HK1136844A1 - 含钒的磷酸酶抑制剂的增强作用 - Google Patents

含钒的磷酸酶抑制剂的增强作用 Download PDF

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Description

含钒的磷酸酶抑制剂的增强作用
本发明涉及磷酸酶的生物化学。具体而言，本发明涉及可与不同磷酸酶的含钒的抑制剂共存的、用作添加剂的化合物。如本发明中用作添加剂的化合物可增强抑制作用。因此，较低浓度的含钒化合物即可充分抑制磷酸酶。
发明背景
磷酸酶是可将磷酸单酯水解为磷酸根离子和含自由羟基的分子的酶。该作用与可将磷酸基团通过例如ATP之类的化学能贮存分子加到其底物上的磷酸化酶和激酶的作用截然相反。
磷酸酶可分为两个主要的类别：金属酶(在其活性部位需要存在两个或多个金属离子以产生活性)和非金属酶。这些类别可进一步划分为亚类。迄今金属酶包括了大部分的磷酸酶，并包括例如碱性磷酸酶(含三个金属离子，其中只有两个是具有催化活性的)、丝氨酸苏氨酸磷酸酶和肌醇单磷酸酶这样的酶。了解最清楚的非金属酶是蛋白酪氨酸磷酸酶，可水解磷酸-酪氨酸残基。
已知蛋白上的磷酸基团的存在与否可在多个生化途径、特别是信号传导途径中起调控作用。酪氨酸残基可通过蛋白激酶连接磷酸基团(磷酸化)。在磷酸化状态下，酪氨酸残基称为磷酸酪氨酸(phosphotyrosine)。酪氨酸磷酸化被认为是信号传导和调控酶活性的关键步骤之一。磷酸酪氨酸可通过特定抗体进行检测。特定的激酶和磷酸酶一起可调控信号传导途径的酶、受体和其它组分、转录因子及其它功能蛋白的活性。
因此，有多种生化方法可检测生物样品中的磷酸化蛋白。例如，裂解样品细胞材料，将蛋白组分进行一维(例如SDS-PAGE)或二维(例如，第一维为等电聚焦，第二维为SDS-PAGE)分离，通过磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸特异抗体检测每个条带或点的磷酸化蛋白。其它特异的检测方法使用与特定磷酸化蛋白特异结合的抗体。这种抗体通常用于来自活组织检查材料的福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中的磷酸化靶蛋白的组织化学检测。
不管使用哪种检测方法，都希望磷酸化蛋白的分析结果可反映实验开始的时间点，即细胞裂解或组织固定和切片时的磷酸化状态。更通常是希望在特定时间点保持蛋白磷酸化的状态。可通过抑制磷酸酯从其靶蛋白上水解来进行保持。为了该目的，本技术领域提供了多种可抑制磷酸酶活性的物质。抑制剂通常可用于检测磷酸化蛋白的检测方法中，也可用于大量纯化磷酸化蛋白的过程中。
在磷酸酶活性的含钒抑制剂中，过钒酸盐和钒酸盐是了解最多应用最广泛的物质。钒酸盐是可模拟磷酸盐水解的过渡态的磷酸盐类似物，因此被认为是通用的磷酸酶抑制剂。不过，公认的是钒酸盐特别适于抑制酪氨酸磷酸酶(Huyer，G.，et al.，J.Biol.Chem.272(1997)843-851)和碱性磷酸酶(例如，Stankiewicz，P.J.，et al.，in Met.Ions Biol.Syst.31(1995)287-324)。但也报道了对其它磷酸酶，例如ATPases、葡萄糖-6-磷酸酶、酸性磷酸酶或果糖-2，6-二磷酸酶的抑制。
但不利之处在于，为了提供有效量的钒酸盐，其浓度必须在微摩尔、甚至毫摩尔的范围。在这点上，“有效量”可理解为在水溶液中的抑制剂浓度在1x(1倍)和50x(50倍)之间，在1x浓度中的有效量可以20为倍数降低磷酸酶活性。相对于钒酸盐，已知其它的磷酸酶活性抑制剂在纳摩尔浓度有效。例如斑蝥素。
然而，已报道可通过形成稳定的含钒络合物来增强抑制作用。例如，二过氧(二嘧啶)含氧钒酸钾(potassium bisperoxo(bipyridine)oxovanadate)(V)和二过氧(1，10菲咯啉)含氧钒酸钾(potassiumbisperoxo(I，10 phenanthroline)oxovanadate)(V)均比原钒酸盐更有效。但钒酸盐的络合作用不是提高有效性所必需的前提条件。例如，羟胺或二甲基羟胺可与钒酸盐自发形成络合物。这些络合物的有效性保持原水平或有一定程度降低(Cuncic，C.，et al.，Biochem.Pharmacol.58(1999)1859-1867)。在细胞水平的检测法中，已发现这两种化合物可增强细胞腔对钒酸盐的吸收(Nxumalo，F.，et al.，J.Biol.Inorg.Chem.3(1998)534-542；Cuncic，C.，et al.，Biochem.Pharmacol.58(1999)1859-1867)。
