GR1010407B - Καινοτομα μεθοδος in vitro πολλαπλασιασμου για την προστασια και διατηρηση φυτων ειδων κανναβης - Google Patents
Καινοτομα μεθοδος in vitro πολλαπλασιασμου για την προστασια και διατηρηση φυτων ειδων κανναβης Download PDFInfo
- Publication number
- GR1010407B GR1010407B GR20220100263A GR20220100263A GR1010407B GR 1010407 B GR1010407 B GR 1010407B GR 20220100263 A GR20220100263 A GR 20220100263A GR 20220100263 A GR20220100263 A GR 20220100263A GR 1010407 B GR1010407 B GR 1010407B
- Authority
- GR
- Greece
- Prior art keywords
- cannabis
- explant
- culture medium
- sponge
- plant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 240000004308 marijuana Species 0.000 title description 44
- 238000004321 preservation Methods 0.000 title 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims abstract description 37
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 241000218236 Cannabis Species 0.000 claims abstract 11
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 142
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 49
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 47
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 27
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 13
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 13
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 13
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 13
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 claims description 13
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 13
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims description 13
- 239000003415 peat Substances 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 10
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 10
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 10
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 9
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 claims description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 7
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 claims description 5
- 235000011624 Agave sisalana Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000198134 Agave sisalana Species 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 229950011318 cannabidiol Drugs 0.000 description 28
- 235000008697 Cannabis sativa Nutrition 0.000 description 27
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 27
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 24
- QHMBSVQNZZTUGM-UHFFFAOYSA-N Trans-Cannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CCC(C)=C1 QHMBSVQNZZTUGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- QHMBSVQNZZTUGM-ZWKOTPCHSA-N cannabidiol Chemical compound OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)=C)CCC(C)=C1 QHMBSVQNZZTUGM-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 22
- ZTGXAWYVTLUPDT-UHFFFAOYSA-N cannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CC=C(C)C1 ZTGXAWYVTLUPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- PCXRACLQFPRCBB-ZWKOTPCHSA-N dihydrocannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)C)CCC(C)=C1 PCXRACLQFPRCBB-ZWKOTPCHSA-N 0.000 description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- QXACEHWTBCFNSA-SFQUDFHCSA-N cannabigerol Chemical compound CCCCCC1=CC(O)=C(C\C=C(/C)CCC=C(C)C)C(O)=C1 QXACEHWTBCFNSA-SFQUDFHCSA-N 0.000 description 18
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 18
- QXACEHWTBCFNSA-UHFFFAOYSA-N cannabigerol Natural products CCCCCC1=CC(O)=C(CC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1 QXACEHWTBCFNSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 15
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 6
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 5
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 5
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 5
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000218235 Cannabaceae Species 0.000 description 2
- 238000010159 Duncan test Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CYQFCXCEBYINGO-UHFFFAOYSA-N THC Natural products C1=C(C)CCC2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3C21 CYQFCXCEBYINGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000035584 blastogenesis Effects 0.000 description 2
- 229930003827 cannabinoid Natural products 0.000 description 2
- 239000003557 cannabinoid Substances 0.000 description 2
- 229940065144 cannabinoids Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 2
- 229960004242 dronabinol Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009105 vegetative growth Effects 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000213578 camo Species 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 235000017807 phytochemicals Nutrition 0.000 description 1
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008653 root damage Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- UGODCLHJOJPPHP-AZGWGOJFSA-J tetralithium;[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-4-hydroxy-2-[[oxido(sulfonatooxy)phosphoryl]oxymethyl]oxolan-3-yl] phosphate;hydrate Chemical compound [Li+].[Li+].[Li+].[Li+].O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H]1O UGODCLHJOJPPHP-AZGWGOJFSA-J 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
- A01H5/12—Leaves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/28—Cannabaceae, e.g. cannabis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με μια νέα μέθοδο αποτελεσματική από πλευράς κόστους και χρόνου in vitro πολλαπλασιασμού και καλλιέργειας ιστών για την παραγωγή φυτών κάνναβης απαλλαγμένων από ασθένειες, κατά προτίμηση φυτών Cannabis sativa, που επιτρέπει την ταχεία και άμεση εισαγωγή στην παραγωγική διαδικασία. Η εφεύρεση αναφέρεται επίσης σε συστήματα για την εκτέλεση μιας τέτοιας μεθόδου.
Description
Καινοτόμα μέθοδος in vitro πολλαπλασιασμού για την προστασία και διατήρηση φυτών ειδών
κάνναβης
ΤΟ ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ
Η παρούσα εφεύρεση σχετίζεται με μια καινοτόμο μέθοδο και σύστημα για μια χρονικά και οικονομικά αποδοτική παραγωγή με ιστοκαλλιέργεια φυτών κάνναβης απαλλαγμένα από ασθένειες. Τα τελευταία χρόνια, η κάνναβη έχει ερευνηθεί και χρησιμοποιηθεί για ιατρικούς σκοπούς. Η κάνναβη περιέχει κανναβινοειδή, συμπεριλαμβανομένης της τετραϋδροκανναβινόλης (THC) και της κανναβιδιόλης (CBD), που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για φαρμακευτικούς και ιατρικούς σκοπούς.
ΣΤΑΘΜΗ ΤΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ
Η κάνναβη είναι ένα γένος ανθοφόρων φυτών που περιλαμβάνει τουλάχιστον τρία είδη, το Cannabis sativa, το Cannabis indica και το Cannabis ruderalis, όπως προσδιορίζεται από τους φαινοτύπους των φυτών και τα προφίλ δευτερογενών μεταβολιτών (χημειότυπος). Είναι γνωστή η καλλιέργεια της κάνναβης σε εσωτερικούς χώρους και σε θερμοκήπια μεγάλης κλίμακας, προκειμένου να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες ανάπτυξης και να επιτευχθεί καλή απόδοση, π.χ. το US 2017/0283333 Α1 αποκαλύπτει την υδροπονική καλλιέργεια λαχανικών και φαρμακευτικών φυτών, όπως η φαρμακευτική κάνναβη.
Η κάνναβη είναι ένα ετήσιο δίοικο φυτό, με αρσενικά και θηλυκά φυτά, που ολοκληρώνει τον κύκλο ζωής του εντός ενός έτους ή και λιγότερο. Η φαρμακευτική κάνναβη μπορεί να αναπαραχθεί εγγενώς ή αγενώς. Τα σπέρματα είναι το προϊόν του εγγενούς τρόπου πολλαπλασιασμού και η χρήση μοσχευμάτων (που ονομάζονται επίσης κλώνοι) είναι τα αποτελέσματα του αγενούς τρόπου πολλαπλασιασμού. Η κλωνοποίηση περιλαμβάνει την κοπή ενός αναπτυσσόμενου βλαστού για να ληφθεί ένα «μόσχευμα», την τοποθέτηση του μοσχεύματος σε ένα καλλιεργητικό μέσο, αφήνοντάς το να αναπτυχθεί και να εκπτύξει ρίζες. Οι κλώνοι λαμβάνονται από θηλυκά φυτά με επιθυμητές φαρμακευτικές ιδιότητες που ονομάζονται μητρικά φυτά ή φυτά δότες. Ουσιαστικά, η κλωνοποίηση είναι η λήψη ενός κυττάρου από ένα φυτό και η προώθηση της ανάπτυξής του σε φυτό: το νέο φυτό μοιράζεται το ίδιο DNA και είναι αντίγραφο του μητρικού φυτού δηλαδή κλώνος.
Ο αγενής τρόπος πολλαπλασιασμού (ονομάζεται επίσης κλωνοποίηση) προτιμάται ιδιαίτερα για την φαρμακευτική κάνναβη για προβλεφιμότητα και ομοιομορφία των φυτών. Προκειμένου να πληρούνται οι κανονισμοί για την φαρμακευτική κάνναβη, είναι συχνά απαραίτητο στις δικαιοδοσίες να έχουν πολύ στενά ελεγχόμενες συνθήκες καλλιέργειας. Για παράδειγμα, το τελικό προϊόν που συλλέγεται πρέπει να ελεγχθεί για να διασφαλιστεί ότι δεν υπάρχουν ανεπιθύμητα συστατικά (όπως φυτοφάρμακα, μύκητες ή βακτήρια) καιότιπληρούνταιτα απαιτούμενα επίπεδα κανναβινοειδών.
Ο in vitro πολλαπλασιασμός είναι συνήθως το πρώτο βήμα στην καλλιέργεια φαρμακευτικής κάνναβης. Μικρά μοσχεύματα, που ονομάζονται έκφυτα, λαμβάνονται και αναπτύσσονται μέχρι να αναπτυχθούν επαρκής αριθμός ριζών. Παραδοσιακά, η συμβατική in vitro διαδικασία μικροπολλαπλασιασμού περιέχει τέσσερα στάδια, δηλαδή την εγκατάσταση της καλλιέργειας (αρχικό στάδιο), τη βλαστογέννεση, τη ριζοβολία των νέων βλαστών και τον εγκλιματισμό των ριζοβολημένων βλαστών (Pierik, R.L.M. In Vitro Culture of Higher Plants; Springer science & business media, 1997; ISBN 0-7923-4527-4). Στο αρχικό στάδιο ένα τμήμα φυτικού ιστού (που ονομάζεται έκφυτο) κόβεται από το φυτό, απολυμαίνεται (αφαίρεση επιφανειακών μολυσματικών παραγόντων) και τοποθετείται σε ένα θρεπτικό μέσο καλλιέργειας. Ένα θρεπτικό μέσο καλλιέργειας τυπικά περιέχει μια πηγή άνθρακα όπως σακχαρόζη, νερό, διάφορα άλατα, μια πηγή αμινοξέων και αζώτου και έναν παράγοντα στερεοποίησης όπως το άγαρ. Ο στόχος αυτού του σταδίου είναι να επιτευχθεί μια ασηπτική καλλιέργεια. Μια ασηπτική καλλιέργεια είναι αυτή που είναι απαλλαγμένη από μολυσματικούς παράγοντες όπως βακτήρια ή μύκητες. Τα έκφυτα, στις τρεις πρώτες φάσεις, περικλείονται σε δοχεία με παθητική ανταλλαγή αερίων, υπό ασηπτικές συνθήκες. Κατά το τελευταίο στάδιο του εγκλιματισμού, ο αναπτυγμένος, ριζοβολημένος βλαστός αφαιρείται από την καλλιέργεια ιστών και τοποθετείται στο έδαφος. Κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού, είναι επιθυμητό να επιτευχθεί ο απαιτούμενος αριθμός εκφύτων με το υψηλότερο ποσοστό επιτυχίας (δηλαδή η απαιτούμενη ανάπτυξη της ρίζας για το επόμενο στάδιο). Είναι επίσης επιθυμητό να είναι τα πολλαπλασιαζόμενα έκφυτα έτοιμα την κατάλληλη στιγμή. Αυτό διασφαλίζει ότι ο μεγαλύτερος αριθμός πολλαπλασιασμένων εκφύτων θα προχωρήσει στο επόμενο στάδιο ανάπτυξης μαζί και στη σωστή στιγμή. Οι τεχνικές in vitro μικροπολλαπλασιασμού προσφέρουν αποτελεσματικές αποδόσεις αναπαραγωγής σε εμπορική κλίμακα φυτών κάνναβης χωρίς ασθένειες. Γενικά, τέτοιες τεχνικές ελαχιστοποιούν τον χώρο καλλιέργειας και μειώνουν το κόστος και τον χρόνο παραγωγής. Τα προϊόντα παρουσιάζουν, μεταξύ άλλων, ομοιομορφία, γενετική και φαινοτυπική, όπως επίσης μορφολογική, που είναι μερικά από τα σημαντικότερα εμπορικά χαρακτηριστικά.
