fab显示功效。通过IN施用的中和Fab相较于IP施用显示与它们的完全Mab对应物的IN递送相似的提高的功效。

实施例14.利用IN抗体的预防研究

鉴于感染后中和抗体的鼻内施用的显著功效，进行研究以评价在用病毒感染之前的预防性鼻内施用的功效。这些研究用于评估和表明鼻内施用在其中个体暴露于流感病毒的情况下的适用性，以及作为预防和减少暴露或高危人群内，或在临床上其中感染或疾病将是总体上更大的健康风险的患者中的传播的有效方法的适用性。在小鼠动物模型中评价组1(H1)抗体CA6261的在流感病毒感染之前数天的施用。评价CA6261在感染攻击之前3、4、5、6和7天的施用，以及直接比较不同剂量的IN与IP给药。

在第一研究中，通过IN或IP施用抗体CA6261，随后用3XLD50剂量的H1PR8病毒攻击小鼠。图13描绘了在用病毒感染前3或4天预防性IN和IP施用的研究。在用3XLD50PR攻击之前3或4天通过IN或IP施用抗体CA6261。通过IN(0.1mg/kg)或IP(0.1mg/kg和1mg/kg)施用CA6261抗体。直至感染前4天(-4dpi)的IN施用(在0.1mg/kg下评估的)保护小鼠免受病毒攻击。在感染之前3或4天以相同剂量(0.1mg/kg)进行的IP施用完全无效。在感染前3或4天的IP施用在1mg/kg上是有效的。通过比较在-3dpi和-4dpi进行的IN(0.1mg/kg)与IP(1mg/kg)施用，在两种情况下，低至1/10的IN剂量比IP有效。

随后评价病毒感染之前5、6和7天的预防性功效。对比IN施用评价高至10倍剂量的IP。在用3XLD50的H1流感病毒PR8(数据未显示)攻击之前5、6或7天通过IP(以1mg/kg)或IN(以0.1mg/kg)施用抗体CA6261。也评估Tamiflu施用(口服10mg/kg，每天2次，持续5天)以用于比较。在-5dpi进行的施用在0.1mg/kg IN上显示了功效。对于病毒攻击前6或7天进行的0.1mg/kg IN施用，并非所有小鼠都存活下来。高至10倍的IP剂量(10mg/kg)在攻击前5、6或7天是有效的。在攻击前5天以0.1mg/kg进行的抗体IN施用至少与在攻击前7天高至10倍的1mg/kg剂量的施用一样有效。

随后评价病毒攻击前5、6和7天的以1mg/kg进行的较高IN剂量。图14描绘了在利用3XLD50的病毒PR8攻击之前5、6或7天，以1mg/kg通过IP或IN施用的抗体CA6261的IN对比IP施用的研究。在长达病毒攻击之前7天进行的1mg/kg抗体的IN施用在预防上是有效的，并且在每一种情况下，IN比相同量的通过IP施用的抗体有效。事实上，在任何时间(攻击之前5、6或7天)上的IN施用均比任何IP施用有效，即使更靠近病毒攻击时施用IP亦如此。在所有情况下，抗体比Tamiflu更有效。

上述研究表明了IN施用事实上在预防性保护方面优于IP施用。达到感染前5天(-5dpi)的0.1mg/kg抗体的IN施用具有针对攻击(3xLD50)的保护作用。在病毒感染之前3-7天的任一天通过IP施用的相同剂量的0.1mg/kg不保护动物(针对相同3xLD50剂量的病毒)。在通过IN施用的抗体的较高剂量(评价1mg/kg)上，如果提前至少达7天施用的话，通过IN施用的抗体可保护免受攻击。未评价提前超过7天的IN施用，但所述施用可以是有效的。

感染后重复给药是有效的，当以数小时间隔(8小时、32小时、52小时)多次给药时，较低的鼻内剂量是有效的(数据未显示)。类似地，病毒感染或暴露前的重复给药经预测是有效的，并且可允许较低的IN预防性给药。

在较高剂量的病毒攻击下评价特别地在用10xLD50的H1病毒PR8攻击前数天施用CA2621抗体的预防功效。在用10xLD50的PR8H1亚型病毒攻击前3和4天，通过IN或IP向动物施用0.1mg/kgCA6261抗体(数据未显示)。病毒攻击前3或4天0.1mg/kg抗体的IP施用完全无效，IP处理的动物与未接受处理的动物相似地死于病毒感染。相反地，在高滴度病毒攻击之前3或4天鼻内施用0.1mg/kg抗体的动物获得保护而免受感染。