进一步已知在存在特定的络合物形成试剂，例如EDTA时，钒酸盐抑制磷酸酶的作用可降低约1,000倍(Huyer，G.，et al.，J.Biol.Chem.272(1997)843-851)。这是非常不利的，因为EDTA在生物化学中通常用来作为稳定剂，以及作为诸如磷酸酶和蛋白酶这样的金属酶的抑制剂。另一种重要的用于制备细胞裂解物的稳定剂是二硫苏糖醇(DTT)。发明人已发现DTT也可显著降低钒酸盐对磷酸酶的抑制作用。
考虑到现有技术的不利因素，本发明的一个目的是提供可增强含钒化合物对具有磷酸酶活性的酶的抑制作用的替代化合物。本发明的另一个目标是提供可抵消EDTA和DTT对含钒化合物的负面作用的化合物。
本发明人惊讶的发现，在存在多羟基化合物(polyol)时，钒酸盐对磷酸酶，特别是磷酸酪氨酸特异的磷酸酶的抑制作用增强了。该作用甚至可在非常简单的多羟基化合物、例如甘油，以及含糖醇，例如甘露醇中观察到。尤为更令人惊讶的是发现EDTA和DTT对钒酸盐的负面作用显著降低，或甚至完全消失。
发明概述
本发明的第一个实施方案是使用含(i)选自氧钒根(vanadyl)(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)及其混合物的离子化合物，及(ii)多羟基化合物的组合物来抑制具有磷酸酶活性的酶。本发明的第二个实施方案是含(i)选自氧钒根(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)及其混合物的离子化合物，及(ii)多羟基化合物的组合物，其特征在于多羟基化合物和含钒化合物的摩尔比等于或大于1∶1。本发明的第三个实施方案是抑制具有磷酸酶活性的酶的方法，包括步骤(a)在水溶液中溶解含(i)选自氧钒根(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)及其混合物的离子化合物及(ii)多羟基化合物的组合物，及(b)将具有磷酸酶活性的酶与步骤(a)中的溶液接触。本发明的第四个实施方案是含包装材料和组分的试剂盒，其中组分含有(i)选自氧钒根(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)及其混合物的离子化合物及(ii)多羟基化合物的组合物。
发明的详细描述
在本发明说明书中的特定术语具有特定含义，或是首次进行定义。为了理解本发明，用于描述本发明的术语当存在本领域接受的含义时，以该含义进行定义，除非那些定义与以下列出的定义相矛盾或部分矛盾。在定义中存在矛盾的情况下，术语的含义首先通过以下列出的定义来进行定义。
本发明的说明书和权利要求书中所用术语“含有”是指“包括，但不限定于”。不定冠词“a”与用于指示诸如抑制剂或添加剂这样的化学化合物的术语一起使用，是用于表示“一个或多个”。“磷酸酶抑制剂”是一种有效抑制通过磷酸酶活性进行的磷酸酯水解、从而从靶分子中释放磷酸根离子的物质。“水”溶液是指其中液体溶剂是至少含80％[v/v]水，更优选地含95％[v/v]、更优选地含99％[v/v]、更优选地含100％[v/v]的溶液。本领域技术人员应理解，溶液进一步可含有一种或多种诸如盐、缓冲液、抑制剂、添加剂及生物分子这样的化合物，其中一种或多种化合物可溶解在液体溶剂中。
如本发明所述的组合物含有选自氧钒根(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)及其混合物的离子化合物。更优选地，含钒离子化合物是原钒酸盐(V)及其寡聚体。优选的寡聚体选自二、三及四聚钒酸盐离子。另一个特别优选的如本发明所述的组合物中的离子化合物是过氧钒酸盐离子。不过，最优选的是原钒酸盐(VO4 3-)。
如本发明所述组合物中的“多羟基化合物”是水溶性有机化合物，其中两个或多个羟基基团与碳原子共价连接。优选地，如本发明所述的多羟基化合物的两个羟基基团与两个邻近的碳原子连接。即，优选的多羟基化合物含有两个邻近的羟基基团。但具有多于两个邻近的羟基基团的多羟基化合物是优选的。已十分了解并且特别优选的具有邻近羟基基团的多羟基化合物是糖醇。“糖醇”是碳水化合物的氢化形式，其羰基基团(醛或酮)被还原为初级或次级羟基基团。碳水化合物的非氢化形式也称为“还原”糖。