Ως εκ τούτου, θα ήταν επιθυμητό να μεγιστοποιηθεί ο αριθμός των υγιών και βιώσιμων αναπαραγόμενων εκφύτων, έτσι ώστε ένα αυξημένο ποσοστό εκφύτων να αναπτύξει ρίζες και να μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο επόμενο στάδιο καλλιέργειας. Αυτό θα οδηγούσε τελικά σε υψηλότερη απόδοση τελικών προϊόντων (π.χ. φαρμακευτικής κάνναβης).
Επιπλέον, θα ήταν επιθυμητό να αυξηθεί η ομοιομορφία των αναπαραγό μενών φυτών, καθώς αυτό αυξάνει την ποιότητα του τελικού προϊόντος (π.χ. φαρμακευτικής κάνναβης).
Επιπλέον, θα ήταν επιθυμητό να επιταχυνθεί η διαδικασία πολλαπλασιασμού, καθώς συνήθως όσο πιο αργή είναι η διαδικασία, τόσο χαμηλότερη είναι η ποιότητα των αναπαραγόμενων φυτών. Επομένως, θα ήταν επιθυμητό να επιταχυνθεί ο πολλαπλασιασμός προκειμένου να επιτευχθεί υψηλότερο ποσοστό επιτυχίας εκφύτων και πιο ομοιόμορφα φυτά.
Ως εκ τούτου, υπάρχει ανάγκη να παρέχεται μια μέθοδος πολλαπλασιασμού εκφύτων κάνναβης, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη απόδοση μέσω της ταχύτερης διαδικασίας πολλαπλασιασμού, διασφαλίζοντας παράλληλα ότι δεν προκαλείται βλάβη στη ρίζα κατά το στάδιο του εγκλιματισμού. Ένας στόχος της εφεύρεσης είναι να παρέχει μια τέτοια μέθοδο που να είναι γρήγορη, αποτελεσματική και οικονομική.
ΣΥΝΟΨΗ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε μια καινοτόμα μέθοδο in vitro πολλαπλασιασμό φυτών κάνναβης και ένα σύστημα εκτέλεσης μιας τέτοιας μεθόδου.
Πιο συγκεκριμένα, από μια άποψη η εφεύρεση σχετίζεται με μια μέθοδο πολλαπλασιασμού ενός εκφύτου Κάνναβης, η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής βήματα:
i) παροχή ενός δοχείου καλλιέργειας που περιέχει ένα σπόγγο ως υπόστρωμα ανάπτυξης, κατά προτίμηση ένα υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη, εμποτισμένο σε ένα ασηπτικό θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ιστού
ii) τοποθέτηση απολυμασμένου εκφύτου Κάνναβης στο εν λόγω σπόγγο
iii) επώαση του εν λόγω δοχείου καλλιέργειας που περιέχει το εν λόγω έκφυτο σε έναν θάλαμο ανάπτυξης
iν) μεταφορά του εν λόγω ανεπτυγμένου εκφύτου κάνναβης μετά την επώαση σε γλάστρα για εγκλιματισμό, και όπου όλα τα προηγούμενα βήματα i-iv εκτελούνται υπό άσηπτες συνθήκες.
Σε μια ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας του σταδίου (ΐ) περιλαμβάνει μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, γλυκίνη, νικοτινικό οξύ, πυριδοξίνη HCI και θειαμίνη HCI με pH ρυθμισμένο στο 5,8, και το εν λόγω έκφυτο κάνναβης του σταδίου (ii) είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο μόσχευμα, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαρών μίσχων και νεαρών φύλλων, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
Σε μια ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας του σταδίου (i) περιλαμβάνει 3,12 μΜ μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 53,28 μΜ γλυκίνη, 1,12 μΜ νικοτινικό οξύ, 4,86 πυριδοξίνη HCI και 3 μΜ θειαμίνη HCI, με το pH ρυθμισμένο στο 5,8, αντιβιοτικά κατά προτίμηση 50 mg l<-1>καναμυκίνης και 100 mg l<-1>πενικιλίνης, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιείται στο ήμισυ της δυναμικότητάςτου και περαιτέρω συμπληρώνεται με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση στο εύρος από 2 μΜ έως 10 μΜ, και το εν λόγω έκφυτο κάνναβης του σταδίου (ϋ) είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο μόσχευμα, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαρών μίσχων και νεαρών φύλλων, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, η εν λόγω επώαση του σταδίου (iii) πραγματοποιείται στους 23±1°C για 2 μήνες.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, τα εν λόγω ανεπτυγμένα έκφυτα, μετά την επώαση, μεταφυτεύονται σε γλάστρα και διατηρούνται σε θερμοκήπιο για εγκλιματισμό στους 25±2°C.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω έκφυτο κάνναβης που τοποθετείται στο υπόστρωμα ανάπτυξης του σπόγγου έχει ύφος περίπου 4 cm.
Σε μια ακόμη περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω έκφυτο κάνναβης είναι ένα έκφυτο Cannabis sativa.
Σε μια άλλη πτυχή, η εφεύρεση σχετίζεται με ένα σύστημα για in vitro πολλαπλασιασμό κλώνων φυτών κάνναβης, το οποίο περιλαμβάνει:
- ένα απολυμασμένο έκφυτο από δότη φυτό κάνναβης που διατηρείται σε βλαστική κατάσταση καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής του.
- απολυμασμένο μέσο καλλιέργειας ιστών για τον πολλαπλασιασμό του εν λόγω εκφύτου, και
- ένα δοχείο με αεριζόμενα ή μη αεριζόμενα πώματα για τον πολλαπλασιασμό του εν λόγω εκφύτου που περιλαμβάνει ένα σπόγγο ως υπόστρωμα ανάπτυξης ριζοβολίας
που χαρακτηρίζεται από το ότι ο εν λόγω σπόγγος ριζοβολίας εμποτίζεται στο εν λόγω ασηπτικό θρεπτικό μέσο ιστοκαλλιέργειας.
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω απολυμασμένο έκφυτο είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο μόσχευμα, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαρών μίσχων καί νεαρών φύλλων, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω θρεπτικό μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται με ένα αντιβιοτικό, κατά προτίμηση καναμυκίνη και/ή πενικιλίνη
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση στο εύρος από 2μΜ έως 10μΜ
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας περιλαμβάνει μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, γλυκίνη, νικοτινικό οξύ, πυριδοξίνη HCI και θειαμίνη HCI με το pH του ρυθμισμένο στο 5,8.
Σε μια ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας περιλαμβάνει 3,12 μΜ μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 53,28 μΜ γλυκίνη, 1,12 μΜ νικοτινικό οξύ, 4,86 πυριδοξίνη HCI και 3 μΜ θειαμίνη HCI με pH ρυθμισμένο στο 5,8.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται με 50 mg l<-1>καναμυκίνης και 100 mg l<-1>πενικιλίνης,
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιείται στο ήμισυ της δυναμικότητάς του, και
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση στο εύρος από 2 μΜ έως 10 μΜ.
Σε μια περαιτέρω υλοποίηση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω φυτό κάνναβης είναι φυτό είδους Cannabis sativa.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, ο εν λόγω σπόγγος είναι ένας φυσικός σπόγγος, ένας οργανικός σπόγγος, ένα υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη ή οποιοδήποτε άλλο υπόστρωμα σπόγγου κατάλληλο για πολλαπλασιασμό ή καλλιέργεια φυτών, κατά προτίμηση ένας σπόγγος με βάση την τύρφη.
ΣΥΝΤΟΜΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΕΔΙΩΝ
ΣΧΗΜΑ 1 (Α-Β).
ΣΧΗΜΑ 1Α. Ανάπτυξη των εγκατεστημένων εκφύτων στα σφουγγάρια ριζοβολίας σε μη αεριζόμενα δοχεία.
ΣΧΗΜΑ 1Β. Ανάπτυξη των εγκατεστημένων εκφύτων στα σφουγγάρια ριζοβολίας σε αεριζόμενα δοχεία.
ΣΧΗΜΑ 2 (Α-Β).
ΣΧΗΜΑ 2Α. Σχηματισμός ριζών εκφύτων στα σφουγγάρια ριζοβολίας σε μη αεριζόμενα δοχεία.
ΣΧΗΜΑ 2Β. Σχηματισμός ριζών εκφύτων στα σφουγγάρια ριζοβολίας σε αεριζόμενα δοχεία.
ΣΧΗΜΑ 3. Καλά ριζοβολημένο έκφυτο τοποθετημένο σε μίγμα τύρφης-περλίτη προς εγκλιματισμό.