评价高滴度攻击之前5、6和7天的抗体施用，通过IN或IP以1mg/kg施用抗体(图15)。在本研究中，只有气道(通过鼻内施用)被施用抗体的动物在病毒攻击时完全存活下来。利用1mg/kg的抗体(在病毒攻击前5、6或7天施用的)处理的小鼠未获得完全保护，小鼠死于感染。Tamiflu在保护上完全无效。在病毒攻击前5或6天利用0.1mg/kg抗体鼻内处理的小鼠在病毒攻击时几乎与未受感染的对照动物一样存活下来。

因此，抗流感抗体的鼻内施用是用于预防病毒感染的有效方案和方法。在病毒感染前至少达7天鼻内施用的流感中和抗体具有抗病毒攻击的保护使用。对于高滴度的病毒(甚至高于可能对于代表人对病毒的暴露所合理预期的)，表明了通过提前至少多至7天的鼻内施用的保护。在这些研究中观察到的保护水平表明鼻内抗体施用在人受试者中对于保护免受病毒攻击以及阻断或减少病毒传播是有效的。肺部施用的抗体在其中全身性施用是无效的条件和情况下具有保护作用。

实施例16.用于流感治疗或预防的组合。

与流感的3个主要株(H1、H3和B)交叉反应的抗体的组合是期望的，以使得任何预期的循环流感可以以单个剂量或剂量的组合来治疗或预防。这可绕开对在施用抗体或抗体混合物之前详尽表征感染性病毒的需要。确定流感株的诊断需要用到临床实验室设施，并且通过需要12-24小时的最短出报告时间，如果在选择适当的定向疗法之前需要确定流感病毒株，则这导致治疗的不利延迟。通过使用针对甲型和乙型流感病毒株的广泛反应性组合物，先前的株诊断在治疗之前不是必需的。另外，抗体，特别地中和抗体，具有不能通过接种获得的立即治疗效应，该效应只起预防作用，通过需要数周来变得有效。

我们寻求评价和鉴定覆盖甲型和乙型流感的单克隆抗体(mAb)的治疗性组合。具体地，适合的和有价值的组合包括有效地针对甲型组1、甲型组2和乙型流感病毒的抗体。这提供了有效地针对相关和循环流感的组合，并且所述组合可在病毒类型的诊断评价或评估之前施用或可被施用而无需所述诊断或评估。治疗性组合的标准包括：有效的中和抗体；具有针对相关循环流感病毒，特别地甲型流感H1和H3以及乙型流感的组合功效的抗体；针对甲型流感或乙型流感攻击的组合功效；抗体之间的显著相互作用或竞争的不存在；对于IP、IV和IN途径或经由气道的途径以及全身性途径是有效的抗体。优选地，被包含在混合物中的mAb具有相容性生物物理性质，以使得它们容易被共配制。pI值的匹配可以是期望的。治疗性组合可有效地针对任何相关循环流感病毒，而无需诊断性评估或表征患者或受试者的流感。人单克隆抗体，或至少在重链和轻链中包含人可变区，特别地至少人互补决定区(CDR)的抗体是优选的，并且可被利用。

评价合适的抗甲型流感抗体。抗H1抗体TRL053(MAb53)在体外和体内中和组1流感病毒(包括H1)上是有效的。TRL-053是从人抗体噬菌体文库分离的，描述于US2012/0020971和WO2011/160083中，并且在中和组1和2H1、H9、H7和H5亚型上是有效的。TRL053表现出在纳摩尔或亚纳摩尔范围内的对流感H1和H5病毒株的结合亲和力Kd，并且表现出8.54的等电点(pI)。在附随的序列表中提供了TRL053的重链和轻链可变区CDR序列，上文中指示了完全可变区氨基酸序列。体内评价TRL053的针对H1病毒PR8的功效(图11B)。用10XLD50的H1流感病毒PR8接种动物，并在24hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的通过IN或IP施用的抗体TRL053(MAb53)处理动物。每日监测动物的体重，持续感染后14天。TRL053对于IP或IN施用是有效的，然而，通过IN施用的TRL053显示比IP给药更大的功效。TRL053仅在10mg/kg的IP剂量上稍许有效。本研究中的IN剂量在10mg/kg和1mg/kg上是有效的。