如本发明所述的组合物优选地含有具有4-100个碳原子的糖醇。在这种情况下，非还原单、二、三及四糖是非常优选的。
一种非常优选的糖醇是非还原单糖。这种糖醇是C4糖醇，优选地选自苏糖醇和赤藓糖醇。同样优选地，糖醇是C5糖醇，优选地选自核糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇和lyxitol。同样优选地，糖醇是C5脱氧糖醇，优选地选自脱氧核糖醇和脱氧阿拉伯糖醇。同样优选地，糖醇是C6糖醇，优选地选自蒜糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、gulitol、艾杜醇、半乳糖醇和塔罗糖醇。
根据本发明，脱氧糖醇包括在术语糖醇中，只要脱氧糖提供了四对或多对邻近的羟基基团即可。优选的糖醇是C6脱氧糖醇，优选地选自脱氧山梨糖醇和脱氧甘露醇。同样优选的糖醇是在C2位置具有其它取代基团的糖醇，优选的例子是N-乙酰山梨糖醇胺2，其它在C2位置具有其它取代基团，例如N-乙酰山梨糖醇胺2。
二糖和单糖均可形成糖醇；但从二糖(例如甘露醇和乳糖醇)衍生的糖醇不是完全氢化的，因为由于糖苷键的原因，仅有一个醛基基团可被还原。对三糖和更高的糖同样如此。因此，具有多达100个C原子的非还原二糖或三糖或者具有非还原性的更高的寡糖在实施本发明时非常有利。蔗糖是十分优选的糖醇。值得注意的是，蔗糖与大多数多糖不同，糖苷键是在葡萄糖和果糖的还原末端形成的，而不是在一个的还原末端和另一个的非还原末端形成的。这种作用抑制了与其它糖单元的进一步成键。由于蔗糖不含有自由的异头碳原子，因此属于非还原糖。
根据本发明，优选的多羟基化合物与含钒离子化合物的摩尔比高于1∶1。特别优选地，摩尔比在100∶1和1∶1之间。更优选地，摩尔比为70∶1和5∶1之间。更优选地，摩尔比为50∶1和10∶1之间。
以不存在含钒抑制剂的样品中的磷酸酶活性为参照(100％)，当将如本发明所述的选自氧钒根(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)的离子化合物与多羟基化合物的组合物加到样品中时，可实质上降低所述磷酸酶活性。优选地，所述活性降低的值为1.5％到40％、更优选地，该值为1.5％到30％、更优选地，该值为1.5％到20％、更优选地，该值为1.5％到10％。
在一方面，多羟基化合物可增强含钒离子化合物对磷酸酶活性的抑制作用。另一方面，多羟基化合物可降低络合物形成试剂的负面影响。即，对磷酸酶活性的抑制不因存在针对二价或三价正电荷金属离子的螯合剂而受到不利影响。因此，二价离子的络合物的形成可以，例如，无副作用地抑制多种蛋白酶的非所要求的活性。所以，本发明的组合物另外含有二价或三价正电荷金属离子的螯合剂。优选的螯合剂选自EDTA、柠檬酸盐、EGTA和1，10-菲咯啉。如本发明所述的组合物中螯合剂的优选浓度是0.1mM到50mM、更优选地是0.2mM到10mM，最优选地是约1mM。
另外，组合物中的多羟基化合物可降低还原剂对含钒离子化合物的负面影响。特别是DTT可降低原钒酸盐对磷酸酶活性的抑制作用。但在存在多羟基化合物时，还原作用会受到逆转。优选的还原剂选自DTT(二硫苏糖醇)、β-巯基乙醇、谷光甘肽和硫氧还蛋白。如本发明所述的组合物中还原剂的优选浓度为0.1mM到30mM、更优选地为0.2mM到10mM、最优选地为约1mM。
在本发明的另一个实施方案中，以便利形式为终端用户提供了组合物。因此另一个实施例是含有测定量的组合物的包装。优选包装材料以防止与水蒸气的水接触。另外，一种或多种包装可在存在诸如硅胶或其它合适物质这样的干材料的情况下贮存。组合物可以是自由流动性颗粒形式。更优选地，组合物是片剂形式。在这种情况下，组合物可另外含有其它利于片剂形成的材料。
此外，本发明的组合物可含有一种或多种其它除了含钒化合物之外的磷酸酶抑制剂。优选地，一种或多种其它磷酸酶抑制剂是例如NaF之类的离子抑制剂。同样优选地，抑制剂也可以是选自斑蝥素、磷酸萘(napthyl phosphate)和微囊藻素毒的低分子量化合物。同样优选地，抑制剂也可以是选自钙调神经磷酸酶自抑制肽和蛋白磷酸酶抑制剂2的peptidic化合物。