ΣΧΗΜΑ 4. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο αριθμό ριζών ανά έκφυτο σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 5. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο μήκος ριζών ανά έκφυτο σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 6. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο ποσοστό ριζοβολίας σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, AC=απoστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 7. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στη μέση αύξηση εκφύτων σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 8. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο αριθμό ριζών ανά έκφυτο σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBG (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 9. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο μήκος ριζών ανά έκφυτο σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBG (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 10. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο ποσοστό ριζοβολίας σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBG (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΣΧΗΜΑ 11. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στη μέση αύξηση εκφύτων σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBG (vented=αεριζόμενα-με φίλτρο, non vented=pp αεριζόμενα δοχεία καλλιέργειας-χωρίς φίλτρο, ΙΒΑ= ινδολοβουτυρικό οξύ, FS= αποστείρωση μέσω φίλτρου, ΑC=αποστείρωση στο αυτόκαυστο, SΕ=τυπικό σφάλμα).
ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΠΡΟΤΙΜΩΜΕΝΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ
Η παρούσα εφεύρεση αναφέρονιαι σε μία καινοτόμο μέθοδο in vitro μικροπολλαπλασιασμού φυτών Cannabis sp., κατά προτίμηση Cannabis sativa. Η νέα μέθοδος συμπτύσσει τα τρία πρώτα στάδια (εγκατάσταση καλλιέργειας, βλαστογένεση καί ριζοβολία βλαστών) σε ένα, μετά ακολουθεί ο εγκλιματισμός, μειώνοντας έτσι τον χρόνο της διαδικασίας καί καθιστώντας την πιο οικονομική για βιομηχανική χρήση. Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται επίσης σε συστήματα για την εφαρμογή στην πράξη μιας τέτοιας νέας μεθόδου πολλαπλασιασμού in vitro. Τέτοια συστήματα περιλαμβάνουν αεριζόμενα και/ή μη αεριζόμενα δοχεία που μπορούν να αποστειρωθούν σε αυτόκαυστο, που περιέχουν πορώδεις σπόγγους ριζοβολίας, εμποτισμένους σε υγρά θρεπτικά μέσα ανάπτυξης, όπου τοποθετούνται τα έκφυτα, προκειμένου να πραγματοποιηθούν τα τρία πρώτα στάδια της διαδικασίας πολλαπλασιασμού. Τέτοια συστήματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν όχι μόνο για τον πολλαπλασιασμό φυτικού υλικού σε βιομηχανική κλίμακα αλλά και για την ενίσχυση της προστασίας και διατήρησης του γενετικού υλικού των ποικιλιών κάνναβης.
Η καινοτόμος βελτιστοποιημένη μέθοδος της εφεύρεσης και τα βελτιστοποιημένα συστήματα επιτρέπουν τη μείωση του χρόνου πολλαπλασιασμού και του κόστους της συνολικής διαδικασίας. Επιπλέον, με τη χρήση ενός πορώδους σπόγγου σε ένα τέτοιο σύστημα, μια ορισμένη ποσότητα υγρού θρεπτικού μέσου απορροφάται στον βαθμό που μπορεί να δεσμευτεί, είναι πάντα δυνατή η προσθήκη συμπληρωματικού υγρού θρεπτικού μέσου, εάν και όταν χρειάζεται, χωρίς να επηρεάζεται το ασηπτικό περιβάλλον, ενώ ένα τέτοιο σύστημα επιτρέπει επίσης μια πιο σταθερή στήριξη των εκφύτων, καλύτερο αερισμάτων ριζών πριν και κατά τη διάρκεια της ριζοβολίας. Τα προτιμώμενα σφουγγάρια για ένα τέτοιο σύστημα αποτελούνται από οργανικό υλικό, πλήρως βιοδιασπώμενο και επομένως φιλικό προς το περιβάλλον. Επιπλέον, όταν ολοκληρωθούν τα τρία πρώτα στάδια και τα ριζωμένα έκφυτα είναι έτοιμα για εγκλιματισμό, δεν χρειάζεται να πλυθούν οι ρίζες για να αφαιρεθεί το στερεό μέσο ανάπτυξης όπως το άγαρ, και επομένως αποφεύγεται πλήρως ο τραυματισμός των ριζών, πολύ συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες των παραδοσιακών μεθόδων πολλαπλασιασμού in vitro. Συνολικά, μια τέτοια μέθοδος επιτρέπει την ευκολότερη και ταχύτερη σκλήρυνση των ριζωμένων μοσχευμάτων σε περιβαλλοντικές συνθήκες. Μετά τον εγκλιματισμό τα νέα φυτά είναι έτοιμα να εισαχθούν ως ανεξάρτητες μονάδες στην παραγωγική διαδικασία π.χ. σε grodan.
Πιο συγκεκριμένα, από μια άποψη η εφεύρεση σχετίζεται με μια μέθοδο πολλαπλασιασμού ενός εκφύτου Κάνναβης, η μέθοδος περιλαμβάνει τα εξής βήματα:
i) παροχή ενός δοχείου καλλιέργειας που περιέχει ένα σπόγγο ως υπόστρωμα ανάπτυξης, κατά προτίμηση ένα υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη, εμποτισμένο σε ένα ασηπτικό θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ιστού
ii) τοποθέτηση εκφύτου Κάνναβης στο εν λόγω σπόγγο
iii) επώαση του εν λόγω δοχείου καλλιέργειας που περιέχει το εν λόγω έκφυτο σε έναν θάλαμο ανάπτυξης
iν) μεταφορά του εν λόγω ανεπτυγμένου εκφύτου κάνναβης μετά την επώαση σε γλάστρα για εγκλιματισμό, καί όπου όλα τα προηγούμενα βήματα i-iv εκτελούνται υπό άσηπτες συνθήκες.
Σε μία ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας του σταδίου (i) περιλαμβάνει μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, γλυκίνη, νικοτινικό οξύ, πυριδοξίνη HCI και θειαμίνη HCI με pH ρυθμισμένο στο 5,8, και το εν λόγω έκφυτο κάνναβης του σταδίου (ϋ) είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο μόσχευμα, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαρών μίσχων και νεαρών φύλλων, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
Σε μια ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας του σταδίου (i) περιλαμβάνει 3,12 μΜ μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 53,28 μΜ γλυκίνη, 1,12 μΜ νικοτινικό οξύ, 4,86 πυριδοξίνη HCI και 3 μΜ θειαμίνη HCI, με το pH ρυθμισμένο στο 5,8, αντιβιοτικά κατά προτίμηση 50 mg l<-1>καναμυκίνης και 100 mg l<-1>πενικιλίνης, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιείται στο ήμισυ της δυναμικότητάςτου και περαιτέρω συμπληρώνεται με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση στο εύρος από 2 μΜ έως 10 μΜ, και το εν λόγω έκφυτο κάνναβης του σταδίου (ii) είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο μόσχευμα, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαρών μίσχων και νεαρών φύλλων, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, η εν λόγω επώαση του σταδίου (iii) πραγματοποιείται στους 23±1°C για 2 μήνες.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, τα εν λόγω ανεπτυγμένα έκφυτα, μετά την επώαση, μεταφυτεύονται σε γλάστρα και διατηρούνται σε θερμοκήπιο για εγκλιματισμό στους 25±2°C.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω έκφυτο κάνναβης που τοποθετείται στο υπόστρωμα ανάπτυξης του σπόγγου έχει ύφος περίπου 4 cm.
Σε μία ακόμη περαιτέρω ενσωμάτωση της εν λόγω μεθόδου, το εν λόγω έκφυτο κάνναβης είναι ένα έκφυτο Cannabis sativa.
Σε μία άλλη πτυχή, η εφεύρεση σχετίζεται με ένα σύστημα για in vitro πολλαπλασιασμό κλώνων φυτών κάνναβης, το οποίο περιλαμβάνει:
- ένα απολυμασμένο έκφυτο από δότη φυτό κάνναβης που διατηρείται σε βλαστική κατάσταση καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής του.
- αποστειρωμένο μέσο καλλιέργειας ιστών για τον πολλαπλασιασμό του εν λόγω εκφύτου.
- ένα δοχείο με αεριζόμενα ή μη αεριζόμενα πώματα για τον πολλαπλασιασμό του εν λόγω εκφύτου που περιλαμβάνει ένα σπόγγο ως υπόστρωμα ανάπτυξης ριζοβολίας και
που χαρακτηρίζεται από το ότι ο εν λόγω σπόγγος ριζοβολίας εμποτίζεται στο εν λόγω ασηπτικό θρεπτικό μέσο ιστοκαλλιέργειας.
Σε μια ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω απολυμασμένο έκφυτο είναι ένα ή περισσότερα από: ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο μόσχευμα, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαρών μίσχων και νεαρών φύλλων, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω θρεπτικό μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται με ένα αντιβιοτικό, κατά προτίμηση καναμυκίνη και/ή πενικιλίνη
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση στο εύρος από 2μΜ έως 10μΜ
Σε μία ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας περιλαμβάνει μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, γλυκίνη, νικοτινικό οξύ, πυριδοξίνη HCI και θειαμίνη HCI με pH ρυθμισμένο στο 5,8.
Σε μια ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας περιλαμβάνει 3,12 μΜ μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 53,28 μΜ γλυκίνη, 1,12 μΜ νικοτινικό οξύ, 4,86 πυριδοξίνη HCI και 3 μΜ θειαμίνη HCI με pH ρυθμισμένο στο 5,8.
Σε μια περαιτέρω ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται με 50 mg l<-1>καναμυκίνης και 100 mg l<-1>πενικιλίνης,
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιείται στο ήμισυ της δυναμικότητάς του, και
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση στο εύρος από 2 μΜ έως 10 μΜ.
Σε μία περαιτέρω υλοποίηση του εν λόγω συστήματος, το εν λόγω φυτό κάνναβης είναι φυτό είδους Cannabis sativa.
Σε μία περαιτέρω ενσωμάτωση του εν λόγω συστήματος, ο εν λόγω σπόγγος είναι ένας φυσικός σπόγγος, ένας οργανικός σπόγγος, ένα υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη ή οποιοδήποτε άλλο υπόστρωμα σπόγγου κατάλληλο για πολλαπλασιασμό ή καλλιέργεια φυτών, κατά προτίμηση ένας σπόγγος με βάση την τύρφη.