抗H1抗体TRL579(MAb579)在体外和体内中和组2流感株上是有效的。TRL-579是从人抗体噬菌体文库分离的，描述于WO2013/086-52中，并且在中和H3和H7上是有效的。TRL579表现出在纳摩尔和亚纳摩尔范围内的对流感H3和H7的结合亲和力Kd，并且表现出8.60的等电点(pI)。在附随的序列表中提供了TRL-579的重链和轻链可变区CDR序列，在上文中指示了完全可变区氨基酸序列。在体内评估TRL579针对H3病毒Vic/11的功效(图12B)。用10XLD50的病毒接种动物，并在24hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的通过IN或IP施用的抗体TRL579处理动物。每日监测动物的体重，持续感染后14天。TRL579对于IP或IN施用是有效的，然而，通过IN施用的TRL579显示比IP给药更大的功效。TRL579仅在10mg/kg的IP剂量上稍许有效。本研究中的IN剂量在10mg/kg和1mg/kg上是有效的。

为了以有效的组合提供合适的抗B抗体，分离针对乙型流感的抗体。使用CellSpot(美国专利7,413,868)鉴定结合流感的血凝素蛋白(HA)并在中和B/Yamagata和B/Victoria进化枝的乙型流感病毒上有效的人抗体，以鉴定高亲和力结合抗体，所述人抗体最初描述于2014年2月4日提交的USSN 61/935,746中。B特异性抗体及其序列，特别地各种B抗体的单克隆抗体重链和轻链CDR序列的列表描述于序列表中。指示了重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3，如通过IMGT标准(国际ImMunoGeneTics数据库imgt；Ehrenmann F.,Kaas Q.和Lefranc M.-P.(2010)Nucleic Acids Res.,38,D301-307)确定的。

所述B抗体被构建并分离来具有相同的重链恒定区序列。对恒定区进行密码子优化以用于在人中表达。上文中提供了重链IgG1恒定区序列(SEQ ID NO：297)。上文中提供了的κ轻链抗体(TRL845、846、847、809、849和854)的轻链恒定区(SEQ ID NO：295)。抗体TRL848和832具有如下文中指示的λ轻链恒定区(SEQ ID NO：296)。

上文中和附随的序列表中指示了B抗体的重链和轻链可变区序列。

实施例17.B抗体的表征。

为了鉴定和表征适用于广泛有效的抗体组合的单克隆抗体，评价针对乙型流感的人抗体的针对乙型流感病毒功效。图16提供了评估各种抗B抗体的血细胞凝集抑制、经典体外中和和体内施用的评价性研究的制表。评估抗体对B谱系Yamagata和Victoria的抗性。以在每一种情况下3个不同研究的概括提供体内结果，其评价了利用10xLD50的病毒接种的，并在24hpi被以1mg/kg通过IN施用指示的TRL抗体的动物的相对初始体重的百分比。观察动物体重，持续14天，标示观察到的最低体重。TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的每一种在整个体内功效评价过程中有效地维持至少96％的初始体重。

评价B抗体对流感病毒的亲和力以用作相对功效的指标方面。在图17中提供了某些数据。记录抗体的等电点。TRL053的等电点(pI)为8.54，TRL579的pI为8.60。评价针对B/Florida(Yamagata谱系)和B/Malaysia(Victoria谱系)流感病毒株的亲和力，将以nM表示的K_D列表。所述B抗体表现出对于B/Florida株的纳米或亚纳米亲和力。在每一种情况下TRL845、TRL847、TRL848、TRL849和TRL854的每一种对于B/Malaysia的亲和力为亚纳摩尔(<1.0nM)(数据未显示)。