由于除了含钒化合物之外存在多羟基化合物时的令人惊讶的效果，因此如本发明所述的组合物适于抑制具有磷酸酶活性的酶。组合物特别适于抑制选自酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、磷酸酪氨酸磷酸酶、ATPase、磷酸丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和二元磷酸酶这样的磷酸酶。最优选地，组合物可用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，即它可以水解磷酸酪氨酸残基的磷酸酯，而磷酸酪氨酸残基是磷酸化多肽的一部分。含有磷酸化酪氨酸残基、并作为磷酸酪氨酸特异蛋白磷酸酶底物的多肽的实施例有红细胞生成素、pErk1、pErk2和pJak2的磷酸化受体。
因此，本发明的另一个实施方案是抑制具有磷酸酶活性的酶的方法，包括步骤(a)在水溶液中溶解含(i)选自氧钒根(II)、钒酸盐(IV)、钒酸盐(V)、低聚钒酸盐(V)及其混合物的离子化合物，及(ii)多羟基化合物的组合物，及(b)将具有磷酸酶活性的酶与步骤(a)中的溶液接触。
因此，本发明的又一实施方案是含如本发明所述的组合物及水溶液的液体组合物。优选地，液体组合物的pH值是其中磷酸酶(一种或多种靶磷酸酶)具有活性的pH值。pH优选地是pH5.5-pH8.5，更优选地是pH6.7-pH8.0。
提供以下实施例、附图和序列列表用于理解本发明，本发明的请求保护的范围于后附的权利要求所示。应理解到，在不偏离本发明的主旨的情况下可进行适当的修改。
附图说明
图1在存在和不存在多羟基化合物时，原钒酸盐对磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制。实验原理见实施例1。纵坐标表示残余的磷酸酶活性。线条表示由以下组合物获得的结果：(1)不加抑制剂(对照，100％残余活性)；(2)1mM原钒酸盐；(3)2mM原钒酸盐；(4)1mM原钒酸盐，27mM甘露醇；(5)1mM原钒酸盐，54mM甘油。
图2在存在和不存在多羟基化合物及存在EDTA和DTT时，原钒酸盐对磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制。实验原理见实施例2。纵坐标表示残余的磷酸酶活性。线条表示由以下组合物获得的结果：(1)不加抑制剂(对照，100％残余活性)；(2)1mM原钒酸盐；(3)2mM原钒酸盐；(4)1mM原钒酸盐，27mM甘露醇；(5)1mM原钒酸盐，54mM甘油。
图3在存在和不存在多羟基化合物及存在EDTA、有或无DTT时，原钒酸盐对磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制。实验原理见实施例3。纵坐标表示残余的磷酸酶活性。线条表示由以下组合物获得的结果：(1)1mM原钒酸盐，含EDTA的Hepes缓冲液；(2)1mM原钒酸盐，含EDTA和DTT的Hepes缓冲液；(3)1mM原钒酸盐，含EDTA的Hepes缓冲液，存在27mM甘露醇；(4)1mM原钒酸盐，含EDTA和DTT的Hepes缓冲液，存在27mM甘露醇；(5)1mM原钒酸盐，含EDTA的Hepes缓冲液，存在54mM甘油；(6)1mM原钒酸盐，含EDTA和DTT的Hepes缓冲液，存在54mM甘油。
图4在存在和不存在甘露醇时，原钒酸盐在昆虫细胞裂解物中对磷酸酶活性的抑制。实验原理见实施例5。纵坐标表示残余的磷酸酶活性。线条表示由以下组合物获得的结果：(1)不加抑制剂(对照，100％残余活性)；(2)1mM原钒酸盐；(3)1mM原钒酸盐，27mM甘露醇。
图5在存在和不存在甘露醇时，原钒酸盐在COS7细胞裂解物中对磷酸酶活性的抑制。实验原理见实施例6。纵坐标表示残余的磷酸酶活性。线条表示由以下组合物获得的结果：(1)不加抑制剂(对照，100％残余活性)；(2)1mM原钒酸盐；(3)1mM原钒酸盐，27mM甘露醇。
实施例1
磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制作用