Η προδιαγραφή καιτα σχέδια πρέπει, συνεπώς, να θεωρηθούν με μία ενδεικτική καί όχι μία περιοριστική έννοια. Ωστόσο, θα είναι προφανές ότι διάφορες τροποποιήσεις καί αλλαγές μπορούν να γίνουν σε αυτό χωρίς να απομακρυνθούμε από το ευρύτερο πεδίο της εφεύρεσης όπως αναφέρεται στις αξιώσεις.
Αλλες παραλλαγές εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της παρούσας εφεύρεσης. Έτσι, ενώ οι αποκαλυπτόμενες ενσωματώσεις είναι επιδεκτικές σε διάφορες τροποποιήσεις και εναλλακτικές κατασκευές, μια εικονογραφημένη εφαρμογή τους φαίνεται στο σχέδιο και άλλες περιγράφονται εδώ. Θα πρέπει να γίνει κατανοητό, ωστόσο, ότι δεν υπάρχει πρόθεση περιορισμού της εφεύρεσης στη συγκεκριμένη μορφή ή μορφές που γνωστοποιούνται, αλλά αντίθετα, η πρόθεση είναι να καλύψει όλες τις τροποποιήσεις, εναλλακτικές κατασκευές και ισοδύναμα που εμπίπτουν στο πεδίο εφαρμογής της εφεύρεσης, όπως ορίζεται στις συνημμένες αξιώσεις.
Ορισμοί
Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, οι επιστημονικοί και τεχνικοί όροι που χρησιμοποιούνται εδώ έχουν τις έννοιες που είναι κοινώς κατανοητές από εκείνους με συνήθη εμπειρία στην τεχνική. Σε περίπτωση οποιοσδήποτε λανθάνουσας ασάφειας, οι ορισμοί που παρέχονται στο παρόν υπερισχύουν οποιουδήποτε λεξικού ή εξωγενούς ορισμού.
Ο όρος "σχετικά" ή "περίπου" σημαίνει την αναφερόμενη τιμή /-10%, για παράδειγμα περίπου 10 σημαίνει 9 έως 11.
Ο όρος «σπόγγος» ή «σφουγγάρι» ή «υπόστρωμα σφουγγαριού», που χρησιμοποιείται εδώ εναλλακτικά στο πλαίσιο της τρέχουσας εφεύρεσης, σημαίνει ότι περιλαμβάνει οποιονδήποτε τύπο φυσικού ή οργανικού σφουγγάρι, θαλάσσιου σφουγγαριού ή θαλάσσιας υδατοκαλλιέργειας σπόγγου, υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη ή οποιοδήποτε άλλο βιοαποικοδομήσιμο υπόστρωμα σπόγγου κατάλληλο για πολλαπλασιασμό ή καλλιέργεια φυτών, κατά προτίμηση υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη.
Ο όρος «κλώνος» ορίζει τους απόγονους ενός μεμονωμένου φυτού που παράγονται αγενώς. Ένας κλώνος είναι συνήθως ένα «αντίγραφο» του γονικού ή του «μητρικού» φυτού. Προς αποφυγή αμφιβολιών, ο όρος «κλώνος» μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να περιγράφει φυτά κάνναβης που παράγονται με «παραδοσιακό» αγενή πολλαπλασιασμό.
Ο όρος "έκφυτο", που χρησιμοποιείται εδώ με αναφορά στην καλλιέργεια φυτικού ιστού, σημαίνει ζωντανό φυτικό ιστό που αφαιρείται από τη φυσική θέση ανάπτυξης και τοποθετείται σε στείρο μέσο (π.χ. DKW ή MS) για καλλιέργεια. Αυτό μπορεί να είναι οποιουδήποτε τύπου ιστού όπως φύλλα, ρίζες, μίσχοι ή οποιοδήποτε τμήμα που λαμβάνεται από ένα φυτό και χρησιμοποιείται για την έναρξη της καλλιέργειας ιστών.
Ο όρος «δότης» φυτό κάνναβης αναφέρεται σε υγιή νεαρά φυτά, στο στάδιο της βλαστικής ανάπτυξης, από τα οποία αφαιρέθηκαν τα έκφυτα.
Ο όρος «μικροπολλαπλασιασμός» ή «πολλαπλασιασμός» είναι η πρακτική του γρήγορου πολλαπλασιασμού φυτικού υλικού για την παραγωγή μεγάλου αριθμού απογόνων φυτών (κλώνων) χρησιμοποιώντας μεθόδους ιστοκαλλιέργειας φυτικών ιστών.
Ο όρος «ποικιλία φυτών κάνναβης με υψηλή περιεκτικότητα σε κανναβιδιόλη (CBD)» σημαίνει ότι περιλαμβάνει οποιαδήποτε φυτική ποικιλία κάνναβης που περιέχει κανναβιδιόλη σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 8,0 τοις εκατό και έως περίπου το 20 τοις εκατό επί του αποξηραμένου αλεσμένου δείγματος ταξιανθίας.
Ο όρος φυτική ποικιλία κάνναβης που περιέχει υψηλή κάνναβη (CBG) σημαίνει ότι περιλαμβάνει οποιαδήποτε φυτική ποικιλία κάνναβης που περιέχει κανναβιγερόλη σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 8,0 τοις εκατό και έως περίπου 20 τοις εκατό επί του αποξηραμένου αλεσμένου δείγματος ταξιανθίας.
Ο όρος «μέσο καλλιέργειας ήμισυς δυναμικότητας» σημαίνει θρεπτικό μέσο καλλιέργειας με μειωμένη συγκέντρωση ανόργανων αλάτων (μακροστοιχεία, μικροστοιχεία, σίδηρος), οργανικές ενώσεις (βιταμίνες και σακχαρόζη) και άγαρ στο μισό.
Εκτός εάν απαιτείται διαφορετικά από τα συμφραζόμενα, οι όροι του ενικού θα περιλαμβάνουν πληθυντικό αριθμό και οι όροι του πληθυντικού θα περιλαμβάνουν τον ενικό. Η χρήση του "ή" σημαίνει "και/ή" εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά. Η χρήση του όρου «συμπεριλαμβανομένων», καθώς και άλλων μορφών, όπως «περιλαμβάνει» και «περιλαμβάνεται», δεν είναι περιοριστική.
Ενώ η παρούσα εφεύρεση έχει περιγράφει με αναφορά στις ειδικές ενσωματώσεις της, θα πρέπει να γίνει κατανοητό από τους ειδικούς του επαγγέλματος ότι μπορούν να γίνουν διάφορες αλλαγές και μπορούν να αντικατασταθούν ισοδύναμα χωρίς να απομακρυνόμαστε από το αληθινό πνεύμα και το πεδίο της εφεύρεσης χρησιμοποιώντας αυτήν την εφεύρεση ως οδηγό. Έχοντας τώρα περιγράφει ορισμένες ενσωματώσεις λεπτομερώς, οι ίδιες θα γίνουν πιο κατανοητές με αναφορά στα ακόλουθα παραδείγματα, τα οποία περιλαμβάνονται για λόγους επεξήγησης μόνο και δεν προορίζονται να είναι περιοριστικά.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ
Παράδειγμα 1: Επιλογή φυτού και απολύμανση εκφύτου
Τα έκφυτα αποκόπηκαν από επιλεγμένα υγιή, εύρωστα, νεαρά μητρικά φυτά κάνναβης στο στάδιο της βλαστικής ανάπτυξης. Δύο ποικιλίες, μια ποικιλία με υψηλή περιεκτικότητα σε κανναβιδιόλη (CBD) και μια ποικιλία με υψηλή περιεκτικότητα σε κανναβιγερόλη (CBG) αντίστοιχα, Cannabis sativa L. (Cannabaceae), συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη, η οποία παρασχέθηκε ευγενικά από την Ekati Alchemy Lab SL (Βαρκελώνη, Ισπανία). Τα φυτά δότες των εκφύτων καλλιεργήθηκαν σε θερμοκήπιο που βρίσκεται στο Ινστιτούτο Μεσογειακών και Δασικών Οικοσυστημάτων του Ελληνικού Γεωργικού Οργανισμού «Δήμητρα». Άριστοι φαινότυποι, με βάση το χημικό προφίλ, θηλυκά φυτά χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Τα μητρικά φυτά επιλέχτηκαν όπως περιεγράφηκε στο loannidis, Κ et al;. Biotechnological Approaches on Two High CBD and CBG Cannabis Sativa L. (Cannabaceae) Varieties: In Vitro Regeneration and Phytochemical Consistency Evaluation of Micropropagated Plants Using Quantitative<1>H-NMR. Molecules 2020, 25, doi:10.3390/molecules25245928, και διατηρήθηκαν στο βλαστικό στάδιο σε φωτοπερίοδο 18 ωρών. Όλα τα φυτά διατηρήθηκαν σε εσωτερικούς χώρους, υπό ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες στους 27±2°C, με φωτοσυνθετική πυκνότητα ροής φωτονίων περίπου 500 μιτιοΙ m<"2>S<_1>στο επίπεδο της καλλιέργειας. Τμήματα γονάτων, ύψους περίπου 4 cm, που περιείχαν μασχαλιαίους οφθαλμούς καθώς και ένα έως δύο φύλλα, από τα υγιή θηλυκά μητρικά φυτά (δότες) χρησιμοποιήθηκαν ως έκφυτα.
Τα έκφυτα απολυμάνθηκαν επιφανειακά με διαδοχική εμβάπτιση σε 1,0% NaOCI (ν/ν) συμπληρωμένο με 0,05% (ν/ν) (10% NaOCI, Fluka, Germany) συμπληρωμένο με 0,05% (ν/ν) Tween-20 (Fisher Bioreagents, USA), υπό συνεχή ανάδευση για 12 λεπτά, ακολουθούμενη σε 70% αιθανόλη (ν/ν) για 45 δευτερόλεπτα. Κάθε εμβάπτιση ακολουθήθηκε από τρία ξεπλύματα με αποστειρωμένο και απιονισμένο νερό που διήρκεσε τρία λεπτά. Η διαδικασία απολύμανσης πραγματοποιήθηκε σε στείρες συνθήκες όπως επίσης και όλοι οι μεταγενέστεροι χειρισμοί. Μετά την απολύμανση, τα νεκρά φύλλα και ιστοί των εκφύτων αφαιρέθηκαν και στη συνέχεια τα έκφυτα κόπηκαν σε επιθυμητά τμήματα (περίπου 3,5cm) με αποστειρωμένα εργαλεία και υπό ασηπτικές επίσης συνθήκες.