在用分别代表Yamagata和Victoria谱系的B/Florida或B/Malaysia病毒感染的动物中测试单克隆乙型流感抗体的功效。在利用10XLD50的病毒感染后24小时通过以1mg/kg进行IN施用来评价抗体。在图18、图19和图22B中提供了B/Florida病毒的功效结果。在图20、图21和图22A中提供了B/Malaysia病毒的功效结果。通过IN施用的抗乙型流感抗体显示针对以10XLD50剂量进行的任一B谱系的感染的功效，几种抗体显示抗体处理的感染的动物保留100％的体重。基于体内功效和新和力研究，抗体TRL847、TRL845、TRL849、TRL848、TRL84、TRL854以及TRL809和TRL832被选定为优选抗体。

这些研究提供了对于与抗H1和抗H3抗体组合使用，以提供具有针对人群中的主要流感株的交叉反应性和有效性的抗体的组合特别有效的几种B抗体。以混合物形式测试抗H1抗体TRL53、抗H3抗体TRL579和抗B抗体的组合。B抗体5A7描述于上面先前的实施例中，并且对于在24hpi通过IP或IN施用治疗B/Florida或B/Malaysia是有效的(图5)。肺部施用显示较大的功效，至少在1mg/kg或0.1mg/kg上是有效的，然而对于全身性递送需要较高的剂量来获得可比较的功效。

实施例18.混合物、组合和组合物。

组合的多种抗体(每种10mg/kg)的施用是很大的蛋白质抗体剂量负荷，并且可能不被很好地耐受或调整，特别是在患病或处于风险中的患者中。以较低剂量(特别地在1mg/kg的范围内)包含抗体的抗体组合或混合物是可行的。抗体的IN施用在本文中被证明在1mg/kg或更少上是有效的，即使以预防的方式提供亦如此。包含有效地针对组1和组2病毒的抗甲型流感抗体，特别地针对H1和抗H3抗体以及抗乙型流感抗体的混合物，以单个剂量或组合提供了抗人群中的所有相同流感株和类型的抗体的组合。体内评价抗体TRL053、TRL579和5A7的混合物(每种1mg/kg，总共3mg/kg抗体)的免受因病毒感染而引起的体重减轻的保护作用。在用10xLD50的病毒感染后24小时，以单一混合的剂量施用抗体混合物。所述混合物显示针对H1病毒、H3病毒、B/Yamagata谱系病毒和B/Victoria谱系病毒的每一种或任一种的感染的功效(图23)。

以抗体混合物形式评价抗H1抗体TRL053、抗H3抗体TRL579和抗B TRL抗体的组合。这些组合包含有效地针对相关流感类型或株，并且当组合时是相容的和有效的抗体。利用相同亚型的骨架构建它们，它们具有相似的pI，不相互作用或竞争，并且中和它们的靶流感病毒而在另外的一种或多种抗体存在的情况无干扰或浓度效应。体内评价感染后施用的TRL053、TRL579和每一种候选B TRL抗体的混合物(每种1mg/kg，总共3mg/kg抗体)的免受因病毒感染而引起的体重减轻的保护作用。表明了针对H1病毒、H3病毒、B/Yamagata谱系病毒和B/Victoria谱系病毒的每一种或任一种的感染的功效。图7A-D描绘了各种混合物的IN施用的研究的结果。利用抗体的组合实现了针对H1病毒、H3病毒和B/Yamagata和B/Victoria谱系病毒感染的完全保护。图7A-7D提供了来自3个示例性混合物-TRL053、TRL579和TRL845(c)(混合物1)、TRL053、TRL579和TRL847(混合物2)以及TRL053、TRL579和TRL849(混合物3)的结果。

图7A-7D显示3种抗流感mAb的共施用不干扰抗B mAb的功效。利用10xLD50的病毒感染小鼠，并在24hpi用3mg/kg由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗BTRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理小鼠，以PBS和无病毒作为对照。每日监测动物的体重，持续感染后14天，并将相对于初始第0天的重量的百分比体重用于绘制曲线。

图7A-7D一起表明所述混合物将提供预期水平的保护，而无来自针对来自所有季节性流感亚型(H1N1、H3N2以及B的两个谱系)的代表性株的混合物中的其它mab的干扰。

图7A显示用10xLD50H1N1感染的并在24hpi用3mg/kg由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7B显示用10xLD50H3N2感染的并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7C显示用10xLD50B/Yamagata谱系感染的并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

图7D显示用10xLD50B/Victoria谱系感染的并在24hpi用3mg/kg的由抗H1CF-401、抗H3CF-402和抗B TRL845(混合物1)、抗B TRL847(混合物2)或抗B TRL849(混合物3)组成的三元mAb混合物处理的小鼠的体内保护。