将重组产生的磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶(人T细胞；Calbiochem，No.Cat 539732)储液在含0.1mM CaCl2、50mM Tris pH7.0的缓冲液中按1∶200稀释。在单独的反应管中制备以下混合物(a-e)：36μl稀释的酶溶液与4μl的(a)水(作为100％对照)，或(b)10mM原钒酸盐；(c)20mM原钒酸盐(d)10mM原钒酸盐，270mM甘露醇；(e)10mM原钒酸盐，540mM甘油中的一种溶液。将各混合物在室温(RT)温育15分钟。然后，从每种混合物中转移10μl的一小份到微孔板中。向每个孔中加入5μl含磷酸酪氨酸残基的待测肽(肽序列为R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G；1mM，溶在水中)溶液及10μl含0.1mMCaCl2、50mM Tris pH7.0的缓冲液，在37℃温育30分钟。通过加入100μl另外含有0.034％[w/v]孔雀绿、10mM钼酸钠及3.4％[v/v]乙醇的1M HCI溶液，来对由磷酸酯键的酶水解所得到的游离磷酸盐进行检测反应。检测反应在室温进行10分钟，其间持续振荡微孔板。通过测定每个反应孔的消光(620nm)来检测磷酸的相对浓度。
实施例2
在存在EDTA和DTT时对磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制作用
将重组产生的磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶(人T细胞；Calbiochem，No.Cat 539732)储液在含25mM Hepes、50mM NaCl、2.5mM EDTA、5mM DTT、pH7.2的缓冲液中按1∶200稀释。在单独的反应管中制备以下混合物(a-e)：36μl稀释酶溶液与4μl(a)水(作为100％对照)，或(b)10mM原钒酸盐；(c)20mM原钒酸盐(d)10mM原钒酸盐，270mM甘露醇；(e)10mM原钒酸盐，540mM甘油中的一种溶液。将混合物在室温(RT)温育15分钟。然后，从每种混合物中转移10μl的一小份到微孔板中。向每个孔中加入5μl含磷酸酪氨酸残基的待测肽(肽序列为R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G；1mM，溶在水中)溶液及10μl含25mM Hepes、50mM NaCl、2.5mM EDTA、5mM DTT、pH7.2的缓冲液，在37℃温育30分钟。通过加入100μl另外含有0.034％[w/v]孔雀绿、10mM钼酸钠及3.4％[v/v]乙醇的1M HCl溶液，来对由磷酸酯键的酶水解所得到的游离磷酸盐进行检测反应。检测反应在室温进行10分钟，其间持续振荡微孔板。通过测定每个反应孔的消光(620nm)来检测磷酸的相对浓度。
实施例3
在存在EDTA、有或无DTT时对磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制作用
将重组产生的磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶(人T细胞；Calbiochem，No.Cat 539732)储液在含25mM Hepes、50mM NaCl、2.5mM EDTA、5mM DTT、pH7.2的缓冲液(酶溶液(i))中或在具有相同组分，但不含DTT的缓冲液(酶溶液(ii))中按1∶200稀释。在单独的反应管中制备以下混合物(a-f)：36μl稀释酶溶液(i)或(ii)以及4μl以下某种溶液(a、d)10mM原钒酸盐；(b、e)10mM原钒酸盐，270mM甘露醇；(c、f)10mM原钒酸盐，540mM甘油。将混合物在室温(RT)温育15分钟。然后，从每种混合物中转移10μl到微孔板中。向每个孔中加入5μl含磷酸酪氨酸残基的待测肽(肽序列为R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G；1mM，溶在水中)溶液及10μl含25mMHepes、50mM NaCl、2.5mM EDTA、5mM DTT、pH7.2的缓冲液(与酶溶液(i)反应)或10μl含25mM Hepes、50mM NaCl、2.5mM EDTA、pH7.2的缓冲液(与酶溶液(ii)反应)，在37℃温育30分钟。通过加入100μl另外含有0.034％[w/v]孔雀绿、10mM钼酸钠及3.4％[v/v]乙醇的1M HCl溶液，来对由磷酸酯键的酶水解所得到的游离磷酸盐进行检测反应。检测反应在室温进行10分钟，其间持续振荡微孔板。通过测定每个反应孔的消光(620nm)来检测磷酸的相对浓度。