Παράδειγμα 2: In vitro εγκατάσταση καλλιέργειας εκφύτων Cannabis sativa
Για την εγκατάσταση των καλλιεργειών χρησιμοποιήθηκαν δύο συστήματα καλλιέργειας. Το πρώτο αποτελούνταν από δοχεία magenta με καπάκια χωρίς φίλτρο (Sigma Aldrich, Merck KGaA, Γερμανία) που το καθένα περιλάμβανε τέσσερα σφουγγάρια ριζοβολίας εμποτισμένα σε 30 ml θρεπτικού μέσου καλλιέργειας. Τα σφουγγάρια ήταν κατασκευασμένα από οργανικό υλικό και ήταν πλήρως βιοδιασπώμενα. Το δεύτερο σύστημα καλλιέργειας αποτελούνταν από δοχεία με καπάκια με φίλτρο (Duchefa Biochemie, Ολλανδία) που το καθένα περιλάμβανε οκτώ σφουγγάρια ριζοβολίας εμποτισμένα σε 65 ml θρεπτικό μέσο καλλιέργειας. Τα σφουγγάρια κόπηκαν έτσι ώστε να αποκτήσουν το ίδιο σχήμα και μέγεθος, δηλαδή 3,0 cm x 3,0 cm χ 2,0 cm. Όλα τα συστατικά κάθε συστήματος καλλιέργειας (σπόγγοι ριζοβολίας, θρεπτικά μέσα και δοχεία) αποστειρώθηκαν ταυτόχρονα σε αυτόκαυστο στους 121°C και υπό πίεση 122 kPa για 20 min. Τα έκφυτα, μετά την απολύμανση, τοποθετήθηκαν στο σύστημα καλλιέργειας, ένα μόσχευμα ανά σπόγγο. Ένα τροποποιημένο θρεπτικό μέσο Murashige and Skoog (MS, Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15, 473-497, doi:10.1111/j.l399-3054.1962.tb08052.x.) χρησιμοποιήθηκε ως μέσο καλλιέργειας, συμπληρωμένο με 3% σακχαρόζη. Η σύνθεση του τροποποιημένου μέσου MS περιείχε 3,12 μΜ μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 53,28 μΜ γλυκίνη, 1,12 μΜ νικοτινικό οξύ, 4,86 πυριδοξίνη HCI και 3 μΜ θειαμίνη HCI αντί για 1,25 μΜ, 26,64 μΜ, 2,43 μΜ, 0,56 μΜ και 0,3 μΜ, αντίστοιχα. To pH του μέσου ρυθμίστηκε στο 5,8 με την προσθήκη 0,1 Ν NaOH ή/και 0,1 Ν HCI. Το μέσο συμπληρώθηκε με τα ακόλουθα αντιβιοτικά: 50 mg l<-1>καναμυκίνη και 100 mg l<-1>πενικιλίνη προκειμένου να αποφευχθεί η μόλυνση από μύκητες. Το θρεπτικό μέσο, τα δοχεία καλλιέργειας, τα σφουγγάρια καθώς και όλος ο εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε στους in vitro χειρισμούς υπό ασηπτικές συνθήκες, αποστειρώθηκαν σε αυτόκαυστο στους 121°C και υπό πίεση 122 kPa για 20 min.
Το τροποποιημένο μέσο MS μισής (1/2Χ) δυναμικότητας (Murashige and Skoog 1962) χρησιμοποιήθηκε ως θρεπτικό μέσο. Πραγματοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές ομάδες πειραμάτων. Η πρώτη, αφορούσε μέσο MS που συμπληρωνόταν με την ορμόνη ριζοβολίας ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε διάφορες συγκεντρώσεις (2,46, 4,92 και 9,84 μΜ). Στη συνέχεια, το μείγμα αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο στους 121°C και 122 kPa για 20 min, προτού το προσθέσουμε στο αποστειρωμένο δοχείο που συμπεριλάμβανε τα αποστειρωμένα σφουγγάρια. Το δεύτερο σύνολο πειραμάτων ήταν παρόμοιο με το πρώτο, με τη διαφορά ότι στο αποστειρωμένο μέσο, το ΙΒΑ προστέθηκε αφού αποστειρώθηκε μέσου φίλτρου (διάμετρος πόρων φίλτρου 0,22μm), υπό ασηπτικές συνθήκες. Το τρίτο σύνολο πειραμάτων αναφερόταν στην εμβάπτιση των κομμένων βάσεων των εκφύτων σε διάλυμα ριζοβολίας ΙΒΑ συγκέντρωσης 15 μΜ. και τοποθέτησή τους στο σύστημα καλλιέργειας. Μετά την εμβάπτιση, τα έκφυτα (μοσχεύματα) μεταφέρθηκαν στο σύστημα καλλιέργειας για ριζοβολία. Οι χειρισμοί που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα φαίνονται στον Πίνακα 1.
Πίνακας 1. Χειρισμοί που χρησιμοποιήθηκαν στις πειραματικές ομάδες. Το χρησιμοποιούμενο μέσο ήταν το τροποποιημένο ήμισυς δυναμικότητας MS.
Χειρισμός
ΙΒΑ αποστειρωμένο Εμβάπτιση εκφύτων Ποικιλία ΙΒΑ αποστειρωμένο
μαζί με το θρεπτικό σε διάλυμα ΙΒΑ με χρήση φίλτρου
μέσο 15mM Έλεγχος Έλενχος Έλεγχος
2.46 μΜ 2.46 μΜ 2 min
CBD
4.92 μΜ 4.92 μΜ 4 min
9.84 μΜ 9.84 μΜ 6 min Control Control Control
2.46 μΜ 2.46 μΜ 2 min
CBG
4.92 μΜ 4.92 μΜ 4 min
9.84 μΜ 9.84 μΜ 6 min
Όλες οι καλλιέργειες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης στους 23±2°C με φωτοπερίοδο 16 ωρών, υπό λαμπτήρες φθορισμού με πυκνότητα ροής φωτοσυνθετικών φωτονίων 50 μmol nr<2>s<-1>στο επίπεδο της καλλιέργειας.
Η ανάπτυξη ριζών και η αύξηση των υγιών χωρίς μόλυνση εκφύτων αξιολογήθηκε μετά από δύο μήνες καλλιέργειας. Αξιολογήθηκε η επίδραση των διαφόρων συγκεντρώσεων των χρησιμοποιημένων ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών σε σχέση με το μέσο ποσοστό ριζοβολίας (%), τον αριθμό και το μήκος των ριζών ανά έκφυτο που προεξείχαν από τα σφουγγάρια. Η αύξηση των εκφύτων στους διάφορους χειρισμούς αξιολογήθηκαν επίσης. Χρησιμοποιήθηκαν οκτώ έκφυτα σε τρεις επαναλήψεις για κάθε χειρισμό και τα πειράματα τοποθετήθηκαν στο θάλαμο ανάπτυξης σε σχέδιο τυχαιοποιημένων πλήρων ομάδων.
Η διαδικασία απολύμανσης των εκφύτων κάνναβης είχε αποτελεσματικότητα σε ποσοστό 87%. Ο σχηματισμός των ριζών, δηλαδή το ποσοστό ριζοβολίας των εκφύτων, ο αριθμός και το μήκος των ριζών ανά έκφυτο, όπως επίσης και η αύξηση των εκφύτων, επηρεάστηκαν στατιστικά σημαντικά από τη συγκέντρωση των ρυθμιστών ανάπτυξης, τον τύπο του δοχείου καλλιέργειας και το γονότυπο (Πίνακας 2 και Πίνακας 3). Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο αριθμό και μέσο μήκος των ριζών ανά έκφυτο, όπως επίσης και στο ποσοστό ριζοβολίας για τις δύο ποικιλίες Cannabis sativa παρουσιάζονται στον Πίνακα 2 και Πίνακα 3 αντίστοιχα. Το Σχήμα 1 δείχνει τη νέα βλαστητική αύξηση των εγκατεστημένων εκφύτων σε σπόγγους ριζοβολίας σε μη αεριζόμενα (Α) και αεριζόμενα (Β) δοχεία. Το Σχήμα 2 δείχνει τον σχηματισμό ριζών των εκφύτων σε μη αεριζόμενα (Α) και αεριζόμενα (Β) δοχεία. Οι Πίνακες 2 και 3, και το Σχήματα 4 έως 6 και 8 έως 10 δείχνουν την επίδραση των συγκεντρώσεων των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο αριθμό και μήκος ριζών ανά έκφυτο και το ποσοστό ριζοβολίας της ποικιλίας Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και της ποικιλίας Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBG αντίστοιχα. Ο Πίνακας 4 παρουσιάζει την επίδραση των συγκεντρώσεων των ρυθμιστών ανάπτυξης στην αύξηση των εκφύτων των ποικιλιών Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και CBG. Το Σχήμα 7 και το Σχήμα 11 παρουσιάζουν την επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στη μέση αύξηση των εκφύτων σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στις δύο ποικιλίες Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και CBG αντίστοιχα.
Πίνακας 2. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο αριθμό καί μέσο μήκος των ριζών ανά έκφυτο όπως επίσης καί στο ποσοστό ριζοβολίας στην ποικιλία Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD. (Οι μέσοι όροι που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σε p < 0.05 σύμφωνα με το Dunkan τεστ).
ν
Πίνακας 3. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στο μέσο αριθμό και μέσο μήκος των ριζών ανά έκφυτο όπως επίσης και στο ποσοστό ριζοβολίας στις ποικιλίες Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBG. (Οι μέσοι όροι που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά για p ≤ 0.05 σύμφωνα με το Dunkan τεστ).
Η επαγωγή της ριζοβολίας ξεκίνησε κατά την τρίτη βδομάδα της διαδικασίας ανάλογα με το χειρισμό. Στατιστικά σημαντικές διαφορές ( p≤0.05 ) στο μέσο αριθμό καί μέσο μήκος των ριζών ανά έκφυτο όπως επίσης καί στο ποσοστό ριζοβολίας παρατηρήθηκαν μεταξύ των χειρισμών εντός κάθε μίας από τις δυο μελετώμενες ποικιλίες. Και οι δυο ποικιλίες κάνναβης, με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και CBG, έδειξαν παρόμοια συμπεριφορά όσον αφορά τα χαρακτηριστικά της ριζοβολίας.