数据表明，组合3种新型和独特的抗体的混合组合物有效地针对由任何相关或循环病毒株或类型引起的流感感染。组合抗体有效地针对组1和组2甲型流感病毒以及乙型流感病毒。利用以单个剂量施用的抗体的组合实现了抗任何攻击的保护。为了使单个剂量组合是有效的和被耐受的，并且无需成本昂贵或过多的抗体剂量，可在被作为混合物直接向气道施用(诸如通过鼻内施用)的组合中实现低剂量。各自在1mg/kg或更少的剂量范围内的抗体的组合的功效先前未曾被针对所有相关甲型和乙型流感病毒的抗体的组合实现。本文中描述的和提供的抗体的组合共同地中和所有相关流感病毒，并且被设计来特别能组合。所述抗体具有相容的生物物理性质。组合中的抗体不能彼此竞争或显著干扰，并且每一种在组合中的活性与它们单独存在时的活性相当。所述抗体具有相似的等电点并且在细胞培养中相似地表达。在本文中的一个方面，所述抗体被建立在相同的IgG骨架上并且共有恒定区序列，重组表达的每一种抗体具有相同的重链和轻链恒定区序列或相关序列。

本发明可在不背离其精神或基本特征的情况下，以其它形式来体现或以其它方式来进行。本公开从而被解释为在所有方面举例说明而非限制，本发明的范围由所附权利要求表示，并且落在等效的含义和范围内的所有变化旨在被包含在本文中。

在整个本说明书中引用于各种参考文献，其每一篇通过引用整体并入本文。

Claims (32)

1.一种分离的人抗体，其包含：

(1) 包含重链可变区(HCVR)的重链氨基酸序列，所述HCVR包含：

由SEQ ID NO: 241的氨基酸序列组成的重链互补决定区1 (HCDR1)、由SEQ ID NO:242的氨基酸序列组成的重链互补决定区2 (HCDR2)和由SEQ ID NO: 243的氨基酸序列组成的重链互补决定区3 (HCDR3)；和

(2) 包含轻链可变区(LCVR)的轻链氨基酸序列，所述LCVR包含：

由SEQ ID NO: 244的氨基酸序列组成的轻链互补决定区1 (LCDR1)、由SEQ ID NO:245的氨基酸序列组成的轻链互补决定区2 (LCDR2)和由SEQ ID NO: 246的氨基酸序列组成的轻链互补决定区3 (LCDR3)；

所述抗体具有结合和/或抑制流感病毒的性质，其中所述流感病毒选自乙型流感株B/Florida/06、B/Mass/12、B/Wisconsin/10、B/Brisbane/08、B/Malaysia/04和/或B/Victoria/87。

2.一种分离的抗体，其特异性结合乙型流感Yamagata和乙型流感Victoria进化枝的每一种的一个或多个株，所述抗体包含：

含有SEQ ID NO: 249的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)和含有SEQ ID NO: 250的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)，

所述分离的抗体具有结合和/或抑制Victoria和Yamagata乙型流感病毒株的性质，所述乙型流感病毒株选自B/Florida/06、B/Mass/12、B/Wisconsin/10、B/Brisbane/08、B/Malaysia/04和/或B/Victoria/87。

3.根据权利要求1所述的分离的人抗体，其结合选自SEQ ID NO: 311、312和313的一个或多个表位，或其不连续表位。

4.一种分离的密码子优化的核酸分子，其编码权利要求1所述的分离的人抗体。

5.一种表达载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种用于表达重组多肽的宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。

7.一种产生抗乙型流感抗体的方法，其包括在允许所述抗体产生的条件下使权利要求6所述的宿主细胞生长，和回收所产生的所述抗体。

8.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体，其中所述抗体表现出如在PBS中测量的大于或等于55℃的第一解链温度(Tm1)。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其还包含具有对于甲型流感的至少一个株的结合特异性的一种或多种人抗体。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中对于甲型流感具有特异性的所述抗体包括对于组1和组2的一个或多个株的特异性。