实施例4
原钒酸盐对磷酸酪氨酸特异的蛋白磷酸酶的抑制作用
表1
在水溶性缓冲液中含有原钒酸盐和其它化合物的组合物中残余的磷酸酶活性如下所示。表格中数据参考图1-3给出的图示。
  缓冲液   活性
  图1：
  1)无抑制剂   100％
  16,6％
  15,7％
  8,5％
  9,7％
  图2：
  1)无抑制剂   25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   100％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   87,7％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   58,0％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   12,4％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   9,3％
  图3：
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；pH7,2   29,5％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   46,3％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；pH7,2   14,1％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   5,8％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；pH7,2   14,9％
  25mM Hepes；50mM NaCl；2,5mM EDTA；5mM DTT pH7,2   7,3％
实施例5
磷酸酶在昆虫细胞裂解物中的抑制作用
收集270mg昆虫细胞(SF9)，用50mM Hepes、50mM NaCl pH7.0洗涤3次，并用2.5ml M-Per(Pierce)裂解10分钟。离心后，收集裂解物上清。
检测磷酸酪氨酸活性：向45μl裂解物中加入5μl水或原钒酸盐(10mM)或原钒酸盐/甘露醇(10mM/270mM)，室温温育10分钟。
然后，从每种混合物中转移10μl到微孔板中。向每个孔中加入5μl待测肽(R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G；1mM，溶在水中)及10μl含0.1mM CaCl2、50mM Tris pH7.0的缓冲液，在37℃温育30分钟。通过加入100μl另外含有0.034％[w/v]孔雀绿、10mM钼酸钠及3.4％[v/v]乙醇的1M HCl溶液，来对由酶水解所得到的游离磷酸盐进行检测反应。检测反应在室温进行10分钟，其间持续振荡微孔板。通过测定每个反应孔的消光(620nm)来检测磷酸的相对浓度。
表2
在水溶性缓冲液中含有原钒酸盐和其它化合物的组合物中残余的磷酸酶活性如下所示。表格中数据参考图4给出的图示。
  磷酸酶活性
  无抑制剂(水对照)   100％
  1mM原钒酸盐   14％
  1mM原钒酸盐/27mM甘露醇   2％
实施例6
磷酸酶在COS7细胞裂解物中的抑制作用
收集COS7细胞，用50mM Hepes、50mM NaCl pH7.0洗涤3次，并用5ml M-Per(Pierce)裂解10分钟。离心后，收集裂解物上清。
检测磷酸酪氨酸活性：向45μl裂解物(1+4，含M-Per(Pierce))中加入5μl水或原钒酸盐(10mM)或原钒酸盐/甘露醇(10mM/270mM)，室温温育10分钟。
然后，从每种混合物中转移10μl到微孔板中。向每个孔中加入5μl待测肽(R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G；1mM，溶在水中)及10μl含0.1mM CaCl2、50mM Tris pH7.0的缓冲液，在37℃温育30分钟。通过加入100μl另外含有0.034％[w/v]孔雀绿、10mM钼酸钠及3.4％[v/v]乙醇的1M HCl溶液，来对由酶水解所得到的游离磷酸盐进行检测反应。检测反应在室温进行10分钟，其间持续振荡微孔板。通过测定每个反应孔的消光(620nm)来检测磷酸的相对浓度。