Ο χειρισμός εμβάπτισης υπερτερούσε σαφώς των άλλων χειρισμών όσον αφορά στο μέσο αριθμό ριζών ανά έκφυτο. Όσον αφορά την υψηλή ποικιλία σε CBD, για τα μη αεριζόμενα δοχεία, ο υψηλότερος μέσος αριθμός ριζών ανά έκφυτο (9,47 και 8,75) παρατηρήθηκε με εμβάπτιση των άκρων του μοσχεύματος σε υδατικό διάλυμα ΙΒΑ 15 mM για 4 και 2 λεπτά, αντίστοιχα. Αυτά έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p≤0,05), με όλες τις άλλες τιμές των υπόλοιπων χειρισμών. Ομοίως, για τα αεριζόμενα δοχεία, ο υψηλότερος μέσος αριθμός ριζών ανά έκφυτο (8,27 και 7,59) παρατηρήθηκε στον ίδιο χειρισμό όπως παραπάνω. Και πάλι, αυτές ήταν στατιστικά σημαντικές διαφορετικές (p≤0,05), με όλες τις άλλες τιμές των χειρισμών επίσης. Για τα αεριζόμενα και τα μη αεριζόμενα δοχεία οι χειρισμοί με εμβάπτιση παρουσίασαν παρόμοια αποτελέσματα. Οι χειρισμοί όπου το μέσο καλλιέργειας ενισχύθηκε με ΙΒΑ, ήταν λιγότερο αποτελεσματικοί, παρουσιάζοντας συγκρίσιμες τιμές (Πίνακας 2). Τα αποτελέσματα σχετικά με την υψηλή ποικιλία CBG ήταν αντίστοιχα παρόμοια. Για τα εξαεριζόμενα και τα μη αεριζόμενα δοχεία, ο υψηλότερος μέσος αριθμός ριζών ανά έκφυτο παρατηρήθηκε σε χειρισμούς εμβάπτισης που ήταν στατιστικά σημαντικές διαφορετικές (p≤0,05) σε σύγκριση με τους υπόλοιπους χειρισμούς. Ο μέγιστος μέσος αριθμός ριζών, 7,79 και 6,75, επιτεύχθηκε σε μη αεριζόμενα και αεριζόμενα δοχεία, αντίστοιχα, με εμβάπτιση των άκρων της βάσης των εκφύτων σε υδατικό διάλυμα ΙΒΑ 15 mM για 4 λεπτά (Πίνακας 3).
Όσον αφορά το μέσο μήκος ρίζας, η προσθήκη ΙΒΑ που αποστειρώθηκε με τη χρήση φίλτρου σύριγγας στο θρεπτικό μέσο, έδειξε τις υψηλότερες τιμές, παρουσιάζοντας σημαντικές διαφορές (p≤0,05) σε σύγκριση με άλλους χειρισμούς, ανεξάρτητα από τον τύπο του δοχείου. Για την ποικιλία υψηλού CBD, το καλύτερο μέσο μήκος ριζών πραγματοποιήθηκε σε μη αεριζόμενα δοχεία (1,54 cm) όταν προστέθηκαν 2,46 μΜ ΙΒΑ στο θρεπτικό μέσο. Η προσθήκη 4,92 μΜ οδήγησε στη δεύτερη υψηλότερη τιμή (1,51 cm) χειρισμός χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά. Η ίδια τάση παρουσιάστηκε και στα αεριζόμενα δοχεία όπου τα καλύτερα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν με την προσθήκη 2,46 μΜ (1,21 cm) και 4,92 μΜ ΙΒΑ (0,97 cm). Οι τελευταίοι τέσσερις χειρισμοί παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p≤0,05) από όλεςτους άλλους (Πίνακας 2). Όσον αφοράτην υψηλή σε CBG ποικιλία, τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια σε κάποιο βαθμό. Η αποστείρωση με φίλτρο σύριγγας του ΙΒΑ οδήγησε στα καλύτερα αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, σε μη αεριζόμενα δοχεία, το υψηλότερο μέσο μήκος ρίζας ανά έκφυτο (0,88 cm) λήφθηκε με την προσθήκη 4,92 μΜ ΙΒΑ, σε σύγκριση με το αντίστοιχα έκφυτα σε αεριζόμενα δοχεία όταν προστέθηκαν 2,46 μΜ ΙΒΑ (0,72 cm). Ο χειρισμός με εμβάπτιση σε 15 mM ΙΒΑ για 2 λεπτά οδήγησε σε τιμή 0,72 cm, παρουσιάζοντας μη στατιστική διαφορά καί με τις δύο προηγούμενους χειρισμούς (Πίνακας 3). Γενικά, τα έκφυτα σε μη αεριζόμενα δοχεία είχαν καλύτερη απόδοση σε σύγκριση με εκείνα σε δοχεία αεριζόμενα (Πίνακας 2 καί Πίνακας 3).
Ανάλογα με τα αποτελέσματα του μέσου μήκους της ρίζας ήταν αυτά όσον αφορά στο μέσο ποσοστό ριζοβολίας. Σχετικά με την υψηλή ποικιλία σε CBD, η συμπλήρωση του μέσου με 2,46 μΜ ΙΒΑ με αποστείρωση με φίλτρο σε αεριζόμενα δοχεία, οδήγησε όλα τα έκφυτα να σχηματίσουν ρίζες. Στο ίδιο σύνολο χειρισμών, η δεύτερη υψηλότερη συχνότητα σχηματισμού ριζών (94,44%) παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ΙΒΑ αποστειρωμένο με φίλτρο σε συγκέντρωση 4,92 μΜ και με εμβάπτιση των άκρων των εκφύτων για 2 λεπτά (Πίνακας 2). Η χρήση μη αεριζόμενων δοχείων οδήγησε σε σχετικά χαμηλότερα ποσοστά. Η καλύτερη συχνότητα σχηματισμού ριζοβολίας (87,50%) επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας 4,92 μΜ ΙΒΑ αποστειρωμένο με φίλτρο. Η προσθήκη ΙΒΑ με αποστείρωση με φίλτρο οδήγησε σε καλύτερα αποτελέσματα σε σύγκριση με τους χειρισμούς εμβάπτισης, αν και αυτές δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά (p≤0,05). Όσον αφορά την ποικιλία υψηλή σε CBG, το υψηλότερο μέσο ποσοστό ριζοβολίας επιτεύχθηκε σε μη αεριζόμενα δοχεία, όταν το μέσο συμπληρώθηκε γενικά με 4,92 μΜ ΙΒΑ. Για τα μη αεριζόμενα δοχεία, κυρίως, η προσθήκη ΙΒΑ στο MS έδειξε το υψηλότερο μέσο ποσοστό ριζοβολίας (Πίνακας 3). Τα αποτελέσματα για τα αεριζόμενα δοχεία ήταν κάπως διαφορετικά. Η υψηλότερη συχνότητα σχηματισμού ριζοβολίας (94,44%) λήφθηκε χρησιμοποιώντας 4,92 μΜ ΙΒΑ, το οποίο αποστειρώθηκε μαζί με το μέσο ή με εμβάπτιση σε 15 mM ΙΒΑ για 2 λεπτά. Κατά μέσο όρο, η συμπλήρωση του θρεπτικού μέσου με ΙΒΑ αποστειρωμένο με τη χρήση φίλτρου οδήγησε σε καλύτερα αποτελέσματα σε σύγκριση με τους χειρισμούς εμβάπτισης, αν και οι δύο ομάδες χειρισμών δεν ήταν στατιστικά διαφορετικοί (p≤0,05).
Σε όλες τους χειρισμούς, ο έλεγχος έδειξε τις χαμηλότερες τιμές, εκτός από αυτήν που αφορούσε στο μέσο αριθμό ριζών ανά έκφυτο (2,85 ρίζες ανά έκφυτο), όταν τα έκφυτα της υψηλής CBD ποικιλίας εγκαταστάθηκαν σε αεριζόμενα δοχεία και σε μείγμα θρεπτικού μέσου 1⁄2Χ MS με 2,46 μΜ ΙΒΑ, το οποίο αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο.
Η επιμήκυνση των βλαστών επιτεύχθηκε μετά από τουλάχιστον τρεις εβδομάδες καλλιέργειας, ανάλογα με τον εφαρμοζόμενο χειρισμό και την ποικιλία. Μέσα σε κάθε ποικιλία, παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p≤0,05) στο μέσο μήκος του βλαστού μεταξύ των διαφορετικών χειρισμών. Η επίδραση των συγκεντρώσεων των ρυθμιστών ανάπτυξης των φυτών στην ανάπτυξη των εκφύτων των δύο ποικιλιών Cannabis sativa παρουσιάζεται στον Πίνακα 4 και στα Σχήματα 7 και 11.
Ο Πίνακας 4 παρουσιάζειτην επίδραση των συγκεντρώσεων των ρυθμιστών ανάπτυξης στην αύξηση των εκφύτων των ποικιλιών Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και CBG. Το Σχήμα 7 και το Σχήμα 11 παρουσιάζουν την επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στη μέση αύξηση των εκφύτων σε σχέση με το δοχείο καλλιέργειας στις ποικιλίες Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και CBG αντίστοιχα.
Πίνακας 4. Η επίδραση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης στη μέση αύξηση στις ποικιλίες Cannabis sativa με υψηλή περιεκτικότητα σε CBD και CBG. (Οι μέσοι όροι που ακολουθούνται από το ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά για p ≤ 0.05 σύμφωνα με το τεστ Dunkan).
Και για τις δύο ποικιλίες κάνναβης, τα μη αεριζόμενα δοχεία υπερτερούσαν σαφώς των αεριζόμενων, αν και δεν υπήρχε στατιστική διαφορά μεταξύ των αντίστοιχων χειρισμών.