12.一种药物组合物，其包含：

(a) 第一抗体，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有由SEQ ID NO:11组成的HCDR1、由SEQ ID NO: 12组成的HCDR2、和由SEQ ID NO: 13组成的HCDR3的重链可变区(HCVR)；和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有由SEQ ID NO: 14组成的LCDR1、由SEQ ID NO: 15组成的LCDR2、和由SEQ ID NO: 16组成的LCDR3的轻链可变区(LCVR)，所述第一抗体能够结合和/或抑制甲型流感病毒H1、H9、H7和H5亚型；

(b) 第二抗体，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有由SEQ ID NO:21组成的HCDR1、由SEQ ID NO: 22组成的HCDR2、和由SEQ ID NO: 23组成的HCDR3的重链可变区(HCVR)；和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有由SEQ ID NO: 24组成的LCDR1、由SEQ ID NO: 25组成的LCDR2、和由SEQ ID NO: 26组成的LCDR3的轻链可变区(LCVR)，所述第二抗体能够结合和/或抑制甲型流感病毒H3和H7亚型；和

(c) 第三抗体，其包含重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含含有由SEQ ID NO:241组成的HCDR1、由SEQ ID NO: 242组成的HCDR2和由SEQ ID NO: 243组成的HCDR3的重链可变区(HCVR)；和轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含含有由SEQ ID NO: 244组成的LCDR1、由SEQ ID NO: 245组成的LCDR2和由SEQ ID NO: 246组成的LCDR3的轻链可变区(LCVR)，所述第三抗体能够结合和/或抑制流感病毒，其中所述流感病毒选自乙型流感株B/Florida/06、B/Mass/12、B/Wisconsin/10、B/Brisbane/08、B/Malaysia/04和/或B/Victoria/87。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述第一抗体包含SEQ ID NO: 19和20的HCVR/LCVR对。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述第二抗体包含SEQ ID NO:29和30的HCVR/LCVR对。

15.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述第三抗体包含SEQ ID NO: 249和250的HCVR/LCVR对。

16.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述第一、第二和第三抗体的每一种表现出均在2 pI点范围内的等电点(pI)。

17.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述第一抗体为包含SEQ ID NO: 17和18的重链(HC)/轻链(LC)氨基酸序列的TRL053/Mab53，所述第二抗体为包含SEQ ID NO: 27和28的HC/LC氨基酸序列的抗体TRL579/Mab579，并且所述第三抗体是包含SEQ ID NO: 247和248的HC/LC氨基酸序列的抗体TRL849。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中以对于治疗或预防有此需要的受试者的甲型流感和乙型流感感染或疾病是有效的量将所述第一、第二和第三抗体的每一种配制在单个剂量中。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述第一、第二和第三抗体的每一种各自以每剂量100 mg/kg或更少的所述第一、第二和第三抗体的每一种的量存在于所述组合物中。

20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述第一、第二和第三抗体的每一种各自以每剂量10 mg/kg或更少的所述第一、第二和第三抗体的每一种的量存在于所述组合物中。

21.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述第一、第二和第三抗体的每一种各自以每剂量1 mg/kg或更少的所述第一、第二和第三抗体的每一种的量存在于所述组合物中。

22.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述第一、第二和第三抗体的每一种各自以每剂量10 mg/kg或更少的总的抗体的量存在于所述组合物中。

23.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述载体包含用于经鼻或肺部递送的稀释剂和/或赋形剂。

24.根据权利要求18所述的药物组合物，其还包含免疫调节剂、抗病毒治疗剂、病毒复制抑制剂、蛋白酶抑制剂、聚合酶抑制剂、血凝素抑制剂、支气管扩张药或吸入皮质类固醇的一种或多种。

25.根据权利要求12所述的药物组合物在制备用于治疗或预防受试者的流感感染的药物中的用途。

26.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂是干扰素β1a。

27.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗病毒治疗剂是选自奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和拉尼米韦的神经氨酸酶抑制剂。

28.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗病毒治疗剂是选自法维拉韦(T-705)和VX 787的RNA聚合酶抑制剂。

29.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗病毒治疗剂是选自流感酶(Das181)和AB-103(p2TA)的宿主细胞靶向治疗剂。

30.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述抗病毒治疗剂是选自金刚乙胺和金刚烷胺的离子通道抑制剂。

31.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述支气管扩张药选自沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇或沙美特罗。

32.根据权利要求1所述的分离的抗体，其为重组抗体。