表3
在水溶性缓冲液中含有原钒酸盐和其它化合物的组合物中残余的磷酸酶活性如下所示。表格中数据参考图5给出的图示。
  磷酸酶活性
  无抑制剂(水对照)   100％
  1mM原钒酸盐   52％
  1mM原钒酸盐/27mM甘露醇   36％
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
F.Hoffmann-La Roche AG
<120>含钒磷酸酶抑制剂的增强作用
<130>24107
<150>EP 07001593.8
<151>2007-01-25
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>蛋白磷酸酶底物
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>在底物肽中，酪氨酸残基是磷酸化的
<400>1
Arg Arg Leu Ile Glu Asp Ala Glu Pro Tyr Ala Ala Arg Gly
1                   5                       10

Claims (13)

1.含水溶剂、具有磷酸酶活性的酶、原钒酸盐、甘露醇和二硫苏糖醇的液体组合物，其特征在于甘露醇的浓度在1mM和100mM之间，甘露醇和原钒酸盐的摩尔比等于或大于1∶1。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于原钒酸盐的浓度在0.1mM到10mM之间。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于原钒酸盐的浓度在0.5mM到5mM之间。
4.如权利要求1到3任何一项中所述的组合物，其特征在于组合物还含有二价或三价正电荷金属离子的螯合剂。
5.甘露醇或甘油在增强选自钒酸盐、低聚钒酸盐、及其混合物的离子化合物对具有磷酸酶活性的酶的抑制效果方面的体外用途，其中所述钒酸盐的钒为五价，所述低聚钒酸盐的钒为五价，该酶可水解溶于具有中性pH并且含有0.7mM-1.2mM浓度的Ca2+离子的缓冲水溶液的、序列为SEQ ID NO：1的肽中磷酸酪氨酸残基的磷酸酯键。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于磷酸酶的活性降低1.5％到40％的值之间。
7.一种体外增强选自钒酸盐、低聚钒酸盐、及其混合物的离子化合物对具有磷酸酶活性的酶的抑制效果的方法，其中所述钒酸盐的钒为五价，所述低聚钒酸盐的钒为五价，所述的酶能水解溶于具有中性pH并且含有0.7mM-1.2mM浓度的Ca2+离子的缓冲水溶液的、序列如SEQ ID NO：1所示肽中的、磷酸酪氨酸残基的磷酸酯键，该方法包括下述步骤：
(a)在水溶剂中溶解含(i)离子化合物和(ii)甘露醇或甘油的组合物，其中甘露醇或甘油和离子化合物的摩尔比等于或大于1∶1，及
(b)将具有磷酸酶活性的酶与步骤(a)的溶液接触。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于溶液中甘露醇或甘油的浓度在1mM到100mM之间。
9.如权利要求7或8中所述的方法，其特征在于所述钒酸盐为原钒酸盐并且溶液中原钒酸盐的浓度在0.1mM到10mM之间。
10.如权利要求7到8任何一项中所述的方法，其特征在于离子化合物和甘露醇或甘油以干物质形式加入到含具有磷酸酶活性的酶的水性样品中。
11.一种试剂盒，其包括包装材料及含(i)选自钒酸盐，其中钒为五价、低聚钒酸盐，其中钒为五价、及其混合物的离子化合物和(ii)甘露醇或甘油的组合物，其中甘露醇或甘油和离子化合物的摩尔比等于或大于1∶1。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于组合物还含有二价或三价正电荷金属离子的还原剂和/或螯合剂。
13.如权利要求11和12任何一项中所述的试剂盒，其特征在于所述组合物作为干物质以片剂形式提供。
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