Όσον αφορά την ποικιλία με υψηλό CBD και τα μη αεριζόμενα δοχεία, η μέγιστη ανάπτυξη (1,59 cm) επιτεύχθηκε κατά τη συμπλήρωση του μέσου με 4,92 μΜ ΙΒΑ με αποστείρωση με φίλτρο. Η εμβάπτιση των εκφύτων σε 15 mM ΙΒΑ για δύο λεπτά οδήγησε στη δεύτερη υψηλότερη ανάπτυξη (1,43 cm). Όταν χρησιμοποιήθηκε μίγμα μέσου MS καί 4,92 μΜ ΙΒΑ αποστειρωμένο στο αυτόκαυστο, επιτεύχθηκε τιμή ανάπτυξης 1,42 cm που δεν ήταν στατιστικά διαφορετική (p≤0,05) με την τελευταία τιμή. Το ίδιο μοτίβο παρατηρήθηκε σε αεριζόμενα δοχεία. Η προσθήκη 4,92 μΜ ΙΒΑ με αποστείρωση με φίλτρο στο μέσο ή η τοποθέτηση σε αυτόκαυστο του μείγματος του μέσου συμπληρωμένου με 4,92 μΜ ΙΒΑ, οδήγησε στις καλύτερες τιμές ανάπτυξης, 1,31 cm και 1,17 cm, αντίστοιχα. Σε αεριζόμενα δοχεία, η αποστείρωση με φίλτρο του ΙΒΑ παρουσίασε τα καλύτερα αποτελέσματα. Αντίθετα, ο χειρισμός με εμβάπτιση έδειξε τις χαμηλότερες τιμές ανάπτυξης, συγκρίσιμες με τον έλεγχο, τιμές που δεν εμφάνισαν επίσης στατιστικά σημαντικές διαφορές (p≤0,05).
Συγκρίσιμα αποτελέσματα με αυτά της ποικιλίας με υψηλό CBD ήταν αυτά που αφορούσαν την ποικιλία με υψηλό CBG. Σε μη αεριζόμενα δοχεία, η μέγιστη ανάπτυξη (1,60 cm) επιτεύχθηκε συμπληρώνοντας το μέσο με 4,92 μΜ ΙΒΑ με αποστείρωση με φίλτρο. Η δεύτερη και η τρίτη υψηλότερη τιμή ανάπτυξης, 1,50 cm και 1,34 cm, επιτεύχθηκαν όταν χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο, σε αυτόκαυστο, μίγμα θρεπτικού μέσου MS 4,92 μΜ ΙΒΑ και στον χειρισμό με εμβάπτιση των εκφύτων σε 15 mM ΙΒΑ για δύο λεπτά, αντίστοιχα. Αυτοί οιχειρισμοί δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p≤0,05). Όσον αφορά τα αεριζόμενα δοχεία, παρατηρήθηκαν αντίστοιχα αποτελέσματα με τα προηγούμενα. Η συμπλήρωση του μέσου με αποστειρωμένο με φίλτρο ΙΒΑ 4,92 μΜ οδήγησε στην καλύτερη τιμή ανάπτυξης (1,24 cm). Τα έκφυτα που υποβλήθηκαν σε εμβάπτιση σε 15 mM ΙΒΑ για δύο λεπτά όπως επίσης αυτά που τοποθετήθηκαν σε μίγμα θρεπτικού μέσου συμπληρωμένο με 4,92 μΜ ΙΒΑ αποστειρωμένο σε αυτόκαυστο, πέτυχαν τα καλύτερα αποτελέσματα, 1,18 cm και 1,13 cm, αντίστοιχα. Και οι τρεις τελευταίοι χειρισμοί δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ τους (p≤0,05). Γενικά, στα αεριζόμενα δοχεία, η αποστείρωση του ΙΒΑ με φίλτρο παρουσίασε τα καλύτερα αποτελέσματα. Αντίθετα, οι χειρισμοί εμβάπτισης έδειξαν τις χαμηλότερες τιμές ανάπτυξης, συγκρίσιμες με τον έλεγχο, τιμές που δεν παρουσίασαν επίσης στατιστικά σημαντικές διαφορές (p≤0,05).
Σε όλες τους χειρισμούς, ο έλεγχος έδειξε, για άλλη μια φορά, τις χαμηλότερες τιμές ανάπτυξης (0,52 cm), εκτός από αυτήν που αφορούσε, πάλι, τα έκφυτα της υψηλής σε CBD ποικιλίας τα οποία υποβλήθηκαν σε εμβάπτιση σε 15 mM ΙΒΑ για τέσσερα λεπτά σε αεριζόμενα δοχεία (Πίνακας 4).
Παράδειγμα 3: Εγκλιματισμός των νέων φυτών
Ζωηρά φυτά (έκφυτα) με καλά ανεπτυγμένες ρίζες, μεταφυτεύτηκαν σε πλαστικά δοχεία 6,5 cm x 6,5 cm x 8,0 cm που περιείχαν αποστειρωμένο μίγμα τύρφης: περλίτη με αναλογία 1:2 (ν/ν). Τα δοχεία τοποθετήθηκαν σε μικρά πλαστικά θερμοκήπια 48cm x 33cm x 20cm (BHR, Γαλλία) με πλαστικό κάλυμμα προκειμένου να αποφευχθεί η απώλεια νερού καί να διατηρηθεί η σχετική υγρασία. Όλα τα φυτά τοποθετήθηκαν υπό ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες στους 25±2°C με φωτοπερίοδο 16 ωρών, υπό λαμπτήρες φθορισμού με πυκνότητα ροής φωτοσυνθετικών φωτονίων περίπου 50 μmol m<-2>s<-1>στο επίπεδο καλλιέργειας. Τα φυτά ποτίζονταν μεμονωμένα κάθε μέρα , εάν ήταν απαραίτητο, με νερό βρύσης καί οι τοίχοι των μικρών πλαστικών θερμοκηπίων ψεκάζονταν με νερό για να διατηρηθεί σε υψηλά ποσοστά η σχετική υγρασία. Ο εγκλιματισμός επιτεύχθηκε ανοίγοντας σταδιακά την πλαστική μπροστινή πόρτα των μικρών πλαστικών θερμοκηπίων. Τα εγκλιματισμένα φυτά μεταφυτεύτηκαν σε γλάστρες και τοποθετήθηκαν σε εσωτερικό χώρο, υπό ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες στους 25±2°C με φωτοπερίοδο φθορισμού 12 ωρών, με πυκνότητα ροής φωτοσυνθετικών φωτονίων περίπου 500 μmol m<-2>s<-1>, από την ανθοφορία μέχρι την ωριμότητα.
Τα έκφυτα εγκλιματίστηκαν σχετικά εύκολα στις ex vitro συνθήκες (95%) με χαμηλές απώλειες. Νέοι βλαστοί και ανάπτυξη παρατηρήθηκαν μέσα σε 2 εβδομάδες. Τα ριζοβολημένα έκφυτα εγκλιματίστηκαν μέσα σε τρεις έως τέσσερις εβδομάδες ανοίγοντας σταδιακά την πλαστική μπροστινή πόρτα των μικρών πλαστικών θερμοκηπίων. Τα εγκλιματισμένα φυτά μεταφυτεύθηκαν σε γλάστρες και τοποθετήθηκαν σε εσωτερικό χώρο υπό ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες, παρουσιάζοντας ποσοστό επιβίωσης 94%. Τα εγκλιματισμένα φυτά εμφάνισαν φυσιολογική ανάπτυξη με λειτουργικά φύλλα και χωρίς μορφολογικές ανωμαλίες. Το Σχήμα 3 παρουσιάζει έκφυτα Cannabis sativa με καλά αναπτυγμένες ρίζες τοποθετημένα σε μίγμα τύρφης-περλίτη για εγκλιματισμό.
Στατιστική ανάλυση
Η ανάλυση διακύμανσης και η δοκιμή πολλαπλού εύρους του Duncan σε ρ<0,05 διεξήχθησαν για την αύξηση του ύψους, το ποσοστό των ριζοβολημένων εκφύτων, τον μέσο αριθμό ριζών ανά έκφυτο καθώς και το μέσο μήκος των ριζών ανά έκφυτο, που προεξέχουν από τους σπόγγους, μεταξύ των χειρισμών. Τα δεδομένα σε ποσοστά υποβλήθηκαν σε κατάλληλο λογαριθμικό μετασχηματισμό ή μετασχηματισμό τόξου ημιτόνου για αναλογίες πριν από τη στατιστική ανάλυση και μετατράπηκαν ξανά σε ποσοστά για παρουσίαση σε πίνακες και γραφήματα. Όλη η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με χρήση λογισμικού SPSS ν.20 για Windows (IBM SPSS Statistics 2011, IBM Corp.).
Claims (15)
1. Ως σύστημα για in vitro πολλαπλασιασμό κλώνων φυτών κάνναβης, λογίζεται το σύστημα που περιλαμβάνει:
-ένα απολυμασμένο έκφυτο προερχόμενο από φυτό δότη κάνναβης το οποίο διατηρείται σε βλαστική κατάσταση καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής του,
-ασηπτικό θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ιστών για τον πολλαπλασιασμό του εν λόγω εκφύτου,
-ένα δοχείο με αεριζόμενο ή μη αεριζόμενο καπάκι για τον πολλαπλασιασμό του εν λόγω εκφύτου που περιλαμβάνει: ένα σπόγγο ριζοβολίας, ένα υπόστρωμα ανάπτυξης και
- κλώνους φυτών κάνναβης απαλλαγμένων από ασθένειες,
- τον εν λόγω σπόγγο ριζοβολίας εμποτισμένο στο εν λόγω ασηπτικό μέσο ιστοκαλλιέργειας.
2. Το σύστημα της αξίωσης 1, όπου το εν λόγω έκφυτο μπορεί να είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο έκφυτο, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαροί μίσχοι και νεαρά φύλλα, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
3. Το σύστημα οποιοσδήποτε από τις αξιώσεις 1 ή 2, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται με ένα αντιβιοτικό, κατά προτίμηση καναμυκίνη και/ή πενικιλίνη
4. Το σύστημα της αξίωσης 3, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση εύρους 2μΜ έως 10μΜ
5. Το σύστημα της αξίωσης 4, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας περιλαμβάνει μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, γλυκίνη, νικοτινικό οξύ, πυριδοξίνη HCI καιθειαμίνη HCI με το pH του ρυθμισμένο στο 5,8.
6. Το σύστημα της αξίωσης 5, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας περιλαμβάνει 3,12 μΜ μονοβασικού φωσφορικού καλιού, 53,28 μΜ γλυκίνης, 1,12 μΜ νικοτινικού οξέως, 4,86 πυριδοξίνης HCI και 3 μΜ θειαμίνης HCI με το pH του ρυθμισμένο στο 5,8,
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται με 50 mg l<-1>καναμυκίνης και 100 mg l<-1>πενικιλίνης,
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιείται στο ήμισυ της δυναμικότητάς του, και
όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση εύρους 2 μΜ έως 10 μΜ.
7. Το σύστημα οποιασδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 6, όπου όταν αναφέρεται το φυτό κάνναβης λογίζεται το είδος Cannabis sativa.
8. Το σύστημα οποιοσδήποτε από τις αξιώσεις 1 έως 7 , όπου ο εν λόγω σπόγγος μπορεί να είναι ένας φυσικός σπόγγος, ένας οργανικός σπόγγος, ένα υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη ή οποιοδήποτε άλλο υπόστρωμα σπόγγου κατάλληλο για πολλαπλασιασμό ή καλλιέργεια φυτών, κατά προτίμηση ένα υπόστρωμα σπόγγου με βάση την τύρφη.
9. Μέθοδος πολλαπλασιασμού ενός εκφύτου κάνναβης, λογίζεται η μέθοδος που περιλαμβάνει τα βήματα:
i) παροχή δοχείου καλλιέργειας που περιέχει ένα σπόγγο ως υπόστρωμα ανάπτυξης, κατά προτίμηση με βάση την τύρφη, εμποτισμένο σε ασηπτικό μέσο ιστοκαλλιέργειας
ii) τοποθέτηση του απολυμασμένου εκφύτου κάνναβης στο εν λόγω σπόγγο
iii) επώαση του εν λόγω δοχείου που περιέχει το εν λόγω έκφυτο σε έναν θάλαμο ανάπτυξης
iν) μεταφορά του εν λόγω ανεπτυγμένου εκφύτου κάνναβης, μετά τη διαδικασία της επώασης σε δοχείο εγκλιματισμού, και όπου όλα τα προηγούμενα βήματα i-iv εκτελούνται υπό ασηπτικές συνθήκες.
10. Η μέθοδος της αξίωσης 9, όπου
το εν λόγω μέσο καλλιέργειας του σταδίου (ΐ) περιλαμβάνει μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, γλυκίνη, νικοτινικό οξύ, πυριδοξίνη HCI και θειαμίνης HCI με το pH του ρυθμισμένο στο 5,8, και
όπου το εν λόγω έκφυτο κάνναβης του σταδίου (ϋ) μπορεί να είναι ένας ή περισσότεροι μεριστωματικοί ιστοί, ένα κορυφαίο έκφυτο, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα κομβικό έκφυτο, άκρες ριζών, άκρες βλαστών, νεαροί μίσχοι και νεαρά φύλλα, κατά προτίμηση ένα μασχαλιαίο έκφυτο.
11. Η μέθοδος της αξίωσης 10, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας του σταδίου (ΐ) περιλαμβάνει 3,12 μΜ μονοβασικού φωσφορικού καλιού, 53,28μΜ γλυκίνης, 1,12 μΜ νικοτινικού οξέος, 4,86 πυριδοξίνης HCI και 3 μΜ θειαμίνης HCI με το pH του ρυθμισμένο στο 5,8, αντιβιοτικά κατά προτίμηση 50 mg l<-1>καναμυκίνης και 100 mg l<-1>πενικιλίνης, όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας χρησιμοποιείται στο ήμισυ της δυναμικότητάςτου, και όπου το εν λόγω μέσο καλλιέργειας συμπληρώνεται περαιτέρω με ινδολο-3-βουτυρικό οξύ (ΙΒΑ) σε συγκέντρωση εύρους 2 μΜ έως 10 μΜ, και
όπου το εν λόγω έκφυτο κάνναβης του σταδίου (ϋ) είναι ένα ή περισσότερα από ένα μεριστωματικό ιστό, ένα κορυφαίο έκφυτο, ένα επάκριο μερίστωμα, ένα μασχαλιαίο έκφυτο, άκρες ριζών, κορυφές βλαστών, νεαροί μίσχοι και νεαρά φύλλα, κατά προτίμηση μασχαλιαία έκφυτα.
12. Η μέθοδος της αξίωσης 11, όπου
το στάδιο επώασης (iii) πραγματοποιείται στους 23±1°C για 2 μήνες.
13. Η μέθοδος της αξίωσης 12, όπου
τα ανεπτυγμένα έκφυτα, μετά τη διαδικασία της επώασης, μεταφυτεύονται σε δοχεία καί διατηρούνται για εγκλιματισμό σε θερμοκήπιο στους 25±2°C
14. Η μέθοδος σύμφωνα με την αξίωση 13, όπου το έκφυτο της κάνναβης που έχει τοποθετηθεί στο υπόστρωμα ανάπτυξης του σπόγγου έχει ύφος περίπου 4 cm.
15. Η μέθοδος σύμφωνα με οποιαδήποτε από τις αξιώσεις 9 έως 14, όπου έκφυτο κάνναβης λογίζεται έκφυτο είδους Cannabis sativa.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20220100263A GR1010407B (el) | 2022-03-28 | 2022-03-28 | Καινοτομα μεθοδος in vitro πολλαπλασιασμου για την προστασια και διατηρηση φυτων ειδων κανναβης |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GR20220100263A GR1010407B (el) | 2022-03-28 | 2022-03-28 | Καινοτομα μεθοδος in vitro πολλαπλασιασμου για την προστασια και διατηρηση φυτων ειδων κανναβης |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| GR1010407B true GR1010407B (el) | 2023-02-16 |
Family
ID=83362560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| GR20220100263A GR1010407B (el) | 2022-03-28 | 2022-03-28 | Καινοτομα μεθοδος in vitro πολλαπλασιασμου για την προστασια και διατηρηση φυτων ειδων κανναβης |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| GR (1) | GR1010407B (el) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105230465A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-13 | 云南大学 | 一种工业大麻的无土快繁方法 |
| WO2021034755A1 (en) * | 2019-08-19 | 2021-02-25 | Node Labs, Inc. | In-vitro photoautotrophic propagation of cannabis |
| CN112715289A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-04-30 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种巴马火麻雌株鉴别及快速扩繁的方法 |
-
2022
- 2022-03-28 GR GR20220100263A patent/GR1010407B/el active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105230465A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-01-13 | 云南大学 | 一种工业大麻的无土快繁方法 |
| WO2021034755A1 (en) * | 2019-08-19 | 2021-02-25 | Node Labs, Inc. | In-vitro photoautotrophic propagation of cannabis |
| CN112715289A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-04-30 | 广西壮族自治区农业科学院 | 一种巴马火麻雌株鉴别及快速扩繁的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| IOANNIDIS KOSTAS, DADIOTIS EVANGELOS, MITSIS VANGELIS, MELLIOU ELENI, MAGIATIS PROKOPIOS: "Biotechnological Approaches on Two High CBD and CBG Cannabis sativa L. (Cannabaceae) Varieties: In Vitro Regeneration and Phytochemical Consistency Evaluation of Micropropagated Plants Using Quantitative 1H-NMR", MOLECULES, SPRINGER VERLAG, BERLIN, DE, vol. 25, no. 24, 1 December 2020 (2020-12-01), DE , pages 5928, XP093000131, ISSN: 1433-1373, DOI: 10.3390/molecules25245928 * |
| IOANNIDIS KOSTAS, TOMPROU IOANNA, MITSIS VANGELIS: "An Alternative In Vitro Propagation Protocol of Cannabis sativa L. (Cannabaceae) Presenting Efficient Rooting, for Commercial Production", PLANTS, MDPI AG, vol. 11, no. 10, 1 January 2022 (2022-01-01), pages 1333, XP093000130, ISSN: 2223-7747, DOI: 10.3390/plants11101333 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Viñas et al. | In vitro propagation of purple pitahaya (Hylocereus costaricensis [FAC Weber] Britton & Rose) cv. Cebra | |
| Franklin et al. | Regeneration of eggplant (Solanum melongena L.) from root explants | |
| Desai et al. | Micropropagation of Anthurium andraeanum-An important tool in floriculture | |
| Benmahioul | Factors affecting in vitro micropropagation of Pistachio (Pistacia vera L.) | |
| CN113331059B (zh) | 一种以鸟王茶树胚轴为外植体建立高效再生体系的方法 | |
| CN104322370A (zh) | 一种苦瓜离体快速繁殖的方法 | |
| Bouquet et al. | Micropropagation of the grapevine (Vitis spp.) | |
| Atak et al. | Micropropagation of Anthurium spp | |
| TWI737234B (zh) | 控制及預防青枯病之組合物 | |
| Nia et al. | Effect of pre-sowing treatments and basal media on in vitro carob (Ceratonia siliqua L.) seed germination. | |
| CN103155869A (zh) | 甜樱桃砧木Colt组织培养方法 | |
| CN115885855B (zh) | 一种以紫魁茶树下胚轴为外植体建立再生体系的方法 | |
| CN106577280A (zh) | 一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗 | |
| Ismail et al. | In vitro micropropagation of Acacia auriculiformis from selected juvenile sources | |
| Pérez-Tornero et al. | Apricot micropropagation | |
| CN114532225B (zh) | 一种德氏兜兰组织培养快速繁殖及栽培方法 | |
| GR1010407B (el) | Καινοτομα μεθοδος in vitro πολλαπλασιασμου για την προστασια και διατηρηση φυτων ειδων κανναβης | |
| Putri et al. | Tissue culture sterilization of Callophylum inophyllum: Renewable energy resources | |
| Zhai et al. | Shoot multiplication and plant regeneration in Caragana fruticosa (Pall.) Besser | |
| Shi et al. | Mass-propagation and bioreactor-based technologies for germplasm conservation, evaluation and international distribution of breadfruit | |
| Northmore et al. | Effects of media composition and auxins on adventitious rooting of Bienertia sinuspersici cuttings | |
| Saito et al. | In vitro propagation from axillary buds of Acacia mangium, a legume tree in the tropics | |
| CN105010133B (zh) | 光皮桦植物组织培养方法及其培养基 | |
| Minipara et al. | Identification of best surface sterilization treatment and control of endophytic bacterial contamination in Annona squamosa L | |
| Kumar et al. | In vitro culture technology and advanced biotechnology tools toward improvement in gladiolus (Gladiolus species): Present scenario and future prospects |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PG | Patent granted |
Effective date: 20230307 |